JP2000226391A

JP2000226391A - マクロライド化合物、および免疫抑制剤の評価方法

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Publication number: JP2000226391A
Application number: JP11339309A
Authority: JP
Inventors: Nobuki Serizawa; 伸記芹澤; Sachiko Kanga; 幸子菅賀; Mutsuo Nakajima; 睦男中島; Tomoko Nishizaki; 知子西崎; Masaaki Kitsuka; 正明木塚
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1998-12-01
Filing date: 1999-11-30
Publication date: 2000-08-15

Abstract

(57)【要約】【課題】優れた免疫抑制活性および抗真菌活性を有す
る新規化合物、ならびにその製造方法を提供する。【解決手段】下記式（Ｉ）：【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫抑制剤また
は抗真菌剤として有用な新規物質およびその製造方法、
ならびに免疫抑制剤の新規な試験方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】臓器移植の際の拒絶反応の抑制や、自
己免疫疾患の治療などに使用される免疫抑制剤ＦＫ５０
６は、Ｔ細胞活性化の初期段階に作用し、インターロイ
キン２の遺伝子の転写・発現を阻害することによって、
強力な免疫抑制効果を発揮する。ＦＫ５０６、サイクロ
スポリンＡなどの免疫抑制剤は、Ｔ細胞内で結合蛋白質
（ＦＫ５０６結合蛋白質（ＦＫＢＰ）、サイクロフィリ
ン等）と複合体を形成し、この複合体がプロテインフォ
スファターゼの一種であるカルシニューリン（カルシウ
ム−カルモジュリン依存性プロテインフォスファター
ゼ、プロテインフォスファターゼ２Ｂとも呼ばれる。以
下「ＣＮ」という）と結合することによりその活性を阻
害する（Kunz, J. and Hall, M. N. (1993) Trend. Bio
chem. Sci. 18, 334-338）。

【０００３】上記のような免疫抑制剤の試験方法として
は、混合リンパ球培養反応を利用する方法（Adler, W.
H. (1970) J. Immunol. 105, 984）が一般的であるが、
この方法は、例えば微生物の二次代謝産物の一次スクリ
ーニング等、一度に多くの検体の試験を行う場合には多
大な労力を必要とする。したがって、より簡便で多検体
処理に適した試験方法が求められていた。

【０００４】ところで、酵母にも、ＣＮと同じ酵素、お
よび免疫抑制剤に対する特異的結合蛋白質（ｙＦＫＢＰ
-１２）が存在することが知られている（Foor, F., et
al.,(1992) Nature 360, 682-684 および Liu, J. et a
l., (1991) Cell 66, 807-815）。ＣＮは、酵母の通常
の増殖には必須ではないが、細胞内イオンの恒常性維持
に関与し、ある種のイオンが関係するストレス条件下の
増殖には必要である。例えば、塩化ナトリウムを多く含
む培地中で酵母を培養すると、細胞内ナトリウムイオン
濃度が上昇し、カリウムイオン濃度が低下することによ
り増殖が停止するが、これに抗してイオン濃度を正常化
し、酵母が増殖を再開するのにＣＮが必要となる（Naka
mura, T., et al., EMBO J., 12, 4063-4071, 1993）。
この系に免疫抑制剤ＦＫ５０６を共存させると、ＦＫ５
０６結合蛋白質依存的に酵母の増殖再開が阻害される
（宮川ら、(1994) 蛋白質・核酸・酵素、39、420）。す
なわち、哺乳動物Ｔ細胞の活性化のプロセスと、酵母が
増殖を再開するプロセスとは、ＣＮを介するという点で
類似する。しかしながら、両プロセスはシグナル伝達開
始のための最初の刺激が異なることから、哺乳動物用の
免疫抑制剤の探索において哺乳動物リンパ球の代りに酵
母を使用できるか否かは不明であった。

【０００５】一方、本発明の化合物に構造乃至活性が類
似する化合物としては、特開平９−２９９８０号公報記
載の下記式（ＩＩ）で表される化合物：

【０００６】

【化２】および、特開平９−１００２９０号公報記載の下記式
（ＩＩＩ）で表される化合物：

【０００７】

【化３】が知られているが、いずれも本発明の化合物とは構造が
異なる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、優
れた免疫抑制活性および抗真菌活性を有する新規化合
物、ならびにその製造方法を提供することにある。さら
に本発明は、免疫抑制活性を有する化合物の新規評価方
法を提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、（１）下
記式（Ｉ）：

