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JP2002526061A - １−デオキシ−ｄ−キシルロース生合成経路の遺伝子 - Google Patents

１−デオキシ−ｄ−キシルロース生合成経路の遺伝子

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JP2002526061A
JP2002526061A JP2000574141A JP2000574141A JP2002526061A JP 2002526061 A JP2002526061 A JP 2002526061A JP 2000574141 A JP2000574141 A JP 2000574141A JP 2000574141 A JP2000574141 A JP 2000574141A JP 2002526061 A JP2002526061 A JP 2002526061A
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JP
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seq
dna
phosphate
protein
polypeptide
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JP2000574141A
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ヨマー、ハッサン
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Jomaa Pharmaka GmbH
Original Assignee
Jomaa Pharmaka GmbH
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、１−デソキシ−Ｄ−キシルロース生合成経路の１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスファートレダクトイソメラーゼ遺伝子、１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスファートシンターゼ遺伝子およびｇｃｐＥ遺伝子、ならびに、ベクター、宿主生物および植物を形質転換するためのその使用、およびこの生合成経路を阻害する物質を決定するためのその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、ウイルス、真核生物および原核生物のゲノムに組み込まれたときに
イソプレノイド生合成を改変するＤＮＡ配列に関し、そしてこれらの遺伝子導入
されたウイルス、真核生物および原核生物を作製するための遺伝子工学的方法に
関する。本発明はまた、植物における除草剤作用、抗菌作用、抗寄生虫作用、抗
ウイルス作用、抗真菌作用、殺菌作用を有する物質、ならびにヒトおよび動物に
おける抗菌作用、抗寄生虫作用、抗真菌作用、抗菌作用および抗ウイルス作用を
有する物質を同定する方法に関する。
【０００２】 従来の酢酸／メバロン酸経路および代わりのメバロン酸非依存性生合成経路で
あるデオキシ−Ｄ−キシルロースリン酸経路によってイソプレノイドが生成され
る生合成経路がすでに知られている（Rohmer, M.、Knani, M.、Simonin, P.、Su
tter, B.およびSahm, H.（1993）：Biochem. J. 295：517〜524）。
【０００３】 しかし、ウイルス、真核生物および原核生物におけるイソプレノイド濃度のデ
オキシ−Ｄ−キシルロースリン酸経路による変化がどのようにもたらされる得る
か、そしてそのような変化がどのような方法によってもたらされ得るかについて
は知られていない。図１には、この生合成経路が示されている。
【０００４】 従って、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートシンターゼ（Ｄ
ＯＸＰシンターゼ）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートレダ
クトイソメラーゼ（ＤＯＸＰレダクトイソメラーゼ）またはｇｃｐＥタンパク質
をコードするＤＮＡ配列が提供される。これらの３つの遺伝子および酵素はイソ
プレノイド生合成に関与している。
【０００５】 ｇｃｐＥタンパク質はキナーゼ機能を有し、糖またはリン糖またはイソプレノ
イド生合成前駆体のリン酸化を触媒し、特に、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリト
ール、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールホスフェート（特に、２−Ｃ−メチ
ル−Ｄ−エリトリトール４−ホスフェート）、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトロー
ス、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトロースホスフェート（特に、２−Ｃ−メチル−
Ｄ−エリトロース４−ホスフェート）のリン酸化を触媒する。イソプレノイド生
合成前駆体の存在下において、ｇｃｐＥタンパク質は、特に、下記の物質のリン
