JP2002527403A - リンホトキシンβ経路の遮断によるウイルス誘導性全身性ショックおよび呼吸窮迫の逆転 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、個体における抗ウイルス応答を誘導する方法を提供し、その方法はＬＴ−Ｂブロック剤の有効量および薬学的に受容可能なキャリアを個体に投与する工程を包含する。特に、本発明はウイルス誘導性全身性ショックおよび呼吸窮迫を処置するための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （関連出願） これは、１９９８年１０月９日に提出された、先の米国仮出願第６０／１０３
，６６２号の一部の継続出願である。先に出願された仮特許出願の教示は本明細
書中に参考として援用される。

【０００２】 （発明の分野） 本発明は、一般的に、個体における抗ウイルス応答を誘導する方法に関する。
特に、本発明は、個体におけるウイルス誘導性全身性ショックおよび呼吸窮迫を
処置するための方法を提供する。この方法は、特定の「リンホトキシンβブロッ
ク剤」の投与を含む。

【０００３】 （発明の背景） いくつかのウイルス（シンノンブル（Ｓｉｎ Ｎｏｍｂｒｅ）（ＳＮＶ）、エ
ボラ、マールブルグ、ラッサおよびデング熱を含む）はすべて、以下の症状の多
くを伴う急性疾患を引き起こす；迅速な発症、発熱、全身性ショックおよび肺窮
迫（Ｌａｃｙら（１９９７）Ａｄｖ．Ｐｅｄ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１２：２１）。
これらの感染の中の別の共通性は、ウイルス感染の全身分布、内皮細胞およびマ
クロファージを標的としていることである（Ｌａｃｙら（１９９７）Ａｄｖ．Ｐ
ｅｄ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１２：２１）。ＳＮＶを除く、これらの顕現性ウイルス
のほとんどは、何十年も前に初めて同定された。これらの発見から何年もして、
これらの病原が世界中で大発生して再出現してきた。１９９８年６月現在で、シ
ロアシネズミ（ｄｅｅｒ ｍｏｕｓｅ）集団の増加に起因して、米国南西部にお
いてＳＮＶ（ハンタウイルス肺ショック症候群の原因因子）の確認された１８３
の症例が存在する。これらの症例のうちわずか５５％が、感染後生き残った（Ｃ
ｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅ
ｎｔｉｏｎ．ＭＭＷＲ．４７，４４９（１９９８））。現在、これらのウイルス
の病因も、毎年全世界でウイルス誘導性全身性ショックおよび呼吸窮迫を患う何
千人もの感染患者を有効に治療する方法についてもほとんど知られていない。

【０００４】 従って、個体におけるウイルス誘導性全身性ショックおよび呼吸窮迫を処置す
るための新規の方法を同定する必要が存在する。

【０００５】 （発明の要旨） 本発明は、上記で言及される問題を、薬学的組成物および個体におけるウイル
ス誘導性全身性ショックおよび呼吸窮迫を処置するための方法を提供することに
より解決する。

【０００６】 本発明の方法および組成物は、特定の薬剤（本明細書中に、リンホトキシン−
β（ＬＴ−Ｂ）ブロック剤として定義される）が個体におけるウイルス誘導性全
身性ショックおよび呼吸窮迫を処置する際に使用され得るという発見を一部利用
する。一つの実施態様において、ＬＴ−Ｂブロック剤は、リンホトキシン−βレ
セプター（ＬＴ−Ｂ−Ｒ）ブロック剤である。好ましい実施態様において、この
ＬＴ−Ｂ−Ｒは、リンホトキシン−Ｂレセプターまたは可溶性リンホトキシン−
Ｂレセプターに対する抗体である。最も好ましい実施態様において、ＬＴ−Ｂ−
Ｒブロック剤は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインと融合されたＬＴ−Ｂ−Ｒ細
胞外リガンド結合ドメインを有する組換えＬＴ−Ｂ−Ｒ融合タンパク質である。

【０００７】 本発明の前述および他の目的、特徴、局面および利点ならびに本発明それ自体
が、以下の好ましい実施態様の記載からより十分に理解される。

【０００８】 （発明の詳細な説明） （定義） より明確かつ簡潔に本願発明の主題を指摘するために、以下の記述および添付
される特許請求の範囲において使用される特定の用語について以下の定義を提供
する。

【０００９】 リンホトキシン−β（ＬＴ−β）は、ＴＮＦファミリーのリガンドのメンバー
であり、これはまた、Ｆａｓ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＯＸ−４０およ
び４−１ＢＢレセプターに対するリガンドを含む（Ｓｍｉｔｈら、Ｃｅｌｌ、７
６、９５９〜６２頁（１９９４））。ＴＮＦ、ＬＴ−α、ＬＴ−βおよびＦａｓ
−ｃａｎを含むＴＮＦファミリーのいくつかのメンバーによるシグナル伝達は、
腫瘍細胞死を壊死またはアポトーシス（プログラム細胞死）により誘導する。非
腫瘍形成細胞において、ＴＮＦおよび多くのＴＮＦファミリーリガンド−レセプ
ター相互作用は、免疫系の発達および種々の免疫攻撃に対する応答に影響を及ぼ
す。

【００１０】 リンホトキシン−β（ｐ３３とも呼ばれる）は、Ｔリンパ球、Ｔ細胞株、Ｂ細
胞株、およびリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞の表面上で同定された。
ＬＴ−βは、１９９２年１月９日にＷＯ９２／００３２９として公開された出願
人の同時系属中の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４５８８、；および１９９４年
６月２３日にＷＯ９４／１３８０８として公開されたＰＣＴ／ＵＳ９３／１１６
６９の主題であり、これらは本明細書中に参考として援用される。

【００１１】 ＬＴ―βレセプター（ＴＮＦファミリーのレセプターのメンバー）は、表面の
ＬＴリガンドに特異的に結合する。ＬＴ−β−ＲはＬＴヘテロマー複合体（主に
、ＬＴ−α１／β２およびＬＴ−α２／β１）に結合するが、ＴＮＦにもＬＴ−
αにも結合しない（Ｃｒｏｗｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４、７０７〜１０頁（
１９９４））。ＬＴ−β−Ｒによるシグナル伝達は、末梢のリンパ器官の発達お
よび体液性免疫応答において役目を果たし得る。

【００１２】 ＬＴ−β−ＲのｍＲＮＡはヒト脾臓、胸腺および他の主要器官において見出さ
れる。ＬＴ−β−Ｒの発現パターンは、ＬＴ−β−Ｒは末梢血Ｔ細胞およびＴ細
胞株上で欠損しているということを除いて、ｐ５５−ＴＮＦ−Ｒについて報告さ
れる発現パターンと類似している。

【００１３】 用語「ＬＴ−βブロック剤」とは、ＬＴ−βに対するリガンド結合、細胞表面
ＬＴ−βクラスター形成もしくはＬＴ−βシグナル伝達を減少させ得るか、また
は細胞内でＬＴ−βシグナルがどのように解釈されるかについて影響を与え得る
薬剤を言う。ＬＴ−βブロック剤の例としては、抗ＬＴ−β、可溶性ＬＴ−β−
Ｒ−Ｆｃ分子、および抗ＬＴ−α、抗ＬＴ−α／βおよび抗ＬＴ−β−Ｒ Ａｂ
が挙げられる。好ましくは、この抗体は、分泌形態のＬＴ−αと交差反応しない
。

【００１４】 用語「ＬＴ−β−レセプターブロック剤」とは、ＬＴ−β−Ｒに対するリガン
ド結合、細胞表面ＬＴ−β−Ｒクラスター形成もしくはＬＴ−β−Ｒシグナル伝
達を減少させ得るか、または細胞内でＬＴ−β−Ｒシグナルがどのように解釈さ
れるかについて影響を与え得る薬剤を言う。ＬＴ−β−Ｒブロック剤の例として
は、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｆｃ分子、および抗ＬＴ−β−Ｒ Ａｂが挙げられる
。好ましくは、この抗体は、分泌形態のＬＴ−αと交差反応を起しない。

【００１５】 用語「抗ＬＴ−βレセプター抗体」とは、ＬＴ−βレセプターの少なくとも一
つのエピトープに特異的に結合する任意の抗体を言う。

【００１６】 用語「抗ＬＴ抗体」とは、ＬＴ−α、ＬＴ−βまたはＬＴ−α／β複合体の少
なくとも一つのエピトープに特異的に結合する任意の抗体を言う。

【００１７】 用語「ＬＴリガンド」とは、ＬＴ−βレセプターに特異的に結合し得るＬＴヘ
テロマー複合体またはその誘導体を言う。

【００１８】 用語「ＬＴ−β−Ｒシグナル伝達」とは、ＬＴ−β−Ｒ経路に関連する分子反
応および引き続いてそこから生じる分子反応を言う。

【００１９】 用語「ＬＴ−β−Ｒリガンド結合ドメイン」とは、ＬＴリガンドの特異的認識
およびＬＴリガンドとの相互作用に関与する、ＬＴ−β−Ｒの一部分を言う。

【００２０】 用語「ＬＴ−α／βヘテロマー複合体」および「ＬＴヘテロマー複合体」とは
、 少なくとも一つのＬＴ−αと、一つ以上のＬＴ−βサブユニット（一つ以上のサ
ブユニットの可溶性形態、変異体形態、改変形態、およびキメラ形態を含む）と
の間の安定な会合を言う。このサブユニットは、静電的相互作用、ファンデルワ
ールス相互作用または共有結合相互作用を介して会合し得る。好ましくは、ＬＴ
−α／６２ヘテロマー複合体は少なくとも２つの隣接するＬＴ−βサブユニット
を有し、そして隣接するＬＴ−αサブユニットを欠損する。ＬＴ−α／βヘテロ
マー複合体が細胞増殖アッセイにおいてＬＴ−β−Ｒ活性化薬剤として役立つ場
合、この複合体は好ましくは可溶性であり、そして化学量論的な（ｓｔｏｉｃｈ
ｉｏｍｅｔｒｙ）ＬＴ−α１／β２を有する。

【００２１】 可溶性ＬＴ−α／６２ヘテロマー複合体は、膜貫通ドメインを欠損し、そして
ＬＴ−αおよび／またはＬＴ−βサブユニットを発現するように操作された適切
な宿主細胞によって分泌され得る（Ｃｒｏｗｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ、１６８、７９〜８９頁（１９９４））。