【００１０】

【化４】で表される化合物またはその塩、（２）下記の物理化
学的性状を有する化合物またはその塩：１）性質：黄色粉末；２）溶解性：ジメチルスルホキシド、メタノール、エタ
ノールに可溶、水に不溶；３）分子式：Ｃ₇₅Ｈ₁₁₄Ｏ₂₆Ｓ；４）分子量：１４６２；５）ＦＡＢマススペクトル：m/z amu ポジティブモード（マトリックス： m-NBA）；１４８５
（Ｍ＋Ｎａ）⁺ ネガティブモード（マトリックス： m-NBA）；１４６２
（Ｍ）^-；６）高分解能ＦＡＢマススペクトル： m/z amu ポジティブモード（マトリックス： m-NBA）測定値；１４８５.７２１１（Ｍ＋Ｎａ）⁺ Ｃ₇₅Ｈ₁₁₄Ｏ₂₆Ｓ＋Ｎａとしての計算値；１４８５．７
２１７；７）紫外線吸収スペクトル（エタノール）：λ_maxｎｍ
（ε） 214(19328)、275(12281)、333(4825)、358(5088)；８）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νmax ｃｍ^-1 3419、2921、2852、1718、1665、1595、1379、1256、11
69、1064；９）¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：δｐｐｍ（積分、多
重度、結合定数）重ジメチルスルホキシド溶液中、テトラメチルシラン
（以下「ＴＭＳ」という）を内部基準として、２９３Ｋ
で測定した核磁気共鳴スペクトル（６００ＭＨｚ）は次
の通りである：8.02(1H, d, 8.03), 7.89(1H, s), 7.75
(1H, d, 8.03), 6.82(1H, m),6.72(1H, s), 6.64(1H,
s), 5.89(1H, d, 15.39), 5.56(1H, m),5.39(1H, dd, 1
5.29, 6.54), 5.38(1H, m), 5.30(1H, s), 5.27(1H,
m),5.01(1H, m), 4.82(1H, br d), 4.74(1H, m), 4.74
(1H, m),4.67(1H, d, 3.95), 4.62(1H, br d), 4.53(1
H, m), 4.53(1H, m),4.50(1H, m), 4.36(1H, d, 4.28),
4.33(1H, m), 4.27(1H, d, 5.62),4.19(1H, d, 5.88),
4.16(1H, m), 4.15(1H, m), 4.12(1H, d, 3.34),3.97
(1H, m), 3.86(1H, m), 3.85(1H, m), 3.79(1H, m), 3.
70(1H, m),3.68(1H, m), 3.62(1H, m), 3.61(1H, m),
3.53(1H, m), 3.47(1H, m),3.29(1H, m), 3.23(1H, m),
3.16(1H, m), 2.67(1H, m), 2.67(1H, m),2.60(1H,
m), 2.44(3H, s), 2.37(1H, m), 2.26(1H, m), 2.00(2
H, m),1.99(3H, s), 1.98(1H, m), 1.86(3H, s), 1.85
(1H, m), 1.84(1H, m),1.82(2H, m), 1.80(1H, m), 1.7
7(1H, m), 1.63(1H, m), 1.62(1H, m),1.61(2H, m), 1.
61(2H, m), 1.58(1H, m), 1.58(1H, m), 1.55(2H, m),
1.55(1H, m), 1.52(1H, m), 1.48(1H, m), 1.45(1H,
m), 1.43(1H, m),1.34(1H, m), 1.27(1H, m), 1.25(2H,
m), 1.12(1H, m), 1.12(1H, m),1.12(3H, d, 5.58),
1.11(1H, m), 1.02(3H, d, 6.15), 1.01(3H, m),0.97(3
H, m), 0.97(3H, m), 0.80(3H, m), 0.77(3H, m), 0.76
(3H, m),0.70(3H, d, 6.00)；１０）¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：δｐｐｍ（多重
度）重ジメチルスルホキシド溶液中（ＴＭＳ内部基準）、２
９３Ｋで測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨ
ｚ）は次の通りである：181.15(s), 180.70(s), 173.64
(s), 170.14(s), 165.44(s), 155.58(s),146.76(d), 14
3.41(s), 143.01(s), 133.56(d), 133.56(d), 129.94
(d),129.16(s), 126.98(d), 126.84(d), 126.72(s), 12
6.05(d), 125.72(d),122.75(d), 102.84(d), 98.26(s),
94.51(d), 78.91(d), 77.01(d), 75.57(d),75.17(d),
75.17(d), 72.97(d), 72.29(d), 72.22(d), 71.42(d),
69.37(d),69.07(d), 69.07(d), 67.19(d), 66.87(d), 6
5.58(d), 64.29(d), 64.07(d),63.22(d) ,62.89(d), 6
2.89(d), 56.88(d), 46.06(t), 44.65(t), 43.55(d),4
2.76(t), 40.61(t), 40.31(t), 40.31(t), 39.63(t), 3
9.63(t), 38.53(d),37.93(d), 37.92(d), 36.70(d), 3
4.49(d), 31.86(t), 30.00(t), 29.17(t),27.15(t), 2
4.46(t), 24.33(t), 21.03(q), 17.93(q), 16.84(q), 1
4.96(q),14.52(q), 14.33(q), 14.28(q), 13.02(q), 1
2.70(q), 9.46(q), 9.14(q),4.87(q)；１１）高速液体クロマトグラフィー：分離カラム：シンメトリーＯＤＳ（φ４．６×１５０
ｍｍ、ウォーターズ社製）；移動相：６５％アセトニトリル−水；流速：１．０ｍｌ／分；検出波長：２１０ｎｍ；温度：２５℃；保持時間：６．４分、（３）ストレプトミセス属に属する（１）または
（２）記載の化合物の生産菌を、（１）または（２）記
載の化合物の生産が可能な条件下で培養し、次いで、該
培養物から（１）または（２）記載の化合物を回収する
ことを特徴とする、（１）または（２）記載の化合物の
製造方法、（４）ストレプトミセス属に属する（１）
または（２）記載の化合物の生産菌がストレプトミセス
・エスピー（Streptomyces sp.）ＳＡＮＫ６６７９７
（ＦＥＲＭＢＰ−６２３５）であることを特徴とす
る、（３）記載の方法、（５）ストレプトミセス属に
属し、（１）または（２）記載の化合物を生産すること
を特徴とする微生物、（６）ストレプトミセス・エス
ピー（Streptomyces sp.）ＳＡＮＫ６６７９７（ＦＥ
ＲＭＢＰ−６２３５）である（５）記載の微生物、
（７）（１）または（２）記載の化合物、もしくはそ
れらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有す
る医薬、（８）（１）または（２）記載の化合物、も
しくはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分とし
て含有する免疫抑制剤、（９）（１）または（２）記
載の化合物、もしくはそれらの薬理学的に許容される塩
を有効成分として含有する抗真菌剤、（１０）物質の
免疫抑制活性を評価する方法であって、酵母を０．１乃
至１．５Ｍの塩化ナトリウム、塩化カリウムもしくは塩
化リチウム、および／または被検物質の存在下で培養
し、次いで、該被検物質の酵母生育阻害活性を測定する
ことを特徴とする方法、（１１）酵母としてSaccharo
myces cerevisiae ＳＡＮＫ５０１８２（ＦＥＲＭ
ＢＰ−４５３０）を用いることを特徴とする、（１０）
記載の方法、に関する。

【００１１】本発明者らは、微生物の二次代謝産物の一
次スクリーニング等の目的により適した免疫抑制剤の評
価方法について鋭意研究した結果、リンパ球の代りに酵
母を使用した新規な方法を開発した。そして、その方法
を用いて、微生物二次代謝産物中に、免疫抑制活性およ
び抗真菌活性を有する物質が生産されていることを見出
した。さらに本発明者らは、この物質を単離、精製し、
その構造および理化学的性質を決定し、本発明を完成さ
せた。

【００１２】本発明の前記式（Ｉ）で表される化合物Ａ
−７７９５１は、いくつかの不斉炭素原子およびいくつ
かの二重結合を有する。それゆえ、種々の光学および幾
何異性体が存在する。本発明においては、これらの異性
体がすべて単一の式で示されているが、本発明はラセミ
化合物を含むこれらの異性体およびこれらの異性体の混
合物も全て含むものである。立体特異的合成法が使用さ
れる場合、または光学活性化合物が原料化合物として使
用される場合、個々の異性体は直接的に製造してもよい
し、一方、異性体の混合物が製造されれば、個々の異性
体は常法により得てもよい。

【００１３】本発明の化合物Ａ−７７９５１は、当業者
に周知の方法を用いて塩にすることができる。本発明は
そのようなＡ−７７９５１の塩も包含する。Ａ−７７９
５１の塩としては、医学的に使用され、薬理学的に許容
されるものであれば特に限定はない。なお、Ａ−７７９
５１の塩が医薬以外の用途に用いられる場合、例えば中
間体として使用される場合には何ら限定はない。そのよ
うな塩としては、好適にはナトリウム塩、カリウム塩、
リチウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、マ
グネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アルミニウ
ム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等
の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩；ｔ−オクチ
ルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グル
コサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エ
チレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジ
ン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシク
ロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジ
アミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタ
ノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、
ピペラジン塩、テトラメチルアンモニア塩、トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のア
ミン塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン
塩、オルニチン塩、アスパラギン塩のようなアミノ酸塩
を挙げることができる。より好適には、薬理学的に許容
される塩として好ましく使用されるもの、すなわち、ナ
トリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩お
よびマグネシウム塩等を挙げることができる。

【００１４】また、本発明の化合物またはその塩は、溶
剤和物となることがある。例えば、大気中に放置した
り、または、再結晶をすることにより、水分を吸収し、
吸着水が付いたり、水和物となる場合があるが、そのよ
うな溶剤和物も本発明に包含される。

