JP2000342290A - ポリペプチド及びポリペプチドの調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 全長ヒト フォン・ヴィレブランド因子前駆
体蛋白質を提供し、及び該ポリペプチドの調製方法を提
供する。 【解決手段】 ｃＤＮＡによってコードされる単離ポリ
ペプチドであって、該ｃＤＮＡが全長ヒト フォン・ヴ
ィレブランド因子前駆体蛋白質の完全なコード配列に相
当するヌクレオチド配列によって表される単離ポリペプ
チド；ｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドを調
製する方法であって、該ｃＤＮＡが全長ヒト フォン・
ヴィレブランド因子前駆体蛋白質の完全なコード配列に
相当するヌクレオチド配列によって表され、該ｃＤＮＡ
を含む宿主細胞を培養する工程及び産生されたポリペプ
チドを単離する工程を含む方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、全長ヒト フォン
・ヴィレブランド因子前駆体蛋白質の完全なコード配列
であるｃＤＮＡによってコードされる単離ポリペプチ
ド、及び該ポリペプチドを調製する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】フォン・ヴィレブランド因子（vWF ）は
約225 kDの分子量（MW）を有する明らかに１つの糖たん
ぱく質から構成されている大きな多量体プラズマたんぱ
く質である。これらのサブユニットは、ジスルフィド結
合によって互いに連結されている。プラスマ内で、vWF
は、２量体から５０以上のサブユニットよりなる多量体
の範囲で、多量体として環化している。２量体は、恐ら
くＣ−末端において、可撓性の“棒状”領域によって結
合されている２つのサブユニットから成っており、多量
化におけるプロトマーであると考えられている。プロト
マーは、大きな、恐らく末端がＮである球状の領域によ
って連結されて、多量体を形成する。

【０００３】vWF は、内皮細胞と巨核球とによって合成
される。このたんぱく質は、まず、２６０kDのグリコシ
ル化前駆体として作られ、次いで、炭化水素処理、硫酸
塩化、二量化、多量化及びたんぱく分解開裂を行ない、
完成２２５kDサブユニットが生成する〔Sporn, L.A., e
t al.(1985) ヒト巨核球におけるvWF たんぱく質の生合
成、J. Clin. Invest.76, 1102-1106; Wagner, D. D.,
et al. (1984) J. ofCell Biology 99, 2123-2130)。 v
WF は、内皮細胞内のヴァイベル−パラーデ体中に貯え
られていることが示されている。これらの小器官が、前
駆体たんぱく質の処理において、役割を演じていること
を否定することはできない。

【０００４】vWF は、止血における臨界的段階に関与す
る。それは、血管損傷後の血小板−血管壁相互作用に含
まれ、血小板栓を形成することになる。vWF には、血小
板糖たんぱく質ＩＢ [Jenkins, C.S.P., et al.(1976)
J. Clin. Invest.69, 1212-1222]、 IIB/III Ａ[Fujimot
o, T., et al.(1982)]腺腫ジホスフェートが、フォン・
ヴィレブランド因子をヒト血小板に結合させる。Nature
297, 154-156)、 コラーゲンタイプＩ及びIII 、並び
に、内皮下層中の未確認の他の成分と特別な相互作用を
示すたんぱく質領域が認められている。これらの確認
は、vWF の特殊な相互作用を抑制することのできるモノ
クロナール抗vWF 抗体に関する研究に基づくものであ
る。vWF たんぱく質の構造−機能関係の深い解析には、
全長vWF cDNAが不可欠であろう。はっきりと定められた
変異をこのcDNAに導入し、その変異cDNAを適当な宿主内
で発現させることによって、vWF たんぱく質内の機能領
域の詳細な位置確認が行なえるであろう。

【０００５】最近、本発明者等は、部分的vWF cDNA連鎖
をクローン形成している [Lynch, D. C., et al.(1985)
Cell 41, 49-56 ; Ginshurg, M., et al. (1985) J. B
iol.Chem. 260, 3931-3936; Verweij, C. L., et al.(1
985)Nucleic Acids Research 13, 4699-4717,オランダ
特許出願85.00961に基づく；Sadler, J. E., et al.(19
85) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82，6394-6398]。 vW
F メッセンジャーRNAに、約9,000nt に延びる短かい
３′未翻訳領域（136nt)が存在することから、vWF 用の
前駆体たんぱく質が、報告されている260kD よりも可成
大きい分子量を持っているものと推測される [Wagner,
D. D., et al. (1984) J. of Cell Biology 99, 2123-2
130]。 全長vWF cDNAによって、前駆体の分子量のなぞが
解明され、その処理過程が確認され、そして、基本構造
が確立されるであろう。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、全長機能性
vWF cDNAにコードされるポリペプチドを提供することに
ある。本発明はまた、該ポリペプチドの調製方法を提供
することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究を
重ね、全長ヒト フォン・ヴィレブランド因子前駆体蛋
白質の完全なコード配列を見出し、本発明を完成するに
至った。従って、本発明は、ｃＤＮＡによってコードさ
れる単離ポリペプチドであって、該ｃＤＮＡが全長ヒト
フォン・ヴィレブランド因子前駆体蛋白質の完全なコ
ード配列に相当し、図３のヌクレオチド２２９−８６７
０によって表される単離ポリペプチドに関する。本発明
はまた、ｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドを
調製する方法であって、該ｃＤＮＡが全長ヒト フォン
・ヴィレブランド因子前駆体蛋白質の完全なコード配列
に相当し、図３のヌクレオチド２２９−８６７０によっ
て表され、該ｃＤＮＡを含む宿主細胞を培養する工程及
び産生されたポリペプチドを単離する工程を含む方法に
関する。

【０００８】本明細書中では、上記発明の他に、全vWF
メッセンジャーRNA に及び、全長機能性vWF cDNAに構成
されるcDNAの単離に言及する。更に、ここでは、上記vW
F cDNAを含有するプラスミド及びファージ、並びに該プ
ラスミド又はファージを含有するバクテリア及び真菌の
ような微生物、動物又はヒト細胞について触れる。ま
た、上記宿主を培養することによって調製されたたんぱ
く質及び得られたたんぱく質の生物学的活性型のものを
含む薬剤組性物も、本明細書中に記載する。この点で、
このような薬剤組成物によって、健康な人間の血液サン
プルから回収されたvWF たんぱく質の投与に課せられる
安全性の問題を打開できることが強調される。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の基礎を形成する研究を達
成するために、次の物質及び方法が用いられた。 物質及び方法cDNAクローニング 全RNA は、ヒトの臍帯の静脈から誘導され、試験管内で
培養された内皮細胞から精製された[Verweij, C. L., e
t al.(1985) Nucleic Acids Research 13, 4699-4717,
オランダ特許出願85.00961に基づく] プライマ支配cDNA
は、本質的にプロトコルに従って合成された[Gubler,
U., et al., (1983) Gene 25, 263-269;Toole, J. J.,
et al., (1985) Nature 312 , 342-347]。 cDNA合成
は、最終濃度がそれぞれ20mM及び0.1 ％になるまで、ED
TAとSDS を加えることにより抑制された。cDNA生成物
を、フェノール−クロロホルムで抽出し、次いでエタノ
ールで沈澱させ、セファデックス（Sephadex) G-50でク
ロマトグラフィーにより精製した。ヌクレオチド6901か
ら6921までに対して相補性のプライマＡ（５′CACAGGCC
ACACGTGGGAGC３′）で、プライマ支配cDNAを合成する場
合は、cDNA生成物をBgl II(6836 及び2141位置）及びKp
n I (4748 位置）で消化した。次いで、消化cDNAを、セ
ファローズ（Sepharose)CL-4B コラムでクロマトグラフ
ィーによりサイズ分別した。

【００１０】約600bp よりも大きいcDNAを含む画分を、
プラスミドpMBL11に結紮し、Bgl IIとKgn I で消化し
た。大腸菌ＤＨＩ株を使用して、約15,000の個々のコロ
ニーからなるcDNA集団を作り、それを２つのオリゴヌク
レオチドプローブ（Ｂ及びＣ）でスクリーニングした。
プローブＢ（５′GAGGCAGGATTTCCGGTGAC３′）は、ヌク
レオチド4819から4839までに対して相補性であり、プラ
スミドpvWF2084の単離に用いられ、2,084bp Bgl II-pn
I vWFcDNA プラグメントを含んでいた。一方、プローブ
Ｃ（５′CAGGGACACCTTTCCAGGGC３′）は2467から2487ま
でに対して相補性であり、プラスミドpvWF2600の検出に
用いられ、約2,600 bpのKpn I-Bgl II vWFcDNAプラグメ
ントを含有していた。

