JP2002502612A

JP2002502612A - モルティエラ

Info

Publication number: JP2002502612A
Application number: JP2000530626A
Authority: JP
Inventors: デュチャーズ，マシュー・ガイ
Original assignee: アベシア・リミテッド
Priority date: 1998-02-07
Filing date: 1999-01-21
Publication date: 2002-01-29
Also published as: GB9802561D0; KR20010040732A; ZA99738B; WO1999040215A1; CN1296527A; ID26203A; EP1053344A1; AU2177299A; CA2320407A1; BR9907701A; NO20003981L; NO20003981D0

Abstract

(57)【要約】形態学的に緻密な変種を用いることにより、培養中のモルティエラの表面への付着性が減少される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】この発明は、モルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）に関する。

【０００２】モルティエラは糸状菌（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｕｓ）の属であっ
て、少なくともモルティエラの幾つかの微生物がポリ不飽和脂肪酸（特に、アラ
キドン酸）の残基及びヒトによって該脂肪酸に代謝可能な他のポリ不飽和脂肪酸
（例えば、γ−リノレン酸）の残基を含む脂質を生産するために産業上興味があ
る。このような脂質及び／又はそられから誘導されるこのような酸は、栄養補助
食品（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）として用いられたと
きにヒトの健康に有益であると考えられている。ヒトの母乳により近づけるため
に、このような脂質及び／又は酸を乳児用調製粉乳（ｉｎｆａｎｔｆｏｒｍｕ
ｌａ）（ヒトの乳児のための人工ミルク）に添加することが提案されている。こ
れらの酸、脂質又はそれらを生産する微生物自体を食することが可能であり、そ
れらのポリ不飽和脂肪酸は次いで消化の正常な過程（ｎｏｒｍａｌｐｒｏｃｅ
ｓｓｅｓ）によって利用されるに至る。

【０００３】本発明者らは、発酵の過程において、モルティエラは装置表面（ｐｌａｎｔ
ｓｕｒｆａｃｅｓ）に付着しやすいことを見いだした。顕微鏡検査（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）によれば、
一般的にモルティエラのフィラメントは非常にもつれる傾向が強く、そのため、
形態学的特徴を定量化するために１つの個体を他の個体と識別することは一般に
可能ではない。しかしながら、もつれていない末端部がもつれた塊（ｍａｓｓ）
からはみ出ており、これらの末端部を検査すると望ましい微生物（ｏｒｇａｎｉ
ｓｍ）は対応する公知の微生物よりも高度に枝分かれしている。

【０００４】望ましい微生物は公知の変種（ｖａｒｉｅｔｉｅｓ）よりも緻密な形態（より
大きな程度の枝分かれに対応する）を有していることを次の処置により示すこと
ができる。望ましい微生物がいかなる理由でかついかなる具合により固体表面に
付着しにくいかは知られていない。

【０００５】モルティエラの望ましい菌株を同定するために、幾つかの菌株を液体培養及び
平板培養で比較条件下で培養してもよい。平板用の栄養培地は液体培養において
用いられる栄養培地と異なっていてもよい。ある期間このような平板培養を行っ
た後で覆われる面積（ａｒｅａ）は、望ましい微生物の場合のほうが同じ液体培
養増殖率の他の微生物の場合に比べて実質的に小さい。典型的には、望ましい微
生物によって覆われる面積は半分より少なく、好ましくは、液体培地における同
じ増殖率のモルティエラの公知の菌株によって覆われる面積の４分の１よりも少
ない。

【０００６】モルティエラの形態は、Ｍ＝Ｋｒ／μｍａｘで表される形態指数（ｍｏｒｐｈ
ｏｌｏｇｙｉｎｄｅｘ）としてより一般的に定量化してもよい。なお、この式
において、Ｋｒは平板上における１時間当たりの平均拡大半径（ａｖｅｒａｇｅ
ｒａｄｉａｌｅｘｐａｎｓｉｏｎ，単位：μｍ）であり、μｍａｘは下記の
組成の液体培養用培地を用いて液体培養でかつ同じ温度においてｌｏｇ_e２を倍増時間（ｄｏｕｂｌｉｎｇｔｉｍｅ）（即ち、拘束を受けない培養条件下（即
ち、その最大増殖速度）で乾燥細胞重量が２倍になるのに要する時間）で割った
値である。

