JP2000342292A

JP2000342292A - α−ヒドロキシアミドの製造方法

Info

Publication number: JP2000342292A
Application number: JP15644799A
Authority: JP
Inventors: Masato Kawabe; 正人河辺
Original assignee: Daicel Chemical Industries Ltd
Current assignee: Daicel Corp
Priority date: 1999-06-03
Filing date: 1999-06-03
Publication date: 2000-12-12

Abstract

(57)【要約】【課題】 α−ヒドロキシニトリルから対応するα−ヒ
ドロキシアミドを効率よく高い生産速度で製造する。【解決手段】 α―ヒドロキシニトリル（例えば、α−
ヒドロキシニトリルが２−ヒドロキシ−４−（メチルチ
オ）−ブチロニトリル）を水和する能力を有する微生物
又はその処理物を、前記α―ヒドロキシニトリルに作用
させ、対応するアミドに変換させる方法において、反応
系にアルデヒド（例えば、２−ヒドロキシ−３−（メチ
ルチオ）−プロピオンアルデヒド）を添加する。前記ア
ルデヒドは、３ｍＭ〜１０００ｍＭの濃度で添加でき
る。アルデヒドの添加により青酸の生成を抑制でき、α
−ヒドロキシアミドを効率よく生成できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は微生物またはその処
理物をα−ヒドロキシニトリルに作用させるα−ヒドロ
キシアミドの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】α−ヒドロキシアミドおよびそれらの誘
導体は様々な分野で利用される有用な化合物であり、例
えば、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）−ブチルア
ミドを加水分解して得られる２−ヒドロキシ−４−メチ
ルチオ酪酸は家畜、特に家禽の飼料に含硫アミノ酸類の
不足を補う目的で添加される飼料添加物である。

【０００３】近年、α−ヒドロキシアミドを製造する方
法として、微生物またはその処理物を用いて、α−ヒド
ロキシニトリルを水和して、対応するα−ヒドロキシア
ミドに変換する方法が幾つか提案されている。しかしな
がら、これらの微生物またはその処理物の活性は未だ十
分に高いとはいえず、高活性な水和能力を持つ微生物の
探索が精力的に行なわれている。

【０００４】α−ヒドロキシニトリルをα−ヒドロキシ
アミドに変換する酵素（ニトリルヒドラターゼ）の活性
は青酸により阻害されることが知られている。そのた
め、ＷＯ９８／３２８７２号明細書では、原料として、
青酸含有量が０．５モル％以下のα−ヒドロキシニトリ
ルを使用することが提案されている。しかし、α−ヒド
ロキシニトリルは、水溶液中でその一部が対応するアル
デヒドと青酸とに分解するので、原料α−ヒドロキシニ
トリル中の青酸量を低減させても、反応液中の青酸濃度
を、ニトリルヒドラターゼ活性が阻害されない程度にま
で低減することは困難であり、α−ヒドロキシニトリル
の水和反応は、青酸によりニトリルヒドラターゼ活性が
阻害された条件下で行わざるを得ない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、α−ヒドロキシニトリルから対応するα−ヒドロキ
シアミドを効率よく高い生産速度で製造する方法を提供
することにある。

【０００６】本発明の他の目的は、青酸の生成を抑制し
つつα−ヒドロキシアミドを効率よく生成できる方法を
提供することにある。

【０００７】本発明のさらに他の目的は、α−ヒドロキ
シニトリルの濃度が高くても、微生物のニトリルヒドラ
ターゼ活性を維持でき、α−ヒドロキシアミドを効率よ
く生成できる方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ニトリル
ヒドラターゼ活性は、青酸に対して可逆的に阻害される
が、α−ヒドロキシニトリルに対しては不可逆的に阻害
されること、すなわち、ニトリルヒドラターゼは、α−
ヒドロキシニトリルとの接触により徐々に失活すること
を見出した。従って、ニトリルヒドラターゼ活性を長時
間安定に維持するためには、反応液中のα−ヒドロキシ
ニトリル濃度をできるだけ小さくし、ニトリルヒドラタ
ーゼ活性をできるだけ高めることが必要となる。

【０００９】本発明者らは、これらの知見に基づいて、
ニトリルヒドラターゼ活性を最大限引き出すため、反応
系中の青酸濃度を低減する方法について鋭意検討した結
果、α−ヒドロキシニトリルの分解反応の平衡を制御す
ることによって、青酸の生成を抑制しつつ、α−ヒドロ
キシニトリルから対応するアミド化合物を効率的に生産
できる方法を見いだし、本発明を完成した。

【００１０】すなわち、本発明のα−ヒドロキシルアミ
ドの製造方法では、α―ヒドロキシニトリルを水和する
能力を有する微生物又はその処理物を、前記α―ヒドロ
キシニトリルに作用させて対応するアミドに変換させる
方法であって、反応系にアルデヒドを添加する。前記ア
ルデヒドとしては、α―ヒドロキシニトリルに対応する
アルデヒドなどを用いることができる。反応系（α―ヒ
ドロキシニトリルを水和する能力を有する微生物又はそ
の処理物を、前記α―ヒドロキシニトリルに作用させ、
対応するアミドに変換させる系）にアルデヒドを添加す
ることにより、青酸の生成を抑制できる。

【００１１】

【発明の実施の形態】［α−ヒドロキシニトリル］本発
明のα−ヒドロキシアミドの製造方法において、原料の
α−ヒドロキシニトリルとしては、例えば、下記式
（Ｉ）で表される化合物が挙げられる。

