JP2000014392A

JP2000014392A - 高度不飽和脂肪酸含有グリセリドの製造方法

Info

Publication number: JP2000014392A
Application number: JP10191723A
Authority: JP
Inventors: Hideyuki Aoki; 秀之青木; Katsuyuki Nishioka; 功志西岡; Mitsumasa Manso; 三正万倉; Kenshiro Fujimoto; 健四郎藤本
Original assignee: Ikeda Shokken KK
Current assignee: Ikeda Shokken KK
Priority date: 1998-07-07
Filing date: 1998-07-07
Publication date: 2000-01-18

Abstract

(57)【要約】【課題】高度不飽和脂肪酸を高純度に含有するグリセ
リドを低コストに、かつ効率よく製造することのできる
高度不飽和脂肪酸含有グリセリドの製造方法を提供す
る。【解決手段】糸状菌を高度不飽和脂肪酸類を含む油脂
混合物を添加した培地中で培養し、高度不飽和脂肪酸を
糸状菌体内にグリセリドの形態で高純度に蓄積させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は糸状菌を利用した高
度不飽和脂肪酸含有グリセリドの製造方法に関し、詳し
くは糸状菌Ｍｕｃｏｒｈｉｅｍａｌｉｓ（ムコール
ヒエマリス）をエイコサペンタエン酸（以下、ＥＰＡと
略記）又はドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡと略記）
等の高度不飽和脂肪酸を含む油脂混合物を添加した培地
中で培養し、高度不飽和脂肪酸を糸状菌体内にグリセリ
ドの形態で高純度に蓄積せしめることにより高度不飽和
脂肪酸を高純度に含有したグリセリドを製造する高度不
飽和脂肪酸含有グリセリドの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＥＰＡ、ＤＨＡ等の高度不飽和脂肪酸は
魚油、藻類，微生物等に含まれ、血液凝固防止作用、抗
高脂血症作用等の種々の生理活性が知られており、食
品、医薬品、化粧品、飼料等の素材として利用されてい
る。

【０００３】ここで、一般にＥＰＡ、ＤＨＡがヒトの血
奬中に吸収される割合は、エチルエステル型で摂取した
場合よりもトリグリセリド型で摂取した方が約３〜４倍
も高いことが報告され（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５２，３２８，（１９
８８））、ＥＰＡやＤＨＡはトリグセリド型で摂取する
ことが望ましいと考えられている。

【０００４】また、肥満防止、高脂血症改善などの多く
の生理活性を有しているリン脂質においても、例えばそ
のアシル基にＥＰＡを多く有することにより、ＥＰＡの
作用として知られている機能（血奬脂質低下作用等）に
加え、脂肪組織重量の低下という機能が認められている
（油科学，第４０巻，第１０号）などの状況から、高度
不飽和脂肪酸を高純度に含有するトリグリセリド、リン
脂質の供給が望まれている。

【０００５】ところで、従来の高度不飽和脂肪酸を高純
度に含有するグリセリドの製造方法としては、以下の方
法が検討、開発されている。

【０００６】まず、トリグリセリドの融点差を利用し、
高度不飽和脂肪酸含量の高いトリグリセリドを調製する
方法である有機溶剤・低温溶剤分別による濃縮法、ある
いは有機溶剤を使用せず低温分別により調製する方法
（鹿山光編：「総合脂質科学」、恒皇社厚生閣出版
（１９８９）等）が知られている。

【０００７】しかしながら、これらの方法では、例えば
イワシ油トリグリセリド中のＥＰＡ含有量は３０％前後
までしか濃縮されず高純度化が困難であったり、有機溶
媒の除去が容易でない等の問題点を有していた。

【０００８】また、酵素であるリパーゼを使用した高度
不飽和脂肪酸含有トリグリセリド、リン脂質の合成方法
（油化学，第３０巻，第７号，１７，１９９０、油化
学，第４１巻，第１号，３９、１９９２、油化学，第４
１巻，第７号，３５，１９９２、鹿山光：「ＡＡ，Ｅ
ＰＡ，ＤＨＡ−高度不飽和脂肪酸」、恒星社厚生閣出版
（１９９５）等）が開発されているが、酵素の価格、設
備費等がコスト高になるという問題点を有していた。

