MXPA00010069A - Metodo para identificar agentes activos quimicos, y agentes activos para inhibir la trayectoria biosintetica del 5-fosfato de 1-desoxi-d-xilulosa. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a un metodo para identificar agentes activos quimicos que son adecuados para tratar enfermedades infecciosas provocadas por parasitos unicelulares o pluricelulares. Conforme al metodo, se pone en contacto proteinas que forman parte de la trayectoria metabolica del 5-fosfato de 1-desoxi-d-xi lu losa, o sus derivados que actuan de la misma manera, con los agentes activos que estan siendo probados en su efectividad contra parasitos, y se selecciona aquellos agentes que inhiben las proteinas o sus derivados. La invencion se refiere tambien a los agentes activos que son identificados y a su uso para producir medicamentos para tratar infecciones parasitarias.

Description

MÉTODO PARA IDENTIFICAR AGENTES ACTIVOS QUÍMICOS, Y AGENTES ACTIVOS PARA INHIBIR LA TRAYECTORIA BIOSINTETICA DEL 5-FOSFATO DE 1 -DESOXI-D-XILULOSA La invención se refiere a un proceso para identificar ingredientes activos que son adecuados para tratar enfermedades parasitarias provocadas por parásitos unicelulares o pluricelulares. La medicina y la industria farmacéutica son las áreas de aplicación de la invención. La invención se refiere también a proteínas, y a fragmentos de proteínas, también a las secuencias de ADN que codifican esas proteínas o fragmentos de proteínas, al uso de esas secuencias de ADN, esas proteínas o sus fragmentos, para identificar sustancias que actúan contra parásitos unicelulares o pluricelulares, y a los ingredientes activos identificados de esa manera y a su uso para producir composiciones farmacéuticas. El término parásitos incluye parásitos unicelulares y parásitos pluricelulares, incluyendo los helmínticos y los antropoideos. Estos provocan enfermedades infecciosas en humanos y en animales. En el contexto de esta invención, se va a usar la definición estrictamente científica de parásitos, es decir, los parásitos unicelulares deben ser tomados en el sentido de protozoarios. Existe ya un gran número de preparaciones contra enfermeddes parasitarias. Las preparaciones de que se dispone ya se han vuelto inútiles para tratar humanos y animales, debido al rápido desarrollo de resistencia. Como resultado, hay ya muchas regiones afectadas por los parásitos de la malaria, que son resistentes a medicamentos tales como cloroquina. También hay informes acerca del desarrollo de resistencia a preparaciones comunes y corrientes (praziquantel) para tratar la bilharzia. Estos desarrollos de resistencia y otros factores han conducido al hecho de que la malaria y la bilharzia ya estén entre las enfermedades tropicales más frecuentes. Se estima que de 300 a 500 millones de personas sufren de malaria. De 2 a 2.5 millones de personas mueren anualmente de malaria. Adicionalmente, los nuevos medicamentos como mefloquin, son muy caros de producir y tienen mucho efectos colaterales. Por lo tanto, hay gran necesidad de composiciones farmacéuticas para tratar humanos y animales. En el pasado hubo muchos intentos por desarrollar composicioines de quimioterapia contra parásitos, en particular contra los patógenos de la malaria y la bilharzia. Uno de esos intentos está relacioado con la inhibición de la llamada biosíntesis de isoprenoide. Los isoprenoides son moléculas que son formdas a partir de unidades individuales de ¡sopreno (difosfato de isopentilo) y adoptan importantes funciones en la célula. Éstos ¡ncluyen los esteróles, las ubiquinonas y otras moléculas que son importantes para el alojamiento del parásito. El proceso a seguir se basó, en este caso, en un modelo que se estableció en hongos y células de mamíferos. En los hongos y en las células de mamíferos, la subunidad difosfato de isopentenilo se forma por condensación de tres moléculas de acetil-CoA a HMG-CoA. HBG-CoA se convierte luego de HMG-CoA-reductasa a mevalonato, que se convierte entonces con fosfato de mevalonato como etapa intermedia, a fosfato de ¡sopentenilo (ver figura 7). Los inhibidores de HMG-Coa-reductasa, tales como, por ejemplo, Lovastatin, Simvastatin y Pravastatin han sido usados para inhibir el desarrollo de parásitos. Sí bien fue posible obtener inhibición in vitro usando dosis muy altas de Lovastatin y Simvstatin, falló la inhibición in vivo. El tratamiento de ratones infectados con esquistosomos, con Lovastatin, condujo a la inhibición de la puesta de huevos de estos gusanos; sin embargo, se tuvo que usar concentraciones muy altas de Lovastatin para destruir algunos de esos gusanos in vivo. Sorprendentemente se ha descubierto que los parásitos, en particular de los géneros Plasmodia y Tripanosoma (que provocan la malaria y el mal del sueño) tienen por lo menos otra trayectoria metabólica para la síntesis de los isoprenoides. Esa trayectoria metabólica está basada en la condensación de 3-fosfato de gliceraldehído y piruvato, a 5-fosfato de 1-desoxi-D-xilulosa (DOXP). Luego se convierte DOXP a 4-fosfato de 2-C-metil-D-eritrosa que se convierte entonces a 4-fosfato de 2-C-metíl-eritritoi como etapa intermedia para el difosfato de isopentenilo. Las enzimas DOXP-sintasa y DOXP-reductoisomerasa, entre otras, están implicadas en esa trayectoria metabólica (véase la figura 7). En el pasado esa trayectoria metabólica únicamente había sido descrita en plantas, en algas y en algunas bacterias (Sprenger y coautores, PNAS, 94 (1995) 12857-62 y Kuzuyama y coautores, Tetrahedron Letters 39 (1998) 4509-12). La inhibición de la trayectoria metabólica de DOXP descrita arriba, en particular las enzimas DOXP-sintasa y DOXP-reductoisomerasa, mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia, es adecuada para prevenir y tratar infecciones provocadas por parásitos unicelulares y pluricelulares en humanos y animales. Como esta trayectoria metabólica no ocurre en humanos, es idealmente adecuada como blanco o destino para una quimioterapia selectiva de parásitos. Las enzimas desoxixilulosa-4-fosfato-sintasa y desoxixilulosa-5-fosfato-reductoisomerasa son particularmente adecuadas como destino para quimioterapia. La inhibición de la enzima desoxixilulosa-5-fosfato-reductoisomerasa de la malaria demostró ser particularmente baja en efectos colaterales, y adecuada, ya que el hombre no tiene substratos y sus precursores ni el producto de la enzima ni la propia enzima. La presente invención se refiere a procesos para obtener ingredientes activos que inhiben la trayectoria metabólica de DOXP y a esos ingredientes activos para producir composiciones farmacéuticas para tratamiento y profilaxis de enfermedades infecciosas provocadas por parásitos unicelulares o pluricelulares. Es el objetivo de la invención proveer un nuevo proceso para identificar los ingredientes activos para el tratamiento de enfermedades parasitarias en humanos y animales. Es otro objetivo desarrollar un proceso para obtener una medicación que destruya selectivamente el patógeno y que tenga pocos efectos colaterales. Se logra este objetivo mediante un proceso de acuerdo con la reivindicación 1. El proceso de acuerdo con la invención y los ingredientes activos encontrados, están caracterizados porque se inhibe la biosíntesis de isoprenoides en la llamada trayectoria metabólica del 5-fosfato de 1 -desoxi-D-xilulosa. Ninguna de las trayectorias metabólicas descritas está presente en los humanos ni en los animales; únicamente en plantas, algas, algunas eubacterias y en parásitos como, por ejemplo, los parásitos de la malaria; por lo tanto, esta estrategia de tratamiento sobresale por tener pocos efectos colaterales. La presente invención se refiere adicionalmente a enzimas implicadas en esta trayectoria metabólica y a fragmentos de esas enzimas. Esas enzimas son proteínas adecuadas para llevar a cabo el proceso de acuerdo con la invención, para identificar ingredientes activos. La presente invención se refiere adicionalmente a secuencias de ADN que codifican esas enzimas o fragmentos de esas enzimas. La presente invención se refiere a un proceso y a anticuerpos para identificar las enzimas o sus fragmentos y producir las enzimas o sus fragmentos por medio de tecnología recombinante. Se refiere además la invención al uso de esas enzimas o sus fragmentos, o al uso de las secuencias de ADN que codifican esas enzimas o esos fragmentos de enzimas, para identificar las sustancias activas contra patógenos unicelulares o pluricelulares.

La invención se refiere adicionalmente a ingredientes activos descubiertos con ayuda de las enzimas de acuerdo con la invención. Se describirá la invención con mayor detalle en lo que viene después, con ayuda de los dibujos anexos, en los que: La figura 1a muestra la secuencia de nucleótidos del gene que codifica la proteína 1 -desoxi-D-xilulosa-5-fosfato-reductoísomerasa de Plasmodium falciparum. La figura 1b muestra la secuencia de ncleótidos dei gene que codifica la 1 -desoxi-D-xilulosa-5-fosfato-sintasa, de Plasmodium falciparum La figura 2a muestra la secuencia de nucleótidos del gene que codifica la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato-reductoisomerasa de Plasmodium falciparum y la secuencia de aminoácidos correspondiente. La figura 2B muestra la secuencia de nucleótidos del gene que codifica la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato-sintasa de Plasmodium falciparum y la secuencia de aminoácidos correspondiente. La figura 3a muestra la secuencia de aminoácidos de la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato-reductoisomerasa de Plasmodium falciparum. La figura 3b muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato-sintasa, de los parásitos Plasmodium falciparum.

La figura 4a es un detalle de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la figura 1b. La figura 4b es un detalle de la secuencia de nucleótidos, con la secuencia de aminoácidos correspondientes, de acuerdo con la figura 2b. La figura 4c es un detalle de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la figura 3b. La figura 5 muestra datos in vivo para los valores de parasitemia después de 4 días de tratamiento con tres dosis, en cada caso, de: formilo, que corresponde a la sal monosódica del ácido 3-(N-formil- N-hidroxilamino)propil fosfónico, y acetilo, que corresponde a la sal monosódica del ácido 3-(N-acetil-N-hidroxilamino)propilfosfóníco. La figura 6a muestra la inhibición del desarrollo de P. falciparum después de la adición de la sal monosódica del ácido 3- (N-formil-N-hidroxilamino)propilfosfónico (círculos claros) y de la sal monosódica del ácido 3-(N-acetil-N-hidroxilamino)prop¡lfosfónico (círculos oscuros) para la cepa HB3. La figura 6b muestra la inhibición del desarrollo de P. falciparum después de la adición de la sal monosódica del ácido 3- (N-formil-N-hidroxilamino)propilfosfónico (círculos claros) y de la sal monosódica del ácido 3-(N-acetil-N-hidroxilamino)propilfosfónico (círculos oscuros) para la cepa A2; y La figura 6c muestra la inhibición del desarrollo de P. falciparum después de la adición de la sal monosódica del ácido 3-(N-formil-N-hidroxilamino)propilfosfónico (círculos claros) y de la sal monosódica del ácido 3-(N-acetil-N-hidroxilamino)propilfosfónico (círculos cerrdos) para la cepa Dd2; y La figura 7 muestra la trayectoria de biosíntesis de acetato/mevalonato clásica, en comparación con la tryectoria de biosínetsis alternativa de DOX-P. Los genes codificadores de las enzimas DOXP-sintasa y DOXP-reductoisomerasa fueron detectados mediante procesos genéticos (figuras 1a, 1b, 2a, 2b). Después del enriquecimiento por la conversión de cadena de polimerasa, a partir de la genoma de P. falciparum, se clonó estos genes en plásmidos bacterianos y se determinó su secuencia de nucleótidos. Los datos de secuencia mostraron una elevada homología de estos genes con los genes correspondientes de algas, plantas y bacterias. Las homologías muy elevadas mostraron que los tres genes codificaban las enzimas DOXP-sintasa y DOXP-reductoisomerasa de P. falciparum. Después de la expresión en sistemas heterólogos, se purificó las enzimas como proteínas recombinantes y se las usó para estudios de actividad en sistemas libres de células. Se midió la actividad de DOXP-sintasa convirtiendo 3-fosfato y piruvato de gliceraldehído a 5-fosfato de 1 -desoxi-D-xiluiosa. Se midió la acividad de la DOXP-reductoisomerasa convirtiendo el 5-fosfato de 1 -desoxi-D-xilulosa a 4-fosfato de 2-C-metil.D.erüritol, en presencia de NADPH. La medición del cambio en la concentración de NADPH es por medio de una variación de parámetros. Este proceso es conocido por las personas expertas en la materia. Se puede definir las enzimas codificándolas con la secuencia de ADN (Figuras 1a, 1b, 2a, 2b) y las secuencias de aminoácido derivadas de ellas (figuras 3a y 3b). Sin embargo, las enzimas de los parásitos individuales pueden ser diferentes de un parásito a otro. Dichas variaciones de los aminoácidos habitualmente son cambios de aminoácido. Sin embargo, también puede haber omisiones, inserciones y adiciones de aminoácidos a la secuencia total. Las enzimas de acuerdo con la invención, dependiendo tanto del tamaño como del tipo de célula en que se expresan, pueden estar glicosiladas o no glicosiladas. Las enzimas de acuerdo con la invención, o los fragmentos de esas enzimas, son producidos mediante expresión del ADN de acuerdo con la invención en sistemas de expresión adecuados; por ejemplo, en bacterias, en particular en E. coli, como sistema de expresión procariótico, o en un sistema de expresión eucríótico, en particular en células COS o en Dictyostelium discoideum. Con ayuda de la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención, es posible buscar el gene de codificación o sus variantes en la genoma de cualquier parásito, para identificarlos y aislar el gene codificador deseado para esas enzimas. Los procesos de este tipo y los procesos de selección adecuados para ese propósito, son conocidos por las personas expertas en la materia.

