JP2003014685A

JP2003014685A - バイオセンサおよびその製造方法

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Publication number: JP2003014685A
Application number: JP2001203954A
Authority: JP
Inventors: Yoshiko Miyamoto; 佳子宮本; Tomohiro Yamamoto; 智浩山本; Yoshikazu Hasegawa; 美和長谷川; Kiichi Watanabe; 基一渡邊; Toshihiko Yoshioka; 俊彦吉岡
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2001-07-04
Filing date: 2001-07-04
Publication date: 2003-01-15

Abstract

(57)【要約】【課題】生体成分中の特定基質濃度を短時間で正確に
測定するため、酵素を含む反応層を薄膜にしたバイオセ
ンサを提供する。【解決手段】本発明に係るバイオセンサは、電気絶縁
性の基板、前記基板上に形成された作用極および対極を
有する電極系、並びに前記電極系上またはその近傍に形
成された少なくとも酵素を含む反応層を具備する。そし
て、この反応層は、これを構成する試薬の溶液をエレク
トロスプレー法によって、電気絶縁性の基板上の電極系
上またはその近傍に、吹き付けて形成する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血液、尿などの生
体試料、食品工業における原料や製品、さらには果汁な
どの試料に含まれる基質（特定成分）を高精度で、迅速
かつ容易に定量するためのバイオセンサおよびその製造
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体試料および食品中の特定成分（基
質）を試料液の希釈および撹拌などを行うことなく、簡
易に定量しうるバイオセンサが提案されている。その一
例として、特開平３−２０２７６４号公報には、絶縁性
基板上にスクリーン印刷などの方法によって電極系を形
成し、この電極系上に酸化還元酵素および電子伝達体を
含有する反応層を形成したバイオセンサが開示されてい
る。

【０００３】このバイオセンサは、以下のようにして試
料中の基質濃度を定量する。まず、試料液をバイオセン
サの反応層上に滴下することにより、反応層が溶解し、
試料液中の基質と反応層の酸化還元酵素との間で酵素反
応が進行する。この酵素反応に伴い、電子伝達体が還元
される。一定時間後、センサの電極に電圧を印加して、
この還元された電子伝達体を電気化学的に酸化し、この
とき得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度を定量
することができる。この主の構成のバイオセンサの反応
層に含まれる酵素の量は、反応層の作製方法がいわゆる
ディップ法を用いることが多く、薄膜として作製するこ
とが困難であった。また、作製した層が不均一になるこ
とを避けるのが困難であった。従って、反応層中に存在
する酵素量は、定量する試料に含まれる基質量と比較し
て過剰であった。また、反応層に含まれる試薬の量が多
いため、試薬層の溶解に時間がかかるという欠点があっ
た。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記のよう
な問題点を解決するもので、均一な薄膜を作製すること
により、反応層における酵素反応をより有効に利用する
バイオセンサを提供することを目的とする。本発明は、
そのようなバイオセンサの製造方法を提供することをも
目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するた
め、本発明のバイオセンサは、電気絶縁性の基板、前記
基板上に形成された作用極および対極を有する電極系、
並びに前記電極系上またはその近傍に形成された少なく
とも酵素を含む反応層を具備し、前記反応層がエレクト
ロスプレー法によって形成された薄膜からなることを特
徴とする。本発明は、また、電気絶縁性の基板、前記基
板上に形成された作用極および対極を有する電極系、並
びに前記電極系上またはその近傍に形成された少なくと
も酵素を含む反応層を具備し、前記反応層の最上層が前
記酵素を含み、当該最上層がエレクトロスプレー法によ
って形成された薄膜からなるバイオセンサを提供する。
前記反応層またはその最上層の厚みは、１０ｎｍから１
０００ｎｍであるのが好ましい。本発明は、作用極およ
び対極を含む電極系を有する電気絶縁性の基板上の前記
電極系上またはその近傍に、少なくとも酵素を含む溶液
をエレクトロスプレー法によって吹き付けて、薄膜の反
応層を形成する工程を有することを特徴とするバイオセ
ンサの製造方法に関する。本発明は、作用極および対極
を含む電極系を有する電気絶縁性の基板上の前記電極系
上またはその近傍に、親水性高分子または電子伝達体を
含む層を形成する工程、および前記の層の上に、少なく
とも酵素を含む溶液をエレクトロスプレー法によって吹
き付けて、薄膜の反応層を形成する工程を有することを
特徴とするバイオセンサの製造方法にも関する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明に係るバイオセンサは、電
気絶縁性の基板、前記基板上に形成された作用極および
対極を有する電極系、並びに前記電極系上またはその近
傍に形成された少なくとも酵素を含む反応層を具備す
る。そして、この反応層は、これを構成する試薬の溶液
をエレクトロスプレー法によって、電気絶縁性の基板上
の電極系上またはその近傍に、吹き付けて形成する。前
記反応層は、電子伝達体を含むのが好ましい。本発明の
他の実施の形態においては、反応層を形成する試薬の一
部、例えば電子伝達体、または親水性高分子を含む溶液
を電極系上またはその近傍に、滴下するなどによって展
開し、乾燥して第１の層を形成した後、その第１の層上
に酵素を含む溶液をエレクトロスプレー法によって吹き
付け、乾燥して酵素を含む第２の層を形成する。第１の
層は、エレクトロスプレー法によって形成してもよい。

