JPS5928486A - Ｓ−カルボキシメチル−ｌ−システインの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＬ−システィンの誘導体であるＳ−カルボキシ
メチル−Ｌ−システィン（以下、単にカルボキシメチル
システィン又は８ＭＣと略ス。）の製造法に関する。

カルボキシメチルシスティンは気管支炎の治療剤特に去
痰剤あるいは解毒剤等に用途を有する化合物であり、そ
の製造法は入毛の加水分解物から分離される７スチンを
還元してＬ−システィンとし、このＬ−システィｅこモ
ノ・・ロゲノ酢酸ヲ反応する方法で製造されている。

Ｌ−システィンは上記の如く入毛等を原料とするため供
給量に限度があり、これに代る工業的生産方法の開発が
望まれていた。

これに対し、本出願人においては既に、２−アミノ−チ
アゾリン−４−カルボン酸（以下、ＡＴＣと記す。）を
原料とし、微生物の作用を利用してシスティン又はシス
チンを製造する方法（特開昭５１−７０８８１．５１−
５４９８３又は特公昭５４−２２７２号公報参照）を開
発した。

コノ方法はＬ−７ステインの工業生産に適した方法であ
るが、ＡＴＣのシスティンへの氷解反応は反応液中に生
成されるシスティンによって強く阻害されるためシステ
ィンを直接得ることができない。そこで、この方法に於
ては、ＡＴＣを水解してシスティンを生成する反応とシ
スティンのシスチンへの酸化反応を同時に行いＡＴＣ水
解反応に阻害作用のない／スチノを生成させ、このシス
チンを還元して／スティノとする方法を採用せざるを得
ない。従って、このＡＴＣを原料とする方法は工程が長
くかつ煩雑てあり、更に収率の低い点についても改善が
望まれていた。

そこて本発明者等は、ＡＴＣから直接カルボキシメチル
システィンを効率良くかつ高収率で製造する方法を開発
することを目的として鋭意研究を重ねた結果、ＡＴＣを
水解してシスチンを生成する能力を有する微生物をモノ
・・ロゲノ酢酸の存在下でＡＴＣに作用せしめるとカル
ボキシメチル／ステイノが直接高収率で生産できること
を発見した。本発明は、この発見に基づいて完成された
ものである。

本発明で使用する微生物はＡＴＣを水解してシスティン
又はシスチンを生成する能力を有する微生物であり、例
えば特開昭５１−５４９８３．５１−７０８８１及び特
公昭５４−２２７２号公報に記載されているアクロモバ
クタ−、アルカリゲネス、バチルス、ブレビバクテリウ
ム、エンテロバクタ−、エルビニア、エッンエリヒア、
フラボバクテリウム、ミクロコツカス、ミコプラナ、／
ニードモナス、サルシナあるし・はセラチアの容態に属
し、ＡＴＣを水解してシスティン又はシスチンを生成す
る能力を有する微生物であり、より具体的に例示するな
らば次の如き菌株があげられる。

