JPS6314697A

JPS6314697A - エイコサペンタエン酸及びこれを含有する脂質の製造方法

Info

Publication number: JPS6314697A
Application number: JP61158651A
Authority: JP
Inventors: Yoshiji Shinmen; 新免　芳史; Akira Shimizu; 昌清水; Hideaki Yamada; 秀明山田
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1986-07-08
Filing date: 1986-07-08
Publication date: 1988-01-21
Anticipated expiration: 2010-02-15
Also published as: JPH0712315B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は醗酵法によるエイフ・リペンクエン酸の製造方
法に関する。

〔従来技術〕

従来からエイコサペンタエン酸く以下ＥＰＡという）の
生産方法としては、魚油またはある種の藻類より抽出、
精製する方法がとられている。しかしながら、いずれの
方法においても、魚油中のＥＰＡ含量は低く、さらには
不完全な精製、濃縮では魚臭が残る等、また藻類の培養
には、ある一定収上の光照射が必要条件である等、残さ
れている問題は多い。

また、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属の
微生物を用いるＥＰＡの製造方法は知られていない。

［発明が解決しようとする問題点〕本発明は、従来ＥＰＡを生産する能力を有することが知
られていなかったモルティエレラ属微生物を使用して、
安価な常用の培地を用いて、高収率で、しかも単純な工
程でＥＰＡを製造することができる方法を提供しようと
するものである。

〔問題点を解決するための手段〕

上記の目的はモルティエレラ属に属しＥＰＡ生産能を有
する微生物を培養してＦ、　Ｐ　Ａ又はＥＦ）’Ａを含
有する脂質を生成−１しめ、そしてＥＰＡを採取するこ
とを特徴とするＵ？、Ｐへの製造方法により達成される
。

〔具体的な説明〕

本発明において番：１、モルティエレラ属に属し、ＥＰ
Ａ生産能を有する微生物であれば、すべて使用すること
ができる。このような微生物として、例えばモルティエ
レラ・コニｒ：Ｉンガタ−（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌ　ｌａ
１並■釦）　ＩＦＯ８５７０、モルティエレラ・エキシ
グア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ｑｘｊＩ（ｕ、ａ）−
ＩＰＯ８５７］、モルティエレラ・ヒグロフイラー（、
Ｍｏ旦−Ｌｐｒｅｌｌａ　　力■ｐ枦辻ハ＞　ｒｐ。

５９４１等を挙げることができる。これらの菌株ｉｔい
ずれも、財団法人配酵研究所からなんら制限なく入手す
ることができる。

また、本発明者らが土壌から分離した菌株モルティエレ
ラ・エロンガタＳＡＭ　０２１９　（ｍ工研菌寄第８７
０３号）を使用することもできる。

次に、上記の菌株ＳＡＭ　０２１９　（微工研菌寄第８
７０３号）の菌学的性質を記載する。

各培地における生育状態培養条件＝２５℃、暗黒下１、麦芽エキス寒天培地コロニーの生育は良好、培養２日目のコロニーは直径２
８−３１ｍｍ　、培養５日目のコロニーは直径６５−７
２ｍｍ　、コロニーは決裂状を呈する、気菌糸の発達は
乏しい、胞子のう胞子の形成は良好、胞子のう柄は気菌
糸より生じる、ニンニクに類似した臭いあり。

２、バレイショ・ブドウ糖寒天培地コロニーの生育は良好、培養２日目のコロニーは直径２
７−３１ｍｍ　、培養５日目のコロニーは直径７５−８
０ｍｍ　、コロニーはパラの庇状を呈する、コロニー中
心部で気菌糸が著しく発達する、コロニーの裏側は黄白
色あるいは黄色、胞子のう胞子の形成は不良、ニンニク
に類似した臭いあり、臭いはやや強い。

３、　ツアペック寒天培地コロニーの生育は比較的良好、培養２日目のコロニーの
直径は２２−２４ｍｍ　、培養５日目のコロニーの直径
は５０−５３ｍｍ　、気菌糸の発達は乏しい、気菌糸が
密にからまりあうことがある。