【０００７】上記のように、本発明は、酵素を含む層を
エレクトロスプレー法によって薄膜として形成するもの
である。反応層を複数の層で構成する場合は、酵素を含
む層を最上層とする。これによって、センサに試料液を
供給した際、酵素が優先的に試料液に溶解し、酵素反応
が速やかに進行する。

【０００８】ここで、エレクトロスプレー法は、質量分
析などで用いられるエレクトロスプレーイオン化法を応
用したものであり、酵素や電子伝達体などの反応層に包
含させる化合物を含む溶液を電場を用いて吹き付ける方
法である。エレクトロスプレー法を用いて反応層を形成
することによって、反応層を構成する各成分を均一に、
かつ薄膜状に塗布することが可能になり、センサの反応
層の溶解性および酵素と電子伝達体の反応性が向上させ
ることができる。

【０００９】本発明において用いられる酵素としては、
グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナー
ゼ、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、フルク
トースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コ
レステロールデヒドロゲナーゼ、コレステロールエステ
ラーゼ、ムタロターゼ、インベルダーゼ、アスコルビン
酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼなどが挙げら
れる。これらの酵素のうち１種または２種以上を混合し
て用いることもできる。本発明のバイオセンサの反応層
は、前記の通り電子伝達体を含ませても良い。この場
合、電子伝達体としては、フェリシアン化物塩、ｐ−ベ
ンゾキノンおよびその誘導体、フェナジンメトサルフェ
ート、メチレンブルー、フェロセンおよびその誘導体な
どが挙げられる。電子伝達体は、これらの１種または２
種以上が用いられる。前述の電子伝達体を反応層中に含
まない場合には、溶液中の酸素や過酸化酸素を利用する
ことによって基質量の定量は可能となる。

【００１０】エレクトロスプレー法を用いる溶液の酵素
や電子伝達体を溶解する溶媒は、水、リン酸緩衝液、ト
リス塩酸緩衝液、フタル酸緩衝液、酢酸緩衝液、塩化ナ
トリウム水溶液などの各種水溶液、あるいはメタノー
ル、エタノール、トルエン、アセトンなどの有機溶媒か
ら選ばれる、１種または２種以上の混合溶液であること
が好ましい。本発明のバイオセンサの反応層には、上記
酵素類や電子伝達体の他に、親水性高分子を含有させて
もよい。反応層中に親水性高分子を添加することによ
り、基板または電極系表面からの反応層の剥離を防ぐこ
とができる。親水性高分子は、反応層表面の割れを防ぐ
効果も有しており、バイオセンサの信頼性を高めるのに
効果的である。また、電極系上を親水性高分子で被覆し
ても良く、上記と同様の効果が得られる。

【００１１】このような親水性高分子としては、カルボ
キシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、
ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エ
チルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、
カルボキシメチルエチルセルロース、ポリビニルピロリ
ドン、ポリビニルアルコール、ポリリジンなどのポリア
ミノ酸、ポリスチレンスルホン酸、ゼラチンおよびその
誘導体、アクリル酸またはその誘導体、無水マレイン酸
またはその塩の重合体、スターチおよびその誘導体など
が挙げられる。特に、カルボキシメチルセルロースが好
ましい。酸化電流の測定方法としては、測定極と対極の
みの二電極方式と、参照電極を加えた三電極方式があ
り、三電極方式の方が、より正確な測定が可能である。