【００１５】さらに本発明は、生体内において代謝され
てＡ−７７９５１に変換される化合物、いわゆるプロド
ラッグも全て含むものである。

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明の免疫抑制剤評価方法
は、酵母を塩濃度の高い培地中で培養し、その際に培地
中に添加した被検試料が酵母の生育を阻害するか否かを
調べることにより実施することができる。ただし、被検
試料が培地中の塩濃度に関係なく酵母の生育を阻害する
場合は、その試料はＣＮとは無関係に抗真菌活性を示す
ものとして陰性と判定される。

【００１７】ここで用いられる酵母としては、市販のパ
ン酵母も好適に用いられるが、Saccharomyces cerevisi
ae ＳＡＮＫ５０１８２株がより好適である。なお、
Saccharomyces cerevisiae ＳＡＮＫ５０１８２株は
平成６（１９９４）年１月１１日付で工業技術院生命工
学工業技術研究所に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭＢ
Ｐ−４５３０が付されている。

【００１８】酵母の培養に用いられる培地としては、汎
用のものをいずれも用いることができるが、１×ＹＰＤ
培地（１％イーストエキストラクト、２％バクトペ
プトン、２％グルコース）が好適である。また、酵母
培養時の温度条件は２０乃至３７℃が好ましく、２８℃
が最も好適である。

【００１９】上記培地に添加される塩としては、塩化ナ
トリウム、塩化カリウムまたは塩化リチウムを用いるこ
とができる。これら塩の上記培地中における濃度範囲は
０．１乃至１．５Ｍが好ましい。より好適には、塩化ナ
トリウムおよび塩化カリウムについては１．０Ｍ、塩化
リチウムについては０．１Ｍの濃度でそれぞれ用いられ
る。場合によっては、これら塩を複数種類組合わせても
よい。また被検試料としては、種々の微生物二次代謝産
物や低分子化合物ライブラリー等、免疫抑制活性を有す
る物質を見出そうとする試料もしくはその混合物等を、
適宜希釈するなどして使用する。

【００２０】上記のような条件の下で、例えばまず一定
量の種酵母と被検試料と塩とを新鮮な培地中に同時添加
し、８乃至２４時間程度培養する。その後、酵母の生育
度を５９５ｎｍの吸光度等により定量し、被検試料の有
無により酵母の生育が阻害されるか否かを判定する。

【００２１】上記方法によれば、上記（１）記載の本発
明の化合物はもとより、既知の免疫抑制剤であるＦＫ５
０６やサイクロスポリンＡも陽性と判定される。またこ
のようにして陽性と判定された試料について、免疫抑制
剤としての活性を確認する目的で、従来の免疫抑制剤の
評価方法として最も一般的な混合リンパ球培養反応試験
を行うと、本発明の方法による判定結果と混合リンパ球
培養反応試験による判定結果とが合致していることが確
かめられる。すなわち、本発明の方法は、免疫抑制剤の
新規評価方法として有用である。その後、被検試料の単
離精製過程において生じる各画分について上記方法を実
施し、陽性と判定された画分についてさらなる精製を行
う操作を繰り返すことにより、微生物二次代謝産物等か
らの免疫抑制活性を有する物質のスクリーニングが可能
である。

【００２２】次に、上記（１）記載の化合物は、ストレ
プトミセス属に属する上記（１）記載の化合物の生産菌
を培養し、次いで該培養物から上記（１）記載の化合物
を分離・精製することにより得ることができる。

【００２３】本発明の化合物の製造において用いられる
ストレプトミセス（Streptomyces）属に属する菌株とし
ては、例えば茨城県岩井市で採集したカヤツリグサ科ス
ゲ属（Carex sp.）の植物生葉から分離されたストレプ
トミセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＳＡＮＫ６
６７９７株を挙げることができる。ＳＡＮＫ６６７９
７株の菌学的特徴は、以下の通りである。

【００２４】１．形態学的特徴ＳＡＮＫ６６７９７株は、ＩＳＰ〔インターナショナ
ル・ストレプトミセス・プロジェクト（International
Streptomyces Project）〕規定の寒天培地上２８℃、１
４日間培養後、顕微鏡下観察では、ＳＡＮＫ６６７９
７株の基生菌糸は良好に伸長、分岐し、薄黄味茶乃至鈍
黄味橙色を示すが、ノカルディア（Nocardia）属菌株様
の菌糸断裂やジグザグ伸長は観察されない。気菌糸は単
純分岐である。気菌糸の先端に１０乃至５０個またはそ
れ以上の胞子連鎖を形成し、胞子連鎖の形態は螺旋状を
示す。走査型電子顕微鏡による観察では、胞子の表面構
造はとげ（Spiny）状を示す。胞子は楕円形で、その大
きさは０．６〜０．９×０．９〜１．３μｍである。ま
た、気菌糸の車軸分岐、菌核や胞子嚢などの特殊器官は
観察されない。

【００２５】２．各種培養基上の諸性質各種培養基上で２８℃、１４日培養後のＳＡＮＫ６６
７９７株の性状は表１に示した通りである。色調の表示
はマンセル方式による日本色彩研究所版「標準色票」の
カラーチップ・ナンバーをあらわす。

【００２６】

【表１】培地の種類項目^*1 ＳＡＮＫ６６７９７株の性状シュークロース・Ｇあまり良くない、平坦、薄黄味茶(2.5Y 8/3)^*2 硝酸塩寒天ＡＭあまり良くない、ビロード状、茶味白(5YR 6/1) Ｒ茶味灰(2.5Y 6/2) ＳＰ産生せずグルコース・Ｇ良好、平坦、薄黄味茶(2.5Y 8/6) アスパラギン寒天ＡＭ原痕跡的に着生、白Ｒ薄黄味茶(2.5Y 8/6) ＳＰ産生せずグリセリン・Ｇ良好、平坦、薄黄味茶(2.5Y 8/4) アスパラギン寒天ＡＭ豊富に形成、ビロード状、茶味灰(2.5Y 6/1) （ＩＳＰ５）Ｒ茶味灰ないし黄味茶(2.5Y 6/2〜10YR 7/6) ＳＰ産生せず澱粉・無機塩寒天Ｇ非常に良好、平坦、鈍黄味橙(10YR 7/8) （ＩＳＰ４）ＡＭ豊富に形成、ビロード状、明るい茶味灰(10YR 6/1) Ｒ茶味灰ないし黄味茶(10YR 6/2〜10YR 7/6) ＳＰ産生せずチロシン寒天Ｇ非常に良好、平坦、黄味茶(10YR 7/6) （ＩＳＰ７）ＡＭ良好、ビロード状、湿潤、明るい茶味灰(7.5YR 7/1) Ｒ茶味灰ないし黄味茶(2.5Y 6/1〜10YR 7/6) ＳＰ産生せず栄養寒天Ｇ非常に良好、平坦、薄黄味茶(2.5Y 8/4) (Difco) ＡＭ良好、ビロード状、茶味白(5YR 6/1) Ｒ薄黄味茶(10YR 6/4) ＳＰ産生せずイーストエキス・Ｇ非常に良好、平坦、薄黄味茶(10YR 6/4) 麦芽エキス寒天ＡＭ豊富に形成、ビロード状、茶味灰(5YR 5/1) （ＩＳＰ２）Ｒ明るい茶(7.5YR 6/6) ＳＰ黄味茶(10YR 6/6) オートミール寒天Ｇあまり良くない、平坦、薄黄味橙(10YR 8/3) （ＩＳＰ３）ＡＭ良好、ビロード状、茶味灰(7.5YR 5/1) Ｒ灰味茶(7.5YR 6/3) ＳＰ薄茶(7.5YR 7/3) 水寒天Ｇ良くない、平坦、薄茶(2.5Y 8/2) ＡＭ僅かに形成、明るい茶味灰(7.5YR 7/1) Ｒ薄茶(2.5Y 8/2) ＳＰ産生せずポテトエキス・Ｇ良くない、平坦、薄黄味茶(2.5Y 8/3) 人参エキス寒天ＡＭ良好に形成、ビロード状、灰味茶(7.5YR 6/2) Ｒ茶味灰(10YR 6/2) ＳＰ産生せず＊１Ｇ：生育、ＡＭ：気菌糸、Ｒ：裏面、ＳＰ：可溶性色素＊２性状の欄の（）内はマンセル方式による色調表示を表す。

