JP2004508277A

JP2004508277A - 不所望の過剰増殖性細胞増殖を治療するための単純ヘルペスウイルス

Info

Publication number: JP2004508277A
Application number: JP2001543145A
Authority: JP
Inventors: レイクエル，シルビー; ハーミストン，テリー
Original assignee: オニックス　ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド
Priority date: 1999-12-08
Filing date: 2000-12-08
Publication date: 2004-03-18
Also published as: US20020072119A1; CN1450910A; EP1244469A2; US6660259B2; AU777886B2; CA2382998A1; AU2256501A; WO2001041801A3; WO2001041801A2

Abstract

本発明は製剤成分、キット、および使用方法に関するものであって、突然変異体ヒト単純ウイルスー１型ウイルスからなるものであり、新生物細胞のような感受性のある過剰増殖性細胞に細胞変性的であるものを提供する。好ましくは、該ウイルスはＩＥ遺伝子１に対してコードされた完全に機能的に活性な野生型ＩＣＰ０ポリペプチドを産出しない。

Description

【０００１】
発明の背景
今世紀の初頭からウイルスが癌の治療に用いられてきた。研究方法は２通りあった；第１の方法は、正常細胞には危害を加えないが、選択的に複製しかつ新生物細胞を殺す腫瘍溶解ウイルスを単離したり生成する事。この際研究者達は最初野生型のウイルスを用いたが、この手法は多少の成功をもたらしたものの成功は限定的であった。正常細胞をほとんどまたは全然傷つけずに、腫瘍の溶解と腫瘍の増殖を遅くする事が出来たが、病気の経過に意味のある変化をもたらす事はなかった。Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ９：１２１１−１２１８（１９５６），Ｃａｓｓｅｌ，Ｗ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ１８：８６３−８６８（１９６５），Ｗｅｂｂ，Ｈ．Ｅ．ｅｔａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ１：１２０６−１２０９（１９６６）を参照。また、Ｋｅｎｎｅｙ，Ｓ．ａｎｄＰａｇａｎｏ，Ｊ．Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．，ｖｏｌ８６，ｎｏ．１６，ｐ．１１８５（１９９４）を参照。
【０００２】
より最近では、野生型ウイルスの使用ではその効果が限定的なため病気が再発するので、研究者達は高い用量で供給出来、かつ正常細胞ではなく新生物細胞において複製能力のある、組換え型ウイルスを用いるようになった。そのようなウイルスはそれ自身有効な腫瘍溶解的な物質であり、さらにウイルスの抗新生物活性を強める形質転換遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を運搬し発現するように操作されうる。この種類のウイルスの一例は、ウイルスのゲノムのＥ１Ｂ領域に突然変異体があるアデノウイルスである。米国特許Ｎｏ．５，６７７，１７８とＢｉｓｃｈｏｆｆ，Ｊ．Ｒ．，Ｄ．Ｈ．Ｋｉｍ，Ａ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃ．Ｈｅｉｓｅ，Ｓ．Ｈｏｒｎ，Ｍ．Ｍｕｎａ，Ｌ．Ｎｇ，Ｊ．Ａ．Ｎｙｅ，Ａ．Ｓａｍｐｓｏｎ−Ｊｏｈａｎｎｅｓ，Ａ．Ｆａｔｔａｅｙ，ａｎｄＦ．ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：３７３−６参照。
【０００３】
癌治療に形質転換遺伝子を用いまたは用いずに複製能力のあるウイルスを使用する事を、研究者達が癌の治療に使用してきた第２の手法、すなわち形質転換遺伝子を発現する非複製ウイルス、と区別する事は重要である。ここではウイルスは単に、直接又は間接に新生物細胞を殺すのに責任のある形質転換遺伝子を伝達する媒介物（ビークル）として使われているにすぎない。この手法はウイルスを癌治療のために用いる有力な手法であったし、これからもあり続ける。しかしながら、この手法は限定的な成功を得ただけであり、ウイルスを複製するほど有効では無い様である。
【０００４】
上述した如く、大用量のウイルス治療に起因する正常組織への損傷を避けるために、ウイルスがその複製を容易にする突然変異を有し、それゆえ腫瘍細胞において新生物溶解活性を有するが、正常細胞に対しては本質的に無害である事が望ましい。この手法は正常細胞の増殖を制御する細胞増殖制御機構の多くが新生物細胞では不活性化されたり失われ、またこの同じ増殖制御機構がウイルスの複製を促進するためにウイルスにより不活性にされるという観察を利用している。
かくして、特定の正常細胞増殖制御機構を不活性にするウイルス遺伝子の除去や不活性化は、ウイルスが正常細胞で複製する事を防止するが、そのようなウイルスは特定の増殖制御機構を欠く新生物細胞において複製し、それを殺す。
【０００５】
遺伝子操作をした複製能力のある単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）が抗腫瘍剤として報告されている。Ｍａｒｔｕｚａｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：８５４（１９９１）参照。ことにＨＳＶ−１チミジンキナーゼ欠落突然変異体であるｄｌｓｐｔｋが動物脳腫瘍モデルにおいて人の悪性神経膠腫細胞に対して抗腫瘍活性を現したことが示された。不幸にして、ＨＳＶ−１ｄｌｓｐｔｋウイルスは腫瘍細胞を適切に殺すに要する用量で重大な脳炎を生じた。Ｍａｒｋｅｒｔｅｔ．ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ３２：５９７（１９９３）。
