JP2004065159A - 核酸増幅反応容器及びそれを用いた核酸の増幅方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ガラスや半導体により構成された反応容器を用いた場合であっても、容易に良好な核酸の増幅反応を行うことができる反応容器及びそれを用いた核酸の増幅方法を提供する。
【解決手段】サンプル中に含まれる核酸の増幅反応を行うための容器であって、基板と、基板上に形成されたキャビティと、キャビティを封止するための蓋板と、蓋板上に形成されたサンプル注入孔を有し、キャビティ及び蓋板の内面の少なくとも一部が疎水性である核酸増幅反応容器。
【選択図】　図１

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸の増幅反応を行うための容器及びそれを用いた核酸の増幅方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、遺伝子情報に関する技術が盛んに開発されている。医療分野では、疾患関連遺伝子を解析することにより、疾患の分子レベルでの治療が可能となってきている。また、遺伝子診断により、患者個人ごとに対応したテーラーメード医療も可能となってきた。製薬分野においては、遺伝子情報を使用して、抗体やホルモンなどのタンパク分子を特定し、薬品として利用している。農業や食品分野などにおいても、多くの遺伝子情報を利用した製品が作り出されている。
【０００３】
このような遺伝子情報に関する技術において最も重要な手法の一つとして、核酸の増幅反応がある。その中でもポリメラーゼ連鎖反応法は、遺伝子のある特定の部分のみを大量に増幅する技術であり、分子生物学等の研究用途の他、医療微生物学、遺伝疾患の臨床診断、法医学等、広範な分野において利用されている。特に臨床の場における遺伝子診断技術では、少ない検体量で、より多くの項目をよ迅速に分析できる事が望まれており、ポリメラーゼ連鎖反応法においても、検体量の微量化及び高速化技術の開発が要望されている。
【０００４】
ポリメラーゼ連鎖反応法については、例えば特開昭６２−２８１号公報に開示されている。ポリメラーゼ連鎖反応法によって遺伝子の増幅を行うためには、二本鎖のＤＮＡを一本鎖へと解離させる工程（熱変性）、プライマーを結合させる工程（アニーリング）、ポリメラーゼによりＤＮＡを伸長する工程（伸長反応）の三段階の工程を１サイクルとして、この工程を３０から３５サイクル繰り返すことによって行う。これらの工程は条件によっても異なるが、通常それぞれ熱変性９４℃×１分間、アニーリング５０〜６０℃×１分間、伸長反応７２℃×１〜５分間の条件で行うため、反応温度を複数回、昇温及び降温することが必要である。したがって、反応の高速化を実現するためには、熱伝導度の高い材料からなる反応容器を用い、検体（サンプル）の温度を急速に昇温及び降温することが望ましい。
【０００５】
これらの反応は、通常ポリプロピレン製のチューブ内で行われるが、ポリメラーゼ連鎖反応の高速化及びサンプルの微量化を目的として、ポリプロピレンよりも熱伝導度の高いガラス製のキャピラリー内や、ポリプロピレンよりも熱伝導度が高く、公知の技術により容易に微細加工が可能なシリコン等の半導体材料で作製されたチップ内でポリメラーゼ連鎖反応を行う技術も開発されている。
【０００６】
また、近年ではＬＡＭＰ法（国際公開第００／２８０８２号パンフレット参照）やＩＣＡＮ法（国際公開第００／５６８７７号パンフレット参照）といった新しい核酸の増幅方法も開発されている。いずれもプライマーの設計・構造が複雑であるという欠点はあるが、等温で増幅反応が行えるという利点もある。これらの方法においても、ポリメラーゼ連鎖反応法と同様に、サンプルの微量化を目的として、ガラスやシリコン等の半導体材料で作製された反応容器を用いることが検討されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、ポリプロピレン等の樹脂に比べ、ＤＮＡはガラス及び半導体には非常に吸着しやすい性質を持つ。そのため、ガラスまたは半導体を材料としたキャピラリーやチップなどを用いて核酸の増幅反応を行う場合、ガラスまたは半導体容器表面へのＤＮＡの吸着を押さえるため、サンプル中にウシ血清アルブミン等のタンパクを加える必要があった。サンプル中にタンパクを加えることにより、ＤＮＡのガラスまたは半導体への吸着は抑えられ、核酸の増幅反応は良好に進むが、増幅効率が落ちる、手順が煩雑になる、吸着防止用のタンパクが必要となることにより材料費が高くなる、といった問題点があった。
