JP2001512667A - ヒトオーファンレセプターｎｔｒ−１ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はヒトＮＴＲ−１と命名された核酸配列を提供し、これは膵臓および胎児の心臓において発現される新規なオーファンレセプターをコードする。本発明はまた、ヒトＮＴＲ−１遺伝子産物に結合するリガンドを検出、および／または測定するために使用され得るアッセイ系を提供する。本発明はまた、ＮＴＲ−１と、ＮＴＲ−１との結合を介してシグナル伝達を開始する薬剤との間の相互作用に基づく、診断方法および治療方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 この国際出願は、１９９７年８月６日に出願された米国仮出願第６０／０５４
，８６９号の優先権を請求する。この出願を通して、種々の刊行物が参照される
。これらの刊行物の開示は、その全体が本出願に参考として援用される。

【０００２】 （序論） 本発明の分野は、細胞機能を調節するポリペプチド分子、このポリペプチドを
コードする核酸配列、ならびにこの核酸配列およびこのポリペプチドを使用する
方法である。本発明は新規なオーファンレセプター分子、それらの使用、および
これらのレセプターと相互作用する新規なリガンドを同定するのに有用なアッセ
イ系を提供する。

【０００３】 （発明の背景） 腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーは主に、種々の細胞
においてシグナル形質導入を誘発する膜貫通のタンパク質からなる。腫瘍壊死因
子α（ＴＮＦ−α）は、活性化マクロファージによって主として産生されるサイ
トカインである。ＴＮＦ−αは、Ｔ細胞およびＢ細胞増殖を刺激し、そして内皮
細胞における接着分子の発現を誘導する。このサイトカインも、感染に対する宿
主防御に重要な役割を果たす。

【０００４】 ＴＮＦ−α活性は、２つの異なるレセプター、ＴＮＦＲ−ｐ５５およびＴＮＦ
Ｒ−ｐ７５によって媒介される。これらの２つのレセプターはまた、主として活
性化リンパ球により分泌される可溶性リンホトキシンα（ＬＴ−α）によって引
き起こされる活性を媒介する。ＴＮＦＲ−ｐ５５の特異的刺激は、例えばインビ
トロ腫瘍細胞傷害性のようなＴＮＦ活性、内皮細胞およびケラチノサイトにおけ
る接着分子の発現、セラミドの付随増加でのスフィンゴミエリナーゼの活性化、
ＮＦ−κＢの活性化、ならびにマンガンスーパーオキシドジスムターゼｍＲＮＡ
の誘導を誘導する。ＴＮＦＲ−ｐ７５の特異的刺激は、マウスおよびヒトの胸腺
細胞および細胞傷害性Ｔ細胞、線維芽細胞およびナチュラルキラー細胞の増殖性
応答、ならびにＰＣ６０細胞におけるＧＭ−ＣＳＦ分泌を生じる。

【０００５】 骨吸収を調節するＴＮＦＲスーパーファミリーの新メンバーの同定は、最近報
告された。この新しく同定されたタンパク質は骨プロテグリン（Ｏｓｔｅｏｐｒ
ｏｔｅｇｒｉｎ）（ＯＰＧ）と名付けられ、破骨細胞（骨吸収の原因である細胞
）の分化をブロックすることにより骨吸収の体液性制御因子として作用すると仮
定された。（Ｓｉｍｏｎｅｔ，Ｗ．Ｓ．，ら、１９９７、Ｃｅｌｌ ８９：３０
９−３１９；Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．の名前で、１９９７年７月３日に発行された
国際公開第ＷＯ ９７／２３６１４号）。しかし、破骨細胞の発達を調節するよ
うに生理学的に作用する可溶性因子については比較的ほとんど知られていない。

【０００６】 新規なレセプター分子は、例えばＰＣＲに基づくスクリーニング、またはこの
ファミリーメンバー間の公知の相同性領域を含むＥＳＴデータベースのコンピュ
ーターサーチを使用して、レセプターの公知のファミリーのさらなるメンバーを
サーチすることにより、しばしば同定および単離される。（例えば、Ｍａｉｓｏ
ｎｐｉｅｒｒｅ，ら、１９９３、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６３１−１６３７を
参照のこと）。このような所謂「オーファン」レセプター（このリガンドは全く
知られていない）の単離、およびこのようなレセプターが発現される組織の引き
続く決定は、標的組織中の細胞の成長、増殖、および再生の調節に対する見識を
提供する。さらにこのようなレセプターはこれらの同族のリガンドを単離するの
に使用され得、次にこれはこのレセプターを発現する細胞の生存、成長および再
生を調節するのに使用され得る。あるいは可溶性レセプターの場合に、このレセ
プター自体リガンドとして挙動し得る。

