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cDNA, die den menschlichen von Willebrand-Faktor codiert, Plasmide oder
Phagen mit einer solchen codierenden cDNA bzw. deren Fragmenten,
Mikroorganismen und tierische oder menschliche Zellen, welche solche Plasmide
oder Phagen enthalten, Herstellung von Proteinen durch Kultivierung der
oben erwähnten Wirte, die erhaltenen Proteine und pharmazeutische
Zusammensetzungen, die eine biologisch aktive Form der erhaltenen Proteine
enthalten.
BESCHREIBUNG
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Der von Willebrand-Faktor (vWF) ist ein grosses, multimeres
Plasmaprotein,
das aus einem scheinbar einzigen Glycoprotein mit einem
Molekulargewicht (MW) von etwa 225 kD besteht. Diese Untereinheiten sind durch
Disulfidbindungen miteinander verbunden. Im Plasma zirkuliert vWF als
Multimere, reichend von einem Dimer bis zu Multimeren aus mehr als 50
Untereinheiten. Dimere bestehen aus zwei Untereinheiten, die vermutlich
an ihren C-Termini durch flexible "stabförmige" Domänen verbunden sind,
und stellen vermutlich die Protomere bei der Multimerisierung dar. Die
Protomere sind durch grosse vermutlich N-terminale globuläre Domänen
verbunden, wodurch sich Multimere bilden.
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vWF wird durch Endothelzellen und Megakaryocyten synthetisiert. Es
wird angenommen, dass dieses Protein anfänglich als ein glycosylierter
Vorläufer mit 260 kD hergestellt wird, der nachfolgend einer Kohlehydrat-
Verarbeitung, Sulfatierung, Dimerisierung, Multimerisierung und
proteolytischer Spaltung unterworfen wird, wodurch sich die reife 225
kD-Untereinheit ergibt [Sporn, L.A. et al (1985) Biosynthesis of vWF protein in
human megakaryocytes, J. Clin. Invest. 76, 1102-1106; Wagner, D.D. et al
(1984) J. of Gell Biology 99, 2123-2130]. Es wurde gezeigt dass vWF in
den Weibel-Palade-Körpern innerhalb der Endothelzellen gespeichert wird.
Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass diese Organellen eine Rolle bei
der Verarbeitung des Vorläuferproteins spielen.
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vWF nimmt an kritischen Schritten bei der Blutstillung teil. Er ist
beteiligt an Blutplättchen-Gefässwand-Wechselwirkungen nach
Gefässverletzung, welche zur Bildung zu Blutplättchenklumpen führen. Auf dem
vWF-Protein sind Domänen zugeordnet worden, welche eine spezifische
Wechselwirkung mit den Blutplättchen-Glycoproteinen IB [Jenkins, C.S.p et al (1976)
J. Clin. Invest. 69, 1212-1222], IIB/IIIA [Fujimoto, T. et al (1982)
Adenomie diphosphate induces binding of von Willebrand factor to human
platelets, Nature 297, 154-156], Kollagene vom Typ 1 und 211 und mit
einem anderen noch unidentifizierten Bestandteil im Subendothelium. Diese
Zuordnungen beruhen auf Untersuchungen mit monoklonalen
Anti-vWF-Antikörpern, welche in der Lage sind, eine spezifische Wechselwirkung von vWF
zu inhibieren. Für eine tiefgehende Analyse der
StrukturFunktions-Beziehungen des vWF-Proteins wird eine vWF-cDNA in voller Länge unerlässlich
sein. Die Einführung wohldefinierter Mutationen in diese cDNA und die
Expression der mutierten cDNA in einem geeigneten Wirt wird eine
detaillierte Lokalisierung von funktionellen Domänen innerhalb des vWF-Proteins
erlauben. Vor kurzem haben die Anmelder und andere (Lynch, D.C. et al
(1985) Gell 41, 49-56; Ginsburg, M. et al (1985) J. Biol. Chem. 260,
3931-3936; Verweij, C.L. et al (1985) Nucleic Acids Research 13,
4699-4717, basierend auf der niederländischen Patentanmeldung 85.00961;
Sadler, J.E. et al (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6394-6398)
cDNA-Teilsequenzen von vWF kloniert. Das Vorliegen einer kurzen
3'-untranslatierten Region (136 nt) in der vWF mRNA, welche sich über
etwa 9000 Nukleotide erstreckt, führte uns dazu, anzunehmen, dass das
Vorläuferprotein für vWF ein Molekulargewicht von beträchtlich mehr als
den berichteten 260 kD hat (Wagner, D.D. et al (1984) J. of Gell Biology
99, 2123-2130). Eine cDNA des vWF in voller Länge wird es uns
ermöglichen, das Rätsel des Molekulargewichtes des Vorläufers zu lösen, seinen
Verarbeitungsweg zu charakterisieren und die Primärstruktur zu ermitteln.
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Diese Erfindung betrifft rekombinante DNA, umfassend ein
DNA-Fragment mit einer Basensequenz, wie sie im wesentlichen durch die Nukleotide
229-8670 in Fig. 3 gezeigt ist, welche einen menschlichen von Willebrand-
Faktor-Vorläufer in voller Länge codiert. Diese rekombinante DNA kann
ferner ein DNA-Fragment enthalten, das von einem Vektorplasmid oder
Phagen abgeleitet ist.
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Die Erfindung stellt auch eine menschliche oder tierische Zelle
oder einen Mikroorganismus zur Verfügung, welche als Resultat der
Gentechnologie solch eine rekombinante DNA enthält. Vorzugsweise ist diese
Zelle in der Lage, biologisch aktiven menschlichen von Willebrand-Faktor
herzustellen.
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Darüber hinaus stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
von biologisch aktivem menschlichen von Willebrand-Faktor zur Verfügung
umfassend die Kultivierung einer solchen Zelle, welche in der Lage ist,
biologisch aktiven menschlichen von Willebrand-Faktor herzustellen, und
Isolierung des produzierten, biologisch aktiven menschlichen von
Willebrand-Faktors.
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Diese Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer
pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verfügung, welche biologisch aktiven
menschlichen von Willebrand-Faktor umfasst, umfassend die Kultivierung
einer solchen Zelle, die in der Lage ist, biologisch aktiven menschlichen
von Willebrand-Faktor zu produzieren, Isolierung und Reinigung des
produzierten, biologisch aktiven menschlichen von Willebrand-Faktors, und
Formulierung desselben zusammen mit einem pharmazeutisch zulässigen Träger
oder Corrigens zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
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In diesem Zusammenhang wird betont, dass es mittels solcher
pharmazeutischer Zusammensetzungen möglich ist, die Sicherheitsprobleme zu
umgehen, die mit der Verabreichung von vWF-Protein, das aus Blutproben von
normalen Einzelmenschen erhalten wird, verbunden sind.
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Um die Untersuchungen, die die Grundlage der Erfindung darstellen,
auszuführen, wurde Verwendung von den unten angegebenen Materialien und
Methoden gemacht.