Como resultado de la aplicación de tecnología recombinante, es posible producir una multiplicidad de variantes de enzimas o fragmentos de enzimas. Se puede modificar los derivados de este tipo, por ejemplo, en uno o más aminoácidos, por sustitución, omisión o adición. La derivación puede ser, por ejemplo, mediante mutagénesis directa al sitio. Se puede efectuar fácilmente variaciones de este tipo, por el personal experto en la materia. Simplemente se debe asegurar que se retengan las propiedades características de las enzimas. Por lo tanto, otro objetivo de esta invención lo constituyen las enzimas, que están implicadas en la trayectoria metabólica DOXP, en particular la DOXP-sintasa y la DOXP-reductoisomerasa, que: (a) ' son el producto de una expresión procariótica o eucariótica de un ADN exógeno; (b) son codificadas a partir de una secuencia de las figuras 1a, 1b, 2a y 2b; (c) son codificadas a partir de una secuencia que se hibrida con las secuencias de ADN mostradas en las figuras 1a, 1b, 2a y 2b, o fragmentos de esas secuencias de ADN (véase, por ejemplo, las figuras 4a y 4b) en la región de ADN que codifica la proteína madura; o (d) son codificadas a partir de secuencias que se hibridarían sin degeneración del código genético, con las secuencias definidas en b) a c), y codificarían un polipéptido con la misma secuencia de aminoácidos.

Se prefiere las enzimas que son codificadas a partir de los nucleótidos de las figuras 1a, 1b, 2a y 2b, o a partir de secuencias de ADN que, debido a la degeneración del código genético, codificarían un polipéptido de la misma secuencia de aminoácidos. Las dos enzimas de acuerdo con la invención (secuencia de las figuras 3a y 3b) se pueden ver como nuevos prototipos de proteínas específicas, parásitos unicelulares y pluricelulares, en particular de los parásitos unicelulares. Esta invención se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican las enzimas y están seleccionadas del grupo: (a) de secuencias de ADN mostradas en las figuras 1a, 1b, 2a y 2b, o sus secuencias complementarias; (b) secuencias de ácido nucleico que se hibriden con una de las secuencias de a); (c) una de las secuencias mencionadas en a) o b), sin degeneración del código genético. La invención se refiere también a enzimas procedentes de cualquier parásito que condense esencialmente pirovato y 3-fosfato de gliceraldehídos a 5-fosfato de 1-desoxi-D-xilulosa (DOXP-sintasa) y convierta el 5-fosfato de 1-desoxi-D-xilulos a 4-fosfato de 2-C-metil-D-eritritol (DOXP-reductoisomerasa). Estas enzimas, similaes a las enzimas de los parásitos de la malaria, pueden ser obtenidas por cuanto se selecciona un banco de ADNc o banco genómico de los parásitos correspondientes, mediante procesos familiares para las personas expertas en la materia, con una sonda hibrídante que contiene enzimas procedentes de secuencias que codifican parásitos de malaria, o mediante comparación de secuencias del ADN y de la secuencia de proteína para las enzimas de los parásitos de malaria, con otras enzimas de parásitos. Con ayuda de los ácidos nucleicos, se puede obtener enzimas de acuerdo con la invención en cantidades grandes, de manera repetible. Se integra el ácido nucleico en vectores de expresión adecuados mediante procesos familiares para las personas expertas en la materia, para expresión en organismos procarióticos y eucarióticos. Un vector de expresión de este tipo contiene preferiblemente un agente promotor ajustable/inducible. Estos vectores recombinantes son introducidos posteriormente, por medio de procesos conocidos, en células anfitrionas para expresión, y Is células anfitrionas transformadas, transfectadas o transducidas son cultivadas bajo condiciones que permiten la expresión del gene heterólogo. Las células anfitríonas adecuadas incluyen células procarióticas tales como, por ejemplo, E. coli, y células eucarióticas, en particular levaduras (por ejemplo, Saccharomycs cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris), células de insectos (por ejemplo, líneas de células de Drosophila melanogaster, como las células S2, Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni); líneas de células de animales vertebrados, particularmente líneas de células de teratocarcinoma, como células CHO o COS y líneas de células de plantas.

Las enzimas de acuerdo con la invención también pueden ser expresadas en plantas y animales transgénicos (por ejemplo, ratones, ovejas, cabras, cerdos, cuyos). Ventajosamente el sistema de expresión ha de ser dispuesto medíante técnicas conocidas por las personas expertas en la materia, de una manera tal, que las enzimas producidas son separadas con la leche de los anímales, o pueden ser obtenidas de partes de plantas de fácil obtención (frutas, hojas, flores, brotes y partes de raíz). Son particularmente adecuados como vectores de expresión para líneas de células de animales vertebrados, los sistemas derivados de virus de papiloma (por ejemplo, SV40), los retrovirus, los virus sindbis, los citomegalovirus y los virus de vacunas. Son particularmente adecuados para células de insectos el sistema de baculovirus; para plantas, los sistemas de células basados en el plásmido tí de Agrobacterium tumefaciens y el bombardeo de células con partículas cubiertas con ácido nucleico. La expresión de las enzimas de acuerdo con la invención es particularmente significativo en los hongos de fango, como Dictyostelium discoideum, Polysphondylium pallidum y Physarum policaphalum, ya que sus células pueden ser cultivadas económicamente en grandes cantidades, en medios simples. El uso de Dictyostelium discoideum ofrece la ventaja adicional de que este organismo usa codones similaes para los aminoácidos respectivos, que Plasmodium falciparum; y, de tal manera, se logra la producción particularmente efectiva de las enzimas de acuerdo con la invención.

Además, se conoce agentes promotores inducibles, por ejemplo, debido a la falta de alimento, para vectores de expresión para Dictyostelium discoideum. Como resultado se puede incrementar ad?cionalmente el rendimiento de la enzima recombinante. Son particularmente adecuadas para la expresión de las enzimas de acuerdo con la invención las células anfitrionas y los organismos del tipo que no tienen enzimas intrínsecas, que condensan el piruvato y el 3-fosfato de gliceraldehído a 5-fosfato de 1-desoxi-D-xilulosa (DOXP-sintasa) y hacen reaccionar el 5-fosfato de 1-desoxi-D-xilulosa a 4-fosfato de 2-C-metil-D-eritrtol (DOXP-reductoisomerasa). Esto se aplica a arqueobacterias, animales, hongos, hongos de fango y algunas eubacterias. Se facilita sustancialmente la detección y purificación de las enzimas recombinantes por la carencia de estas actividades de enzima intrínsecas. Adicionalmente, es posible por primera vez medir económicamente la actividad y, en particular, la inhibición de la actividad de las enzimas recombinantes, de acuerdo con la invención, mediante diversas composiciones químicas y farmacéuticas, en extractos crudos procedentes de las células anfitrionas. Las enzimas de acuerdo con la invención son expresadas ventajosamente en células eucarióticas, cuando se va a lograr modificaciones posteriores a la translación y un plegamiento natural de la cadena de polipéptido. Además, como función del sistema de expresión, durante la expresión de las secuencias de ADN genómico, se elimina los intrones empalmando el ADN y se produce las enzimas en la secuencia de polipéptido característica para el parásito. Las secuencias que codifican intrones también pueden ser eliminadas de las secuencias de ADN para ser expresadas por medio de tecnología de ADN recombinante, o para ser insertadas experimentalmente. Se puede aislar la proteína de la célula anfitriona o del sobrenadante de cultivo de la célula anfitriona, mediante el proceso conocido por las personas expertas en la materia. También puede ser necesaria una reactivación in vitro de las enzimas. Para facilitar la purificación, se puede expresar las enzimas de acuerdo con la invención o fragmentos de las enzimas, como proteína de fusión, con diversas cadenas de péptido. Son particularmente adecuadas para esto las secuencias de oligo-histidina y las secuencias derivadas de glutationa-S-transferasa, tioredoxina o péptidos que se unen a calmodulina. Las fusiones con secuencias derivadas de tioredoxina son particularmente adecuadas para la expresión procariótica, ya que de esa manera se incrementa la solubilidad de las enzimas recombinantes. También se puede expresar las enzimas de acuerdo con la invención, o secuencias parciales de las enzimas, con cadenas de péptidos, conocidas por las personas expertas en la materia, que son de tal naturaleza, que las enzimas recombinantes son transportadas al medio extracelular o hacia ciertos compartimentos de las células anfitrionas. Como resultado se puede facilitar la purificación y la investigación de la actividad biológica de las enzimas.

Con la expresión de las enzimas de acuerdo con la invención, puede ser expedito cambiar codones individuales. El cambio específico de bases en la región codificadora también es sensible cuando los codones usados en los parásitos son diferentes de los codones usados en el sistema de expresión heterólogo, para garantizar la síntesis óptima de la proteína. Las omisiones de las porciones 5' o 3' no transladadas frecuentemente también son sensibles, por ejemplo, cuando está presente una pluralidad de motivos ATTTA de secuencia desestabilizadores, en la región 3' del ADN. Éstos deben ser omitidos entonces en la expresión preferida en eucariones. Los cambios de esta clase son: omisiones, adiciones o cambios de bases, y también constituyen un objetivo de la presente invención. Se puede obtener adicionalmente las enzimas de acuerdo con la invención bajo condiciones estandarizadas, por medio de técnicas conocidas por las personas expertas en la materia, mediante translación in vitro. Los sistemas que son adecuados para esto son: reticulocitos de conejo y extractos de germen de trigo. También se puede transcribir ARNm in vitro a oocitos de xenopus. En virtud de la síntesis química, se puede producir oligopéptidos y polipéptidos, cuyas secuencias se derivan de la secuencia de péptido de las enzimas de acuerdo con la invención. Con selección adecuada de las secuencias, los péptidos de este tipo tienen aspectos que son característicos de las enzimas completas de acuerdo con la invención. Se puede producir péptidos de este tipo en grandes cantidades y son particularmente adecuados para estudios sobre la cinética de la actividad enzimática, el ajuste de la actividad enzimática, la estructura tridimensional de las enzimas, la inhibición de la actividad enzimática por diversas composiciones químicas y farmacéuticas, y la geometría de aglutinación y la afinidad de unión de los diversos ligandos. Se usa de preferencia un ADN con los nucleótidos de las secuencias mostradas en las figuras 1a, 1b, 2a y 2b, o un fragmento de acuerdo con las figuras 4a y 4b, para la producción recombinante de enzimas de acuerdo con la invención. También se refiere la invención a procesos para obtener enzimas involucradas en la trayectoria metabólica de DOXP, en particular las enzimas DOXP-sintasa y DOXP-reductoisomerasa, aislándolas de los parásitos. Se aisla las enzimas de extractos de parásitos mediante procesos cromatográficos, electroforéticos y otros procesos conocidos por las personas expertas en la materia. Se encuentra las enzimas midiendo la actividad enzimática respectiva o la reactividad respectiva, con anticuerpos apropiados. De preferencia se efectúa la detección de las células anfitrionas transformadas, transfectadas o transducidas, que producen recombinantemente las enzimas y la purificación de la proteína, por anticuerpos que se unen a esas enzimas. Se puede obtener los anticuerpos de este tipo con ayuda de las enzimas de acuerdo con la invención, o partes de las enzimas, como antígeno o inmunógeno, mediante procesos conocidos.

