HUT72495A - Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags - Google Patents

Description

A találmány tárgyát kombinatorikus jellegű kémiai reakciók képezik, azaz olyan többlépéses szintézisek, amelyeknek minden lépésében számos különböző molekula jöhet létre, s amelyek nagyszámú, különböző összetételű terméket eredményeznek.

Nagy érdeklődés mutatkozik olyan szintézismódszerek kifejlesztése iránt, amelyek nagyszámú különböző molekulát eredményeznek, amelyek azután különféle fiziológiai és egyéb aktivitásukra nézve vizsgálhatók. Az ilyen szintézisek általában egymást követő lépéseket tartalmaznak, melyeknek során kémiailag módosítják az előző lépésben létrejött molekulát. E módosítás lehet pl. egy monomer egységnek vagy szintonnak a növekvő lánchoz kapcsolása, egy funkciós csoport módosítása stb. A monomer egységek lehetnek pl. aminosavak, nukleotidok, cukrok, lipidek ill. heterociklusos vegyületek, természetes és mesterséges eredetűek egyaránt, valamint ezek kombinációi. Még akkor is hatalmas számú vegyület hozható így létre, ha a lehetséges monomereket a természetben előfordulókra korlátozzuk, hiszen így is 4 nukleotidot, 20 alapvető aminosavat, és megszámlálhatatlan cukormolekulát kell figyelembe vennünk. Hátrányuk azonban az effajta szintéziseknek, melyeknek minden lépésében számos lehetőség adódik, hogy a létrejövő sokfajta molekula közül egy-egy csak igen kis mennyiségben van jelen.Ha valamely vegyület pl. jellegzetes fiziológiai aktivitást mutat, csaknem lehetelen meghatározni a molekula kémiai szerkezetét.

Ráadásul eleddig a fiziológiai hatást mutató vegyületeket általában véletlenszerűen fedezték fel, természetes eredetű elegyek, ill. természtes eredetű aktív vegyületek homológjainak vizsgálata során, akként hogy egyszerre csak viszonylag csekély számú vegyületet teszteltek. Az ilyen nyers elegyek használata esetén az a fő nehézség, hogy az aktív vegyületet tiszta formában izolálni kell, majd meg kell határozni annak szerkezetét.

E hátrányok kiküszöbölésére számos megoldást fejlesztettek ki, melyeknek során szekvenciális szintézis keretében, ellenőrzött ill. véletlenszerű módon,lépésenként adagolják a különböző monomer egységeket, ill. azok keverékét, abból a célból hogy létrehozzák az adott szintézissel egyáltalán előállítható valamennyi molekulatípust, vagy legalábbis azok nagy részét. E módszereknek azonban azt is lehetővé kell tenniük, hogy az érdeklődésre számot tartó - azaz aktivitást mutató - molekulák szerkezete egyedileg is meghatározható legyen.

Az egyik megoldás szerint (Fodor et. al. Science 251: 767 [ 1991] ) egy lapkán, fizikailag is elkülönített helyen végezhető el az egyes vegyületek analízise. Mivel tudjuk, hogy az egyes tartományokba milyen reagenseket adagoltunk, a szintézislépések rekonstruálásával felderíthető az adott szegmensben lévő molekula szerkezete. A lapkát a kívánt aktivitási tesztnek alávetve, az aktivitást mutató szegmensekben található molekulák szerkezete meghatározható.

Egy másik megoldás során a megfelelő oligopeptidek szintézisével párhuzamosan, elméletileg szintetizálják a nekik megfelelő oligonukleotidokat is (Brenner and Lerner, PNAS USA [ 1992] 81: 5381-5383) .

Az alábbi publikációkban további technikai megoldások találhatók

Amoto, Science (1992) 257, 330-331 a polipeptidekkel együtt szintetizált DNS címkék-ről, amelyek segítségével meghatározhatók a polipeptidek.

Lám et. al., Natúré (1991) 354, 82-84 módszer nagy peptidkönyvtárak szintézisére. Houghton et. al., Natúré (1991) 354, 84-86, és Jung és Beck-Sickinger, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1992) 91,367-383, ugyancsak e témával foglalkozik. Kerr et. al., J. Amer. Chem. Soc., (1993), 115,2529-31 peptidláncokkal kódolt oligomer-könyvtárak szintézisét írja le.

A fent leírt módszerek azonban mind olyan esetekre vonatkoznak, amelyeknél szekvenciális láncokat építünk fel, lényegében hasonló részegységekből.Igen fontos lenne módszerek kidolgozása nem hasonló egységeket tartalmazó vegyületekre is.E módszerekkel lehetséges volna pl. szteroidok, antibiotikumok, cukrok, koenzimek, enzim-inhibitorok, ligandumok stb. módosítása, amely a reagensek és /vagy a reakciókörülmények gyakori változtatását kívánja meg, annak érdekében, hogy nagyszámú változatos molekulát nyerhessünk.E reakciókban szerepelhetnek szerves vagy szervetlen reagensek,lehet szó új funkciós csoportok beviteléről ill. a meglévők módosításáról, szubsztituensek kapcsolásáról vagy eltávolításáról, gyűrűk nyitásáról vagy zárásáról, a molekula sztereokémiájának megváltoztatásáról stb. (L. pl. Bunin and Ellman, JACS 114 , 10997,[ 1992] .) Ahhoz hogy egy ilyen módszer használható legyen, természetesen megfelelő eljárás szükséges a keletkező nagyszámú különféle molekula azonosítására.Módszert kell találni az egyes reakciók történetének rögzítésére, és a keletkezett vegyületek kielégítő azonosítására.

Problémát jelent az is, hogy amint az ekként szintetizált vegyület-könyvtárak mérete növekszik, az ismert azonosítási és elválasztási módszerek hatástalannak ill. bizonytalannak mutatkoznak az érdeklődésre számot tartó molekulák kinyerésére ill. azonosítására.Ezért új módszerekre van szükség, amelyek magában a könyvtárban teszik lehetővé a kívánt molekulák szerkezetének meghatározását.

A WO91/17823 és a W092/09300 sz. PCT bejelentések kombinatorikus kémiai könyvtárakkal foglalkoznak.

A fent leírt módszerek hátrányai, valamint az általuk kielégítetlenül hagyott szükségletek vezettek az alább részletesen ismertetendő, valamennyi eddigit felülmúló módszer kidolgozásához.

A találmány tárgya tehát olyan módszerek és kompozíciók kidolgozása, amelyeknek segítségével megvalósítható, hogy a hordozórészecskéken végrehajtott szintézisek lépéseit egyedi címkékkel jelezzük, s igy lehetőség nyíljon a végbement kémiai eseményekből a hordozón létrejött vegyület szerkezetére következtetni. A címkézés azonosító molekulák segítségével valósítható meg.

Az azonosító molekulák az alábbiakkal jellemezhetők:

- a szintézis körülményei között stabilis,

- a szintézislépések alatt kötve marad a hordozóhoz,

- egyértelműen meghatároz egy szintézislépést ami összefüggésben van az adott lépésben lezajló valamelyik részreakcióval·,

- elkülöníthető a vizsgálatban jelenlévő egyéb vegyületektől,

- könnyen lehasitható, s ekkor a szokásos analitikai módszerekkel jól azonosítható jelzömolekulaként jelenik meg.

A találmány szerinti azonosítók egymással kombinálva bináris vagy magasabbrendű rendszert alkothatnak, s így viszonylag csekély számú azonosítóval sok reakciótermék kódolása lehetséges. Bináris rendszer használata esetén N db. azonosítóval akár 2^N különböző vegyület is kódolható.

A találmány szerinti azonosítókat nem kell lépésenként kötni a szubsztráthoz,hanem azok közvetlenül és egyedileg a végtermékmolekulákhoz kapcsolódnak.A fentiek szerint könnyen hasítható részük segítségével lehetővé teszik a szerkezetmeghatározást.

A kombinatorikus szintézisekben általában meghatározható szilárd hordozókat alkalmaznak, amelyeken a reakciók végbemennek, s amelyekhez az azonosítók is kötődnek. A végterméket hordozó egyes hordozórészecskék alávethetök a kívánt tulajdonság szerinti tesztelésnek, majd a kapcsolódó azonosító segítségével kikövetkeztethető a reakciófolyamat, s ebből meghatározható a végtermék szerkezete.

A bejelentésben a címke vagy T jelölés olyan kémiai egységet jelent,amely két fontos tulajdonsággal bír: egyrészt jól megkülönböztethető bármely más kémiai egységtől, másrészt 10 - 10 mól töménységben is jól detektálható.E két tulajdonságot egy viszonylag egyszerű kémiai szerkezet is magában foglalhatja, avagy a két kívánt jellemző két, egymással összekapcsolt szerkezeti részlethez is tartozhat. Ez utóbbi esetben a C-vel (ill. C' , C'' , stb.-vel) jelölt szerkezeti részlet felelős a megkülönböztethetöségért, míg a másik E-vel jelölt a detektálhatóságért és lehetőséget nyújt a többi címkétől való elkülönítésre.

A bejelentésben a kapcsoló vagy L jelölés olyan kémiai egységet jelent, amely az alábbi három tulajdonsággal rendelkezik: Először: köthető egy szilárd hordozóhoz.

