JP2000245476A

JP2000245476A - β−プリメベロシダーゼ遺伝子

Info

Publication number: JP2000245476A
Application number: JP11056299A
Authority: JP
Inventors: Kanzo Sakata; 完三坂田; Masaharu Mizutani; 正治水谷
Original assignee: Amano Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1999-03-04
Filing date: 1999-03-04
Publication date: 2000-09-12
Anticipated expiration: 2019-03-04
Also published as: WO2000052177A1; EP1158052A4; JP4311799B2; ATE301199T1; EP1158052A1; EP1158052B1; DE60021707T2; US6645750B1; DE60021707D1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】植物由来のβ−プリメベロシダーゼ遺伝子の探
索が強く望まれている。【解決手段】特定のアミノ酸配列をコードすることを特
徴とするβ−プリメベロシダーゼ遺伝子及びその利用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物のβ−プリメ
ベロシダーゼ遺伝子に関する。β−プリメベロシダーゼ
は二糖配糖体であるβ−プリメベロシドに作用して茶の
香気成分とプリメベロースを生成する反応を触媒する酵
素である。

【０００２】

【従来の技術】植物の香気成分に関する研究において、
ゲラニオールやリナロール等のアルコール系香気前駆体
として二糖配糖体のβ−primeveroside（６−Ｏ−β−
Ｄ−xylopyranosyl−β−Ｄ−glucopyranoside）あるい
はその類似体の存在が確認され、また、その他の前述し
た他のアルコール系香気成分の前駆体としても二糖配糖
体のβ−primeverosideとその類似体の存在が明らかに
なってきている。

【０００３】本発明者らは、これらの二糖配糖体に特異
的に作用する酵素の存在について、先に茶香気成分生成
酵素であるβ−プリメベロシダーゼを研究し、当該酵素
を単離し、その性質を明らかにした。（特開平８−１４
０６７５）

【０００４】しかしながら、本酵素の塩基配列などは明
確にされてなく、更に遺伝子を単離し、その利用につい
ては全く研究がなされていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、茶由
来のβ−プリメベロシダーゼ遺伝子を単離し、当該酵素
をより安価に提供する手段を提供することにある。本発
明により植物由来のβ−プリメベロシダーゼの幅広い利
用を図ることができる。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討した。その結果、本発明を完
成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明の要旨は、配列表の配列
番号：１に示すアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に
おいて１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若
しくは付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質をコードす
るＤＮＡ。

【０００８】前記ＤＮＡとして具体的には、以下に示す
ＤＮＡが挙げられる。即ち、配列表の配列番号：２に記
載の塩基配列を有するＤＮＡ。又は、配列表の配列番号
２に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし、かつ、β−プリメベロシ
ダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。
本発明のＤＮＡは、上述した蛋白質をコードするＤＮＡ
である。このＤＮＡは、本発明を完成するに際しては、
後に述べるようにして、茶ｃＤＮＡライブラリーから単
離することができたものである。しかしながら、本発明
によりその塩基配列が明らかであるので、配列番号：１
又は２に示す配列に基づいて化学合成することによって
も取得することができる。

【００１０】また、この配列に基づいて作製される合成
オリゴヌクレオチドプローブ又はオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用い、自体公知の方法で茶染色体ＤＮＡライ
ブラリーから、又はＰＣＲ又はハイブリダイゼーション
によって取得することもできる。

【００１１】以下に、茶ｃＤＮＡライブラリーから、Ｐ
ＣＲによって本発明のＤＮＡの一部を取得し、それをプ
ローブに用いたハイブリダイゼーションによって、本発
明のＤＮＡを取得する方法及び得られたＤＮＡを用いて
遺伝子組換え法により大腸菌、酵母よりβ−プリメベロ
シダーゼを生産する方法について、実施例を参照しなが
ら例示する。

【００１２】なお、一般に生理活性を有する蛋白をコー
ドするアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ
酸が欠失、置換、挿入若しくは付加された場合であって
も、その生理活性が維持される場合があることは当業者
において広く認識されている。本発明は、当然のことな
がらこのような修飾が加えられ、かつβ−プリメベロシ
ダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片
も含まれる。