【０００９】また、ＥＰＡ、ＤＨＡなど高度不飽和脂肪
酸を生合成する糸状菌、海洋細菌等を用いた発酵生産に
よる高度不飽和脂肪酸含有トリグリセリド、リン脂質の
製造方法（特開昭６３−１４６９７号公報、特開昭６３
−４４８９１号公報、特開昭６３−２１６４８８号公
報、特開平２−１６９８９号公報、特開平２−２３８７
７号公報）が開発されているが、ＥＰＡ、ＤＨＡ等の高
度不飽和脂肪酸含有量が少ない等の問題点を有してい
た。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記のごと
き従来の問題点に鑑みてなされたもので、その目的とす
るところは、高度不飽和脂肪酸を高純度に含有するグリ
セリドを低コスト、かつ効率よく製造することのできる
高度不飽和脂肪酸含有グリセリドの製造方法を提供する
ことにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、請求項１の発明は、高度不飽和脂肪酸含有グリセリ
ドの製造方法において、糸状菌を高度不飽和脂肪酸類を
含む油脂混合物を添加した培地中で培養することによ
り、高度不飽和脂肪酸を糸状菌体内にグリセリドの形態
で高純度に蓄積せしめることを特徴とする。

【００１２】また、請求項２の発明は、請求項１の発明
において、上記高度不飽和脂肪酸類を含む油脂混合物
が、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、オクタデカテト
ラエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エ
イコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキ
サエン酸等の高度不飽和脂肪酸群から選ばれる少なくと
も１種またはそれ以上を５重量％以上含有する混合物で
あることを特徴とする。

【００１３】また、請求項３の発明は、請求項１の発明
において、上記高度不飽和脂肪酸類を含む油脂混合物
が、遊離脂肪酸又はそれらのグリセリド、脂肪酸塩又は
その低級アルコールエステルからなる群から選ばれる少
なくとも１種またはそれ以上の組み合わせであることを
特徴とする。

【００１４】また、請求項４の発明は、請求項１の発明
において、上記糸状菌がＭｕｃｏｒｈｉｅｍａｌｉｓ
であることを特徴とする。

【００１５】また、請求項５の発明は、請求項１の発明
において、上記糸状菌に蓄積されるグリセリド中の高度
不飽和脂肪酸含有量がトリグリセリド中で５０重量％以
上、又はリン脂質中で２０重量％以上であることを特徴
とする。

【００１６】ここで、上記糸状菌Ｍｕｃｏｒｈｉｅｍ
ａｌｉｓは以下の特徴を有するものである。

【００１７】本発明に用いる糸状菌Ｍｕｃｏｒｈｉｅ
ｍａｌｉｓは、上述のように高度不飽和脂肪酸を糸状菌
体内にグリセリドの形態で高純度に蓄積せしめる能力を
有する糸状菌Ｍｕｃｏｒｈｉｅｍａｌｉｓであれば全
て使用することができる。例えば、Ｍｕｃｏｒｈｉｅ
ｍａｌｉｓＩＦＯ９２６２、９４１０、９４１１な
どを挙げることができる。更には、本糸状菌から誘導さ
れる変異株であって、上記のように高度不飽和脂肪酸を
糸状菌体内にグリセリドの形態で高純度に蓄積せしめる
能力を有する糸状菌も等しく使用することができる。ま
た、本発明者らが土壌から分離した菌株Ｍｕｃｏｒｈ
ｉｅｍａｌｉｓＨＡ−３０を使用することができる。

【００１８】なお、上記菌株Ｍｕｃｏｒｈｉｅｍａｌ
ｉｓＨＡ−３０は、工業技術院生命工学工業技術研究
所に、平成１０年６月２４日に受託番号「ＦＥＲＭＰ
１６８５８」で寄託した。

