JP2002306155A

JP2002306155A - 細胞を培養するための方法および装置

Info

Publication number: JP2002306155A
Application number: JP2002089944A
Authority: JP
Inventors: Andrea Liebmann-Vinson; リエブマン−ヴィンソンアンドレア; Mary Meyer; メイヤーメアリー; Helen V Hsieh; ブイ．ヘシャーヘレン
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2001-03-27
Filing date: 2002-03-27
Publication date: 2002-10-22
Also published as: US20020155594A1; EP1245670A2; EP1245670A3

Abstract

(57)【要約】細胞および組織の増殖のための多孔質の三次元足場であ
って、オープンセルポリマーマトリックスを含む複数の
表面を有し、このオープンセルポリマーマトリックス
は、細孔およびチャネルを有し、この細孔およびチャネ
ルは、実質的に連続的なチャネルの網目構造を形成し、
この網目構造は、細胞および細胞栄養の拡散を促進し、
ここで、この足場および網目構造のこの表面は、内部細
孔表面を含み、細胞付着を促進するよう官能基化されて
いる、足場。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本願は、２００１年３月２７日に出願され
た米国仮出願番号６０／２７８，９５５の利益を主張
し、その内容は、明らかに、本明細書中に参考として援
用される。

【０００２】（発明の分野）本発明は、細胞および組織
を培養するための方法および装置に関する。より特定す
ると、本発明は、細胞の付着および増殖を導くよう処理
された表面を有する、インビトロでの三次元の組織また
は細胞の培養のための、合成多孔質細胞外マトリックス
（通常は足場ともまた呼ばれる）に関する。

【０００３】（発明の背景）通常、ヒトおよび動物のイ
ンビトロでの細胞培養は、人工的な表面上において単層
で実施される。培養容器（例えば、皿、フラスコおよび
マルチウェルプレート）は、平坦な二次元の表面を提供
し、この上で、細胞の単層が形成される。ポリスチレン
は、このような培養容器の製造のために通常使用される
材料である。ポリスチレン表面を処理してこれらに細胞
の付着を導くための酸化的プラズマ処理プロセスもま
た、公知である。このような処理は、足場依存性細胞
（これらは最初に付着し、そしてこれらがさらなる細胞
分裂を起こす前に、拡散しなければならない）の培養の
ために重要である。細胞付着を支持するための培養基材
の効果は、種々の因子（利用可能な表面積、表面の化学
組成および表面湿潤性が挙げられる）に依存する。多く
の細胞に関して、培養収率は、それらの細胞が培養容器
の表面に固定される能力に依存する。

【０００４】ヒトおよび動物の足場依存性細胞を培養す
るための多数のプロセスおよび方法が、当該分野におい
て公知である。細胞および／またはそれらの産物の最終
用途は、どの方法が使用のために最も適切であるかを決
定する。

【０００５】組織および細胞の培養のための多くの標準
的な方法は、組織および細胞に栄養を提供する培養培地
の注意深い管理および制御の必要性によって、制限され
る。栄養の供給の制御は、一度に培養され得る細胞およ
び組織の量を制限する。

【０００６】組織操作は、しばしば、細胞外マトリック
スを使用して、組織細胞の増殖を支持する。組織細胞
は、マクロ細孔質マトリックスに移植されて、宿主組織
と構造的に一体的である新たな組織を作製する。得られ
る組織は、潜在的に、患者において損失したかまたは損
傷した組織の全ての機能を置換し得る。これらの組織細
胞は、代表的に、合成マトリックス上でインビトロで培
養され、次いで引き続いて、インビボに移植され、ここ
で、合成マトリックスは、新たな組織の形成を導く。

【０００７】細胞外合成マトリックスは、細胞の制御さ
れた送達または局在化を容易にするため、および組織形
成のための三次元空間を維持するために、必要とされ
る。これらのマトリックスはまた、機能組織を得るため
の遺伝子発現および組織発生を導くためにも使用され
る。天然に存在するマトリックスは、しばしば、高度に
組織化された構造を形成し得、かつ強度および安定性を
天然の組織に与え得る、線維性タンパク（例えば、コラ
ーゲンおよびエラスチン）から作製される。他の材料と
しては、高度に水和されたゲルを形成する多糖類鎖を含
む、グリコサミノグリカンが挙げられる。多糖類成分
は、マトリックスへの圧縮力に対して抵抗性であり、一
方で線維性タンパクは、引張り強度を提供する。