Se puede detectar proteínas homologas o de conversión cruzada, de otros parásitos, con los anticuerpos para proteínas de acuerdo con la invención; por ejemplo, mediante la prueba de manchado Western. Esta invención se refiere también a métodos para determinar la actividad enzimática de las enzimas DOXP, en particular de las enzimas DOXP-sintasa y DOXP-reductoisomerasa. Se puede determinar esto conforme a las instrucciones conocidas (Sprenger y coautores, PNAS, 94 (997) 12857-62 y Kuzuyama y coautores, Tetrahedron Letters, 39 (1998) 4509-12). En este proceso se detecta la condensación de piruvato y de 3-fosfato de gliceraldehído a 5-fosfato de 1 -desoxi-D-xilulos (DOXP-sintasa) y la conversión de 5-fosfato de 1-desoxi-D-xilulosa a 4-fosfato de 2-C-metil-D-eritritoi (DOXP-reductoisomerasa). Esta invención se refiere también al uso de estos procesos de medición para obtener sustancias que inhiban la actividad de las respectivas enzimas. Mediante la aplicación de tecnología recombinante, es posible producir una multiplicidad de variaciones de enzimas o fragmentos de enzima. Los derivados de este tipo, por ejemplo, pueden ser modificados en uno o más aminoácidos, por sustitución, omisión o adición. Por ejemplo, la derivación puede ser por mutagénesis directa al sitio. Las personas expertas en la materia pueden efectuar fácilmente variaciones de este tipo. Simplemente se deben asegurar que se retengan los aspectos característicos de las enzimas.

Con ayuda de las enzimas de acuerdo con la invención y sus homólogos, se puede encontrar nuevos ingredientes activos específicos contra parásitos. En particular, los procesos de detección descritos arriba pueden ser usados en equipos de prueba apropiados para seleccionar la actividad antiparasitaria de sustancias. Éstos incluyen los procesos conocidos por las personas expertas en la materia, y adecuados para seleccionar sustancias naturales de la flora y de la fauna, de plantas, algas, bacterias o animales, y sus derivados; de bancos químicos, también de bancos que han sido compilados por medio de técnicas conocidas por los expertos en la materia, incluyendo química combinatoria. (Pindur y coautores, Pharmazie in unserer Zeit, 26 (1997) 24-30; Broach y coautores, Nature, 384 (1997) 14-6; Lack y coautores, Chimia, 50 (1996) 445-7); Czarnik y Ellmann, Accounts of Chemical Research 29 (1996); Chemical and Engineering News, 74 (1996) 28-73; Lorin y coautores, Chemical Reviews, 96 (1996) 555-600; Weber y coautores, Nachrichten aus Chemie, Technik und Laboratorium, 42 (1994) 698-702). La presente invención también se refiere al uso de proteínas o de fragmentos de esas proteínas, incluyendo proteínas y fragmentos de proteínas con o sin actividad enzimática, en técnicas conocidas por las personas expertas en la materia, para determinar las estructuras de proteína, en particular, la caracterización de sitios de unión adecuados para el desarrollo de preparaciones con efecto inhibidor sobre la actividad enzimática. Los ingredientes activos obtenidos con ayuda de proteínas de acuerdo con la invención son de gran interés para la medicina y la medicina veterinaria. Los ingredientes activos encontrados con ayuda de las proteínas de acuerdo con la invención son adecuados, de toxicidad homoeotérmica favorable, para luchar contra parásitos patógenos que ocurren en humanos y en animales de ganadería, y en la crianza de animales domésticos, de raza, para zoológico, de laboratorio y animales para experimentación y mascotas. Son efectivos aquí contra todas las etapas individuales de desarrollo de los parásitos destructores y contra parásitos resistentes y normalmente sensibles. Como resultado de la lucha contra los parásitos, se debe reducir las enfermedades, los decesos y las reducciones en el funcionamiento (por ejemplo, en la producción de carne, leche, lana, cueros, huevos, etc.), de modo que el uso de los ingredientes activos permite la crianza más fácil y más eficiente en costo de los animales. Mediante el uso de estos procesos de acuerdo con la invención, que incluyen análisis establecidos, se podría demostrar que la actividad de la DOXP-reductoisomerasa es inhibida por el fosfonato de (N-acetil-N-hidroxiamino)propilo y los derivados de fosfonato de 3-(N-formil-N-hidrox¡am¡no)propilo (fosmidomicina). Ambas sustancias se originan de un banco de sustancias químicas de derivados de ácido acilhidroxilamino-alquilfosfónico. Este grupo de compuestos fue descrito en el pasado como herbicida y bactericida (US 4693742, DE2733658). Se ha demostrado aquí la eficiencia del sistema para obtener ingredientes activos antiparasitarios. Los resultados de los análisis enzimáticos podrían ser confirmados tanto en el cultivo de malaria (véase los ejemplos) como en experimentos con anímales (véase los ejemplos). Los inhibidores encontrados por medio de estos análisis enzimáticos, fueron capaces de inhibir el desarrollo de parásitos de la malaria in vitro e in vivo. El tratamiento de animales durante un periodo de tiempo de 8 días, mostró que sanaban los animales. La forma acetilo mostró una eficacia tres veces mayor que la forma formilo. Este resultado fue muy sorprendente, ya que fueron necesarias concentraciones sustancialmente mayores (hasta de 1000 veces) del fosfonato de 3-(N-acetil-N-hidroxiamino)propilo, para inhibir el crecimiento de bacterias. El proceso de acuerdo con la invención, de tal manera, es adecuado para identificar ingredientes activos y los ingredientes activos de acuerdo con la invención son adecuados para el tratamiento terapéutico y profiláctico de infecciones en humanos y animales, provocadas por parásitos, hongos o virus. Los compuestos son adecuados como profilácticos contra, y para el tratamiento de, infecciones provocadas por patógenos de malaria y del mal del sueño, así como el mal de Chagas, la toxoplasmosis, la disentería amebiana, la leishmanosis, la tricomoniasis, la pneumocistocis, la balantidiosis, la criptosporidiosis, la sarcocistosis, la acantoamebiasis, la naegleriasis, la coccidiosis, la giardiasis y la lambliosis. Los procesos de acuerdo con la presente invención y los ingredientes activos de acuerdo con la invención son particularmente adecuados para tratar la malaria, el mal del sueño y la leishmanosis. También son adecuados los ingredientes activos de acuerdo con la invención para inhibir la trayectoria metabólica de bacterias y plantas. Las sustancias que están identificadas de acuerdo con la invención son inhibidores de la trayectoria metabólica de DOXP, por lo tanto, son también adecuados para uso como herbicidas y para uso en el tratamiento de infecciones bacterianas en humanos y animales. Los animales domésticos y de ganadería, adecuados para el tratamiento incluyen los mamíferos, como, por ejemplo: ganado vacuno, caballar, ovino, porcino, caprino; camellos búfalos de agua, asnos, conejos, peces de agua salada y de agua dulce como, por ejemplo: truchas, carpas y anguilas. Los animales de laboratorio adecuados y los animales para experimentación adecuados incluyen ratones, ratas, cuyos, hámsters dorados, perros, gatos y cerdos. Las mascotas adecuadas incluyen los perros y los gatos. La aplicación puede ser tanto profiláctica como terapéutica. La aplicación de ingredientes activos es directa o tiene la forma de preparaciones adecuadas, conocidas por las personas expertas en la materia, tales como entéricas, parenterales, dérmicas o nasales. Los ingredientes activos de acuerdo con la invención pueden ser usados en combinación con cualesquiera agentes anti- infecciosos conocidos por las personas expertas en la materia. Éstos ¡ncluyen las sustancias que tienen efecto antibacteriano, antiparasitario, antiviral o fungicida. Éstos incluyen los agentes anti-infecciosos que están mencionados en la lista roja y en la literatura especializada (Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie de Forth y coautores, Bl-Wissenschaftsverlag, Mannheim 1998; Antibiotikatherapie, de Simón y Stille, Schattauer-Verlag, Stuttgart 1993). Dado que algunos parásitos tienen tanto la trayectoria metabólica del mevalonato como la trayectoria metabólíca de DOXP, la invención se refiere también a la combinación de inhibidores de la trayectoria metabólica de DOXP con preparaciones que inhiban la trayectoria metabólica grasa, incluyendo los inhibidores de la síntesis o la absorción de lípidos, en particular los inhibidores de la trayectoria metabólica del mevalonato. Los inhibidores de las enzimas HMG-CoA-sintasa y los inhibidores de HMG-CoA-reductasa merecen mención particular. Están incluidos entre los inhibidores de la HMG-CoA-reductasa, en particular, Lovastatain y sus derivados, Mevastatin y sus derivados, Compactin y sus derivados, Simvastatin y sus derivados, Pravastatin y sus derivados, Atorvastatin y sus derivados, Fluvastatin y sus derivados, y Cerivastatín y sus derivados.