【００１９】本発明者らが、土壌から分離した菌株Ｍｕ
ｃｏｒｈｉｅｍａｌｉｓＨＡ−３０の菌学的性質を
以下に記載する。

【００２０】１．各培地における生育状態各培地において、培養条件２５℃、暗黒下、５〜６日間
培養で観察を行った。

【００２１】（ａ）イースト・モルト寒天培地菌の生育は比較的良好、菌のコロニーの背面は、穏やか
な橙色を呈する。氣菌糸から白色の胞子のう柄が観察さ
れるが、その発達は不良、また、胞子のう胞子の形成も
不良である。

【００２２】（ｂ）ポテト・スクロース寒天培地菌の生育は良好、菌のコロニーの背面は、穏やかな橙色
を呈する。氣菌糸から逆立った毛状の淡黄褐色の胞子の
う柄が観察され、その発達は良好である。また、胞子の
う胞子の形成も良好である。

【００２３】２．顕微鏡観察Ｂｅｅｒｗｏｒｔ寒天培地において、培養条件２０℃、
３〜４日間培養を行った菌株について顕微鏡にて、胞子
のう柄、胞子のう、胞子のう胞子などの観察を行った。

【００２４】コロニーは、淡黄褐色で高さは２０ｎｍに
至り、胞子のう柄間には明確な菌糸が確認された。ま
た、コロニーの背面は、穏やかな橙色を呈していた。菌
糸の幅は３０μｍ程度であり、隔壁は認められなかっ
た。胞子のう柄の幅は１４μｍ程度、胞子のうの直径は
６０μｍに至り、内部に多数の胞子のう胞子を含んでい
た。球状の柱軸が認められ、その大きさは、４５×４７
μｍに至っていた。胞子のう胞子は、ほぼ紡錘状で、
（３．３〜９．５）×（１．４〜４．０）μｍの大きさ
であった。

【００２５】上述の各培地における生育状態ならびに顕
微鏡観察の結果は、Ｍｕｃｏｒ属が有する特徴的な性質
を示していることから、本菌株はＭｕｃｏｒ属に属する
と考えられた。

【００２６】そこで、更に本菌株をＳｃｈｉｐｐｅｒ，
Ｍ．Ａ．Ａ：ＳｔｕｄｉｅｓｉｎＭｙｃｏｌｏｇｙ，
Ｎｏ．４，１０，１２，１７，ＣＢＳ，Ｂａａｒｎ，１
９７３，１９７５，１９７６，１９７８に準じて既知の
Ｍｕｃｏｒ属と菌学的諸性質を比較すると、Ｍｕｃｏｒ
ｈｉｅｍａｌｉｓに非常に類似していた。このことか
ら、本菌株をＭｕｃｏｒｈｉｅｍａｌｉｓと同定し
た。

【００２７】本発明に用いる糸状菌Ｍｕｃｏｒｈｉｅ
ｍａｌｉｓを培養するための培地は、当該糸状菌が良く
生育して目的とするグリセリドを生成しうるものが望ま
しい。

【００２８】培地の炭素源としては、例えばグルコー
ス、マルトース、可溶性デンプン、サッカロース、スク
ロース等が挙げられ、これら炭素源の添加量としては培
地の０．１〜１０．０重量％、好ましくは１．０〜５．
０重量％であることが望ましい。

【００２９】また、上述した培地の窒素源としては、ペ
プトン、酵母エキス、コーンスティブリカー、大豆蛋
白、ミルクカゼイン等の天然窒素源が好ましいが、尿素
等の有機窒素源、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、
硫酸アンモニウムなどの無機窒素源を用いることもでき
る。