【０００８】合成ポリマーはまた、構造的足場を形成し
て、操作された組織に強度および構造的完全性を提供す
るために、使用された。ポリマーは、線維またはスポン
ジに基づく足場の形態での、生分解性ポリマー（例え
ば、ポリグリコール酸）であり得る。

【０００９】細胞および組織の増殖を改善するために、
種々のデバイスが提唱された。一例は、Ｋｕｒｊａｎら
に対する米国特許第５，７６３，２６７号に開示されて
いる。そこに開示される装置は、細胞懸濁液の大規模な
培養およびパッケージングに関する。この装置は、処理
チャンバを有する複数の組織足場を備える。流体入口、
流体出口、および流体リザーバが備えられて、この装置
を通して栄養培地を循環させる。

【００１０】組織および細胞を培養するための別の方法
は、Ｎａｕｇｈｔｏｎに対する米国特許第５，２６６，
４８０号に開示されている。この方法は、三次元マトリ
ックスを提供し、そしてこのマトリックスに所望の細胞
を播種する。培養は、種々の医療用途のために使用され
得る三次元組織を作製するために、維持される。

【００１１】組織および細胞を培養するために通常使用
される別のデバイスは、Ｓｅｒｋｅｓらに対する米国特
許第５，０１０，０１３号に開示されるような、ローラ
ーボトルである。このローラーボトルは、細胞を支持す
るためのボトルの表面積を増加するために、複数の皺を
有する。多くの型の細胞は、ゆっくりと増殖し、そして
細胞が付着するための支持体または基材を必要とする。
このローラーボトルは、細胞を支持するための表面積を
増加させることを意図されるデバイスの一例である。

【００１２】先行技術の装置および方法は、一般に、そ
れらの意図される目的においては効果的であった。しか
し、細胞および組織を培養するための改善された方法お
よびデバイスに関する、産業における必要性が、存在し
続けている。

【００１３】上述の特許文献の引用は、上記のもののい
ずれかが直接関連のある先行技術であることの認証とは
意図されない。これらの文献の日付に関する言及または
内容に関する説明の全ては、本発明者らに入手可能な情
報に基づいており、そしてこれらの文献の日付または内
容の正確さに関するいかなる認証をも構成しない。

【００１４】（発明の要旨）本発明は、以下を提供す
る：１．細胞および組織の増殖のための多孔質の三次元足
場であって、オープンセルポリマーマトリックスを含む
複数の表面を有し、このオープンセルポリマーマトリッ
クスは、細孔およびチャネルを有し、この細孔およびチ
ャネルは、実質的に連続的なチャネルの網目構造を形成
し、この網目構造は、細胞および細胞栄養の拡散を促進
し、ここで、この足場および網目構造のこの表面は、内
部細孔表面を含み、細胞付着を促進するよう官能基化さ
れている、足場。

【００１５】２．上記マトリックスが、少なくとも７
０％の多孔度を有する、項１に記載の足場。

【００１６】３．上記官能基化が、酸化的プラズマ処
理により生じる、項１に記載の足場。

【００１７】４．上記細孔が、約５０ミクロン〜約５
００ミクロンである、項１に記載の足場。

【００１８】５．ポリエーテル被覆を有する、項１に
記載の足場。

【００１９】６．細胞または組織を培養する方法であ
って、以下：項１に記載の三次元足場に細胞または組織
を播種する工程、およびこの播種した細胞を培養する工
程、を包含する、方法。

【００２０】７．上記培養する工程の後に上記足場を
回収する工程をさらに包含する、項６に記載の方法。

【００２１】８．細胞または組織を培養する装置であ
って、以下：バイオリアクター、および項１に記載の三
次元足場、を備える、装置。

【００２２】９．上記バイオリアクターが、培養皿、
フラスコ、瓶、またはローラーボトルから選択される、
項８に記載の装置。

【００２３】１０．上記足場が、キャビティ内に位置
する、項９に記載の装置。

【００２４】本発明は、細胞および組織を培養するため
の方法および装置に関する。より特定すると、本発明
は、１つ以上の内部表面を有する多孔質マトリックス上
で、インビトロで細胞および組織を増殖するための方法
および装置に関し、この表面は、細胞増殖を促進するよ
う処理された細孔内部表面を含む。従って、本発明の主
要な課題は、インビトロで細胞および組織の培養物の増
殖の効率を改善するための方法および装置を提供するこ
とである。

【００２５】本発明の別の局面は、細胞および組織の増
殖を促進するための表面積を有する、細胞および組織の
多孔質の足場を提供することである。

【００２６】本発明のさらなる局面は、細胞および組織
の培養物を支持し、そして細胞増殖を促進するための足
場として適切な、オープンセルポリスチレンマトリック
スを提供することである。

