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CN1450910A - 治疗有害的过度增殖性细胞生长的单纯疱疹病毒 - Google Patents

治疗有害的过度增殖性细胞生长的单纯疱疹病毒 Download PDF

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CN1450910A
CN1450910A CN00814842A CN00814842A CN1450910A CN 1450910 A CN1450910 A CN 1450910A CN 00814842 A CN00814842 A CN 00814842A CN 00814842 A CN00814842 A CN 00814842A CN 1450910 A CN1450910 A CN 1450910A
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Abstract

本发明涉及含有突变型人类单纯疱疹病毒1的药物组合物，试剂盒以及它们的使用方法，该病毒对例如赘生性细胞的敏感过度增殖细胞有致细胞病变作用。优选这种病毒不产生由IE基因1编码的具有功能活性的野生型ICPO多肽。

Description

治疗有害的过度增殖性细胞生长的单纯疱疹病毒
                      发明背景
从本世纪早期开始，病毒已经用来治疗癌症。这个方法有两部分；首先，分离或生产能选择性的在赘生性细胞中复制并杀死赘生性细胞而不伤害正常细胞的溶瘤病毒。这里，研究者最初使用了野生型病毒，这种方法取得了一些有限的成功。尽管肿瘤消解和赘生物生长减慢了，并且对正常组织只有一点或者没有损伤，但是该方法对疾病的进程并没有明显的改善。见Smith等人，Cancer9：1211-1218(1956)，CasselW.A等人，Cancer18：863-868(1965)，WebbH.E等人，Lancet1：1206-1209(1966)。也可以见KenneyS和PaganoJ.J.Natl.CancerInst，vol.86，no.16，p.1185(1994).
最近，由于同使用野生型病毒的有限效力联系在一起的疾病复发，研究者已经求助于使用重组病毒，该病毒能以大剂量使用，并且能在赘生性细胞而不在正常细胞中复制，这样的病毒从它们本身的质量来说就是高效的肿瘤消解剂，更进一步，它们可以设计成携带并表达能够增强病毒抗赘生物活性的转基因。这类病毒的一个实施例是在病毒基因组E1B区域发生突变的腺病毒。见美国专利5,677,178以及Bischoff，J.R，D.H.Kirn，A.Williams，C.Heise，S.Horn，M.Muna，L.Ng，J.A.Nye，A.Sampson-Johannes，A.Fattaey and F.McCormick.1996，Science.274：373-6.
将使用带有或不带有治疗癌症的转基因的能复制病毒同研究者已经用来治疗癌症的第二种方法区分开来是很重要的，该第二种方法使用表达转基因的非复制性病毒。这里，病毒只是作为一种载体来传送转基因，该转基因直接或间接的负责杀死赘生性细胞。这种方法已经并将继续成为用病毒治疗癌症的主要方法。但是，这种方法只取得了有限的成功，而且看起来它比复制性病毒的效力低。
如上面所述，为了避免由于大剂量病毒治疗方法的使用而导致的对正常组织的损伤，优选病毒带有某种突变，该突变能促进它在赘生性细胞中的复制，从而提高在其中的肿瘤消解活性，但对正常细胞基本无害。这种方法利用了这样一个观察现象：控制正常细胞生长的许多细胞生长调节机制在赘生性细胞中失活或丢失，同样的这些细胞生长控制机制被病毒失活以利于病毒复制。因此，缺失或失活能使某一特定正常细胞生长控制机制失活的病毒基因，就能阻止病毒在正常细胞中复制，但是这样的病毒能在缺少该特定生长控制机制的赘生性细胞中复制，并且杀死这些细胞。
已经有人报道用经过遗传改造的复制性单纯疱疹病毒1(HSV-1)作为抗赘生物剂。见Martuza等人，Science252：854(1991).特别地，在动物脑瘤模型中已经表明缺少胸苷激酶的HSV-1突变体(d1sptk)显示了对人类恶性神经胶质瘤细胞的抗赘生物活性。不幸的是，在足够杀死赘生性细胞所需的剂量下，HSV-1 dlsptk病毒产生了明显的脑炎症状。见Markert等人，Neurosurgery32：597(1993).