EJEMPLO 1 CLONACIÓN POR EXPRESIÓN DEL GENE DE P. FALCIPARUM. QUE CODIFICA LA DOXP-REDUCTOISOMERASA Se clonó el gene que codifica la DOX-reductoisomerasa de P. falciparum mediante amplificación por RCP de las secuencias correspondientes del ADN genómico como matriz. Para obtener el ADN de genoma se cultivó la cepa HB3 de P. falciparum mediante el proceso de Kersentopf (Tranger y Jensen (1976), Science 193, 657-675). Como medio de cultivo se suplemento RPMI 1640 (con HEPES y L-glutamina, Gibco), con 10% de suero humano, 0.3 µg/ml de gentamicina y 0.1 mM de hipoxantina y un hematocrito de 5%, ajustado con eritrocitos humanos. Se usó en cada caso 15 platos de cultivo con volumen de cultivo de 35 ml, con aproximadamente 4% de parasitemia para la preparación del ADN. Se cosechó los eritrocitos infectados mediante centrifugación y se los lavó dos veces en regulador portador (57 mM de NaCI, 58 mM de KCl, 1 mM de NaH2PO4, 7 mM de K2HPO4, 11 mM de NaHCO3, 14 mM de glucosa). Se liberó los parásitos de los eritrocitos sometiendo a lisis el sedimento de células con un volumen diez veces mayor de solución al 1% de saponina en regulador portador durante 5 minutos, en hielo (modificado de conformidad con Kilejian (1979), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76, 4650-4653). Se lavó los parásitos libres dos veces mediante centrifugación (10 minutos, 10,000 rpm, 4°C) con una solución de 1% de BSA en regulador portador. Se efectuó la preparación del ADN de los parásitos libres obtenidos, conforme a procedimientos normales. Luego se digirió los parásitos con proteinasa K. A continuación se extrajo ei análisis cuatro veces con fenol/cloroformo, se dializó la solución de ADN durante la noche contra TE y luego se precipitó con isopropanol. Se usó el siguiene sensibilizador para la amplificación por RCP. PfYAEMfor 5'-CTGAATTTCATATTACAAAATTAATAGATG-3' PfYAEMrev 5'-GTACTATGAAGAATTATGTTTGTTGTATAT-3' Se usó el siguiente análisis para la conversión de RCP: 3 µl de 10 x regulador de RCP 2.4 µl de 25 mM de MgSO4 2.4 µl de 2.5 mM de dnTP 2 µl de matrices de ADN (0.2 µg/ml) 2 µl de sensibilizador 1 (7.5 µM) 2 µl de sensibilizador 2 (7.5 µM) 0.2 µl de H2O Se efectuó la amplificación con el siguiente perfil: 3 ciclos: 96°C, 1 min. 48°C, 1 min. 72°C, 3 min. 32 ciclos: 95°C, 40 seg. 48°C, 1 min. 72°C, 3 min. Después del último ciclo se incubó el análisis durante otros diez minutos a 72°C, para alargar todos los productos. Se combinó el producto de RCP de cuatro análisis de este tipo y se lo purificó con 0.7% de gel de agarosa. Se efectuó la elución del ADN de los bloques de agarosa con el "equipo para extracción de ADN" (Millipore, No. de catálogo S667). Se precipitó con etanoi el ADN eluido y se lo absorbió en 10 µl de H20. Luego se clonó el producto de RCP de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con el equipo de clonación TA (gene in vitro). Se usó 20 mg de ADN de inserto para el análisis de ligación. Se identificó las colonias de bacterias que llevan el plásmido recombinante deseado mediante preparación analítica del plásmido y digestión con EcoR I de los plásmidos. A continuación se secuenció los productos de RCP clonados, usando sensibilizadores normales, de sentido positivo y de sentido inverso; se completó las secuencias con la técnica de sensibilizador de Walkings. Se volvió a clonar un producto de CP, presente en la orientación correspondiente en el vector pCR2.1, en el vector de expresión pBK-CMV (Stratagene) para expresión en células COS-7. Se llevó a cabo la nueva clonación mediante las insersecciones de las enzimas de restricción Not I y BamH I, que ocurren en el polienlazador de los dos vectores. Para la transfección de las células COS-7 se produjo el vector de expresión con el producto de RCP como inserto, a una escala de preparación, mediante cromatografía de cambio de aniones (Qiagen). Todos los métodos usados para la clonación están descritos detalladamente en J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, E. U. A. Se cultivó las células COS-7 en medio DMEM con 10% de FCS bajo condiciones normales. Se permitió 30 ml de medio de cultivo por botella de cultivo de células. Se usó células con aproximadamente 50% de confluencia para la transfección, que habían sido divididas en día anterior. Se usó DOTAP (Boehriñger) como reactivo de transfección. Se mezcló 40 µl de solución de ADN (0.5 µg/ml) con 110 µl de 20 mM de HEPES (pH 7.4). También se mezcló 100 µl de DOTAP con 230 µl de 20 mM de HEPES (pH 7.4) en un recipiente para conversión de poliestireno. Se pasó con pipeta la solución de ADN a la solución de DOTP y se incubó durante 15 minutos a la temperatura ambiente. Luego se mezcló el análisis con 20 ml de medio de cultivo y se reemplazó el medio de las células COS-7 con esta mezcla. Al siguiente día se transfirió las células con medio fresco a nuevas botellas de cultivo de células. Después de incubar otras 48 horas, se cosechó las células COS-7 transfectadas. Se raspó las células para este propósito y se las lavó 3 veces por centrifugación en regulador de análisis (100 mM de Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM de MnCI2). Se suspendió las células nuevamente en un volumen mínimo de regulador de análisis y se digirió, congelándose tres veces (en nitrógeno líquido) y descongelándolas. Se centrifugó los fragmentos de célula para eliminarlos en un recipiente de 1.5 ml de conversión (13,000 rpm, 10 minutos, 4°C) y se usó el sobrenadante directamente para medir la actividad de enzima o para purificar la enzima.

EJEMPLO 2 PURIFICACIÓN DE LA DOXP-REDUCTOISOMERASA RECOMBINANTE DE P. FALCIPARUM Se purificó la DOXP-reductoisomerasa recombinante de P. falciparum, expresada en células COS-7 para homogeneidad considerable y caracterización más precisa. Se efectuó la purificación en un paso de cromatografía por afinidad y un paso de cromatografía de permeación en gel. Se produjo anticuerpos contra la DOXP-reductoisomeasa de P. falciparum para la producción de una columna de cromatografía por afinidad adecuada. También se seleccionó porciones de la secuencia de aminoácido derivada de la secuencia de ADN para la que se pudo predecir un efecto particularmente elevado de antígeno. Se sintetizó péptidos apropiados y se los usó para inmunizar conejos. Se confirmó la calidad de los antisueros obtenidos mediante su reactividad con los péptidos sintéticos, mediante pruebas de manchado Western. Para las pruebas de manchado Western (BM Western Blotting Kit, Boehringer) se usó extractos de P. falciparum y células COS recombinantes. Se dializó el antisuero para eliminar las aminas de bajo peso molecular, contra PBS para producir la columna de cromatografía por afinidad. Se unió los anticuerpos para la proteína A-sefarosa y se los acopló covalentemente mediante entrelazamiento con DMP (IgG Orientation Kit, Pierce). Se obtuvo el extracto de proteína, como se describió en el ejemplo 1, de 55 botellas de cultivo de células con células COS-7 transfectadas, y se las cargó en las columnas equilibradas con regulador de análisis. Después de lavado excesivo con regulador de análisis, se eluyó la columna con regulador de elución (100 mM de Glicina-HCI (pH 2.8), 0.4% de CHAPS). Se neutralizó inmediatamente el eluado con 1 M de TrisHCI (pH 7.5). Se identificó las fracciones principales mediante análisis de manchado de Western. Se usó anticuerpos biotinilados para detección, para evitar la ruptura por anticuerpos eluidos de la columna en pequeñas cantidades. Se combinó las fracciones principales, se dializó contra regulador de análisis y se concentró mediante ultrafiltración (30 kDa, Amicon). Se efectuó purificación adicional mediante cromatografía por permeación en gel (Superdex 200, Pharmacia) con regulador de análisis como entrada y regulador de elución. Se identificó las fracciones principales como se describió anteriormente, se combinó y concentró, se hizo reaccionar con 20% de glicerol y se congeló a -70°C. Como resultado de SDS-PAGE (12% de acrílamida) bajo condiciones reductoras y tinción con plata (Gel Code Silver Stain Kit, Pierce), se mostró la DOXP-reductoisomerasa limpia de P. falciparum como una banda unificada a 54 kDa.

EJEMPLO 3 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA PURIFICADA Y SELECCIÓN PARA INHIBIDORES Se confirmó la actividad de DOXP-reductoisomerasa de la enzima purificada en un sistema de prueba in vitro. Se usó 100 µl de regulador de análisis con 0.3 mM de NADPH, 0.3 mM de DOXP y 10 µg de enzima recombinante, para un análisis típico de prueba. Se inició la conversión mediante adición de DOXP al análisis completo. Se llevó a cabo la oxidación de NADPH fotométricamente con 340 nm en cubetas de microcuarzo a 37°C. Se usó este sistema de prueba para mostrar la inhibicióin de DOXP-reductoisomerasa recombinante de P. falciparum por diversas sustancias. Después de añadir 1 µM de sal monosódica del ácido 3-(N-formil-N-hidroxilamino)propilfosfónico y 1 µM de sal monosódica de 3-(N-acet¡l-N-hídroxilamino)propilfosfónico) análisis de conversión, no se observó ningún cambio a la absorción a 340 nm. Bajo esas condiciones, se inhibió completamente la DOXP-reductoisomerasa de P. falciparum.

EJEMPLO 4 PRUEBA DE LA EFECTIVIDAD DE LAS SUSTANCIAS CONTRA MALARIA IN VIVO Se probó los diversos derivados mediante la prueba modificada de Peters. Se aplicó las sustancias en un cuarto de la dosis media letal (DL50). En el análisis de prueba se infectó 10 ratones con Plasmodium vinckeii, el patógeno de la malaria en ratones. Una vez que se hubo confirmado la infección por examen de sangre, se trató cuatro ratones. Se usó seis ratones que no habían sido tratados, como controles. El tratamiento con 1-1000 mg/kg/día de la sal monosódica del ácido 3-(N-formil-N-hidroxil-amino)propilfosfónico, durante tres días, condujo a la destrucción de los parásitos en la sangre de los ratones. El grupo tratado estuvo libre de parásitos vivos después de únicamente un día. Los ratones de control tuvieron que ser destruidos el quinto día después de la infección, con una parasitemia de más de 80%. Los ratones tratados todavía estuvieron libres de parásitos 8 semanas después de finalizar el tratamiento. Otros experimentos mostraron una efectividad de 50 mg/kg/día de sal monosódica del ácido 3-(N-formil-N-hidroxilamino)propilfosfón¡co, en ratones con una parasitemia de 80%. Estos ratones también estuvieron libres de parásitos vivos después de un día. Otros resultados para la sal monosódíca de ácido 3-(N-formil-N-hidroxilamino)propiIfosfónico y la sal monosódica del ácido 3-(N-acetil-N-hidroxilamino)propilfosfónico están mostrados en la figura 5.

EJEMPLO 5 PROTECCIÓN CONTRA MALARIA EN EL EXPERIMENTO CON RATONES INFECTADOS Se probó la efectividad de los compuestos in vivo contra la malaria usando ratones machos (cepa BALB/c) que pesaban 20 a 25 g. Un día antes de la infección se trató intraperitonealmente cuatro ratones con 50 mg/kg de sal monosódica de ácido 3-(N-formil-N-hidroxilamino)propilfosfónico. Luego se infectó los ratones con Plasmodium vinckeii. Se usó como controles ratones que no habían sido tratados previamente con la sustancia. No se pudo detectar infección en los ratones tratados, mientras que se destruyó los ratones de control después de 5 días, con una parasitemia de más de 80%. Los ratones tratados estaban libres de parásitos ocho semanas después de la infección.

EJEMPLO 6 INHIBICIÓN IN VITRO DEL DESARROLLO DE PARÁSITOS DE MALARIA SOBRE EL PRINCIPIO DE LA DETERMINACIÓN DE CI50 (LA CONCENTRACIÓN A LA QUE LA VITALIDAD DE LOS PARÁSITOS SE REDUCE A LA MITAD) Para determinar los valores CI50 se cultivó inicialmente parásitos de malaria durante un ciclo completo de 48 horas, en presencia de inhibidores; en las siguientes 24 horas se midió la tasa de sobrevivencia mediante inserción de (3H)-hipoxantina. Se presentó una serie de diluciones de sal monosódica del ácido 3-(N-formil-N-hidroxilamino)propilfosfóníco, en una placa de microtítulación, en alícuotas de 20 µl, concentrada a 10. Luego se añadió 180 µl de suspensión de parásito en el medio de cultivo, a cada concavidad. Se usó cultivos asincrónicos con alrededor de 0.4%) de parasitemia y 2% de hematocritos. Se incubó las placas de microtitulación durante 48 horas. A continuación se añadió 30 µl de (3H)-hipoxantina a cada concavidad. Después de incubar durante 24 horas, se cosechó las células y se midió la radiactividad incorporada.

Los resultados con las cepas HB3, A2 Y Dd2, con resistencia conocida contra otros medicamentos contra la malaria, están mostrados en las figuras 6a, 6b y 6c. En ambas cepas ocurre un valor C150 de menos de 0.5 µM. La resistencia de estas cepas es: Plasmodium falciparum HB3 (Honduras) es resistente a Pyrimethamine. Plasmodium falciparum Dd2 (Vietnam) es resistente a cloroquina, quinina, pirimetamina, cicloguanil y sulfadoxina. Plasmodium falciparum A2 (Gambia) es resistente a cloroquina y cicloguanil. No se encontró resistencia cruzada con las preparaciones contra la malaria.