【００１１】プライマ支配合成のためにプローブＣを使
用して、得られたcDNA生成物を２部に分割した。１部を
Ｃ末端として、前述のようにＧ末端プラスミドpUC9に焼
鈍した[Verweij, C. L., et al. (1985) Nucleic Acids
Research 13, 4699-4717、オランダ特許出願85.00961
に基づく] 。そして、大腸菌ＤＨＩを転換するのに使用
した。6,000 の個々のコロニーを，pvWF2600DNA の“ニ
ック翻訳”575bp BglII-BamH I vWFcDNA で雑種形成し
た。最も長い挿入体（約1,800 bp，pvWF1800で示され
る）でプラスミドを含有する陽性クローンを、更に研究
するために選んだ。プライマＣ支配cDNA生成物を、EcoR
Iメチラーゼで処理し、次いで、 T４−DNA ポリメラー
ゼとdNTPで処理して、末端を純化させた[Maniatis, T.,
et al. (1982)分子クローニング研究所マニュアル、コ
ールドスプリングハーバー研究所（Cold Spring Harbor
Laboratory)] 。

【００１２】リン酸化したEcoR Iリンカー（ニューイン
グランドバイオラブズ、ベバリー、MA) をcDNA生成物の
末端に結紮し、未反応成分を、セファデックス（Sephad
ex)G-50クロマトグラフィによって除去した。pvWF1800D
NAのvWF cDNA挿入体の５′末端の下流側約350 bpに位置
するXho I 部位を他の選択のために使用した。過剰のEc
oR IとXho I で消化した後、セファローズ（Sepharose)
CL-4Bでのクロマトグラフィーが、消化したEcoR Iリン
カーを除去するのに使用された。最終生成物を、EcoR I
とXho I で消化し、大腸菌ＤＨＩを転換するのに使用し
たプラスミドpMBL11DNA に結紮した。約10,000の個々の
コロニーの集団を、プラスミドpvWF1800から、“ニック
翻訳”350 bp Xho I-Hind III vWF cDNAフラグメントで
雑種形成した。このフラグメントのHind III部位は、ベ
クターpUC9のポリリンカーから誘導されている。最も長
い挿入体（約1,330 bp、pvWF1330で示される）を含有す
る陽性クローンについて、更に研究した。

【００１３】S1ヌクレアーゼ保護分析：S1ヌクレアーゼ
保護実験のために、vWF cDNA（フラグメントＶ．図１）
で構成されている2,390 bpセグメント（Xho I −Kpn I)
を含有するプラスミドpvWF2600からの約5,300 bpのXho
I −EcoR I（プローブＶ）を使用した。プローブIIは、
735bp Xba I −Xho I vWF cDNAセグメント（フラグメン
トII、図１）を含有するプラスミドpvWF1330からの4,80
0bp Xba I −EcoR Iフラグメントであった。フラグメン
トの３′末端には、凹部末端をうめるために、DNA ポリ
メラーゼＩ（大きいフラグメント）（ニューイングラン
ドバイオラブズ、ベバリー、MA) を使用して、標識をつ
けた[Maniatis, T., et al (1982) 分子クローニング研
究所マニュアル、コールドスプリングハーバー研究所
（Cold Spring Harbor Laboratory)]。次いで、これら
のプローブを、0.７％低溶融アガロースゲル上で電気泳
動により単離し、精製した[Wiesland, L. (1979) Anal.
Biochem. 48, 305-309]。

【００１４】３つの他のvWF cDNAフラグメントを二重鎖
M13mp18 中でサブクローン形成し、プローブとして使用
した。その末端に、DNA ポリメラーゼＩ（大きいフラグ
メント）を有する一般的なM13 プライマからの伸長によ
り抗反応性DNA を均一に標識づけした。サブクローン形
成フラグメントは、プラスミドpvWF1800（フラグメント
III 、図１）の1,144 bp Xho I −Hind IIIフラグメン
ト、プラスミドpvWF1330（フラグメントＩ、図１）の58
5 bp Xba I −EcoR Iフラグメント、及びプラスミドpv
WF2600（フラグメントIV、図１）の575 bp BamH I−Ba
l IIフラグメントであった。Ｍ13プライマで開始された
DNA 合成が終った後、二重鎖DNA を、フラグメントIII
についてはHind IIIとPvu IIとで消化し（プローブIIを
生成）、フラグメントＩについてはXba I とEcoR Iとで
消化し（プローブＩを形成）、フラグメントIVについて
はBamH IとPvu IIとで消化し（プローブIVを生成）た。
プローブII、 III 、IV及びＶの構造原理は、それらが内
皮RNA と相補性のないベクターDNA のセグメントを含有
しているということである。例えば、プローブIII及びI
Vは、M13mp18 から誘導された約200 bpのものを含有す
る。これらのプローブを、５％ポリアクリルアミド−８
Ｍ尿素ゲル上で電気泳動し、主要フラグメントを単離し
た[Maxam A. G., et al.(1980) Methods Enzymol.65,49
9-560]。

【００１５】S1ヌクレアーゼ保護実験を、本質的に文献
記載のようにして行った[Berk, A.J. et al.(1977) Cel
l 12, 721-732]。 １μg のヒト内皮ポリARNAを、80℃
で10分間加熱した10,000-100,000カウント／分の放射性
標識プローブに加え、次いで、プローブＩ、II、III 及
びＶについては60℃で一晩培養し、プローブIVについて
は57℃で一晩培養した。２００単位／mlのS1ヌクレアー
ゼ（ベチエスダ研究所、ガイサーズブルグ、Md) で、45
℃にて20分間消化した。末消化DNA をエタノールで沈澱
させ、ペレットを、0.8 ％アルカリアガロースゲル又は
６％ポリアクリルアミド系ゲル上で電気泳動させるため
に、適当な緩衝液に溶解した[Maniatis,T., et al. (19
82)分子クローニング研究所マニュアル、コールドスプ
リングバーバー研究所（Cold Spring Harbor Laborator
y)。 始めの方法は、プローブＩ及びIII に用いられ、第
２の方法は、プローブII、IV及びＶに適用された。

【００１６】全長vWF cDNAの組み立て ３′未翻訳領域（8562位置）内で、Hind III部位（2235
位置）からSac I 部位へ延びる約6,331 bpの連続vWF cD
NAセグメントを含むプラスミドpSP6330 vWF の構成につ
いて、次のvWF cDNAを単離した。：PvWF2600DNA からの
2,517 bp HindIII−Kpn Ｉフラグメント（2236位置か
ら4753位置まで）、pvWF2084DNA からの2,084 bp Kpn
Ｉ−Bal IIフラグメント（4753位置から6837位置ま
で）、及びpvWF2280DNA からの1,730 bp Bgl II−Sac
I フラグメント（6837位置から8567位置まで）。これら
３つのvWF cDNAフラグメントは、同時に、ベクターpSP6
4 中に結紮され[Melton, D. A., et al.(1984) Nucl. A
cids Research 12, 7035-7056]、 Hind IIIとSac I とで
消化された。得られた転換体の約半分は、制限酵素分析
によって証明されるように、約6,331 bpの所望のvWF cD
NA挿入体を有するプラスミド（pSP6330vWFで示される）
を含有していた。

【００１７】全長vWF cDNAを含むプラスミドpSP8800vWF
を構成するために、次のフラグメントを単離した。プラ
スミドpSP6330vWFの6,330 bp Hind III−EcoR I挿入体
（EcoR I部位は、ベクターに存在するポリリンカーから
誘導される。）、pvWF1800からの1,044 bp Xho I −Hi
nd IIIフラグメント（1092位置から2236位置まで）、及
びpvWF1330からの1,327 bp EcoR I−Xho I フラグメン
ト（−236 位置から1092位置まで）。

【００１８】これら３つのフラグメントの５倍モル過剰
を、それぞれ、再度、同時に、ベクターpPP65DNAで結紮
し、EcoR Iで開裂し、子牛の腸のアルカリホスファター
ゼ（ボーエリンガー、マンハイム、ＢＲＤ）で処理し
た。得られたコロニーの約30％には、制限酵素分析及び
ヌクレオチド連鎖分析によって証明されるように、約8,
795 bpの所望の全長vWF cDNA挿入体を有するプラスミド
が含まれていた。