【００２７】本発明の別の課題は、細胞または組織の培
養の間に細胞および組織を効果的に固定するために、表
面を官能基化するよう処理された、オープンセルポリス
チレン足場を提供することである。

【００２８】本発明のなお別の局面は、オープンセルポ
リスチレンから作製される足場を使用して、細胞および
組織を培養するための方法を提供することであり、この
オープンセルポリスチレンは、細胞および組織の増殖の
間の細胞および組織の固定を増強するために、酸化的無
線周波数エッチングによって処理されている。

【００２９】本発明のさらなる局面は、細胞および組織
の培養のための三次元足場を提供することであり、ここ
で、この足場は、約５０ミクロン〜約２００ミクロンの
細孔径を有する多孔質のオープンセルポリスチレンフォ
ームである。

【００３０】本発明のなお別の局面は、バイオリアクタ
ーへの挿入物として使用するための足場を提供すること
であり、ここでこの足場は、細胞および組織の増殖を支
持するよう官能基化された表面領域を有する、多孔質の
オープンセルフォームである。

【００３１】本発明の局面および利点は、基本的に、容
器、および細胞の増殖を支持するための、この容器内に
位置する三次元足場支持体を提供することによって、達
成される。この支持体は、多孔質の、オープン細孔ポリ
マーフォーム部材を備える。このポリマーフォーム部材
は、実質的に連続的なポリマーマトリックスを有し、こ
のマトリックスは、内部表面を規定する複数の細孔を有
する。このポリマーマトリックスは、酸化的無線周波数
処理に供されて、この内部表面が官能基化され、そして
このオープン細孔の内部表面の表面への細胞の付着を促
進する。

【００３２】本発明の局面および利点は、細胞を培養す
る方法を提供することによってさらに達成され、この方
法は、オープン細孔ポリマーフォーム部材から形成され
る三次元足場支持体を提供する工程、細胞に栄養培地を
供給しながら、この足場に細胞を播種する工程、および
この細胞をこの足場上でインビトロで培養する工程を包
含し、ここで、このポリマーフォーム部材は、実質的に
連続的なポリマーマトリックスを有し、このポリマーマ
トリックスは、内部表面を規定する複数のオープン細孔
を有し、ここで、このポリマーマトリックスは、酸化的
無線周波数エッチングに供されている。

【００３３】本発明の局面および利点はまた、細胞の増
殖を支持するための多孔質ポリマー足場を調製するため
の方法を提供することによって、達成される。この方法
は、オープン細孔ポリマーマトリックスから形成される
三次元部材を提供する工程、およびこの部材の内部表面
を、酸化的無線周波数エッチングによってエッチングし
て、この部材の表面を酸化する工程を包含し、ここで、
このポリマーマトリックスは、この部材の内部表面を規
定する、相互接続された複数の細孔を有する。

【００３４】本発明のこれらの局面、利点および他の顕
著な特徴は、添付の図面および本発明の以下の詳細な説
明から、明らかとなる。

【００３５】（発明の詳細な説明）本発明は、細胞を培
養するための方法および装置に関する。より特定する
と、本発明は、多孔質足場を使用してインビトロで細胞
および組織を培養するための方法および装置に関する。

【００３６】本発明の足場は、多孔質の三次元部材であ
り、オープンセルポリマーフォームから形成される。こ
の多孔質フォームの足場は、高度に相互接続された細孔
を有する、実質的に連続的なポリマー相を有する。これ
らの細孔は、実質的に連続的なチャネルを、このポリマ
ーマトリックスを通して形成する。これらのチャネル
は、接続されて、細胞増殖に適した非常に高い表面積を
有する実質的に連続的なチャネルの網目構造を、ポリマ
ー相内に形成する。好ましくは、これらのチャネルまた
は細孔は、ポリマー相の全体にわたって分布して、細胞
および細胞栄養の拡散を、これらの細孔にわたって促進
する。

【００３７】本発明の足場は、種々の細胞および組織を
培養するために適切である。この足場は、特に、インビ
トロでの細胞および組織の培養に適切である。培養され
得る細胞の例としては、腫瘍細胞、骨髄細胞、皮膚細
胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、神経学的組織細胞、副腎
細胞などが挙げられる。