美国专利号5,585,096中描述了一种在两个基因上带有突变的复制性突变HSV-1，该病毒对无环鸟苷之类的抗病毒剂敏感，不具有神经毒性，不在非分裂的细胞中复制，但能杀死神经系统的赘生性细胞。这种单纯疱疹病毒突变体不能表达功能性γ34.5基因产物和核糖核苷酸还原酶。
美国专利号5,728,379中描述了一种在体内用复制性单纯疱疹病毒，通过调节性表达基本的立即早期病毒基因产物来杀死赘生性细胞的方法。
美国专利号5,804,413中描述了一些能够表达互补量水平的某种单纯疱疹病毒基本立即早期蛋白的细胞系。
尽管在确定和使用病毒治疗疾病，特别是癌症中已经取得了进展，但是很明显仍存在对更高效病毒的巨大需求。
                        发明简述
本发明的一个方面是描述了一种用一定量突变型单纯疱疹病毒来治疗细胞群体中有害的过度增殖性细胞生长的方法，该病毒对细胞具有裂解性，其中这种病毒并不产生由IE基因1编码的具有功能活性的野生型ICP0多肽。
本发明的另一个方面描述了一种用有效量的突变型人类单纯疱疹病毒来治疗赘生性细胞的方法，该赘生性细胞和同组织类型的正常细胞相比过度表达β-连环蛋白，其中这种病毒并不产生由IE基因1编码的具有功能活性的野生型ICP0多肽。
本发明进一步的方面描述了含有突变型人类单纯疱疹病毒的药物组合物，其中这种病毒并不产生由IE基因1编码的具有功能活性的野生型ICP0多肽。
本发明的另一个方面是通过给细胞施用有效量的突变型人类单纯疱疹病毒来确定那些过度表达β-连环蛋白的细胞的方法，其中这种病毒并不产生由IE基因1编码的具有功能活性的野生型ICP0多肽。
通过对这里披露的全盘考虑，本发明的这些及另一些方面将变得明显。
                        附图简述
图1。野生型17+和d11403对癌细胞和正常细胞裂解能力的比较。在96孔板上用系列稀释的HSV-1株系17+和它的缺失ICP0的衍生物(d11403)感染转化的Vero单层细胞(图A)，癌细胞HT-29(图B)和人类正常的静止细胞HMVEC-d(图C)。感染之后3天(图A和图B)和6天(图C)，对平板进行MTT检验，在570nm的光密度下读取。将一式四份病毒稀释度的平均值绘制成未感染的对照单层细胞的百分比。水平线标出了细胞死亡一半的moi.
图2。野生型17+和d11403对结肠癌细胞裂解能力的比较。在96孔板上用系列稀释的HSV-1株系17+和它的缺失ICP0的衍生物(d11403)感染结肠癌细胞系的单层细胞。感染之后三天进行MTT检验，将一式四份病毒稀释度的平均值绘制成未感染的对照单层细胞的百分比。水平线标出了细胞死亡一半的moi.