サルシナル・ルティア　　　　　　　　　ＡＴＣＣ２７
２（５ａｒｃｉｎａ　Ｉｕｔｅａ　） アクロモバクタ−・デルマルバア　　　　　　ＦＥＲＭ
−Ｐ　３４８３（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ｄｅｌ
ｍａｒｖａｅ　）アルカリゲネス−デニトリフィカンス
　　　　ＡＴＣＣ１５１７３（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ　）バチルス・プレビス
　　　　　　　　　　　ＡＴＣＣ８１８５（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ　）ブレビバクテリウム・フラノ
弘ＡＴＣＣ１３８２６（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
　　ｆｌａｖｕｍ　）エンテロバクタ−・アエロゲ不ス
　　　　　　ＦＥＲＭ−Ｐ　２７６４（Ｅｎｔｅｒｏｂ
ａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ　）エルビニアＯカロ
トボラ　　　　　　　　　　ＦＥＲＭ−Ｐ　２７６６（
Ｅｒｗｉｍｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ　）シュートモ
ナスーチアゾリノフイラム　　　　ＦＥＲＭ−Ｐ　２８
１０（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｔｈｉａｚｏｌｉｎｏ
ｐｈｉｌｕｍ　）ノユートモナスーデスモリチカ　　　
　　　　ＦＥＲＭ−Ｐ　２８１６（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ　ｄｅｓｍｏｌｙｔｉｃａ　）エッンエリヒアーコ
リ　　　　　　　　　　　　ＦＥＲＭ−Ｐ　２７６３（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）ミクロコッカス
ーソドネン／ス　　　　　　　ＡＴＣＣ１１８８０（Ｍ
ｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　５ｏｄｏｎｅｎｓｉｓ　）ミコ
プラナ・ジモルファー　　　　　　　　　　ＡＴＣＣ４
２４９（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ　ｄｉｍｏｒｐｈａ　）セ
ラチア・マルセッセンス　　　　　　　　　ＦＥＲＭ−
Ｐ　２７６５（５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎ
ｓ　）フラボバクテリウム・アシドフィクム　　　　Ａ
ＴＣＣ８３６６微生物を培養するための培地は炭素源、
窒素源、無機イオン、更に要すれば有機微量栄養素を適
宜含有する培地てあり、例えば、炭素源としてダルコー
ス、シュクロース、キシロース、糖蜜等の糖類、酸１等
の有機酸、エタノール、グリセロール、メタノール等の
アルコール類など、窒素源として硫酸アンモニウム、塩
化アンモニウムナト、有機栄養源として、酵母エキス、
ペプトン、肉エキス、コーン・ステイープリカーなど、
無機イオンとして、マグネシウム、鉄、マンガン、カリ
ウム、ナトリウム、リン酸などのイオンが適宜用いられ
る。

微生物の培養法は常法に従って行えば良く、上記培地の
ｐＨを６〜９とし、２０〜４０℃で好気的に培養すれば
良い。

培養に際してはＡＴＣを少量添加することが望ましくＡ
ＴＣの氷解活性の高い微生物菌体が得られる。本発明の
方法では、このようにして得られた微生物を酵素源とし
て使用する。酵素源としては、このようにして得られた
培養液、培養液から分離した分離菌体、洗滌生菌体、凍
結乾燥体、アセトン乾燥菌体、物理的、化学的もしくは
生化学的に破壊された菌体、抽出液、粗精製物、精製物
、精製蛋白標品、または菌体もしくは精製処理物の固定
化物などが酵素源として使用される。

原料であるＡＴＣは合成法にて供給されるＤ一体、Ｌ一
体、ラセミ体のいずれもが使用される。

基質濃度は、バッチ式、連続式によっても異なるが、バ
ッチ式では一般に水性媒質中０．１〜３０％、好ましく
は０．５〜１０％程度で、連続式では、これよりやや濃
度を低下させた方が好ましい。

モノ・・ロゲノ酢酸としてはモノフルオロ酢酸、モノク
ロル酢酸、モノブロム酢酸、モノヨード酢酸あるいはこ
れらの塩類が使用され、濃度は０．１〜ｌＯ％の範囲が
望ましい。

反応は、普通、水性媒質中で１５〜６０℃、好ましくは
３０〜５０℃附近で、ｐＨ＝６〜１０、好ましくは７．
０〜９．５附近で行われる。反応時間は、静置、攪拌、
流下等の手段あるいは酵素標品の形態、力価によって異
ってくるので一様てはないが、バッチ法では通常１ｏ分
〜７２時間程度である。

反応に際して、ヒドロキシルアミン又はセミ力ルバチト
を添加することが望ましく、反応収率を向上することが
できる。このような条件下、モノ・・ロゲノ酢酸の存在
下でＡＴＣに微生物を作用させるとカルボキシメチル／
スティンが直接反応液中に生成される。

反応液からカルポキ／メチルソスティンを採取する方法
は公知の方法に従って行えばよく、例えばカルポキンメ
チルソスティ／は酸性条件で簡単に結晶化するので反応
液から不溶性物質を除去した後酸性化で結晶化する方法
によって簡単に採取される。

以下、実施例にて説明する。

実施例１ 第１表に示す組成の培地を調製し、５０〇−容振盪フラ
スコに５０＋ｌｌｅ宛分注し、１２０℃にて１０分間加
熱した。

グリセロール　　　　　１．０％ 酵母エキス　　　　　　０．５〃 ペプトン　　　　　　　０，５〃 肉エキス　　　　　　　０．５ ＮａＣＩ　　　　　　　　　　Ｏ、５ ＤＬ−ＡＴＣ０，２ この培地にンユートモナス・デスモリチカＡＪ３８６８
　ＦＥＲＭ−Ｐ　２８１６　　を接種し、３０℃にて２
４時間振盪培養した。培養液を遠心分離して菌体を採取
し、湿菌体５．０２を下記組成の基質溶液１００ｍ１！
に添加し、３０℃に保持し時々軽くかきまぜて８時間反
応を行った。