Másodszor:köthető egy címkéhez. Harmadszor: miután mindkettőhöz hozzákötődött, akként hasítható, hogy a címke elválasztható legyen a hordozótól. E három tulajdonság is előfordulhat egy szerkezeti egységben, ill. több, egymással összekapcsolt molekularészletben is. Utóbbi esetben pl. az F¹ egység lehet felelős a hordozóhoz kötődésért, a V jelű egység a lehasíthatóságért, míg az A' jelű a kapcsoló és a címke összekapcsolásáért. Kívánatos, hogy a V és A' egység egymással azonos legyen, ekkor ezt a V-A' szerkezeti részletet F - vei jelölhetjük.

Az azonosító kifejezéssel egy címkét és kapcsolót is magában foglaló kémiai egységet jelölünk. így a legáltalánosabban egy azonosító az L-T formulával jelöhetö, míg különböző fajtái az alábbi jelölésekkel írhatók le: F' -V-A' -T; F' -V-A' -C-E (vagy F' -v-A' -E-C) ; L-C-E (vagy L-E-C) ; és L-C-E-C/_.

A bejelentésben a kötött azonosító kifejezés hordozóhoz kapcsolt azonosítót jelöl.

A választék kifejezéssel a kombinatorikus szintézis egy adott lépésénél szóbajöhetö alternatív variációkat jelöljük, pl. a reaktánsok, reagensek, reakciókörülmények, ill. ezek kombinációi. A szintézislépés kifejezés egy olyan vegyület ill. ligandum szekvenciális szintézisének megfelelő lépését jelöli amely a kombinatorikus szintézis kívánt végterméke.

Az alkil kifejezés egyenes, elágazó, vagy ciklusos struktúrákat ill. ezek kombinációit jelöli. így metil-, etil-, propil-, izopropil-, butil-, szék- és terc-butil-, ciklopropilciklobutil-, ciklopentil-, 2-metil-ciklopropil- stb. csoportot. A kis szénatomszámú alkil kifejezés C--C₆ alkilcsoportot jelöl. A kis szénatomszámú alkenil kifejezés

2-6 szénatomszámú egyenes vagy elágazó láncú ill. ciklikus vagy ezek kombinációjával jellemezhető szerkezetű alkenil-csoportot jelöl.

Azok az anyagok, amelyeknek felületén a találmány szerinti kombinatorikus szintéziseket végrehajtjuk, egyaránt -és egymással felcserélhetöen - lehetnek gyöngyök, szilárd felületek, (szilárd)szubsztrátumok, részecskék, hordozók stb. E kifejezések az alábbiakat jelentik:

a) szilárd hordozók mint gyöngyök, pelyhek, lemezek, kapillárisok, üreges rostok, tűk, szilárd szálak, cellulóz-gyöngyök, porózus üveggyöngyök, szilikagélek, divinilbenzollal megfelelően térhálósított polisztirol-gyöngyök, ojtott kopolimer-gyöngyök, poli-akril-amid gyöngyök, latex-gyöngyök, N,N'-bisz-akriloil- etiléndiaminnal megfelelően térhálósított dimetil-akrilamid gyöngyök, hidrofób polimerrel borított üvegrészecskék, stb. azaz olyan anyagok, amelyek merev, vagy félmerev felülettel rendelkeznek; és

b) oldható hordozók mint pl. a nem keresztkötött polisztirol.

Ezen anyagoknak funkciós csoportokat kell tartalmazniuk, vagy legalábbis meg kell hogy legyen annak a lehetősége, hogy rájuk az azonosítók ill. köztitermékek felkapcsolásához szükséges funkciós csoportokat bevihessük.

A bejelentésben használt rövidítések jelentése a következő:

AcOH	ecetsav
BSA	bisz(trimetil-szilil)acetamid
CAN	cérium(IV)ammónium-nitrát
DEAD	dietil-azo-dikarboxilát

DCM	=	diklór-metán
DIC	=	diizopropil-karbodiimid
DMF	=	N, N-dimetil-formamid
Fmoc	=	9-fluorenil-metoxikarbonil
HOBt	=	1-hidroxi-benztriazol
PhMe	=	toluol
szh.	=	szobahőmérséklet
TFA	=	trifluor-ecetsav
THF	=	tetrahidrofurán

A találmány tárgyát képezi olyan termék-könyvtárak előállítása, amelyeknél az egyes termékek ill. vegyületek egymástól fizikailag elválaszthatók, és a kívánt jellemzőre nézve akár a szilárd hordozóhoz kötötten, akár arról lehasítva vizsgálhatók. Sorozatszintézisekröl lévén szó, ahol az egyes intermedierek mindegyik lépésben igen sokféle módon kezelhetők, nagyon nagyszámú termék keletkezik, melyek közül egy-egy gyakran csak kisebb mint 100 pmol, még többször 10 nmol-nál is kisebb mennyiségben van jelen.Ezért az így előállított végtermékek azonosítása izolálást követő szerkezetmeghatározás útján általában nem lehetséges. Az olyan szekvenciális szintézisekben amelyek külünböző egységek összekapcsolásából állnak, a végtermékek csekély mennyisége miatt az ilyen elemzés igen nehéz, ha ugyan nem lehetetlen. Ha azonban minden reakciólépéshez, ill. azok kombinációihoz (mint pl. adjunk az elegyhez A reagenst, vagy adjunk hozzá A reagenst, majd B reagenst, majd hevítsük 100 °C-ra két órán keresztül) hozzákapcsolunk egy azonosítót, amely meghatározza a reaktánsokból, reagensekből, reakciókörülményekből, ill. ezek kombinációiból álló választékot , a reakció története definiálhatóvá válik minden meghatározható és elkülöníthető szubsztrátra nézve. Az azonosítókról lehasított címkék elemzése lehetővé teszi a reakció- folyamat meghatározását, még pikomoláris, vagy akár fentomloárisnál alacsonyabb koncentrációk esetén is.Meghatározhatjuk egy szintézistermék valamely kémiai vagy biológiai jellemzőjét, különböző vizsgálati módszerek segítségével, májd feltárhatjuk a reakció történetét, s ebből meghatározhatjuk a kívánt tulajdonságokkal bíró termék szerkezetét a termékhez kötött címkék segítségével.

Ha a kiinduláskor többszörös címkerendszert alkalmazunk, elkerülhető a bonyolult együttes szintézis, amely csökkenti a kitermelést, és a védöcsoportok sokszorozását igényli, és nincs szükség szekvenálható címkék alkalmazására, amelyek kémiailag szükségképpen labilisak. A többszörös védelem kényszere, ill. az összes ismert szekvenálható címke molekula (pl. a nukleinsavak vagy peptid-oligomerek) belső instabilitása komolyan behatárolja a könyvtár elemeinél ill. ligandumainál felhasználható szintézis-kémiai lehetőségeket.

Kétszeres vagy többszörös címkék alkalmazása magymértékben lecsökkenti az egy szintézislépésben meglévő választék kódolásához szükséges címkék számát.Pl., ha egy szintézislépésben 125 reagens-választási lehetőség van, a bináris rendszerben mindössze 7 címkére van szükség. Ez igen jelentős különbség, mivel enélkül a rendszer, a szükséges megkülönböztethető címkék igen nagy száma miatt, alig megvalósítható. A találmány szerinti bináris rendszer segítségével 30 megkülönböztethető címke - ami rendelkezésre áll - elegendő több mint 10 szintézis kódolására.

Igen fontos, hogy e módszernél a ligandumról lehasítható címkéket alkalmazunk, ill. olyan vegyületeket, amelyeket dekódolás céljából szintetizáltak. A lehasíthatóság azt is lehetővé teszi, hogy a címkék többféleképpen is megkülönböztethetők legyenek: részben elkülöníthetők(pl. kromatográfiás retenciós idő alapján), majd analizálhatók (pl. spektroszkópiai, tömegspektroszkópiai tulajdonságaik alapján, ill. elektoforézissel stb.). Az elkülönítés többszörös lehetősége nagymennyiségű információ kódolását teszi lehetővé csekély számú címkével.

A lehasítás teszi lehetővé azt is , hogy a címkéket már igen kis mennyiségben is észlelni lehessen, mivel a hordozóról, ill. a végtermékről való lehasításuk kiküszöböli ez utóbbiak detektálást zavaró (pl. fluoreszcenciát csökkentő stb.) hatását.

A lehasítható címkék alkalmazása lehetővé teszi továbbá az automatizált gyors-analizáló rendszerek alkalmazását, valamint a funkciós csoportok detektálás céljára szolgáló funkcionális átalakítását, mivel így kiküszöbölhető a detektálás és a szintézis reakciókörülményeinek különbözőségéből adódó probléma.

Minden címkerendszernél alapvető követelmény, hogy a címkék, ill. a bevitelükre szolgáló reakció kémiai jellemzői összeférhetőek legyenek a végtermék-szintézis

reakciókörülményeivel, és viszont. A címkék előnye, hogy kevéssé reaktívak lévén - mint ezt a helyettesített aril- oxipolimetilén származékok példáján alább bemutatjuk - nagyszámú kémiai átalakítás ill. művelet hajtható végre jelenlétükben a végtermék előállításának érdekében.