【０００７】濃度（ｇｌ^-1）（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ３．０ＭｇＳＯ₄．７Ｈ₂Ｏ１．０Ｋ₂ＳＯ₄ １．３Ｈ₃ＰＯ₄ ０．７５ｍｌ酵母自己消化物（バイオスプリンガー）３．０グルコース４５．０微量成分溶液１．０（組成ＭｎＳＯ₄．４Ｈ₂Ｏ４０ｇｌ^-1 ＺｎＳＯ₄．７Ｈ₂Ｏ５０ｇｌ^-1 ＣｕＳＯ₄．５Ｈ₂Ｏ５ｇｌ^-1 ビオチン５０ｍｇｌ^-1 Ｈ₂ＳＯ₄ ５ｍｌｌ^-1）上記組成物は初期ｐＨ６．８であり、これは必要に応じてＮａＯＨを添加するこ
とによりその低下を防ぐ。Ｋｒの平均値は、次の組成の等しい数の平板上におい
て２４時間の間をおいて行った４日間にわたる測定に基づいている。（ａ）１．９（ｇ／ｌ）Ｋ₂ＨＰＯ₄ １．６（ｇ／ｌ）ＮａＨ₂ＰＯ₄ １．８（ｇ／ｌ）（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ０．２（ｇ／ｌ）ＭｇＳＯ₄．７Ｈ₂Ｏ（高圧蒸気滅菌後に濾過滅菌して添加）０．９（ＭＧ／Ｌ）ＦｅＣｌ₃ １．０（ｍｌ／ｌ）微量成分（７２０ｍｇ／ｌのＣａ、５ｍｇ／ｌのＣｕ、２３ｍｇ／ｌのＺｎを含有し、２ＭのＨＣｌでｐＨ７．２に調整）上記に加えて、最終濃度が４５ｇ／ｌになるまでグルコースを添加し、最終濃度が５ｇ／ｌになるまで酵母エキスを添加し、最終濃度が１５ｇ／ｌになるまで寒天を添加した。（ｂ）ポテトエキス４．０ｇ／リットルグルコース２０．０ｇ／リットル寒天１５．０ｇ／リットルｐＨ５．６±０．２（ｃ）麦芽エキス３０．０ｇ／リットル菌学的ペプトン（ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌｐｅｐｔｏｎｅ）５．０ｇ／リットル寒天１５．０ｇ／リットルｐＨ５．４±０．２（ｄ）１．９ｇ／ｌＫ₂ＨＰＯ₄ １．６ｇ／ｌＮａＨ₂ＰＯ₄ ０．１ｇ／ｌ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ０．２ｇ／ｌＭｇＳＯ₄．７Ｈ₂Ｏ（高圧蒸気滅菌後に濾過滅菌して添加）０．９ｍｇ／ｌＦｅＣｌ₃ １．０ｍｌ／ｌ微量成分（７２０ｍｇ／ｌのＣａ、５ｍｇ／ｌのＣｕ、２３ｍｇ／ｌのＺｎを含有し、２ＭのＨＣｌでｐＨ７．２に調整）０．１ｇ／ｌ酵母エキス４５ｇ／ｌグルコース１５ｇ／ｌ寒天Ｍの値が、Ｍ≦４×１０³μｍ及び好ましくはＭ≦３．５×１０³μｍが好まし
い。もし平板上のコロニーがほとんど円形であるならば、２つの垂直方向の拡大
半径の測定で十分かもしれないが、もし平板上のコロニーが円形から逸脱した形
である場合はより多くの測定が必要であるかもしれない。