【０００７】 （発明の要旨） 本発明は、ヒトＮＴＲ−１と名付けられた、新規のオーファンヒトレセプター
を提供し、これは、膵臓、骨格筋、筋肉ならびに胎児および成体の心臓中に発現
される。このタンパク質は骨プロテグリン（ＯＰＧ）に関し、腫瘍壊死因子レセ
プター（ＴＮＦＲ）に関する。本発明はさらに、ヒトＮＴＲ−１をコードする単
離核酸分子を提供する。その骨プロテグリンとの相同性に基づいて、ヒトＮＴＲ
−１は骨質量の調節に関与し、骨芽細胞または破骨細胞の発達、増殖、および死
を調節するのに、あるいは筋肉代謝を調節するのに有用であり得、ならびに筋肉
の疾患または障害に関係し得る。

【０００８】 本発明はまた、ヒトＮＴＲ−１の細胞外ドメイン、およびこのような細胞外ド
メインをコードする核酸を含有するタンパク質またはポリペプチドを提供する。
本発明はさらに、ヒトＮＴＲ−１またはその細胞外ドメインをコードする単離さ
れた核酸分子を含有するベクターを提供し、これは、細菌細胞、酵母細胞、昆虫
細胞、または哺乳動物細胞、好ましくはＣＯＳまたはＣＨＯ細胞内で、ヒトＮＴ
Ｒ−１またはその細胞外ドメインを発現するのに使用され得る。

【０００９】 本発明はさらに、ヒトＮＴＲ−１と相互作用する薬物のスクリーニングにおい
て、ヒトＮＴＲ−１レセプターまたはその細胞外もしくは細胞内ドメインの使用
を提供する。本明細書中に記載されるレセプターに結合する新規な薬剤は、この
レセプターを自然に発現する細胞内で生存および分化を仲介し得るが、またこの
レセプターを発現するように操作した細胞を処理するのに使用した場合、生存お
よび増殖を与え得る。特定の実施態様において、ヒトＮＴＲ−１の細胞外ドメイ
ン（可溶性レセプター）は、同族のリガンドのスクリーニングに利用される。

【００１０】 本発明のヒトＮＴＲ−１ポリペプチドの好ましい使用には、このレセプターポ
リペプチドに結合する薬剤のスクリーニングが挙げられる。この薬剤は生物学的
に活性な薬剤（アゴニスト）（これはヒトＮＴＲ−１レセプターを活性化する）
であり得るか、またはレセプターに結合し、そしてその活性化をブロックし得る
（アンタゴニスト）。スクリーニング方法は、この薬剤の存在なしで、このポリ
ペプチドが基準親和性でこの結合標的に特異的に結合するという条件下で、細胞
外ヒトＮＴＲ−１ポリペプチド特異的結合標的および候補薬の存在下で、ヒトＮ
ＴＲ−１ポリペプチドをインキュベートする工程；このポリペプチドのこの結合
標的に対する結合親和性を検出し、薬剤で偏った親和性を決定し、ここでこの薬
剤で偏った親和性とこの基準親和性との間の相違は、この薬剤がこのポリペプチ
ドのこの結合標的への結合を調節することを示唆する工程、を包含する。

【００１１】 本発明はまた、ヒトおよび動物におけるＮＴＲ−１発現組織の検出に有用なヒ
トＮＴＲ−１をコードする核酸配列内に含まれる配列とハイブリダイズし得る核
酸プローブを提供する。

【００１２】 本発明はさらに、ヒトＮＴＲ−１に指向される抗体を提供する。

【００１３】 本発明にはまた、診断のおよび治療の有効性を有する。本発明の特定の実施態
様において、本明細書に記載されるレセプターの機能または発現における異常を
検出する方法は、この障害の診断に使用され得る。他の実施態様において、この
レセプターと結合するレセプターまたはアゴニストまたはアンタゴニストの操作
は、疾患の処置に使用され得る。さらなる実施態様において、このレセプターの
細胞外ドメインは、レセプターのその標的への結合をブロックするブロッキング
剤として利用される。

【００１４】 本発明のさらなる実施態様において、過剰のＮＴＲ−１で障害を受ける患者は
、このヒトＮＴＲ−１遺伝子コード領域と一致する効果のある量のアンチセンス
ＲＮＡまたはアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドを投与することで処
置され得、これによりＮＴＲ−１の発現を減少する。