【００１９】試験管内転写及び翻訳 SP６RNA ポリメラーゼ（ニューイングランドニュークリ
アー、ドライアイヒ、BRD)による線状のSP６をベースに
したDNA テンプレートの試験管内転写は、0.1mMのUTP 、
CTP 及びATP 、 0.05mMのGTP 、 並びに２mMの m７G
（５′）PPP(５′）Ｇ（ファーマシア、アップサラ、ス
ェーデン）の存在下でなわれ、末端がキャップされたメ
ッセンジャーRNA を得た〔Melton, D. A., et al.(198
4) Nucl. Acids Research 12, 7035-7056〕。 この５′
をキャップしたメッセンジャーRNA の試験管内翻訳は、
うさぎの赤血球溶解産物系（ニューイングランドニュー
クリアー、ドライアイヒ、BRD)で製造業者の説明書に従
って行なわれた。試験管内翻訳生成物の分析は、８％SD
S-ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって行な
われた 〔Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 650-65
5〕。

【００２０】結 果 部分vWF cDNAクローンの構成及び全長vWF cDNA の組み立
て ：以前、本発明者等は、全長ヒトvWF cDNAの部分を含
有するプラスミドの構成について報告した 〔 Verweij,
C. L., et al.(1985) Nucleic Acids Research 13, 46
99-4717、オランダ特許出願85.00961に基づく；Lynch,
D. C., et al.(1985)Cell 41, 49-56; Ginsburg, M.,
et al. (1985) J. Biol. Chem. 260, 3931-3936; Sadle
r, J. E., et al. (1985) Proc. Nucl. Acod. Sci. USA
82, 6394-6398〕。 本発明者が、オリゴ（dT）を主とし
たヒト内皮cDNA集団から得た最も延展されたvWF cDNA
は、約2,280 bpのもの（pvWF2280）を含んでいた。ヌク
レオチド連鎖分析によって、このcDNA挿入体が、vWF メ
ッセンジャーRNA のポリＡ尾部において開始されている
ことが明らかとなった。全長vWF cDNAを構成するため
に、本発明者はpvWF2280の上流に位置する付加的な重複
vWF cDNA連鎖を単離した。

【００２１】この目的のために、２つの生化学選別を用
いて、vWF cDNA含有プラスミドの数を増加させた。第１
に、部分ヌクレオチド連鎖 〔 Saddler, J. E., et al.
(1985) Proc. Nucl. Acad. Sci. USA 82, 6394-6398 〕
から誘導されたオリゴヌクレオチドプライマーを、cDNA
を合成するために、基質としてヒト内皮ポリARNAを用い
て合成した。第２に、cDNA生成物を、特定数の部位でvW
F cDNAを分割させることが知られている特殊な制限エン
ドヌクレアーゼで消化させた〔 Ginsburg. M.,et al.(1
985) J. Biol. Chem. 260 , 3931-3936 ; Sadler, J.
E., et al. (1985) Proc. Nucl. Acad. Sci. USA 82, 6
394-6398 〕。 これらの制限部位は、つづいて、全長vWF
cDNAを組み立てるのに用いられることができる。クロ
ーニング戦略は、図１Ａにその概略が示されている。隣
接vWF cDNA連鎖を含むプラスミドを、pvWF1330、pvWF18
00、pvWF2600、pvWF2084及びpvWF2280で示した。pvWF13
30DNA の５′部分のヌクレオチド連鎖（vWF メッセンジ
ャーRNA の５′末端に対応する）によって、３つの読み
取り枠のすべてに、無意味なコドンが存在していること
が明らかになった。この発見から、本発明者はpvWF1330
DNA が、翻訳開始コドンを越えて延びていると結論づけ
る。

【００２２】ヒト内皮RNA でのS1ヌクレアーゼ保護実験
は、種々のvWF cDNA挿入体が、vWFメッセンジャーRNA
を十分相補するものであることを証明するために行なわ
れた。プローブの構成及び用いられた条件は、“物質と
方法”の項で述べた通りである。結果を図２に示す。す
べての場合において、保護フラグメントの長さが、種々
のプローブの予想長さと一致している。これらのデータ
から、本発明者は、pvWF1330、pvWF1800及びpvWF2600DN
A の各vWF cDNA挿入体が、vWF メッセンジャーRNA に対
して完全に相補性を有していると結論ずける。残りのプ
ラスミドpvWF2084及びpvWF2280のcDNA挿入体のヌクレオ
チド連鎖は、公表された連鎖に対応して、以前に示され
ている〔 Sadler, J. E., et al. (1985) Proc. Nucl.
Acad. Sci. USA 82, 6394-6398 〕。 その結果、種々の
隣接vWF cDNA連鎖は、vWF メッセンジャーRNA の真のコ
ピーである。

【００２３】本発明者が作ったvWF cDNA連鎖は、約8,90
0 bpの長さである。この長さは、ヒトの内皮（ポリＡ）
RNA のノーザン（Northern) ブロット分析によって測定
したvWF メッセンジャーRNA の長さと一致する 〔 Verw
eij. C. L., et al. (1985)Nucleic Acids Research 1
3, 4699-4717,オランダ特許出願85.00961に基づく〕。
全長vWF cDNAの組み立ての詳細な説明は、“物質と方
法”の項に述べられている。組み立てられた全長vWF cD
NAの正しい組成は、制限酵素分析によって確認された。

【００２４】全長vWF cDNAのヌクレオチド連鎖 vWF cDNAフラグメントのヌクレオチド連鎖分析を、化学
分解法（Maxam, A. M., et al., 1977) 及びジデオキシ
連鎖停止法〔 Sanger, F., et al. (1977) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 〕の２方法で、図１
Ａに概略を示した模式図に従って行った。図３に、vWF
メッセンジャーRNA の５′末端から延びる約8806残基の
ヌクレオチド連鎖及び対応する予想アミノ酸連鎖が示さ
れている。vWF メッセンジャーRNA の３′部分の残りの
ヌクレオチド連鎖は、先に報告されている〔 Saddler,
J. E., et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 82,
6394-6398; Verweij, C. L., et al.(1985) Nucleic A
cids Research 13, 4699-4717.オランダ特許出願85.00
961に基づく〕。

【００２５】一般に、我々のvWF cDNAのヌクレオチド連
鎖とSadler, J. E. et al., (1985)Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82, 6394-6398 のそれとの重複部分には、差
異はなかった。しかし、この著者等によって作られた、
ファージ lambda-HvWF1 上のvWF cDNAの５′末端におけ
る最初の12ヌクレオチド（2217位置及び2229位置に対
応）は、３つの個々の重複cDNA挿入体について確認され
ている我々の連鎖とは、完全に相違している。別の不一
致も、2309位置で観察された。我々の分析によれば、Ｃ
残基が認められ、一方、Saddler, J. E., et al. (198
5) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6374-6398 は、
その特定位置において、それぞれプロリン及びヒスチジ
ンとなるＡ残基を報告している。完成vWF たんぱく質の
自動アミノ酸連鎖分析によって、プロリン残基が単独に
確認されてはいる（Hessel, B. et al.,(1984) Thrombo
sis Research 35, 637-651)が、この相違は、vWF 遺伝
子の多形性によるものであろう。

【００２６】隣接vWF cDNA連鎖で測定された全長は、vW
F メッセンジャーRNA のポリＡ尾部を除いて、8,814 bp
である。翻訳開始部位は、（１位置から４位置まで）で
示され、TAG の無意味はコドン（−75位置から−82位置
まで）の下流側の最初の開始コドンであって、8,439 ヌ
クレオチドの“開放”翻訳読み取り枠がそれに続いてい
るATG コドンに対応していた〔我々の連鎖データ及び S
addler, J. E., et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 82, 6394-6398 の連鎖データから推論〕。この
対応は、予測される22N 末端アミノ酸残基が、信号ペプ
チッドの特徴を示すことが認められることによって、支
持される。最大の可能性をもって、信号ペプチターゼ用
となる開裂部位は、それぞれ22位置と23位置とにおける
グリシン残基とアラニン残基との間に位置している〔 V
on Heijne,(1983) Eur. J. Biochem.133, 17-21 〕。提
案されている翻訳開始コドンは、少なくとも230nt の未
翻訳領域に付随している。

【００２７】8,439 bpの連続vWFcコーディング連鎖によ
って、309kD の計算分子量を有する2,813 アミノ酸残基
のポリペプチッドの合成をプログラムすることができ
る。本発明者等の知る限りでは、これが、今日まで測定
された最長のコーディング連鎖を示している。他のたん
ぱく質と共に、NIH たんぱく質連鎖データバンク内に入
れられている（部分）均一アミノ酸連鎖を、コンピュー
タによって研究したが、他のたんぱく質との大きな同一
性は認められなかった。更に、完成vWF たんぱく質が、
約１５％の炭水化物残基を含有する糖たんぱく質である
ことが報告されている〔 Sodetz, J. M. et al.,(1979)
J. Biol. Chem. 254, 10754-10760 〕。炭化水素成分
が、前駆vWF の計算分子量に対して約15重量％となり、
前駆vWF の分子量は、約350 kDとなるであろうと考えら
れる。