【００２２】 用語「表面ＬＴ−α／６２複合体」および「表面ＬＴ複合体」とは、細胞表面
上に提示される、ＬＴ−αおよび膜結合ＬＴ−βサブユニット（一つ以上のサブ
ユニットの変異体形態、改変形態およびキメラ形態を含む）を含む複合体を言う
。「表面ＬＴリガンド」とは、ＬＴ−βレセプターと特異的に結合し得る表面Ｌ
Ｔ複合体またはその誘導体を言う。

【００２３】 「有効量」は、有益または所望される臨床結果をもたらすのに十分な量である
。有効量は、１回以上の投与において投与され得る。本発明の目的のために、リ
ンホトキシン−Ｂのレセプターへのリンホトキシン−Ｂの結合をブロックする薬
剤の有効量は、ウイルス応答の発達を改善、安定化または遅延させるために十分
な薬剤の量である。特に、ウイルス誘導性全身性ショックおよび呼吸窮迫の発達
を改善、安定化または遅延させるために十分な薬剤。これらの有効性の指標の検
出および測定は、当業者に公知である。

【００２４】 「個体」とは、脊椎動物、特に哺乳動物種のメンバーを言い、そして飼育動物
、競技用動物およびヒトを含む霊長類を含むが、これらに限定されない。

【００２５】 アミノ酸残基の「機能的同等物」とは（ｉ）機能的同等物により置換されたア
ミノ酸残基と類似した反応特性を有するアミノ酸；（ｉｉ）本発明のアンタゴニ
ストのアミノ酸であり、このアミノ酸は、機能的同等物により置換されたアミノ
酸残基と類似する特性を有する；（ｉｉｉ）機能的同等物により置換されたアミ
ノ酸残基と類似する特性を有する非アミノ酸分子。

【００２６】 本発明のタンパク質性アンタゴニストをコードする第１のポリヌクレオチドは
、少なくとも一つの以下の条件を満足する場合、アンタゴニストタンパク質をコ
ードする第２のポリヌクレオチドと比較して「機能的に同等」である。

【００２７】 （ａ）：「機能的同等物」は、標準的なハイブリダイゼーション条件下で第２
のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、そして／または第１のポリヌクレオ
チド配列に対して縮重している第１のポリヌクレオチドである。最も好ましくは
、機能的同等物は、インテグリンアンタゴニストタンパク質の活性を有する変異
タンパク質をコードする。

【００２８】 （ｂ）「機能的同等物」は、第２のポリヌクレオチドによりコードされるアミ
ノ酸配列についての発現をコードする第１のポリヌクレオチドである。

【００２９】 アミノ酸残基の「機能的同等物」とは（ｉ）機能的同等物により置換されたア
ミノ酸残基と類似した反応特性を有するアミノ酸；（ｉｉ）本発明のアンタゴニ
ストのアミノ酸であり、このアミノ酸は、機能的同等物により置換されたアミノ
酸残基と類似する特性を有する；（ｉｉｉ）機能的同等物により置換されたアミ
ノ酸残基と類似する特性を有する非アミノ酸分子。

【００３０】 本発明のタンパク質性アンタゴニストをコードする第１のポリヌクレオチドは
、それが少なくとも一つの以下の条件を満足する場合、アンタゴニストタンパク
質をコードする第２のポリヌクレオチドと比較して「機能的に同等」である。

【００３１】 （ａ）：「機能的同等物」は、標準的なハイブリダイゼーション条件下で第２
のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、そして／または第１のポリヌクレオ
チド配列に対して縮重している、第１のポリヌクレオチドである。最も好ましく
は、機能的同等物は、インテグリンアンタゴニストタンパク質の活性を有する変
異タンパク質をコードする。

【００３２】 （ｂ）「機能的同等物」は、第２のポリヌクレオチドによりコードされるアミ
ノ酸配列についての発現をコードする第１のポリヌクレオチドである。

【００３３】 本発明において使用されるＬＴ−Ｂブロック剤は、本明細書中に列挙される薬
剤ならびにそれらの機能的同等物を含むが、それらに限定されない。本明細書中
で使用される場合、従って、用語「機能的同等物」とは、機能的同等物であると
考えられる、レシピエント（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）に対して、ＬＴ−Ｂブロック
剤と同じかもしくは改善された有益な効果を有するＬＴ−Ｂブロック剤またはＬ
Ｔ−Ｂブロック剤をコードするポリヌクレオチドを言う。当業者において理解さ
れるように、機能的に同等なタンパク質は、例えば、「機能的に同等なＤＮＡ」
を発現させることにより、組換え技術によって産生され得る。従って、本発明は
、天然に存在するＤＮＡによりコードされるＬＴ−Ｂブロック剤ならびに天然に
存在するＤＮＡによりコードされるものと同じタンパク質をコードする天然に存
在しないＤＮＡによりコードされるＬＴ−Ｂブロック剤を含む。ヌクレオチドコ
ード配列の縮重に起因して、他のポリヌクレオチドを使用して、ＬＴ−Ｂブロッ
ク剤をコードし得る。これらは、配列内の同じアミノ酸残基をコードする異なる
コドンの置換により改変される上記の配列のすべてまたは一部を含み、従って、
サイレントな変化を生じる。このような改変配列は、これらの配列の同等物とみ
なされる。例えば、Ｐｈｅ（Ｆ）は、２つのコドン（ＴＴＣまたはＴＴＴ）によ
りコードされており、Ｔｙｒ（Ｙ）は、ＴＡＣまたはＴＡＴによりコードされて
おり、そしてＨｉｓ（Ｈ）は、ＣＡＣまたはＣＡＴによりコードされる。他方、
Ｔｒｐ（Ｗ）は、一つのコドン（ＴＧＧ）によりコードされる。従って、特定の
インテグリンをコードする所定のＤＮＡ配列に対して、そのインテグリンをコー
ドする多くのＤＮＡ縮重配列が存在することが理解される。これらの縮重ＤＮＡ
配列は、本発明の範囲内であると考えられる。

【００３４】 用語「融合物」または「融合タンパクシ質」とは、同一線上に並んだ（ｃｏ−
ｌｉｎｅｒ）、個々のペプチド骨格を介して、最も好ましくは２つ以上のタンパ
ク質をコードするポリヌクレオチド分子の遺伝子発現を介した、２つ以上のタン
パク質またはそのフラグメントの共有結合物を言う。このタンパク質またはその
フラグメントは異なる供給源由来であることが好ましく、ゆえにこの型の融合タ
ンパク質は「キメラ」分子と呼ばれる。従って、好ましい融合タンパク質は、Ｌ
Ｔ−Ｂブロック剤ではない第２の部分と共有結合したＬＴ−Ｂブロック剤または
フラグメントを含むキメラタンパク質である。本発明の好ましい融合タンパク質
は、抗原結合特異性を保持するインタクトな抗体の部分を含み得、例えば、Ｆａ
ｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ｖ
）フラグメント、重鎖の単量体または二量体、軽鎖の単量体または二量体、一つ
の重鎖および一つの軽鎖からなる二量体、などが挙げられる。

【００３５】 最も好ましい融合タンパク質は、キメラタンパク質であり、そして免疫グロブ
リン軽鎖、重鎖、またはその両方のヒンジ領域および定常領域の全てまたは一部
分に融合したか、またはそうでなければそれと連結したＬＴ−Ｂブロック剤部分
を含む。従って、本発明は、以下を含む分子を特徴とする：（１）ＬＴ−Ｂブロ
ック剤部分、（２）第２のペプチド（例えば、ＬＴ−Ｂブロック剤部分の可溶性
またはインビボ寿命を増加させるもの、例えば、免疫グロブリンスーパーファミ
リーのメンバーまたはそのフラグメントもしくは一部分、例えば、ＩｇＧの一部
分もしくはフラグメント、例えば、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域（例えば、ＣＨ２、
ＣＨ３、およびヒンジ領域））。具体的には、「ＬＴ−ＢまたはＬＴ−Ｂ−Ｒ／
Ｉｇ融合物」は本発明の生物学的に活性なＬＴ−Ｂブロックを含むタンパク質で
ある（例えば、可溶性ＬＴ−Ｂ−Ｒ）か、または免疫グロブリンのＮ末端の一部
がＬＴ−Ｂブロック剤と置き換わっている免疫グロブリン鎖のＮ末端に連結した
その生物学的に活性なフラグメントである。ＬＴ−ＢまたはＬＴ−Ｂ−Ｒ／Ｉｇ
融合物の種は、「ＬＴ−Ｂ−Ｒ／Ｆｃ融合物」であり、これは、免疫グロブリン
の定常ドメインの少なくとも一部分に連結された、本発明のＬＴ−Ｂ−Ｒを含む
タンパク質である。好ましいＦｃ融合物は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端ドメイ
ンを含む抗体のフラグメントに連結された、本発明のＬＴ−Ｂブロック剤を含む
。

【００３６】 「標準的なハイブリダイゼーション条件」−塩および温度条件は、０．５×Ｓ
ＳＣ〜約５×ＳＳＣおよび６５℃（ハイブリダイゼーションおよび洗浄の両方に
ついて）に実質的に等価にする。従って、本明細書中で使用される場合、用語「
標準的なハイブリダイゼーション条件」は、操作上の規定であり、そしてハイブ
リダイゼーション条件の範囲を含む。より高いストリンジェンシー条件は、例え
ば、プラークスクリーン緩衝液（０．２％ ポリビニルピロリドン、０．２％
Ｆｉｃｏｌｌ ４００；０．２％ウシ血清アルブミン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）；１Ｍ ＮａＣｌ；０．１％ リン酸ナトリウム；１％ Ｓ
ＤＳ）；１０％ 硫酸デキストラン、および１００μｇ／ｍｌ 変性超音波処理
サケ精子ＤＮＡと、６５℃で１２〜２０時間、ハイブリダイゼーションする工程
、および７５ｍＭ ＮａＣｌ／７．５ｍＭ クエン酸ナトリウム（０．５×ＳＳ
Ｃ）／１％ ＳＤＳで、６５℃で洗浄する工程を包含し得る。より低いストリン
ジェンシー条件は、例えば、プラークスクリーン緩衝液、１０％ 硫酸デキスト
ランおよび１１０μｇ／ｍｌ 変性超音波処理サケ精子ＤＮＡと、５５℃で１２
〜２０時間ハイブリダイゼーションする工程、および３００ｍＭ ＮａＣｌ／３
０ｍＭ クエン酸ナトリウム（２．０×ＳＳＣ）／１％ ＳＤＳで５５℃で洗浄
する工程を包含し得る。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ，６．３．１〜６．３．６節（１９８９）もまた参照のこと。