【００１５】 （発明の詳細な説明） 本発明は、単離されたヒトＮＴＲ−１ポリペプチド、ならびにヒトＮＴＲ−１
アミノ酸配列、またはアッセイ認識可能なヒトＮＴＲ−１特異的活性を有するそ
の機能的ヒトＮＴＲ−１ポリペプチドドメインを含む組換えポリペプチドを含む
ヒトＮＴＲ−１ポリペプチドを提供する。従って、このポリペプチドは、開示さ
れたヒトＮＴＲ−１ポリペプチドの欠失変異体であり得、そして例えば、非ヒト
ＮＴＲ−１ポリペプチドとの融合産物として提供され得る。本発明のヒトＮＴＲ
−１ポリペプチドドメインは、ヒトＮＴＲ−１特異的活性または機能を有する。

【００１６】 ヒトＮＴＲ−１についての多くの適用は、その特性から示唆される。ヒトＮＴ
Ｒ−１は、ＴＮＦを使用して処置されるものと同様の症状の研究および処置に有
用であり得る。さらに、ヒトＮＴＲ−１ ｃＤＮＡは、例えば、細胞株における
ポリペプチドについてのアッセイにおける抗体の使用、あるいはオリゴヌクレオ
チドプライマーに対する配列類似性を有するものを増幅するためおよびどれくら
い多くのヒトＮＴＲ−１が存在するかを知るためのＰＣＲテストにおけるプライ
マーとしてのオリゴヌクレオチドの使用による、診断ツールとして有用であり得
る。もちろん、ヒトＮＴＲ−１の単離も、その推定リガンド、他のヒトＮＴＲ−
１結合ポリペプチドを単離するため、および／またはその特性を研究するための
手がかりを提供する。

【００１７】 ヒトＮＴＲ−１特異的活性または機能は、便利なインビトロ、細胞ベースの、
またはインビボアッセイ−例えば、インビトロ結合アッセイ、細胞培養アッセイ
、動物（例えば、免疫応答、遺伝子治療、トランスジェニックなど）などによっ
て決定され得る。結合アッセイは、結合標的とヒトＮＴＲ−１ポリペプチドとの
特異的分子相互作用が評価される何らかのアッセイを包含する。この結合標的は
、天然の結合標的、または抗体のような特異的免疫ポリペプチドのような非天然
結合標的、または以下に記載のアッセイで同定されるようなヒトＮＴＲ−１特異
的薬剤であり得る。

【００１８】 本発明のポリペプチドは、単離されたまたは純粋であり得−「単離された」ポ
リペプチドはその天然の状態で会合される物質のいくつかをもはや付随せず、そ
して好ましくは所定の試料中の総ポリペプチド重量の少なくとも約０．５％、お
よびより好ましくは少なくとも約５％を構成するものであり；「純粋な」ポリペ
プチドは、所定の試料中の総ポリペプチドの重量の少なくとも約９０％、および
好ましくは少なくとも約９９％を構成する。本発明のポリペプチドおよびポリペ
プチドドメインは、合成され、組換え技術によって産生され、または細胞から精
製され得る。広範な種々の分子および生化学的方法が、本発明の組成物の生化学
的合成、分子発現、および精製に利用可能であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ （Ａｕｓｕｂｅｌら編， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ． Ａｓｓｏｃ．，
Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ＮＹ）を参照のこと。

【００１９】 本発明のポリペプチドは、免疫原として、スクリーニングアッセイにおける標
的として、細胞増殖、分化、および／または機能などを調節するための生物活性
試薬としての使用を含む、広範な種々の使用を見いだす。例えば、本発明は、添
加されたポリペプチドが培地の成分および／または細胞の生理機能の変化に影響
を及ぼす細胞外表面と特異的に相互作用する条件下で、外因性ヒトＮＴＲ−１ポ
リペプチドと細胞または細胞のまわりの培地とを接触させることによって、細胞
外表面を含む細胞の生理機能を調節するための方法を提供する。これらの方法に
よれば、細胞外表面は、血漿膜関連レセプターを含み；外因性ヒトＮＴＲ−１は
、細胞によって生成されないか、またはそうであれば非天然レベル、時期、また
は生理学的位置で発現されるポリペプチドをいい；そして適切な培地は、インビ
トロ培養培地および血液、滑液などのような生理学的液体を含む。ポリペプチド
は、マイクロインジェクション、組換え酵素のプロモーター特異的発現、脂質ベ
シクルの標的された送達などのような何らかの便利な方法によって、細胞の特異
的集団中で導入、発現、または抑制され得る。