图3。在体内对野生型17+和d11403病毒的分析。野生型17+和d11403病毒以一次性1X106pfu或每天2X106pfu五天赘生物内注射入裸鼠的SW620赘生物移植体。监视动物的存活(图A)和赘生物大小(图B)。
                      发明详述
除非另外定义，这里使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员共同理解的内容具有相同的含义。通常这里使用的学术术语和下面所述的实验方法都是本领域中所熟知并常用的。
在重组核酸方法，多核苷酸合成和微生物培养及转化(如电穿孔，脂染法)中使用了标准的技术。通常酶反应和纯化步骤根据制造商的说明书进行。这些技术和方法通常根据本领域中的传统方法和本文件中提供的各种通用参考文献(见Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd.edition(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)来实行。这里使用的学术术语和下面所述的分析化学，有机合成化学和药物剂型中的实验方法都是这个领域中熟知并常用的。在化学合成，化学分析，药物剂型和投递以及治疗患者中使用了标准的技术。
术语“过度增殖性细胞生长”或“过度增殖细胞”是指特征为异常或病理性细胞增殖的疾病状态，如瘤形成。
如这里所使用的，“赘生性细胞”和“赘生物”指那些显示相对自主生长的细胞，它们表现出特征为明显失去细胞增殖控制的异常生长表型。赘生性细胞包含那些活跃的复制或暂时处于非复制休眠状态(G1或G0)的细胞；相似的，赘生性细胞也可以包含那些具有很好分化表型的细胞，或较差分化表型的细胞，或者是这两种细胞的混合体。因此，在某一给定时间点，并不是所有的赘生性细胞都一定是正在复制的细胞。定义为赘生性细胞的集合包含良性赘生性细胞和恶性赘生物(或症状明显的(frank))细胞。症状明显的细胞常常指肿瘤细胞或癌细胞，如果起源于内胚层或外胚层组织的细胞则通常称为癌，如果起源于来自中胚层的细胞类型则通常称为肉瘤。
术语“致细胞病变”包含了任何由本发明疱疹病毒导致的对过度增殖细胞的病理或有害作用，包括细胞裂解，凋亡，细胞生长停止，细胞繁殖停止，细胞周期停止，重要细胞器的损坏，例如线粒体，核和细胞膜，DNA片断化，胞质起泡等。
如这里所用的，“生理条件”是指具有与完整哺乳动物细胞或活哺乳动物组织或器官内基本相似的离子强度，pH值和温度的水性环境。通常，生理条件包括大约有150mM NaCl(或者任选KCl)，pH6.5-8.1，温度大约20-45℃的水性溶液。通常，生理条件对生物大分子之间的分子间联系来说是合适的结合条件。例如，150mM NaCl，pH7.4，温度37℃的生理条件通常是合适的。
本发明涉及在HSV-1基因组的至少一个立即早期基因中包含突变的单纯疱疹病毒-1(HSV-1).这些病毒能感染，能对过度增殖的细胞产生致细胞病变，这些使得它们成为在治疗或诊断某些疾病中有用的治疗和诊断剂。在优选的实施方案中，病毒选择性的对混合的细胞群体中某一特定的细胞类型——过度增殖的细胞——产生致细胞病变作用，因此有利于将它们从总细胞群体中选择性的清除。由于它只处理病变的细胞，而对正常细胞没有明显的有害作用，因此，病毒的这一特性是特别有用的。过度增殖的细胞优选转化细胞或赘生性细胞，或者显示过度增殖性细胞生长的其它细胞。因此在治疗赘生物时这些病毒是有用的，例如优选导致赘生性细胞而不是正常细胞产生肿瘤消解或其它的致细胞病变作用。根据本发明，那些过度表达β-连环蛋白的细胞对这种病毒的致细胞病变和/或细胞裂解作用特别敏感。因此，这种病毒在治疗那些β-连环蛋白代谢缺陷的赘生性细胞时特别有用，也可以用于检测这样的缺陷。
本发明的一个优选的实施方案涉及治疗或预防赘生物的方法，该方法包括给赘生物施用一定量的有致细胞病变和/或裂解细胞作用的突变型人类单纯疱疹病毒，所述病毒并不产生由IE基因1编码的具有完全功能活性的野生型ICP0多肽。
本发明也涉及确定那些过度表达β-连环蛋白的细胞的方法，以任何有效的顺序实行的下述一或多个步骤，例如给上述细胞施用有效量的突变型人类单纯疱疹病毒，其中上述病毒不表达由IE基因1编码的具有完全功能活性的野生型ICP0多肽，以及确定上述细胞中致细胞病变作用和/或细胞裂解的出现情况，由此将所述细胞确定为过度表达β-连环蛋白。