【００３０】窒素源の添加量は、培地の０．０５〜５．
０重量％、好ましくは０．１〜１．０重量％とすること
が望ましい。

【００３１】この他、必要に応じてリン酸塩、硫酸マグ
ネシウム等の無機塩類及びビタミン等の微量元素を、当
該糸状菌の生育を阻害しない程度に添加することができ
る。

【００３２】また、培地に添加する高度不飽和脂肪酸類
を含む油脂混合物は、α−リノレン酸、γ−リノレン
酸、オクタデカテトラエン酸、ジホモ−γ−リノレン
酸、アラキドン酸、ＥＰＡ、ドコサペンタエン酸、ＤＨ
Ａ等の脂肪酸群から選ばれる少なくとも１種またはそれ
以上を５重量％以上含有する油脂混合物の組合せからな
ることが好ましく、天然物及び合成物のいずれも使用で
きる。

【００３３】また、当該油脂混合物は、遊離脂肪酸又は
それらのグリセリド、脂肪酸塩又はその低級アルコール
エステルからなる群から選ばれる少なくとも１種または
それ以上の組み合わせで使用することができる。

【００３４】なお、油脂混合物のグリセリドは、トリグ
リセリド、モノグリセリド、リン脂質等、脂肪酸塩は、
ナトリウム塩、カルシウム塩等、また低級アルコールエ
ステルは、メチルエステル、エチルエステル等であるこ
とが望ましい。

【００３５】また、当該油脂混合物を培地中に添加する
時期は、糸状菌Ｍｕｃｏｒｈｉｅｍａｌｉｓの培養途
中であっても良いが、より好ましくは培養開始前が望ま
しい。

【００３６】また、当該油脂混合物の添加量としては、
培地の０．１〜５．０重量％、より好ましくは０．３〜
１．０重量％とすることが望ましい。

【００３７】また、培養条件としては、通常上記培地成
分の液体培地で振とう培養や通気撹拌培養等により行わ
れ、培養温度は２０〜３０℃とすることが望ましい。ま
た、培地の初発のｐＨは５．０〜７．０、培養時間は２
〜７日が適当である。

【００３８】上述の条件下で糸状菌Ｍｕｃｏｒｈｉｅ
ｍａｌｉｓの培養を行うことにより、高度不飽和脂肪酸
を高純度に含有するグリセリドを菌体内に蓄積せしめ、
培養液から瀘過法、遠心分離法等の常法により目的の高
度不飽和脂肪酸を高純度に含有するグリセリドを含む菌
体を得ることができる。

【００３９】当該菌体はエタノール、水で十分洗浄した
後、例えば凍結乾燥、風乾などの方法により菌体の乾燥
処理を行うことができる。当該乾燥菌体はそのままの形
態でも利用が可能であるが、さらには必要に応じて以下
の方法にて菌体内から高度不飽和脂肪酸を高純度に含有
するグリセリドの抽出を行うことができる。

【００４０】例えば、当該乾燥菌体をクロロホルム／メ
タノール／水混合液等の抽出溶媒に浸漬した状態で超音
波破砕を行い、高度不飽和脂肪酸を含有するグリセリド
を抽出する。更にシリカゲルカラムクロマトグラフィ
ー、フロリジルカラムクロマトグラフィー等を単独又は
組み合わせることにより、グリセリド類を分画すること
ができる。

【００４１】なお、本発明の目的は、糸状菌Ｍｕｃｏｒ
ｈｉｅｍａｌｉｓを高度不飽和脂肪酸を添加した培地
中で培養し、高度不飽和脂肪酸を糸状菌体内にグリセリ
ドの形態で蓄積せしめることにより高純度の高度不飽和
脂肪酸含有油脂を得る製造方法を提供することにあり、
抽出方法、利用方法を限定するものではない。