酸化を触媒する： ＣＨ２（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）＝Ｃ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 ＣＨ２（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）＝Ｃ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＨ、 ＣＨ２（ＯＨ）−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 ＣＨ２（ＯＨ）−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯ−ＣＨ２ＯＨ、 ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＯ−ＣＨ２−ＯＨ、 ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＨ、 ＣＨ２（ＯＨ）−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 ＣＨ２（ＯＨ）−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＨ、 ＣＨＯ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ−（ＯＨ）２、 ＣＨＯ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＨ、 ＣＨ２（ＯＨ）−Ｃ（ＯＨ）（ＣＨ３）−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 ＣＨ２（ＯＨ）−Ｃ（ＯＨ）（ＣＨ３）−ＣＨ＝ＣＨ−ＯＨ、 ＣＨ（ＯＨ）＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 ＣＨ（ＯＨ）＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＨ、 （ＣＨ３）２ＨＣ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 （ＣＨ３）２ＨＣ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−Ｈ、 （ＣＨ３）２ＨＣ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 （ＣＨ３）２ＨＣ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−Ｈ。
【０００６】 ＤＯＸＰシンターゼは、ピルビン酸とグリセルアルデヒド−３−ホスフェート
との縮合を触媒して、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ホスフェートを生成
し、ＤＯＸＰレダクトイソメラーゼは、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−
ホスフェートの２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール４−ホスフェートへの変換
を触媒する（図１を参照のこと）。
【０００７】 本発明は、下記のＤＮＡ配列に関する： 配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは１つはま
たは複数のアミノ酸が欠失し、または付加し、または他のアミノ酸によって置換
されている配列番号２によるポリペプチドのアナログまたは誘導体をコードする
ＤＮＡ配列、 配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは１つはま
たは複数のアミノ酸が欠失し、または付加し、または他のアミノ酸によって置換
されている配列番号４によるポリペプチドのアナログまたは誘導体をコードする
ＤＮＡ配列、および 配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは１つはま
たは複数のアミノ酸が欠失し、または付加し、または他のアミノ酸によって置換
されている配列番号６によるポリペプチドのアナログまたは誘導体をコードする
ＤＮＡ配列。
【０００８】 これらの遺伝子およびその遺伝子産物（ポリペプチド）をその一次構造ととも
に示し、それらは下記のように帰属される： 配列番号１：１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ホスフェートレダクトイソ
メラーゼ遺伝子 配列番号２：１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ホスフェートレダクトイソ
メラーゼ 配列番号３：１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ホスフェートシンターゼ遺
伝子 配列番号４：１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ホスフェートシンターゼ 配列番号５：ｇｃｐＥ遺伝子 配列番号６：ｇｃｐＥタンパク質。
【０００９】 これらのＤＮＡ配列はすべて、Plasmodium falciparumに由来する。
【００１０】 配列表に示されているＤＮＡ配列の他に、好適な配列には、遺伝子コードの縮
重の結果として別のＤＮＡ配列を有するが、同じペプチド、あるいは１つまたは
複数のアミノ酸が欠失し、または付加し、または他のアミノ酸によって置換され
ているポリペプチドのアナログまたは誘導体をコードする配列もまた含まれる。
【００１１】 １−デオキシ−Ｄ−キシルロース経路におけるイソプレノイド生合成に関わる
本発明による配列は、ウイルス、真核生物および原核生物における遺伝子発現に
好適である。
【００１２】 本発明により、真核生物または真核生物細胞には、動物細胞、植物細胞、藻類
、酵母、真菌が含まれ、一方、原核生物または原核生物細胞には、細菌、始原細
菌および真正細菌が含まれる。
【００１３】 ＤＮＡ配列が、上記のＤＮＡ配列が位置するゲノムに組み込まれたとき、ウイ
ルス、真核生物および原核生物における上記遺伝子の発現が可能になる。本発明
によって形質転換されたウイルス、真核生物および原核生物は、それ自体は知ら
れている方法で培養され、そのような培養時に生成したイソプレノイドが単離さ
れ、必要に応じて精製される。場合により、イソプレノイドは周囲の大気中に直
接放出されるので、必ずしもすべてのイソプレノイドを単離する必要はない。
【００１４】 本発明は、イソプレノイド含有量を改変するために、遺伝子導入されたウイル
ス、真核生物および原核生物を作製するための方法に関する。この方法は下記の