任何赘生物都可以用这种病毒来治疗，只要它对病毒的致细胞病变和细胞裂解作用敏感。赘生物是否对这种病毒作用敏感可以用常规方法确定，如下面的实施例所示。例如，可将原代或已建立细胞系的细胞放在体外培养物中，并和各种量的病毒接触(如系列稀释)。感染之后几天，检验细胞的活力和/或死亡来确定细胞裂解是否出现。活力和/或细胞死亡检验可以用常规方法完成，如用Promega公司提供的商业试剂盒和cell titer96TM进行MTT检验。也可以参见Korneniewski，C.和Callewaert，D.M.(1983)J.Immunol.Methods64，313以及Decker，T和Lohmann-Matthes，M.L(1988)J.Immunol.Methods115，61。如实施例中所述，结肠癌细胞(包括结肠直肠癌，结肠腺癌等)是这种病毒的优选目标，因为它们对病毒的细胞裂解作用特别敏感。另外还有一些赘生物可以用这种病毒治疗，但并不仅仅限于这些，如前列腺，肺，胃，乳，子宫，卵巢，胰腺，膀胱，肾，脑，骨，血，口咽，头和颈部，食道，睾丸，宫颈，甲状腺，肾上腺赘生物，淋巴瘤，黑素瘤，白血病，骨髓瘤，何杰金病，癌症，绒毛膜癌，肉瘤，成神经细胞瘤，维尔姆斯氏瘤，良性肿瘤和癌前期的细胞。
由于一些未知的原因，过度增殖细胞，如赘生性细胞，如果它们表达的β-连环蛋白多肽的量超过了它们这一特定细胞类型的正常细胞的表达量，那么这些过度增殖的细胞将是本发明疱疹病毒的优选目标。这里所使用的术语“过度表达”的意思是死亡的目标细胞中β-连环蛋白的水平比同种细胞类型正常细胞中的高，比如高10％，20％，40％，50％，70％，90％，95％，99％，100％，200％。β-连环蛋白是一种涉及细胞粘连和信号传导的多肽。这里表明对IE1基因突变的细胞裂解作用的敏感性是和β-连环蛋白的表达水平相关联的。表达高水平的这种多肽的细胞对细胞裂解作用最敏感，而表达适度水平的细胞则对细胞裂解中度敏感。因此，赘生性细胞是否对根据本发明的病毒敏感可以通过一般的测定其β-连环蛋白的表达水平来确定。反过来，病毒敏感性也可以用来确定细胞是否过度表达这种多肽，其突变体。这并不排除那些对病毒敏感而不过量表达β-连环蛋白的细胞。
根据本发明，β-连环蛋白代谢缺陷的细胞也可以治疗。“缺陷型代谢”是指任何能导致β-连环蛋白多肽异常表达，特别是如上所述的过度表达的细胞机制。例如，β-连环蛋白基因以及调节它表达的基因中的突变，都能导致它的过度表达。β-连环蛋白的特定突变已经在人类赘生物中确定了。这些突变阻遏了APC对β-连环蛋白的下调。见Rubinfeld等人，Science，275：1790-1792，1997；Morin等人，Science，275：1787-1790，1997.β-连环蛋白也可以通过失活APC肿瘤抑制子或激活wnt-1信号通路的方式来致癌性的激活；这两种方式都调节β-连环蛋白。所有这三种机制都会导致β-连环蛋白多肽的过度表达。见，Polakis，Curr.Opinion Genet.Dev.，9：15-21，1999.因此本发明可以用来治疗在β-连环蛋白，wnt-1和APC基因中含有一个或多个突变的细胞，这些突变导致了过高的β-连环蛋白水平。本发明中有用的病毒优选是在某个立即早期(immediate early，IE)基因上含有突变，例如，非必需的IE基因，包括ICP0，ICP22，ICP47，ORF-P，ORF-0和US1.5而必需基因包括ICP4和ICP27。
优选的基因是编码Vmw110或ICP0多肽的IE基因1(IE-1)。这是一个含有775个氨基酸残基的磷酸化核蛋白，表观Mr为110K(Perry等人，J.Gen。Virol.，67：2365-2380，1986)。在HSV基因组中它有两个拷贝，但在体外细胞裂解感染中不是必需的。
在本发明的优选实施方案中，ICP0多肽并不是具有功能活性的野生型ICP0多肽。短语“不是具有功能活性的野生型多肽”是指该多肽基本上缺乏正常(野生型)多肽所显示的至少一种生物活性。已经认识到在某些情况下，IE-1基因产物可能会显示一些残留的活性，但仍具有裂解细胞的作用。因此，本发明包含了具有致细胞病变/细胞裂解作用，但ICP0活性比野生型病毒少，比如少50％，75％，90％，95％，99％等的HSV-1 IE-1突变体。