【００２７】３．生理学的性質２８℃で培養後、２ないし２１日間に観察したＳＡＮＫ
６６７９７株の生理学的性質は表２に示す通りであ
る。

【００２８】

【表２】＊培地１：トリプトン・イーストエキス・ブロス（ＩＳ
Ｐ１）２：ペプトン・イーストエキス・鉄寒天（ＩＳＰ６）３：チロシン寒天（ＩＳＰ７）４：イーストエキス・麦芽エキス寒天（ＩＳＰ２）。

【００２９】また、プリドハム・ゴトリーブ寒天培地
（ＩＳＰ９）を使用して、２８℃、１４日間培養後に観
察したＳＡＮＫ６６７９７株の炭素源の資化性は、表
３に示すとおりである。

【００３０】

【表３】炭素源資化性Ｄ−グルコース＋Ｄ−フルクトース ± Ｄ−アラビノース＋Ｌ−ラムノース＋Ｄ−キシロース ± シュークロース − イノシトール＋ラフィノース − Ｄ−マンニトール＋対照 − ＋：利用する、 ±：弱く利用する、−：利用しない。

【００３１】４．菌体成分についてＳＡＮＫ６６７９７株の細胞壁は長谷川らの方法〔T.
Hasegawa et al., J.Gen. Appl. Microbiol., 29巻、
319〜322頁、(1983年)〕に従い検討した結果、ＬＬ−ジ
アミノピメリン酸が検出されたことから細胞壁タイプＩ
であることが確認された。また、ＳＡＮＫ６６７９７
株の全細胞中の糖成分を上述の長谷川らの方法に従い検
討した結果、特徴的なパターンは認められなかった。

【００３２】ＩＳＰ〔インターナショナル・ストレプト
ミセス・プロジェクト（International Streptomyces P
roject）〕基準、ワックスマン著、ジ・アクチノミセテ
ス（S. A. Waksman、The Actinomycetes）第２巻、ブキ
ャナンとギボンズ編、バージーズ・マニュアル（R. E.
Buchanan and N. E. Gibbons、 Bergey's Manual ofDet
erminative Bacteriology）第８版（1974年）、バージ
ーズ・マニュアル（Bergey's Manual of Systematic Ba
cteriology）第４巻（1989年）、およびストレプトミ
セス（Streptomyces）属放線菌に関する最近の文献によ
って同定を行い、本菌株が放線菌の中でもストレプトミ
セス（Streptomyces）属に属すると判断した。そこで、
本菌株をストレプトミセス・エスピー（Streptomyces s
p.）ＳＡＮＫ６６７９７株と命名した。なお、本菌株
は平成１０（１９９８）年１月２１日に工業技術院生命
工学工業技術研究所に国際寄託され、寄託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−６２３５が付された。

【００３３】以上、ＳＡＮＫ６６７９７株について説
明したが、放線菌の諸性質は一定したものではなく、自
然的、人工的に容易に変異を起こし得ることは周知の通
りである。本発明で使用し得る菌株は、そのような全て
の変異株を包含する。すなわち本発明は、ストレプトミ
セス属に属し、Ａ−７７９５１を生産する全ての菌株を
包含するものである。

【００３４】本発明の化合物の生産菌の培養において
は、通常の放線菌用の培養法が一般に用いられる。

【００３５】本発明の化合物を得るため、その生産菌の
培養は、従来真菌類や放線菌類の菌株の培養に利用され
ている培地中で行われる。そのような培地としては、微
生物が同化できる炭素源、窒素源、無機イオンおよび有
機栄養源等より選択されたものを適宜含有する培地であ
れば、合成または天然培地のいずれでも使用可能であ
る。

【００３６】具体的には、まず炭素源としてはグルコー
ス、フルクトース、マルトース、シュクロース、マンニ
トール、グリセロール、デキストリン、オート麦、ライ
麦、トウモロコシ澱粉、ジャガイモ、トウモロコシ粉、
大豆粉、綿実油、水飴、糖蜜、大豆油、クエン酸、酒石
酸等を単一で、あるいは併用して使用することができ
る。培地中の該炭素源の含量は、一般には培地量の１〜
１０重量％で変量するが、この範囲に限定されない。

【００３７】また、窒素源としては、一般に蛋白質また
はその加水分解物を含有する物質を用いることができ
る。好適な窒素源としては、例えば大豆粉、フスマ、落
花生粉、綿実粉、カゼイン加水分解物、ファーマミン、
魚粉、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキス、生
イースト、乾燥イースト、イーストエキス、マルトエキ
ス、ジャガイモ、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、
硫酸アンモニウム等を使用し得る。これら窒素源は、単
一または併用して培地量の０．２〜１０重量％の範囲で
用いられることが好ましい。

【００３８】さらに栄養無機塩としては、ナトリウム、
アンモニウム、カルシウム、フォスフェート、サルフェ
ート、クロライド、カーボネート等のイオンを得ること
のできる通常の塩類を使用し得る。また、カリウム、カ
ルシウム、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の
微量の金属も使用され得る。

【００３９】なお、液体培養に際しては、消泡剤として
シリコン油、植物油、界面活性剤等を使用することがで
きる。

【００４０】ＳＡＮＫ６６７９７株を培養して、本発
明の化合物を生産するための培地のｐＨは、好適には
５．０〜８．０である。

【００４１】ＳＡＮＫ６６７９７株は１４℃から３５
℃の範囲で生育し、特に２１℃から３０℃の範囲で良好
に生育する。さらに本発明の化合物の生産には２２℃か
ら２８℃で培養することが好ましく、より好適には２６
℃から２８℃で培養することが好ましい。本発明の化合
物は、好気的に培養することにより得られるが、通常用
いられる好気的培養法、例えば固体培養法、振盪培養
法、通気撹拌培養法等が用いられる。