MATERIALIEN UND METHODEN
cDNA-Klonierung:
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Die gesamte RNA wurde gereinigt aus in vitro kultivierten
Endothelzellen, die aus Venen menschlicher Nabelschnüre entstammten [Verweij,
C.L. et al (1985) Nucleic Acids Research 13 4699-4717, basierend auf der
niederländischen Patentanmeldung 85.00961]. Primer-dirigierte cDNA wurde
im wesentlichen gemäss einem beschriebenen Protokoll synthetisiert
[Gubler, U. et al (1983) Gene 25, 263-269; Toole, J.J. et al (1985)
Nature 312, 342-347]. Die cDNA-Synthese wurde durch Zugabe von EDTA und
SDS bis auf eine Endkonzentration von 20 mM respektive 0,1% gestoppt.
Die cDNA-Präparate wurden mit Phenol-Chloroform extrahiert, dann mit
Ethanol gefällt und durch Chromatografie auf Sephadex G-50 gereinigt. Im
Falle der Primer-dirigierten cDNA-Synthese mit dem Primer A
(5' CACAGGCCACACGTGGGAGC 3'), komplementär zu den Nukleotiden 6901 bis
6921, wurde das cDNA-Präparat mit BglII (Positionen 6836 und 2141) und
mit KpnI (Position 4748) verdaut. Darauffolgend wurde die verdaute cDNA
durch Chromatografie auf einer Sepharose CL-4B-Säule grössenfraktioniert.
Fraktionen, die eine cDNA grösser als etwa 600 Bp enthielten, wurden an
das Plasmid pMBL11 ligiert, mit BglII und KpnI verdaut. Eine
cDNA-Bibliothek von etwa 15.000 unabhängigen Kolonien wurde aufgestellt, wobei der
E. coli-Stamm DH1 als Wirt verwendet wurde, welche dann mit zwei
Oligonukleotidsonden (B und C) durchmustert wurde. Sonde B
(5, GAGGCAGGATTTCCGGTGAC 3'), komplimentär zu den Nukleotiden 4819 bis
4839 wurde zur Isolierung des plasmids pvWF2084 eingesetzt, das ein
2084 Bp BglII-KpnI-vWF-cDNA-Fragment enthielt, während Sonde C
(5' CAGGGACACCTTTCCAGGGC 3'), komplementär zu 2467 bis 2487, zur
Detektion des Plasmids pvWF2600 eingesetzt wurde, wobei es ein etwa 2600 Bp
KpnI-BglII-vWF-cDNA-Fragment enthielt.
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Unter Verwendung von Sonde C zur Primer-dirigierten Synthese
teilten die Anmelder das resultierende cDNA-Präparat in zwei Teile. Ein Teil
hörte mit C auf und wurde an ein Plasmid pUC9, das mit G aufhörte, wie
zuvor beschrieben, angebunden (Verweij, C.L. et al (1985) Nucleic Acids
Research 13, 4699-4717, basierend auf der niederländischen Anmeldung
85.00961) und verwendet, um E. coli DH1 zu transformieren. 6000
unabhängige Kolonien wurden mit einem "Nick-translatierten" 575 Bp BglII-BamHI-
vWF-cDNAFragment von pvWF2600 DNA hybridisiert. Ein positiver Klon, der
ein Plasmid mit dem längsten eingefügten Stück (etwa 1800 Bp, genannt
pvWF1800) enthielt, wurde für weitere Untersuchungen gewählt. Der andere
Teil des Primer-C-dirigierten cDNA-Präparates wurde mit EcoRI-Methylase
und nachfolgend mit T4-DNA-Polymerase und dNTPs behandelt, um stumpfe
Enden zu gewährleisten [Maniatis, Z. et al (1982) Molecular Cloning
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory]. Phosphorylierte EcoRI-
Linker [New England Biolabs, Beverly, MA] wurden an die Enden des cDNA-
Präparates ligiert und unumgesetzte Komponenten wurden durch Sephadex
G-50-Chromatografie entfernt. Die XhoI-Stelle, die etwa 350 Basenpaare
stromabwärts des 5'-Endes des vWF-cDNA eingefügten Segmentes von
pvWF1800-DNA gelegen war, wurde zu einer weiteren Selektion verwendet.
Nach Verdauung mit einem Überschuss von EcoRI und XhoI wurde
Chromatografie auf Sepharose CL-4B eingesetzt, um verdaute EcoRI-Linker zu
entfernen. Das Endpräparat wurde an das Plasmid pMBL11-DNA ligiert, welches mit
EcoRI plus XhoI verdaut worden war, und verwendet, um E. coli DH1 zu
transformieren. Eine Sammlung von etwa 10.000 unabhängigen Kolonien wurde
mit einem "Nick-translatierten" 350 Bp XhoI-HindIII-vWF-cDNA-Fragment aus
Plasmid pvWF1800 hybridisiert. Die HindIII-Stelle dieses Fragmentes
entstammte dem Polylinker des Vektors pUC9. Ein positiver Xlon, der das
längste eingefügte Segment enthielt (etwa 1330 Bp, bezeichnet als
pvWF1330), wurde weiter untersucht.
S1-Nukleaseschutz-Analyse:
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Die Anmelder verwandten eine Sonde für
S1-Nukleaseschutz-Experimente, und zwar ein Xhol-EcoRI-Fragment von etwa 5300 Bp (Sonde V) aus
Plasmid pvWF2600, das ein 2390 Bp-Segment (XhoI-KpnI), das aus vWF-cDNA
besteht (Fragment V, Fig. 1), enthält. Sonde II war ein 4800 Bp XbaI-EcoRI-
Fragment aus Plasmid-pvWF1330, welches ein 735 Bp XbaI-XhoI-vWF-cDNA-
Segment (Fragment II, Fig. 1) enthält. Die Fragmente wurden am 3'-Ende
markiert, wobei DNA-Polymerase I (grosses Fragment) [New England Biolabs,
Beverly, MA] verwendet wurde, um die einzelsträngigen Enden aufzufüllen
[Maniatis, T. et al (1982) Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory]. Nachfolgend wurden diese Sonden durch
Elektrophorese auf einem 0,7% niedrigschmelzenden Agarosegel isoliert und wie
beschrieben gereinigt [Wieslander, L. (1979) Anal. Biochem. 48, 305-309].