【０００６】
米国特許Ｎｏ．５，５８５，０９６は二つの遺伝子に突然変異を含む、突然変異をされた複製能力のある単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）が、アシクロビルのような抗ウイルス剤に敏感であり、神経毒ではなくかつ非分割細胞で複製せず、しかも神経系腫瘍細胞を殺しうると述べている。この単純ヘルペスウイルス突然変異体は機能的ガンマ３４．５遺伝子産物とリボヌクレオチドレダクターゼの両方を発現出来ない。
【０００７】
米国特許Ｎｏ．５，７２８，３７９は必須前初期ウイルス遺伝子産物の制御された発現により複製能力のある単純ヘルペスウイルスを用いて体内で腫瘍細胞を殺す方法を述べている。
米国特許Ｎｏ．５，８０４，４１３は補完レベルのある種の単純ヘルペスウイルスの必須前初期プロテインを発現する細胞系統について述べている。
病気、特に癌、を治療するためにウイルスを同定し使用することに進歩がみられるが、明らかに依然としてより有効なウイルスが大いに必要である。
【０００８】
発明の要約
本発明の観点は、細胞個体群中の不所望の過剰増殖性細胞増殖を、細胞を溶解する量の突然変異体単純ヘルペスウイルスで治療する方法の記述であって、そのさい該ウイルスはＩＥ遺伝子１によりコードされた機能的に活性な野生型ＩＣＰ０ポリペプチドを産出しないものである。
本発明の他の観点は、組織学的に同型の正常細胞に比較して過剰にベーターカテニンを発現する新生物細胞を有効量の突然変異体ヒト単純ヘルペスウイルスで処理する記述であって、ここで該ウイルスはＩＥ遺伝子１によりコードされた機能的に活性な野生型ＩＣＰ０ポリペプチドを産出しないものである。
【０００９】
本発明のさらなる観点は、突然変異体ヒト単純ヘルペスウイルスからなる製薬成分の記述であって、ここで該ウイルスはＩＥ遺伝子１に対しコードされた機能的に活性な野生型ＩＣＰ０ポリペプチドを産出しないものである。
本発明の他の観点は、細胞に有効量の突然変異体ヒト単純ヘルペスウイルスを投与する事により過剰にベーターカテニンを発現する細胞を同定する方法であって、ここで該ウイルスはＩＥ遺伝子１によりコードされた機能的に活性な野生型ＩＣＰ０ポリペプチドを産出しないものである。
これらのおよび他の観点はここに述べる開示を全て考慮することで明白になる。
【００１０】
発明の記述
とくにことわらない限り、ここに使われている全ての技術的、科学的術語は本発明が属する技術分野において通常の熟練者により普通に理解されているものと同じ意味を有する。一般的には、ここに使われている専門語と後述の実験室手法は当業界において良く知られ通常使われているものである。
【００１１】
標準技術が組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、および微生物培養と形質転換（例、電気穿孔、リポフェクション）に対して使われる。一般的には、酵素反応と精製段階は生産者規格に従って行われる。技術と方法は、当業界における法と、本明細書を通じて与えられている種々の一般参考文献に従って一般的に行われている（一般的にはＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．参照）。ここに使われている専門語と後述の分析化学、有機合成化学と製剤処方の実験室手法は、当業界において良く知られ、普通に使われているものである。標準的技術が化学合成、化学分析、製剤の処方と供給、および患者の治療に対して用いられている。
【００１２】
“過剰増殖性細胞増殖”または“過剰増殖性細胞”という術語は異常なあるいは病理的な細胞増殖、たとえば新形成により特徴付けられる病気の状態をさしている。
本明細書において使われる場合、“新生物細胞”と“新形成”は比較的自律的な増殖を示す細胞をさすもので、これらは細胞増殖の制御の重要な喪失により特徴づけられる異常な増殖の表現型を示す。新生物の細胞は活発に複製しているか一時的に非複製の休息状態（Ｇ_１又はＧ_０）にあるような細胞を含む；同様に新生物細胞は、良く分化された表現型、不完全に分化された表現型、あるいは両方の型の細胞の混合物からなりうる。
【００１３】
かくして、全ての新生物細胞がある時点において必ずしも細胞を複製しているわけではない。新生物細胞として定義された組は良性新生物中の細胞と悪性（すなわち明白な）新生物の細胞からなる。明白な新生物細胞はしばしば、内胚葉や上皮組織起源の細胞起源の場合は悪性腫瘍として、あるいは中胚葉起因の細胞型起源の場合は肉腫と典型的に名付けられている、腫瘍細胞または癌細胞として言及される。
【００１４】
“細胞変性”という術語は本発明のヘルペスウイルスにより引き起こされた過剰増殖性細胞に対する病理学的あるいは有害な効果を含むものであり、これらには細胞溶解、アポトーシス、細胞増殖の停止、細胞再生の停止、細胞サイクルの停止、ミトコンドリア、核と細胞膜のような活動的な細胞器官（オルガネラ）の破壊、ＤＮＡの断片化、細胞質ブレーブ（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）等が含まれる。
【００１５】
本明細書で用いられる場合、“生理学的条件”は、完全な哺乳動物細胞や生きている哺乳動物の組織空間や器官における条件に本質的に類似のイオン強度、ｐＨおよび温度を有する水的環境をさす。典型的には、生理学的条件は約１５０ｍＭＮａＣｌ（あるいは代わりにＫＣｌ），ｐＨ６．５−８．１，および約２０−４５℃の温度を有する水溶液からなる。一般的には、生理学的条件は生物学的巨大分子の分子間会合に対して適切な結合条件である。たとえば、１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４，３７℃の生理学的条件が一般に適切である。