【００１２】

【実施例】以下に、具体的な実施例を挙げて、本発明を
詳細に説明する。図１は、本発明によるバイオセンサの
反応層を取り除いた分解斜視図である。１はポリエチレ
ンテレフタレートからなる絶縁性の基板を示す。この基
板１上には、スクリーン印刷により銀ペーストを印刷し
てリード２、３を形成してある。基板１上には、さら
に、同様の印刷法により、樹脂バインダーを含む導電性
カーボンペーストからなる作用極４および対極５を含む
電極系、並びに電気絶縁性ペーストからなる電気絶縁層
６を形成してある。電気絶縁層６は、作用極４及び対極
５の露出部分の面積を一定とし、かつリードを部分的に
覆っている。上記リードおよび電極の材料としては、銀
やカーボン以外にも、白金、金、およびパラジウムなど
が用いられる。図２は上記のバイオセンサの縦断面略図
である。

【００１３】図１のようにして電極系を形成した絶縁性
基板１上に、酵素と電子伝達体を含む反応層７が形成さ
れる。この絶縁性基板１に、カバー９、および基板１と
カバー９の間に挟まれるスペーサ８を、図１の一点鎖線
で示すような位置関係をもって接着させることによりバ
イオセンサが組み立てられる。スペーサ８には、試料液
供給路を形成するスリット１０が形成され、カバー９に
は空気孔１１が形成されている。基板１、カバー９およ
びスペーサ８を組み合わせると、基板１とカバー９の間
には、試料供給路となる空間部が形成される。この空間
部は、スリット１０の解放端部１２が試料供給口とな
り、終端部は空気孔１１となる。

【００１４】ここでは、カバー９とスペーサ８の組み合
わせでカバー部材を構成しているが、スペーサ８のスリ
ット１０に相当する溝を設けた１つの部材で構成するこ
ともできる。また、反応層は、必ずしも電極系上に形成
する必要はなく、試料供給路内に露出する部分に形成さ
れていれば良く、試料液は反応層を溶解して電極系上に
達する構成であればよい。

【００１５】《実施例１》図１の基板１の電極系上に、
フェリシアン化カリウムとグルコースオキシダーゼ（Ｅ
Ｃ１．１．３．４：以下ＧＯＤと略す）を含む水溶液を
エレクトロスプレー法によって吹き付け、乾燥させて反
応層７を形成した。このエレクトロスプレー法は、以下
のようにして実施した。基板１をこれより大きい金属板
電極上にセットし、基板１の電極系の上方に、前記溶液
を噴出させるためのノズルをセットし、ノズル内の針状
電極を負にして金属板電極との間に３ｋＶの電圧を印加
して１０秒間前記水溶液をノズルから基板１の電極系上
に吹き付け、次いで乾燥させた。このようにして形成さ
れた反応層７に含まれるフェリシアン化カリウムの量
は、１平方センチメートルあたり０．１ｍｇであり、Ｇ
ＯＤの量は５μｇであった。また、形成した薄膜反応層
の厚みは１００ｎｍであった。

【００１６】次に、図２に示したような位置関係をもっ
て、センサを組み立て、グルコースセンサとしての特性
評価を行った。グルコースを含む試料液が反応層７に供
給されると、試料液内のグルコースは、ＧＯＤによって
酸化される。そして、これと同時に反応層中の電子伝達
体が還元される。続いて、試料液を供給して５５秒後に
対極５を基準にして作用極４に＋０．５Ｖの電圧を印加
して電子伝達体の還元体を酸化した。そして、５秒後の
電流値を測定した。この場合の測定時間、すなわち試料
を供給してから酸化電流値の測定までの時間を１分とす
る。この電流値は、生成した電子伝達体の濃度、すなわ
ち試料液中の基質濃度に比例するので、この電流値を測
定することにより、試料液のグルコース濃度を求めるこ
とができる。０、１８０、３６０、および５４０ｍｇ／
ｄｌの各グルコース濃度の試料を用意し、測定時間を３
０秒とした場合のそれぞれに対するセンサの応答電流値
を測定した結果、応答電流値とグルコース濃度との間に
は一定の相関性があり、良好な直線性を示した。また、
測定時間を１０秒とした場合にも、応答電流値とグルコ
ース濃度の関係は良好な直線性を示した。