【００１３】即ち、配列表の配列番号：１において、１
もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつ、β−プリメベロ
シダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
も、本発明の範囲に含まれる。そのような改変されたＤ
ＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位
のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されるよう
に本発明のＤＮＡの塩基配列を改変することによって得
られる。

【００１４】また、本発明のＤＮＡ又はこれを有する細
胞に変異処理を行い、これらのＤＮＡ若しくは細胞か
ら、例えば配列表の配列番号：２に記載の塩基配列を有
するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするＤＮＡを選択することによっても、改変されたＤ
ＮＡを得ることができる。

【００１５】ここでいう「ストリンジェントな条件」と
は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成されるが、非
特異的なハイブリッドは形成されない条件をいう。この
条件を明確に数値化することは困難であるが、相同性が
高い核酸同士、例えば70〜90％以上の相同性を有するＤ
ＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核
酸同士がハイブリダイズしない条件等が挙げられる。

【００１６】さらに、茶染色体から、本発明のＤＮＡ又
はその一部をプローブに用いて、常法によってβ−プリ
メベロシダーゼ遺伝子を取得し得るが、茶染色体由来の
β−プリメベロシダーゼ遺伝子は、イントロンを含むこ
とも予想される。このようなイントロンで分断されてい
るＤＮＡも、茶β−プリメベロシダーゼをコードする限
り、本発明のＤＮＡに含まれる。

【００１７】更に、得られたβ−プリメベロシダーゼ遺
伝子は、適当なベクターに組み入れた後、大腸菌、酵
母、培養細胞、植物体などに形質転換され、スクリーニ
ングすることにより、β−プリメベロシダーゼを生産す
ることのできる形質転換体を選択できる。

【００１８】このようにして得られた形質転換体は、栄
養培地で培養することにより高いβ−プリメベロシダー
ゼ活性を有するペプチドを安定的に生産する。形質転換
体の培養は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を
選択すれば良く、通常多くの場合は、液体培養で行う
か、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利であ
る。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であれば良
く、例えばグルコース、ラクトース、マルトースなどが
使用される。また窒素源としては利用可能な窒素化合物
であればよく、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス
などが使用される。培養温度はβ−プリメベロシダーゼ
を生産する範囲であればよいが、大腸菌、酵母の場合、
通常10〜42℃程度である。本発明のβ−プリメベロシダ
ーゼを大腸菌、酵母で発現するためには、好ましくは10
〜20℃程度である。

【００１９】培養時間は、β−プリメベロシダーゼの生
産量が最大になるくらいの時間培養すれば良く、通常は
12〜72時間である。培地のpHは、菌が生育し、β−プリ
メベロシダーゼが安定に生産されれば良く、好ましくは
pH６〜８である。

【００２０】本発明の茶由来プリメベロシダーゼ遺伝子
はその存在が明らかであるにもかかわらず、活性確認は
非常な困難であった。本発明は、成熟タンパク質を融合
タンパク質発現系を用いて、特定条件下で培養を行うこ
とによって活性体として発現できることを明らかにし
た。

【００２１】生産されたβ−プリメベロシダーゼは、目
的に応じて様々な処理を施すことができる。β−プリメ
ベロシダーゼが菌体内にある場合には、濾過や遠心分離
などによって菌体を採取し、機械を用いた物理的方法や
リゾチームなどによる酵素的方法によって菌体を破壊
し、抽出する。またこのようにして得られたβ−プリメ
ベロシダーゼは、必要に応じて塩析、濃縮、精製など行
うこともできる。

【００２２】なお、本明細書において特に明記しない限
り、β−プリメベロシダーゼ活性の活性測定は以下のよ
うにして行った。

【００２３】 β−プリメベロシダーゼ活性酵素活性はｐ−ニトロフェニル−β−プリメベロシド
（pNP-Pri)を基質として遊離するｐ−ニトロフェノール
（pNP)を分光光度計で測定することにより調べた。酵素
活性は１分間に１マイクロモルのpNPを遊離する酵素量
を１ユニットと定義した。