【００３７】 「治療的組成物」は、本明細書中で使用される場合、本発明のタンパク質およ
び他の生物学的に適合性の成分を含むと規定される。この治療的組成物は、賦形
剤（例えば、水、鉱物およびタンパク質のようなキャリア）を含み得る。

【００３８】 （ＩＩ．好適な実施態様の説明） 本発明は、ＬＴ−Ｂブロック剤が個体において抗ウイルス応答を誘発し得ると
いう発見に一部依存する。ウイルスに感染した個体を処置することは、個体の生
存率を大きく増大させ得ることが見出された。具体的には、ＬＣＭＶ−１３に感
染したＮＺＢマウスをＬＴ−Ｂブロック剤（例えば、ＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパ
ク質）で処置することは、彼らの生存率を７３％増大させることが示された。

【００３９】 本明細書中で言及される、エボラ、デング熱、ＳＮＶおよび他のウイルスにつ
いての現在の処置は、疾患の伝播に関して、教育を介して予防されている。これ
らの非常に病原性のウイルスに対するワクチンは、存在しない。リバビリン（グ
アニジンアナログ）は、これらの感染のいくつかに対する一般的抗ウイルス薬物
として使用されてきたが、再生可能な成功は、その疾患に対して初期に使用され
た場合に、ラッサ熱の処置において記載されたにすぎなかった（Ｍ．Ｄ．Ｌａｃ
ｙおよびＲ．Ａ．Ｓｍｅｇｏ，Ａｄｖ．Ｐｅｄ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１２，２１（
１９９７））。本発明者らのデータは、これらのウイルスに関連する病理のいく
つかが、免疫媒介性であり得ることを示す。ＬＴ系の遮断は、ウイルス特異的Ｃ
Ｄ８＋Ｔ細胞数およびその機能性を一時的に低減させることによって、生存の機
会を大きく増大させ得る。ＴＮＦα経路を遮断するいくつかの手段を用いる臨床
試験は、いくつかの病気の処置のために既に施行されている（Ｈ．Ｉ．Ｐａｓｓ
，Ｄ．Ｍｅｗ．Ｈ．Ａ．Ｐａｓｓら、Ｃｈｅｓｔ Ｓｕｒｇ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａ
ｍｅｒ．５：７３（１９９５））。本発明者らは、ＬＴβＲ−Ｉｇ処置が、急性
の、急速に進行するウイルス感染（ショックおよび／または肺窮迫を含む）を有
する患者を含むヒト治験において実際に使用するために、動物モデルにおいてさ
らに試験することについて考慮されるべきであると考える。

【００４０】 （ＬＴ−Ｂブロック剤） 本発明の１つの実施態様において、ＬＴ−βブロック剤は、ＬＴ−βシグナル
伝達を阻害するＬＴ−βに対する抗体（Ａｂ）を含む。好ましくは、抗ＬＴ−β
−Ｒ Ａｂは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。阻害性抗ＬＴ−β Ａｂ
および他のＬＴ−βブロック剤は、１つ以上の薬剤が、ＬＴリガンドに結合する
能力、または細胞に対するＬＴ−βシグナル伝達の効果を阻害する能力を検出す
るスクリーニング方法を用いて同定され得る。

【００４１】 本発明の別の実施態様において、ＬＴ−βブロック剤は、ＬＴ−βレセプター
（ＬＴ−Ｂ−Ｒ）ブロック剤を含む。好ましい実施態様において、ＬＴ−Ｂ−Ｒ
ブロック剤は、ＬＴ−β−Ｒシグナル伝達を阻害するＬＴ−β−Ｒに対する抗体
（Ａｂ）である。好ましくは、抗ＬＴ−β−Ｒ Ａｂは、モノクローナル抗体（
ｍＡｂ）である。１つのこのような阻害性の抗ＬＴ−β−ＲｍＡｂは、ＢＤＡ８
ｍＡｂである。阻害性の抗ＬＴ−β−ＲＡｂおよび他のＬＴ−β−Ｒブロック
剤は、１つ以上の薬剤が、ＬＴ−β−ＲもしくはＬＴリガンドに結合するか、ま
たは細胞に対するＬＴ−β−Ｒシグナル伝達の効果を阻害するかのいずれかの能
力を検出するスクリーニング法を用いて同定され得る。

【００４２】 １つのスクリーニング法は、ＬＴ−β−Ｒを有する腫瘍細胞に対するＬＴ−β
−Ｒシグナル伝達の細胞傷害性効果を利用する。腫瘍細胞を１つ以上のＬＴ−β
−Ｒ活性化薬剤に曝露して、ＬＴ−β−Ｒシグナル伝達を誘導する。ＬＴ−β−
Ｒ活性化薬剤としては、ＩＦＮ−γの存在下でのＬＴ−α／６２ヘテロマー複合
体（好ましくは、可溶性ＬＴ−α１／β２）、または抗ＬＴ−β−Ｒ Ａｂを活
性化する薬剤が挙げられる（以下を参照のこと；出願人らの同時係属中の米国特
許出願第０８／３７８，９６８号にも記載される）。

【００４３】 ＬＴ−β−Ｒシグナル伝達を遮断し得る抗体および他の薬剤は、以下のアッセ
イにおいて腫瘍細胞に対するＬＴ−β−Ｒシグナル伝達の細胞傷害性効果を阻害
するそれらの能力に基づいて選択される： １）腫瘍細胞（例えば、ＨＴ２９細胞）を、培地、および試験される薬剤の段階
希釈物の存在下または非存在下で少なくとも１つのＬＴ−β−Ｒ活性化薬剤を含
む一連の組織培養ウェルにおいて３〜４日間培養する； ２）ＭＴＴのようなミトコンドリア機能を測定する生存色素（ｖｉｔａｌ ｄｙ
ｅ）染色を腫瘍細胞混合物に添加し、そして数時間反応させる； ３）各ウェルにおける混合物の光学密度を５５０ｎｍ波長の光（ＯＤ５５０）で
定量する。ＯＤ５５０は、ＬＴ−β−Ｒ活性化薬剤および各ウェルにおける試験
ＬＴ−β−Ｒブロック剤の存在下で残存する腫瘍細胞の数と比例する。ＬＴ−β
−Ｒ活性化腫瘍細胞の細胞傷害性をこのアッセイにおいて少なくとも２０％低減
し得る薬剤または薬剤の組み合わせは、本発明の範囲内のＬＴ−β−Ｒブロック
剤である。

【００４４】 ＬＴ−β−Ｒシグナル伝達を活性化する薬剤または薬剤の組み合わせを上記の
アッセイにおいて使用して、ＬＴ−β−Ｒブロック剤を同定し得る。ＬＴ−β−
Ｒシグナル伝達を誘導するＬＴ−β−Ｒ活性化薬剤（例えば、抗ＬＴ−β−Ｒ
ｍＡｂを活性化する）は、それらの能力単独、または上記の腫瘍細胞アッセイを
用いて腫瘍細胞の細胞傷害性を増強する他の薬剤との組み合わせに基づいて選択
され得る。

【００４５】 ＬＴ−β−Ｒブロック剤を選択する別の方法は、推定薬剤がＬＴリガンド−レ
セプター結合を直接妨害する能力をモニターすることである。リガンド−レセプ
ター結合を少なくとも２０％遮断し得る薬剤または薬剤の組み合わせは、本発明
の範囲内のＬＴ−β−Ｒブロック剤である。

【００４６】 リガンド−レセプター結合の強度を測定する、任意の多くのアッセイを用いて
、推定ＬＴ−β−Ｒブロック剤を用いる競合アッセイを行い得る。レセプターと
リガンドとの間の結合の強度は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）また
はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いて測定され得る。特異的結合はまた、
抗体−抗原複合体を蛍光標識すること、および蛍光活性化セルソーティング（Ｆ
ＡＣＳ）分析を行うことにより、または他のこのような免疫検出法を行うことに
より測定され得る。これらの全ては、当該分野で周知の技術である。

【００４７】 リガンド−レセプター結合相互作用はまた、プラスモン共鳴検出（Ｚｈｏｕら
、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，８１９３〜９８頁（１９９３）；Ｆａｅｇ
ｅｒｓｔｒａｍおよびＯ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ，「Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍ
ｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ」Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｆｆｎｉｔｙ Ｃｈｒｏ
ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２２９〜５２頁，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ
．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３））を利用するＢＩＡｃｏｒｅＴＭ機器（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）で測定され得る。

【００４８】 ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ技術は、金表面にレセプターを結合させ、そしてそれに対
してリガンドを流動させることを可能にする。プラスモン共鳴検出は、リアルタ
イムで表面に結合した質量の直接的定量を与える。この技術は、オン速度および
オフ速度両方の定数をもたらし、従って、推定ＬＴ−β−Ｒブロック剤の存在下
および非存在下で、リガンド−レセプター解離定数および親和性定数が直接決定
され得る。

【００４９】 レセプター−リガンド相互作用を測定するための任意のこれらの技術または他
の技術を用いると、ＬＴ−β−Ｒブロック剤が、単独でまたは他の薬剤との組み
合わせで、表面もしくは可溶性のＬＴリガンドの、表面もしくは可溶性ＬＴ−β
−Ｒ分子への結合を阻害する能力を評価し得る。やはりこのようなアッセイを用
いて、ＬＴ−β−Ｒブロック剤またはこのような薬剤の誘導体（例えば、融合物
、キメラ、変異体、および化学的に改変された形態）を、単独で、またはその改
変された薬剤がＬＴ−β−Ｒ活性化を遮断する能力を最適化する組み合わせで試
験し得る。

【００５０】 ＬＴ−β−Ｒブロック剤は、本発明の１つの実施態様において、可溶性ＬＴ−
βレセプター分子を含む。ヒトＬＴ−β−Ｒの細胞外部分の配列（リガンド結合
ドメインをコードする）は、米国特許第５，９２５，３５１号（本明細書中に参
考として援用される）の図１に示される。米国特許第５，９２５，３５１号の図
１における配列情報および当該分野で周知の組換えＤＮＡ技術を用いて、ＬＴ−
β−Ｒリガンド結合ドメインをコードする機能的フラグメントをベクターにクロ
ーニングし得、そして適切な宿主において発現させて、可溶性ＬＴ−β−Ｒ分子
を生成し得る。本明細書中に記載されるアッセイに従うＬＴリガンド結合につい
てネイティブなＬＴ−βレセプターと競合し得る可溶性ＬＴ−β−Ｒ分子は、Ｌ
Ｔ−β−Ｒブロック剤として選択される。