A találmány szerinti kémiailag stabil címkék további előnye, hogy a gyors és kényelmes szeparációs és elemzési módszerek (mint pl. a gázkromatográfia, ill. a tömegspektroszkópia) széles körét lehet rájuk alkalmazni. A találmány szerinti szerves címkék továbbá általában nem lépnek kölcsönhatásba a biológiai receptorokkal. Ezért a címkék általában nem szolgáltatnak hamis bioógiai eredményeket, és az enzimek és egyéb biológiai molekulák nem módosítják őket.

Végül, a címkék stbilitása lehetővé teszi, hogy számos különböző lehasítási módszert alkalmazhassunk, ezzel is növelve az elemzések érzékenységét.

Találmányunk módszereket ill. vegyületeket ismertet olyan kombinatorikus szintézisek megvalósítására, amelyeknél minden szintézislépéshez egy azonosító kapcsolódik, amely a hordozón vérehajtott szintézisek egy-egy eseményét kódolja. Ez lehet egy reaktáns vagy reakciókörülmény kiválasztása, az adott lépésben, amelyben szerepelhet egy vagy több azonos vagy különböző reaktáns, azonos vagy különböző reakciókörülmények között,vagy pl. részreakcók, többszörös addíciók, addiciós arányok, reagenskombinációk stb.Továbbá, a hordozórészecskék egyes csoprtjait a szekvenciális szintézis folyamán bármikor elválaszthatjuk más csoportoktól, és eltérő kezelésnek vethetjük alá őket.

N darab azonosítót feltételezve, melyek mindegyikének M megkülönböztethető állapota van, M^N különböző szintézist lehet egyértelműen definiálni. M=2 esetben, ahol a különböző állapotot az azonosító megléte vagy hiánya jelentheti, a szintézis bináris kód alapján definiálható. M=3 esetén , ahol a három állapotot pl. az azonosító két különböző koncentrációja ill. a hiánya jelentheti a szintézist 3-as kód alapján lehet definiálni. A 2-nél nagyobb M értékeket magasabbrendű kódoknak nevezzük. Ezek előnye pl. a bináris kódokkal szemben, hogy kevesebb azonosító szükséges ahhoz, hogy a szintézisről ugyanannyi információt kapjunk. A termékek sorozatszintézisek eredményeként vannak meghatározva. Minden szintézislépésnél nagyszámú lehetőség áll rendelkezésre a reaktánsok, reagensek, ill. a reakciókörülmények tekintetében amelyek a könnyen azonosítható és elkülöníthető címke egy-egy tulajdonságában is leképeződnek. Ami a reaktánsokt ill. a reageseket illeti, az előbbiek rendszerint beépülnek a végtermék -azaz az aminosav, nukleofil, elektrofil, dién, alkilező vagy acilezö ágens vagy bármely más szinton stb. szerkezetébe, míg az utóbbiak - savak, bázisok, hevítés, oxidáló vagy redukálószerek - vagy beépülnek a végtermékbe vagy nem. A továbbiakban mindkettőt ágens néven említjük. A szintézis során egyes egyedi reaktánsok beépülhetnek a végtermékbe. Egy-egy szintézislépés egy vagy több reakciólépésből állhat, ami valamely köztitermék módosulását eredményezheti. Sokszor előfordul a fenti lehetőségek kombinációja.

* V >

Bináris kód (M=2) és három azonosító (N=3) használata esetén 8 (2 ) ágens kódolható egy szintézislépésben. Ha az azonosítókat TI, T2, T3-mal, jelenlétüket vagy hiányukat pedig 0-val ill. 1gyel jelöljük, a 8 ágens az alábbi táblázat szerint reprezentálható:

	1·ágens	2.ágens	3.ágens	4.ágens
T1,T2,T3	0,0,0	1,0,0	0,1,0	1,1,0
	5.ágens	6.ágens	7 . ágens	8.ágens
T1,T2,T3	0,0,1	1,0,1	0,1,1	1,1,1

Több azonosítót használva, még több információ kódolható a szintézisről. Pl. 9 azonosító (N=9) és bináris kód (M=2) esetén 512 (2⁴) tagú ágensválaszték kódolható. Hármas alapú kód (M=3) és három azonosító 27 (3³) ágens kódolását engedi meg. Az előbbi jelöléseket akként kiegészítve, hogy a 0,5 pmól/gyöngy koncentrációban jelenlévő azonosítót 1-gyel, az 1 pmól/gyöngy koncentrációjút pedig 0-val jelöljük, a 27 különböző ágens az alábbiak szerint reprezentálható:

	1.ágens	2 . ágens	3. ágens	4.ágens
T1,T2,T3	0,0,0	1,0,0	2,0,0	0,1,0
	5.ágens	6 . ágens		27.ágens
T1,T2,T3	1,1,0	2,1,0		2,2,2

A gyakorlatban a magasabbrendű kódrendszerek használata esetén célszerű a könyvtár minden egyes tagjához még egy további azonosítót is adni adott (pl. 1 pmól.) mennyiségben mivel ez stnadardként használható fel a többi azonosító mérésénél. Az azonosítók mennyiségét gázkromatográfia ill. HPLC segítségével '··· · J *· határozhatjuk meg, számos detektálási módszert alkalmazva. A HPLC-nél a mennyiségek kényelmesen meghatározhatóak szcintillációs számláló segiségével, amennyiben radioaktivan (pl. triciummal { ³H} ) különböző mértékben jelzett azonosítókat alkalmazunk. Különösen előnyös a meghatározást a ³H - ¹⁴C arány mérésével végrehajtani, a ¹⁴C-t használva standardként. Ekként akár a ³H tízféle mennyisége is megkülönböztethető, így egy tízes alapú -decimális - kódrendszer hozható létre, amelynek segítségével hatalmas mennyiségű információ kódolható, csekély számú azonosító segítségével.

Termékek és módszerek

A találmány szerinti termékek és módszerek legnagyobbrészt szerves molekulák módosítását, részegységek eltávolítását egy vagy több funkciós csoport bépítését ill. eltávolítását gyűrűk nyitását ill. zárását stb. jelentik. A kémiai egységek lehetnek természetesek vagy mesterségesek mint nukleofilok, elektrofilok, diének, alkilező vagy acilezö ágensek, diaminok, nukleotidok, aminosavak, cukrok, lipidek és ezek származékai, szerves monomerek szintonok ill. ezek kombinációi. A szóbajöhető reakciók lehetnek: alkilezés, acilezés, nitrálás, halogénezés, oxidáció, redukció, hidrolízis, szubsztitúció, elimináció, addíció stb. A folyamat végtermékei lehetnek monomerek és oligomerek, roppant kis mennyiségben, a reakciók lefolyását és a termékek összetételét a címkék segítségével lehet meghatározni. A monomerek (nem oligomerek) alatt a szervs molekulák igen változatos körét értjük, ezek lehetnek hterociklusos, aromás, aliciklusos, alifás molekulák, ill. ezek kombinációi, valamint szteroidok, antibiotikumok, enzim inhibitorok, ligandumok, hormonok, drogok, alkaloidok, ·#· opioidok, terpének, porfirinek, toxinok, katalizátorok, valamint kombinációik. Az oligomerek körébe tartoznak az oligopeptidek, oligonukleotidok, oligoszacharidok, polilipidek, poliészterek, polamidok, poliuretánok, polikarbamidok, poliéterek poli-foszfor-származékok mint pl. foszfátok, foszfonátok, foszforamidok, foszfonamidok, foszfitek, foszfinamidok, stb., kéntartalmú polimerek mint pl. szulfonok, szulfonátok, szulfitok, szulfonamidok, szulfénamidok, stb. amelyeknél a fenti (P, S) heteroatomok rendszerint C, Η, N, 0, vagy S atomokhoz kötődnek, ill. a fentiek kombinációi.

A reakciók lehetnek változtatások egy központi molekulatörzs különböző tetszőleges helyein, vagy a molekula egy adott pontján. Pl. egy policiklusos vegyület brómozható számos különböző ponton, de olyan brómozószert is használhatunk, amely specifikus a molekula egy adott helyére, mint pl. az N-brómszukcinimid. A reakciókban általában egy, vagy több, de egymással ekvivalens csport játszik szerepet, mint pl. egy glikol egy vagy két hidroxil-csoportja.

A találmány szerinti módszerek magukban foglalják a a reakciók módosítását, bármelyik lépésben, az ágens-választéktól és a körülményektől függően. így pl. az aminosavak esetében ágensként figyelembe vehető a 20 természetes aminosav, de dolgozhatunk szélesebb választékkal is amely magában foglalja a D-aminosavakat, a nem-alfa aminosavakat, az oldalláncúkon,ill. amino-csoportjukon különböző szubsztituenseket tartalmazó aminosavakat, stb. A nukleinsavak esetében figyelembe vehető a DNS-t ill. RNS-t egyaránt felépítő 4 természetes nukleinsav, de nagyszámú egyéb nukleinsav is. A cukrok es a lipidek igen nagyszámú vegyületböl álló csoportot alkotnak, s ez a szám tovább növelhető különböző szubsztitúciókkal, amelyeknél valamennyi fent említett vegyület felhasználható. Az egyedi szerves vegyületek választéka csak csillagászati számokkal írható le. Ezenfelül a formális (mimetikus) analógok is szóba jöhetnek, pl. karbamidok, uretánok, karbonilmetilén-csoportok stb. beépítése a peptidkötések helyére; a foszfátkötésk helyettesítése különböző szerves vagy szervetlen csoportokkal; nitrogén vagy kén helyettesítése éterkötésü oxigénnel és viszont.