【００４２】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を具体
的な実施例に基づいて説明する。

【００４３】＜実施例１＞可溶性デンプン３％、ペプト
ン０．５％、酵母エキス０．３％を含む培地（ｐＨ６．
０）３ｍｌを１２１℃で２０分間加熱滅菌した後、遊離
型ＥＰＡ（純度９５．４重量％）０．５％を別途添加し
培地を調製した。本ＥＰＡ含有培地ならびにＥＰＡを添
加しない前述の培地各々にＭｕｃｏｒｈｉｅｍａｌｉ
ｓＨＡ−３０を接種し、２５℃で２日間培養を行っ
た。培養終了後、瀘過で菌体を分離した。分離した菌体
をエタノール、水で十分洗浄し、凍結乾燥により乾燥を
行った。続いて乾燥菌体を超音波破砕後、クロロホルム
／メタノール／水系の溶媒を用いるＢｌｉｇｈ−Ｄｙｅ
ｒ法により脂質を抽出した。抽出した脂質について、Ｔ
ＬＣ／ＦＩＤ法にてトリグリセリド含量を調べた。続い
てフロリジルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：エ
ーテル＝４：１溶出）によりトリグリセリドを回収し
た。得られたトリグリセリドについて塩酸−メタノール
法によりメチルエステル化し、ガスクロマトグラフィー
法により、トリグリセリド中のＥＰＡ純度（重量％）を
求めた。その結果、表１に示す通りＭｕｃｏｒｈｉｅ
ｍａｌｉｓＨＡ−３０の培養時に遊離型ＥＰＡを添加す
ることにより、ＥＰＡ純度７７．５重量％のトリグリセ
リドを培地１ｍｌ当たり１．８ｍｇ得た。

【００４４】

【表１】

【００４５】＜実施例２＞可溶性デンプン３％、ペプト
ン０．５％、酵母エキス０．３％を含む培地（ｐＨ６．
０）３ｍｌを１２１℃で２０分間加熱滅菌した後、ＥＰ
Ａエチルエステル（純度９５．４重量％）０．５％を別
途添加し培地を調製した。本ＥＰＡ含有培地ならびにＥ
ＰＡを添加しない前述の培地各々にＭｕｃｏｒｈｉｅ
ｍａｌｉｓＨＡ−３０を接種し、２５℃で２日間培養を
行った。培養終了後、瀘過で菌体を分離した。分離した
菌体をエタノール、水で十分洗浄し、凍結乾燥により乾
燥を行った。実施例１の方法に従い、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙ
ｅｒ法により脂質を抽出し、ＴＬＣ／ＦＩＤ法にてトリ
グリセリド含量を調べた。続いてフロリジルカラムクロ
マトグラフィーにより得られたトリグリセリドについて
塩酸−メタノール法によりメチルエステル化し、ガスク
ロマトグラフィー法により、トリグリセリド中のＥＰＡ
純度（重量％）を求めた。その結果、表２に示す通りＭ
ｕｃｏｒｈｉｅｍａｌｉｓＨＡ−３０の培養時に遊
離型ＥＰＡを添加することにより、ＥＰＡ純度５０．１
重量％のトリグリセリドを培地１ｍｌ当たり０．６ｍｇ
得た。

【００４６】

【表２】

【００４７】＜実施例３＞可溶性デンプン３％、ペプト
ン０．５％、酵母エキス０．３％を含む培地（ｐＨ６．
０）３ｍｌを１２１℃で２０分間加熱滅菌した後、遊離
型の高度不飽和脂肪酸後の各種（表３に記載）０．５％
を添加、ＭｕｃｏｒｈｉｅｍａｌｉｓＨＡ−３０を接
種し、２５℃で２日間培養を行った。培養終了後、瀘過
で菌体を分離した。分離した菌体をエタノール、水で十
分洗浄し、凍結乾燥により乾燥を行った。実施例１の方
法に従い、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法により脂質を抽出
し、ＴＬＣ／ＦＩＤ法にてトリグリセリド含量を調べ
た。続いてフロリジルカラムクロマトグラフィーにより
得られたトリグリセリドについて塩酸−メタノール法に
よりメチルエステル化し、ガスクロマトグラフィー法に
より、トリグリセリド中の各種脂肪酸の純度（重量％）
を求めた。その結果、表３に示す通り各種脂肪酸を高純
度に含むトリグリセリドを得た。