ICP0在许多体内和体外的方法中显示了一些生物活性，包括但不限于，在细胞裂解感染中激活病毒基因表达；使细胞从潜伏状态中再激活；和称为ND10的核结构，早幼粒红细胞白血病体(promyelocyticleukaemia bodies)或者PODS结合；和分裂和间期细胞的中心粒结合；在粗提物中与DNA结合；在感染的核中与染色体结合；结合在135kDa的细胞蛋白上；(Herpes Associated Ubiquitin SpecificProtease，HAUSP，(Meredith等人，Virology，200：457-469，1994)；同细胞周期蛋白D3(Kawaguchi等人，J.Virol.，71：7328-36。1997；VanSant，Proc.Natl.Acad.Sci.，96：8184-8189，1999)和EF1-Delta(Kawaguchi等人，J.Virol。，71：1019-1024，1997)相互作用。ICP0的缺失会导致增殖依赖的细胞裂解感染，这样显著的降低了ICP0突  变  体  启  动  有  成  效  的  感  染  的  可  能  性(Stow，J.Gen.Virol.，67(pt12)：2571-2585，1986；Sacks，J.Virol。，61：829-839，1987)。也可以参见Everett，J.Mol.Bio.，202：87-96，1988；Everett等人，EMBO Journal，18：1526-1538，1999。一个优选的活性是它具有从共表达的启动子上反式激活转录的能力。检验可以如Everett等人在J.Gen.Virol.，70：1185-1202，1989；Everett，J.Mol.Bio.，202：87-96，1988中描述的进行。例如，表达ICP0突变体的质粒可以和含有与可检测标记偶联的启动子的质粒共表达，该启动子可以是gD，pSV37/30，SVgD，SV40等。这些质粒可以在多种细胞系中共转染和共表达，这些细胞系包括BHK，Vero，293，A549，Hela，WSHela等。
细胞系和启动子序列的选择可以用传统方法确定。如Everett，J.Mol.Bio.，203：739-751，1988以及O’Hare和Hayward，J.Virol.，56：723-733，1985.典型的，启动子可以可操作的和编码可检测产物(如氯霉素乙酰转移酶)的编码序列连接在一起。如果DNA区域在功能上是相互联系的，那么它们就可操作的连接在一起。例如，启动子如果控制编码序列的转录，那么它们就可操作的连接在一起。当启动子或其它表达控制序列(包括增强子，核糖体结合位点，RNA聚合酶结合位点等)以影响或控制编码序列表达的方式定位时，它们就是可操作的与核苷酸编码序列连接。例如，当启动子可操作的连接在编码序列的5’时，编码序列的表达就由启动子来驱动。由ICP0引起的启动子序列的反式激活导致了可检测产物的表达，从而提供ICP0多肽具有功能活性的信号。ICP0和IE-3基因产物，Vmw175协同作用。因此，HSV-1突变体反式激活启动子的能力可以在有或没有Vmw175的情况下确定。见Everett，J.Mol.Bio.，202：87-96，1988。这里使用的术语“反式激活”指由调节基因编码的因子引起基因序列的激活，如IE-1，这些调节基因并不一定要和它所结合和激活的基因序列毗连。
根据本发明中提到的一个优选的病毒突变体是基本上缺少由IE-1基因编码的有完全功能活性的野生型ICP0多肽的病毒。该基因的功能失活可以通过任何能有效敲除(如剔除)IE-1基因的一个或多个功能的方式来完成。例如，野生型IE-1基因可以通过缺失或插入序列来进行修饰。一个优选的缺失是Stow，J.Gen.Virol.67：2571-2585，1986；Perry等人在J.Gen.Virol.67：2365-2380，1986中所述的d11403.另外一些突变以及制作它们的方法在Everett，J.Mol.Bio.，202：87-96，1988中有描述，特别是表1和表2，或者任何能减少或清除ICP0多种功能中的一种或多种的突变体。
根据本发明的病毒还可以在它的基因组中包含其它修饰。例如，它可以含有插入在IE-1基因中的附加DNA。这种插入能功能性失活IE-1基因，并导致细胞裂解的表型出现，或者它可以插入一个已经失活的基因中，或者替代一个被缺失的基因。