【００４２】小規模な培養においては、２８℃で数日間
振盪培養を行うことが好ましい。培養は、三角フラスコ
中で一段階または複数段階の種の発育工程により開始す
る。種フラスコは定温インキュベーター中で数日間、ま
たは充分に成長するまで振盪する。成長した種は、その
一部または全部を次段階の種培地または生産培地に接種
するのに使用される。接種した生産培地を含むフラスコ
を一定温度で数日間振盪し、培養終了後、フラスコの含
有物を遠心分離またはろ過により分別する。大量培養の
場合には、撹拌機、通気装置を付けた適当なタンクで培
養するのが好ましい。この方法によれば栄養培地をタン
クの中で作製することができる。栄養培地を１２１℃ま
で加熱して滅菌し、冷却後、この滅菌培地に予め成長さ
せてあった種を接種する。培養は２８℃で通気撹拌して
行う。この方法は多量の化合物を得るのに適している。

【００４３】培養の経過に伴って生産される本発明の化
合物の量の経時変化を知るには、例えば培養液に等量の
アセトン加え攪拌後、ろ過して得たアセトン抽出液を、
上記酵母の生育阻害試験に付して測定する。本発明の化
合物の生産量は通常４８時間から１４０時間の培養で最
高値に達する。

【００４４】培養終了後、珪藻土をろ過助剤とするろ過
操作または遠心分離によって菌体とろ液を分別する。本
発明の化合物はその菌体または沈殿層中に存在し、その
物理化学的性状を利用して抽出精製することにより得る
ことができる。

【００４５】例えば、菌体をアセトン抽出し、アセトン
を留去した本発明の化合物を含む溶液を、水と混和しな
い有機溶剤、たとえば、ｎ−ブタノール、酢酸エチル、
メチレンクロライド等の単独またはそれらの組み合わせ
た有機溶剤を用いて抽出することにより、本発明の化合
物を得ることができる。

【００４６】また、活性炭または吸着用樹脂であるアン
バーライトＸＡＤ−２、同ＸＡＤ−４（ローム・アンド
・ハース社製）等や、ダイヤイオンＨＰ−１０、同ＨＰ
−２０、同ＨＰ−５０、同ＣＨＰ２０Ｐ（三菱化学
（株）社製）等を使用し、本発明の化合物を含む液を上
記吸着剤の層を通過させて不純物を吸着させて取り除く
か、または本発明の化合物を吸着させた後、メタノール
水、アセトン水等の水と有機溶剤との混合溶剤を用いて
溶出させることにより、本発明の化合物を回収すること
もできる。

【００４７】このようにして得られた本発明の化合物
は、さらにシリカゲル、フロリジルのような担体を用い
た吸着カラムクロマトグラフィー、アビセル（旭化成工
業（株）社製）、セファデックスＬＨ−２０（ファル
マシア社製）等を用いた分配カラムクロマトグラフィー
および順相、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラ
フィー等で精製することができる。

【００４８】以上の分離、精製の手段を単独または適宜
組み合わせ、場合によっては反復して用いることによ
り、本発明の化合物Ａ−７７９５１を分離精製すること
ができる。なお、本発明の化合物の精製過程における所
在は、前記した酵母の高塩濃度下での生育阻害活性を調
べる方法の他、次に挙げる各々の方法によって検出する
ことができる。

【００４９】混合リンパ球培養反応：ヒトまたはマウ
ス等の末梢血からリンパ球画分を分離し、マイトマイシ
ンＣ刺激またはＸ線照射した群を刺激細胞、未処理群を
反応細胞とし、両者を混合培養（刺激細胞１に対して反
応細胞１乃至２の割合）すると、反応細胞が幼若化を起
こし増殖を開始する。この培養系に被検試料を添加した
ときの、反応細胞の増殖阻害活性を調べる。反応細胞の
増殖は、³Ｈ−チミジンの取り込み等、既知の細胞増殖
定量法を用いて調べることができる。

【００５０】高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
を用いる方法：被検試料について以下の条件でＨＰＬ
Ｃを実施する：分離カラム：シンメトリーＯＤＳ（φ４．６×１５０
ｍｍ、ウォーターズ社製）；移動相：６５％アセトニトリル−水；流速：１．０ｍｌ／分；検出波長：２１０ｎｍ；温度：２５℃。

【００５１】上記条件において、本発明の化合物は保持
時間６．４分の単一ピークとして検出される。

【００５２】以上のごとくして得られる本発明の化合物
は、文献未掲載の新規化合物であるが、その免疫抑制活
性は前記混合リンパ球培養反応等、既知の免疫抑制活性
測定方法を用いて調べることができる。また、本発明の
化合物は、高塩濃度条件下で酵母の生育を阻害すること
から、例えば塩化ナトリウムとの併用により抗真菌剤と
して使用することもできる。

【００５３】本発明の化合物またはその薬理学的に許容
される塩は種々の形態で投与される。その投与形態とし
ては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロッ
プ剤等による経口投与、または注射剤（静脈内、筋肉
内、皮下）、点滴剤、点眼剤、坐剤等による非経口投与
を挙げることができる。これらの各種製剤は、常法に従
って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭
剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等の医薬の製
剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用い
て製剤化することができる。

【００５４】錠剤の形態に成形するに際しては、担体と
してこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば
乳糖、白糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、澱
粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ
酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロ
ップ、グルコース液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキ
シメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リ
ン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤；乾燥
澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、
炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチ
レンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリ
ウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等の崩壊剤；
白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊
抑制剤；第四級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリ
ウム等の吸収促進剤；グリセリン、澱粉等の保湿剤；澱
粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸
等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポ
リエチレングリコール等の潤沢剤等が例示できる。さら
に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖
衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティン
グ錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる。

【００５５】丸剤の形態に成形するに際しては、担体と
してこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば
グルコース、乳糖、カカオバター、澱粉、硬化植物油、
カオリン、タルク等の賦形剤；アラビアゴム末、トラガ
ント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤；ラミナラン
寒天等の崩壊剤等が例示できる。

【００５６】坐剤の形態に成形するに際しては、担体と
してこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば
ポリエチレングリコール、カカオバター、高級アルコー
ル、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グ
リセリド等を挙げることができる。

【００５７】注射剤として調製される場合には、液剤お
よび懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であるのが好ま
しく、これら液剤、乳剤および懸濁剤の形態に成形する
に際しては、希釈剤としてこの分野で慣用されているも
のを全て使用でき、例えば水、エタノール、プロピレン
グリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポ
リオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチ
レンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができ
る。なお、この場合、等張性の溶液を調製するのに十分
な量の食塩、グルコース、あるいはグリセリンを医薬製
剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩
衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。

【００５８】さらに必要に応じて着色剤、保存剤、香
料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有せしめてもよ
い。

【００５９】上記医薬製剤中に含まれる有効成分化合物
の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、通
常全組成物中１乃至７０重量％、好ましくは１乃至３０
重量％含まれる量とするのが適当である。

【００６０】上記医薬製剤の投与方法は特に限定はな
く、各種製剤形態、患者の年齢、体重、性別その他の条
件、疾患の程度等に応じて決定される。例えば錠剤、丸
剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤の場
合には経口投与される。また注射剤の場合には単独であ
るいはグルコース、アミノ酸等の通常の補液と混合して
静脈内投与され、さらには必要に応じて単独で筋肉内、
皮内、皮下もしくは腹腔内投与される。坐剤の場合には
直腸内投与される。