【０００８】本発明は、上で定義した形態指数Ｍが４×１０³μｍ以下、好ましくは３．５ ×１０³μｍ以下であるモルティエラの新規な菌株を含む。モルティエラの好適な菌株は、例えば、以下に挙げるものであり得る：Ｍ．ａ
ｌｐｉｎａ（モルティエラ・アルピナ）、Ｍ．ｂａｉｎｉｅｒｉ（モルティエラ
・バイニエリ）、Ｍ．ｅｌｏｎｇａｔａ（モルティエラ・エロンガタ）、Ｍ．ｅ
ｘｉｇｕａ（モルティエラ・エクシグア）、Ｍ．ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ（モルテ
ィエラ・ハイグロフィア）、Ｍ．ｇｌｏｂａｌｐｉｎａ（モルティエラ・グロバ
ルピナ）、Ｍ．ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ（モルティエラ・ミヌティシマ）、Ｍ．
ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ（モルティエラ・ヴェルティラタ）、Ｍ．ｐｏｌｙｃ
ｅｐｕａｌａ（モルティエラ・ポリセプアラ）及びＭ．ｚｙｚｃｈａｅ（モルテ
ィエラ・ザイズカエ）。これらはエイコサペンタエン酸、γ−リノレン酸（ＧＬ
Ａ）又は好ましくはアラキドン酸及び／又はそれらの誘導体、特にそれらの残基
を含む脂質を、過程の条件（ｐｒｏｃｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）に依存し
て生産し得るものである。

【０００９】さらに本発明は、新規なモルティエラの菌株を選択する方法を提供する。その
ような方法の１つは、同じ条件下で寒天平板上で菌株を培養し、小さなコロニー
面積を有する菌株を選択することを含む。コロニー領域において低い密度として
観察されるほとんど増殖を示さない菌株は無視すべきである。そのようにして選
択された菌株は望ましい形態指数を有する可能性が最も高い。好適な菌株は、栄
養制限（特に窒素制限）の条件下でモルティエラの菌株を長時間培養し、次いで
コロニー面積及び／又は形態の適切な値の個体を選択することによって生産され
得る。次いで、このような個体は栄養制限の条件下で適切に培養され得、もし必
要ならば選択を繰り返してもよい。

【００１０】本発明は、モルティエラの発酵装置表面への実質的な付着が生じるまで、好ま
しくは連続培養後にその培養物から緻密な形態の微生物を選択すること、及び前
記より緻密な微生物の後続発酵を実施することを含む、発酵槽（ｆｅｒｍｅｎｔ
ｏｒ）におけるモルティエラの培養方法を含む。この手順は、表面への低い付着
性を有する微生物が得られるまで必要な回数だけ繰り返してよい。

【００１１】「表面への低い付着性（ｌｏｗａｄｈｅｓｉｏｎｔｏｓｕｒｆａｃｅｓ
）」は、発酵において遭遇する不都合状態（ｔｕｒｂｕｌｅｎｃｅ）にある微生
物を正常な条件下で表面から除去する速度が、かかる表面上における沈着物の形
成（ｂｕｉｌｄ−ｕｐ）を防ぐのに十分であることを意味する。

【００１２】また、本発明は、上述の通りモルティエラを培養する段階（ｓｔｅｐ）を含む
脂質の製造方法を提供する。バッチ培養においては、目的とする微生物が望ましい含有量になるまで増殖さ
れた微生物で培地を最初に接種し、次に１種又は２種以上の栄養素が消費された
後更に培養されることが好ましく、それからバイオマスを回収する。１種又は２
種以上の栄養素の供給は培養中に補充してもよい（「供給バッチ（”ｆｅｄｂ
ａｔｃｈ”）」）。連続培養においては、新しい栄養素を追加し、培養を中止す
ることなく生成物を除去する。このような追加及び除去は連続的であっても断続
的であってもよい。新しい品種のモルティエラはバッチ操作若しくは供給バッチ
操作に都合がよいが、特に連続培養に好適である。各態様において、新しいモル
ティエラは、より均質な混合物を形成し、したがってより優れた混合（ｍｉｘｉ
ｎｇ）を与え、その結果一般的により速い及び／又はより大きなバイオマス形成
を提供する。