【００１６】
本発明はＨＳＶ−１ゲノムの少なくとも一つの前初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙ）遺伝子に突然変異を含む単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）に関する。これらのウイルスは感染可能で、また過常増殖性細胞に対し細胞変性性であり、これらをある種の病気の治療及び診断用としての治療薬および診断薬として有用とする。好ましい具体例では、ウイルスは細胞の混合個体群中の特定の細胞型、過剰増殖性細胞に対して選択的に細胞変性であり、それにより全部の細胞個体群から選択的な除去を容易にする。ウイルスが正常細胞に顕著に有害な効果を生じることなく、病気の細胞を治療出来るので、本ウイルスのこの性質は特に有益である。
【００１７】
過剰増殖性細胞は、好ましくは形質転換された細胞、新生物細胞、あるいは過剰増殖性細胞増殖を示す他の細胞である。かくしてたとえば、好ましくは新形成細胞に、正常細胞には生じないが、新生物溶解や他の細胞変性効果を生じることにより、ウイルスは新形成の治療に有益である。ベーターカテニンポリペプチドを過剰に発現する細胞は、本発明に従いウイルスの細胞変性および／または細胞溶解効果にことに感受性がある。結果として、本ウイルスはベーターカテニン代謝に欠陥のある新生物細胞を治療するのに、またその欠陥を検知するのに特に有用である。
【００１８】
本発明の好ましい具体例は、細胞に対し細胞変性性および／または細胞溶解性である量の突然変異体ヒト単純ヘルペスウイルスを新生物に投与する事により新生物を治療又は予防する方法に関するものであって、ここで該ウイルスがＩＥ遺伝子１によりコードされた完全に機能的に活性な野生型ＩＣＰ０ポリペプチドを産出しないものである。
【００１９】
本発明はまたベーターカテニンを過剰に発現する細胞を同定する方法に関するものであり、いずれかの有効な順番で１又はそれ以上の下記の段階、たとえば、前記細胞に有効量の突然変異体ヒト単純ヘルペスウイルスを投与し、その際前記ウイルスがＩＥ遺伝子１によりコードされた完全に機能的に活性な野生型ＩＣＰ０ポリペプチドを産出せず、かつ前記細胞での細胞変性効果および／または細胞溶解の発生を測定し、それにより前記細胞はベーターカテニンが過剰に発現する事で同定されるものである。
【００２０】
いかなる新生物もそれが細胞変性／細胞溶解効果に感受性がある限り、ウイルスで治療出来る。新生物がウイルス効果に感受性があるか否かは、たとえば下記の例に示す如くに、定例的に決められる。たとえば、初期のあるいは確立した細胞系統の細胞が、試験管中の培養内に置かれ、変化する量のウイルス（たとえば、連続希釈液）と接触されうる。感染の数日後、細胞は細胞溶解が起こったか否かを決めるために、生活力および／または細胞死に対する分析をされうる。
【００２１】
生活力および／または細胞死の分析は、たとえばＰｒｏｍｅｇａ社により述べられているようにその市販キットＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６^ＴＭを使ったＭＴＴ分析により、定例的に行える。Ｋｏｒｎｅｎｉｅｗｓｋｉ，Ｃ．ａｎｄＣａｌｌｅｗａｅｒｔ，Ｄ．Ｍ．（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ６４，３１３とＤｅｃｋｅｒ，Ｔ．ａｎｄＬｏｈｍａｎｎ−Ｍａｔｔｈｅｓ，Ｍ．−Ｌ（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１１５，６１参照。例に見られる如く、結腸癌細胞（結腸直腸癌、結腸腺癌等を含む）は、これらが特にウイルス性溶解効果に感受性があるので、ウイルスの好ましい目標である。治療可能な他の新生物は、以下に限定するものではないが、前立腺、肺、胃、乳房、子宮、卵巣、膵臓、膀胱、腎臓、脳、骨、血、口峡咽頭、頭と首、食道、睾丸、頚部、甲状腺、副腎、リンパ腫、黒色腫、白血病、骨髄腫、ホジキン病、悪性腫瘍、繊毛膜癌、肉腫、神経芽細胞腫、ウイルムス病、良性腫瘍および前癌細胞の新生物を含む。
【００２２】
過剰増殖性細胞、たとえば新生物細胞は、理由は分かっていないが、もしそれらが特定の細胞型に対して正常量より過剰量のポリペプチドベーターカテニンを発現するなら、本発明のヘルペスウイルスの好ましい標的である。ここに使われている“過剰な発現”という術語により、病気の標的細胞内のベーターカテニンの水準は同型の正常細胞内のそれらよりもたとえば、１０％，２０％，４０％，５０％，７０％，９０％，９５％，９９％，１００％，２００％高いことが意味されている。ベーターカテニンは細胞融着と信号形質導入に関与するポリペプチドである。
【００２３】
ＩＥ−１遺伝子突然変異の細胞溶解効果に対する感受性はベーターカテニンの発現水準と関連していることがここに示されている。高水準のポリペプチドを発現する細胞は細胞溶解効果に最も感受性があったが、一方適度の水準で発現する細胞は細胞溶解に対して適度に感受性がある。かくして、新生物細胞が本発明に従ってウイルスに感受性があるか否かはそのベーターカテニンの発現水準を測定する事により定例的に決められうる。反対に、ウイルスの感受性は、細胞がポリペプチドを過剰に発現するか否か、それゆえ突然変異体かを判定するのに用いられる。これはウイルスに感受性があるが、ベーターカテニンを過剰に発現しない細胞を除外するものではない。
【００２４】
