JP2001501811A - Ｐｔｘ感受性ｇタンパク質、それらの調製方法、及びそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＷＤリピートモチーフ６個以下からなる、ヒトＧタンパク質のβ−３サブユニット。

Description

【発明の詳細な説明】 ＰＴＸ感受性Ｇタンパク質、それらの調製方法、及びそれらの使用 説明 本発明は、新規ヒトＧタンパク質（特にＧタンパク質のβ３サブユニット）、 それらの製造方法、並びに診断及び治療におけるそれらの使用に関する。 ヘテロトリマー状グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）は、 細胞内信号伝達においてかなりの重要性を有する。それらは、ホルモンレセプタ ー及びレセプター活性化後に配座変化が発生する別のレセプターが刺激された後 に、細胞外信号の中継を媒介する。このことによりＧタンパク質の活性化が起こ り、続いて活性化Ｇタンパク質は、細胞内エフェクター（例えば、イオンチャン ネル、酵素）を活性化又は阻害することができる。ヘテロトリマー状Ｇタンパク 質は、αサブユニット、βサブユニット、及びγサブユニットの３個のサブユニ ットからなる。現在までに、異なるαサブユニット数種、βサブユニット５種、 及びγサブユニット約１２種が、生化学的方法及び分子生物学的方法によって検 出されている（Ｂｉｒｎｂａｕｍｅｒ，Ｌ．ａｎｄ Ｂｉｒｎｂａｕｍｅｒ，Ｍ ．Ｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｇｐｒｏｔｅｉｎｓ：１９９ ４ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｒｅｓ．１５：２１３−２５２，１９ ９５；Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ，Ｓ．ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｇ．Ｃｏｍｐｌｅ ｘ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｂｙ ｔｈｅ ｔｒａｎ ｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｕｎｙｎ Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ Ａｒｃ ｇ，Ｂ．，Ｇｕｄｅｒｍａｎｎ，Ｔ．，ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｇ．Ｒｅｃｅ ｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｇｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｏｍｐｏ ｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄ ｕｃｔｉｏｎ． Ｐａｒｔ ２．Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７３：１２３−１３２，１９ ９５；Ｎｅｅｒ，Ｅ．Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓ：Ｏｒｇａｎｉｚｅｒｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｉｇｎａｌ ｓ．Ｃｅｌｌ ８０；２４９−２５７，１９９５；Ｒｅｎｓ−Ｄｏｍｉａｎｏ， Ｓ．ａｎｄ Ｈａｍｍ，Ｈ．Ｅ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉ ｏｎａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１０５９−１０６６，１９９５ ）。 レセプターが媒介する或るαサブゴニットの活性化は、百日咳毒素（ＰＴＸ） での前処理によって阻害することができる。これらには、特にα異性体（αｉ１ 、αｉ２、及びαｉ３）、並びに種々のαｏサブユニットが含まれる。また、こ れらのタイプのＧタンパク質は、ＰＴＸ感受性Ｇタンパク質とも称されている。 βγサブユニットは、本質的な機能を、Ｇタンパク質活性化及び細胞内反応の モジュレーションにおいて実施している。今までに開示された全てのＧタンパク 質βサブユニットは、ヌクレオチド配列のレベル及びアミノ酸配列のレベルにお いて、高い水準のホモロジーを有している。更に、これらの類似性は、ヒトβサ ブユニット（β１，β２，β３）においてだけでなく、別の種（例えば、ミバエ 又は酵母菌）のβサブユニットとの比較においても見られる。 