第２表　　基質溶液の組成（ｐＨ８，０）ＤＬ−ＡＴＣ
２，０？／ｄｌ ＫＨ２ＰＯ４１，０／／ ヒドロキシルアミン塩酸塩０．１５　　ｔｔ反応終了後
、反応液中に生成したカルボキシメチル／スティンをカ
チオン交換樹脂ｒＺＹＰＡＸ　ＳＣＸ　Ｊを用いる高速
液体クロマトグラフィーで定量したところ生成量は０．
９１９７ｄｌであった。

モノクロル酢酸の代りにモノフルオロ酢酸ナトリウム０
．９Ｆ、モノブーム酢酸ナトリウム１．２　Ｉｔ’又は
モノヨード酢酸ナトリウム１．６ｖを用いて同様の反応
を行ったところ、カルボキンメチル／スティンの生成量
は夫々、０．９　ｆ／ｄｉ、　０．８７　ｆ／ｄｉ及び
０．９１　ｆ／ｄｉであった。

実施例２ 実施例１の方法で得られた湿菌体５．０を凍結乾燥した
もの、あるいは湿菌体５．０を０．１Ｍ、ｐＨ７，０の
リン酸緩衝液５０ｍ１に懸濁し、これに超音波処理（ト
ミー精工社製ＬＩＲ−２００Ｐ型、２０ＫＣ，５分間）
したもの、更には湿菌体５．Ｏｖを脱イオン水２０　ｍ
ｌに懸濁し、これにアクリルアミバ３，８ｆとメチン／
ビスアクリルアミド２２５〜を加工、Ｎ２ガスを流して
酸素を除去し、過硫酸アンモニウム１７．５ｍ２及ヒＮ
ｌ、Ｎ′−ジメチルアミノプロピオニトリル４０μ２を
加えて固定化した固定化物を夫々調製した。これらの齋
品を第２表に示す組成の基質溶液１００　ｍｌに加え３
０℃ｔこ１６時間保持して酵素反応を行った。反応終了
後、各反応液より不溶性物質を除去した後、生成したカ
ルボキシメチル／スティンの量を測定した。その結果を
第３表に示す。

第　　３　　表 凍結乾燥標品　　　　　０．８６ 超音波処理標品　　　　０．９゜ 固定化標品　　　　　　０１８２ 実施例３ 第午表に示す微生物を第１表に示す培地で実施例１の方
法に従って培養した。夫々の培養液を遠心分離し、湿菌
体５．Ｏｆを取ってこれを第２表に示す基質溶液１００
　ｍｌに懸濁し、３０℃に２４時間保持して反応を行っ
た。反応終了後、反応液中に生成したカルホキ／メチル
システィンを高速液体クロマトグラフィーで定量した。

その結果を第４表に示す。

第４表　　ＳＭＣの生成量

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）２−アミノ−チアゾリン−４−カルボン酸を水解
   してＬ−システィン又はＬ−シスチンを生成する能力を
   有する微生物をモノ・・ロゲノ酢酸の存在下で２−アミ
   ノ−チアゾリン−４−カルボン酸に作用させて　Ｓ−カ
   ルボキシメチル−Ｌ−システィンを生成せしめ、これを
   採取することを特徴とするＳ−カルボキンメチル−８−
   システィンの製造法。
2. （２）　　アクロモバクタ−属、アルカリ土類金属、バ
   チルス属、ブレビバクテリウム属、エンテロバクタ−属
   、エルビニア属、エッンエリヒア属、フラボバクテリウ
   ム属、ミクロコツカス属、ミコプラナ属、シュードモナ
   ス属、サルシナ属又はセラチア属に属し、２−７ミノー
   チアゾリンー４−カルボン酸を水解してＬ−７ステイン
   又はＬ−シスチンを生成する能力を有する微生物を使用
   することを特徴とする特許請求範囲第１項記載のＳ−カ
   ルボキシメチル−Ｌ−システィンの製造法。