【００１２】

【化１】

【００１３】（式中、Ｒ₁は脂肪族炭化水素基、脂環族
炭化水素基、芳香族炭化水素基又は複素環基を示し、こ
れらの基は置換基を有していてもよい）前記脂肪族炭化水素基には、例えば、アルキル基（メチ
ル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブ
チル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、
オクチル、デシル基などのＣ_1-12アルキル基、好ましく
はＣ_1-6アルキル基など）などの飽和脂肪族炭化水素
基；アルケニル基（ビニル、アリル、１−プロペニル、
イソプロペニル、２−ブテニルなどのＣ_2-12アルケニル
基など）、アルキニル基（エチニル、２−プロピニルな
どのＣ_2-12アルキニル基など）などの不飽和脂肪族炭化
水素基などが含まれる。

【００１４】脂環族炭化水素基には、シクロアルキル基
（例えば、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキ
シル、シクロオクチル基などのＣ_3-10シクロアルキル基
など）などの飽和脂環族炭化水素基；シクロアルケニル
基（シクロペンテニル、シクロヘキセニル基などのＣ
_3-10シクロアルケニル基など）などの不飽和脂環族炭化
水素基などが含まれる。

【００１５】芳香族炭化水素基としては、例えば、フェ
ニル、ナフチルなどのＣ_6-14アリール基などが例示でき
る。

【００１６】複素環基には、例えば、窒素原子、酸素原
子及び硫黄原子から選択された少なくとも１つの異種原
子をヘテロ原子として含む複素環基が含まれる。複素環
基は、芳香族性複素環基、非芳香族性複素環基、縮合複
素環基のいずれであってもよい。前記複素環基に対応す
る複素環としては、例えば、ピロリン、ピロール、ピペ
リジン、ピペラジン、ピリジン、ピリミジン、ピリダジ
ン、トリアゾール、キノリンなどの窒素原子含有複素
環；テトラヒドロフラン、フラン、ピランなどの酸素原
子含有複素環；テトラヒドロチオフェン、チオフェンな
どの硫黄原子含有複素環；チアゾリン、チアジアゾリ
ン、チアゾール、チアジン、モルホリンなどの窒素原
子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれた少なくとも２つ
のヘテロ原子を有する複素環などが挙げられる。

【００１７】Ｒ₁で示される基は、ハロゲン原子（例え
ば、塩素原子、臭素原子など）、ヒドロキシル基、アル
コキシ基（例えば、メトキシ、エトキシなどのＣ_1-6ア
ルコキシ基など）、アリールオキシ基（例えば、フェノ
キシなど）、アルキル基（メチル、エチル、プロピル、
イソプロピルなどのＣ_1-6アルキル基など）、アリール
基（フェニル、トリル、クロロフェニル、ナフチルなど
のＣ_6-14アリール基など）、オキソ基、チオール（メル
カプト）基、アルキルチオ基（例えば、メチルチオ（メ
チルメルカプト）、エチルチオなどのＣ_1-6アルキルチ
オ基など）、アリールチオ基（例えば、フェニルチオな
どのＣ_6-14アリールチオ基など）、カルボキシル基、エ
ステル基（例えば、メトキシカルボニルなどのＣ_1-6ア
ルコキシカルボニル基；アセトキシなどのＣ_2-12アシル
オキシ基など）、アシル基（例えば、アセチル、ベンゾ
イルなどのＣ_2-12アシル基）、アミノ基、モノまたはジ
置換アミノ基（例えば、メチルアミノ、ジメチルアミノ
などのモノまたはジ−Ｃ_1- ₆アルキルアミノ基）、ニト
ロ基などの置換基を有していてもよい。置換基の個数
は、例えば、１〜４程度である。

【００１８】好ましいＲ₁には、例えば、炭素数１〜１
２（好ましくは１〜６）程度のアルキル基、炭素数２〜
１２程度のアルケニル基、炭素数２〜１２程度のアルキ
ニル基、炭素数３〜１０程度のシクロアルキル基、炭素
数６〜１４程度のアリール基、及びＣ_7-10アラルキル基
（フェニルメチル、２−フェニルエチル、１−フェニル
エチル、３−フェニルプロピル、４−フェニルブチル基
など）などが含まれる。

【００１９】ヒドロキシニトリルの炭素数は、例えば、
２〜１８、好ましくは３〜１２、さらに好ましくは３〜
８程度である。

【００２０】α−ヒドロキシニトリルの具体的な例とし
て、例えば、ヒドロキシアセトニトリル、ラクトニトリ
ル、ヒドロキシメチルチオアセトニトリル、アセトンシ
アンヒドリン、２−メチルチオラクトニトリル、ヒドロ
キシジメチルチオアセトニトリル、２−ヒドロキシブチ
ロニトリル（α−ヒドロキシブチロニトリル）、２−ヒ
ドロキシ−４−メチルチオブチロニトリル、２−ヒドロ
キシ−２−メチルブチロニトリル、２−ヒドロキシ−３
−メチルブチロニトリル（α−ヒドロキシイソブチロニ
トリル）、２−ヒドロキシ−３−メチルチオブチロニト
リル、２−ヒドロキシペンチロニトリル（α−ヒドロキ
シペンチロニトリル）、２−ヒドロキシヘキシロニトリ
ル（α−ヒドロキシへキシロニトリル）、２−ヒドロキ
シ−４−（メチルチオ）ヘキシロニトリル、２−ヒドロ
キシオクチロニトリル（α−ヒドロキシオクチロニトリ
ル）、３−クロロラクトニトリルなどの飽和脂肪族α−
ヒドロキシニトリル；２−ヒドロキシ−３−ブテンニト
リル、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ−３−ブテンニ
トリル、アクロレインシアノヒドリン、メタクロレイン
シアノヒドリンなどの不飽和脂肪族α−シヒドロキシニ
トリル；２−ヒドロキシ−シクロヘキサンアセトニトリ
ル、シクロペンタノンシアンヒドリン、シクロヘキサノ
ンシアンヒドリンなどの脂環式α−ヒドロキシニトリ
ル；１−シアノ−１−ヒドロキシベンゼン、マンデロニ
トリル、２−ヒドロキシ−３−フェニルブチロニトリ
ル、２−ヒドロキシ−３−フェニル−４−メチルチオブ
チロニトリルなどの芳香族α−ヒドロキシニトリル、ま
たはこれらの置換体などが挙げられる。