A szintézis stratégiája a végtermék szerkezetétől függően változtatható.így megfontolható a termék lépésnkénti változtatása, de meg is őrizhetök az előző szintézislépések eredményei, előrevetítve a későbbi változtatás lehetőségét. Timikor az egységek azonos vegyületcsaládból kerülnek ki, mint az aminosavak nukleotidok vagy cukrok esetében, aránylag jól megalapozott, bevált szintézis-stratégiák, kémiai eszközök alkalmazhatók. Pl. a nukleotidok esetében a foszforamidit vagy foszfit-csoportok alkalmazhatók; az oligopeptidek esetében alkalmazhatók az Fmoc, Boc, és egyéb szokásos védőcsoportok.A cukrok esetében a stratégia kevésbé szokásos, de nagyszámú, a poliszacharidok szintéziséből ismert védőcsoport, reaktív funkciós csoport, ill. reakciókörülmény áll rendelkezésre. A többi esetben a végtermék szrkezetétöl függően ismert vagy újonnan kifejlesztett eljárások egyaránt alkalmazhatók.

Néha szükséges azonos vagy különböző csoportok bevitele azonos ill. különböző helyre. Pl. egy ismert peptid funkciós egység, pl. fibronektin- kötő egység, egy poliszacharid, pl. Le^x, egy szerves csoport, pl. egy laktam, lakton, benzolgyűrű, olefin, glikol, tioéter, stb. beépítésére a szintézis során. Ekként olyan molekuláris szerkezet építhető ki, amely alkalmas a változások befogadására. Eképp néhány szintézislépéssel nagyszámú végtermék állítható elő, a különböző funkciós csoportoknak megfelelően. Erre különösen akkor van szükség, ha nagyszámú, azonos molekulatörzzsel vagy központi egységgel rendelkező, molekulára van szükség, amelyek valamely érdeklődésre számot tartó tulajdonsággal rendelkeznek. A szintézis-stratégiák kialakításakor lehetőség van a szintézislépések olyan csoportosítására, amely éppen a kívánt néhány terméket eredményezi. Szélsőséges példát véve, egy szintézis során előfordulhat szférikus gátlás, töltés és/vagy dipólus kölcsönhatások, alternatív reakcióutak, stb., s lehetséges a reakciókörülmények optimalizálása, annak érdekében, hogy jó kitermeléssel állítsunk elő olyan vegyületeket, amelyek másként nem, vagy csak alacsony hozammal állíthatók elő. Ekként a kombinatorikus szintézis során változatos reakciókörülményekkel találkozhatunk, beleértve a különböző oldószereket, hőmérsékleteket, reakcióidőket, koncentrációkat stb. A szintézis-csoprtosítás segítségével bizonyos termékekből jóval nagyobb koncentrációk hozhatók létre, mint az egyszerű kombinatorikus szintézissel, s így könnyebben végezhetők el az aktivitási tesztek is.

Kapcsolás és lehasitás

A szintézisek során mindegyik szintézislépésben számos különböző reakció fordulhat elő, amelyek nagyszámú köztiterméket eredményeznek. Habár más technikák is rendelkezésre állnak, a legkényelmesebb a kicsiny meghatározható, szilárd szubsztrátumok alkalmazása, amelyek legtöbbször gyöngyök formájában állnak rendelkezésre. Ezek könnyen keverhetők és elkülöníthetők, s ezért a szekvenciális szintézisek szubsztrátjai lehetnek. E szubsztrátok lehetnek szilárdak, porózusak, deformálhatok ill. merevek és bármely szükséges szerkezetben vagy alakban előfordulhatnak. Néhány esetben hasznosak lehetnek a mágneses vagy fluoreszcens gyöngyök. A gyöngyök mérete legalább 10-2000 mikrométer, általában 20-500 mikrométer, legáltalánosabban 50-250 mikrométer átmérőjű gyöngyökkel találkozhatunk. Hordozórészecskék, ill. gyöngyök céljára bármely kompozíció felhasználható, amely a szintézis során megtartja mechanikai integritását, funkcós csoportokkal rendelkezik, vagy azokkal ellátható aktív vegyületekkel való reakciók segítségével, lehetőség van felületén sorozat-szintézisek végrehajtására, valamint azonosítók felkapcsolására, könnyen összekeverhető, ill. elkülöníthető, és lehetséges róla a címkék, ill. a termékek kényelmes lehasítása. Alkalmazhatók cellulóz, porózusüveg, szilikagél ill. polisztirol , különösképpen divinilbenzollal keresztkötött polisztirol gyöngyök, ojtott kopolimer gyöngyök, mint pl. plietilénglikol/polisztirol, poliakrilamid gyöngyök, latex gyöngyök, dimetilakrilamid, különösen N,N' -bisz-akriloil-etilén-diaminnal keresztkötött poliakrilamid gyöngyök, ill. N-t-butiloxikarbonil-béta -alanilN' -akriloil-hexametilén-diamin gyöngyök, kompozitok, mint pl. keresztkötött polisztirollal, ill.lineáris polisztirolra ojtott fluorozott etilénnel borított üvegrészecskék, stb. A szilárd hordozókkal (részecskékkel) foglalkozó összefoglalók találhatók az alábbi helyeken: Atherton, et. al., Prospectives in Peptide Chemistry, Karger, 101- 117 (1981); Amamath, et al., Chem. Rév. 77: 183- 217 (1977); és Fridkin, The Peptides, Vol . 2, Chapter 3, Academic Press. _r Inc. , (1979) , 333- 363.

A szintézis, ill. a végtermék analízis természetétől függ, hogy melyik hordozótipus lesz a legmegfelelőbb. A gyöngyök ugyan a legkényelmesebbnek tűnnek, de adott esetben az egyéb szilárd hordozók, így a különböző kapillárisok, tűk, pórusos szerkezetek stb. is megfelelőek lehetnek; utóbbi esetben a hordozók méretének változtatásával is befolyásolható a reakcó menete, ill. nyomon követhető annak lefolyása.

A szintézis természetétől függően a hordozók sokféleképpen átalakíthatok (funkcionalizálhatók), azon célból, hogy a kezdő molekularészletet hozzájuk kapcsolhassuk. Ez történhet nem labilis észter-, amid-, amin-, ill. éterkötésen keresztül vagy egy kén-, szilícium, ill. szénatom segítségével, attól függően, hogy le akarjuk-e, és ha igen miként, hasítani a terméket a hordozóról. E célra általában stabil kötéseket alkalmaznak, amelyek a termék felszabadításának céljából hasíthatok (1.Táblázat).Két-, vagy többféle kötés is alkalmazható avégett, hogy a címkék és/vagy termékek különbözőképpen legyenek lehasíthatók.

A hordozón nem mindé esetben van szükség reaktív csoportokra.Ha ugyanis a kapcsoló molekularészlet igen reaktív részleteket tartalmaz (pl. nitrének, karbének stb.),ezek egyes- ill. kettős kötéssel közvetlenül is a gyantához köthetők. Ebben az esetben a kapcsoló molekularészletben kell lennie annak a hasítható kötésnek, amely a termék, ill. a címke feszabadítását biztosítj a.

Amennyiben a végtermék a hordozóhoz kötve marad, kellően hosszú kapcsolókar szükséges ahhoz, hogy a végtermék tesztelése alatt a hordozó ne okozzon sztérikus gátlást vagy egyéb zavart. Különböző kötökomponensek alkalmazhatók, különösen a hidrofób természetűek, mint pl. polietilénoxi, szacharid, poliol, észterek, amidok, ezek kombinációi, stb.

A hordozón lévő funkciós csoportok lehetnek hidroxi-, karboxi-, iminohalogenid-, amino-, tio-, aktív halogén (klór vagy bróm), vagy pszeudohalogén (pl. -CF₃, -CN, stb.), karbonil-, szilil-, tozil-csoport, mezilátok, tozilátok, brozilátok, triflátok stb. A funkciós csoport kiválasztásakor figyelembe kell venni, hogy általában az azonosítók is a hordozóhoz kötődnek. Ha a termék ill. az azonosító kapcsolására két különböző funkciós csoportot használunk, ügyelni kell arra hogy mindkettő kompatibilis legyen a megfelelő kapcsolási ill. lehasítási reakciókkal. Egyazon termékhez is alkalmazható többféle kapcsoló csoport, ekként elérhető, hogy a végtermék csekély mennyiségei szelektíven hasíthatok legyenek. A hordozón védett funkciós csoportok is lehetnek, amelyek a szintézis során felszabadíthatok vagy újra megvédhetök.Pl. az amino-csoport védhető benziloxi-karbonil- csoporttal, a hidroxil-csoport benzil-éterrel stb. akár a peptidszintézisekben.