LISTADO DE SECUENCIAS (110) Jomaa, Hassan (120) Método para identificar agentes activos químicos, y agentes activos para inhibir la trayectoria biosintética del 5-fosfato de 1-desoxi-D-xilulosa (130) 15514 (140) PCT/EP99/02463 (141) 1999-04-13 (150) DE19843279.8 (151) 1998-04-14 (150) DE19816196.4 (151) 1998-04-14 (150) DE19828097.1 (151) 1998-06-24 (150) DE19825585.3 (151) 1998-06-09 (150) DE19831637.2 (151) 1998-07-15 (150) DE19831639.9 (151) 1998-07-15 (150) DE19831638.0 (151) 1998-07-15 (160) (170) Patentln Ver. 2.1 (210) 1 (211) 1467 (212) ADN (213) Plasmodium falciparum (220) (221) CDS (222) (1)...(1467) (220) (221) gene (222) (1)...(1467) (220) (221) ARNm (222) (1)...(1467) (400) atg aag aaa tat att tat ata tat ttt tte tte ate acá ata act att 48 Met Lys Lys Tyr lie Tyr lie Tyr Phe Phe Phe lie Thr lie Thr lie 1 5 10 15 aat gat tta gta ata aat aat acá tea aaa tgt gtt tec att gaa aga 96 Asn Asp Leu Val lie Asn Asn Thr Ser Lys Cys Val Ser lie Glu Arg 20 25 30 aga aaa aat aac gea tat ata aat tat ggt ata gga tat aat gga cea 144 Arg Lys Asn Asn Ala Tyr lie Asn Tyr Gly lie Gly Tyr Asn Gly Pro 35 40 45 gat aat, aaa ata acá aag agt aga aga tgt aaa aga ata aag tta tgc 192 Asp Asn Lys lie 7hr Lys Ser Arg Arg Cys Lys Arg lie Lys Leu Cys 50 55 60 aaa aag gat tta ata gat att ggt gea ata aag aaa cea att aat gta 240 Lys Lys Asp Leu lie Asp lie Gly Ala lie Lys Lys Pro lie Asn Val 65 70 75 80 gea att ttt gga agt act ggt agt ata ggt aeg aat gct tta aat ata 288 Ala lie Phe Gly Ser Thr Gly Ser lie Gly Thr Asn Ala Leu Asn lie 85 90 95 ata agg gag tgt aat aaa att gaa aat gtt ttt aat gtt aaa gea ttg 336 lie Arg Glu Cys Asn Lys He Glu Asn Val Phe Asn Val Lys Ala Leu •100 105 110 tat gtg aat aag agt gtg aat gaa tta tat gaa caá gct aga gaa ttt 384 Tyr Val Asn Lys Ser Val Asn Glu Leu Tyr Glu Gln Ala Arg Glu Phe 115 120 125 tta cea gaa tat ttg tgt ata cat gat aaa agt gta tat gaa gaa tta 432 Leu Pro Glu Tyr Leu Cys lie His Asp Lys Ser Val Tyr Glu Glu Leu 130 " 135 140 aaa gaa ctg gta aaa aat ata aaa gat tat aaa ect ata ata ttg tgt 480 Lys Glu Leu Val Lys Asn "le Lys Asp Tyr Lys Pro lie He Leu Cys 145 15C 155 160 ggt gat gaa ggg atg aaa gaa ata tgt agt agt aat agt ata gat aaa 528 Gly Asp Glu Gly Met Lys Glu He Cys Ser Ser Asn Ser He Asp Lys 165 170 175 ata gtt att ggt att gat tet ttt caá gga tta tat tet act atg tat 576 He Val He Gly He Asp Ser Phe Gln Gly Leu Tyr Ser Thr Met Tyr 180 185 190 gea att atg aat aat aaa ata gtt gcg tta gct aat aaa gaa tec att 624 Ala He Met Asn Asn Lys He Val Ala Leu Ala Asn Lys Glu Ser He 195 200 205 gtc tet gct ggt tte ttt tta aag aaa tta tta aat att cat aaa aat 672 Val Ser Ala Gly Phe Phe Leu Lys Lys Leu Leu Asn He His Lys Asn 210 215 220 gea aag ata ata ect gtt gat tea gaa cat agt, gct ata ttt caá tgt 720 -jQ Ala Lys He He Pro Val Asp Ser Glu His Ser Ala He Phe Gln Cys 225 230 235 240 tta gat aat aat aag gta tta aaa acá aaa tgt tta caá gac aat ttt 768 Leu Asp Asn Asn Lys Val Leu Lys Thr Lys Cys Leu Gln Asp Asn Phe 245 250 255 tet aaa att aac aat ata aat aaa ata ttt tta tgt tea tet gga ggt 816 Ser Lys He Asn Asn He Asn Lys He Phe Leu Cys Ser Ser Gly Gly 260 265 270 15 cea ttt caá aat tta act atg gac gaa tta aaa aat gta acá tea gaa 864 Pro Phe G n Asn Leu Thr Met Asp Glu Leu Lys Asn Val Thr Ser Glu 275 280 285 aat gct tta aag cat ect aaa tgg aaa atg ggt aag aaa ata act ata 912 Asn Ala Leu Lys His Pro Lys Trp Lys Met Gly Lys Lys He Thr He 290 295 300 gat tet gea act atg atg aat aaa ggt tta gag gtt ata gaa acc cat 960 0 Asp Ser Ala Thr Met Met Asn Lys Gly Leu Glu Val He Glu Thr His 305 310 315 320 ttt tta ttt gat gta gar tat aat gat ata gaa gtt ata gta cat aaa 1008 Phe Leu Phe Asp Val ñsp Tyr Asn ñsp He Glu Val He Val His Lys 325 330 335 gaa tgc att ata cat tet tgt gtt gaa ttt ata gac aaa tea gta ata 1056 Glu Cys He He Kis Ser Cys Val Glu Phe He Asp Lys Ser Val He 340 345 350 5 agt caá atg tat tat cea gat atg caá ata ccc ata tta tat tet tta 1104 Ser Gln Met Tyr Tyr Pro Asp Met Gln He Pro He Leu Tyr Ser Leu 355 360 365 acá 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47C 475 480 ata tac aac aaa cat aat tet tea tag 1467 He Tyr Asn Lys His Asn Ser Ser 485 (210) 2 (211) 488 (212) PRT (213) Plasmodium falciparum (400) Met Lys Lys Tyr He Tyr He Tyr Phe Phe Phe He Thr He Thr He 1 5 10 15 Asn Asp Leu Val He Asn Asn Thr Ser Lys Cys Val Ser He Glu Arg 20 25 30 Arg Lys Asn Asn Ala Tyr He Asn Tyr Gly He Gly Tyr Asn Gly Pro 35 40 45 Asp Asn Lys He Thr Lys Ser Arg Arg Cys Lys Arg He Lys Leu Cys 50 55 60 Lys Lys Asp Leu He Asp He Gly Ala He Lys Lys Pro He Asn Val 65 " 70 75 80 Ala He Phe Gly Ser Thr Gly Ser He Gly Thr Asn Ala Leu Asn He 85 ' 90 95 He Arg Glu Cys Asn Lys He Glu Asn Val Phe Asn Val Lys Ala Leu 100 105 110 Tyr Val Asn Lys Ser Val Asn Glu Leu Tyr Glu Gln Ala Arg Glu Phe 115 120 125 Leu Pro Glu Tyr Leu Cys He His Asp Lys Ser Val Tyr Glu Glu Leu 130 135 140 Lys Glu Leu Val Lys Asn He Lys Asp Tyr Lys Pro He He Leu Cys 145 150 155 160 Gly Asp Glu Gly Met Lys Glu He Cys Ser Ser Asn Ser He Asp Lys 165 170 175 He Val He Gly He Asp Ser Phe Gln Gly Leu Tyr Ser Thr Met Tyr 180 185 190 Ala He Met Asn Asn Lys He Val Ala Leu Ala Asn Lys Glu Ser He 195 200 205 Val Ser Ala Gly Phe Fhe Leu Lys Lys Leu Leu Asn He His Lys Asn 210 215 220 Ala Lys He lie Pro Val Asp Ser Glu His Ser Ala He Phe Gln Cys 225 230 235 240 Leu Asp Asn Asn Lys Val Leu Lys Thr Lys Cys Leu Gln Asp Asn Phe 245 250 255 Ser Lys He Asn Asn He Asn Lys He Phe Leu Cys Ser Ser Gly Gly 260 265 270 Pro Phe Gln Asn Leu Thr Met Asp Glu Leu Lys Asn Val Thr Ser Glu 275 280 285 Asn Ala Leu Lys His Pro Lys Trp Lys Met Gly Lys Lys He Thr He 290 295 300 Asp Ser Ala Thr Met Met Asn Lys Gly Leu Glu Val He Glu Thr His 305 310 315 320 Phe Leu Phe Asp Val Asp Tyr Asn Asp He Glu Val He Val His Lys 325 330 335 Glu Cys He He His Ser Cys Val Glu Phe He Asp Lys Ser Val He 340 345 350 Ser Gln Met Tyr Tyr Pro Asp Met Gln He Pro He Leu Tyr Ser Leu 355 360 365 Thr Trp Pro Asp Arg He Lys Thr Asn Leu Lys Pro Leu Asp Leu Ala 370 375 380 Gln Val Ser Thr Leu Thr Phe His Lys Pro Ser Leu Glu His Phe Pro 385 390 395 400 Cys He Lys Leu Ala Tyr Gln Ala Gly He Lys Gly Asn Phe Tyr Pro 405 410 415 Thr Val Leu Asn Ala Ser Asn Glu He Ala Asn Asn Leu Phe Leu Asn 420 425 430 Asn Lys He Lys Tyr rhe Asp He Ser Ser He He Ser Gln Val Leu 435 440 445 Glu Ser Phe Asn Ser Gln Lys Val Ser Glu Asn Ser Glu Asp Leu Met 450 455 460 Lys Gln He Leu Gln He His Ser Trp Ala Lys Asp Lys Ala Thr Asp 465 470 475 480 He Tyr Asn Lys His Asn Ser Ser 485 (210) 3 (211) 3872 (212) ADN (213) Plasmodium falciparum (220) (221) CDS (222) (126)...(3740) (220) (221) gene (222) (1)...(3870) (220) (221) ARNm (222) (1)...(3870) (400) ggtaatatac gtataatata tatataatat attcttacgt atgtatcatt tatgaatcat 60 aataatattc taaatttacc ttccgttttt gctcgatctt ctcattttcg tttcagcttt 120 tatca atg att ttt aat tat gtg ttt ttt aag aac ttt gta cea gtt gtt 170 Met He Phe Asn Tyr Val Phe Phe Lys Asn Phe Val Pro Val Val 1 5 10 15 cta tac att ctc ctt ata ata tat att aac tta aat ggc atg aat aat 218 Leu Tyr lie Leu Leu He He Tyr He Asn Leu Asn Gly Met Asn Asn 20 25 30 aaa aat caá ata aaa acá gaa aaa att tat ata aag aaa ttg aat agg 266 Lys Asn Gln He Lys Thr Glu Lys He Tyr He Lys Lys Leu Asn Arg 35 40 45 ttg tea agg aaa aat teg tta tgt agt tet aaa aat aaa ata gea tgc 314 Leu Ser Arg Lys Asn Ser Leu Cys Ser Ser Lys Asn Lys He Ala Cys 50 55 60 ttg tte gat ata gga aat gat gat aat aga aat aeg acá tat ggc tat 362 Leu Phe Asp He Gly Asn Asp Asp Asn Arg Asn Thr Thr Tyr Gly Tyr 65 70 75 aat gtg aat gtt aaa aat gat gat att aat tec tta cta aaa aat aat 410 Asn Val Asn Vai Lys Asn Asp Asp He Asn Ser Leu Leu Lys Asn Asn 80 85 90 95 tat agt aat aaa ttg tac atg gat aag agg aaa aat att aat aat gta 458 Tyr Ser Asn Lys Leu Tyr Met Asp Lys Arg Lys Asn He Asn Asn Val 100 105 110 att agt act aat aaa ata tet ggg tec att tea aat att tgt agt aga 506 He Ser Thr Asn Lys lie Ser Gly Ser He Ser Asn He Cys Ser Arg 