ベーターカテニン代謝に欠陥のある細胞も本発明に従って治療できる。“欠陥のある代謝”により、ベーターカテニンポリペプチドの異常な発現に導き、好ましくは上述した如き過剰発現に導く如何なる細胞機構も意味される。たとえば、ベーターカテニン遺伝子とその発現を調節する遺伝子との突然変異は、その過剰な発現をもたらしうる。ベーターカテニンの特定の突然変異は人の腫瘍で同定されてきた。
【００２５】
これらの突然変異はＡＰＣによりベーターカテニンのダウンレギュレーションを防止する。たとえば、Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１７９０−１７９２，１９９７とＭｏｒｉｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１７８７−１７９０，１９９７を参照。ベーターカテニンはまたＡＰＣ腫瘍抑止剤の不活性化あるいはｗｎｔ−１信号路の活性化により発癌性を活性化される；ここで両者ともベーターカテニンを調節する。これらの機構の３つとも全てベーターカテニンポリペプチドを過剰に発現することになる。たとえば、Ｐｏｌａｋｉｓ，Ｃｕｒｒ．ＯｐｉｎｉｏｎＧｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，９：１５−２１，１９９９を参照。
【００２６】
かくして、本発明は突然変異が過剰なベーターカテニン水準をもたらすベーターカテニン、ｗｎｔ−１とＡＰＣ遺伝子に１あるいはそれ以上の突然変異を含む細胞を治療するために用いられうる。本発明に有用なウイルスは、ＩＣＰ０，ＩＣＰ２２，ＩＣＰ４７，ＯＲＦ−Ｐ，ＯＲＦ−０とＵＳ１．５を含む非必須前初期ＩＥ遺伝子のような前初期（ＩＥ）遺伝子に好ましくは突然変異を有するものであり、一方、必須遺伝子はＩＣＰ４とＩＣＰ２７を含む。
【００２７】
好ましい遺伝子はＶｍｗ１１０或いはＩＣＰ０ポリペプチドをコードするＩＥ遺伝子１（ＩＥ−１）である。それは明らかなＭｒ１１０Ｋ（Ｐｅｒｒｙｅｔａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６７；２３６５−２３８０，１９８６）をもつ７７５のアミノ酸残基からなるリン核蛋白質である。それはＨＳＶゲノム内の二つの模写に存在するが、しかし試験管内での細胞溶解感染に対し絶対には必要とされない。
【００２８】
本発明の好ましい具体例において、ＩＣＰ０ポリペプチドは機能的に活性な野生型ＩＣＰ０ポリペプチドではない。“機能的に活性な野生型ポリペプチドではない”という句は、ポリペプチドが、正常な（野生型）ポリペプチドが発揮する少なくとも一つの生物学的活性を本質的に欠いていることを意味している。幾つかの条件下においてＩＥ−１遺伝子産物は幾らかの残存活性を示すが、依然として細胞溶解効果を有している事が認識されている。かくして、本発明は、細胞変性／細胞溶解的に有効であるが野生型ウイルスよりもＩＣＰ０活性を、たとえば５０％，７５％，９０％，９５％，９９％等低く示す、突然変異ＨＳＶ−１ＩＥ−１突然変異体を含むものである。
【００２９】
ＩＣＰ０は種々の生体内および試験管内過程において多くの生物学的活性を示し、それらには、これだけに限定されるものではないが、下記の活性を含んでいる；溶解感染中にウイルス遺伝子の発現を活性化する、ウイルスを潜伏状態から再活性化する、ＮＤ１０―前骨髄性白血病体すなわちＰＯＤＳ―として知られる核構造と連合する、分裂細胞および間期細胞の両者の動原体を連合する、粗抽出物中でＤＮＡに結合し、感染した核のクロマチンを連合する、１３５ｋＤａ細胞プロテイン（ＨｅｒｐｅｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＵｂｉｑｕｉｔｉｎＳｐｅｃｉｆｉｃＰｒｏｔｅａｓｅ，ＨＡＵＳＰ，（Ｍｅｒｅｄｉｔｈｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００：４５７−４６９，１９９４）に結合する、サイクリンＤ３（Ｋａｗａｇｕｃｈｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：７３２８−３６，１９９７；ＶａｎＳａｎｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９６：８１８４−８１８９，１９９９）およびＥＦ１−Ｄｅｌｔａ（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１０１９−１０２４，１９９７）と相互作用すること。
【００３０】
その除去はＩＣＰ０突然変異体が生産的な感染を引き起こす確率を顕著に減じる多重性依存の溶解感染を引き起こす（Ｓｔｏｗ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６７（ｐｔ１２）：２５７１−２５８５，１９８６；Ｓａｃｋｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１：８２９−８３９，１９８７）。またたとえば、Ｅｖｅｒｅｔｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，２０２：８７−９６，１９８８；Ｅｖｅｒｅｔｔｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ，１８：１５２６−１５３８，１９９９を参照。好ましい活性は共同発現されたプロモーターからの転写をトランス活性化する能力である。分析は下記の記述に従って行いうる。
【００３１】