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Drei andere vWF-DNA-Fragmente wurden in doppelsträngigem M13mp18
subkloniert und als Sonden verwendet. Zu diesem Zweck wurde der
gegensinnige DNA-Strang einheitlich durch Verlängerung vom universellen
M13-Primer aus mit DNA-Polymerase I (grosses Fragment) markiert. Die
subklonierten Fragmente waren ein 1144 Bp XhoI-HindIII-Fragment von Plasmid
pvWF1800 (Fragment 111, Fig. 1), ein 585 Bp XbaI-EcoRI-Fragment von
Plasmid pvWF1330 (Fragment I , Fig. 1) und ein 575 Bp BamHI-BglII-Fragment
von Plasmid pvWF2600 (Fragment IV, Fig. 1). Nach der DNA-Synthese,
gestartet am M13-Primer, wurde doppelsträngige DNA mit sowohl HindIII wie
auch PvuII für Fragment III (wodurch Sonde 11 erhalten wurde), mit sowohl
XbaI wie auch EcoRI für Fragment I (wodurch Sonde I erhalten wurde) und
mit sowohl BamHI wie auch PvuII für Fragment IV verdaut (wodurch Sonde IV
erhalten wurde). Der gemeinsame Gedanke hinter der Konstruktion der
Sonden 11, III, IV und V ist, dass sie ein Segment von Vektor DNA enthalten,
das nicht komplementär mit endotheler RNA ist. Zum Beispiel enthalten
Sonden 111 und IV etwa 200 Bp, die M13mp18 entstammen. Diese Sonden
wurden der Elektrophorese auf einem 5% Polyacrylamid 8 M-Harnstoffgel
unterworfen und die Fragmente von Interesse wurden isoliert [Maxam A.G.
et al (1980) Methods Enzymol. 65, 499-560].
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S1-Nukleaseschutz-Experimente wurden im wesentlichen wie
beschrieben ausgeführt [Berk, A.J. et al (1977) Cell 12, 721-732]. 1 ug
menschlicher
endotheler polyA-RNA wurde zu einer radiomarkierten Probe von
10.000 bis 100.000 Counts pro Minute zugegeben, 10 Minuten lang auf 80ºC
erwärmt, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 60ºC für die Sonden
I, II, 111 und V, und bei 57ºC für die Sonde IV. Verdauung mit 200
Einheiten S1-Nuklease [Bethesda Research Lab., Gaithersburg, Md.] pro ml
während 20 Minuten bei 45ºC folgte. Unverdaute DNA wurde mit Ethanol
gefällt, und die Pellets wurden in dem geeigneten Beladungspuffer für eine
Elektrophorese auf einem 0,8%-igen alkalischen Agarosegel oder auf einem
6%-igen Polyacrylamid-Sequenzierungsgel aufgelöst [Maniatis, T. et al
(1982) Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory]. Das erste Verfahren wurde für die Sonden I und 111 angewandt,
wohingegen das zweite für die Sonden II, IV und V angewandt wurde.
Zusammenbau der vWF-cDNA in voller Länge:
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Zur Konstruktion des Plasmids pSP6330vWF, das ein kontinuierliches
vWF-cDNA-Segment von etwa 6331 Bp enthält, das sich von der HindIII-
Stelle (Position 2235) bis zur SacI-Stelle in der 3'-untranslatierten
Region (Position 8562) erstreckt, wurden die folgenden vWFcDNA-Fragmente
isoliert: Das 2517 Bp HindIII-KpnI-Fragment (Position 2236-4753) aus
pvWF2600 DNA, das 2084 Bp KpnI-BglII-Fragment (Position 4753-6837) aus
pvWF2084 DNA und das 1730 Bp BglII-SacI-Fragment (Position 6837-8567) aus
pvWF2280 DNA. Diese drei vWF-cDNA-Fragmente wurden gleichzeitig in den
Vektor pSP64 ligiert [Melton, D.A. et al (1984) Nucl. Acids Research 12,
7035-7056], und mit sowohl HindIII und SacI verdaut. Etwa die Hälfte der
resultierenden Transformanten enthielt ein Plasmid (pSP6330vWF genannt)
mit dem gewünschten vWF-cDNA-Insert von etwa 6331 Bp, wie durch
Restriktionsenzymanalyse verifiziert wurde.
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Zur Konstruktion des Plasmids pSP8800vWF, das eine vWF-cDNA voller
Länge enthielt, wurden die folgenden Fragmente isoliert: Das 6330 Bp
HindIII-EcoRI-Insert von Plasmid pSP6330vWF (die EcoRI-Stelle entstammt
dem auf dem Vektor vorliegenden Polylinker), das 1044 Bp XhoI-HindIII-
Fragment (Position 1092-2236) aus pvWF1800, und das 1327 Bp EcoRI-XhoI-
Fragment (Position 236-1092) aus pvWF1330. Ein fünffacher molarer
Überschuss jedes dieser drei Fragmente wurde wiederum gleichzeitig mit Vektor
pSP65-DNA ligiert, mit EcoRI gespalten und mit alkalischer Phosphatase
aus Kälberdarm behandelt [Boehringer, Mannheim, BRD]. Etwa 30% der
resultierenden Kolonien enthielten ein Plasmid mit dem gewünschten
eingefügten Segment der vWF-cDNA in voller Länge von etwa 8795 Bp, wie durch
Restriktionsenzymanalyse und Nukleotidsequenzanalyse bestätigt wurde.
In vitro-Transkription und -Translation:
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In vitro-Transkription linearer, auf SP6 basierender DNA-Muster mit
SP6-RNA-Polymerase [New England Nuclear, Dreieich, BRD], wurde in
Anwesenheit von 0,1 mM UTP, CTP und ATP, 0,05 mM GTP und 2 mM m7G(5')ppp(5')G
[Pharmacia, Uppsala, Schweden] durchgeführt, um mRNA-Präparate mit einem
gekappten Ende herzustellen [Melton, D.A. et al (1984) Nucl. Acids
Research 12, 7035-7056]. In vitro-Translation solcher 5'-verkappten mRNAs
wurde in einem Kaninchen-Reticulocytenlysat-System durchgeführt [New
England Nuclear, Dreieich, BRD], und zwar gemäss den Beschreibungen des
Herstellers.
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Analyse der in vitro-Translationsprodukte wurde durch
Elektrophorese auf einem 8 ob SDS-Polyacrylamidgel wie beschrieben durchgeführt
[Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 650-655].
ERGEBNISSE
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Konstruktion von cDNA-Klonen eines vWF-Teils und Zusammenbau der
vWF-cDNA in voller Länge:
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In der Vergangenheit haben die Anmelder und andere über die
Konstruktion von Plasmiden berichtet, die einen Teil einer cDNA des vWF in
voller Länge enthielten (Verweij, C.L. et al (1985) Nucleic Acids
Research 13, 4699-4717, basierend auf der niederländischen
Patentanmeldung 85.00961; Lynch, D.C. et al (1985) Cell 41, 49-56; Ginsburg, M. et
al (1985) J. Biol. Chem. 260, 3931-3936; Sadler, J.E. et al (1985) Proc.