【００２０】 本発明は、ヒトＮＴＲ−１特異的結合剤、このような薬剤を同定および製造す
る方法、ならびに診断、治療、および薬学的開発におけるその使用を提供する。
ヒトＮＴＲ−１特異的結合剤は、体細胞で組換えたタンパク質レセプター様特異
的抗体またはＴ細胞抗原レセプターのようなヒトＮＴＲ−１特異的レセプターを
含み（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと）、そしてまた、１、２、
および３ハイブリッドスクリーニングのようなアッセイで同定した他の結合剤、
ならびに以下に記載のような化学ライブラリーのスクリーニングで同定される非
天然結合剤を含む。特定の目的の薬剤は、ヒトＮＴＲ−１機能を調節する。

【００２１】 本発明は、ヒトＮＴＲ−１核酸を提供し、これは、翻訳可能な転写物、ハイブ
リダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー、診断核酸などとしての使用、な
らびにヒトＮＴＲ−１遺伝子および遺伝子転写物の存在を検出することならびに
追加のヒトＮＴＲ−１ホモログおよび構造アナログをコードする核酸を検出また
は増幅することにおける使用を包含する、広範な種々の適用を見いだす。

【００２２】 本発明の核酸は、合成／非天然配列であり、および／または単離される、すな
わち、その天然状態で会合される物質のいくつかをもはや付随せず、好ましくは
所定の画分に存在する総核酸の重量の少なくとも約０．５％、より好ましくは少
なくとも約５％を構成し、そして通常組換えは、非天然配列または天然染色体上
で連結される以外のヌクレオチドに連結される天然配列を含むことを意味する。
本明細書に開示されるヌクレオチド配列およびそのフラグメントを含む核酸は、
天然の染色体上で連結されるもの以外の配列に直に隣接した、または天然の染色
体上で連結されるもの以外の配列に直に隣接する１０ｋｂより少ない、好ましく
は２ｋｂより少ないネイティブのフランキング領域に隣接した末端に、このよう
な配列またはフラグメントを含む。核酸は、通常、ＲＮＡまたはＤＮＡであるが
、しばしば、他の塩基を含む核酸あるいは改変された安定性を提供するためのヌ
クレオチドアナログなどを使用するために有利である。

【００２３】 開示されたヒトＮＴＲ−１ポリペプチドのアミノ酸配列は、選択された発現系
（Ｈｏｌｌｅｒら （１９９３） Ｇｅｎｅ １３６： ３２３−３２８；Ｍａ
ｒｔｉｎら （１９９５） Ｇｅｎｅ １５４： １５０−１６６）について最
適化されたヒトＮＴＲ−１ポリペプチドをコードする核酸を逆翻訳するために使
用され、または天然のヒトＮＴＲ−１をコードする核酸配列の単離における使用
のための縮重オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを生成するために使
用される（「ＧＣＧ」ソフトウエア， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
Ｇｒｏｕｐ， Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）。ヒトＮＴＲ−１をコー
ドする核酸は、発現ベクターの一部であり得、そして例えば、発現およびスクリ
ーニングのため、トランスジェニック動物のため、ヒトＮＴＲ−１媒介シグナル
形質導入と関連する疾患についての候補薬物の有効性のような機能的研究のため
などに、組換え宿主細胞に組み込まれ得る。発現系は、代替翻訳後プロセシング
によってヒトＮＴＲ−１ポリペプチド構造的および機能的改変体に影響を及ぼす
ために選択および／または適合される。

【００２４】 本発明はまた、ヒトＮＴＲ−１ ｃＤＮＡ特異的配列を有しおよび配列番号１
との特異的ハイブリダイゼーションをもたらすために十分な核酸ハイブリダイゼ
ーションプローブおよび複製／増幅プライマーを提供する。特異的ハイブリダイ
ゼーションを証明することは、一般的に、ストリンジェント条件を必要とし、こ
の条件は、例えば、５×ＳＳＰＥ（０．１８Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＮａＰ
Ｏ₄、ｐＨ ７．７、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ）緩衝液中３０％ホルムアミドを 含む緩衝液中で４２℃の温度にてハイブリダイズすること、および０．２×ＳＳ
ＰＥで４２℃にて洗浄する場合に結合したままであること；好ましくは５×ＳＳ
ＰＥ緩衝液中５０％ホルムアミドを含む緩衝液中で４２℃の温度にてハイブリダ
イズすることおよび４２℃の０．２×ＳＳＰＥ緩衝で４２℃にて洗浄する場合に
結合したままであることである。ヒトＮＴＲ−１ ｃＤＮＡホモログはまた、Ｂ
ＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら （１９９０） Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａ
ｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．
２１５： ４０３−４１０）のようなアラインメントアルゴリズムを使用して他
のポリペプチドとは区別され得る。