たとえば、Ｅｖｅｒｅｔｔ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：１１８５−１２０２，１９８９；Ｅｖｅｒｅｔｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，２０２：８７−９６，１９８８。たとえば、突然変異体ＩＣＰ０を発現するプラスミッドは検知可能な標識をつけたプロモーターを含むプラスミッドと共に共同発現され、そのプロモーターはｇＤ，ｐＳＶ３７／３０，ＳＶｇＤ，ＳＶ４０等である。プラスミッドは、ＢＨＫ，ベロ，２９３，Ａ５４９，ＨｅＬａ，ＷＳＨｅＬａ等を含む種々の細胞系統で共同トランスフェクションされ、また共発現されうる。
【００３２】
細胞系統とプロモーター配列の選択は月並みに決められうる、たとえば、Ｅｖｅｒｅｔｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，２０３：７３９−７５１，１９８８とＯ’ＨａｒｅａｎｄＨａｙｗａｒｄ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５６：７２３−７３３，１９８５参照。典型的に、プロモーターは検知可能な産物（例、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）をコードするコード配列に実施可能に結合されうる。ＤＮＡ領域は、それらがお互いに関連している時に実施可能に結合される。たとえば、プロモーターは、それが配列の転写を制御するなら、コード配列に実施可能に結合される。
【００３３】
プロモーター、あるいは他の発現制御配列（エンハンサー、リボゾーム結合サイト、ＲＮＡポリメラーゼ結合サイト等を含む）は、プロモーター配列がコード配列の発現に影響するあるいは達成するような方法で位置付けられる時に、ヌクレオチドコード配列に実施可能に結合されうる。たとえば、プロモーターがコード配列に実施可能に結合される時に、コード配列の発現はプロモーターにより動かされる。ＩＣＰ０によるプロモーター配列のトランス活性化は、ＩＣＰ０ポリペプチドが機能的に活性であるという信号を与える検知できる産物の発現をもたらす。
【００３４】
ＩＣＰ０はＩＥ−３遺伝子生成物、Ｖｍｗ１７５、と相乗的に働く。かくして、プロモーターをトランス活性化する突然変異体ＨＳＶ−１ＩＥ−１の能力はＶｍｗ１７５の存在下および不存在下で測定されうる。Ｅｖｅｒｅｔｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，２０２：８７−９６，１９８８を参照。ここで使われている“トランス活性化”という術語は、ＩＥ−１のような制御遺伝子によりコードされた因子により遺伝子配列の活性化に関係している。
ここでＩＥ−１は、それが結合したり活性化したりする遺伝子配列と必ずしも隣接しない。
【００３５】
前述の如く本発明に従った好ましい突然変異体ウイルスはＩＥ−１遺伝子によりコードされた完全に機能的に活性な野生型ＩＣＰ０ポリペプチドに本質的に欠陥のあるものである。遺伝子の機能的な不活性化は、ＩＥ−１遺伝子の１またはそれ以上の機能を叩き出す（即ち、除去する）のに有効な如何なる方法でも達成しうる。たとえば、野生型ＩＥ−１遺伝子は、除去したりそこに配列を挿入することにより変更されうる。好ましい除去は、Ｓｔｏｗ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：２５７１−２５８５，１９８６；Ｐｅｒｒｙｅｔａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：２３６５−２３８０，１９８６に述べられているｄｌ１４０３である。他の突然変異とそれらを作る方法は、たとえばＥｖｅｒｅｔｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０２：８７−９６，１９８８に、特に表１と２に示されている、すなわち、ＩＣＰ０の多くの機能の１またはそれ以上を減じたり廃止したりする突然変異である。
【００３６】
本発明に従うウイルスはさらにそのゲノムに他の変更を含みうる。たとえば、それはＩＥ−１遺伝子に挿入された追加のＤＮＡを含みうる。この挿入はＩＥ−１遺伝子を機能的に不活性化することが出来、結果として溶解性表現型を生じる、あるいはすでに不活性化された遺伝子に挿入されたり、または除去された遺伝子を代替するだろう。
【００３７】
いかなる望ましいＤＮＡも挿入されうる、それには選択的なマーカーをコードするＤＮＡや、より好ましくはインターフェロン、サイトカイン、ケモカインのような治療的、生物学的に活性なプロテインにコードする遺伝子、あるいはもっと好ましくはチミジンキナーゼ（Ｍａｒｔｕｚａｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：８５４，１９９４）、シトシンデアミンダーゼ（米国特許Ｎｏ．５，３５８，８６６）、ｃｙｐ４５０（米国特許Ｎｏ．５，６８８，７７３）、およびその他を含む酵素を転換するプロドラッグに対しコードするＤＮＡが含まれる。
【００３８】
治療的や生物学的に活性なプロテインやその断片をコードする遺伝子の他の例は、例として、インターロイキン２（米国特許Ｎｏ４，７３８，９２７あるいはＮｏ．５，６４１，６６５）、インターロイキン７（米国特許Ｎｏ４，９６５，１９５あるいはＮｏ．５，３２８，９８８）、インターロイキン１２（米国特許Ｎｏ５，４５７，０３８）、腫瘍壊死因子アルファ（米国特許Ｎｏ４，６７７．０６３あるいはＮｏ．５，７７３，５８２）、インターフェロンガンマ（米国特許Ｎｏ４，７２７，１３８あるいはＮｏ．４，７６２，７９１）、あるいはＧＭ−ＣＳＦ（米国特許Ｎｏ５，３９３，８７０あるいはＮｏ．５，３９１，４８５）のような、免疫調節プロテインにコードするものを含む。
【００３９】