胞子のう胞子の形成は非常に良好、胞子のう柄は気菌糸
より生じるニンニクに類似した臭いあり。

４、ＬＣＡ寒天培地（培地の調製方法は、三浦宏一部、
工藤光代著“水生不完全菌のための一寒天培地”日本画
学会会報ＩＩ巻、１１６−１１８頁、１９７０年に従っ
た）コロニーの生育は良好、培養２日目のコロニーの直径は
２７−２４１ｍｍ　、培養５０目のコロニーは直径６４
−（ｉ６ｍｍ　、コロニーは決裂状を呈する、気菌糸の
発達はコロニーの中心部を除いて乏しい、胞子のう胞子
の形成は良好。胞子のう柄は気菌糸より生じる。ニンニ
クに類似した臭いあり。

検鏡観察各培地の検鏡標本およびコロニーの直接検鏡で、胞子の
う柄、胞子のう柄の分岐の仕方、胞子のう、胞子のう胞
子などを観察した。

胞子のう柄は長さ８７．５−３２０μｍ、幅は基部で３
−７．５μｍ、先端に向けて先細り、１．０−２．５μ
ｍとなる。胞子のう柄はしばしば基部で分岐する。胞子
のうば球形、直径１５−３０μｍ、内部に多数の胞子の
う胞子を含む、離脱後やや不明瞭なカラーを残す。胞子
のう胞子は楕円形、希に腎臓形、表面は平滑、７．５−
１２．５Ｘ　５−７．５μｍ、厚膜胞子は比較的多数形
成される。単独、希に連鎖することがある。時に数本の
菌糸を周囲に出すことがある。楕円形また細球形、１２
．５−３０Ｘ　７．５−１５μｍ０または直径１２．５
−１５μｍ０接合胞子は観察されない。

３、生理的性質最適生育条件ｐＨ：６−９温度：２０−３０℃ 生育の範囲ｐＨ：４−１０温度：５−４０℃ 以上の菌学的諸性質に従い本発明の菌株（ＳＡＭ−０２
１９）の分類学的位置の検索を１．１．八、ｖｏｎ　Ａ
ｒｘ。

“Ｔｈｅ　Ｇｅｎｅｒａ　ｏｆ　Ｆｕｎｇｉ　５ｐｏｒ
ｕｌａＬｉｒ＋ｇｉｎ　Ｉ”ｕｒｅＣｕｌｔｕｒｅ、”
　３ｒｄ　ｅｄ、、　Ｊ、Ｃｒａｍｅｒ、１ｍ１ｌ、お
よびに、Ｈ。

Ｄｏｍｓｃｈ、　　Ｗ、Ｇａｍ５．＆　　Ｔ、１１．八
ｎｄｃｒｓｏｎ％’Ｃｏｍｐｔ＋ｎｄｉｕｍ　　ｏｆＳ
ｏｉｌ　Ｆｕｎｇｉ、”＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒａｓｓ
、　１９ＦＩＯに準拠して求めると、胞子のう柄の先端
に球状の胞ｒ−のうを形成する、柱軸を持たない、胞子
のう胞子に付属糸がない、培養菌糸がニンニクに［４以
した臭いを発する、ということから本菌株はＬ９Ｌｉｊ
−ｃｒｅｌ　ｉａ属に属する真菌であると考えられる。

そこで、ＪＧａｍｓ、”Ａ　Ｋｅｙ　ｔｏ　ｔｈｅ　５
ｐｅｃｉｅｓ　ｏｆＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ、”　Ｐｅ
ｒｓｏｏｎｉａ　９　、　３８１−３９１　、１９７７
に準拠して既知のＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ−属の種類と
菌学的諸性質を比較すると、本菌株はコロニーがビロー
ド状でない、培養菌糸がニンニクに類似した臭いを発つ
する、胞子のう柄が長さ８７．５−３２０　ｐ　ｍで分
岐は下部でのみ生じ、葡萄の房状に分岐しない、胞子の
うば内部に多数の胞子のう胞子を含む、ということから
Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌ　ｌａ属Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌ　Ｉａ
亜属（Ｓｕｇｅｎ、　Ｍｏｒｔｉｅｒｅ上ｍ圭レー節（
Ｓｅｃし。