A végtermék lehasításához számos reaktáns és módszer használható.Az éter (bezhidril-éter. indanil-éter, stb.) jellegű védöcsoportok savas ill. enyhén reduktív körülmények között hasíthatok.Alkalmazható a β-elimináció is, ez esetben enyhe bázissal szabadítjuk fel a kívánt terméket. Az acetálok és tio-analógjaik gyenge savak, különösen karbonil-vegyületek esetében használhatók. Formaldehid, sósav és alkoholok reakciójával oc-klór-éterek keletkeznek. Ezek a gyantán lévő hidroxil csoporthoz kapcsolva acetált adnak. Számos fotolabilis kapcsoló-csoport alkalmazható, mint pl.

ο-nitrobenzil-, 7-nitroindanil-, 2-nitrobenzhidril-éterek vagy -észterek stb. Észtereket, ill. amidokat használva kapcsoló ágensként, a gyantán lévő hidroxil- ill. amino- csoportokhoz való kapcsolás után félészterek ill. -amidok keletkeznek, különösen ciklikus anhidridek esetén. A reakcióban kapcsolószerként jól használható a karbodiimid. Peptidek is használhatók kapcsoló ágensként, ekkor a hasítás enzimatikus hidrolízissel végezhető, különösképpen ha az enzim felismer egy speciális szekvenciát. Karbonátok és karbamátok karbonsavszármazékok, mint pl.foszgén, karbonil- diimidazol, stb. és egy gyenge bázis segítségével állíthatók elő. A kötés hasítható savval, bázissal, vagy erős redukálószerrel, mint pl. LiAlH₄, különösen karbonsavészterek esetében. A hasítható kötések listája megtalálható pl. az alábbi műben: Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd ed. , Wiley, 1991. A különböző rendszrek változatossága igen sok variációt tesz lehetővé a termékek és azonosítók kapcsolása, valamint a végtermékek illl. címkék lehasítása területén.

A következő táblázatban különböző kapcsolóegységek (az I. képletben F²-vel jelölve), ill. lehasításuk módja található.

I.TÁBLÁZAT

Különböző kapcsolóegységek és lehasitásuk módja

Kapcsolóegység	Hasító reagens
szilil	fluorid vagy sav
A	hv
B	Ce(NHJ?(NOrfA
-NCO,(L) *	OH, H*, vagy LiAlH,
C	0^, OsOyiOf, or KMnO,
D	1) O2vagyBr2/ Me0H 2) H.O*
-Si-(L)	oxidáció, cl^ stb.
E	HT0'
F	H^O*
G	F or H*
H x= keto, észter, amid, NO2, szulfid, szulfoxid, szulfon, és más elektronszívó csoportok	bázis, OH
I	H30 vagy redukció (pl. Ll/NH,)
J	(^P),RhCl(H)
K	Li,Mg, or BuLi
M	Hg*2
N x=halogén vagy pszeudohalogén	Zn vagy Mg
0	oxidáció (pl. . pb(0Ac)i vagyHAI0A)
P x=elektronszívó csoport	base

Az (L) jelölés a termék ill. címke kapcsolódási helyét mutatja

L jelöli a címkét vagy terméket, amely közvetlenül, vagy egy megfelelő funkciós csoporttal bíró kapcsolóegységen (pl. C(0)0) keresztül kapcsolódik a jelzett atomhoz.

R jelentése H vagy kis szénatonszámú alkil.

Kapcsolóegységek

A megfelelő kapcsolóegység kiválasztása a szintézis-stratégia része, mivel abból funkciós csoportok maradhatnak vissza a végtermékben. Általában bonyolult, bár lehetséges, a végtermék további módosítása a hordozóról való lehasítás után. Helyesebb, ha a szintézis-stratégiába eleve betervezzük a kapcsolóegység csatlakozási pontján visszamaradó funkciós csoportokat. Ha a végtermék természete lehetővé teszi, olyan hasítási módszerek is használhatók, melyekkel eltávolíthatók e csoportok, pl. egy aril-tioéter- ill. szilil-csoport, fém-hidriddel, ill. savval lehasítva. Az is követhető stratégia, hogy a szükséges funkciós csoporthoz választjuk ki a megfelelő kapcsolóegységet. Néha kívánatos lehet, hogy egy molekulán több, kapcsolásra alkalmas funkciós csoport legyen, ami különböző kapcsolási módszerek alkalmazását teheti szükségessé, s lehetővé válhat szükség esetén különböző lehasítási módszerek alkalmazása is, amelyek párhuzamosan, ill. egymást követően hajthatók végre, pl. fénybesugárzás il. savas hidrolízis.

Különösen érdekesek az azonosítók kapcsolása szempontjából a nitrén ill. karbén csoportok, amelyek a C-H kötéseknél képesek kovalens kötést létrehozni, ill. az olefinkötésekböl ciklopropán (karbén esetében) ill. aziridin (nitrénnél) gyűrűt alakítanak ki.

Számos szubsztituált benzol-származék alakítható ki amely e csoportokat tartalmazza, olyan vegyületekböl amelyek karbének ill. nitrének kialakítására alkalmas funkciós csoportokkal rendelkeznek mint pl.: CHN₂, COCHN₂ , SO₂CHN₂ , ill. N₃, N0₂, NO, SO₂N₃ A karbének diazoalkán származékokból állíthatók elő, fotolízissel, termolízissel, ill. alacsony vegyértékű átmeneti fémeket tartalmazó vegyületekkel {pl. Rh(OAc)₂ } . A nitréneket fotolízissel, vagy termolízissel állíthatjuk elő azidokból, valamint nitro-, nitrozovegyületekböl és azidokból foszforvegyületekkel ill. alacsony vegyértékű átmeneti fémekkel.

Különösen érdekes kapcsolóegységek (F¹ -F²-) a kővetkezők: 2nitro-4-karbobenziloxi-, 2-nitro-4-diazoacetii-benziloxi-, 4vagy 5-azidometil-karbonil-2-metoxi-fenoxi-, 2-metoxi-4- vagy

5-karboxi-fenoxi-csoport.

A következő vegyületek esetében T a címkét, Z a karbén ill. nitrén prekurzort, vagy egy karboxi csoportot jelöl, R jelentése H vagy kis szénatomszámú alkil csoport. Fotokémiai címkelehasítás(pl. kb. 350 nm-es UV sugárzással) esetére pl.: T-3-Z-2-nitrobenzil-éter, T-4-Z-2-nitrobenzil-éter, T-5-Z-2nitrobenzil-éter, Τ-β-Ζ-2-nitrobenzil-éter, T-2-Z-4nitrobenzil-éter, T-3-Z-4-nitrobenzil-éter, T-3-Z-2nitrobenzil-karbonát nitrobenzil-karbonát nitrobenzil-karbonát

T-4-Z-2-nitrobenzil-karbonát, T-5-Z-2T-6-Z-2-nitrobenzil-karbonát, T-2-Z-4 és T-3-Z-4-nitrobenzil-karbonát. Oxidatív hasítás (pl. cérium-ammónium-nitráttal) esetére:1-OT-2-OR-3-Zbenzol, l-OT-2-OR-4-Z-benzol, l-OT-2-OR-5-Z-benzol, 1-OT-2-OR-

6-Z-benzol, l-OT-4-OR-2-Z-benzol, és l-OT-4-OR-3-Z-benzol.

Reduktív ill. alkilezéses hasítás (pl. lítium/ammóniával, ill. metil-jodidddal) esetére: T-(2-Z-fenil)-tioéter, T-(3-Z~ fenil)tioéter, és T-4-Z-(fenil)tioéter. Deszililezéses lehasítás(pl. tetrabutil-ammónium fluoriddal ill. savval) esetére: T-dialkil-(2-Z-fenil)szilil-éter, T-dialkil-(3-Zfenil)szilil-éter, T-dialkil-(4-Z-fenil)-szilil-éter, Tdialkil-(2-Z-fenil)szilán, T-dialkil-(3-Z-fenil)-szilán, és Tdialkil-(4-Z-fenil)-szilán.

Kombinatorikus szintézis

A szintézisek általában 2, legyakrabban 4, de akár 10 választási lehetőséget tartalmazó lépésekből állnak. E lehetőségek száma általában nem haladja meg a százat, de az ötvenet is ritkán. A lépések száma általában legalább 3, gyakrabban legalább 4, gyakorta legalább 5, nem több azonban 30-nál, általában 25-nél sem, előnyösen 20-nál is kevesebb, még előnyösebben 10-nél sem több, gyakorta kb.8.

A számos lépés és választási lehetőség végül számos hasonló vegyületet eredményez, melyek közül általában legalább egy érdeklődésre számot tartó tulajdonsággal bíró vegyület található. Az ismertetett módszerrel lehetséges több mint 25000, általában több mint 50000, előnyösen több mint 200 000, de akár egymillió, vagy több vegyület is előállítható. Ez általában legalább 20 vegyületet jelent, de akár 10⁶ féle molekula is keletkezhet.