【００２８】前駆vWF のアミノ酸連鎖の特色 予測されたアミノ酸連鎖（図３）と完成vWF たんぱく質
の確認Ｎ末端アミノ酸連鎖〔 Hessel, B. et al., (198
4) Thrombosis Research 35, 637-651 〕との比較によ
って、vWF 前駆たんぱく質が、報告されている260 kDの
糖たんぱく質〔Wagner, D. D., et al. (1983) J. Bio
l. Chem. 258, 2065-2067 〕よりも可成大きいという
我々の先の仮定〔 Verweij, C. L., et al. (1985) Nat
leic Acide Research 13, 4699-4717,オランダ特許出
願85.00961に基づく〕が確かめられた。予測されたアミ
ノ酸連鎖が完成（225 kD）vWF たんぱく質のＮ端末連鎖
と一直線になっていることは、完成vWF たんぱく質に対
してコードを行うヌクレオチド連鎖が、2290位置で開始
することを示している。この結論は、vWF 前駆体たんぱ
く質が、完成たんぱく質よりも大きい763 アミノ酸残基
であることを意味する。明らかに、この前駆連鎖（計算
分子量81kD）は、たんぱく質処理によって除去されて、
約225 kDの分子量を有する完成vWF 糖たんぱく質を生成
する。

【００２９】vWF 前駆たんぱく質のアミノ酸連鎖を相同
マトリックス比較することによって、約350 のアミノ酸
残基の長さを有する４つの領域（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ
４）が作られていることが明らかとなる。この領域の部
分（Ｄ′、約96のアミノ酸）は、完成vWF のＮ末端に存
在するように見える。図４Ａは、整列したこれらのくり
返し領域を示す。前駆連鎖の顕著な特徴は、それが、主
にＤ領域（Ｄ１、Ｄ２）の複製からなっているというこ
とである。このくり返しは、くり返しの構造的同一性を
示すシステイン残基の位置が著しく保持されていること
を示している。興味あることに、前駆連鎖は、698 位置
から702 位置までにおいて、アルギニン−グリシン−ア
スパラギン酸連鎖（“ＲＧＤ”連鎖）を有している。上
記アミノ酸連鎖を有するテトラペプチッドが、同じ連鎖
を含有し、細胞結合内に含まれているたんぱく質を競合
することが示されている〔 Pierschbacher, M. D. et a
l., (1984) Nature 309, 30-33 〕。完成vWF たんぱく
質のＣ末端部内に、別のRGD連鎖が存在していることが
注目されている〔 Sadler, J. E. et al.(1985) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82, 6394-6398 〕。

【００３０】vWF メッセンジャーRNA の試験管内翻訳 約300 kDの分子量を有するグリコシル化されていない前
駆体たんぱく質に対して、コーディング能力を示すよう
にするために、全長vWF cDNAを組み立てた。全長vWF cD
NAをプラスミドpSP65 内へ挿入した。このプラスミド
は、特にSP６RNAポリメラーゼによって支配されるクロ
ーン化DNA 連鎖の試験管内“ランオフ”転写を行わせる
エス、ティフィムリウム バクテリオファージ（S. Typ
himurium Bacteriophage) SP６プロモータを含有してい
る〔 Melton, D. A. et al., (1984)Natl. Acids Resea
rch 12, 7035-705 〕。このようなメッセンジャーRNA
生成物は、赤血球溶解産物を用いて、有効に翻訳される
ことができる。

【００３１】まず、連続6,331bp vWF cDNA連鎖を含んで
いるプラスミドpSP6330 vWF（図１Ｂ）を作った。この
プラスミドは、完成vWF に対するすべてのコーディング
連鎖、更に前駆連鎖のＣ端末部から、18アミノ酸残基に
対してコードを行う連鎖を含有している。pSP6330 vWF
DNAから転写されたRNA によって支配されるたんぱく質
合成の開始は、完成vWF のＮ末端の下流側８アミノ酸の
メチオニンコドンにおいて生ずる。次いで試験管内合成
vWF メッセンジャーRNA の翻訳によって、220kDの計算
分子量を有する（グリコシル化されていない）ポリペプ
チッドが生成するであろう。その結果、前駆vWF に対す
る完全なコーディング連鎖を含んでいるpSP8800 vWF
（図１Ｂ）が構成された。

【００３２】このプラスミドは、計算分子量が309,250
Ｄであるたんぱく質をコード化するであろう。プラスミ
ドpSP6330 vWF 及びpSP8800 vWF は、それぞれ、EcoR I
及びSal I で直線化され、試験管内で転写される。種の
vWF メッセンジャーRNA の試験管内翻訳の結果を、図５
に示す。pSP6330 vWF DNAによってコード化されたポリ
ペプチッドは、約200kDの分子量を示す。この分子量と
計算分子量（220kD）との不一致は、恐らく、これらの
ゲル中の大きなたんぱく質の分子量測定が、不正確であ
ることによるものであろう。pSP8800 vWF の完全なコー
ディング連鎖は、200kDよりも実質的に大きい分子量を
有するポリペプチッドに翻訳される。

【００３３】この異常に長いポリペプチッドについて、
より正確に分子量を測定するために、我々は、全長vWF
cDNAの選択部分から誘導した。部分的な重複ポリペプチ
ッドを作成した。そのために、pSP8800 vWF DNAをBamH
Iで消化し、転写体（長さ2855nt) を翻訳した。この転
写体の３′末端における405 ntが、EcoR Iで開裂された
pSP6330 vWF から作られた転写体の５′末端を構成する
ということは注目されるべきである。それ故、上記ポリ
ペプチッドの分子量計算は、共通たんぱく領域を引い
て、約309 kDの分子量になるべきである。BamH I消化テ
ンプレートから誘導されたたんぱく質は、約100 の測定
分子量を有し、一方、先に示したように、EcoR Iで開裂
されたpSP6330 vWF テンプレートは、約200 kDの生成物
を生ぜしめる。これらの分子量計算及び共通領域（15k
D）を差し引くことによって、測定分子量は、309,250Ｄ
の計算分子量と一致する285 kDとなる。

【００３４】更に、Xho I 消化されたpSP8800 vWFDNAか
ら誘導された転写体（1320nt）の翻訳によって、分子量
が39kDのポリペプチッドが明らかとなる。この結果は、
１位置から４位置までにおける翻訳開始サイドの対応と
一致する。これらのデータから、2,813 アミノ酸残基か
ら成る前駆体vWF たんぱく質の合成をプログラムする8,
439 bpのコーディング連鎖を持った全長vWF cDNAが構成
されていると結論づけられる。

【００３５】考 察 本発明は、全長vWF cDNAを含有するプラスミドの構成を
規定する。ヌクレオチド連鎖分析〔 本特許出願； Verw
eij, C. L., et al. (1985) Nucleic Acids Research 1
3, 4699-4717,オランダ特許出願85.00961に基づく； Sa
dler, J. E. etal., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 82, 6394-6398 〕によって、ポリＡ尾部が誘導され
たcDNAを除いて、構成されたvWF cDNAの長さが、8,805
bpになることが明らかになった。この結果は、内皮（ポ
リＡ）RNA のノーザーン（Northern) ブロット分析〔Ve
rweij, C. L., et al.(1985) Nucleic Acids Research1
3, 4699-4717,オランダ特許出願85.00961に基づく〕に
よって測定したvWF メッセンジャーRNA の長さ（約9,00
0 nt）と一致する。前駆体vWF たんぱく質についての全
体のコーディング連鎖は、8,439 bpであり、分子量が約
309 kDのグリコシル化されていないポリペプチッドに対
応している。このたんぱく質についての翻訳開始部位
は、１位置から４位置までにおけるATG コドンに対応さ
せられることができる（図３参照）。

【００３６】この対応は、SP６転写系で生じた全長vWF
メッセンジャーRNA での試験管内翻訳実験の結果と一致
する。グリコシル化たんぱく質は、信号ペプチッドを除
去した後でも、300 kDよりも可成大きくなるであろう。
完成vWF の前駆体糖たんぱく質による分子量は、260 kD
を示すということが報告されている〔Wagner, D. D.,et
al. (1983) J. Biol. Chem. 258, 2065-2067 〕。本発
明者等が前駆体たんぱく質に対応させた分子量との不一
致は、大きな（糖）たんぱく質に固有の、SDS-ポリアク
リルアミドゲル電気泳動による分子量測定の不正確さに
よるものであろう。