ｌＷ旺奸ｈυ」□）に含まれると考えられる。

ｈ訂亜１圏節には２２種が含まれている。本菌株とこれ
ら２２種と菌学的諸性質を比較すると、本菌株はハ吐棟
匹且虹α薊憇、（１匹り旦ハ、およびＬ軒並ｕ田の３種
に類似すると考えられる。そこで、Ｋ、Ｉｌ、Ｄｏｍｓ
ｃｈ、　Ｗ、Ｇａｍ５＋＆　Ｔ、−Ｈ，八ｎｄｅｒｓｏ
ｎ。

“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　５ｏｌｌ　Ｆｕｎｇｉ
、”　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

１９８０、Ｗ、Ｇａｍ５　、　”Ｓｏｍｅ　ｎｅｗ　ｏ
ｒ　ｎｏｔｅｗｏｒｔｈｙ　５ｐｅｃ、１ｅｓｏｆ　Ｍ
ｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ、”　Ｐｅｒｓｏｏｎｉａ９　、
１１１−１４０．１９７７）、およびＧ、Ｌｉｎｎｅｍ
ａｎｎ＋″Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　Ｃｏｅｍａｎｓ　
１８６３．Ｈ，Ｚｙｃｈａ　＆　Ｒ，Ｓｉｅｐｍａｎｎ
、　”Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ　Ｅｉｎｅ　Ｂｅｓｃｈ−ｒ
ｅｉｂｕｎｇ　　Ａ１１ｅｒ　　Ｇａｔｔｕｎｇｅｎ　
　ａｎｄ　　Ａｒｔｅｎ　　ｄｉｅｓｅｒ　　Ｐｉｌｚ
−ｇｒｕｐｐｅ、”ｐｐ、１５５−１４０．　Ｊ、Ｃｒ
ａｍｅｒ、１９６９を参考にして、本菌株とこれら３種
と菌学的諸性質を比較した。本菌株は、Ｆｊ、Ｈｃ　ｈ
　ａ　ｅとは胞子のう柄の長さと基部の幅、胞子のうの
大きさで、明瞭に異なる。

Ｌ１卯七圏とは胞子のう胞子の形態と大きさで、明瞭に
異なる。−Ｍ、　ｅ−Ｉ−ｏ　ｎＪｌｉ−ａ、、ｔ４＋
　Ｉ　ａとは胞子のう柄がやや短い、厚膜胞子の形態が
楕円形または細球形でときに連鎖することがあり、さら
に厚膜胞子がときに数本の菌糸を周囲に出す、という点
で異なるが、本発明者らはこのような差異は本菌株をＭ
ｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　　ｅｌｏｇ−ａｔａと別種であ
るとするには十分でないと判断した。そこで、本発明者
らは本菌株をＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ｅｌ卯ｐ−ｔａ
　ＳＡＭ　０２１９と同定した。ＳＡＭ　０２１９株は
昭和６１年３月１９日に通商産業省工業技術院微生物ｆ
業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−８７
０３とし′ζ寄託されている。