Némely szintéziseknél egy szintézislépés mindössze egy ill. két választási lehetőséget tartalmaz, de a lehetőségek száma általában az előállítani kívánt vegyületek számától, és az adott szintézis-stratégiától függ. A legtöbb stratégia esetén a szintézislépések kb. 40%-ánál a választási lehetőségek száma korlátozott, kevesebb mint 5, még gyakrabban 2 ill. 1. Ilyen korlátozás a szekvencális szintézisek mintegy 2 lépésénél, még gyakrabban a lépések mintegy 20-ánál fordulhat elő.

Reakciófolyamat

A szintézis kivitelezését legalább 10³, gyakrabban legalább , előnyösen legalább 10 gyönggyel kezdhetjük el, de általában nem több mint 10¹⁵, méginkább kevesebb mint 1O^{* 10} darabbal. Az első lépés választási lehetőségeitől függően, a gyögyök ennek megfelelő számú tartályba oszthatók. E célra használhatók mikrotitráló lapok, különálló tartályok, oszlopok, gélek, Terasaki lapok, lombikok, Merrifield-féle szintézisedények stb. A részecskéket (gyöngyöket) általában csoportokba osztjuk, legalább mindegyikbe egy darabot, de általában egy csomót kb. 1000, de akár 10⁵ darabot is, attól függően hány részecske, ill. választási lehetőség van az adott szintézislépésben.

Ezután mindegyik tartályhoz a megfelelő ágenst adjuk, valamint az azonosítót ami kódolja a reagenst ill. a reakciólépést.

Minden lépésben lejátszódik a kívánt reakció. Ennek befejeződése után a gyöngyöket tisztára mossuk a reagenstől, valamennyit összekeverjük, s a következő lépés választási lehetőségeinek megfelelő számú csoportba osztjuk. E folyamatot (gyöngy-szétosztás, reakciólépés, rekombinálás s. í. t.) iteráljuk a kombinatorikus szintézis befejezéséig.

Néha ugyanazt a reakciót két- vagy több konténerben játszatjuk le párhuzamosan, hogy megnöveljük bizonyos termékek arányát a többihez képest. Máskor a folyamatot bizonyos csoportoknál adott lépéseknél megszakítjuk, így növelve a végtermék változatosságát. Más esetekben különböző szintézisutakat rendezhetünk csoportokba.

A szintézis történetének rögzítése, ill. kódolása céljából az egyik megoldás szerint C vagy C¹ ill.mindkettő jelen lehet a gyöngyökön, kapcsol C későbbi felkapcsaolása azonban kizárja C¹ jelenlétét. A gyöngyök minden szintézislépésben megjelölhetők az adott lépésre, ill. választási lehetőségre egyedileg jellemző azonosítóval. Más megoldás szerint, egyetlen címke használható a szintézis történetének rögzítésére ill. kódolására. Az alkalmazott kémiai reakcióktól függően a címkézés végbemehet a föreakció előtt, azzal párhuzamosan, ill. utána is. A reakció során bármikor mintát vehetünk a gyöngyökből és lehasítás után ellenőrizhetjük, hogy a megfelelő címke kapcsolódott-e a gyöngyhöz.

Mint fentebb említettük, néhány esetben a részecskék egy része alcsportokba különíthető el, amelyek mindegyike ezután különböző reakciósorozatokba vihető. További reakciók céljából az ilyen alcsoportok bármikor ismét összekeverhetők. Pl. ha egy reakciólépésben beépítünk egy telítetlen kötést, a következő lépés előtt a mintát kettéosztva az egyik része telíthető, a másikból pedig epoxid képezhető. Ezután a két részlet etérő reakcióutakon reagáltatható tovább.

A szintézis befejezése után a végtermék a kívánt tulajdonságra nézve vizsgálható, akár úgy, hogy a ligandumot lehasitjuk a gyöngyről, akár úgy, hogy rajtahagyjuk azon. Az utóbbi esetben a gyöngyök pl. inkubálhatók monoklonális egér Y antitestekkel, vizes pufferrben. Az inkubáció és mosás után a gyöngyöket alkálikus foszfatázzal konjugált nyúl (ill. kecske) poliklonális antitestekkel inkubáljuk, amelyek az egér antitestek ellen irányulnak. Fluoreszcens csapadékot adó reagenst használva, a fluoreszkáló gyöngyök, amelyekhez monoklonális antitest kötődött, manuálisan elválaszthatók a többi (jóval nagyobb mennyiségű) sötét gyöngytől.Egy másik eljárás szerint a gyöngyök egy fluoreszcencia-érzékeny sejtválogatóval is szétválogathatok, s a címkék ezen folyamat alatt is rajtuk maradnak.Ezután legalább néhány címkét minden kiválasztott gyöngyről lehasítunk.

Azon esetekben, amelyeknéla szintézis nem hasonló egységek lépésenként! összekapcsolásából áll, vagy ahol melléktermékek is képződnek a reakcióban, előfordulhat, hogy egyetlen gyöngyön nagyszámú vegyület található, és az is, hogy az is, hogy az aktív vegyület szerkezete nem határozható meg a reakció történetéből. A találmány szerinti eljárással a reakció történetének ismeretében a szintézis nagyobb méretekben reprodukálható, igy megfelelő mennyiségű termék(ek) nyerhető(k), izolálhatok, és így meghatározható az aktív vegyületek szerkezete.

A tárgyalt módszer számos különböző reakciósorozattal illusztrálható. Pl. barbiturátokat a kővetkezőképpen lehet előállítani:

-Egy aldehidet ill.ketont egy acetát-észterrel reagáltatunk a Claisen-kondenzáció körülményei között, így szubsztituálatlan, vagy akár négyszeresen helyettesített krotonátokat kaphatunk. -A kapott krotonát ezután egy második acetáttal reagáltatható, a Michael-addíció körülményei között, így akár hatszorosan szubsztituált glutarátok nyerhetők.

-Ez utóbbiakat ammóniával, monoszubsztituált aminokkal összehozva állíthatók elő a különféle barbiturátok, az aldehidek ill. ketonok, acetátok ill.aminok szerkezetétől függően igen nagy változatosságban. Ha a szubsztituenseken amino-, karboxi-, hidroxi-, tiol-, stb. funkciós csoportok vannak jelen, ezeket védeni ill. módosítani kell.

Egy másik példa szerint {Bunin és Ellman, JACS, 114, 10997 (1992)}, benzodiazepinek állíthatók elő. A szintézis kezdetén különböző amino-védett, szubsztituált 2-amino-benzofenonokat kapcsolnak az egyes részecskékhez, pl. egy 4'-hidroxi csoporton keresztül. Ezután a különböző reakció-edényekben elhelyezett részecske-csoportokhoz különböző Fmoc-védett természetes ill. mesterséges α-aminosavakat adnak, peptidkötés kialakítására alkalmas reakciókörülmények között. A védöcsoportok lehasítása után belső ciklizáció következik be, ezt a nitrogénatomon alkilezö ágens segítségével végrehajtott alkilezés követi. Mindössze három reakciólépésben igen nagyszámú benzodiazepin állítható elő, ezután e könyvtárak trankvilláns vagy egyéb aktivitásra vizsgálhatók.

A fenti módszerekkel gyógyszeranalógok széles választéka állítható elő, vérnyomáscsökkentő szerek pl. enalapril; bétblokkolók pl. propanolol; fekélyellenes gyógyszerek (H₂ receptor antagonisták), pl. cimetidin és ranitidin; gombaölö szerek (koleszterol-demetiláz inhibitorok), pl. izokonazol; szorongásellenes szerek, pl. diazepám; analgetikumok, pl. aszpirin, fenacetamid és fentanil; antibiotikumok, pl. vancomicin, penicillin és cefalosporin; gyulladásgátlók, pl. kortizon; fogamzásgátlók, pl. progesztinek; vetélést okozó szerek, pl. RU-456; antihisztaminok pl.klórfenamin;köhögés elleni szerek pl. kodein; nyugtatok pl. barbitol. stb.

Pl. cimetidin analógok szintézisében szerepelhetnek hidroximetil szubsztituált hisztidinek és más heterociklusok ahol a többi szén- ill.nitrogénatomok lehetnek tovább szubsztituáltak ill. szubsztituálatlanok, α-ω-alkil-tiolok, és szubsztituált tioamidin észterek, ahol a nitrogénen különböző csoportok lehetnek, mint pl. nitro-, ciano-, hidroxi-, alkil-, ezek kombinációi stb.

Azonosítók

A találmány szerinti azonosítók az (I) képlettel írhatók le:

F^-C-E-C' (I) ahol F^r-F² jelentése olyan kapcsolóegység, amely lehetővé teszi a címkének a hordozóra való rákapcsolását, ill. lehasítását;

C-E-C' pedig a jelzésre alkalmas megkülönböztethető címkét jelöli;

E a címke olyan komponense,amely lehetővé teszi: (a) a detektálást, pl. egy elektrofór csoport amely gázkromatográfiával, ill. tömegspektroszkópiával analizálható, vagy (b) detektálás ill. elkülönítés szempontjából is figyelembe vehetők;

C és C' olyan címke komponensek amelyek alkalmasak arra, hogy egyedileg megkülönböztessenek egy címkét bármely más címkétől, alkalmasak elkülönítésre is, eltérő lánchosszuk ill.

szubsztitúciójuk miatt, hiszen ez különböző kromatográfiás retenciós idővel ill. tömegspektroszkópiás m/e aránnyal jár.