工程を含む： ａ）下記の部分配列を有するＤＮＡ配列の作製： ｉ）ウイルス、真核生物および原核生物において活性であり、目的とする標的
組織および標的細胞におけるＲＮＡの生成を確実にするプロモーター、 ｉｉ）配列番号２、４または６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
、あるいは配列番号２、４または６のポリペプチドのアナログまたは誘導体をコ
ードするＤＮＡ配列、 ｉｉｉ）ウイルス、真核生物および原核生物において上記遺伝子の発現を可能
にするか、または増強する５’非翻訳配列および３’非翻訳配列、 ｂ）ベクター（例えば、プラスミド、ウイルスＤＮＡ）を使用して、あるいはベ
クターを使用することなく、ウイルス、真核生物および原核生物のゲノムにＤＮ
Ａ配列を移入して組み込ませること。
【００１５】 完全な植物体を、このような方法で形質転換された植物細胞から再生させるこ
とができる。
【００１６】 配列番号１、配列番号３および配列番号５のヌクレオチド配列を有するタンパ
ク質コード配列は、特定の組織または細胞における転写を確実にするプロモータ
ーを備えることができる。そのようなプロモーターは、生成させるタンパク質を
コードする配列に対してセンス方向で（プロモーターの３’末端がコード配列の
５’末端に）連結される。ｍＲＮＡ合成の停止を決定する停止シグナルがコード
配列の３’末端に結合されている。発現タンパク質を特定の細胞小器官（クロロ
プラスト、アミロプラスト、ミトコンドリア、液胞、細胞質または細胞間隙など
）に誘導するために、いわゆるシグナル配列またはトランジットペプチドをコー
ドするさらなる配列をプロモーターとコード配列との間に挿入することができる
。場合により、ある種のシグナルをコードする配列をタンパク質のＣＯＯＨ末端
に挿入する必要がある。シグナル配列は、タンパク質のコード配列と同じ読み枠
でなければならない。非常に多くのクローニングベクターを、本発明によるＤＮ
Ａ配列を高等植物に導入することに関して調製するために得ることができる。そ
のようなベクターは、大腸菌の複製シグナル、および形質転換細胞の選抜を可能
にするマーカーを含有する。所望する遺伝子が植物に導入される方法に依存して
、さらなるＤＮＡ配列が必要となることがある。例えば、Ｔｉプラスミドまたは
Ｒｉプラスミドを使用して植物細胞を形質転換する場合、Ｔｉプラスミドおよび
ＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの少なくとも一方の右側境界を、しかし多くの場合
にはその右側境界および左側境界を隣接領域として導入遺伝子に挿入しなければ
ならない。植物細胞を形質転換するためにＴ−ＤＮＡを使用することは詳細に調
べられており、欧州特許第１２０５１６号；Hoekamaの「バイナリー植物ベクタ
ーシステム」Offset-drukkerij Kanters B.V. Alblasserdam（1985）、第Ｖ章；
Fraley他、Crit. Rev. Plant Sci.、４、１〜46、およびAn他（1985）、EMBO J.
、４、277〜287に包括的に記載されている。導入された遺伝子がゲノムに一旦組
み込まれると、その遺伝子は一般に安定であり、最初に形質転換された細胞の子
孫にも保持される。遺伝子は、通常、殺生物剤または抗生物質（例えば、カナマ
イシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ヒグロマイシンまたはホスフィノトリシン
など）に対する耐性を形質転換された植物細胞に付与する選択マーカーを含む。
従って、使用される特定のマーカーは、挿入されたＤＮＡを有しない細胞から形
質転換細胞を選択することを目的とする。
【００１７】 多くの技術を、植物にＤＮＡを導入するために用いることができる。このよう
な技術には、アグロバクテリウム属細菌（例えば、Agrobacterium tumefaciens
）を用いた形質転換、プロトプラスト融合、ＤＮＡのマイクロ注入、エレクトロ
ポレーション、ならびに弾道学的方法およびウイルス感染が含まれる。その後、
植物体を、形質転換された植物材料から、選択目的の抗生物質または殺生物剤を
含有する適切な培地で再生させることができる。注入用およびエレクトロポレー
ション用のプラスミドには特定の条件を必要としない。しかし、植物体をそのよ
うな形質転換細胞から再生させようとする場合には選択マーカー遺伝子を存在さ
せなければならない。形質転換された細胞は従来の方法で植物に成長させられる
（McCormick他（1986）、Plant Cell Reports、５、81〜84）。そのような植物
は、通常的に栽培して、同じ形質転換ゲノムまたは他のゲノムを有する植物と交
配することができる。得られる個体は、対応する表現型特性を有する。
【００１８】 本発明はまた、本発明による１つまたは複数のＤＮＡ配列を含有する発現ベク
ターを提供する。そのような発現ベクターは、適切な機能的調節シグナルを本発
明によるＤＮＡ配列に配置することによって得られる。そのような調節シグナル
は、発現に関与するＤＮＡ配列（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハ
ンサー、リボソーム結合部位など）であって、宿主生物により認識されるＤＮＡ
配列である。
【００１９】 例えば、宿主生物における組換えＤＮＡの複製または組換えを制御するさらな
る調節シグナルもまた、発現ベクターの必要に応じて使用される構成部分であり
得る。
【００２０】 本発明によるＤＮＡ配列または発現ベクターで形質転換された宿主生物もまた
本発明により提供される。
【００２１】 本発明による酵素を発現させるために好適な宿主細胞および宿主生物は、ＤＯ
ＸＰシンターゼ、ＤＯＸＰレダクトイソメラーゼまたはｇｃｐＥタンパク質の機
能を有する内在性酵素を含まないものである。これは、始原細菌、動物、真菌、
粘菌およびある種の真正細菌の場合である。そのような内在性の酵素活性が存在
しないことによって、組換え酵素の検出および精製がかなり容易になる。結果と
して、宿主細胞から得られる粗抽出物において、活性を、特に、様々な化学品お