【００５１】 米国特許第５，９２５，３５１号の図１に示される配列から選択されたアミノ
酸配列を含む可溶性ＬＴ−βレセプターは、レセプター融合タンパク質のインビ
ボ安定性を増大させるか、またはその生物学的活性もしくは位置を調節するため
に１つ以上の異種タンパク質ドメイン（融合ドメイン）に結合され得る。好まし
くは、安定な血漿タンパク質（これは、代表的には、循環中で２０時間を超える
半減期を有する）を用いて、レセプター融合タンパク質を構築する。このような
血漿タンパク質としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：免疫グ
ロブリン、血清アルブミン、リポタンパク質、アポリポタンパク質およびトラン
スフェリン。可溶性ＬＴ−β−Ｒ分子を特定の細胞もしくは組織型に標的化し得
る配列はまた、ＬＴ−β−Ｒリガンド結合ドメインに結合して、具体的に位置決
定された可溶性ＬＴ−β−Ｒ融合タンパク質を作製し得る。ＬＴ−β−Ｒリガン
ド結合ドメインを含むＬＴ−β−Ｒ細胞外領域の全てまたは機能的部分（米国特
許第５，９２５，３５１号の図１）は、ヒトＩｇＧ１重鎖のＦｃドメインのよう
な免疫グロブリン定常領域に融合され得る（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１５４，３３〜４６頁（１９９５））。可溶性レセプター−ＩｇＧ融合
タンパク質は、一般的な免疫試薬であり、そしてそれらの構築方法は、当該分野
で公知である（例えば、米国特許第５，２２５，５３８号を参照のこと）。機能
的ＬＴ−β−Ｒリガンド結合ドメインは、ＩｇＧ１以外の免疫グロブリンクラス
またはサブクラスに由来する免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃドメインに融合され得
る。異なるＩｇクラスまたはサブクラスに属する抗体のＦｃドメインは、異なる
二次的エフェクター機能を活性化し得る。このＦｃドメインがコグネイトＦｃレ
セプターによって結合される場合に活性化が生じる。二次的エフェクター機能と
しては、補体系を活性化する能力、胎盤を横切る能力および種々の微生物タンパ
ク質を結合する能力が挙げられる。免疫グロブリンの種々のクラスおよびサブク
ラスの特性は、Ｒｏｉｔｔら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４．８頁（Ｍｏｓｂｙ−
Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．，第３版、１９９３）に記載され
る。補体酵素カスケードは、抗原結合ＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＭ抗体のＦ
ｃドメインにより活性化され得る。ＩｇＧ２のＦｃドメインは、あまり効果的で
ないようであり、そしてＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのＦｃドメイン
は、補体を活性化するには非効率的である。従って、その関連する二次的エフェ
クター機能が特定の免疫応答またはＬＴ−β−Ｒ Ｆｃ融合タンパク質で処置さ
れる疾患のために所望されるか否かに基づいてＦｃドメインを選択し得る。ＬＴ
−リガンド保有標的細胞を傷つけるかまたは殺傷するために有利であれば、ＬＴ
−β−Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質を作製するために特に活性なＦｃドメイン（Ｉｇ
Ｇ１）を選択し得る。あるいは、ＬＴ−β−Ｒ−Ｆｃ融合物を補体系を誘発する
ことなく細胞に標的化することが所望される場合、不活性ＩｇＧ４ Ｆｃドメイ
ンが選択され得る。

【００５２】 Ｆｃレセプターへの結合および補体活性化を低減または排除するＦｃドメイン
における変異が記載された（Ｓ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．，１０，２３９−６５頁（１９９２））。これらのまたは他の変異を
単独でまたは組み合わせで使用して、ＬＴ−β−Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質を構築
するために使用されるＦｃドメインの活性を最適化し得る。

【００５３】 ヒト免疫グロブリンＦｃドメインに融合されたリガンド結合配列を含む可溶性
のヒトＬＴ−β−Ｒ融合タンパク質（ｈＬＴ−β−Ｒ−Ｆｃ）の生成は、米国特
許第５，９２５，３５１号（本明細書中に参考として援用される）の実施例１に
記載される。ｈＬＴ−β−Ｒ−Ｆｃを分泌する、実施例１に従って作製された１
つのＣＨＯ株は、「ｈＬＴ−β；Ｒ−ｈＧ１ ＣＨＯ＃１４」とよばれる。この
株のサンプルは、ブタペスト条約の規定に従って、アメリカンタイプカルチャー
コレクション（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）に１９９５年７月２
１日に寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１１９６５を割り当てられた。

【００５４】 可溶性のマウスＬＴ−β−Ｒ融合分子（ｍＬＴ−β−Ｒ−Ｆｃ）は、米国特許
第５，９２５，３５１号（本明細書中に参考として援用される）の実施例２に記
載される。ｍＬＴ−β−Ｒ−Ｆｃを分泌する、米国特許第５，９２５，３５１号
の実施例２に従って作製されたＣＨＯ株は、「ｍＬＴβ；Ｒ−ｈＧ１ ＣＨＯ＃
１．３．ＢＢ」とよばれる。この株のサンプルは、ブタペスト条約の規定に従っ
て、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ，Ｍｄ．）に１９９５年７月２１日に寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号ＣＲ
Ｌ１１９６４を割り当てられた。

【００５５】 レセプター−Ｉｇ融合タンパク質の接合点を形成する異なるアミノ酸残基は、
可溶性ＬＴ−βレセプター融合タンパク質の構造、安定性および最終的な生物学
的活性を変更させ得る。１つ以上のアミノ酸は、選択されたＬＴ−β−Ｒフラグ
メントのＣ末端に付加されて、選択された融合ドメインを有する接合点を改変し
得る。

【００５６】 ＬＴ−β−Ｒ融合タンパク質のＮ末端はまた、選択されたＬＴ−β−Ｒ ＤＮ
Ａフラグメントが組換え発現ベクターへの挿入のためにその５’末端で切断され
る位置を変更することにより変化され得る。各ＬＴ−β−Ｒ融合タンパク質の安
定性および活性は、慣用的な実験法および本明細書中に記載のＬＴ−β−Ｒブロ
ック剤を選択するためのアッセイを用いて試験され得、そして最適化され得る。

【００５７】 図１に示される細胞外ドメイン内のＬＴ−β−Ｒリガンド結合ドメイン配列を
使用すると、アミノ酸配列改変体がまた構築されて、ＬＴリガンドに対する可溶
性ＬＴ−βレセプターまたは融合タンパク質の親和性を改変し得る。本発明の可
溶性ＬＴ−β−Ｒ分子は、表面ＬＴリガンド結合に関して、内因性細胞表面ＬＴ
−βレセプターと競合し得る。ＬＴリガンド結合に関して細胞表面ＬＴ−βレセ
プターと競合し得るＬＴ−β−Ｒリガンド結合ドメインを含む任意の可溶性分子
は、本発明の範囲内に入るＬＴ−β−Ｒブロック剤であると想定される。

【００５８】 本発明の別の実施態様において、ヒトＬＴ−βレセプターに対する抗体（抗Ｌ
Ｔ−β−Ｒ Ａｂ）は、個体（ヒトを含む）をウイルス誘導性全身性ショックお
よび呼吸窮迫にあるか、またはその危険に置く状態を処置する際における使用の
ためのＬＴ−β−Ｒブロック剤として機能する。本発明の抗ＬＴ−β−Ｒ Ａｂ
は、ポリクローナルであっても、またはモノクローナル（ｍＡｂ）であってもよ
く、そしてＬＴ−β−Ｒシグナル伝達を遮断する能力、インビボでのそれらのバ
イオアベイラビリティー、安定性または他の所望の形質を最適化するように改変
され得る。

【００５９】 ヒトＬＴ−βレセプターに対するポリクローナル抗体血清は、ヤギ、ウサギ、
ラット、ハムスターまたはマウスのような動物に、完全フロイントアジュバント
中のヒトＬＴ−βレセプター−Ｆｃ融合タンパク質（米国特許第５，９２５，３
５１号の実施例１）を皮下注射し、次いで、不完全フロイントアジュバント中で
腹腔内または皮下でブースター注射することによる従来の技術を用いて調製され
る。ＬＴ−βレセプターに対する所望の抗体を含むポリクローナル抗血清は、従
来の免疫学的手順によってスクリーニングされる。

【００６０】 ヒトＬＴ−βレセプター−Ｆｃ融合タンパク質に対するマウスモノクローナル
抗体（ｍＡｂ）は、米国特許第５，９２５，３５１号の実施例５に記載されるよ
うに調製される。マウス抗ヒトＬＴ−β−Ｒ ｍＡｂ ＢＤＡ８を生成するハイ
ブリドーマ細胞株（ＢＤ．Ａ８．ＡＢ９）は、ブタペスト条約の規定に従ってア
メリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１０８０１ Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２
０９）に、１９９５年１月１２日に寄託し、そしてＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１７
９８を割り当てられた。

【００６１】 抗ＬＴ−β−Ｒ抗体の種々の形態はまた、標準的な組換えＤＮＡ技術（Ｗｉｎ
ｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３４９，２９３〜９９頁（１９
９１））を用いて作製され得る。例えば、「キメラ」抗体が構築され得、ここで
は、動物の抗体由来の抗原結合ドメインがヒト定常ドメインに連結される（例え
ば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８１，６８５１〜５５頁
（１９８４））。キメラ抗体は、ヒトの臨床処置において使用される場合に動物
抗体により誘発される、観察される免疫原性応答を低減する。さらに、ＬＴ−β
−Ｒを認識する組換え「ヒト化抗体」が合成され得る。ヒト化抗体は、大部分の
ヒトＩｇＧ配列を含むキメラであり、そこに、特異的抗原結合を担う領域が挿入
される（例えば、ＷＯ９４／０４６７９）。動物を所望の抗原で免疫し、対応す
る抗体を単離し、そして特異的抗原結合を担う可変領域配列の一部を取り出す。
次いで、動物由来の抗原結合領域をヒト抗体遺伝子の適切な位置にクローニング
し、ここで、この抗原結合領域が欠失される。ヒト化抗体は、ヒト抗体中の異種
（種間）配列の使用を最小にし、そして処置される被験体における免疫応答を惹
起する可能性が低い。