【００２４】具体的は測定サンプル300μリットルと20m
Mクエン酸緩衝液（pH6.0）1100μリットルと同緩衝液に
10mMで溶かしたｐNP-Pri 300μリットルを混合して37℃
でインキュベートした。30、60、90、120分後にそれぞ
れ反応液340μリットルを分取し、１M 炭酸ナトリウム
水溶液を170μリットル加え反応を停止させ分光高度計
により405ｎmの吸光度を測定した。

【００２５】基質となるpNP-プリメベロシドは、例えば
pNP-グルコシド（メルク社製）とキシロオリゴ糖（和光
純薬社製）を酵素キシロシダーゼ（シグマ社製）を用い
て反応させ、pNP-グルコシドにキシロースをβ-1,6結合
で１残基転移させることにより合成できる。

【００２６】 β−グルコシダーゼ活性酵素活性はｐ−ニトロフェニル−β−グルコシドを基質
として、のβ−プリメベロシダーゼ活性測定法に準じ
て行った。

【００２７】

【実施例】実施例１粗酵素液の調製新鮮な茶葉（ヤブキタ種）をドライアイスで冷却したア
セトン中にて破砕した後、残査を−20℃のアセトンでろ
液がほとんど無色になるまで洗浄し乾燥させアセトンパ
ウダーとした。

【００２８】このアセトンパウダーを１リットルの0.1M
クエン酸緩衝液（pH6.0）に懸濁させ４℃にて３時間攪
拌し酵素を抽出した。抽出物を遠心分離して残査を除去
した後、上清に等量のアセトンを加え攪拌後4℃に一晩
放置した後蛋白画分を沈殿させた。次いで遠心分離によ
り沈殿物を集めクエン酸緩衝液に溶解後、硫安塩析を行
った。40〜80%飽和硫安画分の析出を20mMクエン酸緩衝
液に溶解し同緩衝液で透析を行った。

【００２９】実施例２ β−プリメベロシダーゼの精製酵素活性はｐ−ニトロフェニルーβープリメベロシド
（pNP-Pri)を基質として遊離するｐ−ニトロフェノール
（pNP)を分光光度計で測定することにより調べた。酵素
活性は１分間に１マイクロモルのpNPを遊離する酵素量
を１ユニットと定義した。

【００３０】透析後酵素画分を20mMクエン酸緩衝液で平
衡化したCM-トヨパール650カラム（東ソー社製）に流
し、吸着画分を0-0.5M NaClを含む同緩衝液で溶出し回
収した。回収した酵素画分を限外ろ過膜（アミコンPM-1
0、グレース・ジャパン社製）とセントリコン（Centric
on10、グレース・ジャパン）で濃縮した後、20mMクエン
酸緩衝液で平衡化したMono S HR（ファルマシア・バイ
オテク社製）に流し吸着した酵素画分を0-0.2MのNaClを
含む同緩衝液で溶出し回収した。

【００３１】実施例３茶プリメベロシダーゼのアミノ
酸配列の決定精製されたプリメベロシダーゼをトリプシンで部分分解
し逆相クロマトグラフィーによって分離、精製を行いペ
プチド断片を得た。得られたペプチド断片のアミノ酸配
列をアミノ酸シーケンサーにより決定し以下のアミノ酸
配列を得た。

【００３２】

【配列番号：３】

【００３３】実施例４茶プリメベロシダーゼ遺伝子ク
ローンの単離ヤブキタ種茶葉よりRNA抽出キット（ファルマシアバ
イオテク）により全RNAを抽出し、オリゴｄTカラムによ
りポリ（A）＋RNAを調製し、λZAPII−ｃDNA Synthesis
Kit（Stratagene社製）に従いλベクターを用いてｃDN
Aライブラリーを構築した。このλベクターをin vitro
excision によりファージミッドへ切り出しプラスミド
状のcDNAライブラリーを調製した。