よび薬品によって、本発明による組換え酵素の活性阻害を直接的に測定すること
もまた初めて可能になる。
【００２２】 本発明による酵素は、ポリペプチド鎖の翻訳後修飾および本来のフォールディ
ングが達成され得る場合には真核生物細胞において都合よく発現させられる。さ
らに、発現システムに依存して、ＤＮＡがスプライシングされることによってイ
ントロンが除かれ、そして酵素が寄生虫に特徴的なポリペプチド鎖で産生される
ことが、ゲノムＤＮＡ配列を発現させたときに保証される。組換えＤＮＡ技術を
使用して、イントロンをコードする配列を、発現させるＤＮＡ配列から除くこと
ができ、あるいは発現させるＤＮＡ配列に実験目的で挿入することができる。
【００２３】 タンパク質は、宿主細胞または宿主細胞の培養上清から、当業者に知られてい
る方法を使用して単離することができる。酵素のインビトロ再活性化もまた必要
とされ得る。
【００２４】 精製を容易にするために、本発明による酵素または酵素の部分配列は、様々な
ペプチド鎖との融合タンパク質として発現させることができる。オリゴヒスチジ
ン配列、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、チオレドキシンまたは
カルモジュリン結合ペプチドから得られる配列がこの目的に特に適する。
【００２５】 本発明による酵素または酵素の部分配列はさらに、当業者に知られている、組
換え酵素が細胞外の培地に輸送されるか、あるいは宿主細胞の特定の器官に輸送
されるようなペプチド鎖との融合タンパク質として発現させることができる。こ
の結果、酵素の精製および生物学的活性の研究がともに容易になり得る。
【００２６】 本発明による酵素を発現させるとき、個々のコドンを改変することが便利であ
ることが明らかにされることがある。コード領域における塩基の意図的な置換も
また、タンパク質の最適な合成を確実にするために、寄生虫で使用されているコ
ドンが異種の発現システムにおけるコドン使用と異なる場合には望ましいことで
あり得る。
【００２７】 本発明による酵素はさらに、当業者に知られている方法によるインビトロ翻訳
によって標準的な条件のもとで得ることができる。この目的に好適なシステムは
、ウサギ網状赤血球および小麦胚芽抽出物および細菌溶解物である。インビトロ
転写されたｍＲＮＡもまた、ツメガエル（Xenopus）卵母細胞において翻訳させ
ることができる。
【００２８】 本発明による酵素のペプチド配列から誘導される配列であるオリゴペプチドお
よびポリペプチドは化学合成によって得ることができる。配列を適切に選択する
ことによって、そのようなペプチドは、本発明による酵素に特徴的な性質を有す
る。そのようなペプチドは大量に製造することができ、酵素活性の速度論、酵素
活性の調節、酵素の三次元構造、様々な化学品および薬品による酵素活性の阻害
、ならびに様々なリガンドの結合構造および結合親和性を調べるために特に適し
ている。
【００２９】 配列番号１、３または５の配列に由来するヌクレオチドを有するＤＮＡは、好
ましくは、本発明による酵素の組換え産生のために使用される。
【００３０】 従って、本発明はさらに、デオキシ−Ｄ−キシルロースリン酸代謝経路を阻害
する化合物をスクリーニングするための方法に関する。この方法により、配列番
号１、配列番号３または配列番号５によるオリゴヌクレオチド配列あるいはその
変化体またはホモログの一部を少なくとも含む組換え発現ベクターを含有する宿
主生物が提供され、ヒトおよび動物における抗菌作用、抗寄生虫作用、抗菌作用
、抗ウイルス作用および抗真菌作用、あるいは植物における抗菌活性、抗ウイル
ス活性、殺菌活性、除草剤活性または抗真菌活性を有すると考えられる化合物が
提供される。その後、宿主細胞はそのような化合物と接触させられ、化合物の活
性が測定される。
【００３１】 本発明はまた、ｇｃｐＥタンパク質の酵素活性を測定するための方法を提供す
る。その活性は、知られている方法を使用して測定することができる。測定は、
糖またはリン糖またはイソプレノイド生合成前駆体のリン酸化を検出することに
よって、特に、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エ
リトリトールホスフェート（特に、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール４−ホ
スフェート）、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトロース、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリ
トロースホスフェート（特に、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトロース４−ホスフェ
ート）のリン酸化を検出することによって行われる。本発明により、この測定方
法の使用が、特定の酵素の活性を阻害する物質を同定するためにも提供される。
【００３２】 ＤＯＸＰシンターゼおよびＤＯＸＰレダクトイソメラーゼの酵素活性は、グリ
セルアルデヒド−３−ホスフェートの２−Ｃ−メチルエリトリトール４−ホスフ
ェートへの変換を測定することによって１段階で検出することができる。
【００３３】 ＤＯＸＰシンターゼおよびＤＯＸＰレダクトイソメラーゼの活性測定は同様に
進行する。Querol他によって記載された蛍光法もまた、ＤＯＸＰシンターゼ活性
を測定するために適する（Querol他、アブストラクト、第４回植物イソプレノイ
ドに関する欧州シンポジウム、バルセロナ、1999年4月21日〜23日）。
【配列表】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１１月１４日（２０００．１１．１４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００５】 ｇｃｐＥタンパク質はキナーゼ機能を有し、糖またはリン糖またはイソプレノ
イド生合成前駆体のリン酸化を触媒し、特に、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリト
ール、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールホスフェート（特に、２−Ｃ−メチ
ル−Ｄ−エリトリトール４−ホスフェート）、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトロー
ス、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトロースホスフェート（特に、２−Ｃ−メチル−
Ｄ−エリトロース４−ホスフェート）のリン酸化を触媒する。イソプレノイド生
合成前駆体の存在下において、ｇｃｐＥタンパク質は、特に、下記の物質のリン
酸化を触媒する： ＣＨ２（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）＝Ｃ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 ＣＨ２（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）＝Ｃ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＨ、 ＣＨ２（ＯＨ）−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 ＣＨ２（ＯＨ）−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯ−ＣＨ２ＯＨ、 ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＯ−ＣＨ２−ＯＨ、 ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＨ、 ＣＨ２（ＯＨ）−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 ＣＨ２（ＯＨ）−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＨ、 ＣＨＯ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 ＣＨＯ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＨ、 ＣＨ２（ＯＨ）−Ｃ（ＯＨ）（ＣＨ３）−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 ＣＨ２（ＯＨ）−Ｃ（ＯＨ）（ＣＨ３）−ＣＨ＝ＣＨ−ＯＨ、 ＣＨ（ＯＨ）＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 ＣＨ（ＯＨ）＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＨ、 （ＣＨ３）２ＨＣ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 （ＣＨ３）２ＨＣ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−Ｈ、 （ＣＨ３）２ＨＣ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 （ＣＨ３）２ＨＣ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−Ｈ。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００６】 ＤＯＸＰシンターゼは、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド−３−ホスフェ
ートの縮合を触媒して、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ホスフェートを生
成し、ＤＯＸＰレダクトイソメラーゼは、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−
ホスフェートの２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール４−ホスフェートへの変換
を触媒する（図１を参照のこと）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００７】 本発明は、下記のＤＮＡ配列に関する： 配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは１つはま
たは複数のアミノ酸が欠失し、または付加し、または他のアミノ酸によって置換
されている配列番号２によるポリペプチドのアナログまたは誘導体をコードする
ＤＮＡ配列であって、ポリペプチドの酵素活性が保持され、かつその配列は寄生
虫に由来し、天然株の変動性の枠内で存在するその配列変異体が含まれる、ＤＮ
Ａ配列、 配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは１つはま
たは複数のアミノ酸が欠失し、または付加し、または他のアミノ酸によって置換
されている配列番号４によるポリペプチドのアナログまたは誘導体をコードする
ＤＮＡ配列であって、ポリペプチドの酵素活性が保持され、かつその配列は寄生
虫に由来し、天然株の変動性の枠内で存在するその配列変異体が含まれる、ＤＮ
Ａ配列、および 配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは１つはま
たは複数のアミノ酸が欠失し、または付加し、または他のアミノ酸によって置換
されている配列番号６によるポリペプチドのアナログまたは誘導体をコードする