【００１３】連続培養は公知の方法で、例えば、エアリフト発酵槽（ａｉｒｌｉｆｔｆ
ｅｒｍｅｎｔｏｒ）（この発酵槽は動く部分はないが、溝を公知の品種（ｖａｒ
ｉｅｔｉｅｓ）で詰まってもよい）内で又は撹拌容器内で実施してよい。

【００１４】本発明による微生物は、典型的には、ｐＨ４５ないし１０、好ましくはｐＨ６
ないし８で増殖させ得る。脂質生産のためには、ｐＨは最初の値が５ないし６か
ら最後の値が６．５ないし７．５に上るよう調節することが好ましい。温度は５
−４０℃、好ましくは２０−３０℃である。微生物は固体培地上で培養してもよ
いが、液体培地を使用するのが好ましい。液体中の炭素源は可溶化物（ｓｏｌｕ
ｂｌｅｓ）、例えば、グルコース（ブドウ糖）、フルクトース（果糖）、スクロ
ース（蔗糖）、マルトース（麦芽糖）若しくは可溶性デンプン、または低溶解性
炭水化物、脂肪酸又は脂質及び／又は（増殖のために炭化水素を代謝する微生物
の場合）炭化水素を含んでもよい。窒素源は複合的（ｃｏｍｐｌｅｘ）であって
よく、例えば、蛋白質、ペプチド及び／又はアミノ酸、例えば、酵母エキス、肉
エキス、コーンスティープリカーが挙げられ、或いは単一的（ｓｉｍｐｌｅ）で
あってもよく、例えば、硝酸塩及び／又はアンモニウムイオン（アンモニウムイ
オンは、例えば、硫酸塩又はアンモニアガスとして供給される）が挙げられ、或
いは窒素源は複合的供給源と単一的供給源の混合物であってもよい。リン酸塩の
供給源は無機物質が好ましい。微量成分及びビタミンを含めてもよい。炭素源の
濃度（全培地に基くｗ／ｗ）は０．１％以上が好ましく、３０％以上であっても
よいが、好ましくは１−１５％、例えば、２−１０％である。窒素源の濃度（全
培地に基くｗ／ｗ）は、当量の窒素原子（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔＮ）として計
算して、例えば、０．０１ないし１％，特に０．１ないし０．４％である。栄養
源が消耗した時には、追加の栄養源を加えてもよい。複数の炭素源を用いてもよ
い。脂質の収率を高めるために、炭素材料以外の栄養源、特に窒素又はリン酸塩
の消費後の培養相（ｐｈａｓｅｏｆｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）を操作するこ
とが好ましい。

【００１５】培養は、好気性条件、好適には気体として供給される溶存酸素（濃縮されてい
てもよい）の存在下で行う。培養物を、例えば、攪拌あるいはガス流でかき混ぜ
ることが好ましい。好ましくは、エアリフト発酵槽（液体の循環を、酸素、空気
等のガス注入で維持する）を用いる。

【００１６】培養された細胞は好適には、有機溶媒等（例えば、ヘキサン、エステル、アル
コールを使用するが、これらを組み合わせたものを使用してもよく、あるいはこ
れらを連続して使用してもよい）により抽出される。必要であれば、例えばクロ
ロホルムなどのハロゲン化ハイドロカーボンによって抽出してもよいが、環境問
題を避けるためには、ハイドロカーボン類、アルコール類あるいはエステル類を
使用することが好ましい。