F egy kapcsolóegység, amely szelektíven hasítható a címke felszabadítására; és F¹ olyan funkciós csoport amely a hordozóhoz kapcsolódást biztosítja; vagy F egy kötés, ha F lehasítható csoport, pl. OH vagy karboxi.

Míg az [i) képletű azonosítókat mindig a kombinatorikus szintézis megfelelő lépésénél adjuk az elegyhez, addig az E komponens a szintézis végén, akár az - előnyösen fotokémiai vagy oxidatív -szubsztrátról való lehasítás előtt vagy után is adható. Pl. ha C OH, NHR⁴, ill. SH funkciót tartalmaz, E a lehasítás előtt kapcsolható C-hez. Más esetben, ha E-t a lehasítás után kapcsoljuk, a kapcsolódási pont azonos lehet F² kapcsolási helyével. Erre mutat be példát az alábbi reakcióvázlat:

N(CB₃ )₂ ahol: S= szubsztrát és n= 1-40

Az azonosítónak a szubsztráthoz kapcsolását az alábbi vázlat mutatj a be:

F^L-F²-C-E-C' + S--------> S-F¹' -F²-C-E-C' ahol F¹' -F²-C-E-C' jelenti szubsztráthoz kötött azonosítót. Pl. ha a hordozón amino-etil funkciós csoportok vannak, és F‘ ·♦·· jelentése COOH-csoport, akkor F¹' jelentése -C(0)-; ha a hordozó telítetlen kötést tartalmaz, és F‘ jelentése N₂CH-C(O)-, ekkor

F^l' jelentése =CH-C(O)- vagy -CH₂-C(O)-.

Az (l\ képletű azonosítók közül különösen az(la) képletnek fontosak:

ahol

F^:-F²-{ C(E-C' )_a} _b (la]

F^L jelentése: Co2h, CH2X, nr’r¹ , C(O)R¹, OH, CHN2,

S(O₂)C1, S(O₂)CHN₂, n₃, no₂, NO, S(O₂)N₃, NCO, vagy NCS;

F jelentése pedig: _

SH, C(O)CHN₂,

OC(O)X, C(O)X,

— Si(R^l)2A— . —SUE¹ )2—

A— — XC(O)O—

--CR=CIt— (CR₂)₂--, —CB¹⁼= CR^!---CíR¹)-—, — C(r’)₂----CR¹==CR¹—·' ^C(E)2^A ’ ° ^{ClR )jA}

— CR¹⁼=C R— C (R^l A—

,—ft— (CRjJjA— _

·♦ ···· ••''Λ * · · » • · · ···· ζ χ ·· ·♦» — S—CÍR*), λ— · —CCXJE-—C(R*)- A— — C(OE)Jf---C(R¹)₂A— . —C(OH)R —C(Cű₂X)R —

·· ···· ····

A jelentése -O, -OC(O)-, vagy -NHC(O)-;

C jelentése kötés, C₁-C₂₀ alkilén, amely szubsztituálva lehet 140 F, Cl, Br, C^Cg alkoxi-, NR⁴R⁴, OR⁴, vagy NR⁴, ill.

-{[ C (R⁴) 2] m-Y-Z-Y-[ C (R⁴) 2] _nY~Z-Y} p— csoporttal, azzal a feltétellel, hogy a szénatomok száma C+C'-ben előnyösen 20;

C'jelentése H; F; Cl; C₁-C₂₀ alkilén, amely szubsztituálva lehet 1-40 F, Cl, Br, C_L-C₆ alkoxi-, NR⁴R⁴, OR⁴, vagy NR⁴, ill.

-{[ C(R⁴)2] m-Y-Z-Y-[ C(R⁴)2] _nY-Z-Y} _p- csoport;

E jelentése Ei C₁₀ alkii amely 1-20 F, Cl, vagy Br atommal van szubsztituálva; vagy Q-aril csoport, amelynek aril csoportja 17 F, Cl, NO₂, SO₂R⁵ vagy 1-5 F,C1, NO₂, S0₂R⁵-csoporttal helyettesített fenil-csoporttal van szubsztituálva;

R¹ jelentése H vagy Ο_:-Ο₆ alkil-csoport;

R³ jelentése C=O, C(O)O, CÍOJNR¹, S, SO, vagy SO₂;

R jelentése H vagy C₁-C₆-alkil-csoport;

R⁵ jelentése C₁-C₆-alkil-csoport;

a jelentése 1-5;

b jelentése 1-3;

m és n jelentése egyaránt 0-20;

p jelentése 1-7;

Q jelentése kötés, 0, S, NR₄, C=O, -C(O)NR^S, -NR⁵C(O)-, -C(0)0vagy -OC(O)-;

X jelentése távozó csoport, mint pl. Br, Cl, tiflát, mezilát, tozilát, vagy OC(O)OR⁵;

Y jelentése kötés, 0, S, vagy NR⁴;

Z jelentése kötés; fenil-csoport, amely szubsztituálva lehet

1-4 F, Cl, Br, C^C^-alkil-csoport , amely 1-13 F vagy Cl atommal lehet szubsztituálva, C₁-C₆ alkoxi-csoport amely 1-13 F, Cl, vagy Br atommal lehet szubsztituálva; [ C (R ) ₂] i-₂o< vagy (CF₂) ^20, azal a feltétellel, hogy amikor Z jelentése kötés a szomszédos Y' csoportok közül egy szintén kötést jelent; és aril jelentése mono- vagy biciklusos legfeljebb 10 szénatomos aromás gyűrű, amely 1 vagy 20, S, ill. N atomot tartalmazhat. Az la. képletben lévő F* definíciója szerint a baloldali kötés az F^L-hez kapcsolódik.

Az ^Iaz j. képlet azonosítóként:

szerinti vegyületek szintén jól használhatók FL-[C(E-C')Jb (la')

ahol: F¹ jelentése OH vagy COOH; a többi szimbólum jelentése azonos az (la\ képletbélivel.

Az (ia^ képletű vegyületek közül azok előnyösek, amelyekben F j elentése:

CO,H_r OH, CHN_2i C(O)CHK₂, C(O)X, NCS.

vagy

CH-X:

C és C' jelentése egymástól függetlenül szubsztituálatlan, vagy 1-40 F vagy Cl ill. [ 0-(CH₂) ₂_-.] _p csoporttal szubsztituált C,-C₂₀ alkil-csoport.

E jelentése 1-20 F vagy Cl atommal szubsztituált alkilcsoport; Q-aril-csoport, ahol aril jelentése 1-7 F vagy Cl atommal szubsztituált biciklusos aromás gyűrű; vagy 1-5 F, Cl, NO₂, vagy SO₂R₅ csoporttal szubsztituált Q-fenil-csoport; és

Q jelentése kötés, 0, -NR⁵C(0)-, vagy -OC (0)-csoport.

Az ^Ia)képletű vegyületek közűi előnyösek, amelyekben ^-C(E-C')_d jelentése - (CH₂) ₃.₁₅-(CF₂)₁_i₅F,

- (C^H ₂) ₃.₁₅- (CCi₂) „jCl, - (CH₂CH₂-O) ,._S-Ar,

- (CH₂CH₂CH₂O) _V5-Ar, _vagy - (CH₂),. ₁₂-O-Ar ;

ahol Ar jelentése pentafluor-, pentaklór-, vagy pentabrómfenil, ill. 2,3,5,6-tetrafluor-4(2,3,4,5,6-pentafluor-fenil)fenil-, 2,4,6-triklórfenil-, 2,4,5-triklórfenil-, 2,6-diklór-4fluor-fenil-, vagy 2,3,5,6-tetrafluor-fenil-csoport.

Az la. képlet szerinti további előnyös vegyületeket az alábbi képletek mutatják be:

~í^Cr2)l-LS^r > VAGY

ahol Ar jelentése pentafluor-, pentaklór-, vagy pentabrómfenil, 2,3,5,6-tetrafluor-4(2,3,4,5,β-pentafluor-fenil)-fenil2,4,6-triklórfenil-, 2, 4,5-triklórfenil-, 2,6-diklór-4-fluorfenil-, vagy 2, 3,5, 6-tetrafluor-fenil-csoport.

További előnyős la. képletű vegyületek, amelyekben E-C' jelentése H, OH, vagy NH₂. Az ilyen vegyületek igen hasznosak a kombinatorikus szintézis végén, különösen fluoreszcenciával ill. elektronbefogással detektálható R csoport, mint pl. benzil-klorid, ill. poli-halo-benzoil-haloid esetében.