【００３７】完成vWF をコード化する連鎖は、完成vWF
の確認されたＮ末端アミノ酸連鎖〔Hessel, B.et al.,
(1984) Thrombosis Research 35, 637-651 〕が、予測
アミノ酸連鎖（図３）と直線をなすことから推測される
ように、翻訳開始コドンの下流側の2,286 bpにおいて開
始する。この2,286 bpの長さの前駆連鎖が、計算分子量
が83kDであるポリペプチッドをコード化できることが示
された。従って、前駆vWF たんぱく質をプロテアーゼに
処理すると、２つの異ったポリペプチッドを生成するで
あろう。763 位置と764 位置におけるアルギニン残基と
セリン残基との間の特定の開裂が、内皮細胞のヴァイベ
ル−パラーデ体内で多分起っているであろう。

【００３８】何故ならば、プロテアーゼ禁止剤（pMSF）
の存在下では、フォン・ヴィレブランド抗原II(vWAg I
I）で示される別の糖たんぱく質を有する完成vWF のこ
れら小器官内で、複合体が検出されるからである（Mont
gomery, R. R. 及び ZimmermanT. S. 1978 J. Clin. In
vest. 61, 1498-1507)。前駆体vWF たんぱく質の前駆連
鎖が、vWAg II と同じのようであることを示すいくつか
の議論を進めることができる。

【００３９】i) グリコシル化されていない前駆連鎖の
分子量（83kD）が、vWAg II 糖たんぱく質の分子量98kD
と合致する。 ii) vWF 及びvWAg II の両者は、培養内皮細胞によって
合成され、１−デスアミノ−８−Ｄ−アルギニン バソ
プレシン（DDAVP)での刺激によって、これらのたんぱく
質が同時に放出されることが示されている（Mc Carrol
l, D. R. et al, 1984 Blood 63, 532-535)。 iii) 免疫蛍光検査法を使用すると、両たんぱく質が核
周辺領域内及びヴァイベル−パラーデ体内で局在化する
ことが示されている（Mc Carroll, D. R. et al.(198
5), J. Clin. Invest. 75, 1089-1095)。

【００４０】iv) vWF 及びvWAg II は、共に血小板中に
存在し、血小板活性化によって共に放出される。 v) vWF 及びvWAg II たんぱく質の量がプラスマ内で直
線的に関連しており、重症フオン・ヴィレブランド病患
者のプラスマと血小板には、両たんぱく質が欠乏してい
る。 vi) 前述の如く、vWF とvWAg II との複合体が、セリン
プロテアーゼ禁止剤（PMSF) の存在下では検出される
が、禁止剤が存在しない場合は検出されない。

【００４１】前駆連鎖の予測アミノ酸連鎖は、顕著な構
造を示す。それは、約350のアミノ酸残基の長さの複製
セグメントから成っている。これ等の２つのセグメント
は、37％のアミノ酸同族を共有している。更に、それら
は、同じように位置するシステイン残基を相当に保持し
ていることを示しており、これらの直接くり返しの中
に、構造的特徴が保持されていることを示している。前
駆連鎖の中のこのくり返しの２つのコピーは、完成vWF
中にも存在し、一方、このくり返しの部分は、完成vWF
のＮ末端に存在する。内部相同領域についても、Sadle
r, J. E. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 82,
6394-6398 (1985)によって報告されており、そのうちの
２つは、２つに複製されていたが、１つは、３つの複製
の形で存在した（図４Ｂ）。

【００４２】これらのくり返し連鎖は、完成vWF たんぱ
く質内において、約1070のアミノ酸残基の長さを有して
いる。本発明者が発見したくり返し構造は、Sadler J.
E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 82, 6394-6
398 (1985)によって報告されているものとは無関係のも
のである。これらのデータから、約90％の前駆体vWFた
んぱく質は、くり返し領域で構成されており、前駆体vW
F 遺伝子が、少なくとも４つの異なった領域の一連の複
製過程から発展していることを示していると結論づけら
れる。

【００４３】前駆連鎖は、vWF2量体から成る大きな多量
体の形成に関与しているであろう（Wagner, D. D. 及び
Marder, V. J. 1984, J. of Cell Bialogy 99, 2123-2
130; Lynch, D. E. et al. (1983), The Journal of Bi
ological Chemiatry 258, 12757-12760) 。この点で、
たんぱく質のＮ及びＣ末端部に主に存在する結晶におい
て、前駆vWF が非常に富んでいる（8.1 ％）ことに注目
するのは適切であろう。前駆連鎖のシステイン含有量は
高い（8.6 ％）。vWF のＣ末端におけるジスルフィド結
合は、２つのサブユニットを結合する棒状領域を形成す
る必要があることが示されている（Fowler, W. E. et a
l. J. Clim. Invest. 76, 1491-1500 (1985)。多量体
は、多分Ｎ末端においてジスルフィド架橋によって、こ
れらの２量体を結合し、球状領域を作ることによって形
成されるのであろう。前駆連鎖におけるシステイン残基
のフリーのスルフヒドリル基は、恐らく、多量体の形成
にとって、欠くことのできないものであろう。

【００４４】前駆連鎖内に“RGD(C)”アミノ酸連鎖が存
在することが、このたんぱく質の別の機能について示す
ことになろう。フィブロネクチンやヴィトロネクチンの
ようなたんぱく質のRGD 含有領域が、細胞表面の受容体
との相互作用において、決定的な役割を演ずることが示
されている〔Pierschbacher, M. D.及び Ruaslahti,E.
(1984) Nature 309, 30-33 ; Pytela, R. et al. Pro
c. Nat. Acad. Sci. US A 82, 5766-5770 〕。これら
の相互作用は、RGD 含有ペプチッドによって抑制され
る。完成vWF の活性化血小板との相互作用も、RGD 含有
ペプチッドによって抑制され、vWF のこの領域が血小板
結合に含まれていることを示唆している（Ginsburg, M.
1985 J. Biol. Chem. 260, 3931-3936 ; Haverstick,
P. M. etal. 1985, Blood)。完成vWF 及び前駆連鎖に
おいて、共にRGD 連鎖が存在し、それはvWAg II につい
ても同等であろううと思われ、更にこれら２つのたんぱ
く質の間の注目すべき相同性と構造保存に基づいて、特
定の細胞表面受容体との特定の相互作用において、前駆
連鎖は、完成vWF と同じ機能を持っているものと推測さ
れる。

【００４５】図面の説明 図１Ａ及び図１Ｂは、vWF 、cDNAの構成、全長vWF cDNA
の組み立て及びヌクレオチド連鎖の測定のための方策 A) vWF メッセンジャーRNA はバーで示される。空白
帯、信号ペプチッドコーディング領域；斜線帯、前駆連
鎖コーディング領域；中実帯、完成vWF コーディング領
域 オリゴヌクレオチド（２０量体）Ａ（6901−6921）、Ｂ
（4819−4839）及びＣ（2467−2487）、プライマ支配cD
NA合成用及び／又は雑種形成用プローグとして使用され
たもので、小さいバーで示されている。コロニースクリ
ーニング用プローグとして用いられた575 bp BG1 II −
BamH I及び350 bp Hind III−Xho I フラグメントは、
空白バーで示されている。vWF メッセンジャーRNA の模
式標示の下に、全長vWF cDNAの組み立とヌクレオチド連
鎖のために用いられた５つの部分隣接vWF cDNAが示され
ている。S1ヌクレアーゼ保護実験に使用されたフラグメ
ントＩ, II, III, IV,及びＶが、それらが誘導されたvW
F cDNA挿入体の上に示されている。矢印は、ヌクレオチ
ド連鎖方策を示す。マクサムとギルバート（1977）の方
法によって連鎖解析を行う場合は、放射性標式の位置
が、矢印端部の短かい垂直線によって示される。矢印端
部のスラッシは、端部標識が、ベクターDNA によって指
定された末端にあったことを意味する。本研究において
適切な制限エンドヌクレアーゼ部位のみが示されてい
る。B. BamH I ; Bg、Bgl II ; E. EcoR I；H. Hind II
I ; K. Kpn I ; M. Mst I ; N. Nar I ; P. Pvu II ;
S. Sal I ;Sc. Sac I ; X, Xba I ; Xh. Xho I.