【００６２】 異なるクラスの組換え抗ＬＴ−β−Ｒ抗体の構築はまた、抗ＬＴ−β−Ｒ可変
ドメインおよび異なるクラスの免疫グロブリンから単離されたヒト定常ドメイン
（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を含むキメラ抗体またはヒト化抗体を作製すること
によって達成され得る。例えば、増大した抗原結合部位結合価を有する抗ＬＴ−
β−Ｒ ＩｇＭ抗体は、ヒトμ鎖定常領域を有するベクターに抗原結合部位をク
ローニングすることにより組換え的に生成され得る（Ａｒｕｌａｎａｎｄａｍら
、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７７，１４３９〜５０頁（１９９３）；Ｌａｎｅら
、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２，２５７３〜７８頁（１９９３）；Ｔｒ
ａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３９，６８〜７０頁（１９８９））。さ
らに、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、抗原結合部位の付近のアミノ酸残基
を改変することにより、組換え抗体とそれらの抗原との結合親和性を改変し得る
。ヒト化抗体の抗原結合親和性は、分子モデリングに基づいた変異誘発により増
大され得る（Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．
，８６，１００２９〜３３頁（１９８９）；ＷＯ９４／０４６７９）。

【００６３】 標的とされる組織型または想定される特定の処置スケジュールに依存して、Ｌ
Ｔ−β−Ｒに対する抗ＬＴ−β−Ｒ Ａｂの親和性を増大または減少させること
が所望され得る。例えば、半予防的な処置のためにＬＴ−β経路を介してシグナ
ル伝達する低減した能力を有する、一定レベルの抗ＬＴ−β−Ｒ Ａｂで患者を
処置することは有利であり得る。同様に、ＬＴ−β−Ｒに対する増大した親和性
を有する阻害性の抗ＬＴ−β−Ｒ Ａｂは、短期間の処置に関して有利であり得
る。

【００６４】 ヒトＬＴ−βレセプターに対する他の抗体を試験することにより、ヒトにおい
てＬＴ−β−Ｒブロック剤として機能する、さらなる抗ＬＴ−β−Ｒ抗体が、個
体（ヒトを含む）をウイルス誘導性全身性ショックおよび呼吸窮迫にさせるか、
またはその危険に置く状態を処置するために、本明細書中に記載の従来の実験法
およびアッセイを用いて同定され得ることを予測する。

【００６５】 本発明の別の好ましい実施態様は、ＬＴ−β−Ｒブロック剤として機能するＬ
Ｔリガンドに対する抗体を含む組成物および方法を包含する。抗ＬＴ−β−Ｒ
Ａｂに関して上記で記載されるように、ＬＴ−β−Ｒブロック剤として機能する
抗ＬＴリガンド抗体は、ポリクローナルであっても、またはモノクローナルであ
ってもよく、そしてそれらの抗原結合特性およびそれらの免疫原性を調節するた
めに慣用的な手順に従って改変され得る。本発明の抗ＬＴ抗体は、２つのＬＴサ
ブユニット個々の内のいずれか一方に対して惹起され得、これらのＬＴサブユニ
ットとしては、可溶性形態、変異形態、改変形態およびキメラ形態のＬＴサブユ
ニットが挙げられる。ＬＴサブユニットが抗原として使用される場合、好ましく
は、それらは、ＬＴ−βサブユニットである。ＬＴ−αサブユニットが使用され
る場合、（米国特許第５，９２５，３５１号の実施例３に記載されるアッセイに
従って）得られる抗ＬＴ−α抗体が表面ＬＴリガンドに結合し、そして分泌され
たＬＴ−αと交差反応もせず、ＴＮＦ−Ｒ活性を調節もしないことが好ましい。

【００６６】 あるいは、１つ以上のＬＴサブユニットを含む、ホモマー（ＬＴ−β）または
ヘテロマー（ＬＴ−α／６２）複合体に対する抗体が惹起され得、そしてＬＴ−
β−Ｒブロック剤としての活性についてスクリーニングされ得る。好ましくは、
ＬＴ−α１／β２複合体を抗原として用いる。上記で議論されるように、得られ
る抗ＬＴ−α１／β２抗体が、分泌されたＬＴ−αに結合することなく、かつＴ
ＮＦ−Ｒ活性に影響を及ぼすことなく表面ＬＴリガンドに結合することが好まし
い。

【００６７】 ポリクローナル抗ヒトＬＴα抗体の産生は、出願人らの同時係属中の出願（Ｗ
Ｏ９４／１３８０８）において記載される。モノクローナル抗ＬＴα抗体および
モノクローナル抗ＬＴβ抗体もまた、記載される（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｍｕｎｏｌ．，５４，３３〜４６頁（１９９５））。マウス抗ヒトＬＴβｍ
Ａｂは、米国特許第５，９２５，３５１号の実施例６に記載されるように調製さ
れた。マウス抗ヒトＬＴβ−Ｒ ｍＡｂ Ｂ９を産生するハイブリドーマ細胞株
（Ｂ９．Ｃ９．１）は、ブダペスト条約の規定に従って、１９９５年７月２１日
にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴ
ＣＣ）（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓ
ｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号１１９６
２を割り当てられた。

【００６８】 モノクローナルハムスター抗マウスＬＴα／６２抗体は、米国特許第５，９２
５，３５１号の実施例７に記載されるように調製された。ハムスター抗マウスＬ
Ｔα／６２ ｍＡｂ ＢＢ．Ｆ６を産生するハイブリドーマ細胞株（ＢＢ．Ｆ６
．１）は、ブダペスト条約の規定に従って、１９９５年７月２１日にＡｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１０
８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ
．２０１１０−２２０９）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＭＢ１１９６３を割り
当てられた。

【００６９】 蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイが、米国特許第５，９２５，３５１
号の実施例６および７において記載されるように、ＬＴβ−Ｒブロック剤として
作用し得るＬＴサブユニットおよびＬＴ複合体に対して指向される抗体について
スクリーニングするために開発された。このアッセイにおいて、可溶性のヒトＬ
Ｔβ−Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質は、試験抗体の増加量の存在下で表面ＬＴ複合体
（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４，３３〜４６頁（１９９５
））を発現する、ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３細胞に添加される。ＬＴβレセプター
−リガンド相互作用を少なくとも２０％阻害し得る抗体は、ＬＴβ−Ｒブロック
剤として選択される。

【００７０】 動物を免疫するための抗原としてＬＴサブユニットではなくＬＴα／β複合体
を使用することは、より効率的な免疫をもたらし得るか、または表面ＬＴリガン
ドについてのより高い親和性を有する抗体を生じ得る。ＬＴα／６２複合体を用
いる免疫によって、ＬＴαサブユニットおよびＬＴβサブユニットの両方上のア
ミノ酸残基（例えば、ＬＴα／６２間隙を形成する残基）を認識する抗体が単離
される得るということが考えられる。ヒトＬＴα／６２ヘテロマー複合体に対し
て指向される抗体を試験することによって、ヒトにおいてＬＴβ−Ｒブロック剤
として機能するさらなる抗ＬＴ抗体が、慣用的な実験および本明細書中に記載さ
れるアッセイを使用して同定され得る。

【００７１】 （投与） 本明細書中に記載される組成物は、個体におけるウイルス誘導性全身性ショッ
クおよび呼吸窮迫を処置するための方法において有効用量で投与される。好まし
い薬学的処方物および所定の適用のための治療的に有効な用量レジメの決定は、
例えば、患者の状態および体重、所望の処置の程度、および処置についての患者
の耐性を考慮に入れて、十分に当業者の範囲内である。可溶性ＬＴβ−Ｒの約１
ｍｇ／ｋｇの用量が、最適の処置用量のための適切な開始点であると予想される
。

【００７２】 治療的に有効な用量の決定はまた、標的細胞（ブロック剤に依存してＬＴβ−
ＲまたはＬＴリガンド陽性細胞）を１〜１４日間コートするのに必要なＬＴβ−
Ｒブロック剤の濃度を測定するインビトロ実験を実行することによって評価され
得る。本明細書中に記載されるレセプター−リガンド結合アッセイが使用されて
、細胞コート反応をモニターし得る。ＬＴβ−ＲまたはＬＴリガンド陽性細胞は
、ＦＡＣＳを使用して活性化されたリンパ球集団から分離され得る。これらのイ
ンビトロ結合アッセイの結果に基づいて、適切なＬＴβ−Ｒブロック剤濃度の範
囲は、本明細書中に記載されるアッセイに従って、動物において試験されるため
に選択され得る。

【００７３】 本発明の可溶性ＬＴβ−Ｒ分子、抗ＬＴリガンド、および抗ＬＴβ−Ｒ Ａｂ
の投与（単独でまたは組み合わせて、抗体もしくは複合体の単離されそして精製
された形態、それらの塩またはその薬学的に受容可能な誘導体を含む）は、免疫
抑制活性を示す薬剤の、従来的に受容されてきた投与の様式のいずれかを使用し
て達成され得る。

【００７４】 これらの療法において使用される薬学的組成物はまた、種々の形態にあり得る
。これらには、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液体溶液もしくは懸濁剤、坐剤、な
らびに注射可能な溶液および注入可能な溶液のような、固体、半固体、および液
体投与量形態が含まれる。好ましい形態は、意図される投与の様式および治療的
適用に依存する。

【００７５】 投与の様式は、経口、非経口、皮下、静脈内、病変内、または局所的投与を含
み得る。本発明の可溶性ＬＴβ−Ｒ分子、抗ＬＴリガンド、および抗ＬＴβ−Ｒ
Ａｂは、例えば、取り込みまたは安定性を刺激する補因子を伴うかまたは伴わ
ない、滅菌の、等張性処方物中に配置され得る。その処方物は、好ましくは液体
であるか、または凍結乾燥した粉末であり得る。例えば、本発明の可溶性ＬＴβ
−Ｒ分子、抗ＬＴリガンド、および抗ＬＴβ−Ｒ Ａｂは、５．０ｍｇ／ｍｌ
クエン酸一水和物、２．７ｍｇ／ｍｌ クエン酸三ナトリウム、４１ｍｇ／ｍｌ
マンニトール、１ｍｇ／ｍｌ グリシン、および１ｍｇ／ｍｌ ポリソルベー
ト２０を含む処方緩衝液を用いて希釈され得る。この溶液は、凍結乾燥され、冷
蔵下で保存され、そして滅菌Ｗａｔｅｒ−Ｆｏｒ−Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ＵＳＰ
）を用いて、投与の前に再構築され得る。