【００６１】その使用量は症状、年齢、体重、投与方法
および剤形等によって異なるが、通常は成人に対して１
日あたり、上限として２００ｍｇ（好ましくは１００ｍ
ｇ）、下限として０．１ｍｇ（好ましくは１ｍｇ）を症
状に応じて一回または数回に分けて投与することができ
る。

【００６２】

【実施例】以下に実施例および試験例をあげて本発明
をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定さ
れるものではない。

【００６３】実施例１．酵母の生育を利用したスクリ
ーニング系によるＡ−７７９５１生産菌の選択 Saccharomyces cerevisiae ＳＡＮＫ５０１８２（Ｆ
ＥＲＭＢＰ−４５３０）株を、１×ＹＰＤ培地（１％
イーストエキストラクト、２％バクトペプトン、２
％グルコース）１０ｍｌを入れた１００ｍｌ容三角
フラスコ中に一白金耳接種し、２８℃、２１０ｒｐｍで
一晩培養したものを種酵母として用いた。９６穴プレー
ト（ＭＳ−８０９６Ｆ：住友ベークライト（株）社製）
の各ウエルに２×ＹＰＤ培地１５０μｌ、５Ｍ塩化ナ
トリウム６０μｌ、被検試料５μｌ、種酵母５μｌを
入れ、各ウエル内液量を滅菌水で３００μｌとなるよう
に調整した。また同時に、５Ｍ塩化ナトリウムを添加
しない以外は全く同じ条件のプレートを用意した。これ
らを２８℃で１６時間静置培養した後、各ウェル内を懸
濁させ、マイクロプレートリーダー（モデル４５０：バ
イオラッド社製）で５９５ｎｍの吸光度を測定した。被
検試料無添加群における吸光度を基準として、被検試料
における吸光度の減少率を酵母生育阻害率とした。塩化
ナトリウム添加群でのみ酵母生育阻害活性を示し、かつ
その生育阻害率が５０％以上のウエルを陽性と評価し
た。

【００６４】上記方法を用いて、種々の微生物二次代謝
産物のスクリーニングを実施した結果、茨城県岩井市で
採集したカヤツリグサ科スゲ属の植物生葉から分離され
たストレプトミセス・エスピー（Streptomyces sp.）Ｓ
ＡＮＫ６６７９７株の菌体抽出物が陽性と評価され
た。

【００６５】また、既知の免疫抑制剤であるＦＫ５０６
およびシクロスポリンＡについて同様の試験を実施した
結果、いずれも陽性と判定された。

【００６６】実施例２．Ａ−７７９５１の生産（Ａ）培養下記の組成の培地５００ｍｌを２リットル容三角フラス
コ４本に入れ、１２１℃で３０分間加熱滅菌した。２８
℃に冷却した後に、ストレプトミセスエスピー（Stre
ptomyces sp.）ＳＡＮＫ６６７９７株（ＦＥＲＭＢ
Ｐ−６２３５）のスラントをホモジナイズして接種し、
２８℃、２１０ｒｐｍ回転振盪培養機で、１６８時間
培養し種培養液とした。

【００６７】培地組成：グルコース５．０％大豆粉（ソーヤフラワー：日清製粉（株）社製）１．０％肉エキス（エルリッヒ肉エキス：極東製薬（株）社製）０．４％ポリペプトン（日本製薬（株）社製）０．４％イーストエキストラクト（ディフコ社製）０．１％炭酸カルシウム０．５％塩化ナトリウム０．２５％消泡剤（ＣＢ−４２２１０％アセトン溶液：日本油脂（株）社製）０．０１％滅菌前ｐＨ７．２。

【００６８】さらに、上記組成の培地１５リットルを３
０リットル容量のジャーファーメンテーター４基に仕込
み、１２１℃で３０分間加熱滅菌した。これを２８℃に
冷却した後、種培養液を４５０ｍｌずつ接種して、毎分
１５リットルの空気を通気し、溶存酸素量５．０ｐｐｍ
を保持させるように回転数を１００〜２３０ｒｐｍの範
囲内で調整し、２８℃で７２時間攪拌培養した。

【００６９】（Ｂ）単離上記（Ａ）で得られた培養液５５リットルに、ろ過助剤
としてセライト５４５(ジョンズマンビルプロダク
トコーポレーション社製）２．４ｋｇを加えてろ過
し、菌体のケーキ９．２ｋｇを得た。このケーキに４０
リットルの８０％アセトン−水を加えて１時間攪拌抽出
後、ろ過を行ってアセトン抽出液を得た。このアセトン
抽出液４０リットルを減圧下濃縮して濃縮液１２リット
ルを得た。この濃縮液のｐＨを７．０に調整して１０リ
ットルの酢酸エチルで３回抽出をし、有機層を回収し
た。酢酸エチル抽出３回分の有機層をまとめ、飽和食塩
水で洗浄してから、無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾紙
でろ過後、減圧下濃縮乾固してＡ−７７９５１を含む抽
出物２６．８ｇを得た。

【００７０】次いでこの抽出物２６．８ｇを、酢酸エチ
ル５００ｍｌで溶解した後にコスモシールＣ１８−ＯＰ
Ｎ（ナカライテスク（株）社製）４０ｇにコーティング
し、あらかじめ５０％アセトニトリル−水で平衡化した
コスモシールＣ１８−ＯＰＮ１リットルを充填したカラ
ムに重層した。５０％アセトニトリル−水２．５リット
ルで洗浄し、５０％アセトニトリル−水１．９リット
ル、６０％アセトニトリル−水１．６リットルで溶出し
た。それぞれ溶出画分をｐＨ７に調整して酢酸エチル抽
出して有機層を集め、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナ
トリウムで脱水して濾紙でろ過後、減圧下濃縮乾固して
油状物４．１４ｇ（５０％アセトニトリル溶出画分）お
よび０．９６ｇ（６０％アセトニトリル溶出画分）を得
た。

【００７１】得られた油状物４．１４ｇ、０．９６ｇを
それぞれ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用
いて分取し、Ａ−７７９５１を精製した。あらかじめＨ
ＰＬＣカラム（ＹＭＣ−ＰａｃｋＳ−１０５０−２０
−ＳＲＯＤＳ（１５／３０）φ１００×５００ｍｍ：
ワイエムシイ社製）を７０％アセトニトリル−水で平衡
化し、メタノール１５ｍｌで油状物０．９６ｇを溶解し
試料溶液として全量を注入後、７０％アセトニトリル−
水を移動相として流速２４０ｍｌ／分で展開した。検出
波長２１０ｎｍでモニタ−して、保持時間４８分から５
０分の溶出液４８０ｍｌを集めた。残りの油状物４．１
４ｇについても同様にＨＰＬＣ分取を行い、保持時間４
８分から５２分の溶出液９６０ｍｌを集めた。これらの
溶出液を減圧下濃縮乾固して、黄色粉末４８．２ｍｇを
得た。

【００７２】さらに、あらかじめ７０％アセトニトリル
−水で平衡化したＨＰＬＣカラム（センシューパック・
ペガシルＯＤＳ、φ２０×２５０ｍｍ、センシュー科学
（株）製）に、前記粉末全量をメタノール０．８ｍｌで
溶解した試料溶液の半量を注入後、７０％アセトニトリ
ル−水を移動相として流速６．０ｍｌ／分で展開した。
検出波長２１０ｎｍでモニタ−して、保持時間３４分か
ら３５分の溶出液６ｍｌを集めた。残りの試料溶液につ
いても同様の操作を行って、溶出液を回収した。これら
の溶出液を減圧下濃縮乾固して、Ａ−７７９５１の黄色
粉末９．４ｍｇを得た。