【００２１】好ましいα−ヒドロキシニトリルには、α
−ヒドロキシニトリル（ラクトニトリル、アセトンシア
ンヒドリンなどの炭素数３〜８程度の脂肪族α−シアン
ヒドリンなど）、メチルチオ基を有するα−ヒドロキシ
ニトリル（例えば、２−ヒドロキシ−４−（メチルチ
オ）−ニトリル）が含まれる。

【００２２】前記α−ヒドロキシニトリルは、慣用の方
法、例えば、アルデヒド又はケトンにシアン化水素を作
用させる方法、アルデヒド又はケトンと亜硫酸水素ナト
リウムとの付加物に、シアン化カリウムなどのシアン化
アルカリ等を作用させる方法などにより製造できる。

【００２３】［微生物又はその処理物］本発明の方法で
は、微生物としてはニトリルを水和させる能力を有する
ものであればいずれも使用できる。ニトリルから対応す
るアミドを生成させる能力（ニトリルヒドラターゼ活
性）を有する前記微生物として、例えば、以下の微生物
が例示される。

【００２４】（１）ミクロコッカス属：ミクロコッカス
(Micrococcus）ｓｐ．Ａ１１１（ＦＥＲＭＰ−２７
２０）など。

【００２５】（２）バクテリヂウム属：バクテリヂウム
(Bacterdium)ｓｐ．Ｒ３４１（ＦＥＲＭＰ−２７１
９）、バクテリヂウム(Bacterdium)ｓｐ．Ｒ３４０（Ｆ
ＥＲＭＰ−２７１８）など。

【００２６】（３）バチラス属：バチラス（Bacillus)
ｓｐ．Ｒ３３２（ＦＥＲＭＰ−２７１７) 、バチラス
スミシー（Bacillus smithii) ＳＣ−Ｊ０５−１（Ｆ
ＥＲＭＰ−１４０３７，ＦＥＲＭＢＰ−４９３５）
など。

【００２７】（４）ミクロバクテリウム属：ミクロバク
テリウムフラバム(Microbacterium flovum) ＩＡＭ
１６４２など。

【００２８】（５）シュードモナス属：シュードモナス
(Pseudomonas)ｓｐ．ＳＫ８７（ＦＥＲＭＰ−１１３
１１）、シュードモナスクロロラフィス(Pseudomonas
chlororaphis)Ｂ２３（ＦＥＲＭＢＰ−１８７）、シ
ュードモナス(Pseudomonas)ｓｐ．ＰＳ１（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１８８）、シュードモナス(Pseudomonas)ｓｐ．
ＭＹ−１（ＦＥＲＭＰ−９１７４）など。

【００２９】（６）アルカリゲネス属：アルカリゲネス
(Alcaligenes)ｓｐ．ＢＣ１６−２（ＦＥＲＭＰ−１
１２７６）など。

【００３０】（７）コリネバクテリウム属：コリネバク
テリウムニトリロフィラス(Corynebacterium nitrilo
philus) ＡＴＣＣ２１４１９、コリネバクテリウム(C
orynebacterium)ｓｐ．Ｎ−７７１（ＦＥＲＭＰ−４
４４５）、コリネバクテリウム(Corynebacterium)ｓ
ｐ．Ｎ−７７４（ＦＥＲＭＰ−４４４６）など。

【００３１】（８）ブレビバクテリウム属：ブレビバク
テリウムインペリアル(Brevibacterium imperiale)Ｂ
−２２２（ＦＥＲＭＰ−２７２１）、ブレビバクテリ
ウム(Brevibacterium)ｓｐ．Ｒ３１２（ＦＥＲＭＰ−
２７２２）、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)ｓ
ｐ．Ｃ２１１（ＦＥＲＭＰ−２７２３）など。

【００３２】（９）ノカルジア属：ノカルジア(Nocardi
a)ｓｐ．Ｎ−７７５（ＦＥＲＭＰ−４４４７）など。

【００３３】（１０）ロドコッカス属：ロドコッカス
ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous) ＡＴＣＣ３
３２７８、ロドコッカスロドクロウス(Rhodococcus r
hodochrous) Ｊ−１（ＦＥＲＭＢＰ−１４７８）、ロ
ドコッカスロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)
ＩＦＭ１５３、ロドコッカスエリスロポリス(Rhodo
coccus erythropolis)ＩＦＯ１２３２０、ロドコッカ
スエリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)ＩＦＭ
１５５、ロドコッカスエリスロポリス(Rhodococcus
erythropolis)ＡＫ３１３２（ＦＥＲＭＢＰ−１０
４０）、ロドコッカス (Rhodococcus)ｓｐ．ｓ−６
（ＦＥＲＭＢＰ−６８７、ロドコッカス(Rhodococcu
s)ｓｐ．ＡＫ３３（ＦＥＲＭＢＰ−１０４７）、ロ
ドコッカスルブロペルチンクタス(Rhodococcus rubro
pertinctus) ＪＣＭ３２０４、ロドコッカス（Rhodoc
occus）ｓｐ．Ｃｒ４（ＦＭＲＭＢＰ−６５９６）、
ロドコッカス（Rhodococcus）ｓｐ．Ａｍ８（ＦＭＲＭ
ＢＰ−６５９５）など。