【００３８】本発明のポリマー足場は、インビボでの細
胞および組織の増殖のための移植物として、ならびに特
に、細胞および組織を種々のバイオリアクターにおいて
支持するための、インビトロでの細胞増殖のために、適
切である。このバイオリアクターは、例えば、培養皿、
フラスコ、瓶、またはローラーボトルであり得る。

【００３９】本発明による足場は、好ましくは、必要に
応じて挿入および除去され得る、バイオリアクターにお
いて使用するための挿入物である。あるいは、バイオリ
アクター自体が、本発明に従って、バイオリアクターの
表面において細胞および組織の増殖を直接促進するよう
に作製され得る。

【００４０】図１および２に示す本発明の１つの実施形
態において、バイオリアクター１０は、ローラーボトル
１２の形態である。ローラーボトル１２は本発明の種々
の局面を説明することが意図されること、ならびにこの
バイオリアクターは他の形状、大きさおよび形態を有し
得ることが、理解される。図示される実施形態におい
て、ローラーボトル１２は、実質的に円筒形の側壁１４
および閉じた底端部１６を有する。図示される実施形態
において、底端部１６は、ボトル１２の内部表面積を増
加させるための、凹部１８を備える。ローラーボトル１
２はまた、頂部壁２０を備え、これは、頂部壁２０から
延びる頸部２４によって形成される開口部を有する。閉
鎖部材２６が提供されて、頸部２４に嵌合し、使用中に
ボトル１２を閉じる。好ましくは、閉鎖部材２６は、使
用中に液体サンプルを含むために、耐漏出シールを形成
する。本発明の実施形態において、閉鎖部材２６は、当
該分野において公知のように、空気透過性膜を有し得
る。

【００４１】ローラーボトル１２は、キャビティ３０内
に位置する多孔質足場２８を備える。図示される実施形
態において、足場２８は、実質的に円柱形の形状を有
し、そして全体の寸法は、キャビティ３０の内部寸法よ
りわずかに小さい。この実施形態において、足場２８
は、キャビティ３０の内部を移動して、ボトル１２が細
胞増殖プロセスの間に回転するにつれて、細胞増殖支持
培地と連続的に接触するような寸法にされた、挿入物と
して提供される。好ましくは、足場２８は、ローラーボ
トル１２の内部表面との過剰の衝突を回避するような形
状および寸法を有して、細胞が足場２８の表面から外れ
ることを減少させる。図２に示すように、足場２８は、
相互接続された細孔３４を有する、実質的に連続的なポ
リマーマトリックス３２を備える。

【００４２】さらなる実施形態において、足場２８は、
固定された位置で、ローラーボトル１２または他のバイ
オリアクターの内部に設置される。１つの実施形態にお
いて、足場２８は、ローラーボトル１２から取り外し可
能である。図示される実施形態において、足場２８は、
ローラーボトル１２の開口部２２より大きく、そして取
り外しを意図されない。足場が取り外し可能である実施
形態において、バイオリアクターは、バイオリアクター
からの足場の容易な分離を可能にする適切な寸法にされ
る。取り外し可能な端部キャップを有し、その結果支持
体表面が挿入され得るローラーボトルの一例は、Ｍｕｓ
ｓｉらに対する米国特許第４，９１２，０５８号に開示
され、これは、その全体が、本明細書中に参考として援
用される。

【００４３】細胞および組織を培養するための本発明の
方法は、内部に多孔質足場２８が収容された培養容器
（例えば、図１および２の実施形態のローラーボトル１
２）を提供する。多孔質足場２８には、標的細胞が播種
され、そして標的細胞の増殖を支持し得る栄養増殖培地
が供給される。次いで、ローラーボトル１２は、当該分
野において公知のような適切なローリングデバイス内
に、適切な温度条件下で、そして足場２８上の標的細胞
を培養するに十分な時間にわたって、配置される。

【００４４】図示される実施形態は、細胞を培養するた
めのローラーボトルに関する。本発明の足場はまた、細
胞および組織の増殖を支持および促進し得る、他のバイ
オリアクターに対して使用され得る。適切なバイオリア
クター培養容器の例は、Ｋａｙａｌらに対する米国特許
第５，３９１，４９６号に開示されるような容器であ
り、これは、その全体が、本明細書中に参考として援用
される。さらなる実施形態において、バイオリアクター
は、培養培地および細胞または組織の足場を支持し得
る、複数のチャンバを有し得る。適切なバイオリアクタ
ーの例は、Ｋｕｒｊａｎらに対する米国特許第５，７６
３，２３７号に開示されており、これは、その全体が、
本明細書中に参考として援用される。