【００７６】 この組成物はまた、好ましくは、当該分野で周知の従来的な薬学的に受容可能
なキャリアを含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、１９８０、Ｍａｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと）。このような薬学的に受容可能なキャリアは
、他の医薬的薬剤、キャリア、遺伝子キャリア、アジュバント、賦形剤など（例
えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物）を含み得る。この組成物は、好ま
しくは、単位用量の形態にあり、そして通常１日に１回以上投与される。

【００７７】 本発明の薬学的組成物はまた、罹患した組織または血流中に配置されるか、そ
の近くに配置されるか、またはさもなくばそれと連絡するように配置される、ミ
クロスフェア、リポソーム、他の微小粒子送達系、または徐放性処方物を使用し
て投与され得る。徐放性キャリアの適切な例には、成型品（例えば、坐剤または
微小カプセル）の形態にある半透性のポリマーマトリックスが含まれる。移植可
能なまたは微小カプセルの徐放性マトリックスには、ポリアクチド（米国特許第
３，７７３，３１９号；ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびエチル−
Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２
２，５４７〜５６頁（１９８５）；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレー
ト）またはエチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍ
ａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５，１６７−２７７頁（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃ
ｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２，９８〜１０５頁（１９８２）））が含まれる。

【００７８】 本発明の可溶性ＬＴβ−Ｒ分子、抗ＬＴリガンド、および抗ＬＴβ−Ｒ Ａｂ
を含むリポソームは、単独でまたは組み合わせて、周知の方法によって調製され
得る（例えば、ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，３６８８〜９２頁（１９８５）；
Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７，
４０３０〜３４頁（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４
，５４４，５４５号を参照のこと）。通常、リポソームは小さな（約２００〜８
００Å）単層型のものであり、ここで脂質含量は、約３０モル％コレステロール
より多い。コレステロールの比率は、可溶性のＬＴβ−Ｒ分子、抗ＬＴリガンド
、および抗ＬＴβ−Ｒ Ａｂ放出の最適な割合を制御するために選択される。

【００７９】 本発明の可溶性ＬＴβ−Ｒ分子、抗ＬＴリガンド、および抗ＬＴβ−Ｒ Ａｂ
はまた、ＬＴβ−Ｒブロッキング活性を調節するために、他のＬＴβ−Ｒブロッ
ク剤、免疫抑制剤、またはサイトカインを含むリポソームに結合され得る。ＬＴ
β−Ｒ分子、抗ＬＴリガンド、および抗ＬＴβ−Ｒ Ａｂのリポソームへの結合
は、毒素または化学療法剤を標的化された送達のために抗体にカップリングする
ために広範に使用されてきた任意の公知の架橋試薬（例えば、ヘテロ二官能性架
橋剤）によって達成され得る。リポソームへの結合体化もまた、炭水化物指向性
の架橋試薬４−（４−マレイニドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）（Ｄｕ
ｚｇｕｎｅｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｂｓｔ．Ｓｕｐｐｌ．１６
Ｅ７７（１９９２））を用いて達成され得る。

【００８０】 本発明の組成物および方法のＬＴβ−Ｒブロック剤は、処置される状態、障害
、または疾患に依存して、ＬＴβ−Ｒシグナル伝達の所望のレベルを得るために
改変され得る。ＬＴβ−Ｒシグナル伝達の絶対的なレベルは、それらのそれぞれ
の分子標的についてのＬＴβ−Ｒブロック剤の濃度および親和性を操作すること
によって、細かく調整され得ることが想定される。例えば、本発明の１つの実施
態様において、可溶性ＬＴβ−Ｒ分子を含む組成物が、被験体に投与される。可
溶性ＬＴβレセプターは、表面ＬＴリガンドを結合することについて、細胞表面
ＬＴβレセプターと有効に競合し得る。表面ＬＴリガンドと競合する能力は、可
溶性かつ細胞表面のＬＴβ−Ｒ分子の相対的濃度、およびリガンド結合について
のそれらの相対的親和性に依存する。

【００８１】 表面ＬＴリガンドとの変異体可溶性ＬＴβ−Ｒの結合親和性を増加または減少
させる変異を有する可溶性ＬＴβ−Ｒ分子は、当業者に周知の標準的な組換えＤ
ＮＡ技術を使用して作製され得る。部位特異的変異またはランダムな変異を有す
る多くの分子は、本明細書中に記載される慣用的な実験および技術を使用して、
ＬＴβ−Ｒブロック剤として機能するそれらの能力について試験され得る。同様
に、本発明の別の実施態様において、抗体は、ＬＴβ−Ｒブロック剤としてのＬ
Ｔβレセプターまたは１つ以上のＬＴリガンドサブユニット機能のいずれかに対
して指向された。ＬＴβレセプターシグナル伝達をブロックするこれらの抗体に
ついての能力は、変異、化学修飾によって、または被験体に送達される抗体の有
効な濃度または活性を変化させ得る他の方法によって改変させ得る。

【００８２】 （用途） 一般的な問題として、本発明の方法は、個体において抗ウイルス応答を誘導す
るために利用され得、これは、ＬＴ−Ｂブロック剤および薬学的に受容可能なキ
ャリアの有効量を個体に投与する工程を包含する。処置されるウイルス応答は、
かなり多数の公知のウイルスの任意の数によって引き起こされ得、これらには、
シンノンブル（ＳＮＶ）、エボラ、マールブルグ、ラッサ、およびデング熱が含
まれるがそれらに限定されない。

【００８３】 （等価物） 本発明は、その意図または本質的な性質から逸脱することなく、他の特定の形
態において具体化され得る。従って、前述の実施態様は、本明細書中に開示され
た本発明に限定するのではなく、例示するすべての点において考慮される。従っ
て、本発明の範囲は、前述の記載によるのではなく、添付の特許請求の範囲によ
って示され、そして特許請求の範囲の意味の中でのすべての変更、およびその等
価物の範囲は、そこに含まれることが意図される。