【００４６】B) 全長vWF cDNAの組み立て、プラスミド
pSP6330 vWF は、Hind III部位（2235位置）からSac I
部位（8562位置）まで、延びており、ベクターpSP64 内
でサブクローン化されている、6,331 bp vWF cDNAA連鎖
を含んでいる。プラスミドpSP8800 vWF は、BcoR I部位
（パネルＡ参照）からSac I 部位（8562位置）まで延び
ており、ベクターpSP65 内でサブクローン化されている
全長vWF cDNAを含んでいる。全長vWF cDNAの組み立てに
使用されるフラグメントの限界を定める制限エンドヌク
レアーゼ部位は、アストリックスで示されている。pvWF
1330DNA の構成に使用される全長vWF cDNAの５′端部に
おけるEcoR I部位は、EcoR Iリンカーから始まる。SP6R
NA ポリメラーゼによる試験管内“ランオフ”転写のた
めに、プラスミドDNA を直線化させるのに用いられた制
限酵素用部位は、ドットで示されている。プラスミドpS
P8800 vWF 内のSal I 部位及びプラスミドpSP6330 vWF
内のEcoR I部位は、pSP 型ベクターのポリリンカーに存
在する。

【００４７】図２は、S1ヌクレアーゼ保護分析、内皮ポ
リA+RNA を、vWF cDNA連鎖を含む〔32P〕標識プローブ
で雑種形成した。種々のプローグの構成及び用いられた
条件は、“実験方法”の項に述べられている。プローブ
中に存在するvWF cDNAセグメントは、図１に示されてい
る。パネルＡは、0.８％アルカリアガロースゲル中のサ
ンプルを電気泳動した後の結果を示すものである。パネ
ルＢは、６％ポリアクリルアミド−８Ｍ尿素ゲル中で電
気泳動した後の結果を示している。レーン1: 1,444 bp
vWF cDNAフラグメントIII （図１）を含むプローブIII
での雑種形成。レーン２：2,400 bp vWF cDNA フラグメ
ントＶ（図１）を含むプローブＶでの雑種形成、レーン
３：585 bp vWF cDNA フラグメントＩ（図１）と同等の
プローグＩでの雑種形成。レーン４：565 bp vWF cDNA
フラグメントIV（図１）を含むプローブIVでの雑種形
成。レーン5:765 bp vWF cDNA フラグメントII（図１）
を含むプローブII での雑種形成。符号：-，S1ヌクレア
ーゼ不存在下での雑種形成成分の培養：+，S1ヌクレア
ーゼ存在下で雑種形成成分の培養；Ｃ，内皮ポリA＋RNA
の不存在下での雑種形成した後、S1ヌクレアーゼと共
に、サンプルを培養；Ｍ１個の標準DNA 長さのマーカ
ー。

【００４８】図３Ａ〜図３Ｊは、vWF メッセンジャーRN
A の５′末端から誘導されたvWF cDNAの8806bpのヌクレ
オチド連鎖。番号は、推定ATG 翻訳開始コドンから出発
する。予想アミノ酸連鎖は、ヌクレオチド連鎖の下に示
されており、別個に番号が付けられていて、推定メチオ
ニン翻訳開始コドンから再度出発する。ポテンシャルな
Ｎ結合グリコシル化部位にはアンダーラインを施し、ト
リペプチッド アルギニン−グリセリン−アスパラギン
酸は、枠でかこんである。

【００４９】図４Ａ及び図４Ｂは、vWF用前駆体内の内
部相同性 A) ４つのくり返し領域Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４及び
Ｄ′のアミノ酸連鎖の直線性。一字表示が用いられ、ア
ミノ酸は、図３に示したように番号がつけられる。４個
又は５個のくり返しの中で同じものは棒でかこんであ
る。 B) 前駆vWF内の内部相同領域の模式表示。３個複製領
域Ａ（Ａ１、Ａ２及びＡ３）、Sadien et al. (1985)に
よって報告されているような２個複製領域Ｂ（Ｂ１及び
Ｂ２）並びにＣ（Ｃ１及びＣ２）、４個複製領域Ｄ（Ｄ
１、Ｄ２、Ｄ３、及びＤ４）が示されている。これらの
くり返しの数字位置は次の通りである：Ａ１（1242−14
80）、Ａ２（1480−1673）、Ａ３（1673−1875）、Ｂ１
（2296−2331）、Ｂ２（2375−2400）、Ｃ１（2400−25
16）、Ｃ２（2544−2663）、Ｄ１（34−387）、Ｄ２（3
87−746）、Ｄ３（866−1242）、Ｄ4 （1947−2299）及
びＤ′（769−866）。

【００５０】図５は、vWFメッセンジャーRNAの試験管内
翻訳 “実験方法”の項で述べたように、SP6RNAポリメラーゼ
での“ランオフ”転写を使って、試験管内でキャップさ
れたvWF メッセンジャーRNA を作った。RNA 生成物を
〔35S〕−メチオニンを含有する赤血球溶解産物翻訳系
に加え、ポリペプチッドを90分間合成した。ポリペプチ
ッドを、８％SDS-ポリアクリルアミドゲル上で分別し、
蛍光間接撮影に付した。Ｍ：分子量マーカーたんぱく
質、Ｅ：内因的に合成したポリペプチド（RNAを添加せ
ずに）レーン１：pSP6330 vWF DNA から転写されたvWF
メッセンジャーRNA によってコード化され、EcoR Iで消
化したポリペプチッド、レーン２：pSP8800 vWF から転
写されたvWF メッセンジャーRNA によりコード化され、
Sal I で消化したポリペプチッド、レーン３：pSP8800v
WF DNA から転写されたvWF メッセンジャーRNA によっ
てコード化され、BamH Iで消化したポリペプチッド、レ
ーン４：pSP8800 vWF DNA から転写されたvWF メッセン
ジャーRNA によってコード化され、Xho I で消化したポ
リペプチッド。

【００５１】大腸菌ＤＨＩ株における組換えDNA プラス
ミドpSP8800 vWF のサンプルは、オランダ国、バーン
（Baarm)の菌培養中央局（Centraalabureau voor Schim
mel cultures) にCBS 番号163.86として、1986年３月26
日に寄託した。