【００４５】本発明の足場は、適切な処理工程による表
面酸化または官能基化に耐えられる、種々のポリマーか
ら作製され得る。足場を形成するために使用される多孔
質ポリマーマトリックスの表面を酸化的プロセスに供す
ることは、このポリマーの表面に官能基を作製すること
が見出された。特に、プラズマ酸化は、ポリマーマトリ
ックス全体にわたってポリマーを改変および官能基化し
得ることが、見出された。官能基化は、培養中にポリマ
ー表面への細胞の付着を促進し、一方で、細胞が種々の
回収技術によって、除去および回収されることを可能に
する。

【００４６】本発明の好ましい実施形態において、足場
２８は、多孔質オープンセルポリマー（および特に、ポ
リスチレンフォーム）から作製され、これは、酸化的無
線周波数エッチングに供される。オープンセルポリスチ
レン足場の酸化的無線周波数エッチングが、ポリスチレ
ンを滅菌し、そしてポリマーマトリックスにわたって、
ポリスチレンの表面を官能基化することが、見出され
た。ポリスチレンの官能基化は、細胞の固定および細胞
の培養を促進し得る表面を生成する。無線周波数エッチ
ングは、オープンセルポリスチレンの細孔に効果的に貫
入して、これらの細孔の内部表面をプラズマに曝露し
得、これらの細孔の表面を酸化および官能基化する。

【００４７】好ましい実施形態において、足場は、長
さ、幅および厚みを有する三次元構造体であり、多孔質
オープンセルポリスチレンから作製される。オープンセ
ルポリスチレンは、好ましくは、約７０％〜約７５％の
多孔度を有し、そして活性表面積は、少なくとも約１０
ｍ²／ｇである。好ましくは、ポリマーフォームは、少
なくとも９０％、そしてより好ましくは、少なくとも約
９３％の多孔度を有する。ポリマーマトリックスの表面
積は、約１０ｍ²／ｇ〜約５０ｍ²／ｇである。ポリスチ
レンフォームのオープン細孔は、好ましくは、相互接続
されて、実質的に連続的なチャネルを、連続的なポリマ
ーマトリックスを通して形成する。これらのチャネル
は、好ましくは、相互接続されて、チャネルの網目構造
を形成し、この網目構造は、栄養培地がこのチャネルを
通って効率的な細胞増殖を促進することを可能にする。

【００４８】細孔の寸法および特に直径は、培養される
細胞または組織に依存して、変動し得る。細孔の寸法
は、細胞がその細孔に入ることを可能にし、そして細胞
に対する栄養がその細孔を通って交換されることを可能
にするために十分に大きくなければならない。本発明の
実施形態において、細孔径は、約５０ミクロン〜約５０
０ミクロン、そして好ましくは、約５０ミクロン〜約２
００ミクロンの範囲であり得る。１つの実施形態におい
て、細孔は、約９０ミクロン〜約１００ミクロンの平均
直径を有する。細孔は、好ましくは、増殖中の細胞を支
持し、一方で水性栄養培地がこれらの細孔を通って流れ
ることを可能にし、そしてこれらの細孔が、得られる細
胞増殖を、リンスまたは他の細胞回収方法によって解放
することを可能にするために十分な大きさである。細孔
径は、足場を作製するために使用されるプロセスに依存
して、変動し得る。特定の実施形態において、細孔は、
実質的に２つの異なる大きさであり、これらが相互接続
されて、実質的に連続的なチャネルを形成する。他の実
施形態において、足場は、実質的に均一な大きさの細孔
を有する連続的なポリマーマトリックスから形成され、
これらの細孔が相互接続されて、実質的に連続的なチャ
ネルを形成する。

【００４９】図示される実施形態において、本発明の足
場は、円柱形のブロック様部材である。さらなる実施形
態において、足場は、バイオリアクターにおいて使用す
るために適した任意の所望の形状を有し得る。１つの実
施例において、足場は、円盤様の形状を有し、これは、
培養皿または他の適切なバイオリアクター内に配置され
得る。足場は、種々の細胞培養皿、組織培養皿およびマ
ルチウェルプレートの形態であり得る。足場のオープン
細孔フォームは、その構造が、種々の公知の細胞回収技
術および材料を使用しての細胞の容易なリンスおよび解
離を可能にする点で、特に望ましい。細胞を足場からリ
ンスおよび解離するための１つの適切な機構は、タンパ
ク分解酵素（例えば、トリプシン）を含む溶液を使用す
る。細胞を解離するための他の適切な機構は、細胞に付
与される力が溶解を誘導しない限り、超音波処理または
撹拌を包含する。しかし、細胞が最終的に核酸抽出アッ
セイまたはタンパク質抽出アッセイ（例えば、細胞産
物、代謝産物、または細胞膜表面の分子もしくは部分を
単離するため）において使用される場合には、溶解の防
止は、さほど重要ではない。当業者は、培養物からの細
胞の最終的な用途に適合する場合には、当該分野におい
て公知の任意の方法が、培養した細胞を足場からリンス
または解離する際に有用であることを、理解する。