Nucl. Acad. Sci. USA 82, 6394-6398]. Die ausgedehnteste vWF-cDNA, die die
Anmelder aus einer Oligo(dT)-geprimten menschlichen
Endothel-cDNA-Bibliothek erhielten, umfasste etwa 2280 Bp (pvWF2280). Nukleotidsequenzanalyse
ergab, dass dieses cDNA-eingefügte Segment (Insert) am polyA-Ende von
vWF-mRNA startete. Um eine cDNA für vWF in voller Länge zu konstruieren,
haben die Anmelder zusätzliche, überlappende vWFcDNA-Sequenzen, welche
stromaufwärts von pvWF2280 gelegen sind, isoliert. Zu diesem Zweck wurden
zwei biochemische Selektionen ausgeführt, um die Anzahl der vWF-cDNA
beinhaltenden Plasmide zu erhöhen. Zunächst wurden Oligonukleotidprimer,
abgeleitet aus den Nukleotidteilsequenzen [Sadler, J.E. et al (1985)
Proc. Nucl. Acad. Sci. USA 82, 6394-6398], synthetisiert, um die cDNA-
Synthese mit menschlicher Endothel-polyA-RNA als Substrat zu dirigieren.
Als zweites wurden cDNA-Präparate mit speziellen
Restriktionsendonukleasen verdaut, welche bekannt sind, vWF-cDNA an einer beschränkten Anzahl
von Stellen zu schneiden [Ginsburg, M. et al (1985) J. Biol. Chem. 260,
3931-3936; Sadler, J.E. et al (1985) Proc. Nucl. Acad. Sci. USA 82,
6394-6398]. Diese Restriktionsstellen können im folgenden verwendet
werden, um eine vWF-cDNA in voller Länge zusammenzusetzen. Die
Klonierungsstrategie ist in Fig. 1A dargestellt. Die Plasmide, die benachbarte
vWF-cDNA-Sequenzen enthielten, wurden pvWF1330, pvWF1800, pvWF2600,
pvWF2084 und pvWF2280 bezeichnet. Die Nukleotidsequenz des 5'-Teils von
pvWF1330 DNA (entsprechend dem 5'-Ende von vWF-mRNA) enthüllte, dass
Nonsense-Codons in allen drei Leserahmen vorlagen. Aus diesem Befund
schliessen die Anmelder, dass pvWF1330-DNA über das
Translationsinitiationscodon hinausreicht.
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S1-Nukleaseschutz-Experimente mit menschlicher Endothel-RNA wurden
ausgeführt, um zu beweisen, dass die verschiedenen vWF-cDNA-Inserte der
vWF-mRNA voll komplementär sind. Die Konstruktion der Sonden und die
verwendeten Bedingungen sind im Abschnitt "Materialien und Methoden"
beschrieben. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt. In allen Fällen ist die
Länge der geschützten Fragmente in Übereinstimmung mit der vorhergesagten
Länge der verschiedenen Sonden. Aus diesen Daten schliessen die Anmelder,
dass die vWF-cDNA-eingefügten Segmente von pvWF1330, pvWF1800 bzw.
pvWF2600 DNA vollständig komplementär zur vWF-mRNA sind. Es wurde bereits
zuvor gezeigt, dass die Nukleotidsequenz der verbleibenden
cDNA-insertierten Segmente von Plasmid pvWF2084 und pvWF2280 der veröffentlichten
Sequenz entsprechen [Sadler, J.E. et al (1985) Proc. Nucl. Acad. Sci. USA
82, 6394-6398]. Infolgedessen sind die verschiedenen benachbarten
vWF-cDNA-Sequenzen originalgetreue Kopien von vWF-mRNA.
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Die vWFcDNA-Sequenzen, die die Anmelder konstruiert haben,
überspannen eine Länge von etwa 8900 Bp. Diese Länge ist mit der Grösse von
vWF-mRNA konsistent, wie sie durch Northern blot-Analyse von menschlicher
Endothel(polyA)RNA bestimmt wurde [Verweij, C.L. et al (1985) Nucleic
Acids Research 13, 4699-4717, basierend auf der niederländischen
Patentanmeldung 85.00961]. Eine detaillierte Beschreibung der Zusammensetzung
der vWF-cDNA in voller Länge ist in dem Abschnitt "Materialien und
Methoden" gegeben. Die korrekte Zusammensetzung der assemblierten cDNA des vWF
in voller Länge wurde durch Restriktionsenzymanalyse festgestellt.
Nukleotidsequenz von vWF-cDNA der vollen Länge:
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Nukleotidsequenzanalyse von vWF-cDNA-Fragmenten wurde sowohl
mittels der chemischen Abbaumethode [Maxam, A.M. et al (1977)), wie auch
durch die Dideoxy-Kettenabbruchmethode [Sanger, F. et al (1977) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467] gemäss dem in Fig. 1A skizzierten
Schema ausgeführt. In Fig. 3 sind die Nukleotidsequenz von etwa 8806
Resten, die vom 5'-Ende der vWF-mRNA ausgeht, und die entsprechende
vorhergesagte Aminosäuresequenz dargestellt. Über die verbleibende
Nukleotidsequenz des 3'-Teils der vWF-mRNA wurde zuvor berichtet [Sadler, J.E.
et al (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6394-6398; Verweij, C.L. et
al (1985) Nucleic Acids Research 13, 4699-4717, basierend auf der
niederländischen Patentanmeldung 85.00961]. Allgemein zeigt der
Überlappungsteil unserer Nukleotidsequenz der vWF-cDNA mit der von Sadler, J.E. et al
(1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA 82, 6394-6398, keine Unterschiede. Die
ersten 12 Nukleotide jedoch (entsprechend den Positionen 2217-2229) am
5'-Ende der vWF-cDNA auf dem Phagen lambda-HvWF1, der von diesen Autoren
konstruiert wurde, sind vollständig abweichend von unserer Sequenz,
welche ausgehend von drei unabhängigen überlappenden cDNA-eingefügten
Segmenten aufgestellt wurde. Eine weitere Diskrepanz wurde in Position 2309
beobachtet. Unsere Analyse ergibt einen C-Rest, wohingegen Sadler, J.E.
et al (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6394-6398, einen A-Rest
berichten, was in einem Prolin bzw. einem Histidin in dieser speziellen
Position resultiert. Dieser Unterschied könnte in einem Polymorphismus im
vWF-Gen liegen, obwohl der Prolinrest unabhängig davon durch
automatisierte Aminosäuresequenzanalyse des reifen vWF-Proteins ermittelt wurde
[Hessel, B. et al (1984) Thrombosis Research 35, 637-651].
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Die Gesamtlänge, die von den benachbarten vWF-cDNASequenzen
überspannt wird, beträgt 8814 Bp, unter Ausschluss des polyA-Endes von
vWF-mRNA. Die Translationsinitiationsstelle wurde dem angezeichneten
ATG-Codon zugeordnet (Position 1 bis 4), welches das erste Initiatorcodon
stromabwärts des TAG-Nonsense-Codons (Position -79 bis -82) ist, welches
gefolgt wird von einem offenen Translationsleserahmen von 8439
Nukleotiden [abgeleitet von unseren Sequenzdaten und denen von Sadler, J.E. et al
(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6394-6398). Diese Zuordnung wird
durch die Beobachtung gestützt, dass die vorhergesagten 22 N-terminalen
Aminosäurereste die charakteristischen Merkmale eines Signalpeptides
aufweisen. Die Spaltungsstelle für eine Signalpeptidase mit der höchsten
Wahrscheinlichkeit liegt zwischen den Glycin- und Alaninresten bzw. bei
Position 22 und 23 [Von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133, 17-21]. Dem
vorgeschlagenen Translationsinitiationscodon geht eine untranslatierte
Region von mindestens 230 Nukleotiden voraus.