【００２５】 ヒトＮＴＲ−１ハイブリダイゼーションプローブは、臨床および実験室試料に
おいて野生型および変異体対立遺伝子を同定することにおける使用を見いだす。
変異体対立遺伝子は、高処理能力比臨床診断のための対立遺伝子特異的オリゴヌ
クレオチド（ＡＳＯ）プローブを生成するために使用される。ヒトＮＴＲ−１核
酸はまた、活性ヒトＮＴＲ−１の細胞発現または細胞内濃度または利用可能性を
調節するために使用される。ヒトＮＴＲ−１阻害核酸は、代表的には、開示され
たヒトＮＴＲ−１コード配列の相補物を含むアンチセンス−一本鎖配列である。
所定のヒトＮＴＲ−１ポリペプチドの発現のアンチセンス調節は、遺伝子調節配
列に作動可能に連結したアンチセンス核酸を用い得る。細胞は、遺伝子の転写が
、内因性ヒトＮＴＲ−１をコードするｍＲＮＡに結合し得るアンチセンス転写物
を得るように配向したプロモーター配列とともにヒトＮＴＲ−１配列を含むベク
ターでトランスフェクトされる。アンチセンス核酸の転写は、構成的または誘導
性であり得、そしてベクターは、安定な染色体外維持または組込みを提供し得る
。あるいは、所定のヒトＮＴＲ−１ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡまた
はｍＲＮＡに結合する一本鎖アンチセンス核酸は、標的されたポリペプチドの発
現における実質的な減少を生じる濃度で、宿主中でまたは宿主から一時的に単離
される標的細胞に投与され得る。ヒトＮＴＲ−１発現における富化は、対応する
遺伝子産物の機能的発現を増加させるヒトＮＴＲ−１核酸を標的された細胞タイ
プに導入することによってもたらされる。このような核酸は、ヒトＮＴＲ−１発
現ベクター、内因性対立遺伝子の機能的発現をアップレギュレートするベクター
、または変異体対立遺伝子の標的された修正についての置換ベクターであり得る
。生存可能な細胞への核酸の導入のための技術は、当該技術分野で公知であり、
そしてレトロウイルスベースのトランスフェクション、ウイルスコートタンパク
質−リポソーム媒介トランスフェクションなどを含む。

【００２６】 本発明は、ヒトＮＴＲ−１調節可能な細胞機能のレベルで活性な薬剤について
、薬剤、化合物、先導化合物を同定する効率的方法を提供する。一般的に、これ
らのスクリーニング方法は、天然のヒトＮＴＲ−１結合標的とのヒトＮＴＲ−１
の相互作用を調節する化合物についてアッセイする工程を包含する。タンパク質
−タンパク質結合アッセイ、イムノアッセイ、細胞ベースのアッセイなどを含む
、結合剤についての広範な種々のアッセイが提供される。好ましい方法は、先導
化合物についての化学ライブラリーの自動化された費用効率の良い高処理能力ス
クリーニングに従う。

【００２７】 インビトロ結合アッセイは、ヒトＮＴＲ−１ポリペプチドを含む成分の混合物
を用い、これは、他のペプチドまたはポリペプチド、例えば、検出または固定の
ためのタグなどとの融合産物の一部であり得る。アッセイ混合物は、天然のヒト
ＮＴＲ−１結合標的を含む。ネイティブな結合標的は使用され得るが、一部がア
ッセイで便利に測定可能な本発明のヒトＮＴＲ−１に対する結合親和性およびア
ビディティーを提供する限り、その一部を使用することが、しばしば好ましい。
アッセイ混合物はまた、候補薬理学的薬剤を含む。候補薬剤は、多数の化学クラ
スを含むが、代表的には、これらは、有機化合物、好ましくは小有機化合物であ
り、そして合成または天然化合物のライブラリーを含む広範な種々の供給源から
得られる。塩、緩衝剤、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、洗浄剤、プロ
テアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤などのような種々の
他の試薬も含まれ得る。混合物成分は、必須の結合を提供する任意の順序で添加
され得、そしてインキュベーションは、最適結合を容易にする任意の温度で行わ
れ得る。混合物は、候補薬理学的薬剤の存在がなければ、ヒトＮＴＲ−１が、参
照結合親和性を有する細胞結合標的、一部、またはアナログを特異的に結合する
条件下でインキュベートされる。インキュベーション期間は、最適結合について
選択されるが、迅速な高処理能力比スクリーニングを容易にするためにも最小に
される。