【００７３】この黄色粉末の一部を取り高速液体クロマ
トグラフィ−（ＨＰＬＣ）で分析したところ下記の結果
を得た。

【００７４】分離カラム：シンメトリーＯＤＳ（φ
４．６×１５０ｍｍ：ウォーターズ社製）；移動相：６５％アセトニトリル−水；流速：１．０ｍｌ／分；検出波長：２１０ｎｍ；温度：２５℃；保持時間：６．４分。

【００７５】試験例酵母の生育阻害試験で活性があった試料の免疫抑制活性
を、混合リンパ球培養（以下「ＭＬＣ」という）反応を
用いて確認した。

【００７６】リンパ球の調製：ヒト末梢血４０ｍｌを
採取し、ハンクス平衡塩溶液（Hanks' Balanced Salt S
olution：以下「ＨＢＳＳ」という。ギブコ・ビーアー
ルエル社製）で２倍希釈後、フィコール−パックプラ
ス（ファルマシア社製）に積層して、１７００ｒｐｍ
３０分、２０℃で遠心した。中間層を回収し、ＨＢＳＳ
で洗浄後、４℃で１０００ｒｐｍで１０分間遠心して、
沈殿を１０％ウシ胎仔血清（以下「ＦＢＳ」という）
を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ・ビーアールエル
社製）で再懸濁させた。これをヒト末梢血リンパ球の浮
遊細胞とした。細胞をカウント後、１０％ＦＢＳを含
むＲＰＭＩ１６４０培地で２×１０⁶細胞／ｍｌに調製
し、ＭＬＣ反応の「反応細胞」として用いた。

【００７７】刺激細胞の調製：上記ヒト末梢血リンパ
球の浮遊細胞を、５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０
培地で１×１０⁵細胞／ｍｌに調整し、細胞培養フラス
コに入れて５％炭酸ガス、３７℃で１時間培養した。上
清を回収後、５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地
で１×１０⁶細胞／ｍｌに調整し、マイトマイシンＣ
（協和醗酵（株）社製）を５０μｇ／ｍｌとなるように
添加して３７℃で６０分間保温した。ＲＰＭＩ１６４０
培地で細胞を３回洗浄後、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭ
Ｉ１６４０培地で２×１０⁶細胞／ｍｌに調整したもの
をＭＬＣ反応の「刺激細胞」として用いた。

【００７８】ＭＬＣ反応：上記のように調製した反応
細胞液５０μｌ、刺激細胞液５０μｌおよび被検試料液
１００μｌを９６穴プレートに入れ、５％炭酸ガス、３
７℃の条件下で７日間培養した。被検試料は、０．５％
ジメチルスルホキシドおよび１０％ＦＢＳを含むＲ
ＰＭＩ１６４０培地で２００μｇ／ｍｌに調製し、これ
をストックサンプルとして１０倍ずつ段階希釈して用い
た。

【００７９】７日間の細胞培養終了後に、³Ｈ−チミジ
ンを１８．５Kbq／ウェルで添加し、さらにで１８時間
培養後、セルハーベスターを用いて各ウェルの細胞を回
収し、細胞内に取り込まれた放射活性を液体シンチレー
ションカウンターで測定した。被検試料未添加群の細胞
に取り込まれた放射活性を基準にして、被検試料添加群
の細胞に取り込まれた放射活性の抑制率を計算した。そ
の結果を表４に示す。

【００８０】

【表４】Ａ−７７９５１ ³Ｈ−チミジン抑制率添加濃度取り込み量 (％) (μｇ／ｍｌ) （ｃｐｍ）反応細胞のみ０ 486 − 刺激細胞のみ０ 32 − 反応細胞＋刺激細胞０ 57080 ０ 0.00001 18455 67.7 0.0001 14161 75.2 0.001 25653 55.1 0.01 13988 75.5 0.1 24686 56.8 1 7605 86.7 Ａ−７７９５１は、低濃度で免疫抑制活性を示した。

【００８１】細胞毒性：ヒト由来細胞株Ｕ９３７（Ａ
ＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ−１５９３）を１０％ＦＢＳを含
むＲＰＭＩ１６４０培地で１×１０⁴細胞／ｍｌに調整
し、９６穴プレートに１００μｌ／ウェルずつ入れ、同
時に上記ＭＬＣ反応に使用したのと同じ被検試料を１０
０μｌ添加した。このものを５％炭酸ガス、３７℃の条
件下で４日間培養した後、各ウェルの上清を除去し、Ｐ
ＢＳで５ｍｇ／ｍｌに希釈したＭＴＴ試薬（３−（４，
５−ジメチル−２−チアゾイル）−２，５−ジフェニル
−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド：和光純薬工業（株）
社製）を１０μｌ／ウェル添加した。さらに３７℃で４
時間培養後、上清を除去し、ジメチルスルホキシドを１
５０μｌ／ウェル添加して撹袢後、マイクロプレートリ
ーダーで５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。被検試
料未添加群の吸光度を基準として、被検試料添加群の吸
光度の抑制率を計算することにより細胞毒性を評価し
た。その結果を表５に示す。

【００８２】

【表５】Ａ−７７９５１添加濃度ＯＤ５５０ｎｍ抑制率 (μｇ／ｍｌ) （％）０ 1.48 ０ 0.00001 1.37 7.4 0.0001 1.37 7.4 0.001 1.50 1.4 0.01 1.33 10.1 0.1 1.67 -12.8 Ａ−７７９５１は、０．１μｇ／ｍｌ以下の濃度では、
Ｕ９３７の増殖にほとんど影響を与えなかった。

【００８３】製剤例カプセル剤：実施例２で得られた化合物１００ｍｇ乳糖１００ｍｇトウモロコシ澱粉１４８．８ｍｇステアリン酸マグネシウム１．２ｍｇ全量３５０ｍｇ上記処方の粉末を混合し、６０メッシュのふるいに通し
た後、この粉末をゼラチンカプセルに入れ、カプセル剤
とする。