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Eine kontinuierliche vWF-cDNA-codierende Sequenz von 8439 Bp
programmiert möglicherweise die Synthese eines Polypeptides von 2813
Aminosäureresten mit einem berechneten Molekulargewicht von 309 kD. Nach dem
Wissen der Anmelder stellt dies die längste codierende Sequenz, die bis
heute bestimmt wurde, dar. Eine computerunterstützte Recherche nach
(partiellen) homologen Aminosäuresequenzen mit anderen Proteinen, die in der
NIH-Proteinsequenz-Datenbank enthalten sind, ergab keine wesentlichen
Ahnlichkeiten mit anderen Proteinen. Ausserdem wurde berichtet, dass das
reife vWF-Protein ein Glycoprotein ist, das etwa 15% Kohlehydratreste
enthält [Sodetz, J.M. et al (1979) J. Biol. Chem. 254, 10754-10760]. Wenn
angenommen wird, dass die Kohlehydrateinheiten auch etwa 15 Gew.% zum
berechneten Molekulargewicht von pro-vWF beitragen, dann wird das
Molekulargewicht von pro-vWF etwa 350 kD betragen.
Besonderheiten der Aminosäuresequenz von Pre-vWF:
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Ein Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenz (Fig. 3) mit der
ermittelten N-terminalen Aminosäuresequenz von reifem vWF-Protein
[Hessel, B. et al (1984) Thrombosis Research 35, 637-651] bestätigt
unsere vorhergehende Annahme [Verweij, C.L. et al (1985) Nucleic Acids
Research 13, 4699-4717, basierend auf der niederländischen Patentanmeldung
85.00961], dass das vWF-Vorläuferprotein beträchtlich grösser ist als das
bekannte 260 kD Glycoprotein [Wagner, D.D. et al (1983) J. Biol. Chem.
258, 2065-2067]. Ein Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenz mit
der N-terminalen Sequenz des reifen (225 kD) vWF-Proteins zeigt, dass die
Nukleotidsequenz, welche reifes vWF-Protein codiert, bei Position 2290
beginnt. Diese Schlussfolgerung impliziert, dass das vWF-Vorläuferprotein
763 Aminosäurereste grösser ist als das reife Protein. Offensichtlich
wird diese Pro-Sequenz (berechnetes MW 81 kD) durch Protein-Processing
entfernt, woraus das reife vWF-Glycoprotein mit einem Molekulargewicht
von etwa 225 kD entsteht.
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Ein Homologiematrixvergleich der Aminosäuresequenz des
vWF-Vorläuferproteins ergibt eine Vervierfachung einer Domäne (D1, D2, D3, D4) mit
einer Länge von etwa 350 Aminosäureresten. Ein Teil dieser Domäne (D',
etwa% Aminosäuren) scheint am N-Terminus des reifen vWF vorzuliegen.
Fig. 4A zeigt die Anordnung dieser sich wiederholenden Domänen. Ein
entscheidendes Merkmal der Pro-Sequenz ist, dass es hauptsächlich aus einer
Verdoppelung der D-Domäne (D1, D2) besteht. Die Wiederholungseinheiten
weisen eine signifikante Konservierung der Position von Cysteinresten
auf, welche einen Hinweis auf eine strukturelle Ähnlichkeit der sich
wiederholenden Einheiten darstellt. Interessanterweise umfasst die Pro-
Sequenz eine Arginin-Glycin-Asparaginsäure-Seguenz ("RGD"-Sequenz) bei
Position 698-702. Es ist gezeigt worden, dass ein Tetrapeptid mit der
erwähnten Aminosäuresequenz mit Proteinen mit einer ähnlichen Sequenz, die
an der Zellzusammenlagerung beteiligt sind, konkurrieren kann
[Pierschbacher, M.D. et al (1984) Nature 309, 30-33]. Es wurde bemerkt, dass eine
weitere RGD-Sequenz am C-terminalen Teil des reifen vWF-Proteins vorliegt
[Sadler, J.E. et al (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6394-6398].
In vitro-Translation von vWF-mRNA:
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Eine vWF-cDNA von voller Länge wurde zusammengesetzt, um ihre
Codierfähigkeit für ein unglycosyliertes Vorläufer-Protein mit einem MW von
etwa 300 kD zu demonstrieren. vWF-cDNA in voller Länge wurde in das
Plasmid pSP65 insertiert. Dieses Plasmid enthält den S.
Typhimurium-Bakteriophagen-SP6-Promotor, welcher eine in vitro-"Run off"-Transkription von
klonierten DNA-Sequenzen erlaubt, spezifisch dirigiert durch SP6-RNA-
Polymerase [Melton, D.A. et al (1984) Nucl. Acids Research 12,
7035-7056]. Solche mRNA-Präparate können effizient unter Verwendung eines
Reticulocytenlysates translatiert werden.
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Zu Beginn wurde Plasmid pSP6330vWF (Fig. 1B) konstruiert, das eine
kontinuierliche 6331 Bp vWFcDNA-Sequenz beinhaltet. Dieses Plasmid
enthält die vollständige Codiersequenz für reifen vWF und zusätzlich eine
Sequenz, die 18 Aminosäurereste vom C-terminalen Teil der Pro-Sequenz
codiert. Der Beginn der Proteinsynthese, dirigiert durch aus
pSP6330vWF-DNA transkribierte RNA, sollte am Methionincodon 8 Aminosäuren
stromabwärts des N-Terminus von reifem vWF stattfinden. Translation der
in vitro synthetisierten vWF-mRNA wird dann ein (unglycosyliertes)
Polypeptid mit einem berechneten MW von 220 kD ergeben. Darauffolgend wurde
pSP8800vWF (Fig. 1B) konstruiert, das die vollständige codierende Sequenz
für Pre-vWF enthält. Dieses Plasmid wird ein Protein mit einem
berechneten Molekulargewicht von 309.250 D codieren. Die Plasmide pSP6330vWF und
pSP8800vWF wurden mit EcoRI bzw. SalI linearisiert und in vitro
transkribiert. Die Ergebnisse der in vitro-Translation der verschiedenen
vWF-mRNAs sind in Fig. 5 gezeigt. Die durch pSP6330vWF-DNA codierten
Polypeptide zeigen ein MW von etwa 200 kD. Die Diskrepanz dieses MW mit
dem berechneten MW (220 kD) ergibt sich möglicherweise aufgrund einer
Ungenauigkeit in der MW-Abschätzung von grossen Proteinen in diesen Gelen.