任何想要的DNA都可以插入，包括编码选择性标记的DNA，或者优选编码治疗性的具有生物活性蛋白质的基因，如干扰素，细胞因子，趋化因子，或者更优选编码前体药物转化酶的DNA，包括胸苷激酶(Martuza等人，science.252：854，1991)，胞嘧啶脱酰胺酶(U.S.专利号5358866)，cyp450(U.S.专利号5688773)，和其它。
编码具有医疗或生物活性蛋白质或其片断的基因的另一些实施例包括那些编码免疫调节蛋白的基因，例如白介素2(U.S.专利号4738927或5641665)；白介素7(U.S.专利号4965195，5328988)；白介素12(U.S.专利号5457038)；赘生物坏死因子α(U.S.专利号4677063或5773582)；干扰素γ(U.S.专利号4727138或4762791)；或者GM-CSF(U.S.专利号5393870或5391485)。另一些免疫调节蛋白包括巨噬细胞炎性蛋白，包括MIP-3(见Well，T.N.和Peitsch，MC.J.Leukoc.Biol Vol61(5)：pages545-50，1997)，和细胞自杀或凋亡诱导蛋白，包括BAD和BAX。见Yang，E.等人Cell，vol80，pages285-291(1995)；和Sandeep，R等人Cell vol91，pages231-241(1997)。单核细胞趋化蛋白(MCP-3α)也可以使用。一个优选的实施方案基因是嵌合基因，其包含编码跨细胞膜蛋白，如VP22或TAT的基因，以及和它融合在一起的编码优选对赘生性细胞有毒性而对正常细胞无毒的蛋白的基因。
另外，根据本发明的疱疹病毒除了IE-1之外，还可以在基因组的其它位点含有突变。
根据本发明的疱疹病毒可以以任何适合达到预期效果的方式施用，即在有效条件下施用。在优选的实施方案中，施用病毒来治疗赘生物。病毒通常以能在赘生性细胞中有效产生致细胞病变作用的量来施用，例如，能产生细胞裂解或肿瘤消解的量。术语“细胞裂解”或“肿瘤消解”的意思是病毒对过度增殖的目标细胞(如赘生性细胞)比对正常细胞优先产生分解(裂解)。因此，病毒对这种细胞是致细胞病变的。
完成裂解、肿瘤消解或其它治疗效果的有效量可以常规确定。如进行剂量响应实验，其中，对目标细胞施用不同剂量来确定能引起裂解的有效量。依据各种因素来选择用量，包括病毒施用的环境(如癌症患者，动物模型，组织培养细胞等)，被治疗细胞的位置，被治疗患者或动物的年龄、健康、性别、体重等。有效量包括例如105-1012pfu，最好是107-108pfu.
这里描述的HSV病毒突变体优选对赘生性细胞有致细胞病变或细胞裂解作用。因此，优选根据本发明的治疗能导致赘生性细胞的裂解。在这个意义上，治疗指通过清除赘生性细胞而改善了疾病。这种清除能引起赘生物消退。但是，治疗也可以使赘生物停止或减慢生长，而没有任何明显的消退。在本发明的优选方法中，在宿主(如有赘生物的人类，或移植有赘生性细胞的非人类哺乳动物，例如通过皮下或腹膜腔内将人类赘生性细胞注射入动物模型)中，病毒被用来通过裂解方法将赘生性细胞从正常群体中清除。
可以以任何适合达到治疗效果的方法施用病毒。例如，依据过度增殖目标细胞的位置，可以赘生物内的，局部的，经肠的，非肠道的，静脉内的，肌肉内的，皮下的，经口的，经鼻的，脑内的，心室内的将病毒直接注射入肿瘤或其附近。
本发明疱疹病毒可以以裸露DNA，病毒颗粒，在脂质体内或者和诸如磷酸钙、DEAE-葡聚糖复合体、脂质、聚合体等复合在一起的方式施用。见U.S.Pat.5,976,567和5,962,429。病毒可以在培养体系中以传统方式生产，并包装成成熟病毒颗粒，或者可以制备裸露的DNA并将其复合在任何合适的载体上，如上面所述的载体。根据本发明的疱疹病毒可以和任何能有效治疗赘生物或其它过度增殖性细胞生长的治疗手段配合施用，包括手术，放射和化学治疗剂，如烷化剂，(如顺铂)结构类似物或抗代谢物(如氨甲蝶呤)，激素剂(如他莫昔芬)，androcorticosteroids(如强的松)，aromatase抑制剂，GnRH类似物，生物反应修饰物(如干扰素)，肽类激素抑制物，天然产物(如长春花碱，丝裂霉素)等。见Current Medical Diagnosis andTreatment，Tierney等人主编，1997，pages：81-87.