【００４８】

【表３】

【００４９】＜実施例４＞可溶性デンプン３％、ペプト
ン０．５％、酵母エキス０．３％を含む培地（ｐＨ６．
０）５０ｍｌを１２１℃で２０分間加熱滅菌した後、遊
離型ＥＰＡ（純度９５．４重量％）０．５％を添加した
培地にＭｕｃｏｒｈｉｅｍａｌｉｓＨＡ−３０を接
種し、２５℃で２日間培養を行った。培養終了後、瀘過
で菌体を分離した。分離した菌体をエタノール、水で十
分洗浄し、凍結乾燥により乾燥を行い、乾燥菌体を得
た。続いて乾燥菌体を超音波破砕後、クロロホルム／メ
タノール／水系の溶媒を用いるＢｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法
により脂質を抽出した。抽出した脂質について、ＴＬＣ
／ＦＩＤ法にてリン脂質含量を調べた。続いてシリカゲ
ルカラムクロマトグラフィーによりリン脂質画分（１０
０％メタノール溶出）を分離、回収した。得られたリン
脂質について塩酸−メタノール法によりメチルエステル
化、ガスクロマトグラフィー法により、リン脂質中のＥ
ＰＡ純度（重量％）を求めた。その結果、表４に示す通
りＭｕｃｏｒｈｉｅｍａｌｉｓＨＡ−３０の培養時
に遊離型ＥＰＡを添加することによりＥＰＡ純度３８．
１重量％のリン脂質を培地１Ｌ当たり６３ｍｇ得た。

【００５０】

【表４】

【００５１】

【発明の効果】以上説明したように、本発明では、糸状
菌を高度不飽和脂肪酸類を含む油脂混合物を添加した培
地中で培養することにより、高度不飽和脂肪酸を糸状菌
体内にグリセリドの形態で高純度に蓄積せしめるように
したので、高度不飽和脂肪酸を高純度に含有するグリセ
リドを低コストに、かつ効率よく製造することができる
等の効果を奏する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:785） (72)発明者万倉三正広島県福山市箕沖町95番地７池田食研株式会社内 (72)発明者藤本健四郎宮城県仙台市泉区２丁目３番地13 Ｆターム(参考） 4B064 AD88 AD89 AD90 CA05 CC03 CD05 CD07 DA01 DA10 DA11 4B065 AA66X AC14 BA22 BB05 BB08 BB09 BB10 CA13 CA41 CA43 CA44 CA50

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】高度不飽和脂肪酸含有グリセリドの製造
方法において、糸状菌を高度不飽和脂肪酸類を含む油脂
混合物を添加した培地中で培養することにより、高度不
飽和脂肪酸を糸状菌体内にグリセリドの形態で高純度に
蓄積せしめることを特徴とする高度不飽和脂肪酸含有グ
リセリドの製造方法。
【請求項２】上記高度不飽和脂肪酸類を含む油脂混合
物が、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、オクタデカテ
トラエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、
エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘ
キサエン酸等の高度不飽和脂肪酸群から選ばれる少なく
とも１種またはそれ以上を５重量％以上含有する混合物
であることを特徴とする請求項１に記載の高度不飽和脂
肪酸含有グリセリドの製造方法。
【請求項３】上記高度不飽和脂肪酸類を含む油脂混合
物が、遊離脂肪酸又はそれらのグリセリド、脂肪酸塩又
はその低級アルコールエステルからなる群から選ばれる
少なくとも１種またはそれ以上の組み合わせであること
を特徴とする請求項１に記載の高度不飽和脂肪酸含有グ
リセリドの製造方法。
【請求項４】上記糸状菌がＭｕｃｏｒｈｉｅｍａｌ
ｉｓであることを特徴とする請求項１に記載の高度不飽
和脂肪酸含有グリセリドの製造方法。
【請求項５】上記糸状菌に蓄積されるグリセリド中の
高度不飽和脂肪酸含有量がトリグリセリド中で５０重量
％以上、又はリン脂質中で２０重量％以上であることを
特徴とする請求項１に記載の高度不飽和脂肪酸含有グリ
セリドの製造方法。