Die vollständige Codiersequenz von pSP8800vWF-DNA wird in ein Polypeptid
mit einem MW, das wesentlich grösser als 200 kD ist, translatiert. Um
eine genauere MW-Abschätzung für dieses aussergewöhnlich lange Polypeptid
zu erreichen, stellten wir überlappende Polypeptidteile her, die aus
ausgewählten Teilen der cDNA für vWF in voller Länge abgeleitet waren. Zu
diesem Zweck wurde pSP8800vWF-DNA mit BamHI verdaut, und das Transkript
(2855 nt lang) wurde translatiert. Es sollte bemerkt werden, dass
405 Nukleotide am 3'-Ende dieses Transkripts den 5'-Terminus des
Transkripts darstellen, das aus pSP6330vWF, das mit EcoRI gespalten
wurde, erzeugt wird. Daher sollte ein Zusammenzählen der MWs der oben
erwähnten Polypeptide in einem MW von etwa 309 kD resultieren, nachdem die
gemeinsame Proteinregion subtrahiert wurde. Das Protein, das von der mit
BamHI verdauten Schablone abgeleitet wurde, hat ein geschätztes MW von
etwa 100 kD, während, wie zuvor gezeigt, die mit EcoRI gespaltene
Schablone pSP6330vWF ein Produkt von etwa 200 kD ergibt. Zusammenzählen
dieser MWs und Subtraktion der gemeinsamen Region (15 kD) resultiert in
einem geschätzten MW von 285 kD, welches in Übereinstimmung mit dem
berechneten MW von 309.250 D ist. Ferner ergibt die Translation von
Transkripten (1320 Nukleotide), abgeleitet aus pSP8800vWF-DNA, die mit
XhoI verdaut wurde, ein Polypeptid mit einem MW von 39 kD. Dieses
Ergebnis stimmt mit der Zuordnung der Translationsinitiationsstelle bei
Position 1 bis 4 überein.
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Aus diesen Daten schliessen die Anmelder, dass sie eine cDNA für
vWF in voller Länge mit einer codierenden Sequenz von 8439 Bp konstruiert
haben, welche die Synthese eines Vorläufer-vWF-Proteins programmiert, das
aus 2813 Aminosäureresten besteht.
DISKUSSION
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Diese Erfindung erreicht die Konstruktion eines Plasmids, das
vWF-cDNA in voller Länge enthält. Nukleotidsequenzanalyse [diese
Patentanmeldung; Verweij, C.L. et al (1985) Nucleic Acids Research 13,
4699-4717 basierend auf der niederländischen Patentanmeldung 85.00961;
Sadler, J.E. et al (1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA 82, 6394-6398] ergab,
dass die Länge der assemblierten vWF-cDNA, unter Ausschluss der vom
polyA-Schwanz abgeleiteten cDNA, 8805 Bp beträgt. Dieses Resultat stimmt
mit der Länge von vWF-mRNA überein (etwa 9000 Nukleotide), wie durch
Northern Blot-Analyse von Endothel(polyA)RNA bestimmt wurde [Verweij,
C.L. et al (1985) Nucleic Acids Research 13, 4699-4717, basierend auf der
niederländischen Patentanmeldung 85.00961). Die vollständige
Codiersequenz für ein Vorläufer-vWF-Protein beträgt 8439 Bp, entsprechend einem
unglycosylierten Polypeptid mit einem MW von etwa 309 kD. Die
Translationsinitiationsstelle für dieses Protein konnte dem ATG-Codon in
Position 1 bis 4 zugeordnet werden (siehe Fig. 3). Diese Zuordnung stimmt mit
den Ergebnissen von in vitro-Translations-Experimenten mit Teilen der
vWF-mRNA in voller Länge überein, die durch das SP6-Transkriptionssystem
erzeugt wurden. Das glycosylierte Protein wird, sogar nach Entfernung
eines Signalpeptides, beträchtlich grösser sein als 300 kD. Es wurde
berichtet, dass das Molekulargewicht, das dem Vorläufer-Glycoprotein für
reifen vWF zugeschrieben wird, 260 kD beträgt [Wagner, D.D. et al (1983)
Biol. Chem. 258, 2065-2067). Die Diskrepanz mit dem MW, das die Anmelder
dem Vorläufer-Protein zuordnen, kann von einer Ungenauigkeit der
MW-Abschätzungen durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese herrühren, wie
sie bei grossen (Glyco)proteinen inhärent ist.
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Die Sequenz, die reifen vWF codiert, beginnt bei 2286 Bp
stromabwärts des Translationsinitiationscodons, wie aus einem Vergleich der
festgestellten N-terminalen Aminosäuresequenz von reifem vWF [Hessel, B.
et al (1984) Thrombosis Research 35, 637-651] mit der vorhergesagten
Aminosäuresequenz (Fig. 3) geschlossen wurde. Es wurde gezeigt, dass
diese 2286 Bp lange Prepro-Sequenz in der Lage ist, ein Polypeptid mit einem
berechneten MW von 83 kD zu codieren.
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Infolgedessen wird das Pro-vWF-Protein durch eine Protease
weiterverarbeitet, wodurch sich zwei unterschiedliche Polypeptide ergeben. Es
ist denkbar, dass die spezifische Spaltung zwischen den Arginin- und
Serinresten in den Positionen 763 und 764 innerhalb der Weibel-Palade-
Körper der Endothelzelle geschieht, da in Anwesenheit eines
Proteaseinhibitors (PMSF) ein Komplex von reifem vWF mit einem weiteren Glycoprotein,
bezeichnet als von Willebrand-Antigen II (vW AgII) [Montgomery, R.R. und
Zimmerman, T.S. (1978) J. Clin. Invest. 61, 1498-1507], in diesen
Organellen detektiert werden kann. Verschiedene Argumente können vorgebracht
werden, welche darauf hinweisen, dass es wahrscheinlich ist, dass die
Pro-Sequenz des Vorläufer-vWF-Proteins identisch ist mit vW AgII.
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(i) Das MW der unglycosylierten Pro-Sequenz (83 kD) stimmt mit dem
berichteten MW des vW AgII-Glycoproteins von 98 kD überein.
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(ii) Es wurde gezeigt, dass sowohl vWF wie auch vW AgII durch
kultivierte Endothelzellen synthetisiert werden, und dass diese Proteine
zugleich bei Stimulierung mit 1-Desamino-8-D-argininvasopressin (DDAVP)
[McCarroll, D.R. et al (1984) Blood 63, 532-535] freigesetzt werden.
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(iii) Unter Verwendung von Immunofluoreszenztechniken wurde
gezeigt, dass beide Proteine in der perinuklearen Region und in den Weibel-
Palade-Körpern lokalisiert sind [McCarrol, D.R. et al (1985), J. Clin.
Invest. 75, 1089-1095].
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(iv) Sowohl vWF wie auch vW AGII liegen in Blutplättchen vor und
werden zusammen nach der Blutplättchenaktivierung freigesetzt.
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(v) Die Konzentrationen von vWF und vW AgII-Protein sind im Plasma
linear verknüpft, und beide Proteine fehlen in Plasma und Blutplättchen
eines Patienten mit einer schweren von Willebrand-Krankheit.