相互に接触し、そしてヘテロトリマーの規則的な形成に必要なα、β、及びγ サブユニットにおけるそれらのアミノ酸は、Ｘ線構造解析によって決定可能にな ってきた。 今までに開示されてきた全てのＧタンパク質βサブユニットは、ＷＤリピート タンパク質に属する。前記βサブユニットのＮ末端は、主にγサブユニットと相 互作用し、そしてＣ末端は、レセプターとの相互作用に関与する。 βサブユニットは、プロペラ構造と称される構造を形成する。前記Ｇβサブユ ニットのβプロペラは、７個のβプロペラ翼からなり、それぞれのプロペラ翼は 、逆平行配置のアミノ酸領域４個からなる。前記βプロペラの７つの折りたたみ 対称体は、アミノ酸配列（ＷＤリピート７個を含む）レベルにおいて検出するこ とができる。ＷＤリピートモチーフは、アミノ酸約４０個を含み、そしてＴｒｐ −Ａｓｐジペプチド配列を含む多くの保存されたアミノ酸を有する。このＷＤモ チーフは、ＷＤリピートをしばしば終了させる（Ｆｉｇ．１）。 驚くべきことに、７個のＷＤリピートモチーフ（別途記載）ではなく、６個の みのＷＤリピートモチーフからなるＧタンパク質β３サブユニットが、例えば高 血圧症患者において発生していることが発見された。正常血圧者と比較して、こ れらの高血圧症患者では、ＰＴＸ−感受性Ｇタンパク質の細胞活性化能力が増加 している。 これらの高血圧症患者中の前記β３サブユニットに関する新規のアミノ酸配列 が、公知の配列よりも４１アミノ酸だけ短いことが、分子分析によって示された 。この配列を、配列表のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載する。これは、公知のヒ トβ３サブユニットから、アミノ酸１６７〜２０７を欠失させることによって形 式的に誘導される。 それらをコードする相当するＤＮＡ配列を、配列表のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ に記載する。 高血圧症患者において短縮Ｇβ３サブユニットが発生する理由は、おそらく関 連する遺伝子の選択的スプライシングであろう。ＤＮＡレベルにおいて、推定ス プライシング部位の前に、正確にイントロンが存在する。前記イントロンは、そ のオープンリーディング部位中の４９７番ヌクレオチド（番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のものと同じ）の後から開始する。 また、ゲノムＤＮＡに関するＰＣＲによって、約６２０番のヌクレオチドから 開始するイントロンを検出することも可能であった。前記の短縮形態は、明らか に、完全なエキソンの欠失によって発生する。更に、本発明は、宿主有機体中に おいて、それらをコードする核酸配列を発現させることによる、前記短縮形態の ヒトＧβ３サブユニットの調製方法に関する。 前記の組換え発現は、好ましくは、コードしている核酸配列に加え、他にシグ ナル配列及び調節配列（例えば、プロモーター、ターミネーター、リボソーム結 合部位、及びポリアデニル化部位など）を有する遺伝子コンストラクトを調製す ることによって実施する。遺伝子の組換え発現の一般的な手順は、当業者に周知 である。 更に、本発明は、遺伝子治療医薬の製造への、本発明による核酸配列の使用に 関する。前記の核酸配列を、直接的形態で、又は適当な遺伝子ベクター調製後に 、 患者の細胞中へ導入することにより、その中でのＧタンパク質の活性化能力の増 加を達成することができる。 これは、Ｇタンパク質に関係する調節異常（Ｆｅｈｌｓｔｅｕｅｒｕｎｇ）が 存在する多くの障害において望ましい。 Ｇタンパク質調節異常に関係する疾患とは、Ｇタンパク質が信号伝達に関与し ているが、その機能が生理学的方法で実行されない障害を意味する。 前記障害としては、心血管障害、代謝障害、及び免疫学的障害を挙げることが できる。 心血管障害としては、例えば、高血圧症、妊娠高血圧症（妊娠中毒、妊娠高血 圧症）、冠状心臓病（ｋｏｒｏｎａｒｅ Ｈｅｒｚｋｒａｎｋｈｅｉｔ）、局所 性及び／又は全身性アテローム血栓症、血管の狭窄症、血管再生処置後の再狭窄 （例えば、ステント移植を伴うか又は伴わないＰＴＣＡ）、発作に対する傾向、 血栓症、及び血小板凝集の増加を挙げることができる。 代謝障害としては、例えば、代謝症候群、インスリン抵抗性及び高インスリン 血症、二型真性糖尿病、糖尿病合併症（例えば、腎症、神経障害、及び網膜症等 ）、脂質代謝障害、中枢化学受容障害〔ＣＯ₂耐性、アシドーシス耐性、乳児突 然死（ＳＩＤＳ）〕を挙げることができる。 免疫疾患としては、例えば、体の免疫反応［イムノグロブリンの形成、Ｔ細胞 ｅ）低下、増殖（けが治癒能力を含む）に対する全般的低下傾向、腫瘍発生及び 増殖（悪性転換細胞の転移能力を含む）の傾向、ＨＩＶ感染後に病気が臨床的に 明白となるまでの潜伏期間の持続、カポシ肉腫、肝臓の硬変傾向、移植耐性、及 び移植拒絶を挙げることができる。 