【００３４】特にロドコッカス（Rhodococcus）ｓｐ．
Ｃｒ４株、ロドコッカス（Rhodococcus）ｓｐ．Ａｍ８
株は、ニトリルからアミドへの変換能力の高い菌株とし
て例示できる。ロドコッカス（Rhodococcus）ｓｐ.Ｃｒ
４株は岡山県岡山市の畑土より採取した土壌から分離さ
れた菌株であり、ロドコッカス（Rhodococcus）ｓｐ.Ａ
ｍ８株は岐阜県岐阜市の水田より採取した土壌から分離
された菌株である。前記菌株は両方とも好気性のグラム
陽性の桿菌である。

【００３５】（１１）アースロバクター属：アースロバ
クター(Arthrobacter)ｓｐ．ＨＲ１（ＦＥＲＭＰ−１
１３０１）、アースロバクターグロビホルミス(Arthr
obacter globisformis) ＩＦＯ１２１３８、アースロ
バクターオウレセンス(Arthrobacter aurescens)ＩＡ
Ｍ１２３４０など。

【００３６】（１２）アグロバクテリウム属：アグロバ
クテリウムラジオバクター(Agrobacterium radiobact
er) ＳＣ−Ｃ１５−１（ＦＥＲＭＢＰ−３８４３）な
ど。

【００３７】（１３）アスペルギルス属：アスペルギル
スニガー(Aspergillus nigar) ＪＣＭ１９２５，２２
６１など。

【００３８】（１４）ペニシリウム属：ペニシリウム
クリソゲナム(Penicillium crysogenum)ＩＦＯ５４７
３など。

【００３９】（１５）コクリオボラス属：コクリオボラ
スミヤビアヌス(Cochliobolus miyabeanus) ＯＵＴ
２０７４など。

【００４０】（１６）フザリウム属：フザリウム(Fusar
ium)ｓｐ．ＭＹ−３（ＦＥＲＭＰ−９１８８）など。

【００４１】（１７）エンテロバクター属：エンテロバ
クター(Enterobacter )ｓｐ．ＭＣ１２７０７（ＦＥＲ
ＭＰ−１２８０１）など。

【００４２】（１８）キサントバクター属：キサントバ
クターフラブス(Xanthobacter flavus) ＪＣＭ１２
０４など。

【００４３】（１９）エルウィニア属：エルウィニア
ニグリフルエンス(Erwinia nigrifluens) ＭＡＦＦ０３
−０１４３５など。

【００４４】（２０）シトロバクター属：シトロバクタ
ーフロンディ(Citrobacter freundii)ＭＣ１２６１５
（ＦＥＲＭＰ−１２３９０）など。

【００４５】（２１）エアロモナス属：エアロモナス(A
eromonas)ｓｐ．ＭＣ１２６１５（ＦＥＲＭＰ−１２
３９０）など。

【００４６】（２２）ゴルドナ属：ゴルドナルブロペ
ルチンクタス(Gordona rubropertinctus) ＪＣＭ３２
０４など。

【００４７】なお、ＩＦＯ番号の付された微生物は
（財）発酵研究所（ＩＦＯ）から、ＡＴＣＣ番号の付さ
れた微生物は、American Type Culture Collection（Ａ
ＴＣＣ）から、ＩＡＭ番号の付された微生物は東京大学
応用微生物研究所（ＩＡＭ）から、ＩＦＭ番号の付され
た微生物は千葉大学生物活性研究所（ＩＦＭ）から、Ｊ
ＣＭ番号の付された微生物は理化学研究所微生物系保存
施設からそれぞれ入手できる。また、ＦＥＲＭ番号の付
された微生物は工業技術院生命工学工業技術研究所に寄
託されている。

【００４８】前記微生物は、α−ヒドロキシニトリルか
らα−ヒドロキシアミド化合物を生成させるのに有用で
あり、前記微生物の菌体又はその処理物を、α−ヒドロ
キシニトリルに作用させることにより、対応するα−ヒ
ドロキシアミド化合物に変換できる。

【００４９】前記微生物を培養する際の培地としては、
微生物が通常資化し得るグルコース、フルクトース、ス
クロース、デキストリン、デンプン等の糖類、グリセロ
ール、ソルビトール、エタノール等のアルコール類、フ
マル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類お
よびその塩類、パラフィン等の炭化水素類などから選択
された少なくとも一種の炭素源；硫酸アンモニウム、硝
酸アンモニウム等の窒素源；硫酸マグネシウム、塩化第
二鉄、塩化コバルト等の無機栄養素や金属を含有する培
地、又はこれらの培地に酵母エキス、肉エキス等の天然
有機窒素源を添加した培地などを用いることができる。

【００５０】前記培地には、必要に応じて、微生物の増
殖を促進する因子、培地のｐＨ保持に有効な緩衝物質、
反応生成物であるアミドの生成能力を高める因子（誘導
源や金属）などを添加してもよい。