【００８４】 （実施例） 腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）は、ウイルス感染および他の免疫原に対する急性シ
ョック応答を容易にする際に鍵となる役割を果たす（Ｋ．Ｃ．Ｆ．Ｓｈｅｅｈａ
ｎ，Ｎ．Ｈ．Ｒｕｄｄｌｅ、およびＲ．Ｄ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１４２，３８８４（１９８９）；Ｇ．Ｗ．Ｈ．ＷｏｎｇおよびＤ．Ｖ．
Ｇｏｅｄｄｅｌ Ｎａｔｕｒｅ ３２３，８１９（１９８６）；Ｂ．Ｂｅｕｔｌ
ｅｒ，Ｉ．Ｗ．Ｍｉｌｓａｒｋ，Ａ．Ｃｅｒａｍｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９，
８６９（１９８５）；Ｆ．Ｍａｃｋａｙ，Ｐ．Ｒ．Ｂｏｕｒｄｏｎ，Ｄ．Ａ．Ｇ
ｒｉｆｆｉｔｈｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，３２９９（１９９７）；Ｐ
．Ｄ．Ｃｒｏｗｅ，Ｔ．Ｌ．ＶａｎＡｒｓｄａｌｅ，Ｂ．Ｎ．Ｗａｌｔｅｒら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４，７０７（１９９４））。ショックを含むデング熱のエ
ピソードの間、患者からの血清のＴＮＦαのレベルは、可溶性ＴＮＦＲ−７５の
レベルと同様に上昇する（Ｄ．Ｈｏｂｅｒら、Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．
，４８，３２４（１９９３）；Ｄ．Ｂ．Ｂｅｔｈｅｌｌ，Ｋ．Ｆｌｏｂｂｅ，Ｃ
．Ｘ．Ｔ．Ｐｈｕｏｎｇら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７７，７７８（１
９９８））。本発明者らは、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルスの改変体、ＬＣＭＶ、
クローン１３（ＬＣＭＶ−１３）（ＨＨ，ＩＩ）で感染させたマウスの血清中の
ＴＮＦαレベルを測定した。ＬＣＭＶ−１３で感染させたマウスの血清中のＴＮ
Ｆαレベルを、感染後４日までアッセイについて検出のレベルの少し上にあるこ
とを見出した（血清ＴＮＦαレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｇｅｎｚｙｍｅ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，カタログ番号８０−２８０２−００）によって測定し
た）。５日目および６日目に、その疾患がそのピークにある場合、血清中の可溶
性ＴＮＦαレベルは、正常の３〜６倍に増大した（データは示さず）。従って、
本発明者らは、モノクローナル抗体、ＴＮ３−１９．１２を使用することによっ
て、ＴＮＦα機能をブロックすることを選択した。この抗体は、分泌されたＴＮ
Ｆαの両方に結合することが公知であり、従って、ＥＬＩＳＡによって確認され
るようなマウスからのその枯渇を引き起こす（Ｋ．Ｃ．Ｆ．Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｎ
．Ｈ．ＲｕｄｄｌｅおよびＲ．Ｄ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１４２，３８８４（１９８９）Ｇ．Ｗ．Ｈ．ＷｏｎｇおよびＤ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄ
ｅｌ Ｎａｔｕｒｅ ３２３，８１９（１９８６）；Ｂ．Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｉ．
Ｗ．Ｍｉｌｓａｒｋ，Ａ．Ｃｅｒａｍｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９，８６９（１
９８５）；Ｆ．Ｍａｃｋａｙ，Ｐ．Ｒ．Ｂｏｕｒｄｏｎ，Ｄ．Ａ．Ｇｒｉｆｆｉ
ｔｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，３２２９（１９９７）；Ｐ．Ｄ．Ｃｒｏ
ｗｅ，Ｔ．Ｌ．ＶａｎＡｒｓｄａｌｅ，Ｂ．Ｎ．Ｗａｌｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２６４，７０７（１９９４）；Ｄ．Ｈｏｂｅｒら、Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．
Ｈｙｇ．，４８，３２４（１９９３）；Ｄ，Ｂ，Ｂｅｔｈｅｌｌ，Ｋ．Ｆｌｏｂ
ｂｅ，Ｃ．Ｘ．Ｔ．Ｐｈｕｏｎｇら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７７，７
７８（１９９８））。血清ＴＮＦαレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定
した（ＧｅｎｚｙｍｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，カタログ番号８０−２８０２−
００）。ＮＺＢマウスに２．５×１０⁶ｐｆｕ Ｃｌ １３をｉ．ｖ．で与え、
続いて感染後１日目および４日目に、エンドトキシンを含まないＰＢＳ（参考文
献Ｓを参照のこと）中の２５０μｇのＴＮ３−１９．１２抗体を含む２回のｉ．
ｐ．注射を行った。コントロールマウスには、同じ日に抗体を含まない同じ容量
のＰＢＳを注射した。この処置（抗ＴＮＦ）は、これらのマウスの生存率にほと
んど効果を有さなかった（図３）。リンホトキシンα（ＬＴα）（ＴＮＦβとし
ても知られるが、これは、同じレセプターおよびその生物学的効果の多くを、Ｔ
ＮＦαと共有する）は、この抗体によって認識されない（Ｆ．Ｍａｃｋａｙ，Ｐ
．Ｒ．Ｂｏｕｒｄｏｎ，Ｄ．Ａ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１５９，３２９９（１９９７））。ＴＮＦαおよびＬＴαの両方を標的化するこ
とが、生存率を増加させるために必要とされることがあり得る。この仮説を試験
するために、本発明者らは、上記のＴＮ３−１９．１２ ｍＡｂおよびヒトＩｇ
Ｇ１のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインにＴＮＦｐ５５レセプターの細胞外
ドメインを融合させたレセプター融合タンパク質（ＴＮＦＲ５５−Ｉｇ）を使用
した（Ｗ．Ｒ．Ｆｏｒｃｅ，Ｂ．Ｎ．Ｗａｌｔｅｒ，Ｃ．Ｈｅｓｓｉｏｎら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５，５２８０（１９９５）；Ｇ．Ｔ．Ｍｉｌｌｅｒ，
Ｐ．Ｓ．Ｈｏｃｈｍａｎ，Ｗ．Ｍｅｉｅｒら、ＪＥＭ．，１７８，２１１（１９
９３）；Ｊ．Ｌ．Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，Ｉ．Ｄｏｕｇａｓ，Ａ．Ｎｇａｍ−ｅｋら
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４：３３（１９９５））。マウスを、参考文献Ｒ
に記載されるように処置した。三重で処置した群について、ＴＮＦＲ５５−Ｉｇ
タンパク質およびＬＴβＲ−Ｉｇタンパク質を、感染後０日目および３日目に、
２００μｇ量で、ｉ．ｐ．で与えた。コントロールマウスには、同じ日に同じ量
で、これらの融合タンパク質（ＡＹ１９４３−２９）の合成において使用される
ヒト抗体を与えた。ＬＴβＲ−Ｉｇのみを受容したマウスを、ＴＮＦＲ５５−Ｉ
ｇ注射が除外された以外は、同様に処置した。この処置はまた、ＬＣＭＶ−１３
感染したＮＺＢマウスにおいて、生存率を有意に変化させなかった（抗ＴＮＦお
よびＴＮＦＲ５５−Ｉｇ群を参照のこと）。膜型のリンホトキシン、ＬＴαのヘ
テロマー、およびＬＴβは、ＴＮＦＲ−７５またはＴＮＦＲ−５５を認識しなか
ったが、むしろＬＴβＲ（１５）と呼ばれる第３のレセプターに結合する。本発
明者らは、ヒトＩｇＧ１（ＬＴβＲ−Ｉｇ）のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメ
インにもまた結合している、ＬＴβＲ細胞外ドメインを含む融合タンパク質を使
用することを選択した。抗ＴＮＦα ｍＡｂ、ＴＮＦＲ５５−ＩｇおよびＬＴβ
Ｒ−Ｉｇでのマウスの処置（三重処置またはＴＮＦＲ５５−ＩＧおよびＬＴβＲ
−Ｉｇ）は、生存の劇的な増加を生じた（それぞれ、８０％および７０％まで）
。対照的に、抗ＴＮＦα ｍＡｂおよびＴＮＦＲ５５−Ｉｇで処置したマウスの
２０％のみが、感染で生存した。最近、ＬＴβＲについての第２のリガンド、Ｌ
ＩＧＨＴが同定された（Ｄ．Ｎ．Ｍａｕｒｉ，Ｒ．Ｅｂｎｅｒ，Ｒ．Ｉ．Ｍｏｎ
ｔｇｏｍｅｒｙら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８，２１（１９９８）；Ｒ．Ｉ．Ｍｏｎ
ｔｇｏｍｅｒｙ，Ｍ．Ｓ．Ｗａｒｎｅｒ，Ｂ．Ｌｕｍら、Ｃｅｌｌ ８７，４２
７（１９９６））。ＬＩＧＨＴはまた、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（
ＨＶＥＭ）を結合することが示されており、これは、活性化されたＣＤ４ Ｔ細
胞およびＣＤ８ Ｔ細胞上で発現されるＴＮＦＲファミリーのメンバーと有意な
相同性を有するＩ型膜貫通タンパク質である（Ｄ．Ｎ．Ｍａｕｒｉ，Ｒ．Ｅｂｎ
ｅｒ，Ｒ．Ｉ．Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８，２１（１９９
８）；Ｒ．Ｉ．Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｍ．Ｓ．Ｗａｒｎｅｒ，Ｂ．Ｌｕｍら、
Ｃｅｌｌ ８７，４２７（１９９６））。本明細書に提供された結果に基づく、
ＬＴβＲ−ＩｇによるＬＴβ₂α₁およびＬＩＨＧＴの結合による、ＬＴβＲシグ
ナル伝達および潜在的なＨＶＥＭシグナル伝達の阻止は、三重処置群において見
られる効果の大部分の原因であるようであった。本発明者らは、ＬＣＭＶ−１３
感染ＮＸＢマウスをＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質で処置することによって、こ
の仮説を確認した。この群のマウスの生存率（７３％）は、三重処置群とほぼ同
じ高さであった（図３）。総合すれば、これらのデータは、ＬＴβＲおよび／ま
たはＨＶＥＭシグナル伝達経路が、全身性ショックおよび呼吸窮迫を含む急性の
致死性の疾患の統合に関与することの最初の実証を表す。

【００８５】 ＬＴβ遮断処理後の生存の機構を決定する目的において、ＮＰ１１８特異的Ｔ
細胞についてのＣＤ８／テトラマーの両方の同時染色、ＮＺＢ Ｌ^Dシステムに
おけるドミナントＣＤ８エピトープ、およびＮＰ１１８ペプチドで刺激された脾
臓細胞によって産生されるインターフェロンγについての細胞内染色を、コント
ロール抗体、ＬＴβＲ−Ｉｇ単独で、または三重処置した、ＬＣＭＶ−１３感染
させたＮＺＢマウス由来のサンプル上で実行した。図４は、三重処置したマウス
において見られた最大の効果を有する、ＮＰ１１８特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数の
減少を例証する。コントロール抗体で処置したマウスにおいて、１０％のテトラ
マー陽性細胞のみが活性にＩＮＦγを産生した。ＬＣＭＶ−１３感染の間のアネ
ルギー性Ｔ細胞の出現は、以前に実証され、そしてこれはマウスにおける高いレ
ベルのウイルス抗原に起因するようである（図１）。ＬＴβＲ−Ｉｇ処置マウス
においてＮＰ１１８特異的細胞の数が減少しただけでなく、ＩＮＦγを産生する
細胞の割合もまた減少した。この効果は、三重処置群においてなおさらに顕著で
あった。従って、ＣＤ８画分は、ＬＣＭＶ−１３感染へのこの致死的なＮＺＢ応
答の供給源であり得る。活性化されたＣＤ８が、ＬＴβ₂α₁を提示することが既
知であるという事実は、この仮説と一致する（Ｙ．Ａｂｅ，Ａ．Ｈｏｒｉｕｃｈ
ｉ，Ｙ．Ｏｓｕｋａら、Ｌｙｍｐｈ．Ｃｔｙｏｋ．Ｒｅｓ．，１１，１１５（１
９９２）；Ｃ．Ｆ．Ｗａｒｅ，Ｐ．Ｄ．Ｃｒｏｗｅ，Ｍ．Ｈ．Ｇｒａｙｓｏｎら
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４９，３８８１（１９９２）；Ｊ．Ｌ．Ｂｒｏｗｎ
ｉｎｇ，Ａ．Ｎｇａｍ−ｅｋ，Ｐ．Ｌａｗｔｏｎら、Ｃｅｌｌ，７２，８４７（
１９９３））。この主張を支持するために、本発明者らは、感染したＮＺＢマウ
スで、インビボでＣＤ８陽性Ｔ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞を枯渇させた（雄性
ＮＺＢマウスに２．５×１０⁶ｐｆｕ ＬＣＭＶ−１３をｉ．ｖ．で与え、続い
て、抗Ｔ細胞抗体の５００μｌ ｉ．ｐ．注射を２回行った。ｍＡｂ Ｌｙｔ２
．４３を使用して、ＣＤ８⁺Ｔ細胞を枯渇させた。一方、ＣＤ４⁺Ｔ細胞枯渇のた
めにＧＫ１．５（Ｍ１）抗体を使用した。両方の抗体を、ハイブリドーマ上清か
らの硫酸アンモニウム沈殿、続いてＰＢＳに対する透析によって調製した。ＦＡ
ＣＳ分析を使用して、いくつかのマウスにおける枯渇を確認した。）。ＣＤ４
Ｔ細胞枯渇は、生存を増加させなかった。対照的に、ＣＤ８ Ｔ細胞の枯渇は、
ＬＴβＲ−Ｉｇ処置マウスとは異なり、疾患症状の非存在下において１００％の
生存を生じた（図５）。ＣＤ８枯渇マウスのいくつかの組織におけるウイルス力
価は、処置していないマウスよりも高かったので、死は、ウイルス感染による組
織の破壊からではなく、ＣＤ８ Ｔ細胞によって媒介される毒性の免疫応答から
生じるようである。