更に、本発明は、障害診断（特に、Ｇタンパク質調節異常に関係する疾患に罹 病するリスクを決定することを含む）への、本発明による核酸配列の使用に関す る。 或る障害のリスクを決定する他に、本発明の使用を通じて、例えば、中枢の化 学受容能力、ＣＯ₂耐性、アシドーシス耐性、乳児突然死（ＳＩＤＳ）のリスク 、或るタイプのスポーツに対する適合性に関する一般的生理学的なデータ、及び 報 告を得ることもできる。 更に、本発明は、短縮形態のＧβ３サブユニットをコードする核酸配列に相補 的な核酸配列の使用に関する。このタイプの配列は、Ｇタンパク質調節異常に関 係する障害の治療又は予防用のアンチセンスコンストラクトとして使用すること ができる。 更に、本発明は、対象者のヒトＧタンパク質β３サブユニットの遺伝子配列と 配列表のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の遺伝子配列とを比較し、そして配列表のＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ：１の遺伝子配列と一致する場合には、その対象者に疾患のリス クが増加していると判断することにより、前記対象者に関して、Ｇタンパク質調 節異常に関連する障害に罹病する相対的リスクを決定する方法に関する。 相対的リスクを決定する前記の本発明の方法では、その対象者の遺伝的情報を 含む身体材料を、その対象者から採取する。これは、一般的に、血液サンプルか ら核酸を単離することによって行う。 Ｇタンパク質β３サブユニットに対する遺伝子の構造は、単離した対象者の核 酸から決定し、そしてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載の配列と比較する。 前記遺伝子の構造は、核酸のシークエンシングによって決定することができる 。これは、ゲノムＤＮＡから直接、又は核酸の増幅（例えばＰＣＲ法による）の 後に実施することができる。 前記遺伝子の構造は、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡレベルで行うことができる。 決定は、ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した後に、シークエンシングにより実施するこ とが好ましい。前記ＰＣＲ反応に適したプライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ に記載の配列から、当業者により容易に推定することができる。このための手順 は、いずれの場合においても、前記欠失部位の前及び後のプライマー結合鎖及び 相補鎖を選択するのが有利である。 しかしながら、遺伝子の比較に、別の方法（例えば、選択的ハイブリダイゼー ション又は制限酵素を用いる適当なマッピング）も用いることができる。 前記の診断方法も、タンパク質レベルにおいて実施することができる。例えば 、本発明によるタンパク質を用いて、短縮形態のＧβ３サブユニットを認識する ための特異的な抗体を産生することができる。次に、このタイプの抗体を用いて 、 適切な場合には通常のＥＬＩＳＡ法によって、前記の遺伝子検査に加えて、又は その代わりに、タンパク質化学検査を行うことができる。 のＧβ３サブユニットの短縮化）を有する遺伝子導入動物の産生に関する。この タイプの遺伝子導入動物は、特に前記疾患の研究及び治療用の動物モデルとして 、非常に重要である。遺伝子導入動物の産生方法は、当業者に一般的に知られて いる。 以下の実施例において、本発明を更に説明する。 実施例 １．本質的高血圧症におけるＧタンパク質活性化の機能的結果 正常血圧対象者及び高血圧症患者の細胞由来のＧタンパク質の活性化の詳細な 特徴付けを実施した。この目的のために、放射線標識［³⁵Ｓ］ＧＴＰｙＳの刺激 による取り込みを、Ｗｉｅｌａｎｄらにより記載された方法（Ｗｉｅｌａｎｄ， Ｔ．，Ｌｉｅｄｅｌ，Ｋ．，Ｋａｌｄｅｎｂｅｒｇ−Ｓｔａｓｃｈ，Ｓ．，Ｍｅ ｙｅｒ ｚｕ Ｈｅｒｉｎｇｄｏｒｆ，Ｄ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｍ．，及びＪａ ｋｏｂｓ，Ｋ．Ｈ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｇ ｐｒｏ ｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ ｃ ｅｌｌｓ，Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓ Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒ ｍａｃｏｌ．