本発明に使用される菌株を培養する為には、その菌株の
胞子、菌糸又は予め培養して得られた前培養液を、液体
培地又番、を固体培地に接種し培養する。液体培地の場
合に、炭素源上してはグルコース、フラクトース、＋シ
ロース、勺ツカロース、マルトース、可溶性デンプン、
ｔＪ、’ｉ蜜、グリセロール、マンニトール智の−・般
的に使用されているものがいずれも使用できるが、これ
らに限られるものではない。窒素源としてはペプトン、
酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コー
ンステイブリカー等の天然窒素源の他に、尿素等の有機
窒素源、ならびに硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、
硫酸アンモニウム等の無機窒素源を用いることができる
。この他必要に応しリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸
鉄、硫酸銅等の無機塩及びビタミン等も微量栄養源とし
て使用できる。これらの培地成分は微生物の生育を害し
ない濃度であれば特に制限はない。実用上一般に、炭素
源は０．１〜３０重量％、好ましくは１〜１０重量％、
窒素源は０．０１〜５重量％、好ましくは０．１〜２重
景％の濃度とし、さらに炭化水素、脂肪酸、脂肪酸塩ま
たは油脂を添加しても良い。又、培養温度は５〜４０℃
、好ましくは培養開始から１０〜２０℃とするか、又は
２０〜３０℃にて培養して菌体を増殖せしめた後１０〜
２０℃にて培養を続けてＥＰＡを生産せしめる。このよ
うな温度管理により、生成脂肪酸中のＥＰＡの比率を上
昇せしめることができる。培地のｐＨは４〜１０、好ま
しくは６〜９としく１０）て、通気攪拌培養、振盪培養、又は静置培養を行なう。

培養は通常２〜１０日間行う。

固体培地で培養する場合は、固形物重量に対して５０〜
１００重量％の水を加えたふすま、もみがら、米ぬか等
を用い、５〜４０℃、りｆましくは前記の温度において
、３〜１４日間培養を行う。この場合に必要に応じて培
地中に窒素源、無機塩類、微量栄養源および、添加物と
して、炭化水素、脂肪酸、脂肪酸塩、またば油脂を加え
ることができる。

このように培養し′ζ、菌体内に、ＥＰＡを含有する脂
質が生成蓄積される。液体培地を使用した場合には、培
養菌体から、次のようにしてＥＰＡの採取を行なう。

培養終了後、培養液、Ｉ、り遠心分間１及び濾過等の常
用の固液分離手段により培養菌体を得る。菌体は十分水
洗し、好ましくは乾燥する。乾燥は凍結乾燥、風乾等に
よって行うことができる。乾燥菌体は、好ましくは窒素
気流下で有機溶媒によって抽出処理する。有機溶媒とし
てはエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、ク
ロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル等を用いる
ことができ、またメタノールと石油エーテルの交互抽出
や、クロロホルム−メタノール−水の一層系の溶媒を用
いた抽出によっても良好な結果を得ることができる。抽
出物から減圧下で有機溶媒を留去することにより、高濃
度のＥＰＡを含有した脂質が得られる。

また、上記の方法に代えて湿菌体を用いて抽出を行うこ
とができる。この場合にはメタノール、エタノール等の
水に対して相溶性の溶媒、又はこれらと水及び／又は他
の溶媒とから成る水に対して相溶性の混合溶媒を使用す
る。その他の手順は上記と同様である。

上記のようにして得られた脂質中には、ＥＰＡが脂質化
合物、例えば脂肪の構成成分として含まれている。これ
らを、直接分離することもできるが、低級アルコールと
のエステル、例えばエイコサペンタエン酸メチルとして
分離するのが好ましい。このようなエステルにすること
により、他の脂質成分から容易に分離することができ、
また、培養中に生成する他の脂肪酸、例えばバルミチン
酸、オレイン酸、リノール酸等（これらも、ＥＰＡのエ
ステル化に際してエステル化される）から容易に分離す
ることができる。例えば、ＥＰＡのメチルエステルを得
るには、前記の抽出脂質を無水メタノール−塩酸５％〜
ｌＯ％、ＢＦ３−メタノール１０％〜５０％等により、
室温にて１〜２４時間処理するのが好ましい。