【００５１】前記誘導源としては、例えば、各々の微生
物に適したアセトニトリル、イソバレロニトリル、イソ
ブチロニトリル、ベンゾニトリル等のニトリル化合物、
また、アセトアミド、プロピオアミド等のアミド化合物
が含まれる。

【００５２】これらの誘導源及び金属は一種又は二種以
上組み合わせて使用できる。また、前記培地は、液体培
地、固体培地（平板培地など）などであってもよい。

【００５３】微生物の培養は、生育可能な条件下であれ
ばよく、例えば、培地のｐＨは、通常、ｐＨ２〜１２、
好ましくはｐＨ４〜１０、さらに好ましくはｐＨ５〜８
程度であり、培養温度は、例えば、５〜６０℃、好まし
くは1０〜５０℃、さらに好ましくは２０〜４０℃程度
である。培養は、微生物の活性が最大となるまで培養す
ればよく、その期間は、例えば、１０時間〜１０日間程
度、好ましくは１〜４日間程度である。微生物の培養
は、嫌気性又は好気性条件下のいずれで行ってもよい
が、好気性条件下で行うのが好ましい。

【００５４】前記微生物の培養物からの菌体の採取は、
慣用の方法、例えば遠心分離法などにより行うことがで
きる。また、菌体の破砕は、例えば、ホモジナイザーな
どにより機械的に行ってもよく、超音波などを用いて行
ってもよい。

【００５５】前記微生物は、生菌体として用いてもよ
く、菌体処理物として用いてもよい。前記処理物（菌体
処理物）としては、菌体に種々の処理を施したもの、例
えば、菌体破砕物、アセトン処理物、凍結乾燥物、菌体
からの抽出物［酵素（粗酵素又は精製酵素）など］など
が含まれる。これらの菌体又はその処理物は、例えば、
ポリアクリルアミドゲル法、含硫多糖ゲル法（カラギー
ナンゲル法など）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法など
の慣用の方法により固定化して用いてもよい。

【００５６】［アルデヒド］反応系において、α−ヒド
ロキシニトリルの一部は、下記反応式で示されるように
可逆的に解離又は分解するようである。

【００５７】

【化２】

【００５８】（式中、Ｒ₁は、前記式（Ｉ）に同じ。）このような反応系にアルデヒドを添加すると、上記平衡
はα−ヒドロキシニトリル側に移動する。すなわち、ア
ルデヒドの添加により、青酸の生成を抑制でき、青酸に
よるニトリルヒドラターゼ活性の阻害を低減できる。そ
のため、基質（α−ヒドロキシニトリル）は対応するア
ミドに効率よく変換される。従って、基質濃度が比較的
高くても、ニトリルヒドラターゼの高い活性が比較的長
期間維持でき、α−ヒドロキシアミドを効率的に得るこ
とができる。

【００５９】本発明の方法において、反応系に添加され
るアルデヒドとしては、任意のアルデヒドが使用でき、
例えば、下記式（ＩＩ）で表される化合物が挙げられ
る。

【００６０】

【化３】

【００６１】（式中、Ｒ₂は、前記式（Ｉ）におけるＲ₁
と同じ。）上記式（ＩＩ）で表されるアルデヒドの具体的な例とし
ては、例えば、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、
メチルチオアセトアルデヒド、ジメチルチオアセトアル
デヒド、３−メチルチオプロピオンアルデヒド、プロピ
オンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデ
ヒド、４−メチルチオブチルアルデヒド、２−メチルブ
チルアルデヒド、３−メチルブチルアルデヒド、３−メ
チルチオブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、イソバ
レルアルデヒド、カプロンアルデヒド、４−（メチルチ
オ）ヘキシルアルデヒド、オクチルアルデヒド、３−ク
ロロアセトアルデヒド、グリオキサール、グリオキシル
酸、グルタルアルデヒドなどの飽和脂肪族アルデヒド；
アクロレイン、クロトンアルデヒド、メタクロレインな
どの不飽和脂肪族アルデヒド；シクロヘキサナール、シ
クロペンタナールなどの脂環式アルデヒド；ベンズアル
デヒド、２−フェニルプロビオンアルデヒド、２−フェ
ニル−３−メチルチオプロピオンアルデヒドなどの芳香
族アルデヒド、またはこれらの縮合体や置換体などが挙
げられる。これらのアルデヒドは単独で又は二種以上組
み合わせて使用できる。

【００６２】後工程での精製効率を高めるため、好まし
いアルデヒドには、前記基質（α−ヒドロキシニトリ
ル）に対応するアルデヒド（すなわち、式（ＩＩ）にお
いてＲ ₂＝Ｒ₁であるアルデヒド）、例えば、炭素数２〜
７程度の脂肪族アルデヒド、メチルチオ基を有するアル
デヒド（例えば、３−（メチルチオ）−プロピオンアル
デヒド）が含まれる。

【００６３】前記アルデヒドの添加量は、反応を阻害し
ない広い範囲から選択でき、通常、３〜１０００ｍＭ、
好ましくは４〜８００ｍＭ（例えば、４〜５００ｍ
Ｍ）、より好ましくは５〜１００ｍＭの濃度である。ア
ルデヒドの添加量が少なすぎると、α−ヒドロキシニト
リルの分解による青酸の生成を十分に低減できず、多す
ぎると、反応効率が向上しない。