药学可接受的载体或赋形剂可以用来传送病毒。可以使用多种水溶液，如水，缓冲液，0.4％的盐溶液，0.3％的甘氨酸蛋白质等等。这些溶液经过消毒，并且除了需要的疱疹病毒载体，通常不含有其它颗粒性物质。该组合物可以含有药物可接受的辅助性物质，用来维持大致生理条件，如调节pH的缓冲物质，毒性调节物质等，如醋酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙，乳酸钠等。能增进疱疹病毒感染细胞的赋形剂也可以包含在内。
可以以熟练操作人员熟知的方法进行化疗，包括系统性的直接注射入赘生物，或者将需要的化学治疗剂和合适的缓释材料相结合定位在赘生物的位置上，或者通过动脉内渗透入癌。优选的化学治疗剂是顺铂，优选的剂量可以由操作者根据要治疗癌的性质和在施用顺铂时通常要考虑的其它因素来选择。优选的是，顺铂在3-6小时内以50-120mg/m2的剂量静脉内施用。更优选的是，在4小时内以80mg/m2的剂量静脉内施用。优选和顺铂结合施用的第二种化学治疗剂是5-氟尿嘧啶。5-氟尿嘧啶的优选剂量是每天800-1200mg/m2，连续5天。
本发明还涉及到含有有效量的本发明疱疹病毒的药物组合物，例如其中病毒以适于治疗使用的形式存在。另外，本发明涉及含有能在所述赘生物中裂解细胞的突变型人类疱疹病毒的试剂盒和上面提到的化学治疗剂。，其中所述病毒并不产生由IE1基因编码的具有功能活性的野生型ICP0多肽
下面的实施例用来说明本发明，以及协助本领域普通技术人员实施和使用本发明。这些实施例并不试图以任何方式限制书面专利所确认的揭露或保护范围。
                     实施例
有报道指出HSV立即早期蛋白ICP0对生产性感染是非必需的(Stow，J.Gen.Virol，67(pt12)：2571-2585，1986，以及图1A所示。)。在正常的原代细胞(人类微脉管上皮细胞，真皮起源，HMVEC-d，图1C)中对ICP0病毒d11403的分析表明，同野生型(17+)病毒相比，病毒感染明显减弱(大约50倍)。
在几种细胞系上对d11403病毒进行肿瘤消解分析，表明除在结肠癌细胞系上外(图2)，这种病毒同野生型病毒相比一般都被减毒。但在结肠癌细胞系HT-29上，这种缺失型病毒的细胞裂解能力高于wt17+(图1B)。
在所检验的结肠癌细胞系中，d11403的肿瘤消解能力与β-连环蛋白的细胞水平相一致(图2)。例如，表达高水平的β-连环蛋白的SW620对d11403的细胞裂解十分敏感。表达适度水平的β-连环蛋白的CCL221，HT-29和SW480对d11403中度敏感(同17+相比)，而与17+相比，β-连环蛋白低于正常水平的RKO则对d11403的细胞裂解很不敏感(β-连环蛋白的水平在以前的研究中确定，Polakis，P.Biochim Biophy Acta.vol7：p1332(3)，1997；和Polakis，P.Curr.Opin.Genet Dev.vol.9(1)：p.15，1999)。结果，若将与17+相比d11403对正常细胞系的减毒(相对于17+为50倍)与该病毒对结肠癌细胞系的效力增加(相对于17+为10倍)联系起来，那么d11403对结肠癌细胞的体外治疗指数就是17+的500倍。
另外，动物实验表明，单剂量(1X106pfu)的17+赘生物内注射入裸鼠身上来源于SW620的异种移植赘生物会导致动物死亡(感染后(PI)11天20％死亡，图3A)。相反，这些动物能很好的忍受相似剂量的d11430(100％存活)(图3A)，另外，与没有治疗的动物相比，使赘生物减少50％(图3B)。