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(vi) Wie zuvor erwähnt, kann ein Komplex zwischen vWF und vW AgII
in Anwesenheit eines Serinproteaseinhibitors (PMSF), und nicht in
Abwesenheit des Inhibitors detektiert werden.
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Die vorhergesagte Aminosäuresequenz der Pro-Sequenz zeigt eine
bemerkenswerte Struktur auf. Sie ist aus einem duplizierten Segment mit
einer Länge von etwa 350 Aminosäureresten zusammengesetzt. Diese zwei
Segmente weisen eine 37%-ige Aminosäurehomologie auf. Darüber hinaus
weisen sie eine beträchtliche Konservierung ähnlich lokalisierter
Cysteinreste auf, was darauf hinweist, dass Strukturmerkmale innerhalb
dieser direkten Wiederholungseinheiten erhalten wurden. Zwei Kopien
dieser Wiederholungseinheiten innerhalb der Pro-Sequenz liegen auch
innerhalb des reifen vWF vor, wohingegen ein Teil dieser Wiederholungsregion
am N-Terminus von reifem vWF vorliegt. Interne homologe Regionen wurden
auch von Sadler, J.E. et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 82, 6394-6398
(1985), berichtet, wovon zwei dupliziert wurden, während eine in
dreifacher Form vorliegt (Fig. 4B). Diese Wiederholungssequenzen überspannen
eine Länge von etwa 1070 Aminosäureresten im reifen vWF-Protein. Die
Wiederholungsstrukturen, die die Anmelder gefunden haben, sind unabhängig
von denen, die von Sadler, J.E. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82,
6394-6398 (1985), berichtet wurden. Aus diesen Daten schliessen die
Anmelder, das etwa 90 ob des Vorläufer-vWF-Proteins aus
Wiederholungsregionen zusammengesetzt ist, was darauf hinweist, dass das Vorläufer-vWF-Gen
sich aus einer Reihe von Verdoppelungsereignissen von mindestens vier
verschiedenen Regionen entwickelt hat.
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Die Pro-Sequenz kann an der Bildung von grossen Multimeren
teilhaben, welche aus vWF-Dimeren zusammengesetzt sind [Wagner, D.D. und
Marder, V.J. (1984), J. of Cell Biology 99, 2123-2130; Lynch, D.E. et al
(1983), The Journal of Biological Chemistry 258, 12757-12760]. In diesem
Zusammenhang kann es relevant sein, festzustellen, dass Pro-vWF extrem
reich an Cysteinen ist (8,1%), welche hauptsächlich in den N- und
C-terminalen Teilen des Proteins lokalisiert sind. Der Cysteingehalt der
Pro-Sequenz ist sogar höher (8,6%). Es wurde gezeigt [Fowler, W.E. et
al, J. Clin. Invest. 76, 1491-1500 (1985)], dass Disulfidbrücken an den
C-Termini von vWF stäbchenförmige Domänen bilden müssen, welche zwei
Untereinheiten verbinden. Multimerbildung sollte durch Verbindung dieser
Dimere, wahrscheinlich wiederum durch Disulfidbrücken an ihren N-Termini,
geschehen, wodurch globuläre Domänen erzeugt werden. Freie
Sulfhydrylgruppen der Cysteinreste in der Pro-Sequenz sind wahrscheinlich eine
Grundvoraussetzung für die Bildung von Multimeren.
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Die Anwesenheit einer "RGD(C)"Aminosäuresequenz innerhalb der
Pro-Sequenz kann auf eine weitere Funktion dieses Proteins hinweisen. Es
wurde gezeigt, dass eine RGD enthaltende Region auf Proteinen, wie etwa
Fibronectin und Vitronectin, eine entscheidende Rolle bei der
Wechselwirkung mit Rezeptoren auf einer Zelloberfläche spielt [Pierschbacher, M.D.
und Rouslahti, E. (1984) Nature 309, 30-33; Pytela, R, et al, Proc, Nat.
Acad. Sci. USA 82, 5766-5770). Diese Wechselwirkungen werden durch RGD
enthaltende Peptide inhibiert. Eine Wechselwirkung von reifem vWF mit
aktivierten Blutplättchen wird auch durch RGD enthaltende Peptide
inhibiert, was nahelegt, dass diese Region auf vWF an der
Blutplättchenbindung beteiligt ist [Ginsburg, M. (1985) J. Biol. Chem. 260, 3931-3936;
Haverstick, P.M. et al (1985) Blood]. Auf der Grundlage der Anwesenheit
einer RGD-Sequenz sowohl in reifem vWF wie auch der Pro-Sequenz, welche
vW AgII äquivalent sein kann, und einer erstaunlichen Homologie und einer
strukturellen Konservierung zwischen diesen zwei Proteinen, nehmen die
Anmelder an, dass die Pro-Sequenz eine ähnliche Funktion wie das reife
vWF-Protein in einer spezifischen Wechselwirkung mit speziellen
Zelloberflächenrezeptoren haben könnte.
LEGENDEN ZU DEN FIGUREN
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Fig. 1: Strategie zur Konstruktion von vWF-cDNAs, dem Zusammenbau
von vWF-cDNA in voller Länge und der Bestimmung der Nukleotidsequenz.
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(A) vWF-mRNA ist durch einen Balken dargestellt; offene Fläche,
Signalpeptid codierende Region; gestrichelte Fläche, Pro-Sequenz
codierende Region; ausgefüllte Fläche, reifen vWF codierende Region.
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Die Oligonukleotide (20-mere) A (6901-6921), B (4819-4839) und C
(2467-2487), welche zur Primerdirigierten cDNA-Synthese und/oder als
Sonden für Hybridisierungen verwendet wurden, sind durch kleine Balken
gekennzeichnet. Das 575 Bp BglII-BamHI- und das 350 Bp HindIII-XhoI-
Fragment, welche als Sonden für das Kolonie-Screening verwendet wurden,
sind durch offene Balken gekennzeichnet. Unter der schematischen
Darstellung der vWF-mRNA sind die fünf benachbarten vWF-Teil-cDNAs gegeben,
welche zur Zusammensetzung der vWF-cDNA in voller Länge und für die
Nukleotidsequenzierung verwendet wurden; die Fragmente I, II, 111, IV und V,
welche in den S1-Nukleaseschutz-Experimenten verwendet wurden, sind
oberhalb
des vWF-cDNA-Inserts, von welchem sie abgeleitet wurden, gezeigt.
Die Pfeile zeigen die Nukleotidsequenzierungsstrategie an. Im Fall der
Sequenzanalyse nach dem Verfahren von Maxam und Gilbert (1977) wird die
Position der radoaktiven Markierung durch eine kurze vertikale Linie am
Ende eines Pfeils angegeben. Die Schrägstriche am Ende der Pfeile
bedeuten, dass die Endmarkierung an einem Terminus war, der durch Vektor-DNA
spezifiziert war. Es werden nur Restriktionsendonukleasenstellen
angegeben, welche in dieser Untersuchung relevant sind. B, BamHI; Bg, BglII; E,
EcoRI; H, HindIII; K, KpnI; M, Mst I; N, NarI; P, PvuII; S, SalI; Sc,
SacI; X, XbaI; Xh, XhoI.