【００６４】α−ヒドロキシニトリルから対応するアミ
ドへの変換は、前記菌体又はその処理物を含む水又は緩
衝液などと、菌体又はその処理物を含む基質（α−ヒド
ロキシニトリル）の有機溶媒（ｎ−ヘキサン、酢酸エチ
ルなどの非水溶性溶媒）溶液とを含む二相系における反
応により行ってもよく、また、菌体又はその処理物を含
む水又は緩衝液の懸濁液に、基質（α−ヒドロキシニト
リル）の緩衝液溶液又は水溶性有機溶媒（エタノールな
ど）溶液を直接添加、混合する単相系の反応により行っ
てもよい。前記基質（α−ヒドロキシニトリル）は完全
に溶解していなくてもよい。また、固定化された菌体又
はその処理物をカラムに充填し、基質（α−ヒドロキシ
ニトリル）の緩衝液溶液を通じて反応させてもよい。

【００６５】反応系の前記菌体又はその処理物の濃度
は、例えば、０．０１〜７０重量％、好ましくは０．０
５〜３０重量％、さらに好ましくは０．１〜１０重量％
程度である。基質濃度は、例えば、０．１〜８０重量
％、好ましくは１〜６０重量％程度、さらに好ましくは
５〜５０重量％程度である。

【００６６】反応温度は反応が進行する程度であればよ
く、例えば、０〜６０℃、好ましくは５〜５０℃、さら
に好ましくは１０〜４０℃程度である。例えば、水溶性
有機溶媒を添加した系においては、反応系の温度が０℃
以下であってもよい。反応ｐＨは、例えば、３〜１２、
好ましくは４〜１０、さらに好ましくは５〜８程度であ
る。反応時間は、例えば１分〜１００時間、好ましくは
５分〜５０時間、さらに好ましくは３０分〜３０時間程
度である。

【００６７】このような反応により、前記α−ヒドロキ
シニトリル化合物は対応するアミド化合物に変換され
る。例えば、α−ヒドロキシニトリルとして、２−ヒド
ロキシ−４−（メチルチオ）ブチロニトリルを用いる
と、２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）ブチルアミド
が得られる。

【００６８】得られたα−ヒドロキシアミド化合物は、
慣用の方法により分離精製できる。例えば、濃縮、イオ
ン交換、電気透析、抽出、晶析、膜分離、遠心分離など
の分離手段に供したり、反応液から菌体を遠心分離、膜
分離などによって除去した後、前記分離手段に供する方
法などにより、目的化合物であるα−ヒドロキシアミド
化合物を分離することができる。

【００６９】生成したα−ヒドロキシアミド化合物から
は、カルボン酸を製造することもできる。例えば、本発
明によって得られたα−ヒドロキシアミド化合物を、特
開平１０−１７９１８３号公報に記載されている方法な
どに従って加水分解することにより、α−ヒドロキシカ
ルボン酸などのカルボン酸を製造できる。特開平１０−
１７９１８３号公報には、微生物をニトリルに作用させ
て対応するアミドを生成させ、このアミドを塩基（水酸
化ナトリウムなどのアルカリ金属水酸化物など）の存在
下で加水分解して対応するカルボン酸の塩を生成させ、
さらにこのカルボン酸の塩を電気透析して対応するカル
ボン酸と塩基とを生成することが開示されている。この
方法と本発明の微生物によるアミド化合物の製造方法と
を組み合わせて用いると、ニトリルの水和触媒として硫
酸を用いることなく重硫酸アンモニウムなどの副生成物
を伴なわずにカルボン酸を得ることもできる。

【００７０】

【発明の効果】本発明では、反応系にアルデヒドを添加
するので、α−ヒドロキシニトリルから対応するα−ヒ
ドロキシアミドを効率よく高い生産速度で製造できる。
また、ニトリルヒドラターゼ活性を阻害するの青酸の生
成を抑制しつつα−ヒドロキシアミドを効率よく生成で
きる。そのため、α−ヒドロキシニトリルの濃度が高く
ても、微生物のニトリルヒドラターゼ活性を維持でき、
α−ヒドロキシアミドを効率よく生成できる。

【００７１】

【実施例】以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細
に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定さ
れるものではない。

【００７２】以下の実施例および比較例で使用される略
語は以下の意味を有する。

【００７３】ＨＭＢＮ：２−ヒドロキシ−４−（メチル
チオ）−ブチロニトリルＭＭＰ：３−（メチルチオ）−プロピオンアルデヒドＨＭＢＡｍ：２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）−ブ
チルアミドＨＭＢＡ：２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）−酪酸以下の実施例および比較例では以下の方法で物質の定量
を行なった。

【００７４】ＨＭＢＮ、ＭＭＰ、ＨＭＢＡｍ及びＨＭＢ
Ａの定量：液体クロマトグラフ法カラム：Ｊ‘ｓｐｈｅｒｅＯＤＳ−Ｍ８０（４．６ｍ
ｍφ×２５０ｍｍＬ、ＹＭＣ製）移動相：０．１％リン酸：アセトニトリル：メタノール
＝８：１：１流量：１．０ｍＬ／分検出器：ＵＶ検出器検出波長：２１０ｎｍカラム温度：４０℃ 青酸の定量：ポストカラム誘導体化法を用いた液体クロ
マトグラフ法カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋＡＭＩＮＯ−Ｎａ（６ｍ
ｍφ×１００ｍｍＬ、島津製作所製）移動相：酒石酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．１）移動相流量：０．６ｍｌ／分反応試薬液：１０ｍＭｏ−フタルアルデヒドのメタノ
ール溶液と２００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
９．２）の混合溶液（１／４（vol／vol））反応試薬流量：０．４ｍｌ／分カラムおよび反応漕温度：５０℃ 反応漕容積：４００μｌ検出器：蛍光検出器励起波長Ｅｘ：３３０ｎｍ蛍光測定波長Ｅｍ：３８０ｎｍ比較例１ [２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）−ブチロニトリ
ル（ＨＭＢＮ）の解離平衡の測定]１０℃に維持したｐ
Ｈ６およびｐＨ８のリン酸緩衝液に、濃度が１．３１重
量％になるようにＨＭＢＮを添加し、ＨＭＢＮの分解に
より生成する青酸および３−（メチルチオ）−プロピオ
ンアルデヒド（ＭＭＰ）の濃度を経時的に測定した。そ
の結果をそれぞれ図１および図２に示す。