【００３４】次いでペプチド断片のアミノ酸配列を基に
合成したオリゴヌクレオチドプローブB GLU1：

【００３５】

【配列番号：４】

【００３６】とpBluescriptSK+ベクター上の−20プライ
マー

【００３７】

【配列番号：５】

【００３８】をPCRプライマーとし、上記で作製したプ
ラスミド状のcDNAライブラリーを鋳型としてPCRを行
い、DNAフラグメントを得た。このフラグメントをプロ
ーブとしてヤブキタ種λZAPII−ｃDNA ライブラリーよ
りDIG System（ベーリンガーマンハイム）を用いてポジ
ティブクローンを得た。15個のポジティブクローンでイ
ンサートDNAの長さが最長のものを選択しin vivo excio
nによりファージミッドpBluescriptSK+を調製しインサ
ートDNAの塩基配列を決定した。その結果、決定したア
ミノ酸配列を含む全長５０７アミノ酸からなるオープ
ンリーディングフレーム（ORF）を含む遺伝子断片が得
られたことが明らかとなった。

【００３９】実施例５茶プリメベロシダーゼ遺伝子の発現（１）クローニングされた遺伝子がプリメベロシダーゼ遺伝子
であるか否かを確認するために、得られたcDNAの発現を
試みた。いくつかの植物由来酵素遺伝子で大腸菌におい
て活性発現が報告されているので、大腸菌での発現を試
みた。507アミノ酸残基をコードする部分を含む遺伝子
断片を鋳型としプライマーNN1：

【００４０】

【配列番号：６】

【００４１】とMM2：

【００４２】

【配列番号：７】

【００４３】でPCRにて増幅しフラグメントを得た。得
られたフラグメントはORFの上流にBamHIサイトを下流に
SalIサイトを導入してある。フラグメントを制限酵素Ba
mHIとSalIで切り出した後、発現ベクターｐKK233-3（フ
ァルマシアバイオテク）のBamHI、SalIサイトに挿入し
ｐKK233-3Priを得た。次いでｐKK233-3Priで大腸菌JM10
5を形質転換した。形質転換された大腸菌を100mlのLB培
地に接種し37℃で135分間培養し、終濃度 0.1 mMのIPTG
を加えさらに21時間培養した。培養後菌体を遠心分離で
回収し、4mlのカラム緩衝液（20mM Tris・HCl、200mMNa
Cl、１ｍM EDTA,10mM 2-mercaptoethanol、pH7.4）に再
懸濁し、Branson Sonifier 250にて超音波破砕した。遠
心により上清を可溶性画分、沈殿を不溶性画分とした。

【００４４】プリメベロシダーゼ活性測定のために可溶
性画分300μリットルと20mMクエン酸緩衝液（pH6.0）11
00μリットルと同緩衝液に10mMで溶かしたｐNP-Pri 300
μリットルを混合して37℃でインキュベートした。30、
60、90、120分後にそれぞれ反応液340μリットルを分取
し、１M 炭酸ナトリウム水溶液を170μリットル加え反
応を停止させ分光高度計により405ｎmの吸光度を測定し
ｐNPの遊離を観察した。その結果、酵素活性は観察され
なかった。

【００４５】茶プリメベロシダーゼ遺伝子の発現
（２）得られたｃDNAクローンのアミノ酸配列をタンパク側か
ら求められたアミノ末端配列とを比較したところ、茶プ
リメベロシダーゼは前駆体構造をとっている可能性が示
唆された。得られたｃDNA中のオープンリーディングフ
レームから推測されるアミノ酸組成を解析すると、開始
コドンから28番目のアミノ酸までは疎水性のアミノ酸に
富んだ領域でシグナル配列状の領域であることが予想さ
れた。そこで、この部分が発現を阻害している可能性を
考え、この部分を欠失させた遺伝子断片を作製した。プ
ライマーＭＭ１：