【００２８】 インキュベーション後、ヒトＮＴＲ−１と１つ以上の結合標的との間の薬剤で
偏った結合は、何らかの便利な方法によって検出される。無細胞結合タイプアッ
セイについては、分離工程が、結合していない成分と結合した成分を分離するた
めにしばしば使用される。分離は、沈殿、固定などによって、次いで、例えば、
メンブラン濾過またはゲルクロマトグラフィーによる洗浄によって、もたらされ
得る。無細胞結合アッセイについては、成分の１つは、通常、標識を含むかまた
は標識に結合される。標識は、放射活性、発光、光学または電子密度などのよう
な直接的検出、あるいはエピトープタグ、酵素などのような間接的検出を提供し
得る。例えば、光学または電子密度、放射発光、非放射エネルギー転移によって
、または抗体結合体で間接的に検出されるなどの、標識の性質および他のアッセ
イ成分に依存して標識を検出するために、種々の方法が使用され得る。薬剤の存
在下での結合親和性と比較して薬剤の不在下での標的に対するヒトＮＴＲ−１ポ
リペプチドの結合親和性の差は、薬剤が、対応する結合標的へのヒトＮＴＲ−１
ポリペプチドの結合を調節することを示す。本明細書で使用される場合、差は、
統計学的に有意であり、そして好ましくは、少なくとも５０％、より好ましくは
少なくとも９０％差を示す。

【００２９】 本発明は、培地と接触して細胞外表面を含む細胞の生理機能を改変する方法を
提供し、この方法は、このポリペプチドが、この細胞の生理機能の変化に影響を
及ぼすためのこの培地および細胞外表面の少なくとも１つの成分と特異的に相互
作用する条件下で、外因性ヒトＮＴＲ−１ポリペプチドとこの培地とを接触させ
る工程を包含する。

【００３０】 本発明は、生物学的に活性な薬剤についてスクリーニングする方法をさらに提
供し、この方法は、ａ）この薬剤の存在がなければ、ポリペプチドが参照親和性
で結合標的を特異的に結合する条件下で、細胞外ヒトＮＴＲ−１ポリペプチド特
異的結合標的および候補薬剤の存在下でヒトＮＴＲ−１ポリペプチドをインキュ
ベートする工程；ｂ）薬剤で偏った親和性を決定するためにこの結合標的に対す
るこのポリペプチドの結合親和性を検出する工程であって、ここで薬剤で偏った
親和性と参照親和性との間の差が、この薬剤がこの結合標的へのポリペプチドの
結合を調節することを示す、工程を包含する。

【００３１】 本発明の１つの実施態様は、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む単離された
ヒトＮＴＲ−１ポリペプチドまたはヒトＮＴＲ−１特異的活性を有するそのフラ
グメントである。

【００３２】 本発明の他の実施態様は、本明細書に記載のアミノ酸配列を含むヒトＮＴＲ−
１ポリペプチドをコードする組換え核酸またはヒトＮＴＲ−１特異的活性を有す
るそのフラグメントである。

【００３３】 さらに他の実施態様は、本明細書に記載のヌクレオチド配列を含む単離された
核酸、または少なくとも１８の連続する塩基を有しそして天然のヒトＮＴＲ−１
ｃＤＮＡの存在下で本明細書に記載の配列を有する核酸と特異的にハイブリダ
イズするために十分なそのフラグメントである。

【００３４】 本発明はまた、例えば、診断適用においてポリペプチドの検出に有用である本
明細書に記載のヒトＮＴＲ−１ポリペプチドに対する抗体を提供する。このヒト
ＮＴＲ−１ポリペプチドに対するモノクローナル抗体の調製については、培養物
中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する何らかの技術が使用され得る。
例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ （１９７５， Ｎａｔｕｒｅ
２５６：４９５−４９７）によって最初に開発されたハイブリドーマ技術、なら
びにトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら， １９
８３， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２）、およびヒトモノクロ
ーナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら， １９
８５，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ
Ｔｈｅｒａｐｙ」， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． ７７−９６頁
）などは、本発明の範囲内である。

【００３５】 診断または治療使用のためのモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体
またはキメラヒト−マウス（または他の種）モノクローナル抗体であり得る。ヒ
トモノクローナル抗体は、当該技術分野で公知の多くの技術のいずれかによって
作製され得る（例えば、Ｔｅｎｇら， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０：７３０８−７３１２；Ｋｏｚｂｏ
ｒら， １９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２−７９；Ｏ
ｌｓｓｏｎら， １９８２， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ９２：３−１６
）。ヒト定常領域とともにマウス抗原結合ドメインを含むキメラ抗体分子が調製
され得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃ
ａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１：６８５１， Ｔａｋｅｄａら， １９
８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２）。