【０００８】
そこで本発明は、ガラスや半導体により構成された反応容器を用いた場合であっても、容易に良好な核酸の増幅反応を行うことができる反応容器及びそれを用いた核酸の増幅方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために、本発明の核酸増幅反応容器は、サンプル中に含まれる核酸の増幅反応を行うための容器であって、基板と、前記基板上に形成されたキャビティと、前記キャビティを封止するための蓋板と、前記蓋板上に形成されたサンプル注入孔を有し、前記キャビティ及び前記蓋板の内面の少なくとも一部が疎水性であることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明の核酸の増幅方法は、上記の核酸増幅反応容器を用い、前記核酸増幅反応容器のサンプル注入孔からキャビティ内にサンプルを注入する工程Ａと、前記キャビティ内の前記サンプル中に含まれる核酸の増幅反応を行う工程Ｂと、前記キャビティから前記サンプルを取り出す工程Ｃとを含むことを特徴とする。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００１２】
本発明の一実施の形態に係る核酸増幅反応容器は、サンプル中に含まれる核酸の増幅反応を行うための容器であって、基板と、前記基板上に形成されたキャビティと、前記キャビティを封止するための蓋板と、前記蓋板上に形成されたサンプル注入孔を有し、前記キャビティ及び前記蓋板の内面の少なくとも一部が疎水性であることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明の一実施の形態に係る核酸の増幅方法は、上記の核酸増幅反応容器を用い、前記核酸増幅反応容器のサンプル注入孔からキャビティ内にサンプルを注入する工程Ａと、前記キャビティ内の前記サンプル中に含まれる核酸の増幅反応を行う工程Ｂと、前記キャビティから前記サンプルを取り出す工程Ｃとを含むことを特徴とする。
【００１４】
以上のようにすると、サンプル中に含まれる核酸のキャビティ及び蓋板内面への付着を低減することができるので、サンプル中に吸着防止用のタンパクを加える必要がなく、ガラスや半導体により構成された反応容器を用いた場合であっても、容易に良好な核酸の増幅反応を行うことができる。
【００１５】
本発明において用いられる核酸の増幅反応としては特に限定されず、ポリメラーゼ連鎖反応法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法等を用いることができる。この中でも、核酸の増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応であると、プライマーの設計・構造が容易であるため好ましい。また、ポリメラーゼ連鎖反応においてはサンプルの温度を変化させる必要があるので、サンプル中に含まれるＤＮＡが反応容器に吸着しやすいため、本発明はポリメラーゼ連鎖反応を用いる場合において特に有効である。
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について図面を用いてさらに詳細に説明する。図１は、本発明の一実施の形態に係るである核酸増幅反応容器の構造を示す分解斜視図である。
【００１７】
図１に示すように、本発明による核酸増幅反応容器では、少ないサンプル量であっても精度良く調整できるように、また温度の上昇・下降が速やかに行われるように、基板１上にキャビティ２を形成して作製され得る。
【００１８】
本発明による核酸増幅反応容器に用いられる基板１は、サンプル液と反応しなければどのような材料でもよく、シリコン、ゲルマニウム等の半導体、石英ガラス、鉛ガラス、ホウ珪酸ガラスなどのガラス、セラミック等を使用することができる。基板１上に形成されるキャビティ２の形成方法は、基板１がシリコン等の半導体であれば、ＲＩＥ等のドライエッチングや強アルカリ性のエッチング液等を用いたウェットエッチングを用いることができ、ガラスであれば、フッ酸等を用いたウェットエッチングを用いることができる。中でも、基板１としてシリコン等の半導体を用いれば、半導体分野において公知である微細加工技術を利用し、微小なキャビティを精度良く加工することができるので好ましい。