【００４６】

【配列番号：８】

【００４７】と前述のＭＭ２：

【００４８】

【配列番号：９】

【００４９】をプライマーとしてクローニングされた遺
伝子を鋳型としてPCRにより成熟体部分をフラグメント
として増幅した。増幅したフラグメントをBamHIとSalI
で切断し融合蛋発現ベクターｐQE30（Quiagen社製）、
ｐRSETA(Invitorgen社製)、ｐGEX４(ファルマシアバイ
オテク社製)のBamHIとSalIサイトに挿入したベクターｐ
QE30ΔPri、ｐRSETAΔPri、ｐGEX４ΔPriで大腸菌JM109
をそれぞれ形質転換した。形質転換した大腸菌を100ml
のLB培地に接種し37℃で135分間培養し、終濃度 0.1mM
のIPTGを加えさらに21時間培養した。培養後菌体を遠心
分離で回収し、前述の方法で可溶性画分を調製しプリメ
ベロシダーゼ活性を測定した。その結果いずれの場合に
おいても活性は見出されなかった。

【００５０】茶プリメベロシダーゼ遺伝子の発現
（３）発現が確認できなかったのは培養液に加えた発現誘導に
必要なIPTG（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド）濃度が適切でない可能性が考えられたの
でｐQE30ΔPri、ｐRSETAΔPri、ｐGEX４ΔPriで形質転
換されたJM109を、前述の培養で誘導時にIPTGを終濃度
0.1、１、9mMで加えて培養し菌体を回収後可溶性画分を
調製し活性を調べた。その結果、可溶性画分には活性は
認められなかった。

【００５１】茶プリメベロシダーゼ遺伝子の発現
（４）以上〜の遺伝子発現の試みの結果からプリメベロシ
ダーゼの発現は通常の方法では困難なことが明らかとな
った。発現が困難な理由として菌体内で合成された酵素
が不活性な形で不溶性画分に存在している可能性が考え
られた。発現ベクターｐQE30ΔPri、ｐRSETAΔPri、ｐG
EX４ΔPriでは挿入された遺伝子はそれぞれ、54kDa、54
kDa、81kDaの融合蛋白として発現する。そこで不溶性画
分をSDS-PAGEにより解析したところ、それぞれの不溶性
画分で融合蛋白に相当するサイズの蛋白がIPTGの誘導に
よって観察されることが分かった。したがって、遺伝子
は発現しているものの不活性な形で不溶性画分に移行し
ているものと考えられた。

【００５２】以上の結果を熟慮した結果、IPTG誘導後の
大腸菌を通常の37℃ではなくより低温の25℃以下で培養
することにより、発現遺伝子産物の不活化を防ぐことが
できると考えた。そこで大腸菌の遺伝子の発現をIPTG誘
導後の培養温度を通常よりも低い温度ととして遺伝子の
発現を試みた。ベクターｐQE30ΔPri、ｐRSETAΔPri、
ｐGEX４ΔPriで形質転換されたJM109をLB培地100mlに接
種して培養し、終濃度0.1mMのIPTGを加えた後25、22℃
で一晩培養あるいは18℃で13時間培養し菌体を回収し前
述の方法で可溶性画分を調製し活性を測定した。その結
果、活性は確認されなかった。

【００５３】茶プリメベロシダーゼ遺伝子の発現
（５）次に別の融合蛋白発現ベクターであるｐMALc（New Engl
and, Biolabs社製）を用いて発現を試みた。前述と同様
に成熟体部分をPCRで増幅してｐMALcベクターのBamHI、
SalIサイトに挿入しｐMALcΔPriを作製し大腸菌JM109を
形質転換した。形質転換した大腸菌を100mlのLB培地に
接種し37℃で135分間培養し、終濃度 0.1 mMのIPTGを加
えさらに21時間培養した。培養後菌体を遠心分離で回収
し、前述の方法で可溶性画分を調製しプリメベロシダー
ゼ活性を測定した。その結果いずれの場合においても活
性は見出されなかった。融合蛋白である分子量94kDaの
蛋白は不溶性画分中に観察されたのでこの場合も発現し
た蛋白がおそらくフォールディングの不良で不活性なま
ま不溶性画分に移行したものと考えられた。

【００５４】そこで、終濃度0.1mM IPTG添加後の培養温
度を通常よりもより下げた22℃と18℃、さらには10℃と
し24時間培養した。その結果、それぞれの可溶性画分に
融合蛋白質の存在が確認され、活性も確認された。ま
た、当該可溶性画分についてβ−グルコシダーゼ活性を
測定したが、その活性は認められなかった。