ＤＮＡ配列であって、ポリペプチドの触媒機能が保持されている、ＤＮＡ配列。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/12 ４Ｂ０６５ 31/10 33/00 ４Ｃ０８４ 31/12 Ｃ１２Ｎ 9/00 ４Ｃ０８６ 33/00 9/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 9/10 9/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 9/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 9/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ｃ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/48 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，Ｔ Ｊ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2B030 AB04 AD05 CA06 CA17 CA19 CD12 2G045 AA31 AA34 AA35 CB20 FB01 FB02 4B024 AA01 AA07 BA07 BA08 CA04 CA06 DA01 EA04 FA02 GA11 HA01 4B050 CC03 DD11 LL01 4B063 QA06 QA07 QQ08 QR90 QS02 4B065 AA88X AA90Y AB01 AC14 BA01 CA28 CA29 CA44 4C084 AA07 AA13 BA01 BA08 BA22 BA23 BA44 CA51 DC01 NA14 ZB331 ZB351 ZB371 ZC192 4C086 AA01 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB33 ZB35 ZB37 ZC19

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは１つはま
    たは複数のアミノ酸が欠失し、または付加し、または他のアミノ酸によって置換
    されている配列番号２の前記ポリペプチドのアナログまたは誘導体をコードする
    ＤＮＡ配列。
  2. 【請求項２】 配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは１つはま
    たは複数のアミノ酸が欠失し、または付加し、または他のアミノ酸によって置換
    されている配列番号４の前記ポリペプチドのアナログまたは誘導体をコードする
    ＤＮＡ配列。
  3. 【請求項３】 配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは１つはま
    たは複数のアミノ酸が欠失し、または付加し、または他のアミノ酸によって置換
    されている配列番号６の前記ポリペプチドのアナログまたは誘導体をコードする
    ＤＮＡ配列。
  4. 【請求項４】 プロモーター、オペレーター、エンハンサー、リボソーム結合部位などの機能
    的な調節シグナルをさらに含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記
    載のＤＮＡ配列。
  5. 【請求項５】 下記の部分配列を有するＤＮＡ配列： ｉ）ウイルス、真核生物および原核生物において活性であり、目的とする標的組
    織および標的細胞におけるＲＮＡの生成を確実にするプロモーター、 ｉｉ）請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ配列、 ｉｉｉ）ウイルス、真核生物および原核生物において、前記ＲＮＡの３’末端に
    ポリ（Ａ）残基を付加させる３’非翻訳配列。
  6. 【請求項６】 イソプレノイド含有量を改変するために遺伝子導入されたウイルス、真核生物
    および原核生物を作製するための方法であって、請求項４または５に記載される
    ＤＮＡ配列を、ベクターを使用して、あるいはベクターを使用することなく、ウ
    イルス、真核生物および原核生物のゲノムに移して組み込むことを特徴とする方
    法。
  7. 【請求項７】 請求項１〜５に記載される１つまたは複数のＤＮＡ配列を、その配列が発現さ
    せられる「外来」ＤＮＡまたは「付加」ＤＮＡとして含有する植物および植物細
    胞などの遺伝子導入されたシステム。
  8. 【請求項８】 請求項１〜５に記載される１つまたは複数のＤＮＡ配列を含有する発現ベクタ
    ー。
  9. 【請求項９】 １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸代謝経路に含まれるタンパク質
    であって、ａ）配列番号１、３または５のＤＮＡによってコードされるか、ｂ）
    成熟タンパク質をコードするＤＮＡ領域において、配列番号１、３または５のＤ
    ＮＡ配列と、あるいはこれらのＤＮＡ配列のフラグメントとハイブリダイゼーシ
    ョンするＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質。
  10. 【請求項１０】 寄生虫の培養上清または粉砕された寄生虫からクロマトグラフィー的方法およ
    び電気泳動的方法による精製で得られる、請求項９に記載のタンパク質。
  11. 【請求項１１】 前記タンパク質は、 ａ）ウイルス、真核生物または原核生物での外因性ＤＮＡの発現産物であること
    、ｂ）配列番号１、３または５の配列によってコードされるか、あるいは成熟タ
    ンパク質をコードするＤＮＡ領域において、配列番号１、３または５のＤＮＡ配
    列と、またはこれらのＤＮＡ配列のフラグメントとハイブリダイゼーションする
    ＤＮＡ領域によってコードされること、あるいはｃ）ｂ）において規定される配
    列と遺伝子コードの縮重を伴うことなくハイブリダイゼーションし、かつ対応す
    るアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列によってコードさ
    れることを特徴とする、請求項９および１０のいずれかに記載のタンパク質。
  12. 【請求項１２】 前記タンパク質は配列番号２、４または６のアミノ酸配列を含むことを特徴と