付加的な免疫調節プロテインはさらに、ＭＩＰ−３と（Ｗｅｌｌ，Ｔ．Ｎ．ａｎｄＰｅｔｉｓｃｈ，ＭＣ．Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌｖｏｌ６１（５）：ｐａｇｅｓ５４５−５０，１９９７参照）、細胞自殺、すなわちＢＡＤとＢＡＸを含むプロテインを誘導する細胞死、を含むマクロファージ炎症プロテインを含む。Ｙａｎｇ，Ｅ．，ｅｔａｌ，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ８０，ｐａｇｅｓ２８５−２９１（１９９５）とＳａｎｄｅｅｐ，Ｒ．，ｅｔａｌ，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．９１，ｐａｇｅｓ２３１−１４１（１９９７）を参照。単球走化性プロテイン（ＭＣＰ−３アルファ）もまた使用されよう。好ましい具体例の遺伝子は、好ましくは新生物に毒性であるが正常細胞には毒性の無いプロテインをコードする遺伝子に融合した細胞膜、たとえば、ＶＰ２２かＴＡＴを横切るプロテインをコードする遺伝子からなるキメラ遺伝子である。
【００４０】
その上、本発明に従ってヘルペスウイルスはＩＥ−１に加えて、そのゲノムの他の位置に突然変異を含みうる。
本発明に従ってヘルペスウイルスは望まれる効果を達成するために適切な方法で投与される、すなわち、それは効果的な条件下で投与される。望ましい具体例では、ウイルスは新生物を治療する為に投与される。ウイルスは一般的には新生物細胞に細胞変性効果を生じるに有効な量で、すなわち細胞に溶解的或いは腫瘍溶解的な量で投与される。”溶解的”あるいは“腫瘍溶解的”という術語により、ウイルスが過剰増殖性の目標（たとえば新生物）細胞で、正常細胞よりも選択的に分裂（溶解）を生じることを意味する。かくして、ウイルスはそのような細胞に対し細胞変性である。
【００４１】
溶解、腫瘍の自然退縮や他の治療効果を達成する為の有効量は、たとえば、変化する用量が溶解を生じるに有効な量を決定する為に目標細胞に投与される用量―反応実験を行う事により、定例的に決められる。量は、ウイルスが投与される環境（たとえば、癌患者、動物モデル、組織培養細胞等）、治療されるべき細胞の場所、年齢、健康、性別、治療される患者や動物の体重、等を含む種々の因子に基づいて選ばれる。有効な量はたとえば１０^５ ― １０^１２ｐｆｕｓ、好ましくは１０^７ − １０^８ｐｆｕｓを含む。
【００４２】
ここに述べられている突然変異体ＨＳＶウイルスは好ましくは新生物細胞に対して細胞変性的或いは溶解的である。かくして、本発明に従って治療は新生物細胞の溶解をもたらす事が好ましい。この意味で、治療は、病気が新生物細胞を除去する事により変えられる事を示す。そのような除去は腫瘍の自然退縮をもたらしうる。しかしながら、治療はいかなる顕著な自然退縮なしに、腫瘍の増殖を止めたり遅くしたりしうる。本発明の好ましい方法においては、ウイルスは、ホスト（たとえば、新形成を有する人や、動物モデルに人の新生物細胞を皮下もしくは腹腔内に注射したような、新生物細胞を移植された、人ではない哺乳動物）に、正常な個体群から新生物細胞を溶解する事により除去する為に使われる。
【００４３】
ウイルスは治療効果をあげるために適切な方法で投与されうる。たとえば、過剰増殖する目標細胞の場所に応じて、腫瘍に直接あるいは近くに注射で、腫瘍内に、局所に、腸内に、非経口で、静脈内に、筋肉内に、皮下に、経口で、鼻腔に、大脳に、心室に投与されうる。
【００４４】
本発明ヘルペスウイルスは裸のＤＮＡとして、または燐酸カルシュウム、ＤＥＡＥ−デキストラン錯体、脂質、ポリマー等の適切な担体に複合されたリポソーム内のウイルス粒子として投与されうる。たとえば、米国特許Ｎｏ５．９７６，５６７及びＮｏ．５，９６２，４２９を参照。ウイルスは通常培養で製造されかつ成熟したウイルス粒子に包まれうる、あるいは、裸のＤＮＡが調製され、上述した如き適切な担体に複合されうる。
【００４５】
本発明に従うヘルペスウイルスは、新生物や他の過剰増殖性細胞増殖を治療するのに有用な他の治療法と共に投与されうる。ここに含まれるものは、たとえば、手術、放射線、及びアルキル化剤（例えば、シスプラチン）、構造類似体や代謝拮抗物質（例、メトトレキサート）、ホルモン剤（例、タモキシフェン）、アンドロコーチコステロイド（例、プレドニソン）、アロマターゼ阻害剤、ＧｎＲＨ類似体、生物学的反応修飾物質（例、インターフェロン）、ペプチドホルモン阻害剤、自然産物（例、ビンブラスチン、マイトマイシン）等の化学療法剤である。たとえば、ＣｕｒｒｅｎｔＭｅｄｉｃａｌＤｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄＴｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｔｉｅｒｎｅｙｅｔａｌ．，編．，１９９７，Ｐａｇｅｓ，８１−８７参照。
【００４６】
製剤上許容出来る担体すなわち医薬品添加物がウイルスを送達するために用いられよう。種々の水溶液、たとえば、水、緩衝液水、０．４％食塩水、０．３％グリシンプロテイン、その他同様なものが用いられうる。これらの溶液は無菌で、一般的には望まれるヘルペスウイルス保菌生物以外の粒子物質を含まない。成分は、ｐＨ調節剤や緩衝剤、毒調節剤と類似物、たとえば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリ、塩化カルシューム、乳酸ナトリウム等、生理学的条件に近づけるために必要な製剤上許容できる補助剤を含みうる。ヘルペスウイルスによる細胞の感染を促進する医薬品添加物が混入されよう。
【００４７】
化学療法は熟練一般医に良く知られた方法で施されるであろう。これには、全身に、または癌への直接注入で、あるいは適切な徐放物質や癌に動脈内で撒き散らす望ましい化学療法剤を伴って癌の場所に局所的な投与を含むだろう。