前記の処理液からエイコサペンタエン酸メチルエステル
を回収するにはヘキサン、エーテル、酢酸エチル等の有
ａ溶剤で抽出するのが好ましい。

次に、この抽出液を無水酢酸すトリウム等により乾燥し
、有機溶媒をグ「ましくは減圧下で留去することにより
主として脂肪酸エステルから成る混合物が得られる。こ
の混合物中には、目的とするエイコサペンタエン酸メチ
ルエステルの他に、パルミチン酸メチルエステル、ステ
アリン酸メチルエステル、オレイン酸メチルエステル等
が含まれている。これらの脂肪酸メチルエステル混合物
からエイコサペンタエン酸メチルエステルを単離するに
は、カラムクロマトグラフィー、低温結晶化法、尿素包
接体法等を、単独で、又は組み合わせて使用することが
できる。

こうして単離されたエイコサペンタエン酸メチルからＥ
ＰＡを得るには、アルカリで加水分解した後、エーテル
、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出すればよい。

また、ＥＰＡをそのメチルエステルを経ないで採取する
には、前記の抽出脂質をアルカリ分解（例えば５％水酸
化ナトリウムにより室温にて２〜３時間）した後、この
分解液から、脂肪酸の抽出・精製に常用されている方法
により抽出・精製することができる。

次に、実施例により、この発明をさらに具体的に説明す
る。

実衡開土グルコース５％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３
％及び麦芽エキス０．３％を含む培地（ｐＨ６，０）５
０ｍ７！を５００ｍｊ！容坂ロフラスコに入れ、１２０
℃で２０分間殺菌した。モルティエレラ・エロンガタＳ
ＡＭ　０２１９（ＦＢＩ団１’　１ｔ７（１３）　　ｌ
白金耳を接種し、レシフ゛ロシェーカー（Ｉ　ＩＯｒｐ
ｍ）により１２℃で７日間振盪培養した。培養後、濾過
にて菌体を回収し、十分水洗した後、凍結乾燥した。こ
れにより、０．７ｇの乾燥菌体をｉｉ１人二０この菌体
より、クロロホルム−メタノール　水の一層系の溶媒ヲ
用いるＢｌｉｇｈ　＆　Ｄｙｅｒの抽出法に３Ｌっ゛Ｃ
聡脂質を抽出したところ、１５０■の脂ｒｔが得られた
。この脂質を無水メタノール−塩酸（！１５：５）を用
いて、２０℃にて３時間処理するこ吉によっ゛（メチル
エステル化し、エーテルで抽出して９５■の脂肪酸メチ
ルを得た。この脂肪酸メチルのｋ１１成はガスクロマト
グラフィーによる分４Ｊ１で、パルミチン酸メチル１２
％、ステアリン酸メチル１２％、オレイン酸メチル２４
％、リノール酸メチル５％、γ−リルン酸メチル８％、
ビスホモγ−リルン酸メチル５％、アラキドン酸メチル
ｌＯ％、エイコサペンタエン酸メチル１３％、その他１
１％であることが認められた。この混合物脂肪酸メチル
をカラムクロマトグラフィーによって分離し、エイコサ
ペンタエン酸メチル画分を分取し、ロータリーエバポレ
ーターによって溶媒を留去した“結果、６．５■の精製
されたエイコサペンタエン酸メチルを得た。本標品と市
販のエイコサペンタエン酸メチル標準サンプルについて
、ガスクロマトグラフィー分析、高速液体クロマトグラ
フィー分析、質量分析、及びＮＭＲ分析によって比較を
行なったところ、両者はいずれの分析においても一致し
た。精製前及び精製後のエイコサペンタエン酸メチル量
は培地当り、それぞれ０．２５ｍ１ｒ／ｍβ及び０．１
３■／ｍＩ！、乾燥菌体当りそれぞれ１８ｍｇ／ｇ及び
９■／ｇであった。

実施例Ｉ実施例１と同じ組成の培地５１を１５Ｉｌジャーファー
メンタ−に仕込み、１２０℃で４０分間殺菌後、モルテ
ィエレラ・エロンガタＳＡＭ　Ｏ２１９（ＦＥＲＭＰ−
８７０３’）の前培養液２００　ｍ　１２を接種した。