【００５２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> IMMUNO AG <120> Polypeptide and Method for Preparing Polypeptide <130> X1G-1626 <150> NL 8500961 <151> 1985-04-01 <160> 1 <210> 1 <211> 8806 <212> DNA <213> Human <400> 1 gaaagggag ggtggttggt ggatgtcaca gcttgggctt tatctccccc agcagtggga 60 ttccacagcc cctgggctac ataacagcaa gacagtccgg agctgtagca gacctgattg 120 agcctttgca gcagctgaga gcatggccta gggtgggcgg caccattgtc cagcagctga 180 gtttcccagg gaccttggag atagccgcag ccctcatttg caggggaaga tgattcctgc 240 cagatttgcc ggggtgctgc ttgctctggc cctcattttg ccagggaccc tttgtgcaga 300 aggaactcgc ggcaggtcat ccacggcccg atgcagcctt ttcggaagtg acttcgtcaa 360 cacctttgat gggagcatgt acagctttgc gggatactgc agttacctcc tggcaggggg 420 ctgccagaaa cgctccttct cgattattgg ggacttccag aatggcaaga gagtgagcct 480 ctccgtgtat cttggggaat tttttgacat ccatttgttt gtcaatggta ccgtgacaca 540 gggggaccaa agagtctcca tgccctatgc ctccaaaggg ctgtatctag aaactgaggc 600 tgggtactac aagctgtccg gtgaggccta tggctttgtg gccaggatcg atggcagcgg 660 caactttcaa gtcctgctgt cagacagata cttcaacaag acctgcgggc tgtgtggcaa 720 ctttaacatc tttgctgaag atgactttat gacccaagaa gggaccttga cctcggaccc 780 ttatgacttt gccaactcat gggctctgag cagtggagaa cagtggtgtg aacgggcatc 840 tcctcccagc agctcatgca acatctcctc tggggaaatg cagaagggcc tgtgggagca 900 gtgccagctt ctgaagagca cctcggtgtt tgcccgctgc caccctctgg tggaccccga 960 gccttttgtg gccctgtgtg agaagacttt gtgtgagtgt gctggggggc tggagtgcgc 1020 ctgccctgcc ctcctggagt acgcccggac ctgtgcccag gagggaatgg tgctgtacgg 1080 ctggaccgac cacagcgcgt gcagcccagt gtgccctgct ggtatggagt ataggcagtg 1140 tgtgtcccct tgcgccagga cctgccagag cctgcacatc aatgaaatgt gtcaggagcg 1200 atgcgtggat ggctgcagct gccctgaggg acagctcctg gatgaaggcc tctgcgtgga 1260 gagcaccgag tgtccctgcg tgcattccgg aaagcgctac cctcccggca cctccctctc 1320 tcgagactgc aacacctgca tttgccgaaa cagccagtgg atctgcagca atgaagaatg 1380 tccaggggag tgccttgtca caggtcaatc acacttcaag agctttgaca acagatactt 1440 caccttcagt gggatctgcc agtacctgct ggcccgggat tgccaggacc actccttctc 1500 cattgtcatt gagactgtcc agtgtgctga tgaccgcgac gctgtgtgca cccgctccgt 1560 caccgtccgg ctgcctggcc tgcacaacag ccttgtgaaa ctgaagcatg gggcaggagt 1620 tgccatggat ggccaggacg tccagctccc cctcctgaaa ggtgacctcc gcatccagcg 1680 tacagtgacg gcctccgtgc gcctcagcta cggggaggac ctgcagatgg actgggatgg 1740 ccgcgggagg ctgctggtga agctgtcccc cgtctatgcc gggaagacct gcggcctgtg 1800 tgggaattac aatggcaacc agggcgacga cttccttacc ccctctgggc tggcggagcc 1860 ccgggtggag gacttcggga acgcctggaa gctgcacggg gactgccagg acctgcagaa 1920 gcagcacagc gatccctgcg ccctcaaccc gcgcatgacc aggttctccg aggaggcgtg 1980 cgcggtcctg acgtccccca cattcgaggc ctgccatcgt gccgtcagcc cgctgcccta 2040 cctgcggaac tgccgctacg acgtgtgctc ctgctcggac ggccgcgagt gcctgtgcgg 2100 cgccctggcc agctatgccg cggcctgcgc ggggagaggc gtgcgcgtcg cgtggcgcga 2160 gccaggccgc tgtgagctga actgcccgaa aggccaggtg tacctgcagt gcgggacccc 2220 ctgcaacctg acctgccgct ctctctctta cccggatgag gaatgcaatg aggcctgcct 2280 ggagggctgc ttctgccccc cagggctcta catggatgag aggggggact gcgtgcccaa 2340 ggcccagtgc ccctgttact atgacggtga gatcttccag ccagaagaca tcttctcaga 2400 ccatcacacc atgtgctact gtgaggatgg cttcatgcac tgtaccatga gtggagtccc 2460 cggaagcttg ctgcctgacg ctgtcctcag cagtcccctg tctcatcgca gcaaaaggag 2520 cctatcctgt cggcccccca tggtcaagct ggtgtgtccc gctgacaacc tgcgggctga 2580 agggctcgag tgtaccaaaa cgtgccagaa ctatgacctg gagtgcatga gcatgggctg 2640 tgtctctggc tgcctctgcc ccccgggcat ggtccggcat gagaacagat gtgtggccct 2700 ggaaaggtgt ccctgcttcc atcagggcaa ggagtatgcc cctggagaaa cagtgaagat 2760 tggctgcaac acttgtgtct gtcgggaccg gaagtggaac tgcacagacc atgtgtgtga 2820 tgccacgtgc tccacgatcg gcatggccca ctacctcacc ttcgacgggc tcaaatacct 2880 gttccccggg gagtgccagt acgttctggt gcaggattac tgcggcagta accctgggac 2940 ctttcggatc ctagtgggga ataagggatg cagccacccc tcagtgaaat gcaagaaacg 3000 ggtcaccatc ctggtggagg gaggagagat tgagctgttt gacggggagg tgaatgtgaa 3060 gaggcccatg aaggatgaga ctcactttga ggtggtggag tctggccggt acatcattct 3120 gctgctgggc aaagccctct ccgtggtctg ggaccgccac ctgagcatct ccgtggtcct 3180 gaagcagaca taccaggaga aagtgtgtgg cctgtgtggg aattttgatg gcatccagaa 3240 caatgacctc accagcagca acctccaagt ggaggaggac cctgtggact ttgggaagtc 3300 ctgggaagtg agctcgcagt gtgctgacac cagaaaagtg cctctggact catcccctgc 3360 cacctgccat aacaacatca tgaagcagac gatggtggat tcctcctgta gaatccttac 3420 cagtgacgtc ttccaggact gcaacaagct ggtggacccc gagccatatc tggatgtctg 3480 catttacgac acctgctcct gtgagtccat tggggactgc gcctgcttct gcgacaccat 3540 tgctgcctat gcccacgtgt gtgcccagca tggcaaggtg gtgacctgga ggacggccac 3600 attgtgcccc cagagctgcg aggagaggaa tctccgggag aacgggtatg agtgtgagtg 3660 gcgctataac agctgtgcac ctgcctgtca agtcacgtgt cagcaccctg agccactggc 3720 ctgccctgtg cagtgtgtgg agggctgcca tgcccattgc cctccaggca aaatcctgga 3780 tgagcttttg cagacctgcg ttgaccctga agactgtcca gtgtgtgagg tggctggccg 3840 gcgttttgcc tcaggaaaga aagtcacctt gaatcccagt gaccctgagc actgccagat 3900 ttgccactgt gatgttgtca acctcacctg tgaagcctgc caggagccgg gaggcctggt 3960 ggtgcctccc acagatgccc cggtgagccc caccactctg tatgtggagg acatctcgga 4020 accgccgttg cacgatttct actgcagcag gctactggac ctggtcttcc tgctggatgg 4080 ctcctccagg ctgtccgagg ctgagtttga agtgctgaag gcctttgtgg tggacatgat 4140 ggagcggctg cgcatctccc agaagtgggt ccgcgtggcc gtggtggagt accacgacgg 4200 ctcccacgcc tacatcgggc tcaaggaccg gaagcgacca tcagagctgc ggcgcattgc 4260 cagccaggtg aagtatgcgg gcagccaggt ggcctccacc agcgaggtct tgaaatacac 4320 actgttccaa atcttcagca agatcgaccg ccctgaagcc tcccgcatcg ccctgctcct 4380 gatggccagc caggagcccc aacggatgtc ccggaacttt gtccgctacg tccagggcct 4440 gaagaagaag aaggtcattg tgatcccggt gggcattggg ccccatgcca acctcaagca 4500 gatccgcctc atcgagaagc aggcccctga gaacaaggcc ttcgtgctga gcagtgtgga 4560 tgagctggag cagcaaaggg acgagatcgt tagctacctc tgtgaccttg cccctgaagc 4620 ccctcctcct actctgcccc ccgacatggc acaagtcact gtgggcccgg ggctcttggg 4680 ggtttcgacc ctggggccca agaggaactc catggttctg gatgtggcgt tcgtcctgga 4740 aggatcggac aaaattggtg aagccgactt caacaggagc aaggagttca tggaggaggt 4800 gattcagcgg atggatgtgg gccaggacag catccacgtc acggtgctgc agtactccta 4860 catggtgacc gtggagtacc ccttcagcga ggcacagtcc aaaggggaca tcctgcagcg 4920 ggtgcgagag atccgctacc agggcggcaa caggaccaac actgggctgg ccctgcggta 4980 cctctctgac cacagcttct tggtcagcca gggtgaccgg gagcaggcgc ccaacctggt 5040 ctacatggtc accggaaatc ctgcctctga tgagatcaag aggctgcctg gagacatcca 5100 ggtggtgccc attggagtgg gccctaatgc caacgtgcag gagctggaga ggattggctg 5160 gcccaatgcc cctatcctca tccaggactt tgagacgctc ccccgagagg ctcctgacct 5220 ggtgctgcag aggtgctgct ccggagaggg gctgcagatc cccaccctct ccccagcacc 5280 tgactgcagc cagcccctgg acgtgatcct tctcctggat ggctcctcca gtttcccagc 5340 ttcttatttt gatgaaatga agagtttcgc caaggctttc atttcaaaag ccaatatagg 5400 gcctcgtctc actcaggtgt cagtgctgca gtatggaagc atcaccacca ttgacgtgcc 5460 atggaacgtg gtcccggaga aagcccattt gctgagcctt gtggacgtca tgcagcggga 5520 gggaggcccc agccaaatcg gggatgcctt gggctttgct gtgcgatact tgacttcaga 5580 aatgcatggt gccaggccgg gagcctcaaa ggcggtggtc atcctggtca cggacgtctc 5640 tgtggattca gtggatgcag cagctgatgc cgccaggtcc aacagagtga cagtgttccc 5700 tattggaatt ggagatcgct acgatgcagc ccagctacgg atcttggcag gcccagcagg 5760 cgactccaac gtggtgaagc tccagcgaat cgaagacctc cctaccatgg tcaccttggg 5820 caattccttc ctccacaaac tgtgctctgg atttgttagg atttgcatgg atgaggatgg 5880 gaatgagaag aggcccgggg acgtctggac cttgccagac cagtgccaca ccgtgacttg 5940 ccagccagat ggccagacct tgctgaagag tcatcgggtc aactgtgacc gggggctgag 6000 gccttcgtgc cctaacagcc agtcccctgt taaagtggaa gagacctgtg gctgccgctg 6060 gacctgcccc tgcgtgtgca caggcagctc cactcggcac atcgtgacct ttgatgggca 6120 gaatttcaag ctgactggca gctgttctta tgtcctattt caaaacaagg agcaggacct 6180 ggaggtgatt ctccataatg gtgcctgcag ccctggagca aggcagggct gcatgaaatc 6240 catcgaggtg aagcacagtg ccctctccgt cgagctgcac agtgacatgg aggtgacggt 6300 gaatgggaga ctggtctctg ttccttacgt gggtgggaac atggaagtca acgtttatgg 6360 tgccatcatg catgaggtca gattcaatca ccttggtcac atcttcacat tcactccaca 6420 aaacaatgag ttccaactgc agctcagccc caagactttt gcttcaaaga cgtatggtct 6480 gtgtgggatc tgtgatgaga acggagccaa tgacttcatg ctgagggatg gcacagtcac 6540 cacagactgg aaaacacttg ttcaggaatg gactgtgcag cggccaggac agacgtgcca 6600 gcccatcctg gaggagcagt gtcttgtccc cgacagctcc cactgccagg tcctcctctt 6660 accactgttt gctgaatgcc acaaggtcct ggctccagcc acattctatg ccatctgcca 6720 gcaggacagt tcgcaccagg agcaagtgtg tgaggtgatc gcctcttatg cccacctctg 6780 tcggaccaac ggggtctgcg ttgactggag gacacctgat ttctgtgcta tgtcatgccc 6840 accatctctg gtctacaacc actgtgagca tggctgtccc cggcactgtg atggcaacgt 6900 gagctcctgt ggggaccatc cctccgaagg ctgtttctgc cctccagata aagtcatgtt 6960 ggaaggcagc tgtgtccctg aagaggcctg cactcagtgc attggtgagg atggagtcca 7020 gcaccagttc ctggaagcct gggtcccgga ccaccagccc tgtcagatct gcacatgcct 7080 gagcgggcgg aaggtcaact gcacaacgca gccctgcccc acggccaaag ctcccacgtg 7140 tggcctgtgt gaagtagccc gcctccgcca gaatgcagac cagtgctgcc ccgagtatga 7200 gtgtgtgtgt gacccagtga gctgtgacct gcccccagtg cctcactgtg aacgtggcct 7260 ccagcccaca ctgaccaacc ctggcgagtg cagacccaac ttcacctgcg cctgcaggaa 7320 ggaggagtgc aaaagagtgt ccccaccctc ctgccccccg caccgtttgc ccacccttcg 7380 gaagacccag tgctgtgatg agtatgagtg tgcctgcaac tgtgtcaact ccacagtgag 7440 ctgtcccctt gggtacttgg cctcaaccgc caccaatgac tgtggctgta ccacaaccac 7500 ctgccttccc gacaaggtgt gtgtccaccg aagcaccatc taccctgtgg gccagttctg 7560 ggaggagggc tgcgatgtgt gcacctgcac cgacatggag gatgccgtga tgggcctccg 7620 cgtggcccag tgctcccaga agccctgtga ggacagctgt cggtcgggct tcacttacgt 7680 tctgcatgaa ggcgagtgct gtggaaggtg cctgccatct gcctgtgagg tggtgactgg 7740 ctcaccgcgg ggggactccc agtcttcctg gaagagtgtc ggctcccagt gggcctcccc 7800 ggagaacccc tgcctcatca atgagtgtgt ccgagtgaag gaggaggtct ttatacaaca 7860 aaggaacgtc tcctgccccc agctggaggt ccctgtctgc ccctcgggct ttcagctgag 7920 ctgtaagacc tcagcgtgct gcccaagctg tcgctgtgag cgcatggagg cctgcatgct 7980 caatggcact gtcattgggc ccgggaagac tgtgatgatc gatgtgtgca cgacctgccg 8040 ctgcatggtg caggtggggg tcatctctgg attcaagctg gagtgcagga agaccacctg 8100 caacccctgc cccctgggtt acaaggaaga aaataacaca ggtgaatgtt gtgggagatg 8160 tttgcctacg gcttgcacca ttcagctaag aggaggacag atcatgacac tgaagcgtga 8220 tgagacgctc caggatggct gtgatactca cttctgcaag gtcaatgaga gaggagagta 8280 cttctgggag aagagggtca caggctgccc accctttgat gaacacaagt gtctggctga 8340 gggaggtaaa attatgaaaa ttccaggcac ctgctgtgac acatgtgagg agcctgagtc 8400 caacgacatc actgccaggc tgcagtatgt caaggtggga agctgtaagt ctgaagtaga 8460 ggtggatatc cactactgcc agggcaaatg tgccagcaaa gccatgtact ccattgacat 8520 caacgatgtg caggaccagt gctcctgctg ctctccgaca cggacggagc ccatgcaggt 8580 ggccctgcac tgcaccaatg gctctgttgt gtaccatcag gttctcaatg ccatggagtg 8640 caaatgctcc cccaggaagt ccagcaagtg aggctgctgc agctgcatgg gtgcctgctg 8700 ctgcctgcct tggcctgatg gccaggccag agtgctgcca gtcctctgca tgttctgctc 8760 ttgtgccctt ctgagcccac aataaaggct gagctcttat cttgca 8806