115 120 125 aat caá aaa gaa aat gaa caá aaa agá aat aaa caá aga tgt tta act 554 Asn Gln Lys Glu Asn Glu Gln Lys Arg Asn Lys Gln Arg Cys Leu Thr 130 135 140 caá tgt cae act tat aat atg tea cat gaa cag gac aaa cta gct aat 602 Gln Cys His Thr Tyr Asn Met Ser His Glu Gln Asp Lys Leu Ala Asn 145 150 155 gat aat aat agg aat aat aaa aag aat ttt aat tta tta ttt ata aat 650 Asp Asn Asn Arg Asn Asn Lys Lys Asn Phe Asn Leu Leu Phe He Asn 160 165 170 175 tat ttt aat ttg aaa cga atg aaa aat tet ctt cta aat aaa gac aat 698 Tyr Phe Asn Leu Lys Arg Met Lys Asn Ser Leu Leu Asn Lys Asp Asn 180 185 190 tte ttt tac tgt aaa gaa aaa aaa ttg tea ttt ctg cat aag gcc tat 746 Phe Phe Tyr Cys Lys Glu Lys Lys Leu Ser Phe Leu His Lys Ala Tyr 195 200 205 aaa aaa aaa aat tgc act ttt caá aat tat agt tta aaa aga aaa tet 794 Lys Lys Lys Asn Cys Thr Phe Gln Asn Tyr Ser Leu Lys Arg Lys Ser 210 215 220 aat cgt gat tea cat aaa ttg ttt tet gga gaa ttt gac gat tat acá 842 Asn Arg Asp Ser His Lys Leu Phe Ser Gly Glu Phe Asp Asp Tyr Thr 225 230 235 aat aat aat gcz tta tat gaa tec gaa aaa aaa gaa tac att acá cta 890 Asn Asn Asn Ala Leu Tyr Glu Ser Glu Lys Lys Glu Tyr He Thr Leu 240 245 250 255 aat aat aat aat aaa aat aat aat aat aaa aat aat gat aat aaa aat 938 Asn Asn Asn Asn Lys Asn Asn Asn Asn Lys Asn Asn Asp Asn Lys Asn 260 265 270 aat gat aat aat gat ta: aat aat aat aat agt tgt aat aat tta gga 986 Asn Asp Asn Asr. Asp Tyr Asn Asn Asn Asn Ser Cys Asn Asn Leu Gly 275 280 285 gag aga tec aat cat tat gat aat tat ggt gga gat aat aat aat cea 1034 Glu Arg Ser Asn His Tyr Asp Asn Tyr Gly Gly Asp Asn Asn Asn Pro 290 295 300 tgt aat aat aat aat gac aaa tat gat ata gga aaa tat tte aaa cag 1082 Cys Asn Asn Asn Asn Asp Lys Tyr Asp He Gly Lys Tyr Phe Lys Gln 305 310 315 att aat acc ttt att aat att gat gaa tat aaa act ata tat ggt gat 1130 He Asn Thr Phe lie Asn He Asp Glu Tyr Lys Thr He Tyr Gly Asp 320 325 330 335 gaa ata tat aaa gaa ata tat gaa cta tat gta gaa aga aat att oct 1178 Glu He Tyr Lys Glu He Tyr Glu Leu Tyr Val Glu Arg Asn He Pro 340 345 350 gaa tat tat gaa cga aaa tat ttt tea gaa gat att aaa aag agt gtc 1226 Glu Tyr Tyr Glu Arg Lys Tyr Phe Ser Glu Asp He Lys Lys Ser Val 355 . 360 365 cta ttt gat ata gat aaa tat aat gat gtc gaa ttt gaa aaa gct ata 1274 Leu Phe Asp He Asp Lys Tyr Asn Asp Val Glu Phe Glu Lys Ala He 370 375 380 aaa gaa gaa ttt ata aat aat gga gtt tat att aat aat ata gat aat 1322 Lys Glu Glu Phe He Asn Asn Gly Val Tyr He Asn Asn He Asp Asn 385 390 395 acá tat tat aaa aaa gaa aat att tta ata atg aaa aag ata tta cat 1370 Thr Tyr Tyr Lys Lys Glu Asn He Leu He Met Lys Lys He Leu His 400 405 410 415 tat tte cea tta tta aaa tta att aat aat cea tea gat tta aaa aag 1418 Tyr Phe Pro Leu Leu Lys Leu He Asn Asn Pro Ser Asp Leu Lys Lys 420 425 430 tta aaa aaa caá tat tta ect tta tta gea cat gaa tta aaa ata ttt 1466 Leu Lys Lys Gln Tyr Leu Pro Leu Leu Ala His Glu Leu Lys He Phe 435 440 445 tta ttt ttt att gta aat ata acá gga ggt cat ttt tec tet gtt tta 1514 Leu Phe Phe He Val Asn He Thr Gly Gly His Phe Ser Ser Val Leu 450 455 460 age tet tta gaa att caá tta tta tta ttg tat att ttt aat caá cea 1562 Ser Ser Leu Glu He Glr. Leu Leu Leu Leu Tyr He Phe Asn Gln Pro 465 470 ••. 475 tat gat aat gtt ata tat gat ata gga cat caá gea tat gta cat aag 1610 Tyr Asp Asn Val He Tyr Asp He Gly His Gla Ala Tyr Val His Lys 480 4S5 490 495 ata ttg acc gga aga aaa cta tta ttt cta tea tta aga aat aaa aaa 1658 He Leu Thr Gly Arg Lys Leu Leu Phe Leu Ser Leu Arg Asn Lys Lys 500 . 505 510 ggt att agt gga tte cta aat att ttt gaa agt att tat gat aaa ttt 1706 Gly He Ser Gly Phe Leu Asn He Phe Glu Ser lie Tyr Asp Lys Phe 515 520 525 ggg gct ggt cae agt tec act tea tta agt gct ata caá gga tat tat 1754 Gly Ala Gly His Ser Ser Thr Ser Leu Ser Ala He Gln Gly Tyr Tyr 530 535 540 gaa gcc gag tgg caá gtg aag aat aaa gaa aaa tat gga aat gga gat 1802 Glu Ala Glu Trp Gln Val Lys Asn Lys Glu Lys Tyr Gly Asn Gly Asp 545 550 555 ata gaa ata agt gat aac gea aat gtc aeg aat aat gaa agg ata ttt 1850 He Glu He Ser Asp Asn Ala Asn Val Thr Asn Asn Glu Arg He Phe 560 ¿65 5.70 575 caá aaa gga ata cae aat gat aat aat att aac aat aat att aat aat 1898 Gln Lys Gly He His Asn Asp Asn Asn He Asn Asn Asn He Asn Asn 580 585 590 aat aat tat ate aat ect tea gat gtg gta g a aga gaa aat aeg aat 1946 Asn Asn Tyr He Asn Pro Ser Asp Val Val Gly Arg Glu Asn Thr Asn 595 600 605 gta cea aat gta cga aat gat aac cat aac gtg gat aaa gta cae att 1994 Val Pro Asn Val Arg Asn Asp Asn His Asn Vai Asp Lys Val His He 610 615 620 gct att ata gga gat cgt ggt tta acá ggt gga atg gea tta gaa gcg 2042 Ala He He Gly Asp Giy Gly Leu Thr Gly Gly Met Ala Leu Glu Ala 625 630 635 tta aat tat att tea tte ttg aat tet aaa att tta att att tat aat 2090 Leu Asn Tyr He Ser Fría Leu Asn Ser Lys He Leu He He Tyr Asn 640 €45 650 655 gat aac gga caá gtt e tta cea acá aat gcc gta agt ata tea ggt 2138 Asp Asn Gly Gln Val Ser Leu Pro Thr Asn Ala Val Ser He Ser Gly 660 665 670 aat aga oct ata ggt ttt ata tita gat cat tta cat tat ttt gtt tet 2186 Asn Arg Pro He Gly Ser He Ser Asp His Leu Hxs Tyr Phe Val Ser 675 680 685 aat ata gaa gea aat gtc ggt gat aat aaa tta teg aaa aat gea aaa 2234 Asn He Glu Ala As a Gly Asp Asn Lys Leu Ser Lys Asn Ala Lys 690 695 700 gag aat aac att ttt gaa aat ttg aat tat gat tat att ggt gtt gtg 2282 Glu Asn Asn He Phe Glu Asn Leu Asn Tyr Asp Tyr He Gly Val Val 705 710 715 aat ggt aat aat acá gaa gag ctc ttt aaa gta tta aat aat ata aaa 2330 Asn Gly Asn Asn Thr Glu Glu Leu Phe Lys Val Leu Asn Asn He Lys 720 725 730 735 gaa aat aaa tta aaa aga gct act gtt ctt cat gta cgt acá aaa aaa 2378 Glu Asn Lys Leu Lys Arg Ala Thr Val Leu His Val Arg Thr Lys Lys 740 745 750 teg aat gat ttt ata aat tea aag agt cea ata agt ata ttg cae tet 2426 Ser Asn Asp Phe He Asn Ser Lys Ser Pro He Ser He Leu His Ser 755 760 765 ata aag aaa aat gag att tte ect tte gat acc act ata tta aat gga 2474 lie Lys Lys Asn Glu lie Phe Pro Phe Asp Thr Thr lie Leu Asn Gly 770 775 780 aat att cat aag gag aae aag ata gaa gaa gag aaa aat gtg tet tea 2522 Asn He His Lys Glu Asn Lys He Glu Glu Glu Lys Asn Val Ser Ser 785 790 795 tet acá aag tat gat gta aat aat aag aat aat aaa aat aat gat aat 2570 Ser Thr Lys Tyr Asp Vai Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Asp Asn 800 805 810 815 agt gaa att ata aaa tat gaa gat atg ttt tea aaa gag aeg tto acá 2618 Ser Glu He He Lys Tyr Glu Asp Met Phe Ser Lys Glu Thr Phe Thr 820 825 830 gat ata tat acá aat gaa atg tta aaa tat tta aag aaa gat aga aat 2666 Asp He Tyr Thr Asn Glu Met Leu Lys Tyr Leu Lys Lys Asp Arg Asn 835 840 845 ata ata tte cta tet cce gct atg tta gga gga tea gga ttg gtt aaa 2714 He He Phe Leu Ser Prt Ala Met Leu Gly Gly Ser Gly Leu Val Lys 850 855 860 att agt gag cgt tat cea aat aat gta tat gat gta ggt ata gea gaa 2762 He Ser Glu Arg Tyr Prt Asn Asn Val Tyr Asp Val Gly He Ala Glu 865 870 875 caá cat tet gta act ttt gea gea gct atg gea atg aat aag aaa tta 2810 Gln His Ser Val Thr Pha Ala Ala Ala Met Ala Met Asn Lys Lys Leu 880 885 890 895 aaa ata caá tta tgt ata tat teg acc ttt tta caá aga gea tat gat 2858 Lys He Gln Leu Cys He Tyr Ser Thr Phe Leu Gln Arg Ala Tyr Asp 900 905 910 caá att ata cat gat ctt aat tta caá aat ata ect tta aag gtt ata 2906 Gln He He His Asp Leu Asn Leu Gln Asn He Pro Leu Lys Val He 915 920 925 att gga aga agt gga tta gta gga gag gat ggg gea acá cat caá ggt 2954 He Gly Arg Ser Gly Leu Val Gly Glu Asp Gly Ala Thr His Gln Gly 930 935 940 ata tat gat tta tet tat ctt ggg acá ctt aac aat gea tat ata ata 3002 He Tyr Asp Leu Ser Tyr Leu Gly Thr Leu Asn Asn Ala Tyr He- He 945 350 955 tet cea agt aat caá ctt gat ttg aaa aga gct ctt agg ttt gct tat 3050 Ser Pro Ser Asn Gln Val Asp Leu Lys Arg Ala Leu Arg Phe Ala Tyr 960 965 970 975 _ tta gat aag gac cat tce gtg tat ata cgt ata ccc aga atg aac ata 309E Leu Asp Lys Asp His Ser Val Tyr He Arg He Pro Arg Met Asn He 980 985 990 tta agt gat aag tac atg aaa gga tat ttg aac att cat atg aaa