【００５０】本発明の足場は、培養プロセス中にこの足
場が容器の壁または他のビーズに対して一貫して衝突し
ない点で、細胞および組織の培養デバイスにおける従来
のビーズより優れた利点を有する。従来のビーズは、細
胞を、表面でのみ支持するかまたは少なくとも主として
表面で支持し、そしてその結果、このビーズがバイオリ
アクターの壁および他のビーズと接触するにつれて、細
胞が表面から分離される。

【００５１】さらに、栄養増殖培地からの足場の回収
が、プラスチックビーズの回収と比較して、この足場に
よって単純化される。このことは一般に、低下した細胞
の損失およびより高い培養収率を生じる。

【００５２】さらに、三次元の足場は、代表的に細胞株
の表現型の変化を引き起こす従来の平坦な表面とは対照
的に、特定の細胞株の表現型を維持し得る。

【００５３】本発明の好ましい実施形態において、足場
２８は、適切なバイオリアクター内に配置され得る挿入
物である。取り外し可能な足場は、単一の立方体、ブロ
ック、球、管、棒、円盤、膜、フィルム、シート、また
はバイオリアクターの適切な形状および大きさの他の構
造であり得る。さらなる実施形態において、足場は、繊
維から形成され得、これらは束に形成される。さらなる
実施形態において、これらの繊維は、織布マットまたは
不織布マットであり得る。これらの繊維はまた、連続的
なチャネルを備えるオープン細孔構造を有する、ポリマ
ーマトリックスから形成される。繊維の表面は、酸化的
プラズマエッチングに供されて、繊維およびポリマーマ
トリックスの表面が官能基化される。

【００５４】本発明の足場は、当該分野において公知の
ように、オープン細孔ポリマーフォームを生成するため
の種々のプロセスによって作製され得る。好ましい実施
形態において、足場は、多孔質ポリスチレン本体から作
製される。ポリスチレンは、好ましくは、高分子量の剛
性ポリマーである。さらなる実施形態において、ポリス
チレンは、可撓性ポリマーであり得る。培養培地と非反
応性であり、そして細胞または組織の培養を妨害しな
い、他の適切なポリマーもまた、使用され得る。他の実
施形態において、ポリマーは、生腐食性ポリマーであり
得る。適切な生分解性または生腐食性ポリマーの例とし
ては、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエチレンオキ
シド／ポリプロピレンテレフタレート、ポリカプロラク
トン、ポリヒドロキシブチレート、ならびにポリエステ
ル、ポリカーボネート、ポリ酸無水物およびポリ（オル
トエステル）のコポリマーが挙げられる。他の適切なポ
リマーとしては、ポリアミノカーボネート、ポリアクリ
レートおよびポリウレタンが挙げられる。

【００５５】足場は、オープン細孔フォーム構造を作製
し得る種々のプロセスによって作製され得る。フォーム
は、例えば、適切な気体膨張または発泡剤によって生成
され得る。気体発泡法によって生成する多孔質ポリマー
マトリックスは、固体ポリマー部材を使用し、これは、
ポリマーを飽和させるために、高圧二酸化炭素に曝され
る。圧力の解放は、溶解した二酸化炭素の核形成および
膨張を引き起こし、約１００ミクロンおよび９３％の多
孔度のマクロ細孔を形成する。気体発泡は、溶媒（これ
は残って細胞および組織の増殖を妨害し得る）の使用を
回避するという利点を有する。この方法は、圧力下で二
酸化炭素を吸収し得るポリマーに限定される。

【００５６】１つの実施形態において、足場は、溶媒キ
ャスティング、粒子浸出プロセスによって作製される。
このプロセスにおいて、ある量の選択されたポリマー
が、適切な溶媒または溶媒の混合物に溶解される。第二
の溶媒が添加されて、溶解したポリマーの冷却時に、相
分離を生じさせ得る。ポリマーの溶液は、一般に、約
０．５重量％〜約２５重量％、そして代表的に、約１０
重量％〜約２０重量％のポリマーを含む。