３５１：３２９−３３６，１９９５）によって定量した。予めジギ トニンによって透過性にしておいた細胞を、ペプチドマストパラン７を用いて刺 激することによって、最初にＧ−タンパク質を活性化させた。このペプチドは、 活性化したＧ−タンパク質結合レセプターの立体配置を模倣しているので、これ を用いて、レセプターとは無関係に、直接的なＧタンパク質活性化を誘発するこ とができる（Ｒｏｓｓ，Ｅ．Ｍ．及びＨｉｇａｓｈｉｊｉｍａ，Ｔ．Ｒｅｇｕｌ ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｍａｓ ｔｏｐａｒａｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２３７：２７−３８，１９９４）。ＭＡＳ− ７によって誘発されるＧＴＰｙＳの結合は、完全にＰＴＸ感受性であるので、そ れを使用して、Ｇｉタイプのヘテロトリマー状Ｇタンパク質の活性化を定量する ことができる。Ｆｉｇ．２は、正常血圧（ＮＴ）及び高血圧（ＨＴ）状態におい て、マスチパラン（ｍａｓｔｉｐａｒａｎ）７（ＭＡＳ−７）によって誘発され るＧタンパク質活性化の濃度依存性を示す。ＭＡＳ−７は、ＨＴ細胞上での強い ［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を誘発し、ＥＣ５０が約５μＭである（Ｆｉｇ．２）。 最大結合に達するのは、約２５〜５０μＭのＭＡＳ−７である。これに対して、 ＮＴ細胞への同等の［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ結合に必要な濃度は、１０倍高い（Ｆｉ ｇ．２）。これらのデータは、ＨＴ細胞内のＰＴＸ感受性Ｇタンパク質の活性化 には、ＮＴ細胞内のＰＴＸ感受性Ｇタンパク質の活性化よりも、明らかに、より 低い活性化レセプターが要求されることを示している。 Ｆｉｇ．３は、正常血圧者（ＮＴ）由来の細胞系及び高血圧症患者（ＨＴ）由 来の細胞系に対する［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳの結合（マストパラン７によって刺激） のタイムコースを示す。 高血圧細胞への［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳの結合は、明らかにスピードアップされて いる（正常血圧中では、速度定数が０．００５Ｓ^-1であるのに対し、高血圧状態 中では０．０１Ｓ^-1である）。 Ｆｉｇ．４は、正常血圧者及び高血圧症患者から単離した細胞膜に対する［³⁵ Ｓ］ＧＴＰγＳの結合（マストパラン７によって刺激）のＧＤＰ依存性を示す。 高血圧症患者由来の膜に対する［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳの最大に刺激された結合は、 低ＧＤＰ濃度（約０．２μｍｏｌ／リットル）において起きるが、正常血圧者由 来の膜においては、同じ効果のために、ＧＤＰ濃度１μｍｏｌ／リットルが必要 であることが明らかである。 同様の方法で、高血圧細胞由来の膜調製物への［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳの結合（マ ストパラン７によって刺激）の最大結合は、低い遊離Ｍｇ²⁺濃度（０．０１ｍｍ ｏｌ／リットル）において発生するが、正常血圧細胞由来の膜においては、同じ 最大結合のために、遊離Ｍｇ²⁺濃度０．１ｍｍｏｌ／リットルが必要である（Ｆ ｉｇ．５）。 続いて、高血圧細胞由来のＧタンパク質の増加した活性化能力の再構成につい ての実験を実施した。この目的のために、ウシの眼由来のＧタンパク質αサブユ ニットトランスデューシン（αｔ）及び光受容体ロドプシンを精製した（Ｐｈｉ ｌｌｉｐｓ，Ｗ．Ｊ．，Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｃ．，ａｎｄ Ｃｅｒｉｏｎｅ，Ｒ．Ａ ．Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ／ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｉ Ｉ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ−βγ ｓｕｂ ｕｎｉｔ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ−ａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｔｏ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ．Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７０４０−１７０４６，１９９２）。更に、コ レートの添加によって、正常血圧細胞及び高血圧細胞由来の膜から、Ｇタンパク 質を抽出した〔Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｊ．，Ｎｏｒｔｈｕｐ，Ｊ．Ｋ．，ａｎｄ Ｓｃｈｉｍｍｅｒ，Ｂ．Ｐ．Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｇｕａｎｙｌ ｎｕｃｌｅｏ ｔｉｄｅｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ βγ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｉｎ ａ ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｙ １ ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９（１９）：８９３３−８９３７，１９９ ２〕。ロドプシン（すなわち、レセプター）によって誘発される、α−トランス デューシン（αｔ）への［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳの特異的な結合を計測し、そしてこ の結合における、正常血圧細胞及び高血圧細胞の膜からのコレート抽出物の効果 を調査した。全ての実験において、コレート抽出物中の前記タンパク質濃度が同 じであった。 Ｆｉｇ．６は、αｔへの［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳの結合（ロドプシンによって刺激 ）における、正常血圧細胞及び高血圧細胞由来のコレート抽出物の効果を示す。 この場合は、正常血圧者由来のコレート抽出物による媒介よりも、高血圧細胞 由来のコレート抽出物が、αｔへの［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳのロドプシン触媒結合を 促進することが明白である。 前記の実験から、以下に記載の結論を下すことが可能である。 ＊ 高血圧細胞内において、Ｇタンパク質の活性化能力が増加されている。これ は、明らかに、より低い活性化レセプターが、高血圧細胞に要求されること、 そして更に、Ｇタンパク質活性化の速度論が明らかにスピードアップされてい ることにおいて、正常血圧細胞中のＧタンパク質活性化と比較した場合に、よ り効果的である（Ｆｉｇ．２及び３）。 ＊ 更に、高血圧細胞の場合は、正常血圧細胞の場合よりも、最大Ｇタンパク質 活性化に要求される遊離ＧＤＰ及び遊離Ｍｇ²⁺の濃度が、明らかに低い。これ は、α、β、及びγサブユニットのタンパク質相互作用が、正常血圧細胞中よ りも高血圧細胞中において明らかにより効果的に起こるという結論を導く（Ｆ ｉｇ．４及びＦｉｇ．５）。 ＊ 正常血圧細胞由来のコレート抽出物によるよりも、高血圧細胞由来のコレー ト抽出物による方が、αｔへの［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳのロドプシン触媒化結合が 、明らかに向上する。このことは、高血圧細胞の場合に向上したＧタンパク質 活性化が、イン・ビトロ系において再構成されることが可能なことを証明して いる（Ｆｉｇ．６）。更に、これらの発見から、高血圧細胞中の潜在的な交替 は、ヘテロトリマー状Ｇタンパク質のβγサブユニット中で発見されることを 、明確に結論付けることができる。前記再構成系中において、αｔの存在下で 前記コレート抽出物中に依然として存在するαサブユニットの活性化が起こら ない。更に、添加された光受容体ロドプシンは、コレート抽出物中に内因的に 残存するαサブユニットを活性化せずに、添加されたαｔだけを特異的に活性 化する。 前記の新規タンパク質は、アミノ酸２９９個からなる。前記のヒトＧβ３サブ ユニットと比較すると、第４のＷＤリピート領域中に欠失がある。しかしながら 、いくつかのアミノ酸の配列の規則性から考えて、前記の新規短縮Ｇβ３タンパ ク質が、本来のプロペラ構造を同様に形成しているものの、この新規プロペラは 、プロペラ翼が７枚（Ｆｉｇ．１）ではなく、おそらく６枚（Ｆｉｇ．７）から なると推測することができる。 前記の新規短縮Ｇβ３サブユニットのＮ末端及びＣ末端は、どちらも、従来か ら知られているＧβ３サブユニットから変化していないので、ヘテロトリマー状 Ｇタンパク質のαサブユニット及びγサブユニット、並びに結合レセプターとの 相互作用が損なわれているものと予測することができる。