【００１７】《実施例２》フェリシアン化カリウムを含
む水溶液を調製し、これを電極上に滴下し、乾燥する方
法で第一の層を電極系上に形成した。この第一の層に含
まれるフェリシアン化カリウムの量は１平方センチメー
トルあたり１ｍｇであった。次に、ＧＯＤ水溶液を調製
し、この水溶液を実施例１と同様なエレクトロスプレー
法によって第一の層上に吹き付け、乾燥させて第二の層
を形成した。ただし、印加電圧は２．５ｋＶ、吹き付け
時間は２．５秒とした。この第２の層に含まれるＧＯＤ
の量は、反応層１平方センチメートルあたり１μｇであ
った。作製した薄膜の第２の層の厚みは、２０ｎｍであ
った。実施例１と同様の方法でグルコース標準液に対す
るセンサ応答電流値を測定した結果、測定時間が３０秒
および１０秒のいずれにおいても応答電流値はグルコー
ス濃度に対し良好な直線性を示した。

【００１８】《比較例１》フェリシアン化カリウムとＧ
ＯＤを含む水溶液を電極上に滴下し、乾燥させて反応層
を形成した。この反応層に含まれるフェリシアン化カリ
ウムの量は１平方センチメートルあたり１ｍｇであり、
ＧＯＤの量は、５０μｇであった。作製した反応層の厚
みは、２０μｍであった。実施例１と同様の方法でグル
コース標準液に対するセンサ応答電流値を測定した結
果、測定時間を３０秒とした場合には応答電流値とグル
コース濃度との関係は良好な直線性を示した。しかし、
測定時間を１０秒とした場合には、応答電流値とグルコ
ース濃度との関係は、高濃度域において直線性を示さな
かった。

【００１９】《実施例３》実施例２と同様に、フェリシ
アン化カリウムを含む第１の層を形成した。次に、コレ
ステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼ
を含む水溶液を調製し、その溶液をエレクトロスプレー
法によって上記の第１の層上に吹き付けてから乾燥さ
せ、第２の層を形成した。この場合の印加電圧は２ｋ
Ｖ、吹き付け時間は２０秒とした。この第２の層７ｂに
含まれる酵素の量は、反応層１平方センチメートルあた
り、コレステロールオキシダーゼは２０μｇ、コレステ
ロールエステラーゼは５０μｇであった。第２の層の薄
膜の厚みは、１５０ｎｍであった。

【００２０】グルコースセンサの場合と同様の方法でコ
レステロールセンサを作製し、コレステロールを含む試
料液に対するセンサ応答電流値を測定した結果、測定時
間３分における応答電流値はコレステロール濃度に対し
良好な直線性を示した。また、測定時間１分においても
コレステロール濃度に対し良好な直線性を示した。

【００２１】《比較例２》図１の基板１の電極系上に、
フェリシアン化カリウムとコレステロールオキシダーゼ
とコレステロールエステラーゼの混合水溶液を滴下し、
乾燥させて反応層７を形成した。この層７に含まれるフ
ェリシアン化カリウムの量は反応層１平方センチメート
ルあたり１ｍｇであり、コレステロールオキシダーゼの
量は０．１ｍｇ、コレステロールエステラーゼの量は
０．５ｍｇであった。反応層の厚みは、５０μｍであっ
た。次に、実施例３と同様の方法でセンサの応答電流値
を測定した。その結果、測定時間３分においては、応答
電流値とコレステロール濃度との間には一定の相関性が
あり、良好な直線性を示した。この応答直線性は実施例
１で示したものとほぼ同じであった。しかしながら、測
定時間１分では良好な応答直線性を示さなかった。

【００２２】《実施例４》白金で作られた電極系上に、
グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）を含む水溶液をエレ
クトロスプレー法によって吹き付け、乾燥させて反応層
７を形成した。印加電圧２ｋＶで５秒間吹き付けて形成
した反応層７に含まれるＧＯＤの量は３μｇであった。
また、形成した薄膜反応層の厚みは５０ｎｍであった。
この電極系上にグルコースを含む試料液を供給すると、
試料液内のグルコースは、ＧＯＤによって酸化され過酸
化水素を形成する。そこで、試料液を供給して１０秒後
に対極５を基準にして作用極４に＋１．０Ｖの電圧を印
加して、５秒後の電流値を測定した。この電流値は、試
料液中の基質濃度に比例するので、この電流値を測定す
ることにより、試料液のグルコース濃度を求めることが
できる。０、１８０、３６０、および５４０ｍｇ／ｄｌ
の各グルコース濃度の試料を用意し、測定時間を３０秒
とした場合のそれぞれに対するセンサの応答電流値を測
定した結果、応答電流値とグルコース濃度との間には一
定の相関性があり、良好な直線性を示した。測定時間を
１０秒とした場合にも、応答電流値とグルコース濃度の
関係は良好な直線性を示した。