【００７５】図１および２から明らかなように、溶液の
ｐＨが高いほどＨＭＢＮの分解速度は速く、ｐＨ６では
平衡に達するまで３時間以上を要したのに対し、ｐＨ８
ではほぼ瞬時に平衡状態に達した。また、平衡時の青酸
濃度とＭＭＰ濃度は溶液のｐＨとは殆ど無関係であっ
た。平衡時の青酸濃度は約３０ｐｐｍであり、ＭＭＰ濃
度は約２００ｐｐｍ（約１．９ｍＭ）であった。

【００７６】実施例１ [ＭＭＰを添加した場合のＨＭＢＮの解離平衡の測定]１
０℃に維持したｐＨ６のリン酸緩衝液に、濃度がそれぞ
れ１．３１重量％および１０００ｐｐｍになるように、
ＨＭＢＮおよびＭＭＰを添加した。ＨＭＢＮの分解によ
り生成する青酸およびＭＭＰの濃度を経時的に測定し
た。その結果をそれぞれ図３および図４に示す。

【００７７】図３および４から明らかなように、平衡時
の青酸濃度は約５ｐｐｍであり、ＭＭＰ濃度は約１２０
０ｐｐｍ（約１２ｍＭ）であった。すなわち、青酸濃度
はＭＭＰを添加しない場合に比べて約６分の１に減少し
た。

【００７８】比較例２１０℃に維持したｐＨ６のリン酸緩衝液に、ＨＭＢＮ
３．２８ｇを添加し、１時間攪拌し、青酸濃度を測定し
たところ１０ｐｐｍであった。

【００７９】この混合液に、ニトリルヒドラターゼ活性
を有する微生物の洗浄菌体[ロドコッカス（Rhodococcu
s）ｓｐ．Ｃｒ４（ＦＭＲＭＢＰ−６５９６）]０．４
０ｇを添加してＨＭＢＮの水和反応を行ない、２−ヒド
ロキシ−４−（メチルチオ）−ブチルアミド（ＨＭＢＡ
ｍ）の濃度を経時的に測定した。その結果を図５に示
す。

【００８０】比較例３ｐＨ６のリン酸緩衝液に代えてｐＨ８のリン酸緩衝液を
用いる以外は比較例２と同様の条件でＨＭＢＮの水和反
応を行い、ＨＭＢＡｍの濃度を経時的に測定した。その
結果を図６に示す。実施例２１０℃に維持したｐＨ６のリン酸緩衝液２４６．０７ｇ
に、ＨＭＢＮ３．２８ｇおよびＭＭＰ０．２５ｇ（９．
６ｍＭ）を添加し、１時間攪拌し、青酸濃度を測定した
ところ４．５ｐｐｍであった。

【００８１】この混合液に、ニトリルヒドラターゼ活性
を有する微生物の洗浄菌体[ロドコッカス（Rhodococcu
s）ｓｐ．Ａｍ８（ＦＭＲＭＢＰ−６５９５）]０．４
０ｇを添加してＨＭＢＮの水和反応を行ない、２−ヒド
ロキシ−４−（メチルチオ）−ブチルアミド（ＨＭＢＡ
ｍ）の濃度変化を経時的に測定した。その結果を図５に
示す。

【００８２】実施例３ｐＨ６のリン酸緩衝液に代えてｐＨ８のリン酸緩衝液を
用いる以外は実施例２と同様の条件でＨＭＢＮの水和反
応を行い、ＨＭＢＡｍの濃度を経時的に測定した。その
結果を図６に示す。

【００８３】実施例４ＭＭＰ０．２５ｇに代えてプロピオンアルデヒド０．２
５ｇ（１７ｍＭ）を用いる以外は実施例２と同様の条件
でＨＭＢＮの水和反応を行ない、ＨＭＢＡｍの濃度を経
時的に測定した。その結果を図５に示す。

【００８４】比較例４ [固定化菌体の調製]κ−カラギーナン（中央化成（株）
製）２．１ｇと０．９重量％食塩水４５．０ｇとを混合
し、７０℃に加熱し、次いで４０℃に冷却した（Ａ
液）。また、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物
の洗浄菌体[ロドコッカス（Rhodococcus）ｓｐ．Ｃｒ４
（ＦＭＲＭＢＰ−６５９６）]８．０ｇと０．９重量
％食塩水８．０ｇとを混合し、４０℃に加熱した（Ｂ
液）。Ａ液とＢ液とを混合し、チューブポンプ（チュー
ブ内径２ｍｍφ）で１０℃に冷却した０．３Ｍ塩化カリ
ウム水溶液中に押出し、外径２ｍｍφの糸状ゲル化物を
得た。この糸状ゲル化物を約１０ｍｍの長さに細断し、
固定化菌体とした。