【００１９】
こうして形成したキャビティ２は、反応中にサンプルが流出しないよう適当な材質を用いた蓋板３で封止される。蓋板３の材質は、基板１の材質と同様のものを用いることができるが、基板１と完全に接着もしくは密着し、キャビティ２内部のサンプルを封止することが好ましい。例えば、基板１がシリコン、蓋板３がガラスの場合、陽極接合、直接接合等の技術を用いて封止することができる。その他、基板１及び蓋板３が双方ともガラスの場合は、フッ酸接合の技術を用いた接着等により封止することも可能である。
【００２０】
蓋板３にはキャビティ２内部にサンプルを注入するためのサンプル注入孔４が設けられている。サンプル注入孔４は少なくとも１つあれば良いが、２つ以上設けておくと、サンプルの注入時に用いたもの以外のサンプル注入孔４がキャビティ２内部の空気の逃げ道として機能し、サンプルを速やかに注入することができるので好ましい。サンプル注入孔４は、サンプルを注入した後は耐熱性テープなどを用いて封止され、核酸の増幅反応中にサンプルがサンプル注入孔４から漏出または気化することを防ぐ効果を有する。
【００２１】
このように作製した核酸増幅反応容器の内面を疎水性にする処理を施すことによって、サンプルにウシ血清アルブミン等のタンパクを加えることなく、核酸の増幅反応を良好に行うことができる。疎水性にする処理は、特に基板１もしくは蓋板３の材料としてガラスを用いたときに効果的である。疎水性にする処理としては、キャビティ２及び蓋板３の内面の少なくとも一部を疎水性の膜により被覆する方法が挙げられる。
【００２２】
疎水性の膜としては、処理後のキャビティ２及び蓋板３内面がサンプルと反応せず、９５℃程度の温度上昇に耐え得るものであれば特に限定されないが、フッ素化合物を含むもの、もしくはシリコン化合物を含むものであると、疎水性の効果が高いため好ましい。
【００２３】
フッ素化合物としては、フッ化炭素を利用することができる。上記の基板１と蓋板３とを組み合わせた核酸増幅反応容器を、フッ化炭素ガス雰囲気中に設置し、プラズマを発生させることによりプラズマ処理を行うと、核酸増幅反応容器の外壁のみでなく、キャビティ２及び蓋板３内面までフッ化炭素膜が形成され、キャビティ２及び蓋板３内部が疎水性となる。また、フッ素系シランカップリング材を用いてもフッ素化合物を含む疎水性の膜を形成することができる。
【００２４】
一方、シリコン化合物を含む疎水性の膜は、シリコナイズ処理によって形成し得る。シリコナイズ液としては、例えばＳＩＧＭＡＣＯＴＥ（登録商標、シグマ製）を用いることができる。デシケータ内に核酸増幅反応容器とシリコナイズ液とを入れ、デシケータ内を真空に吸引することにより、シリコナイズ液が気化し、シリコン化合物の蒸気が、核酸増幅反応容器外壁と、キャビティ２及び蓋板３内面とにまで付着して疎水性の処理を行うことができる。また、サンプル注入孔４からキャビティ２内部に直接シリコナイズ液を注入し、蒸留水で洗い流すことによっても、キャビティ２及び蓋板３内面の疎水性の処理を行うことができる。
【００２５】
このようにして、キャビティ２及び蓋板３の内面の少なくとも一部が疎水性である核酸増幅反応容器を用いて核酸の増幅反応を行うことにより、ＤＮＡがキャビティ２及び蓋板３の表面に吸着することを防ぎ、サンプルにウシ血清アルブミン等のタンパクを加えることなく、容易に良好な核酸の増幅反応を行うことができる。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明の一実施の形態に係る核酸増幅反応容器を用いて、核酸の増幅反応としてポリメラーゼ連鎖反応を行った実施例について説明する。
【００２７】
基板１として厚さ５００μｍのシリコン単結晶板を用いて、核酸増幅反応容器であるポリメラーゼ連鎖反応容器を作製した。
【００２８】
まず、表面が鏡面処理された厚みが５００μｍのシリコン単結晶板と厚みが４００μｍのガラスを用意し、シリコン単結晶板に六フッ化硫黄を用いたドライエッチングによって、６ｍｍφのキャビティ２を形成した。エッチング深さは、１７０μｍとした。
【００２９】
次に、蓋板３となるガラスに、サンドブラストによってサンプル注入孔４となる０．６ｍｍφの穴を２箇所開けた。
【００３０】