【００３６】 当該技術分野で公知の種々の手順は、本明細書に記載のヒトＮＴＲ−１ポリペ
プチドのエピトープに対するポリクローナル抗体の産生について使用され得る。
抗体の産生について、種々の宿主動物は、ヒトＮＴＲ−１ポリペプチド、あるい
はそのフラグメントまたは誘導体の注射によって免疫され得、これにはウサギ、
マウス、およびラットが含まれるがこれらに限定されない。宿主種に依存して、
免疫学適応答を増加させるために種々のアジュバントが使用され得、これには、
フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのような無機物ゲル、リ
ゾレシチンのような表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペ
プチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、お
よびＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのような潜在的に有用なヒトアジュバ
ントを含むが、これらに限定されない。

【００３７】 選択されたヒトＮＴＲ−１ポリペプチドエピトープに対する抗体の分子クロー
ンは、公知の技術によって調製され得る。組換えＤＮＡ方法論（例えば、Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら， １９８２， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋを参照のこと）は、モノクローナル抗体分子、またはその抗原結合領
域をコードする核酸配列を構築するために使用され得る。

【００３８】 本発明は、抗体分子およびこのような抗体分子のフラグメントを提供する。分
子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、公知の技術によって生成され得
る。例えば、このようなフラグメントは、抗体分子のペプシン切断によって産生
され得るＦ（ａｂ’）₂フラグメント；Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントのジスルフ ィド架橋を還元することによって生成され得るＦａｂ’フラグメント；ならびに
パパインおよび還元剤で抗体分子を処理することによって生成され得るＦａｂフ
ラグメントを含むが、これらに限定されない。抗体分子は、公知の技術、例えば
、免疫吸着または免疫アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ（高速液体
クロマトグラフィー）のようなクロマトグラフ方法、またはその組み合わせによ
って精製され得る。

【００３９】 以下の実施例は、例示によって提供され、そして限定を提供するものではない
。

【００４０】 （実施例１ ヒトＮＴＲ−１遺伝子のクローニングおよび配列決定） ＴＮＦファミリーの公知のヒトおよびマウスメンバーのアミノ酸配列を、ｍＲ
ＮＡ配列のランダムフラグメントのＮＩＨ ＥＳＴデータベースを検索するため
のｔｂｌａｓｔｎ疑問として使用した（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓｔｅｐｈｅｎ
Ｆ．， Ｗａｒｒｅｎ Ｇｉｓｈ， Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ， Ｅｕｇｅｎｅ
Ｗ． Ｍｙｅｒｓ， およびＤａｖｉｄ Ｊ． Ｌｉｐｍａｎ （１９９０）
． Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．
Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−１０）。各疑問は、ヒットの
リスト、すなわち、疑問配列に対する実質的な配列類似性を有するＥＳＴ配列を
生成した。代表的には、リストの上部におけるヒットは、疑問タンパク質のｍＲ
ＮＡコピー、次いでファミリーおよびランダム−チャンス類似性の他のメンバー
に由来するＥＳＴに対応した。

【００４１】 ｐａｒｓｅｒプログラムを使用して、ファミリーのメンバーのすべてとの検索
からヒットのすべてを組み合わせおよび分類した。これは、公知のタンパク質に
対応するヒットのすべての迅速な削減を可能にした。残りのヒットを、ファミリ
ーに特徴的な配列モチーフの保存について分析した。追加のデータベース検索を
行って、重複するＥＳＴを同定した。２つのヒトｃＤＮＡクローン、Ｉ．Ｍ．Ａ
．Ｇ．Ｅコンソーシアムからの識別番号３６６３０５（’３０５クローン）およ
び５９２２５６（’２５６クローン）が相同性配列を含むことが識別された。こ
れらのクローン、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＡ０２５６７２およびＡＡ１５５
６４６はＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌ
ｅ，ＡＬ）から入手し、ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒおよび
Ｔａｑ Ｄｉｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔ
ｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して配列決定した。

【００４２】 この’３０５クローンは終止コドンおよびポリＡテールを含有し、従ってこの
分子の３’末端をコードすることを決定した。この’２５６クローンはこの’３
０５クローンの５’末端で、約３００ヌクレオチド長に渡って整列させた。互い
に、この重複クローンは、約２２０アミノ酸のポリペプチドをコードするが、骨
プロテグリンと比較した場合、この５’末端から約８０アミノ酸が不足していた
。さらに、予想したシグナルペプチドについて、または最初のメチオニンについ
てのコード配列が無いので、この’２５６クローンの５’末端は不完全であると
みなされた。次いで、この５’ＲＡＣＥ手順を、このシグナルペプチドを含む６
３個の不足アミノ酸をコードするヌクレオチド配列を得るために使用した。この
コード配列と隣接するＰＣＲプライマーを使用して、この全コード配列を含む単
一フラグメントを構築した。次いで、ヒトＮＴＲ−１の配列を、配列決定により
、さらに確認した。ヒトＮＴＲ−１のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を本
明細書に示す。ノーザン分析は、成体肺、骨格筋、腎臓、胎盤、および膵臓、な
らびに胎児心臓および胃におけるヒトＮＴＲ−１転写物を明らかにした。