aat 3146 Leu Ser Asp Lys Tyr Met Lys Gly Tyr Leu Asn He His Met Lys Asn 995 1000 1005 gag age aaa aat ate gat gta aac gtg gat ata aac gat gat gta gat 3194 Glu Ser Lys Asn lie A=p Val Asn Val Asp He Asn Asp Asp Val Asp 1010 1015 1020 aaa tat agt gaa gaa tat atg gac gat gat aat ttt ata aaa teg ttt 3242 Lys Tyr Ser Glu Glu Tyr Met Asp Asp Asp Asn Phe He Lys Ser Phe 1025 1030 1035 att gga aaa tet aga art att aaa atg gat aat gaa aat aat aat acá 3290 He Gly Lys Ser Arg He He Lys Met Asp Asn Glu Asn Asn Asn Thr 1040 1C-55 1050 1055 aat gaa cat tat tea acc aga gga gat acá cag acá aaa aaa aaa aaa 3338 Asn Glu His Tyr Ser Ser Arg Gly Asp Thr Gln Thr Lys Lys Lys Lys 1060 1065 1070 gtt tgt ate ttt aac att ggt agt atg ctt ttt aat gta att aat gct 3386 Val Cys He Phe Asn Met Gly Ser Met Leu Phe Asn Val He Asn Ala 1075 1080 1085 ata aaa gaa att gaa aaa gaa caá tat att tea cat aat tat tet ttt 3434 He Lys Glu He Glu Lys Glu Gln Tyr He Ser His Asn Tyr Ser Phe 1090 1095 1100 tea att gtt gat atg ata ttt tta aat ect tta gat aaa aat atg ata 3482 Ser He Val Asp Met He Phe Leu Asn Pro Leu Asp Lys Asn Met He 1105 1110 1115 gat cat gta ata aaa caá aat aaa cat caá tat tta att act tat gaa 3530 Asp His Val He Lys Gln Asn Lys His Gln Tyr Leu He Thr Tyr Glu 1120 1125 1130 1135 gat aat act ata ggt ggt ttt tet acá cat tte aat aat tat tta ata 357Í Asp Asn Thr He Gly Gly Phe Ser Thr His Phe Asn Asn Tyr Leu He 1140 1145 1150 gaa aat aat tat att acá aaa cat aac tta tat gtt cat aat att tat 3626 Giu Asn Asn Tyr He Thr Lys His Asn Leu Tyr Val His Asn He Tyr 1155 1160 1165 tta tet aat gag cea att gaa cat gea tet ttt aag gat caá caá gaa 3674 Leu Ser Asn Glu Pro He Glu His Ala Ser Phe Lys Asp Gln Gln Glu 1170 1175 1180 gtc gtc aaa atg gat aaa tgt agt ctt gtc aat aga att aaa aat tat 3722 Val Val Lys Met Asp Lys Cys Ser Leu Val Asn Arg He Lys Asn Tyr 1185 1190 1195 ctt aaa aat aat ect acá tgatgtaaga taaatatata tttctaaaat 3770 Leu Lys Asn Asn Pro Thr 1200 1205 tatttttttt ttatacttta atgtgtacaa taaaatatat atetaaatat attttatttg 3830 tacgcttttt tttttttttt t taattgtt atttttgtat at 3872 (210) 4 (211) 1205 (121) PRT (213) Plasmodium falciparum (400) Met He Phe Asn Tyr Val Phe Phe Lys Asn Phe Val Pro Val Val Leu 1 5 '• 10 15 Tyr He Leu Leu He He Tyr He Asn Leu Asn Gly Met Asn Asn Lys 20 25 30 Asn Gln He Lys Thr Glu Lys He Tyr He Lys Lys Leu Asn Arg Leu 35 40 45 Ser Arg Lys Asn Ser Leu Cys Ser Ser Lys Asn Lys lie Ala Cys Leu 50 55 60 Phe Asp He Gly Asn Asp Asp Asn Arg Asn Thr Thr Tyr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 Val Asn Val Lys Asn Asp Asp He Asn Ser Leu Leu Lys Asn Asn Tyr 85 90 95 Ser Asn Lys Leu Tyr Met Asp Lys Arg Lys Asn lie Asn Asn Val He 100 105 110 Ser Thr Asn Lys He Ser Gly Ser He Ser Asn He Cys Ser Arg Asn 115 120 125 Gln Lys Glu Asn Glu Gln Lys Arg Asn Lys Gln Arg Cys Leu Thr Gln 130 135' 140 Cys His Thr Tyr Asn Met Ser His Glu Gln Asp Lys Leu Ala Asn Asp 145 150 155 160 Asri" Asn Arg Asn Asn Lys Lys Asn Phe Asn Leu Leu Phe He Asn Tyr 165 170 175 Phe Asn Leu Lys Arg Met Lys Asn Ser Leu Leu Asn Lys Asp Asn Phe 180 185 190 Phe Tyr Cys Lys Glu Lys Lys Leu Ser Phe Leu His. Lys Ala Tyr Lys 195 200 205 Lys Lys Asn Cys Thr Phe Gln Asn Tyr Ser Leu Lys Arg Lys Ser Asn 210 215 220 Arg Asp Ser His Lys Leu Phe Ser Gly Glu Phe Asp Asp Tyr Thr Asn 225 230 235 240 Asn Asn Ala Leu Tyr 31u Ser Glu Lys Lys Glu Tyr He Thr Leu Asn 245 250 255 Asn Asn Asn Lys Asn Asn Asn Asn Lys Asn Asn Asp Asn Lys Asn Asn 260 265 270 Asp Asn Asn Asp Tyr Asn Asn A'sn Asn Ser Cys Asn Asn Leu Gly Glu 275 280 285 Arg Ser Asn His Tyr Asp Asn Tyr Gly Gly Asp Asn Asn Asn Pro Cys 290 295 300 Asn Asn Asn Asn Asp Lys Tyr Asp He Gly Lys Tyr Phe Lys Gln He 305 310 315 320 Asn Thr Phe He Asn He Asp Glu Tyr Lys Thr He Tyr Gly Asp Glu 325 330 335 He Tyr Lys Glu He Tyr Giu Leu Tyr Val Glu Axg Asn He Pro Glu 340 345 350 Tyr Tyr Glu Arg Lys Tyr Phe Ser Glu Asp He Lys Lys Ser Val Leu 355 360 365 Phe Asp He Asp Lys Tyr Asn Asp Val Glu Phe Glu Lys Ala He Lys 370 375 380 Glu GH Phe He Asn Asn Gly Val Tyr He Asn Asn He Asp Asn Thr 385 390 395 400 Tyr Tyr Lys Lys Glu Asn He Leu He Met Lys Lys He Leu His Tyr 405 410 415 Phe Pro Leu Leu Lys Leu He Asn Asn Pro Ser Asp Leu Lys Lys Leu 420 425 430 Lys Lys Gln Tyr Leu Pro Leu Leu Ala His Glu Leu Lys He Phe Leu 435 440 445 Phe Phe He Val Asn He Thr Gly Gly His Phe Ser- Ser Val Leu Ser 450 455 460 Ser Leu Glu He Glr. Leu Leu Leu Leu Tyr lie Phe Asn Gln Pro Tyr 465 470 475 480 Asp Asn Val He Tyr Asp He Gly Kis Gln Ala Tyr Val His Lys He 485 490 495 Leu Thr Gly Arg Lys Leu Leu Phe Leu Ser Leu Arg Asn Lys Lys Gly 500 505 510 He Ser Gly Phe Le Asn lie Phe Giu Ser He Tyr Asp Lys Phe Gly 515 520 525 Ala Gly His Ser Ser Thr Ser Leu Ser Ala :ie Gln Gly Tyr Tyr Glu 530 535 54C Ala Glu Trp Gln Val Lys Asn Lys Glu Lys Tyr Gly Asn Gly Asp lie 545 550 555 560 Glu He Ser Asp Asn Ala Asn Val Thr Asn Asn Glu Arg He Phe Gln 565 570 575 Lys Gly He Hxs Asn Asp Asn Asn He Asn Asn Asn He Asn Asn Asn 580 585 590 Asn Tyr He Asn Pro Ser Asp Val Val Gly Arg Glu Asn Thr Asn Val 595 600 605 Pro Asn Val Arg Asn Asp Asn His Asn Val Asp Lys Val His He Ala 610 615 620 He He Gly Asp Gly Gly Leu Thr Gly Gly Met Ala Leu Glu Ala Leu 625 630 635 640 Asn Tyr He Ser Phe Leu Asn Ser Lys He Leu He He Tyr Asn Asp 645 650 655 Asn Gly Gln Val Ser Leu Pro Thr Asn Ala Val Ser He Ser Gly Asn 660 665 670 Arg Pro He Gly Ser He Ser Asp His Leu His Tyr Phe Val Ser Asn 675 680 685 He Glu Ala Asn Ala Gly Asp Asn Lys Leu Ser Lys Asn Ala Lys Glu 690 695 700 Asn Asn He Phe Glu Asn Leu Asn Tyr Asp Tyr He Gly Val Val Asn 705 710 715 720 Gly Asn Asn Thr Glu Glu Leu Phe Lys Val Leu Asn Asn He Lys Glu 725 730 735 Asn Lys Leu Lys Arg Ala Thr Val Leu His Val Arg Thr Lys Lys Ser 740 745 750 Asn Asp Phe He Asn Ser Lys Ser Pro He Ser He Leu His Ser He 755 760 765 Lys Lys Asn Glu He Ppe Pro Phe Asp Thr Thr He Leu Asn Gly Asn 770 775 780 He His Lys Glu Asn Lys He Glu Glu Glu Lys Asn Val Ser Ser Ser 785 733 7S5 800 Thr Lys Tyr Asp Val Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Asp Asn Ser 805 810 815 Giu He He Lys Tyr Glu Asp Met Phe Ser Lys Glu Thr Phe Thr Asp 820 825 830 He Tyr Thr Asn Glu Met Leu Lys Tyr Leu Lys Lys Asp Arg Asn He 835 840 845 He Phe Leu Ser Pro Ala Met Leu Gly Gly Ser Gly Leu Val Lys He 850 _ 855 860 Ser Glu Arg Tyr Pro Asn Asn Val Tyr Asp Val Gly He Ala Glu Gln 865 870 875 880 His Ser Val Thr Phe Ala Ala Ala Met Ala Met Asn Lys Lys Leu Lys 885 890 895 He Gln Leu Cys He Tyr Ser Thr Phe Leu Gln Arg Ala Tyr Asp Gln 900 905 910 He He His Asp Leu Asn Leu Gln Asn He Pro Leu Lys Val He He 915 920 925 Gly Arg Ser Gly Leu Val Gly Glu Asp Gly Ala Thr His Gin Gly lie 930 935 940 Tyr Asp Leu Se? Tyr Leu Gly Thr Leu Asn Asn Ala Tyr He He Ser 945 950 " 955 960 Pro Ser Asn Gln Val Asp Leu Lys Arg Ala Leu Arg Phe Ala Tyr Leu 965 970 ' 975 Asp Lys Asp His Ser Val Tyr He Arg He Pro Arg Met Asn lie Leu 980 985 990 Ser Asp Lys Tyr Met Lys Gly Tyr Leu Asn He His Met Lys Asn Glu 995 1000 _ 1005 Ser Lys Asn He Asp Val Asn Val Asp He Asn Asp Asp Val Asp Lys 1010 1015 1020 Tyr Ser Glu Glu Tyr Met Asp Asp Asp Asn Phe He Lys Ser Phe He 025 1030 1035 1040 Gly Lys Ser Arg He He Lys Met Asp Asn Glu Asn Asn Asn Thr Asn 1045 1050 1055 Glu His Tyr Ser Ser Arg Gly Asp Thr Gln Thr Lys Lys Lys Lys Val 1060 1065 1070 Cys He Phe Asn Met Gly Ser Met Leu Phe Asn Val He Asn Ala He 1075 1080 1085 Lys Glu He Glu Lys Glu Gln Tyr He Ser His Asn Tyr Ser Phe Ser 1090 1095 1100 He Val Asp Met He Phe Leu Asn Pro Leu Asp Lys Asn Met He Asp 105 1110 1115 1120 His Val He Lys Gln Asn Lys His Gln Tyr Leu He Thr Tyr Glu Asp 1125 1130 1135 Asn Thr He Gly Gly Phe Ser Thr His Phe Asn Asn Tyr Leu He Glu 1140 1145 1150 Asn Asn Tyr He Thr Lys His Asn Leu Tyr Val His Asn He Tyr Leu 1155 1160 1165 Ser Asn Glu Pro He Glu His Ala Ser Phe Lys Asp Gln Gln Glu Val 1170 1175 1180 Val Lys Met Asp Lys Cys Ser Leu Val Asn Arg He Lys Asn Tyr Leu 185 1190 1195 1200 Lys Asn Asn Pro Thr 1205