【００５７】足場に細孔を形成するための粒子の量は、
得られるポリマー溶液と混合される。粒子は、足場の所
望の細孔径に従って選択される。粒子は、単一の大きさ
であり得るか、またはポリマーマトリックスに選択され
た細孔径の分布を提供する粒径のブレンドであり得る。
粒子は、非毒性の生体適合性物質であり、ポリマー溶液
を形成するために使用される有機溶媒に不溶であるかま
たは実質的に不溶である。好ましい実施形態において、
粒子は、水に易溶である。適切な粒子の例としては、生
物学的に受容可能なアルカリ金属塩およびアルカリ土類
金属塩のような、結晶性物質が挙げられる。これらの塩
は、代表的に、ハロゲン化物、リン酸塩および硫酸塩で
ある。代替の実施形態において、粒子は、糖の結晶また
は水溶性ポリマーもしくはタンパク質（例えば、アルブ
ミン）のミクロスフィアであり得る。塩化ナトリウム
が、代表的に使用される。なぜなら、これは容易に入手
可能であり、水溶性であり、そして非毒性であるからで
ある。

【００５８】足場は、粒子の床を適切な容器または鋳型
内に形成し、そして加熱されたポリマー溶液をこの粒子
の上に注ぐことによって、製造される。あるいは、粒子
は、ポリマー溶液と混合され、そして鋳型内に注がれ得
る。ポリマー溶液が完全に粒子と混合した後に、この溶
液が冷却されて、ポリマーが固化する。次いで、有機溶
媒が減圧下で除去されて、ポリマーマトリックスが形成
される。次いで、粒子に適した溶媒を使用して、粒子が
ポリマーマトリックスから浸出される。粒子が溶解され
て、オープンセルフォーム足場が製造される。

【００５９】相分離プロセスにおいて、ポリマーは、低
温にて溶媒に溶解される。相分離は、温度を低下させ、
そしてクエンチすることによって誘導され、二相固体が
生成する。固化した溶媒が昇華によって除去されて、ポ
リマーマトリックスが生成される。

【００６０】ポリマーマトリックスが作製された後に、
このポリマーは酸化的処理に供されて、官能基が足場の
表面に形成される。酸化的処理は、細孔に貫入してポリ
マーマトリックスのポリマー表面を官能基化させるよう
に、適用される。酸化的処理は、代表的に、ポリマーマ
トリックスの細孔を通って内部表面および間隙表面へと
拡散する。酸化的処理は、表面の改変を起こして、ポリ
マーの水素原子を酸素原子または窒素原子で置換し、ヒ
ドロキシル基、アミノ基、カルボニル基およびカルボキ
シル基を形成する。

【００６１】好ましい実施形態において、足場は、無線
周波数酸化的プラズマ処理のような酸化的処理に供され
る。この処理雰囲気は、反応性の気相酸素原子およびラ
ジカルを含み、これらがポリマー表面と接触して、官能
基を生成する。酸素原子およびラジカルは、非平衡の低
圧環境において気体供給源から発生し、そして対流およ
び拡散の移送によって、ポリマー表面に送達される。こ
れらのラジカルは、気体を高いエネルギー条件に曝して
気体プラズマ放電を生じさせることによって、気体供給
源から発生する。この放電は、当該分野において公知で
あるように、無線周波数、マイクロ波、コロナ放電また
は直流放電によって、発生し得る。この放電はまた、レ
ーザー光分解、光出力ＵＶ／ＶＵＶランプ駆動式光分
解、高エネルギー電子ビーム、マイクロ波、直流電源、
および他の高強度イオン化放射源またはラジカル形成放
射源から発生し得る。プラズマガス放電は、本発明のポ
リマーを処理するための１つの好ましい方法である。ポ
リマーフォームの内部表面を処理するために適切な方法
およびデバイスは、Ｋｏｏｎｔｚに対する米国特許第
５，１４１，８０６号および同第５，２１５，７９０号
に開示されており、これらはその全体が、本明細書中に
参考として援用される。

【００６２】プラズマ放電のための気体供給源は、好ま
しくは、酸素である。さらなる実施形態において、気体
供給源は、アンモニアまたは窒素と水素との混合物であ
り得る。気体供給源は、実質的な純粋な形態でか、また
はヘリウムもしくはアルゴンのような気体で希釈され
て、使用され得る。希釈された気体は、反応器内で、よ
り長く持続し、そしてより高い濃度の反応性ラジカルを
生成する点で、有利であり得る。気体プラズマ反応器の
一例は、Ｋｏｏｎｔｚに対する米国特許第５，３３２，
５５１号に開示されており、これは、その全体が、本明
細書中に参考として援用される。好ましい実施形態にお
いて、足場は、反応性酸素原子を含む酸化的無線周波数
処理に供されたポリスチレンフォームである。