１８℃、通気量０．５ν、ｖ、ｍで５日間通気攪拌培養
を行ない、得られた湿菌体１５０ｇ　（乾燥重量５０ｇ
）について、実施例１と同様に抽出、加水分解、及びメ
チルエステル化を行なったところ、総脂質１３ｇ、及び
混合脂肪酸メチル８ｇを得た。このものの組成はパルミ
チン酸メチル１３％、ステアリン酸メチル１４％、オレ
イン酸メチル２８％、リノール酸メチル８％、Ｔ−リノ
ール酸メチル８％、ビスホモＴ−リルン酸メチル３％、
アラキドン酸メチル１３％、エイコサペンタエン酸メチ
ル６％、その他７％であることが認められた。エイコサ
ペンタエン酸メチルの生成量は培地当り、０．１０ｇ／
ｉ、乾燥菌体当り９，６■／ｇであった。

又、培養終了後、濾過によって得られた培養濾液４，２
７０ｍｆｆを乾燥後、実施例１と同様に抽出、加水分解
、メチルエステル化を行なったところ、７％のエイコサ
ペンタエン酸メチルを含む混合脂肪酸メチル８２■をｌ
ｉた。

災隻桝↓ モルティエレラ・エキシクア（Ｍｏｒｔ−ｊｅｒｅｌ　
Ｉａ■ハ川、用ＩＦＯ８５７１）、及びモルティエレラ
・ヒグロフイラ（Ｍμ」国ｒ−ｅ−１ｊｑ　　ｈｙ−Ｂ
−ｒｏｌ、ｌ４ｊｊｑ、ＩＦＯ５９４１）について実施
例１と同様な操作を行なったところ、そ（Ｉ７）れぞれ４７■及び７２■の脂肪酸メチルが得られた。

これらの脂肪酸メチル中に含まれるエイコサペンタエン
酸メチルを単離・精製したところ、それぞれ４．８　ｗ
ｘ、及び７．４■が得られた。

実覇［４− グルコース２％、酵母エキス１％、Ｔｗｅｅｎ　２００
．２％及び、種々の炭化水素、脂肪酸ナトリウム又は油
脂０．５％を含む培地（ｐＨ６，０）　２０　ｍｊ＋を
１００ｍ１容マイヤーに入れ、１２０℃で２０分間殺菌
した。モルティエレラ・エロンガタＳＡＭ　０２１９（
ＦＥＲＭ　Ｐ−８７０３）　　１白金耳を接種し、ロー
タリーシェーカー（２０Ｏｒｐｍ）により２８℃で５８
．間培養した。

得られた菌体について実施例１と同様に抽出、加水分解
、及びメチルエステル化を行なった。培地に添加した種
々の炭化水素、脂肪酸ナトリウム、及び油脂のそれぞれ
について、得られた乾燥菌体重量、総脂質量、総脂肪酸
メチル量、エイコサペンタエン酸メチル含量、及び培地
当りのエイコサペンタエン酸メチル生成量は下表のよう
になった。

標準培地にアマニ油又はリノール酸ナトリウムを添加し
た場合、エイコサペンタエン酸の生成量は培地１ｍｌ１
当り、（１，４４ｍＲ，１０，３２■ときわめて高い濃
度となった。その他、炭化水素、脂肪酸、脂肪酸塩また
は油脂を添加した場合も著量のエイコサペンタエン酸を
生成したが、無添加の場合はほとんど生成がみられなか
った。

実隻拠工実施例と同じ組成の培地２０ｍＡ’を１００ｍ／容マイ
ヤーに入れ、１２０℃で２０分間殺菌した。モルティエ
レラ・エロンガタＳＡＭ　０２１９（ＦＥＲＭ　Ｐ−８
７０３）ｌ白金耳を接種し、ロータリーシェーカー（２
０Ｏｒｐｍ）により、２８℃で５日間培養後、培養温度
を１２℃に変え、同様にして３日間培養した。得られた
菌体について実施例１と同様に抽出、加水分解、メチル
エステル化を行なったところ、エイコサペンタエン酸メ
チルを９％含む、混合脂肪酸メチル７５■を得た。