细胞培养，病毒学，核酸，多肽的另一些方面，可以参考标准书籍。见Davis等人(1986)，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevir Sciences Publishing，Inc.，New York；Hames等人.，CurrentProtocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人主编，JohnWiley& Sons，Inc；Current Protocols in Protein Science，JohnE.Coligan等人主编，John Wiley&Sons，Inc；Animal Cell culture，Freshney等人，IRL Press，1992；Basic cell culture protocols，Pollard and Walker，Humana Press，1997；General Techniques ofCell Culture，Harrison and Rae，Cambridge University Press，1997；Virus Culture，Cann主编，Oxford University Press，1999；Herpes SimplexVirus protocols，Brown and Maclean主编，HuamanaPress，1998。
即使没有进一步的阐述，相信本领域中的技术人员利用前面的描述，可以将本发明最大限度的使用。因此，前面的优选的特定实施方案应理解成仅仅是作为说明用，并不是以任何方式来限制公开的其它内容。
上面引用的以及图中的所有专利和出版物的公开内容都作为参考文献全文引入。
从前面的描述中，本领域的技术人员能很容易的确定本发明的基本特征，以及在不背离本发明精神和范围的前提下，对本发明进行各种改变和修改以使它能适用于多种用途和条件。

Claims (21)

1.在含有过度增殖细胞的细胞群体中治疗不需要的过度增殖性细胞生长的方法，包括：使所述过度增殖的细胞与一定量能裂解该细胞的突变型单纯疱疹病毒接触，其中所述病毒不产生由IE基因1编码的具有功能活性的野生型ICP0多肽。
2.权利要求1的方法，其中所述病毒在IE基因1中含有缺失。
3.权利要求2的方法，其中所述缺失位于IE基因1的区域1，2，3，4，或5。
4.权利要求1的方法，其中病毒是d11403.
5.权利要求1的方法，其中所述病毒在IE基因1中含有插入。
6.权利要求1的方法，其中所述ICP0多肽在转染检验中没有可检测的活性。
7.权利要求1的方法，其中所述细胞是赘生性细胞，并且该细胞和同类型的正常细胞相比过度表达β-连环蛋白。
8.权利要求1的方法，其中所述细胞在APC基因中含有突变。
9.权利要求7的方法，其中所述细胞在APC基因中含有突变。
10.权利要求1的方法，其中所述细胞在wnt-1基因中含有突变。
11.权利要求7的方法，其中所述细胞在wnt-1基因中含有突变。
12.权利要求1的方法，其中所述细胞在β-连环蛋白基因中含有突变。
13.权利要求7的方法，其中所述赘生性细胞在β-连环蛋白基因中含有突变。
14.权利要求7的方法，其中所述赘生性细胞选自结肠，结肠直肠或腺癌的组。
15.权利要求1的方法，其中所述赘生性细胞具有选自含SW620，CCL221，HT-29，或SW480之组的细胞的特征。
16.鉴定过度表达β-连环蛋白的细胞的方法，包括：
给所述细胞施用有效量的突变型人类单纯疱疹病毒，其中该病毒不产生由IE基因1编码的具有功能活性的野生型ICP0多肽，以及确定在所述细胞中裂解的出现，从而将所述细胞鉴定为过度表达β-连环蛋白。
17.权利要求16的方法，其中所述病毒在IE基因1中含有缺失。
18.权利要求17的方法，其中病毒是d11403.
19.包含突变型人类单纯疱疹病毒和无菌生理平衡溶液的药物组合物，其中所述病毒不产生由IE基因1编码的具有功能活性的野生型ICP0多肽。
20.如权利要求19所述的药物组合物，其中还含有化学治疗剂。
21.包含突变型的人类单纯疱疹病毒和化学治疗剂的试剂盒，其中所述病毒不产生由IE基因1编码的具有功能活性的野生型ICP0多肽。
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