次に、シリコン単結晶板とガラスとを、酸性洗浄剤を用いて表面を洗浄し、互いの間に空気が入らないように張り合わせた後、３００℃で３時間加熱することによって、接着剤を用いない直接接合によってシリコン単結晶板からなる基板１とガラスからなる蓋板３とを接着した。最後に８ｍｍ×１６ｍｍに切り出して、チップ状のポリメラーゼ連鎖反応容器とした。
【００３１】
このようにして作製したポリメラーゼ連鎖反応容器をチャンバー内に入れた後、チャンバー内を減圧雰囲気にして、その後Ｃ_４Ｆ_８ガスを流して約１０〜５０ｍｔｏｒｒの一定の圧力になるようにした状態で、チャンバー外部に設置したコイルに高周波電力を印加することでプラズマを発生させて、ポリメラーゼ連鎖反応容器内外表面にＣＶＤによるＣＦ_２膜を形成した。プラズマを発生させる手段としては、他にチャンバー内部あるいは周辺に設置した電極に高周波電力を印加させてもよいが、チャンバー外部に設置したコイルによる誘導プラズマを用いることが好ましい。これは誘導プラズマによって発生したプラズマでは、基板にバイアスが発生しないので、基板にイオン衝撃を与えることが少なく、ポリメラーゼ連鎖反応容器内の微小な内部にも均一にＣＦ_２膜が形成されるからである。なお、処理時間は３分〜６分とした。
【００３２】
純水接触角による疎水性（撥水性）評価では、処理前のシリコンの接触角は４８°、ガラスの接触角は３５°であったのに対し、処理後の接触角はそれぞれ１０８°、及び１０６°となった。この容器をＣＦ_２＋容器とした。比較例として、疎水性の処理を施さないポリメラーゼ連鎖反応容器を用意し、この容器をＣＦ_２−容器とした。
【００３３】
ポリメラーゼ連鎖反応は、テンプレートとしてλＤＮＡ（寳酒造製）（λＤＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｖ００６３６，Ｊ０２４５９，Ｍ１７２３３，Ｘ００９０６を参照）を用いた。プライマーとしてＴａＫａＲａ　ポリメラーゼ連鎖反応　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（寳酒造製）のＣｏｎｔｒｏｌ　Ｐｒｉｍｅｒ１（５’−ＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴ−３’）及びＰｒｉｍｅｒ３（５’−ＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＧＣＣ−３’）を用いて実験を行った（５００ｂｐ増幅用）。２．５Ｕ／μｌ　ＴａＫａＲａ　Ｚ−Ｔａｑ　０．５μｌ、１０×Ｚ−Ｔａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ　５μｌ、２．５ｍＭ　ｅａｃｈ　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　４μｌ、２０ｐｍｏｌ／μｌ　Ｐｒｉｍｅｒ１及びＰｒｉｍｅｒ３　各２．２５μｌ、０．２５μｇ／μｌ　ウシ血清アルブミン２μｌを加えた後、１０ｎｇ／μｌ　λＤＮＡ　５μｌを加え蒸留水２９μｌを加えて総量を５０μｌとした。このサンプルをＢＳＡ＋サンプルとした。一方、ウシ血清アルブミン２μｌを加えず、蒸留水を３１μｌ加えたサンプルも調製した。このサンプルをＢＳＡ−サンプルとした。
【００３４】
上記で調製した２種類のサンプルを、本実施例のＣＦ_２＋容器及び比較例のＣＦ_２−容器にそれぞれ５μｌ、コントロールとして０．５ｍｌポリプロピレンチューブに２０μｌ注入し、サンプル注入孔４を耐熱性テープで封止した。
【００３５】
ポリメラーゼ連鎖反応は、アルミブロック式のサーマルサイクラーを用いて、９８℃１分、５５℃１分、７２℃２０秒で３０サイクル行った。トータルの反応時間は８０分であった。
【００３６】
ポリメラーゼ連鎖反応終了後、１．５ｍｌ遠心チューブ内に容器を挿入し、１０ｋｒｐｍの回転数で１分間遠心処理を行うことにより、容器からサンプルの回収を行った。回収したサンプルは、アガロースゲル電気泳動を行い、ポリメラーゼ連鎖反応により目的の５００ｂｐが増幅されているかどうかを確認した。
【００３７】
図２に、ポリメラーゼ連鎖反応の結果を表す電気泳動写真を示す。図中、Ａはマーカー（分子量マーカー）の場合、Ｂは容器が従来のポリプロピレンチューブ、サンプルがＢＳＡ−サンプルの場合、Ｃは容器が本実施例のＣＦ_２＋容器、サンプルがＢＳＡ＋サンプルの場合、Ｄは容器が本実施例のＣＦ_２＋容器、サンプルがＢＳＡ−サンプルの場合、Ｅは容器が比較例のＣＦ_２−容器、サンプルがＢＳＡ＋サンプルの場合、Ｆは容器が比較例のＣＦ_２−容器、サンプルがＢＳＡ−サンプルの場合を示す。また、矢印で示した部分が目的の増幅産物である。