【００６３】さらなる実施形態において、ポリマーの表
面は、選択された成分に付着した適切な材料で、被覆ま
たは処理され得る。例えば、酸化的処理の前に、ポリマ
ー表面は、ポリエチレンオキシドのようなポリエーテル
で被覆され得る。酸化の際に、残余の官能基化されたポ
リエチレンオキシド被覆は、ペプチド、タンパク質およ
び他の生体分子に付着し得る。

【００６４】上記で引用された参考文献は、具体的に援
用されようとそうでなかろうと、全て、本明細書中に参
考として援用される。

【００６５】ここで、本発明を十分に記載したが、本発
明は、広範な等価のパラメータ、濃度、および条件にお
いて、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、
そして過度の実験なしで実施され得ることが、当業者に
よって理解される。

【００６６】インビトロにおける細胞および組織培養物
の増殖の効率を改善するための方法および装置が、開示
される。効率の改善は、酸化的プラズマ放電によって表
面処理されたオープンセルポリマーフォームから形成さ
れる足場の使用によって、達成される。

【００６７】１つの実施形態において、ポリマーフォー
ムは、酸素ガスプラズマで処理されてポリマーの表面が
官能基化された、ポリスチレンフォームである。好まし
い実施形態において、足場は、細胞および組織を培養す
るためのバイオリアクターのための挿入物として、使用
される。足場は、相互接続された複数のオープン細孔を
含む連続的ポリマーマトリックスを有する、多孔質ポリ
マー構造体から形成される。細孔径は、代表的に、約５
０ミクロン〜約５００ミクロンの範囲である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の１つの実施形態における、ロ
ーラーボトル型の反応容器の斜視図である。

【図２】図２は、多孔質足場を示す、図１の容器の断面
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 595117091 １ＢＥＣＴＯＮＤＲＩＶＥ，ＦＲＡＮＫＬＩＮＬＡＫＥＳ，ＮＥＷＪＥＲＳＥＹ 07417−1880，ＵＮＩＴＥＤＳＴＡＴＥＳＯＦＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者アンドレアリエブマン−ヴィンソンアメリカ合衆国ノースカロライナ 27592，ウイロウスプリングス，ノーヴェンバーコート 611 (72)発明者メアリーメイヤーアメリカ合衆国ノースカロライナ 27705，ダラム，ウェルカムサークル 1325 (72)発明者ヘレンブイ．ヘシャーアメリカ合衆国ノースカロライナ 27713，ダラム，エイバクロンビードライブ 3602 Ｆターム(参考） 4B029 AA02 DB10 DF06 4B065 BC01 BC11 BC42

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞および組織の増殖のための多孔質の
三次元足場であって、オープンセルポリマーマトリック
スを含む複数の表面を有し、該オープンセルポリマーマ
トリックスは、細孔およびチャネルを有し、該細孔およ
びチャネルは、実質的に連続的なチャネルの網目構造を
形成し、該網目構造は、細胞および細胞栄養の拡散を促
進し、ここで、該足場および網目構造の該表面は、内部
細孔表面を含み、細胞付着を促進するよう官能基化され
ている、足場。
【請求項２】前記マトリックスが、少なくとも７０％
の多孔度を有する、請求項１に記載の足場。
【請求項３】前記官能基化が、酸化的プラズマ処理に
より生じる、請求項１に記載の足場。
【請求項４】前記細孔が、約５０ミクロン〜約５００
ミクロンである、請求項１に記載の足場。
【請求項５】ポリエーテル被覆を有する、請求項１に
記載の足場。
【請求項６】細胞または組織を培養する方法であっ
て、以下：請求項１に記載の三次元足場に細胞または組
織を播種する工程、および該播種した細胞を培養する工
程、を包含する、方法。
【請求項７】前記培養する工程の後に前記足場を回収
する工程をさらに包含する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】細胞または組織を培養する装置であっ
て、以下：バイオリアクター、および請求項１に記載の
三次元足場、を備える、装置。
【請求項９】前記バイオリアクターが、培養皿、フラ
スコ、瓶、またはローラーボトルから選択される、請求
項８に記載の装置。
【請求項１０】前記足場が、キャビティ内に位置す
る、請求項９に記載の装置。