Claims (24)

REIVINDICACIONES

1.- Proceso para obtener ingredientes activos químicos que son adecuados para tratar enfermedades infecciosas provocadas por parásitos unicelulares o pluricelulares, caracterizado porque se pone en contacto proteínas que están implicadas en la trayectoria metabólica del 5-fosfato de 1-desoxi-D-xilulosa, o sus derivados que actúan similarmente, con los ingredientes activos que son investigados en cuanto a su actividad con respecto a los parásitos; y se selecciona los ingredientes activos que inhiben las proteínas o sus derivados.

2.- Proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque las proteínas están implicadas por lo menos en uno de los siguientes pasos a) - i): (a) convertir el gliceraldehído y el piruvato a 1 -desoxi-D-xilulosa; (b) convertir el 3-fosfato de gliceraldehído y el piruvato para formar difosfato de isopentenilo; (c) formar 5-fosfato de 1 -desoxi-D-xilulosa; (d) convertir 3-fosfato de gliceraldehído ypiruvato para formar 5- fosfato de 1 -desoxi-D-xilulosa; (e) convertir 5-fosfato de 1 -desoxi-D-xilulosa; (f) formar 4-fosfato de 2-C-metil-D-epJritol; (g) convertir 5-fosfato de 1-desoxi-D-xilulosa a 4-fosfato de 2-C- metil-D-eritritol; (h) convertir 4-fosfato de 2-C-metil-D-eritritol; (i) convertir 4-fosfato de 2-C-metil-D-epJritol a difosfato de isopentenilo.

3.- Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado además porque el ingrediente activo inhibe la producción de las enzimas implicadas o los cofactores implicados, en particular la conversión de la enzima 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato-sintasa o 1-desoxi-D-x i lulosa-5- fosfato-reductoisomerasa, o promueve la degradación de las enzimas implicadas o los cofactores implicados.

4.- Proteína, con o sin actividad de 1 -desoxi-D-xilulosa-5-fosfato-síntasa, que está implicada en la trayectoria metabólica del 5-fosfato de 1-desoxi-D-xilulosa y a) está codificada a partir de la secuencia de ADN mostrada en las figuras 1b y 2b; o b) está codificada a partir de secuencias de ADN que se hibridan con las secuencias de ADN mostradas en las figuras 1b o 2b, o fragmentos de esas secuencias de ADN, en la región del ADN que codifica la proteína madura.

5.- Proteína con o sin actividad de 1 -desoxi-D-xílulosa-5-fosfato-reductoisomerasa, implicada en la trayectoria metabólíca del 5-fosfato de 1-desoxi-D-xiluiosa, caracterizada porque está: (a) codificada a partir de la secuencia de ADN mostrada en las figuras 1a y 2a, o (b) está codificada a partir de secuencias de ADN que se hibridan con las secuencias de ADN mostradas en las figuras 1a o 2a, o fragmentos de esas secuencias de ADN en la región del ADN que codifica la proteína madura.

6.- Proteína de conformidad con las reivindicaciones 4 o 5, y proteínas adicionales que están implicadas en la trayectoria metabólica del 5-fosfato de 1-desoxi-D-xilulosa, caracterizada porque pueden ser obtenidas a partir de los sobrenadantes de cultivo de parásitos o a partir de los parásitos digeridos, mediante técnicas de purificación cromatográficas y electroforéticas.

7.- Proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizadas porque es: (a) el producto de una expresión procariótica o eucariótica de un ADN exógeno; (b) está codificada a partir de las secuencias 1a, 1b, 2a o 2b, o está codificada a partir de secuencias de ADN que se hibridan con las secuencias de ADN mostradas en las figuras 1a, 1b, 2a o 2b, o fragmentos de esas secuencias de ADN en la región del ADN que codifica la proteína madura; o (c) está codificada a partir de secuencias de ADN que se hibridarían con las secuencias definidas en (b) sin degeneración del código genético, y codificarían un polipéptido con la secuencia de aminoácidos correspondiente.

8.- Proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 4 a 7, caracterizada porque consiste de los aminoácidos de las secuencias 2a, 2b, 3a o 3b.

9.- Proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, caracterizada además porque la proteína es 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato-sintasa o 1 -desoxi- D-xi I ulosa -5-f osf ato-reductoisomerasa.

10.- Ácido nucleido que codifica una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, caracterizado porque está seleccionado del grupo: a) de las secuencias de ADN mostradas en las figuras 1a, 1b, 2a, 2b o las secuencias de ADN complementarias; b) las secuencias de ácido nucleico que se hibridan con la secuencia de a); c) las secuencias de ácido nucleico que se híbridarían con una de las secuencias mencionadas en a) o b), sin degeneración del código genético.

11.- ADN, caracterizado porque tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la secuencia mostrada en la figura 1a, la secuencia mostrada en la figura 1b, la secuencia mostrada en la figura 2a y la secuencia mostrada en la figura 2b.

12.- Vector de expresión recombínante, que contiene ADN, que codifica una proteína de acuerdo con las reivindicaciones 4 a 9 y expresa el ADN que codifica la proteína en un microorganismo transformado o en una célula eucariótica transformada, o en un animal o en una planta.

13.- Célula anfitriona, en particular una célula anfítriona procariótica, una célula anfitriona eucariótica, animales y plantas que, con está transfectada con un ADN que codifica una proteína de acuerdo con las reivindicaciones 4 a 9, y puede producir la proteína mencionada.

14.- Célula anfitriona de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque es E. coli o una línea de células de mamífero.

15.- El uso de ADN que codifica una proteína de acuerdo con las reivindicaciones 4 a 9, para la transfección de un organismo procariótico o eucariótico.

16.- Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicacioines 1 a 3, caracterizado además porque se obtiene la proteína de parásitos o de sobrenadantes de cultivo de los cultivos de parásitos, mediante técnicas cromatográficas y electoforéticas.

17.- Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 16, caracterizado además porque se produce recombinantemente la proteína por expresión del ADN que codifica una proteína, conforme a una de las reivindicaciones 4 a 9, en una célula anfitriona adecuada, y se aisla la proteína de la célula anfítriona o del sobrenadante de cultivo de la célula anfitriona.

18.- El usod e una proteína de la trayectoria metabólica de 5-fosfato de 1 -desoxi-D-xilulosa, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, como antígeno o inmunógeno, para producir anticuerpos que se enlazan a esta proteína.

19.- Anticuerpos contra una proteína de la trayectoria metabólica de 5-fosfato de 1 -desoxi-D-xilulosa, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, caracterizados porque pueden ser obtenidos mediante técnicas de inmunización in vitro, o inmunizando un animal con una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, y obteniendo los anticuerpos del suero o de las células de bazo de los animales inmunizados.

20.- El uso de una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, para identificar sustancias que actúan de manera antiparasitaria.

21.- El uso de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 19, para identificar una sustancia que tiene acción antiparasitaria.

22.- Proceso para identificar ácidos nucleicos que codifican una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, caracterizado porque se incuba la muestra que va a ser investigada, con una sonda de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de: a) las secuencias de ADN mostradas en la figura 1a y b, o la secuencia complementaria a ellas; b) ácidos nucleicos que se hibridan a una de las secuencias de a), por cuanto se incuba la sonda de ácido nucleico con el ácido nucleico de la muestra y se detecta opcionalmente la hibridación por medio de otro partícipe de unión de la sonda de ácido nucleico.

23.- Proceso de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque se amplifica el ácido nucleico que se va a detectar, antes de la detección. 24.- Sistemas de prueba, caracterizados porque usan una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para identificar una sustancia que tiene acción antiparasitaria. 25.- Ingrediente activo para producir una composición farmacéutica para tratar enfermedades infecciosas provocadas por parásitos unicelulares o pluricelulares, caracterizado porque está identificado usando un sistema de prueba de acuerdo con la reivindicación 24. 26.- Ingrediente activo para producir una composición herbicida o farmacéutica para tratar enfermedades infecciosas provocadas por bacterias, caracterizado porque está identificado usando un sistema de prueba de conformidad con la reivindicación

24. 27.- Ingrediente activo para producir una composición farmacéutica para tratar enfermedades infecciosas provocadas por parásitos unicelulares o pluricelulares, caracterizado porque inhibe las enzimas o cofactores de la trayectoria metabólica del 5-fosfato de 1 -desoxi-D-xilulosa. 28.- Ingrediente activo de conformidad con la reivindicación 25 o 27, caracterizado además porque inhibe por lo menos uno de los siguientes pasos a) - i): (a) convertir el gliceraldehído y el piruvato a 1 -desoxi-D-xilulosa; (b) convertir el 3-fosfato de gliceraldehído y el piruvato para formar difosfato de ¡sopentenilo; (c) formar 5-fosfato de 1-desoxi-D-xilulosa; (d) convertir 3-fosfato de gliceraldehído ypiruvato para formar 5- fosfato de 1 -desoxi-D-xilulosa; (e) convertir 5-fosfato de 1 -desoxi-D-xilulosa; (f) formar 4-fosfato de 2-C-metil-D-eritritol; (g) convertir 5-fosfato de 1-desoxi-D-xilulosa a 4-fosfato de 2-C- metil-D-eritritol. (h) convertir 4-fosfato de 2-C-metil-D-eritritol; (i) convertir 4-fosfato de 2-C-metil-D-eritritol a difosfato de isopentenilo. 29.- Ingrediente activo de conformidad con la reivindicación 25, 27 o 28, caracterizado además porque el ingrediente activo inhibe la producción de las enzimas implicadas, o de los cofactores implicados, en particular la conversión de la enzima 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato-sintasa o 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato-reductoisomerasa, o promueve la degradación de las enzimas implicadas o de los cofactores implicados. 30.- Ingrediente activo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, caracterizado además porque el ingrediente activo es fosfonato de 3-(N-acet¡I-N-hidroxiamino)propilo o fosfonato de 3-(N-formil-N-hídroxiamino)propilo. 31.- El uso de un ingrediente activo de conformidad con la reivindicación 25, 27 o 30, para producir una composición farmacéutica para tratar enfermedades infecciosas provocadas por parásitos unicelulares o pluricelulares, en particular malaria, mal del sueño y leishmaniosis. 32.- El uso de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado además porque la composición farmacéutica comprende también uno o una pluralidad de constituyentes del grupo que consiste de inhibidores para las trayectorias del metabolismo de las grasas, la síntesis del colesterol o la absorción del colesterol. 33.- El uso de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque el inhibidor del metabolismo de las grasas es un inhibidor de HMG-CoA-reductasa o un inhibidor de HMG-CoA-sintasa, en particular Lovastatin, Mevastatin, Compactin, Simvastatin, Pravastatin, Atorvastatin, Fluvastatin y Cerivastatin.