【００５５】茶プリメベロシダーゼ遺伝子の発現
（６）酵母においても発現を試みた。発現ベクターとしてpYES
2(Invitrogen社）を用い、まず前駆体をコードする遺伝
子断片をプライマーNN1：

【００５６】

【配列番号：１０】

【００５７】とMM3：

【００５８】

【配列番号：１１】

【００５９】を用いてPCRでフラグメントとして増幅
し、pYES2のBamHIとXhoIサイトに挿入したpYES2Priを作
製し、これにより酵母INVSc1株を形質転換した。形質転
換された酵母をYPG培地にて30℃で24時間培養し菌体を
回収後、前述と同様の方法で超音波破砕し可溶性画分を
調製し活性を測定したが活性は検出できなかった。次に
成熟体部分をプライマーＭＭ１：

【００６０】

【配列番号：１２】

【００６１】とMM3：

【００６２】

【配列番号：１３】

【００６３】でPCRにて増幅しフラグメントとして回収
後、pYES2のBamHIとXhoIサイトに挿入したpYES2Priを作
製し、これにより酵母INVSc1株を形質転換した。形質転
換された酵母をYPG培地にて通常の培養温度30℃より低
い20,10℃で72時間培養し菌体を回収後、前述と同様の
方法で超音波破砕し可溶性画分を調製し活性を測定し
た。その結果可溶性画分に活性を検出できた。また、当
該可溶性画分についてβ−グルコシダーゼ活性は認めら
れなかった。

【００６４】以上の結果、茶由来プリメベロシダーゼ遺
伝子の発現が困難だったのは大腸菌という発現系が適切
でなかったためではなく、この遺伝子そのものの活性発
現が困難であったためと考えられる。

【００６５】

【発明の効果】このようにこの茶由来プリメベロシダー
ゼ遺伝子の発現による活性確認には非常な困難性があ
り、成熟体蛋白をかぎられた従来の融合蛋白として、通
常培養を行わない条件で活性体として検出できることが
判明した。我々は鋭意検討の末、茶由来プリメベロシダ
ーゼの発現に適した特殊な条件を初めて見出すことがで
き、その条件下でプリメベロシダーゼ遺伝子がプリメベ
ロシダーゼ活性を発現することを困難の末示した。以上
の結果、茶プリメベロシダーゼの遺伝子配列とアミノ酸
配列が始めて明らかとなった。