【００１７】

【実施例】

モルティエラ・アルピナ（ＭｏｒｉｅｒｅｌｌａＡｌｐｉｎａ）ＡＴＣＣ３
２２２２は、溶存酸素圧力（dissolved oxygen tension ODT)が空気飽和の約２０％に維持された、ｐＨ６．８、２６℃の好気条件下における連続培養で生育さ
れた。発酵期間中を通してグルコース濃度が持続的に５〜２０ｇ／ｌに維持され
、硫酸アンモニウムが制限基質（limiting substrate）となるように、過量のグ
ルコースを主要炭素源として加えたＳＤ４培地（下の表を参照）を用いて培養を
行った。希釈率０．０５ｈ―¹と同等となるように培地を加えた。

【００１８】毎日、発酵槽から培養サンプルを採取し、Ｓ２ＧＹＥアガープレートで生育さ
せ（付録２参照）、得られたコロニーの集落変異を注意深く調べた。連続培養発酵槽に接種してから６２０時間後、集落変異を観察した。これらの
集落変異株は親である原株よりも小さい領域を占めていた。さらに、集落変異株
の方が分岐が多かった。

【００１９】培養をさらに１６５時間続けたところ、存在する株の８８％が集落変異株とな
った。新しい集落変異株の純培養を、２８℃でＳ２ＧＹＥプレートで行った。７日間
生育させた後、無菌的に、菌糸上の胞子を滅菌生理食塩水に移して、胞子懸濁液
を調製した。次いで、１０μｌ滴の胞子溶液を、所望の培地を含むアガープレー
トの中央に移した。

【００２０】次いで、プレートを２８℃でインキュベートし、各プレートのコロニーの直径
を計測することにより（直角をなす２径を計測）、コロニーの増大率を毎日計測
した。これは、下記の４種類の培地において行われた。（Ａ）Ｓ２ＧＹＥアガー（Ｂ）ポテトデキストロースアガー（Ｃ）麦芽エキス（Ｄ）Ｓ２ＬｏｗＮ（付録２を参照）。原株に対しても同様のプロセスを行った。

【００２１】各日の半径成長率を算出し、成長期間全体の平均値を決定した（付録３を参照
）。データからは、新株の半径増大率が原株のそれより顕著に低いことがわかる
。

【００２２】この新しい微生物は、２６℃、好気性条件下で液体培地で培養された（付録４
を参照）。バッチ発酵を採用し、開始ｐＨを６．８とし、滅菌された２モルＮａ
ＯＨを添加して培養ｐＨが下がるのを防いだ。ｐＨ上昇をコントロールするため
の手段は何も設けなかった。微生物の最大成長率はＣＯ₂放出率（ＣＥＲ）を測定して決定した。同様にして原微生物を同一の条件で培養し、同一の方法で最大
成長率を決定した。その結果、これらの成長率は同様であり（原株が０．０６ｈ ^-1 、新株が０．０７ｈ^-1）、新株の方が接着性が少ないことが示された。培養サ
ンプルを６日間成長させた後に分析した。ジクロロメタンとメタノールの２：１
ｖ／ｖ混合物溶媒抽出によりこのバイオマスの油分含有量を決定し、メチルエス
テルを形成しガス液体クロマトグラフィーで分析することにより、この抽出され
た油分のアラキドン酸含有量を決定した。結果を下記の表に示す。

【００２３】

【表１】

【００２４】上記のデータを用いて、各株についての形態指数（Ｍ）を算出することが可能
である。

【００２５】

【式１】

【００２６】付録１ＳＤ４培地成分濃度（ｇｌ^-1）（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ３．２ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．５Ｋ₂ＳＯ₄ １．０Ｈ₃ＰＯ₄ １．０酵母自己分解物（バイオスプリンガー）０．５微量元素溶液１．０^* 微量元素溶液^* 成分濃度（ｇｌ^-1）ＭｇＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ４０ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ５０ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ５ビオチン５０ｍｇＨ₂ＳＯ₄ ５ｍｌ。