好ましい化学療法剤はシスプラチンであり、好ましい用量は治療される癌の性質、またシスプラチン投与の際に通常考慮される他の因子に基づき一般医により選ばれるだろう。好ましくは、シスプラチンは静脈内に３−６時間かけて５０−１２０ｍｇ／ｍ^２の投与量で与えられる。より好ましくは静脈内に４時間かけて８０ｍｇ／ｍ^２の投与量で与えられる。シスプラチンと共に好んで投与される第二の化学療法剤は、５−フルオロウラシルである。５−フルオロウラシルの好ましい投与量は、連続５日間で１日当たり８００−１２００ｍｇ／ｍ^２である。
【００４８】
本発明はまた本発明に従う発明ヘルペスウイルスの有効量からなる製剤成分に関するものであって、たとえば、ここで該ウイルスは治療用の形態になっていることを特徴とする。さらに、発明は、前記新生物中の細胞に溶解的である突然変異体ヒト単純ヘルペスウイルスと前述した如き化学療法剤とを含むキットに関するものであって、前記ウイルスはＩＥ遺伝子１に対してコードされた機能的に活性な野生型ＩＣＰ０ポリペプチドを生成しないことを特徴とする。
下記の例は本発明を説明し、それを作ったり使用したりするのに通常の術の一つを助ける為に提示されている。これらの例は開示の範囲や特許状で与えられる保護を如何なる点でも限定することを意図したものではない。
【００４９】
例
ＨＳＶの前初期プロテインＩＣＰ０は生産的な感染に対し必須でない事が報告されている（Ｓｔｏｗ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６７（ｐｔ１２）：２５７１−２５８５，１９８６，および図１Ａ参照）。
一次正常細胞（ヒト微細導管上皮細胞、皮膚起源、ＨＭＶＥＣ−ｄ，図１Ｃ）へのＩＣＰ０ウイルスｄｌ１４０３の分析で、野生型１７＋に比較してウイルス感染の著しい減衰（約５０ｘ）が示された。
数種の細胞系統へのｄｌ１４０３の新生物溶解性分析で、このウイルスが結腸癌細胞系統を除いて野生型ウイルスに比較して一般的に減衰された事が示された（図２）。しかしながら、この除去されたウイルスの溶解能力は、結腸癌細胞系統ＨＴ−２９に対してｗｔ１７＋より良かった（図１Ｂ）。
【００５０】
試験された結腸癌細胞系統へのｄｌ１４０３の新生物溶解能力はベーターカテニンの細胞性水準に一致した（図２）。たとえば、高水準のベーターカテニンを発現するＳＷ６２０はｄｌ１４０３溶解に最も感受性があった。中程度にベーターカテニンを発現するＣＣＬ２２１、ＨＴ−２９とＳＷ４８０は１７^＋に比べてｄｌ１４０３に対し中程度に感受性があった。一方低ないし正常水準のベーターカテニンを有するＲＫＯは、１７^＋に比べてｄｌ１４０３溶解に対し最も抵抗する（ベーターカテニンの水準は以前の研究で測定された。
【００５１】
たとえば、Ｐｏｌａｋｉｓ，Ｐ．ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ．Ｖｏｌ．７：ｐ．１３３２（３），１９９７；および、Ｐｏｌａｋｉｓ，Ｐ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＧｅｎｅｔＤｅｖ．Ｖｏｌ．９（１）：ｐ．１５１９９９）。その結果、もし正常細胞系統に対し１７^＋に比べてｄｌ１４０３の減衰（１７^＋に比べて５０Ｘ）が、結腸癌細胞系列に対しウイルスの増加した効力（１７^＋に比べて１０Ｘ）と組み合わせられるならば、結腸癌細胞系列に対するｄｌ１４０３の試験管内治療指数は１７^＋に比べて５００倍になる。
【００５２】
さらに、動物による研究で、ヌードマウスにＳＷ６２０起源の異種移植癌に癌内注入した１用量（１Ｘ１０^６ｐｆｕ）の１７^＋は動物死亡率を生じたことが示されている（感染後（ＰＩ）１１日で２０％、図３Ａ）。対照的に、同用量のｄｌ１４３０は動物で良く許容され（１００％生存）（図３Ａ）、かつ未治療の動物に比べて５０％の腫瘍減少を生じた（図３Ｂ）。
【００５３】
細胞培養、ウイルス学、核酸、ポリペプチド等の他の観点については標準的教科書を参照されたい。たとえば、Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．（１９８６），ＢａｓｉｃＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＥｌｓｅｖｉｒＳｃｉｅｎｃｅｓＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ；Ｈａｍｅｓｅｔａｌ．（１９８５），ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＬ．Ｐｒｅｓｓ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．；ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ編，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ；ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ，ＪｏｈｎＥ．Ｃｏｌｉｇａｎｅｔａｌ編，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ；ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ，Ｆｒｅｓｈｎｅｙｅｔａｌ．，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，１９９２；ＢａｓｉｃＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＰｏｌｌａｒｄａｎｄＷａｌｋｅｒ，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，１９９７；ＧｅｎｅｒａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｏｆＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ，ＨａｒｒｉｓｏｎａｎｄＲａｅ，ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，１９９７；ＶｉｒｕｓＣｕｌｔｕｒｅ，Ｃａｎｎ編，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，１９９９；ＨｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘＶｉｒｕｓＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＢｒｏｗｎａｎｄＭａｃＬｅａｎ編，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，１９９８を参照。