【００８５】図９にＨＭＢＮ連続水和反応装置のフロー
図を示す。この装置は、α−ヒドロキシニトリルを含む
溶液（仕込み液）を貯蔵する仕込液タンク1と、α−ヒ
ドロキシニトリルに微生物の活性を作用させるため、固
定化された微生物又はその処理物を充填したカラム３
と、このカラムにおいてα−ヒドロキシニトリルから変
換されたα−ヒドロキシアミドを含む反応混合液を貯蔵
する反応液タンク７とを備えている。仕込液タンク１か
らカラム３へ至るラインには、仕込液タンク１内の仕込
み液（基質溶液）をカラム３へ供給するための仕込みポ
ンプ２が設けられている。カラム３は、カラム３内に仕
込み液（基質溶液）を循環させるためのラインを備えて
おり、このラインには、仕込み液を循環させるための循
環ポンプ４が設けられている。さらに、カラム３はジャ
ケット５を備えており、このジャケットには温度調節装
置６からの温度調整用液体が循環している。

【００８６】図９に示す装置のジャケット付ガラス製カ
ラム（２０ｍｍφ×２００ｍｍＬ）に固定化菌体８ｇを
充填した。このカラムにリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
８）を循環ポンプで循環させた。ジャケットに冷却水を
通し、カラム内温度を１０℃に維持した。

【００８７】前記カラムに、仕込み液として８重量％の
ＨＭＢＮを含有するリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）を
速度７ｇ／ｈｒで仕込み、カラム内の液面が一定になる
ように反応液を抜き出した。反応中、反応液中の青酸お
よびＭＭＰ濃度はそれぞれ、約１５ｐｐｍ、１００ｐｐ
ｍ（０．９６ｍＭ）であった。反応液中のＨＭＢＮ、Ｈ
ＭＢＡｍ、ＨＭＢＡ（２−ヒドロキシ−４−（メチルチ
オ）−酪酸）の濃度を経時的に定量した。その結果を図
７に示す。

【００８８】図７から明らかなように、反応時間の経過
に伴い、固定化菌体中のニトリルヒドターゼ活性が低下
し、ＨＭＢＮ濃度が徐々に上昇した。ＨＭＢＮ濃度が２
重量％になるまで要した時間は約８０時間であった。

【００８９】実施例５仕込み液として、８重量％のＨＭＢＮを含有するリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ８）に代えて、８重量％のＨＭＢ
Ｎ及びＭＭＰ１２００ｐｐｍ（１２ｍＭ）を含有するリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）を用いる以外は、比較例
４と同様の条件でＨＭＢＮの連続水和反応を行った。反
応中、反応液中の青酸およびＭＭＰ濃度はそれぞれ、約
５ｐｐｍ、１０００ｐｐｍ（９．６ｍＭ）であった。反
応液中のＨＭＢＮ、ＨＭＢＡｍ、ＨＭＢＡ（２−ヒドロ
キシ−４−（メチルチオ）−酪酸）の濃度を経時的に定
量した。その結果を図８に示す。

【００９０】図８から明らかなように、反応時間の経過
に伴い、固定化菌体中のニトリルヒドターゼ活性が低下
し、ＨＭＢＮ濃度が徐々に上昇した。ＨＭＢＮ濃度が２
重量％になるまで要した時間は約１５０時間であり、比
較例４に比べて約２倍に延びた。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は比較例１における青酸濃度の経時的変化
を示すグラフである。

【図２】図２は比較例１における３−（メチルチオ）−
プロピオンアルデヒド（ＭＭＰ）濃度の経時的変化を示
すグラフである。

【図３】図３は実施例１における青酸濃度の経時的変化
を示すグラフである。

【図４】図４は実施例１におけるＭＭＰ濃度の経時的変
化を示すグラフである。

【図５】図５は、比較例２、実施例２及び実施例４にお
ける結果を示すグラフである。

【図６】図６は、比較例３及び実施例３における結果を
示すグラフである。

【図７】図７は比較例４における結果を示すグラフであ
る。

【図８】図８は実施例５における結果を示すグラフであ
る。

【図９】図９は連続水和反応装置のフロー図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 α―ヒドロキシニトリルを水和する能力
を有する微生物又はその処理物を、前記α―ヒドロキシ
ニトリルに作用させ、対応するアミドに変換させるα−
ヒドロキシアミドの製造方法であって、反応系にアルデ
ヒドを添加するα−ヒドロキシアミドの製造方法。
【請求項２】アルデヒドが、α―ヒドロキシニトリル
に対応するアルデヒドである請求項１記載のα−ヒドロ
キシアミドの製造方法。
【請求項３】アルデヒドを、３〜１０００ｍＭの濃度
で添加する請求項１記載のα−ヒドロキシアミドの製造
方法。
【請求項４】 α−ヒドロキシニトリルがメチルチオ基
を有する請求項１記載のα−ヒドロキシアミドの製造方
法。
【請求項５】 α−ヒドロキシニトリルが２−ヒドロキ
シ−４−（メチルチオ）−ブチロニトリルである請求項
１記載のα−ヒドロキシアミドの製造方法。
【請求項６】２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）−
ブチロニトリルの反応系に、２−ヒドロキシ−３−（メ
チルチオ）−プロピオンアルデヒドを添加する請求項１
記載のα−ヒドロキシアミドの製造方法。
【請求項７】 α―ヒドロキシニトリルを水和する能力
を有する微生物又はその処理物を、前記α―ヒドロキシ
ニトリルに作用させ、対応するアミドに変換させる系に
アルデヒドを添加して、反応系中の青酸の生成を抑制す
る方法。