【００２７】付録２Ｓｅｅｄ２の配合Ｓｅｅｄ２培地１．９（ｇ／ｌ）Ｋ₂ＨＰＯ₄ １．６（ｇ／ｌ）ＮａＨ₂ＰＯ₄ １．８（ｇ／ｌ）（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ０．２（ｇ／ｌ）ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（オートクレーブ後、濾過滅菌して添加）０．９（ｍｇ／ｌ）ＦｅＣｌ₃ １．０（ｍｌ／ｌ）Ｆｉｓｏｎｓ微量元素（７２０ｍｇ／ｌのＣａ、５ｍｇ／ｌ
のＣｕ、２３ｍｇ／ｌのＺｎを含み２ＭＨＣｌでｐＨ７．２とする）。培地（Ａ）Ｓ２ＧＹＥは、Ｓｅｅｄ２培地にグルコースを最終濃度４５ｇ／ｌとなるように
添加した物である。酵母エキス（ＯｘｏｉｄＬ２１）を最終濃度５ｇ／ｌとな
るように添加し、アガー（ＯｘｏｉｄＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌＬ１
１）を最終濃度１５ｇ／ｌとなるように加えた。培地（Ｂ）ポテトデキストロースはＯｘｏｉｄ（ＣＭ１３９）から得られた。下記のように
調製される。処方ｇｍ／リッターポテトエキス４．０グルコース２０．０アガー１５．０ｐＨ５．６±０．２培地（Ｃ）麦芽エキスアガーはＯｘｏｉｄ（ＣＭ５９）から得られた。下記のように調製さ
れる。処方ｇｍ／リッター麦芽エキス３０．０真菌性ペプトン５．０アガー１５．０ｐＨ５．４±０．２培地（Ｄ）Ｓ２ＬｏｗＮは、硫酸アンモニウムのレベルを０．１ｇｌ^-1に変更したＳｅｅ
ｄ２培地である。酵母エキス（ＯｘｏｉｄＬ２１）を最終濃度０．１ｇ／ｌと
なるように添加し、グルコースを最終濃度４５ｇ／ｌとなるように加え、さらに
最終濃度１５ｇ／ｌとなるように加えた。

【００２８】付録３種々の培地Ａ−Ｄ上でのモルティエラの新規株と原株の放射状コロニー拡大速
度（Ｋｒ）の比較

【００２９】

【表２】

【００３０】新規株は１９９８年１月８日に、イギリス連邦農業局、国際菌学研究所（Comm
onwealth Agricultural Bureau, International Mycological Institute), Ferr
y Lane, Kew, Surrey TW9 3AF, United Kingdom （現在はUK Centre (Egham), B
akeham Lane, Egham, Surrey, TW20 9TY）に寄託番号IMI 378077で寄託された。

【００３１】付録４濃度（ｇｌ^-1）（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ３．０ＭｇＳＯ₄．７Ｈ₂Ｏ１．０Ｋ₂ＳＯ₄ １．３Ｈ₃ＰＯ₄ ０．７５ｍｌ酵母自己分解物質（BioSpringer）３．０グルコース４５．０トレースエレメント溶液１．０（組成ＭｎＳＯ₄．４Ｈ₂Ｏ４０ｇｌ^-1 ＺｎＳＯ₄．７Ｈ₂Ｏ５０ｇｌ^-1 ＣｕＳＯ₄．５Ｈ₂Ｏ５ｇｌ^-1 ビオチン５０ｍｇｌ^-1 Ｈ₂ＳＯ₄ ５ｍｌｌ^-1）

【００３２】ＣＡＢＩバイオサイエンスＣＡＢインターナショナルの一部門 UK Centre (Egham), Bakeham Lane, Egham, Surrey, TW20 9TY 電話：++44(0)1784 470111 ファックス：++44(0)1784 470909 拝啓特許手続上の寄託受け入れ通知書微生物：モルティエラ・アルピナ IMI CC Number: 378077 （Mortierella alpina）株番号：２６Ｃ１９９８年１月１２日受け入れの上記の微生物は、１９９８年１月８日に貴方が
サインした申請書に記載の期間と条件に従い、１９９８年１月１２日に特許手続
上の寄託として受託され、そのコピーは貴方が所持すべきものである。敬具長官国際菌学研究所（International Mycological Institute） Egham, UK 遺伝子資源コレクション日付１９９７年２月６日