【００８６】 本発明者らは、本明細書で、静脈投与の高用量のＬＣＭＶ−１３で感染させた
ＮＺＢマウスが、エボラ感染、マールブルグ感染、ラッサ感染、デング熱感染、
およびシンノンブル感染といくつかの共通の特徴を共有する、急性の、迅速に進
行する疾患を発症することを報告した。この病気の致死率は、活性化された場合
に、ＴＮＦα、ＬＴα、およびＬＴβを発現することが知られているＣＤ８⁺Ｔ
細胞の存在に依存した。これは、希望を与える知見であるが、ＣＤ８⁺Ｔ細胞の
枯渇によるウイルス感染の処置は、的を得ていない。このような処置は、他の日
和見感染に対して、患者を無防備なままにし得る。さらに、ウイルスのクリアラ
ンスは、ＣＴＬの非存在下においてではないようなので、ＣＤ８⁺画分の再構築
の際のウイルスに対する患者の耐性のリスクは非常に現実的である。本発明者ら
は、ＬＴβＲ−Ｉｇの投与によるＬＴβＲ／ＨＶＥＭ経路の遮断は、一旦処置を
停止した場合、ホメオスタシスへの迅速な回復を伴う、天然においては一過性の
、強力な処置であることを示す（ＭａｃｋａｙおよびＢｒｏｗｎｉｎｇ、未公開
）。この様式において処置した生存しているマウスは、最終的に、試験された組
織からウイルスを取り除き（データは示さず）、そしてもはや疾患の徴候を示さ
ない。

【００８７】 これらのデータは、ＬＴβＲがシグナル伝達が、抗ウイルス応答およびＣＤ８
Ｔ細胞機能において重要な役割を果たすことの最初の実証であることを表す。
リンホトキシン系は、多分、Ｔ細胞およびＢ細胞組織を方向付けるいくつかのケ
モカインの発現の制御を介してリンパ系構造の組織と密接に関連している（Ｃｈ
ａｐｌｉｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０，２８９（１９９８
），Ｊ．Ｃｙｓｔｅｒ，印刷中）。濾胞性樹状細胞（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｄ
ｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）の成熟機能状態は、定常的なＢ細胞シグナル伝達
によって維持され、そしてこれらの細胞は、ＬＴβＲシグナル伝達の停止に際し
て１日以内に消失する。これらの細胞は、Ｂ細胞画分およびＴ細胞画分への抗原
の提示のために決定的である。合理的な推測は、ＣＤ８細胞への抗原提示のいく
つかの局面または成熟の間のケモカイン勾配におけるこれらの細胞の適切な配置
（ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ）が、ＬＴβＲシグナル伝達の破壊によって妨害され
ることである。ＬＴ機能の以前の研究は、主としてＢ細胞の生物学に焦点を当て
ており、そしてＴ細胞機能における関与は予期されなかった。ＬＴはさらなる機
能を有するか、またはこれらのデータは、新規なリガンドＬＩＧＨＴについての
役割を反映するかのいずれかである。本明細書で実証した疾患の進行においてＨ
ＶＥＭおよびＬＩＧＨＴが何の役割を果たし得るかは、現在のところわからない
。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＮＺＢマウスにクローン１３ＬＣＭＶが感染すると死に至ることを示
す。ＬＣＭＶ−１３に感染したＮＺＢマウス（ｎ＝１４）の死亡率曲線およびＬ
ＣＭＶ−１３に感染したマウスの感染後６日目の種々の組織（ｎ＝７）における
ウイルス力価。

【図２】 図２は、ＮＺＢマウスにおけるＬＣＭＶ−１３感染の組織学的プロフィールを
示す。（Ａ）（１００×、Ｈ＋Ｅ）における正常肺、（Ｂ）感染後５日目の肺に
おける単核細胞浸潤および肺胞壁肥厚を伴う間質性肺炎（１００×、Ｈ＋Ｅ）、
（Ｃ）脾臓におけるリンパ枯渇、細胞壊死および小胞構造の閉塞（２５×、Ｈ＋
Ｅ）（Ｄ）脾臓における細胞壊死および核崩壊砕片（ｋａｒｙｏｒｒｈｅｃｔｉ
ｃ ｄｅｂｒｉｓ）を示すより高倍率の図（１５８、Ｈ＋Ｅ）、（Ｅ）肺におけ
るＬＣＭＶ−１３陽性内皮細胞（矢印）およびマクロファージ（白矢印）（１０
０×、ＩＨＣ）、（Ｆ）脾臓におけるＬＣＭＶ−１３陽性内皮細胞（矢印）およ
び中皮細胞（矢じり）およびマクロファージ（白矢印）（５０×、ＩＨＣ）、（
Ｇ）心臓におけるＬＣＭＶ−１３陽性内皮細胞（１００×、ＩＨＣ）、（Ｈ）肝
臓におけるＬＣＭＶ−１３陽性クッパー細胞および洞様管壁細胞（１００×、Ｉ
ＨＣ）。

【図３】 図３は、ＬＴβＲシグナル伝達経路の遮断は、クローン１３感染ＮＺＢマウス
の生存率を有意に改善することを示す。記載されるような処置をされたクローン
１３感染ＮＺＢマウスについての死亡率曲線をここに提示する。ＮＺＢマウスに
は２．５×１０⁶ｐｆｕ Ｃｌ １３ ｉ．ｖ．が与えられ、次にエンドトキシ
ンを含まないＰＢＳ（参考文献Ｓ参照）中に２５０μｇのＴＮ３−１９．１２抗
体を含むｉ．ｐ．注入を感染後１日目および４日目の２回行った。コントロール
マウスには、同じ日に抗体を含まない同じ容量のＰＢＳが注入された。マウスは
、参考文献Ｒに記載されるように処置された。３重処置群に関して、ＴＮＦＲ５
５−ＩｇおよびＬＴβＲ−Ｉｇタンパク質が感染後０および３日目に２００μｇ
量でｉ．ｐ．で与えられた。コントロールマウスには、これらの融合タンパク質
（ＡＹ１９４３−２９）の合成の際に使用されるヒト抗体が同じ日に同じ量で与
えられた。ＬＴβＲ−Ｉｇのみを与えたマウスをＴＮＦＲ５５−Ｉｇ注入を省略
したこと以外は、同様に処置した。データは、いくつかの実験（抗ＴＮＦ（ＴＮ
３−１９．１２）単独）、ＬＴβＲ−Ｉｇ単独についてはｎ＝１６、３重処置群
についてはｎ＝１０（３重処置群についてはｎ＝１０、ＬＴβＲ−Ｉｇ単独につ
いてはｎ＝２２、ＬＴβＲ−Ｉｇ＋ＴＮＦＲ５５−Ｉｇ群についてはｎ＝１０、
抗ＴＮＦおよびＴＮＦＲ５５−Ｉｇ処置群についてはｎ＝５、抗ＴＮＦ（ＴＮ３
−１９．１２）単独についてはｎ＝６、およびコントロールについてはｎ＝２５
）からまとめられた。

【図４】 図４は、ＬＴβＲ経路の遮断がＣＤ８ Ｔ細胞機能の減少を生じることを示す
。異なる処置群におけるマウス由来の脾細胞を感染後６日目に収集し、以前に記
載されたようにＮＰ１１８ ９マーペプチドを含むＬ^dテトラマーで染色した。
生じた値を非特異的バックグランド染色について調整した。同じペプチドに応答
したインターフェロンγ産生をモニターするために、細胞を、最終濃度０．１μ
ｇ／ｍｌのＮＰ１１８およびＩＬ−２の存在下で３７℃５時間インキュベートし
た。ここで生じた値をペプチドの非存在下におけるバックグランドレベルについ
て調整した。コントロールヒトＩｇで処置された３匹のマウス由来の脾細胞を、
２匹のＬＴβＲ−Ｉｇマウス（ＬＴβ＃２／３）由来の脾細胞と同じようにプー
ルした。他のすべての結果は、個々のマウス由来である。

【図５】 図５は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞ではなく、ＣＤ８⁺Ｔ細胞の枯渇がＮＺＢマウスにおけ
るＬＣＭＶ−１３感染の致命的効果を逆転させることを示す。マウスをインビボ
の細胞集団の枯渇について記載されるように処置した。死亡率曲線は、処置され
た各々の群（ｎ＝４）について示されている。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年７月１８日（２００１．７．１８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４

【補正方法】追加

【補正内容】

【図４】

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５

【補正方法】追加

【補正内容】

【図５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＷ (71)出願人 Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， 2009 Ｒｉｄｇ ｅｗｏｏｄ Ｄｒｉｖｅ， Ａｔｌａｎｔ ａ， Ｇｅｏｒｇｉａ 30322， Ｕｎｉ ｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉ ｃａ (72)発明者 ブローニング， ジェフ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02146， ブルッキン， ミルトン ロー ド 32 (72)発明者 プグリィーリィ， マリアン アメリカ合衆国 ジョージア 30341， アトランタ， フラワーズ ロード サウ ス 3273， アパートメント ダブリュ (72)発明者 アーメッド， ラフィ アメリカ合衆国 ジョージア 30307， アトランタ， デュランド ミル ドライ ブ 1811 Ｆターム(参考） 4C084 AA01 AA02 AA17 AA27 BA41 BA44 CA53 CA62 DA26 NA14 ZB331 ZB332 4C085 AA01 AA13 AA14 EE01

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 個体における抗ウイルス応答を誘導する方法であって、該方
   法は、リンホトキシン−βのそのレセプターへの結合をブロックする薬剤の有効
   量および薬学的に受容可能なキャリアを該個体に投与する工程を包含する、方法
   。
2. 【請求項２】 前記薬剤がＬＴ−β−Ｒブロック剤である、請求項１に記載
   の方法。
3. 【請求項３】 前記薬剤が、リンホトキシン−βレセプターまたは可溶性リ
   ンホトキシン−βレセプターに対する抗体である、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記薬剤が、リンホトキシン−βレセプター／Ｉｇ融合タン
   パク質である、請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記薬剤が、可溶性リンホトキシン−β、またはリンホトキ
   シン−βに対する抗体である、請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 個体における抗ウイルス応答を誘導する方法であって、該方
   法はリンホトキシン−βレセプターおよび／またはＨＶＥＭシグナル伝達経路を
   ブロックする薬剤の有効量を該個体に投与する工程を包含する、方法。
7. 【請求項７】 前記個体がシンノンブルウイルス、エボラウイルス、マール
   ブルグウイルス、ラッサウイルスまたはデング熱ウイルスに感染する、請求項１
   〜６に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記薬剤がリンホトキシン−β−Ｒ／Ｉｇ融合タンパク質で
   ある請求項７に記載の方法。