受託番号変更届昭和６２年１月−８日％府庁長官　黒　１）明　雄　殿１、事件の表示昭和６１年特許願第１５８６５１号２、発明の名称エイコサペンタエン酸の製造方法３、手続をした者事件との関係　特許出願人名称　（１９０）　　サントリー株式会社４、代理人住所　〒１０５東京都港区虎ノ門二丁目８番１０号５、
旧寄託機関の名称工業技術院微生物工業技術研死所７、　新寄託機関の名称工業技術院微生物工業技術研凭所８、新受託番号微工研条寄第１２３９号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１２３９）９、添付書類の目録新寄託番号を証明する資面　　　１通手続補正書（自発）昭和６２年１月パ日特許庁長官　黒　１）明　雄　殿１、事件の表示昭和６１年特許願第１５８６５１号２、発明の名称エイコサペンタエン酸の製造方法３、補正をする者事件との関係　特許出願人名称　（１９０）サントリー株式会社４、代理人住　所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号（
外４名）５、補正の対象（１）明細書の「特許請求の範囲」の欄（２）明細書の
「発明の詳細な説明」の欄（３）受託証の写し６、補正の内容（１）特許請求の範囲を別紙の通シに補正する。

（２）■　明細書第４Ｊｌｊ第１行目、及び第２行目か
ら３行目のｒ８７０３号）」の次に「（微工研条寄第１
２３９号）」を加入する。

■　同第９頁第１２行目「寄託されている。」をｒ寄託
され、微工研条寄第１２３９号（ＦＥＲＭＢＰ−１２３
９）として国際寄託に移・ａされた。」に補正する。

■　同第１５員第１行目、第１６頁第１６行目から第１
７行目、第１８Ｊｉ［１２２行目及び第２０頁第６行目
ｒ　（ＦＩＲＭ　Ｐ−８７０３）Ｊの次にｒ　（ＦＥＲ
Ｍ　ＢＰ−１２３９）　Ｊを加入する。

■　同第１９員第１８行目ｒｌｏ、３２ダ」をｒＯ，３
２ＷｖＪに補正する。

■　同第２０貞第１３行目の後に次の記載を加入する。

「実施例６グルコース２俤、酵母エキス１係を含む培地（ＰＨ６，
０）２０１１／を１００−容マイヤーに入れ、１２０℃
で２０分間殺菌した。モルティエレラ・エロンガタＳＡ
Ｍ　０２１９（ＦＩＲＭ　Ｐ−８７０埠（ＦＥＲＭ　Ｂ
Ｐ−１２３９）１白金耳を接種し、ロータリーシェーカ
ー（２００ｒｐｍ　）によシ２８℃で４日間培養後、種
々の脂肪酸ナトリウム又は油脂１００＃を１２０℃で１
５分間殺菌後、添加し、さらに同様にして２日間培養し
た。得られた菌体について、実施例１と同様に抽出、加
水分解、及びメチルエステル化を行なった。培地に添加
した種々の脂肪酸ナトリウム、及び油脂それぞれについ
て、得られた乾燥菌体当シ、及び培地当シのエイコサペ
ンタエン酸メチル生成量は下表のようになった。

上記のごとく、培養坤中（培養４日後）に脂肪酸、油脂
類などを添加することにょシ、対照無添加区で認められ
なかったエイコサペンタエン酸が、培地１ｄ当り０．０
０６Ｍｆｌ　〜０．２５．９生成した。」（３）受託証
の写しを遺児する。