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａ及び図１Ｂは、vWF 、cDNAの構成、全長
vWF cDNAの組み立て及びヌクレオチド連鎖の測定の仕方
を示す説明図である。

【図２】図２は、S1ヌクレアーゼ保護分析、内皮ポリA
＋RNA を、vWF cDNA連鎖を含む〔32Ｐ〕標識プローブで
雑種形成の状況を示す説明図である。

【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｊは、vWF メッセンジャーRNA
の５′末端から誘導されたvWF cDNAの8806bpのヌクレオ
チド連鎖を示す説明図である。

【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａの続きである。

【図３Ｃ】図３Ｃは、図３Ｂの続きである。

【図３Ｄ】図３Ｄは、図３Ｃの続きである。

【図３Ｅ】図３Ｅは、図３Ｄの続きである。

【図３Ｆ】図３Ｆは、図３Ｅの続きである。

【図３Ｇ】図３Ｇは、図３Ｆの続きである。

【図３Ｈ】図３Ｈは、図３Ｇの続きである。

【図３Ｉ】図３Ｉは、図３Ｈの続きである。

【図３Ｊ】図３Ｊは、図３Ｉの続きである。

【図４Ａ】図４Ａ及び図４ＢはvWF 用前駆体内の内部相
同性の説明図である。

【図４Ｂ】図４Ａ及び図４ＢはvWF 用前駆体内の内部相
同性の説明図である。

【図５】図５は、vWF メッセンジャーRNA の試験管内翻
訳の説明図である。

フロントページの続き (72)発明者 ディアハルダ ポール ヨハン オランダ王国，1111 ズィーエクス ディ マン，ロード クラウスラン 1005番地 (72)発明者 ハーツ マルガレータ ヘンドリカ ルイ サ オランダ王国，1061 ジーダブリュ アム ステルダム，ドゥ スハープヘルダストラ ード 34のＩＩＩ番地

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ｃＤＮＡによってコードされる単離ポリ
   ペプチドであって、該ｃＤＮＡが全長ヒト フォン・ヴ
   ィレブランド因子前駆体蛋白質の完全なコード配列に相
   当し図３のヌクレオチド２２９−８６７０によって表さ
   れる、単離ポリペプチド。
2. 【請求項２】 ｃＤＮＡによってコードされるポリペプ
   チドを調製する方法であって、該ｃＤＮＡが全長ヒト
   フォン・ヴィレブランド因子前駆体蛋白質の完全なコー
   ド配列に相当し、図３のヌクレオチド２２９−８６７０
   によって表され、該ｃＤＮＡを含む宿主細胞を培養する
   工程及び産生されたポリペプチドを単離する工程を含む
   方法。