【００６６】

【配列表】 <110> Amano pharmaceutical Co.. Ltd. <120> β−プリメベロシダーゼ遺伝子 <130> P99-615 <141> 1999-03-04 <160> 13 <210> 1 <211> 507 <212> PRT <213> Camellia var. sinensis <400> 1 Met Met Ala Ala Lys Gly Ser Val Val Val Gly Val Leu Ala Ile Val 1 5 10 15 Ala Tyr Ala Leu Val Val Ser Glu Val Ala Ile Ala Ala Gln Ile Ser 20 25 30 Ser Phe Asn Arg Thr Ser Phe Pro Asp Gly Phe Val Phe Gly Ala Ala 35 40 45 Ser Ser Ala Tyr Gln Phe Glu Gly Ala Ala Lys Glu Gly Gly Lys Gly 50 55 60 Pro Asn Ile Trp Asp Thr Phe Thr His Glu Phe Pro Gly Lys Ile Ser 65 70 75 80 Asn Gly Ser Thr Gly Asp Val Ala Asp Asp Phe Tyr His Arg Tyr Lys 85 90 95 Glu Asp Val Lys Val Leu Lys Phe Ile Gly Leu Asp Gly Phe Arg Met 100 105 110 Ser Ile Ser Trp Ala Arg Val Leu Pro Arg Gly Lys Leu Ser Gly Gly 115 120 125 Val Asn Lys Glu Gly Ile Ala Phe Tyr Asn Asn Val Ile Asn Asp Leu 130 135 140 Leu Ser Lys Gly Ile Gln Pro Phe Ile Thr Ile Phe His Trp Asp Leu 145 150 155 160 Pro Gln Ala Leu Glu Asp Glu Tyr Gly Gly Phe Leu Ser Pro His Ile 165 170 175 Val Asn Asp Phe Arg Asp Phe Ala Glu Leu Cys Phe Lys Glu Phe Gly 180 185 190 Asp Arg Val Lys His Trp Ile Thr Met Asn Glu Pro Trp Ser Tyr Ser 195 200 205 Tyr Gly Gly Tyr Asp Ala Gly Leu Leu Ala Pro Gly Arg Cys Ser Ala 210 215 220 Phe Met Ala Phe Cys Pro Lys Gly Asn Ser Gly Thr Glu Pro Tyr Ile 225 230 235 240 Val Thr His Asn Leu Leu Leu Ser His Ala Ala Ala Val Lys Leu Tyr 245 250 255 Lys Glu Lys Tyr Gln Ala Tyr Gln Lys Gly Gln Ile Gly Ile Thr Leu 260 265 270 Val Thr Tyr Trp Met Ile Pro Tyr Ser Asn Ser Lys Ala Asp Lys Asp 275 280 285 Ala Ala Gln Arg Ala Leu Asp Phe Met Tyr Gly Trp Phe Ile Glu Pro 290 295 300 Leu Ser Phe Gly Glu Tyr Pro Lys Ser Met Arg Arg Leu Val Gly Lys 305 310 315 320 Arg Leu Pro Arg Phe Thr Lys Glu Gln Ala Met Leu Val Lys Gly Ser 325 330 335 Phe Asp Phe Leu Gly Leu Asn Tyr Tyr Ile Ala Asn Tyr Val Leu Asn 340 345 350 Val Pro Thr Ser Asn Ser Val Asn Leu Ser Tyr Thr Thr Asp Ser Leu 355 360 365 Ser Asn Gln Thr Ala Phe Arg Asn Gly Val Ala Ile Gly Arg Pro Thr 370 375 380 Gly Val Pro Ala Phe Phe Met Tyr Pro Lys Gly Leu Lys Asp Leu Leu 385 390 395 400 Val Tyr Thr Lys Glu Lys Tyr Asn Asp Pro Val Ile Tyr Ile Thr Glu 405 410 415 Asn Gly Met Gly Asp Asn Asn Asn Val Thr Thr Glu Glu Gly Ile Lys 420 425 430 Asp Pro Gln Arg Val Tyr Phe Tyr Asn Gln His Leu Leu Ser Leu Lys 435 440 445 Asn Ala Ile Ala Ala Gly Val Lys Val Lys Gly Tyr Phe Thr Trp Ala 450 455 460 Phe Leu Asp Asn Phe Glu Trp Leu Ser Gly Tyr Thr Gln Arg Phe Gly 465 470 475 480 Ile Val Tyr Val Asp Phe Lys Asp Gly Leu Lys Arg Tyr Pro Lys His 485 490 495 Ser Ala Leu Trp Phe Lys Lys Phe Leu Leu Lys 500 505 <210> 2 <211> 1730 <212> DNA <213> Camellia var. sinensis <400> 2 ggtaggcaat gatggcagcg aaagggtcag ttgtagtggg agtgttagca attgttgcgt 60 atgcacttgt tgtaagtgag gttgccatag cagctcaaat ctcctccttc aacagaacca 120 gctttcctga tggttttgtc tttggagctg cctcttctgc ctaccagttt gaaggtgctg 180 ccaaggaagg tgggaaaggc cccaatattt gggatacctt cactcatgag tttccaggta 240 aaatatcgaa tggtagcact ggagatgtag ctgatgactt ttatcatcgt tacaaggaag 300 atgtgaaggt gctgaagttt ataggactag atggtttcag aatgtccatc tcatgggccc 360 gagtattacc tcgggggaag cttagcggag gagtgaacaa ggaaggtatc gccttctaca 420 acaatgtcat caatgacctt ttatcgaaag gtatacaacc ttttataaca atctttcact 480 gggatcttcc ccaagcccta gaagatgaat atggaggctt