【００３８】
図２から分かるように、本実施例のポリメラーゼ連鎖反応容器を用いた場合では、ウシ血清アルブミンの有無に関わらず、従来法によるポリメラーゼ連鎖反応（図中Ｂの場合）と同様に目的のＤＮＡが増幅されていることが確認できた（図中Ｃ及びＤの場合）。一方、比較例のポリメラーゼ連鎖反応容器では、ウシ血清アルブミンの存在下では増幅物が確認されたが（図中Ｅの場合）、ウシ血清アルブミンの存在無しでは、増幅物は確認できなかった（図中Ｆの場合）。よって、半導体及びガラスにより構成された反応容器を用いた場合であっても、吸着防止用のタンパク質を用いることなく、容易に良好な核酸の増幅反応を行うことができた。
【００３９】
なお、本実施例では、シリコン単結晶板とガラスとを、互いの間に空気が入らないように張り合わせた後、３００℃で３時間加熱し、直接接合によってシリコン単結晶板からなる基板１とガラスからなる蓋板３とを接着したが、加熱するときの温度はガラスの材質によって変えれば良い。ナトリウム、カリウムなどを含むガラスであれば２５０℃で、これらを含まないガラスであれば４００℃程度まで上げる。また、ガラスの材質は石英ガラスのように不純物を含まないものでも可能である。この場合はさらに温度を５００℃以上に上げる。さらに、蓋板材料はシリコン単結晶板でも可能である。この場合はキャビティ２を形成したシリコン単結晶板とサンプル注入孔４を形成したシリコン単結晶板とを直接接合によって張り合わせる。張り合わせ時の温度は５００℃以上にすればよい。
【００４０】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、ガラスや半導体により構成された反応容器を用いた場合であっても、容易に良好な核酸の増幅反応を行うことができる反応容器及びそれを用いた核酸の増幅方法を提供することができる。
【００４１】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態における核酸増幅反応容器の構造を示す分解斜視図
【図２】本発明の一実施例及び比較例の核酸増幅反応容器を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った際の増幅産物の結果を示す電気泳動写真を示す図
【符号の説明】
１　基板
２　キャビティ
３　蓋板
４　サンプル注入孔

Claims (9)

1. サンプル中に含まれる核酸の増幅反応を行うための容器であって、基板と、前記基板上に形成されたキャビティと、前記キャビティを封止するための蓋板と、前記蓋板上に形成されたサンプル注入孔を有し、前記キャビティ及び前記蓋板の内面の少なくとも一部が疎水性であることを特徴とする、核酸増幅反応容器。
2. 核酸の増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応であることを特徴とする、請求項１記載の核酸増幅反応容器。
3. 基板が、半導体により構成されることを特徴とする、請求項１または２記載の核酸増幅反応容器。
4. 蓋板が、ガラスにより構成されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸増幅反応容器。
5. キャビティ及び蓋板の内面の少なくとも一部が、疎水性の膜により被覆されていることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸増幅反応容器。
6. 疎水性の膜がフッ素化合物を含むことを特徴とする、請求項５記載の核酸増幅反応容器。
7. 疎水性の膜がシリコン化合物を含むことを特徴とする、請求項５記載の核酸増幅反応容器。
8. 請求項１記載の核酸増幅反応容器を用い、前記核酸増幅反応容器のサンプル注入孔からキャビティ内にサンプルを注入する工程Ａと、前記キャビティ内の前記サンプル中に含まれる核酸の増幅反応を行う工程Ｂと、前記キャビティから前記サンプルを取り出す工程Ｃとを含むことを特徴とする、核酸の増幅方法。
9. 核酸の増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応であることを特徴とする、請求項８記載の核酸の増幅方法。

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