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(B) Zusammenbau der vWF-cDNA in voller Länge. Plasmid pSP6330vWF
enthält eine 6331 Bp vWF-cDNA-Sequenz, die sich von der HindIII-Stelle
(Position 2235) bis zur SacI-Stelle (Position 8562) erstreckt,
subkloniert in Vektor pSP64. Plasmid pSP8800vWF schliesst vWF-cDNA in voller
Länge ein, die sich von der EcoRI-Stelle (siehe Tafel A) bis zur SacI-
Stelle (Position 8562) erstreckt, subkloniert in Vektor pSP65.
Restriktionsendonukleasestellen, die die Fragmente begrenzen, die zum
Zusammenbau der vWF-cDNA von voller Länge verwendet wurden, sind mit einem Stern
bezeichnet. Die EcoRI-Stelle am 5'-Ende der vWF-cDNA in voller Länge
rührt vom EcoRI-Linker her, der zur Konstruktion von pvWF1330-DNA
verwendet wurde. Die Stellen für Restriktionsenzyme, welche verendet wurden, um
Plasmid-DNAs für eine in vitro-"Run off"-Transkription durch SP6-RNA-
Polymerase zu linearisieren, sind durch einen Punkt gekennzeichnet. Die
SalI-Stelle in Plasmid pSP8800vWF und die EcoRI-Stelle in Plasmid
pSP6330vWF liegen in den Polylinkern der pSPTyp-Vektoren vor.
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Fig. 2: S1-Nukleaseschutzanalyse. Endothel-polyA+RNA wurde mit
[32P]-markierten Sonden hybridisiert, welche vWF-cDNASequenzen
enthielten. Die Konstruktion der verschiedenen Sonden und die verwendeten
Bedingungen sind in Abschnitt "Experimentelles Vorgehen" beschrieben. Die
vWF-cDNA-Segmente, die in den Proben vorliegen, sind in Fig 1 gezeigt.
Tafel A zeigt die Ergebnisse nach Elektrophorese der Proben in einem
0,8%-igen alkalischen Agarosegel. Tafel B gibt die Resultate nach
Elektrophorese in einem 6%-igen Polyacrylamid-8 H Harnstoffgel an. Spuren 1:
Hybridisierung mit Sonde III, enthaltend das 1444
Bp-vWFcDNA-Fragment 111 (Fig. 1). Spuren 2: Hybridisierung mit Sonde V, enthaltend das
2400 Bp vWF-cDNA-Fragment V (Fig. l). Spuren 3: Hybridisierung mit Sonde
I, welche dem 585 Bp vWF-cDNA-Fragment I (Fig. 1) äquivalent ist. Spuren
4: Hybridisierung mit Sonde IV, enthaltend das 565 Bp
vWF-cDNA-Fragment
IV (Fig 1). Spuren 5: Hybridisierung mit Sonde II, enthaltend das
765 Bp vWF-cDNA-Fragment II (Fig. 1). Symbole: -, Inkubierung der
hybridisierten Komponenten in Abwesenheit von S1-Nuklease; +, Inkubierung der
hybridisierten Komponenten in Anwesenheit von S1-Nuklease; c, Inkubierung
der Proben mit S1-Nuklease nach Hybridisierung in Abwesenheit von
Endothel-polyA+RNA; M, einzelstrangige DNA-Längenmarkierer.
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Fig. 3: Nukleotidsequenz von 8806 Bp von vWF-cDNA, abgeleitet vom
5'-Terminus von vWF-mRNA. Die Zählung beginnt am vermuteten
ATG-Translationsinitiationscodon. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz wird unterhalb
der Nukleotidsequenz gezeigt und separat numeriert, wobei wiederum vom
vermuteten Methionin-Translationsinitiationscodon ausgegangen wird.
Potentielle N-gebundene Glycosylierungsstellen sind unterstrichen. Das
Tripeptid Arginin-Glycin-Asparaginsäure ist eingerahmt.
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Fig. 4: Interne Homologie mit dem Vorläufer für vWF.
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(A) Anordnung der Aminosäuresequenzen der vier Wiederholungsdomänen
D1, D2, D3, D4 und D'. Die EinBuchstaben-Notierung wird verwendet, und
die Aminosäuren werden numeriert, wie in Fig. 3 bezeichnet. Reste, welche
unter den vier oder fünf Wiederholungseinheiten identisch sind, sind
eingerahmt.
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(B) Schematische Darstellung von internen homologen Einheiten in
Pro-vWF. Gezeigt sind die verdreifachte Domäne A (A1, A2 und A3) und zwei
verdoppelte Domänen B (B1 und B2) und C (C1 und C2), wie von Sadler et al
(1985) berichtet, und die vervierfachte Domäne D (D1, D2, D3 und D4). Die
Zahlenposition dieser Wiederholungseinheiten werden aufgelistet: A1
(Reste 1242-1480), A2 (1480-1673), A3 (1673-1875), B1 (2296-2331), B2
(2375-2400), C1 (2400-2516), C2 (2544-2663), D1 (34- 7), D2 (387-746)> ,
D3 (866-1242), D4 (1947-2299) und D' (769-866).
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Fig. 5: In vitro-Translation von vWF-mRNA.
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Gekappte vWF-mRNA wurde in vitro hergestellt, wobei die "Run off"-
Transkription mit SP6-RNA-Polymerase verwendet wurde, wie im Abschnitt
"Experimentelles Vorgehen" beschrieben. Die RNA-Präparate wurden zu einem
Reticulocytenlysat-Translationssystem zugegeben, das [35S]-Methionin
enthielt, und Polypeptide wurden 90 Minuten lang synthetisiert. Die
Polypeptide wurden auf einem 8%-igen SDS-Polyacrylamidgel fraktioniert und dann
der Fluorografie unterworfen. N: MW-Marker-Proteine. E: endogen
synthetisierte Polypeptide (ohne zugegebene RNA). Spur 1: Polypeptide, die durch
vWF-mRNA, transkribiert aus pSP6330vWF-DNA, codiert werden, verdaut mit
EcoRI. Spur 2: Polypeptide, die durch vWF-mRNA, das aus pSP8800vWF-DNA
transkribiert wurde, codiert werden, verdaut mit SalI. Spur 3:
Polypeptide, die durch vWF-mRNA, das aus pSP8800vWF-DNA transkribiert wurde,
codiert werden, verdaut mit BamHI. Spur 4: Polypeptide, die duch vWF-mRNA
codiert werden, die aus pSP8800vWF-DNA transkribiert und mit XhoI verdaut
wurde.
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Eine Probe des rekombinanten DNA-Plasmids pSP8800vWF im Stamm
E. coli DH1 wurde am "Centraalbureau vor Schimmelcultures" in Baarn,
Niederlande, unter der Nummer CBS 163.86 am 26. März 1986 hinterlegt.