【００２３】エレクトロスプレー法を用いた反応層形成
法は、ディップ法による形成法と比較して薄膜化が可能
である。そのため、反応層に含まれる酵素を含む試薬の
溶解がスムーズになる。その結果、測定時間の短縮が可
能とある。薄膜の厚みは、１０ｎｍ以下は均一な膜を作
製するのが困難である。また、作製できたとしても、そ
こに含まれる試薬量が不十分であるため、センサとして
十分に機能しない。一方、反応層の薄膜の厚みが１００
０ｎｍ以上であると、反応層の溶解性が下がり、短時間
での測定が困難になる。したがって、薄膜の厚さを１０
ｎｍから１０００ｎｍにすることが有効である。

【００２４】以上の実施例では、グルコースセンサおよ
びコレステロールセンサについて説明したが、その他の
酵素を用いたグルコースセンサまたはコレステロールセ
ンサ、および乳酸センサ、果糖センサ、しょ糖センサ、
アルコールセンサ、アスコルビン酸センサなどの各セン
サにも本発明を適用できることはいうまでもない。

【００２５】

【発明の効果】以上のように、本発明によれば、血液、
尿などの生体試料、食品工業における原料や製品などの
試料中に含まれる基質を高精度で、迅速かつ容易に定量
しうるバイオセンサを得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例におけるバイオセンサの反応
層を除いた分解斜視図である。

【図２】同バイオセンサの縦断面略図である。

【符号の説明】

１電気絶縁性の基板２、３リード４作用極５対極６絶縁層７反応層８スペーサ９カバー１０スリット１１空気孔

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/483 Ｇ０１Ｎ 27/30 ３５３Ｂ３５３Ｐ 27/46 ３３６Ｈ３３６Ｇ３３８ (72)発明者長谷川美和大阪府門真市大字門真1006番地松下電器産業株式会社内 (72)発明者渡邊基一大阪府門真市大字門真1006番地松下電器産業株式会社内 (72)発明者吉岡俊彦大阪府門真市大字門真1006番地松下電器産業株式会社内Ｆターム(参考） 2G045 AA13 AA16 CA25 CA26 DA31 DA69 FB01 FB05 GC20 4B029 AA07 AA21 BB16 CC03 CC11 FA12 4B033 NA03 NA23 NA24 NB34 NB45 NB63 NB66 NC04 NC06 NC12 NC16 ND05 ND16 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ03 QQ68 QQ76 QR03 QR04 QR12 QR84 QS28 QS39 QX05

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】電気絶縁性の基板、前記基板上に形成さ
れた作用極および対極を有する電極系、並びに前記電極
系上またはその近傍に形成された少なくとも酵素を含む
反応層を具備し、前記反応層がエレクトロスプレー法に
よって形成された薄膜からなることを特徴とするバイオ
センサ。
【請求項２】電気絶縁性の基板、前記基板上に形成さ
れた作用極および対極を有する電極系、並びに前記電極
系上またはその近傍に形成された少なくとも酵素を含む
反応層を具備し、前記反応層の最上層が前記酵素を含
み、当該最上層がエレクトロスプレー法によって形成さ
れた薄膜からなることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項３】前記反応層が電子伝達体を含む請求項１
または２記載のバイオセンサ。
【請求項４】前記反応層の厚みが、１０ｎｍから１０
００ｎｍである請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項５】前記最上層の厚みが、１０ｎｍから１０
００ｎｍである請求項２記載のバイオセンサ。
【請求項６】作用極および対極を含む電極系を有する
電気絶縁性の基板上の前記電極系上またはその近傍に、
少なくとも酵素を含む溶液をエレクトロスプレー法によ
って吹き付けて、薄膜の反応層を形成する工程を有する
ことを特徴とするバイオセンサの製造方法。
【請求項７】作用極および対極を含む電極系を有する
電気絶縁性の基板上の前記電極系上またはその近傍に、
親水性高分子または電子伝達体を含む層を形成する工
程、および前記の層の上に、少なくとも酵素を含む溶液
をエレクトロスプレー法によって吹き付けて、薄膜の反
応層を形成する工程を有することを特徴とするバイオセ
ンサの製造方法。