【００８４】

【発明の効果】本発明により、免疫抑制活性を有する
化合物の新規評価方法が提供された。また、本発明によ
り、優れた免疫抑制活性を有する新規化合物、該化合物
の生産菌および該化合物の製造方法が提供された。本発
明の化合物は、医薬、特に臓器移植時の拒絶反応や自己
免疫疾患等の症状を改善するための免疫抑制剤として有
用である。さらに、本発明の化合物は抗真菌剤としても
有用である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｐ 17/18 ＤＣ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｔ //(Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者中島睦男東京都品川区広町１丁目２番58号三共株式会社内 (72)発明者西崎知子東京都品川区広町１丁目２番58号三共株式会社内 (72)発明者木塚正明茨城県つくば市御幸が丘33 三共株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記式（Ｉ）：【化１】で表される化合物またはその塩。
【請求項２】下記の物理化学的性状を有する化合物ま
たはその塩：１）性質：黄色粉末；２）溶解性：ジメチルスルホキシド、メタノール、エタ
ノールに可溶、水に不溶；３）分子式：Ｃ₇₅Ｈ₁₁₄Ｏ₂₆Ｓ；４）分子量：１４６２；５）ＦＡＢマススペクトル：m/z amu ポジティブモード（マトリックス： m-NBA）；１４８５
（Ｍ＋Ｎａ）⁺ ネガティブモード（マトリックス： m-NBA）；１４６２
（Ｍ）^-；６）高分解能ＦＡＢマススペクトル： m/z amu ポジティブモード（マトリックス： m-NBA）測定値；１４８５.７２１１（Ｍ＋Ｎａ）⁺ Ｃ₇₅Ｈ₁₁₄Ｏ₂₆Ｓ＋Ｎａとしての計算値；１４８５．７
２１７；７）紫外線吸収スペクトル（エタノール）：λ_maxｎｍ
（ε） 214(19328)、275(12281)、333(4825)、358(5088)；８）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νmax ｃｍ^-1 3419、2921、2852、1718、1665、1595、1379、1256、11
69、1064；９）¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：δｐｐｍ（積分、多
重度、結合定数）重ジメチルスルホキシド溶液中、テトラメチルシラン
（以下「ＴＭＳ」という）を内部基準として、２９３Ｋ
で測定した核磁気共鳴スペクトル（６００ＭＨｚ）は次
の通りである：8.02(1H, d, 8.03), 7.89(1H, s), 7.75
(1H, d, 8.03), 6.82(1H, m),6.72(1H, s), 6.64(1H,
s), 5.89(1H, d, 15.39), 5.56(1H, m),5.39(1H, dd, 1
5.29, 6.54), 5.38(1H, m), 5.30(1H, s), 5.27(1H,
m),5.01(1H, m), 4.82(1H, br d), 4.74(1H, m), 4.74
(1H, m),4.67(1H, d, 3.95), 4.62(1H, br d), 4.53(1
H, m), 4.53(1H, m),4.50(1H, m), 4.36(1H, d, 4.28),
4.33(1H, m), 4.27(1H, d, 5.62),4.19(1H, d, 5.88),
4.16(1H, m), 4.15(1H, m), 4.12(1H, d, 3.34),3.97
(1H, m), 3.86(1H, m), 3.85(1H, m), 3.79(1H, m), 3.
70(1H, m),3.68(1H, m), 3.62(1H, m), 3.61(1H, m),
3.53(1H, m), 3.47(1H, m),3.29(1H, m), 3.23(1H, m),
3.16(1H, m), 2.67(1H, m), 2.67(1H, m),2.60(1H,
m), 2.44(3H, s), 2.37(1H, m), 2.26(1H, m), 2.00(2
H, m),1.99(3H, s), 1.98(1H, m), 1.86(3H, s), 1.85
(1H, m), 1.84(1H, m),1.82(2H, m), 1.80(1H, m), 1.7
7(1H, m), 1.63(1H, m), 1.62(1H, m),1.61(2H, m), 1.
61(2H, m), 1.58(1H, m), 1.58(1H, m), 1.55(2H, m),
1.55(1H, m), 1.52(1H, m), 1.48(1H, m), 1.45(1H,
m), 1.43(1H, m),1.34(1H, m), 1.27(1H, m), 1.25(2H,
m), 1.12(1H, m), 1.12(1H, m),1.12(3H, d, 5.58),
1.11(1H, m), 1.02(3H, d, 6.15), 1.01(3H, m),0.97(3
H, m), 0.97(3H, m), 0.80(3H, m), 0.77(3H, m), 0.76
(3H, m),0.70(3H, d, 6.00)；１０）¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：δｐｐｍ（多重
度）重ジメチルスルホキシド溶液中（ＴＭＳ内部基準）、２
９３Ｋで測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨ
ｚ）は次の通りである：181.15(s), 180.70(s), 173.64
(s), 170.14(s), 165.44(s), 155.58(s),146.76(d), 14
3.41(s), 143.01(s), 133.56(d), 133.56(d), 129.94
(d),129.16(s), 126.98(d), 126.84(d), 126.72(s), 12
6.05(d), 125.72(d),122.75(d), 102.84(d), 98.26(s),
94.51(d), 78.91(d), 77.01(d), 75.57(d),75.17(d),
75.17(d), 72.97(d), 72.29(d), 72.22(d), 71.42(d),
69.37(d),69.07(d), 69.07(d), 67.19(d), 66.87(d), 6
5.58(d), 64.29(d), 64.07(d),63.22(d) ,62.89(d), 6
2.89(d), 56.88(d), 46.06(t), 44.65(t), 43.55(d),4
2.76(t), 40.61(t), 40.31(t), 40.31(t), 39.63(t), 3
9.63(t), 38.53(d),37.93(d), 37.92(d), 36.70(d), 3
4.49(d), 31.86(t), 30.00(t), 29.17(t),27.15(t), 2
4.46(t), 24.33(t), 21.03(q), 17.93(q), 16.84(q), 1
4.96(q),14.52(q), 14.33(q), 14.28(q), 13.02(q), 1
2.70(q), 9.46(q), 9.14(q),4.87(q)；１１）高速液体クロマトグラフィー：分離カラム：シンメトリーＯＤＳ（φ４．６×１５０
ｍｍ、ウォーターズ社製）；移動相：６５％アセトニトリル−水；流速：１．０ｍｌ／分；検出波長：２１０ｎｍ；温度：２５℃；保持時間：６．４分。
【請求項３】ストレプトミセス属に属する請求項１ま
たは２記載の化合物の生産菌を、請求項１または２記載
の化合物の生産が可能な条件下で培養し、次いで、該培
養物から請求項１または２記載の化合物を回収すること
を特徴とする、請求項１または２記載の化合物の製造方
法。
【請求項４】ストレプトミセス属に属する請求項１ま
たは２記載の化合物の生産菌がストレプトミセス・エス
ピー（Streptomyces sp.）ＳＡＮＫ６６７９７（ＦＥ
ＲＭＢＰ−６２３５）であることを特徴とする、請求
項３記載の方法。
【請求項５】ストレプトミセス属に属し、請求項１ま
たは２記載の化合物を生産することを特徴とする微生
物。
【請求項６】ストレプトミセス・エスピー（Streptom
yces sp.）ＳＡＮＫ６６７９７（ＦＥＲＭＢＰ−６２
３５）である請求項５記載の微生物。
【請求項７】請求項１または２記載の化合物、もしく
はそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含
有する医薬。
【請求項８】請求項１または２記載の化合物、もしく
はそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含
有する免疫抑制剤。
【請求項９】請求項１または２記載の化合物、もしく
はそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含
有する抗真菌剤。
【請求項１０】物質の免疫抑制活性を評価する方法で
あって、酵母を０．１乃至１．５Ｍの塩化ナトリウム、
塩化カリウムもしくは塩化リチウム、および／または被
検物質の存在下で培養し、次いで、該被検物質の酵母生
育阻害活性を測定することを特徴とする方法。
【請求項１１】酵母としてSaccharomyces cerevisiae
ＳＡＮＫ５０１８２（ＦＥＲＭＢＰ−４５３０）
を用いることを特徴とする、請求項１０記載の方法。