【００４３】 先の発明は、理解の明確さのために、図解および実施例によりいくらか詳細に
記載されたが、特定の変化および改変は、この添付の請求項の精神または範囲か
ら逸脱することなく、さらになされ得ることは、本発明の教示に照らして当業者
に容易に明らかである。

【００４４】 本発明は、本明細書に記載される特定の実施態様による範囲に限定されない。
実際は、本発明の種々の改変は、本明細書に記載されたものに加えて、上述およ
び添付図から、当該者に明らかになる。このような改変は、この添付の請求の範
囲の範囲内にあることが意図される。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 マシアコウスキ， ピオトル ジェイ. アメリカ合衆国 ニューヨーク 12569, プレザント バレー， ボックス 404, ホルター レーン (72)発明者 モリス， ジョディ アメリカ合衆国 ニューヨーク 10956, ニュー シティ， ブリストル コート ３ (72)発明者 バレンズエラ， デイビッド エム. アメリカ合衆国 ニューヨーク 10598, ヨークタウン ハイツ， ギオルダノ ドライブ 529 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA63 CA04 DA02 HA01 HA12 HA15 4B064 AG01 AG27 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AA91X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4H045 AA11 AA30 CA40 DA51 EA50 FA74

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトＮＴＲ−１をコードする単離された核酸分子。
2. 【請求項２】 以下からなる群より選択される配列を有する、請求項１に記
   載の単離された核酸分子： （ａ）配列番号１に記載のヒトＮＴＲ−１のコード領域を含むヌクレオチド配
   列； （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズ
   し、そしてヒトＮＴＲ−１の生物学的活性を有する分子をコードする、ヌクレオ
   チド配列；または （ｃ）遺伝コードの縮重がなければ、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列
   にハイブリダイズし、そしてヒトＮＴＲ−１の生物学的活性を有する分子をコー
   ドする、ヌクレオチド配列。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の核酸分子を含むベクター。
4. 【請求項４】 前記核酸分子が、宿主細胞においてその発現を指向し得る発
   現制御配列に作動可能に連結される、請求項３に記載のベクター。
5. 【請求項５】 プラスミドである、請求項３または４に記載のベクター。
6. 【請求項６】 単離されたヒトＮＴＲ−１ポリペプチド。
7. 【請求項７】 配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、単離されたヒト
   ＮＴＲ−１ポリペプチド。
8. 【請求項８】 宿主細胞中に請求項３または４に記載のベクターを含む、ヒ
   トＮＴＲ−１の産生のための宿主−ベクター系。
9. 【請求項９】 前記宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺
   乳動物細胞である、請求項８に記載の宿主−ベクター系。
10. 【請求項１０】 ＮＴＲ−１が前記のとおり産生される条件下で請求項８ま
    たは９に記載の宿主−ベクター系の細胞を増殖させる工程を包含する、ヒトＮＴ
    Ｒ−１を産生する方法。
11. 【請求項１１】 請求項６または７に記載のヒトＮＴＲ−１を特異的に結合
    する抗体。
12. 【請求項１２】 モノクローナル抗体である、請求項１１に記載の抗体。
13. 【請求項１３】 請求項６または７に記載のヒトＮＴＲ−１、およびキャリ
    アを含む、組成物。
14. 【請求項１４】 請求項１１または１２に記載の抗体、およびキャリアを含
    む、組成物。
15. 【請求項１５】 ヒトまたは動物の体の処置の方法における、あるいは診断
    方法における使用のための、請求項６または７に記載のヒトＮＴＲ−１、請求項
    １１または１２に記載の抗体、あるいは請求項１３または１４に記載の組成物。
16. 【請求項１６】 請求項１０に記載の方法によって産生されるポリペプチド
    。
17. 【請求項１７】 免疫グロブリン定常領域に融合されたヒトＮＴＲ−１レセ
    プターの細胞外部分を含む、レセプター体。
18. 【請求項１８】 前記定常領域がヒト免疫グロブリンγ−１定常領域である
    、請求項１７に記載のレセプター体。