【００５４】
さらなる詳述を加えなくとも、技術に熟練した人は、前述の記述を用いて、本発明を最大限利用出来る。したがって前述の好ましい特定の具体例は、単に例証的であって、開示の他の部分を決して限定するものではない。
上記引用し、図示した全ての特許と文献の全ての開示は、ことごとく参考文献としてここに入れられている。
前述の記述から、技術に熟練した人は本発明の本質的な特徴を容易につきとめることが出来、発明の精神と範囲から離れることなく、それを種々の用途と条件に応用するために発明の種々の変更と修正を行う事が出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１．　癌細胞と正常細胞に対する野生型１７^＋とｄｌ１４０３の溶解活性の比較。ＨＳＶ−１菌株１７^＋とそのＩＣＰ０除去誘導体（ｄｌ１４０３）の連続希釈液が、９６穴方式（ｗｅｌｌｆｏｒｍａｔ）におかれた形質転換されたベロ細胞（パネルＡ）、癌ＨＴ−２９細胞（パネルＢ）と人の正常な無活動なＨＭＶＥＣ−ｄ細胞（パネルＣ）の単層を感染するために使われた。
感染後の３日間（パネルＡとＢ）と６日間（パネルＣ）、プレートはＭＴＴ分析のために処理され、５７０ｎｍでの光学濃度が読まれた。ウイルス希釈液の１濃度４点の平均値が非感染の対照細胞単層の百分率としてプロットされた。水平線は５０％の細胞死のｍｏｉを示している。
【図２】
図２．　結腸癌細胞に対する野生型１７^＋とｄｌ１４０３の溶解能力の比較。ＨＳＶ−１菌株１７^＋とそのＩＣＰ０除去誘導体（ｄｌ１４０３）の連続希釈液が９６穴方式におかれた結腸癌細胞系列の単層を感染するために使われた。感染３日後、ＭＴＴ分析が行われ、ウイルス希釈液の１濃度４点の平均値が非感染の対照細胞単層の百分率としてプロットされた。水平線は５０％の細胞死亡のｍｏｉを示している。
【図３】
図３．　野生型１７^＋とｄｌ１４０３ウイルスの人体内の分析。野生型１７^＋とｄｌ１４０３ウイルスがＳＷ６２０の腫瘍異種移植されたヌードマウスの腫瘍内に１Ｘ１０^６ｐｆｕで１回、または５日間に毎日２Ｘ１０^５ｐｆｕで注入された。腫瘍の大きさ（パネルＢ）だけでなく動物の生存（パネルＡ）も監視された。

Claims

過剰増殖性細胞を含んで成る細胞固体群中の不所望の過剰増殖性細胞増殖を処理するための方法であって、前記の過剰増殖性細胞に、前記の細胞に細胞溶解可能な量の突然変異体単純ヘルペスウイルスを接触させ、ここで前記ウイルスはＩＥ遺伝子１によりコードされた機能的に活性な野生型ＩＣＰ０ポリペプチドを産出しないことを特徴とする方法。
前記ウイルスがＩＥ遺伝子１における欠失を含んで成る請求項１に記載の方法。
前記欠失がＩＥ遺伝子１の領域１，２，３，４，または５にある請求項２に記載の方法。
該ウイルスがｄｌ１４０３である請求項１に記載の方法。
前記ウイルスがＩＥ遺伝子１の挿入を含んで成る請求項１に記載の方法。
前記ＩＣＰ０ポリペプチドがトランスフェクション分析で検出しうる活性を持たない請求項１に記載の方法。
前記細胞が新生物細胞であり、かつ前記細胞が同型の正常細胞に比較してベーターカテニンを過剰に発現する請求項１に記載の方法。
前記細胞がＡＰＣ遺伝子に突然変異を含む請求項１に記載の方法。
前記細胞がＡＰＣ遺伝子に突然変異を含む請求項７に記載の方法。
前記細胞がｗｎｔ−Ｉ遺伝子に突然変異を含む請求項１に記載の方法。
前記細胞がｗｎｔ−Ｉ遺伝子に突然変異を含む請求項７に記載の方法。
前記細胞がベーターカテニン遺伝子に突然変異を含む請求項１に記載の方法。
前記新生物細胞がベーターカテニン遺伝子に突然変異を含む請求項７に記載の方法。
前記新生物細胞が結腸癌、結腸・直腸癌、あるいは腺癌からなる群から選択される請求項７に記載の方法。
前記新生物細胞がＳＷ６２０，ＣＣＬ２２１，ＨＴ−２９，あるいはＳＷ４８０からなる群から選択される細胞の性質を有する請求項１に記載の方法。
ベーターカテニンを過剰に発現する細胞を同定する方法であって、前記細胞に有効量の突然変異体ヒト単純ヘルペスウイルスを投与し、ここで前記ウイルスがＩＥ遺伝子１によりコードされた機能的に活性な野生型ＩＣＰ０ポリペプチドを産出せず、かつ前記細胞における細胞溶解の発生を測定し、それにより前記細胞がベーターカテニンを過剰に発現するものとして同定される事を特徴とする方法。
前記ウイルスがＩＥ遺伝子１の欠失を含む請求項１６に記載の方法。
該ウイルスがｄｌ１４０３である請求項１７に記載の方法。
突然変異体ヒト単純ヘルペスウイルスおよび無菌の生理学的に釣り合いのとれた溶液を含んで成り、前記ウイルスがＩＥ遺伝子１によりコードされた機能的に活性な野生型ＩＣＰ０ポリペプチドを産出しない事を特徴とする、医薬組成物。
さらに化学療法剤を含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
突然変異体ヒト単純ヘルペスウイルスおよび化学療法剤を含んで成り前記ウイルスがＩＥ遺伝子１に対してコードされる機能的に活性な野生型ＩＣＰ０ポリペプチドを生成しない事を特徴とするキット。