【００３３】ＣＡＢＩバイオサイエンスＣＡＢインターナショナルの一部門 UK Centre (Egham), Bakeham Lane, Egham, Surrey, TW20 9TY 電話：++44(0)1784 470111 ファックス：++44(0)1784 470909 拝啓特許手続上の生存証明微生物：モルティエラ・アルピナ IMI CC Number: 378077 （Mortierella alpina）株番号：２６Ｃ上記の微生物の生存について、１９９８年１月２７日に試験を実施した。この日
において前記微生物は生存していた。生存試験を行った条件（試験が否定的である場合にのみ記載すること）条約により認められた国際寄託当局であるＩＭＩ遺伝資源関連コレクションが、
ブタペスト条約における特許手続上の微生物寄託に従い証明書を発行する。敬具長官国際菌学研究所（International Mycological Institute） Egham, UK 遺伝子資源コレクション日付１９９７年２月６日

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:645）Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】好ましくは発酵槽の表面にモルティエラ（Mortierella）が実質的に付着するまで培養を継続した後に、培養物から緻密な形態の生物を選択し、そ
して前記のより緻密な生物で次の発酵を行うことを含む、発酵槽中でモルティエ
ラを培養する方法。
【請求項２】表面への低い付着性をもつ生物が得られるまで前記の工程を繰り返
すことを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】多くて４ｘ１０^-3μｍの形態指数（Ｍ）によって特徴づけられるモ
ルティエラの変種。
【請求項４】液体培養とプレート培養の両方でモルティエラの多数の株を成育し
、そして液体培養で同様の成育速度のモルティエラの株と比較してプレートの低
領域を覆う株を選択することを含む、固体表面への低い付着性をもつモルティエ
ラ変種を選択する方法。
【請求項５】栄養限定条件下に液体培地中でモルティエラの株を培養し、これで
得られる個々のものをプレート培養で培養し、前記生物を再培養するのに匹敵す
る条件下に実施した別のプレート培養物と比べて小さいコロニー領域をもつ少な
くとも１つの生物を選択し、そして所望により表面への低い付着性をもつ生物が
得られるまでこの工程を繰り返すことを含む、モルティエラ変種を産生する方法
。
【請求項６】脂質もしくは脂質含有食品を製造する方法であって、モルティエラ
の液体培養工程を含み、ここでモルティエラは請求項３に記載するものであるか
、請求項４に記載するように選択するか、あるいは請求項５に記載するように産
生するものである前記方法。
【請求項７】モルティエラの培養が連続的である請求項１、２又は６記載の方法
。
【請求項８】モルティエラがモルティエラ・アルピナ（Mortierella Alpina）で
ある、請求項１、２、５もしくは６に記載の方法、又は請求項３に記載するか、
請求項４に記載するように選択するか、あるいは請求項５に記載するように産生
するモルティエラ。
【請求項９】溶解酸素の存在下に可溶性炭水化物を含む液体培地中、６から８の
ｐＨ及び５から４０℃の温度でモルティエラを培養する、請求項１、２、６、７
もしくは８に記載の方法。
【請求項１０】請求項３に記載するか、請求項５に記載するように選択するか、
あるいは請求項１、２、６、７、８もしくは９のいずれかに記載の方法で産生し
たモルティエラから、好ましくは有機溶媒による溶媒抽出によって脂質を回収す
る方法。
【請求項１１】国際菌学研究所（International Mycological Institute）に受託番号IMI 378077で寄託された株の性質を有するモルティエラ、及びその変種、
変異体並びに誘導体。