    する、請求項９〜１１のいずれかに記載にタンパク質。
  13. 【請求項１３】 ｇｃｐＥタンパク質の酵素活性を測定するための方法であって、糖またはリン
    糖またはイソプレノイド生合成前駆体のリン酸化、特に、２−Ｃ−メチル−Ｄ−
    エリトリトール、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールホスフェート（特に、２
    −Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−ホスフェート）、２−Ｃ−メチル−Ｄ
    −エリトロース、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトロースホスフェート（特に、２−
    Ｃ−メチル−Ｄ−エリトロース−４−ホスフェート）ならびにホスフェートおよ
    びアルコール前駆体のリン酸化が検出されることを特徴とする方法。
  14. 【請求項１４】 下記のホスフェートまたはアルコールのリン酸化が検出されることを特徴とす
    る、請求項１３に記載の方法： ＣＨ２（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）＝Ｃ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 ＣＨ２（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ３）＝Ｃ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＨ、 ＣＨ２（ＯＨ）−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 ＣＨ２（ＯＨ）−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯ−ＣＨ２ＯＨ、 ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＯ−ＣＨ２−ＯＨ、 ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＨ、 ＣＨ２（ＯＨ）−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、
    ＣＨ２（ＯＨ）−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＨ、 ＣＨＯ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 ＣＨＯ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＨ、 ＣＨ２（ＯＨ）−Ｃ（ＯＨ）（ＣＨ３）−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 ＣＨ２（ＯＨ）−Ｃ（ＯＨ）（ＣＨ３）−ＣＨ＝ＣＨ−ＯＨ、 ＣＨ（ＯＨ）＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 ＣＨ（ＯＨ）＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＨ、 （ＣＨ３）２ＨＣ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 （ＣＨ３）２ＨＣ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−Ｈ、 （ＣＨ３）２ＨＣ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）２、 （ＣＨ３）２ＨＣ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｏ−Ｈ。
  15. 【請求項１５】 ＤＯＸＰシンターゼおよびＤＯＸＰレダクターゼの酵素活性を混合測定するた
    めの方法であって、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートの２−Ｃ−メチルエ
    リトリトール−４−ホスフェートへの変換が検出されることを特徴とする方法。
  16. 【請求項１６】 ヒトおよび動物における感染プロセスを処置するための化合物のスクリーニン
    グ方法であって、 ａ）配列番号１、配列番号３または配列番号５に記載されるオリゴヌクレオチド
    配列あるいはその変化体またはアナログの少なくとも一部を含む組換え発現ベク
    ターを含有する宿主細胞と、さらにはヒトおよび動物における抗真菌作用、抗生
    物作用、抗寄生虫作用または抗ウイルス作用を有すると考えられる化合物とを提
    供すること、 ｂ）前記宿主細胞を前記化合物と接触させること、および ｃ）前記化合物の抗菌作用、抗真菌作用、抗生物作用、抗寄生虫作用または抗ウ
    イルス作用を測定すること を含む方法。
  17. 【請求項１７】 植物を処置するための化合物のスクリーニング方法であって、 ａ）配列番号１、配列番号３または配列番号５に記載されるオリゴヌクレオチド
    配列あるいはその変化体またはアナログの少なくとも一部を含む組換え発現ベク
    ターを含有する宿主細胞と、さらには植物における抗菌作用、抗ウイルス作用、
    抗寄生虫作用、殺菌作用、殺真菌作用または除草剤作用を有すると考えられる化
    合物とを提供すること、 ｂ）前記宿主細胞を前記化合物と接触させること、および ｃ）前記化合物の抗菌作用、抗ウイルス作用、抗寄生虫作用、殺菌作用、殺真菌
    作用または除草剤作用を測定すること を含む方法。
  18. 【請求項１８】 ヒトおよび動物における疾患を予防または処置するための、請求項１〜５のい
    ずれかに記載されるＤＮＡまたは請求項９〜１２のいずれかに記載されるタンパ
    ク質または請求項７に記載される遺伝子導入システムの使用。
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