７、添付書類の目録（１）補正特許請求の範囲　　　　　１通（２）受託証
の写し　　　　　　　　１通２、　４ＩｌＦ−許請求の
範囲１・　モルティエレラ（Ｍｏｒｔ１ｉｅｒ＠ｌ１ｍ）属
に属し、エイコサインクエン酸生産能を有する微生物を
培養してエイコサペンタエン酸、又はエイコサインタエ
ン酸全含有する脂質を生成せしめ、そしてエイコサペン
タエン酸を採取することを特徴とするエイコサペンタエ
ン酸の製造方法。

２、培養開始時より、または最適生育温度で培養した後
に最適生育温度以下の温度で培養することを特徴とする
特許請求の範囲第１項記載の方法。

３、培地へ炭化水素、脂肪酸、脂肪酸塩、または油脂を
添加することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
方法。

４、培養中の培養液へ、脂肪酸、脂肪酸塩または油脂を
添加することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
方法。

手続補正書（自発）昭和６２年６り／？日特許庁長官　黒　１）明　雄　殿１、事件の表示昭和６１年特許願第１５８６５１号２、発明の名称エイコサペンタエン酸及びこれを含有する脂質の製造方
法（新名称）３、補正をする者事件との関係　　　特許出願人名称　（１９０）サントリー株式会社４、代理人住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号６、
補正の対象ｉｌｌ　　明細書の「発明の名称」の欄（２）　　明Ｓ
書の［特、ＩＴ請求の範囲］の欄（３）明細書の「発明
の詳細な説明」の欄７、補正の内容に補正する。

（２、特許請求の範囲を別紙の通りに補正する。

（３）■　明細書箱１ｔ′〔第１９行１１「エイコサペ
ンタエン酸」をｒエイ：ｌサベンタエン酸及びこれを含
有する脂質１に補正する。

■　同第２頁第１７行目ｒＥＰＡＪをｒＥＰＡ及びこれ
を含有する脂質」に補正する。

■　同第３頁第５行「１［製造方法）をｒ製造方法；及
びモルティエレラ属に属しエイコサペンタエン酸生産能
を有する微生物を培養してエイコサペンタエン酸を含有
する脂質を− 妻寺典巻採取することを特徴とするエイコサペンタエン
酸を含有する脂質の製造方法ｊに補正する。

８、添付書類の目録特許請求の範囲　　　　　　　　　　１通２、特許請求
の範囲 ■、　モルティエト・う（ＨｏｒＬｉｅｒｅｌｌａ）属
に属し、エイコサペンタエン酸生産能を有する微生物を
培養してエイコサペンタエン酸、又はエイコサペンタエ
ン酸を含有する脂質を生成せしめ、そしてエイコサペン
タエン酸を採取することを特徴とするエイコサペンタエ
ン酸の製造方法。

５、　モルティエトラ（ＭｏｒＬｉｔ！ｒｅｌ　Ｉａ）
属に属し、ニオコサペンタエン酸生産能を有する微生物
を培養してエイコサペンタエン酸を含有する脂質を朱−
１−４取することを特徴とするエイコサペンタエン酸を含有する脂質の製造方法。

６、培養開始時より、または最適生育温度で培養した後
に最適生育温度以下の温度で培養することを特徴とする
特許請求の範囲第５項記載の方法。

７、培地へ炭化水素、脂肪酸、脂肪酸塩、または油脂を
添加することを特徴とする特許請求の範囲第５項記載の
方法。

８、培養中の培養液へ、脂肪酸、脂肪酸塩または油脂を
添加することを特徴とする特許請求の範囲第５項記載の
方法。

Claims

【特許請求の範囲】１、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属に属
し、エイコサペンタエン酸生産能を有する微生物を培養
してエイコサペンタエン酸、又はエイコサペンタエン酸
を含有する脂質を生成せしめ、そしてエイコサペンタエ
ン酸を採取することを特徴とするエイコサペンタエン酸
の製造方法。２、培養開始時より、または最適生育温度で培養した後
に最適生育温度以下の温度で培養することを特徴とする
特許請求の範囲第１項記載の方法。３、培地へ炭化水素、脂肪酸、脂肪酸塩、または油脂を
添加することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
方法。