前記の機能的な結果に 関連して、前記の新規短縮Ｇβ３サブユニットが、高血圧症患者において観察さ れるヘテロトリマー状Ｇタンパク質活性化の増加を、機能的に媒介することが明 らかである。 高血圧症患者において前記の新規短縮Ｇβ３サブユニットが発生する理由は、 ヒトＧβ３をコードする遺伝子の選択的スプライシングであると想像される。実 際に、ＤＮＡレベルにおいて、イントロンが、推定されるスプライシング部位の 前に正確に存在する（Ｆｉｇ．１０）。 前記イントロンは、ＡＴＧ開始コドンのＡを、＋１とすれば、オープンリーデ ィングフレーム中の４９７番塩基の後ろから開始する。 イントロンリミット及び分枝部位は、イタリックで表記して、下線を付した。 また、ゲノムＤＮＡに関するＰＣＲによって、前記オープンリーディングフレ ーム中の約６２０番塩基から開始するイントロンを発見することもできるので、 本明細書に記載の短縮形態のヒトＧβ３は、明らかにオリジナルＧβ３の選択的 スプライシングの結果として、完全なエキソンの欠失が起きている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/00 Ａ６１Ｐ 3/10 3/10 9/00 9/00 9/12 9/12 13/12 13/12 25/00 25/00 27/00 27/00 35/04 35/04 37/00 37/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＷＤリピートモチーフ６個以下からなる、ヒトＧタンパク質のβ−３サブユ ニット。 ２．配列表のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１ に記載のタンパク質。 ３．請求項１又は２に記載のタンパク質をコードする、核酸配列。 ４．配列表のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載の配列を有する、請求項３に記載の 核酸配列。 ５．前記請求項のいずれか一項に記載の核酸配列に、場合により適当な調節シグ ナルを設け、そして宿主有機体中で発現させることを特徴とする、前記請求項の いずれか一項に記載のタンパク質の製造方法。 ６．免疫不全なヒト由来の免疫細胞中で前記の発現を起こす、請求項５に記載の 方法。 ７．前記のヒトがＨＩＶ−陽性である、請求項６に記載の方法。 ８．ヒトの体細胞中で発現を起こす、請求項５に記載の方法。 ９．Ｇタンパク質調節異常に関係する疾患の治療用医薬製造への、前記請求項の いずれか一項に記載の核酸配列の使用。 １０．障害診断への、ヒトＧタンパク質β３サブユニットに対する遺伝子中の遺 １１．Ｇタンパク質調節異常に関係する疾患に罹病するリスク決定への、ヒトＧ タンパク質β３サブユニットに対する遺伝子中の遺伝子変化の使用。 １２．前記遺伝子変化が、配列表のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載の配列を包含 する、請求項１０又は１１に記載の使用。 １３．前記疾患が、心血管障害、代謝障害、又は免疫学的障害である、請求項１ ０〜１２に記載の使用。 １４．前記疾患が、高血圧症である、請求項１０〜１２に記載の使用。 １５．遺伝子導入動物産生への、前記請求項のいずれか一項に記載の核酸配列の 使用。 １６．疾患の治療又は予防用のアンチセンス医薬製造への、請求項３又は４に記 載の核酸配列に相補的な核酸配列の使用。 １７．前記疾患が、高血圧症、妊娠高血圧症、冠状心臓病、血管形成術後の再狭 窄、又は発作である、請求項１６に記載の使用。 １８．前記疾患が、糖尿病性続発症、例えば腎症、多発性神経障害、又は網膜症 である、請求項１６に記載の使用。 １９．前記疾患が、転移性腫瘍である、請求項１６に記載の使用。 ２０．対象者のヒトＧタンパク質β３サブユニットの遺伝子配列と配列表のＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ：１の遺伝子配列とを比較し、そして配列表のＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：１の遺伝子配列と一致する場合には、その対象者に疾患のリスクが増加して いると判断することによる、Ｇタンパク質調節異常に関係する障害発病の前記対 象者における相対的リスクを決定する方法。 ２１．シークエンシング、制限分析、又は選択的ハイブリダイゼーションによっ て遺伝子の比較を実施する、請求項２０に記載の方法。 ２２．請求項１又は２に記載のタンパク質に対して特異的に指向する抗体を調製 するための、前記タンパク質の使用。