tttaagccca cacattgtga 540 acgatttccg ggattttgca gagctgtgct tcaaggagtt tggtgaccga gttaaacatt 600 ggatcacaat gaatgaacca tggtcttact cctatggggg ttatgatgca ggtctcctag 660 caccgggccg ttgttcggct tttatggcat tttgccctaa agggaattct gggactgagc 720 cctatatagt tacccacaat ttgcttcttt ctcatgctgc tgctgtgaaa ctatacaagg 780 agaaatatca ggcatatcaa aaggggcaga tagggataac actagtgact tattggatga 840 ttccctactc caattcgaaa gccgacaagg atgcagcaca acgagccctt gatttcatgt 900 atggatggtt tattgagcca ttaagctttg gtgaatatcc aaaaagcatg cgtagactcg 960 ttggtaaaag gttaccaagg ttcactaaag agcaagctat gttggtgaag gggtctttcg 1020 atttcctcgg actaaattac tatattgcaa attatgtact aaatgttccc acttctaata 1080 gtgttaatct cagctacaca accgattctc tttctaatca aactgcattc cgaaatgggg 1140 tagctattgg gagaccaact ggggtacctg catttttcat gtacccgaaa ggattgaaag 1200 atctattggt ctacacaaag gagaagtaca acgatccagt tatttacata acagagaatg 1260 gcatgggtga caacaataat gttacaactg aagaaggcat caaggatccc cagagggtct 1320 atttctacaa tcagcatctt ctatcactta aaaatgccat tgcggctggc gtgaaggtta 1380 aaggttactt tacatgggca tttcttgaca attttgaatg gttatccggt tacacccaaa 1440 ggttcggaat tgtctatgta gatttcaaag atggactaaa aagatacccc aaacattcag 1500 ctttgtggtt caagaaattc ctcctcaagt agtgaaggtt tcggtgtatg actaaaagcg 1560 ctatgagttc aataagttgt ctccactcta tttaaatcta tcaaattagt aaggtggaga 1620 acaacacttt ggtatcttca tttcgcaata aaatgtatgg cactcttcac acaacttttt 1680 tgtaatcggt aataatgatt gtgttgcatt caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1730 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Camellia var. sinensis <400> 3 Ile Ser Xaa Gly Ser Thr Gly Asp Val Ala Asp Asp Phe Tyr His Arg 1 5 10 15 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 gtygcygayg ayttytayca 20 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 gtaaacgacg gccagt 16 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 ggatccatga tggcagcgaa agggtca 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 gtcgacctac ttgaggagga atttctt 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 ggatccgctc aaatctcctc cttcaac 27 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 gtcgacctac ttgaggagga atttctt 27 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 ggatccatga tggcagcgaa agggtca 27 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 ctcgagctac ttgaggagga atttctt 27 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 ggatccgctc aaatctcctc cttcaac 27 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 ctcgagctac ttgaggagga atttctt 27

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号：１に示すアミノ酸配
列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは複数のア
ミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸
配列を含む蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】蛋白質がβ−プリメベロシダーゼ活性を示
す請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】ＤＮＡが配列表の配列番号：２に記載の塩
基配列を含むものである請求項１又は請求項２記載のＤ
ＮＡ。
【請求項４】ＤＮＡが配列表の配列番号：２に記載の塩
基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、かつ、β−プリメベロシダーゼ活性を
有するタンパク質をコードする請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項５】ＤＮＡが、植物由来のものである請求項１
乃至４記載のＤＮＡ。
【請求項６】植物が茶である請求項５記載のＤＮＡ。
【請求項７】請求項１〜６のいずれかに記載のＤＮＡ断
片を含むことを特徴とするベクター。
【請求項８】請求項７に記載のＤＮＡによって形質転換
された組換え体。
【請求項９】組換え体が大腸菌又は酵母である請求項８
記載の形質転換された組換え微生物。
【請求項１０】請求項８又は請求項９記載の組換え体を
培養し、培養物からβ−プリメベロシダーゼを得ること
を特徴とするβ−プリメベロシダーゼの製造法。