Az I. képletű vegyületek az alábbi reakcióvázlatok szerint, ill. egyéb ismert módszerekei állíthatók elő:

1.REAKCIÓVÁZLAT

Azonosító címke előállítása

X

X

X

OH

X

X

ELEKTROFÓR FENOL, ArOH

X= Cl VAGY F

2.REAKCIÓVÁZLAT

Azonosítók fotolitikusan lehasítható kapcsolóegységekkel

ΗΟ

Al 0

3. REAKCIÓVÁZLAT

Azonosítók oxidációval lehasítható kapcsolóegységekkel

TOLUOL

1· LiOH, THF/VÍZ

REFLUX

2. SOCLj.

TOLUOL REFLUX

Ar

4.REAKCIÓVÁZLAT

Azonosítók egyéb oxidációval lehasítható kapcsolóegységekkel

pph_T deadjoluol ^Al *

1. KMnO_d, ACETON/VÍZ _______—-----------►

2. OXALOIL-KLORID kát. DMF, CH₂C1₂

5.REAKCIÓVÁZLAT

E-C' címkék

1. BH_T THF

2. C5_:C0₃. Br(CH₂)_nCH₃

6. REAKCIÓVÁZLAT

Azonosítók fotolitikusan lehasítható kapcsolóegységekkel

E-C'

CÍMKE

L. C0CL₂, toluol

F

F

7.REAKCIÓVÁZLAT

Azonosítók oxidációval lehasítható kapcsolóegységekkel

Et₂O/CH₂Cl₂

Az azonosítók egy vagy több azonos címkét tartalmazhatnak. Az azonosítók különböző vegyületek lehetnek, amelyek egymástól megkülönböztethetők, és egyértelműen meghatározzák az egyes reakciólépéseket, ill. az azokon belüli választási lehetőségeket. Ekként igen nagy kombinatorikus könyvtárak állíthatók elő viszonylag csekély számú azonosító, és kevesebb mint 50 címke segítségével.

Valamennyi reakciólépés során azonosítók kombinációi alkalmazhatók, amelyek meghatározzák az adott lépést ill. azon belüli választást. Minden azonosító kovalens vagy nemkovalens módon kötve lehet a hordozóhoz ill. a termékhez, de inkább a hordozóhoz. Az azonosítók kombinációi teszik lehetővé a bináris ill. egyéb kódok alkalmazását amelyek segítségével a reakciólépés ill. a választási lépés meghatározható. A kombináció egy vagy akár 0 azonosítóból is állhat.

Címkék

A (C-E-C' ) képletű címkéket eddig az alábbiakkal jellemeztük: a hordozóról az F₂ minőségétől függően, előnyösen fotolízissel vagy oxidációval hasíthatok le; egyedileg megkülönböztethetők, Általában elkülöníthetők; a szintézis reakciókörülményei között stabilisak; a reakciólépést, ill. a választott ágenst egyaránt egyértelműen kódolják; a különböző címkék egyszerűen, bonyolult technikai eszközök használata nélkül azonosíthatók; viszonylag gazdaságosnak kell lenniük, és aránylag kevés molekulának is erős jelet kell szolgáltatnia; megfelelő érzékenységgel elválaszthatóaknak kell lenniük a meghatározásuk során jelenlévő egyéb komponensektől.

A címkék szerkezetileg lehetnek rokonságban, vagy eltérőek is, mint pl. homológ sorozatok, ismétlődő funkciós csoportok, a periódusos rendszer rokon elemei, különböző izotópok ezek kombinációi, stb. A címkék használhatók mint egy bináris kód elemei, így egy címke két lehetőséget kódolhat, 2 címke 4-et, 3 címke 8-at, 5 címke 32-t, s.í. t. így a szintézis minden reakciólépésében viszonylag csekély számú címke sokkal nagyobb számú választási lehetőséget jelölhet. Az azonosítókat tartalmazó címkék akár más reakciólépésekhez is kapcsolódhatnak. A kombinatorikus szitézisek minden címkéjének megkülönböztethetőnek kell lennie minden más címkétől.

Eképpen igen nagy kombinatorikus könyvtárak szintetizálhatok viszonylag csekély számú címkével, általában kevesebb mint 60, még általánosabban kevesebb mint 50 darabbal.

Általában mindegyik gyöngyre legalább 0.01 fentomól, még általánosabban 0.001-50 pikomól kell hogy jusson mindegyik címkéből, bár különleges körülmények között nagyobb vagy kisebb mennyiségek is alkakmazhatók. A végtermék mennyisége szintén legalább ebben a nagyságrendben mozog, a kapott 10⁴ féle molekula mennyisége általában legalább 0.01 pmól., még általánosabban legalább 1.0 pmól., s rendszerint nem több mint 10 nmól. A gyöngyök, a reakciólépések, ill. az azokon belüli választási lehetőségek számától függően, a végtermékek száma altalaban 10 , meg általánosabban 10 , de elerheti akár a 10 8 4 8 et is, általában nem több mint 10 , előnyösen 10 -10 , még

8 általánosabban 10 -10 nagyságrendben mozog.

A címkék legnagyobbrészt szerves molekulák. Mindegyik címke általában kevesebb mint 100 atomot, még általánosabban kevesebb mint 80 atomot, általában kevesebb mint 60 hidrogéntől különböző atomot tartalmaz, kivéve a kapcsolóegységet, amely nem marad a címkén a hordozóról való lehasítás után. A kapcsolóegység bármilyen méretű lehet, általában kevesebb mint 30 atomot, még általánosabban kevesebb mint 20 hidrogéntől különböző atomot tartalmaz. A kapcsolóegység mérete nem kritikus, alapjában kényelmi kérdés. A címkék tartozhatnak hasonló szerkezetű vegyületekböl álló vegyületcsaládokba, de lehetnek különböző természetű vegyületek is mint pl. alifás, aliciklusos, aromás, heterociklusos vegyületek ill. ezek kombinációi. Megkülönböztető jegy lehet az ismétlődő egységek száma, pl. a metilén-csoportoké egy alkil-csoportban, az alkilénoxi-egységeké egy polietilén-oxi szerkezeti részletben, a halogénatomoké egy polihalogénezett vegyületben, ill. aés/vagy β-szubsztituált etilénekben ahol a szubsztituensek lehetnek: alkil-csoportok, oxi-, karboxi-, amino-, halogén- és hasonló csoportok, ill. izotópok, stb.

Címke analízis

A címkék lehasítása a hordozóról különböző módszerekkel, így pl. oxidativ, termolitikus, hidrolitikus, ill. fotolitikus körülmények között történhet, az F csoport természetétől függően; pl. egy katekol-éter esetében cérim-ammónium-nitráttal történő oxidációval, egy nitrobenzil-étrer, -észter, ill. -amid esetében fotolízissel vagy egyéb módszerekkel, amint ez az 1. táblázatban látható.

« *

A címkék fizikai tulajdonságaik alapján is megkülönböztethetők, pl. a molekulatömeg ill. a gáz- vagy folyadék-kromatográfiás retenciós idő alapján. A helyzetizomerek retenciós ideje is különböző. Ha a helyzetizomerek ill.sztereoizomerek nem alkalmasak az elkülönítésre, akkor különböző számú szubsztituens alkalmazható, mint pl. halogének (pl. fluor), metil-, hiroxi-csoportok, vagy egyéb oldalláncok, amelyek különböző számú (pl. metilén-, ill. etilénoxi ) egységből álló láncokhoz kapcsolódnak biztosítva ezzel a kívánt szeparációs lehetőséget. A radioizotópok aránya is felhasználható, különösen, ha ezek sugárzása különböző, mint pl. a ¹⁴C és a ³H esetében. A fizikai különbségek, különösen a tömegszám, információt szolgáltathatnak a reakciólépésröl, ill. az azon belüli választásról.

A C/ H arany helyett nem radioaktív ízotópkeverek is felhasználható,mint pl. -CH_mD_n, ahol m értéke 0-3, és n = 3-n. Pl. tömegspektroszkópiával detektálva akár 4 különböző metilcsoport meglétét, nagyszámú választási lépés határozható meg.

Ha E jelentése kötés, C' jelentése pedig H, a hordozóról való lehasításkor nyert címkék egy aktív funkciós csoportot tartalmaznak, amely lehetővé teszi, hogy detektálható jelző reagens kapcsolódhasson a címkéhez. Ez a funkciós csoport lehet pl. kettőskötés, különösen aktivált kettőskötés, hidroxi-, tio, amino-, karboxi-csoport stb. Ezután a címkét a jelző reagens feleslegével reagáltatják, hogy a megfelelő E-C terméket nyerjék analízis céljára. Ekként olyan jelző reagensek széles választéka is felhasználható az azonosító rendszer részeként, amelyek nem volnának kompatibilisek a végtermékre vonatkozó szintézis-stratégiával. Ilyen jelző reagensek lehetnek pl. a halogénezett aromás vegyületek (pl. perfluor-benzil-bromid), fluoreszkáló csoportok (pl. danzil-klorid), radioizotópok, kemolumineszcens vegyületek, stb.

Nyilvánvaló, hogy a bemutatott példa-címkéken és reakciókon kívül nagyszámú egyéb kombináció is felhasználható.

A címkék kémiai és fizikai tulajdonságaitól függően választható ki a megfelelő elválasztási módszer, ami lehet valamilyen kromatográfia, pl. gáz- (GC), folyadék- (LC), különösen nagynyomású folyadék- (HPLC), ill. vékonyréteg-kromatográfia, elektroforézis, stb. Kromatográfia helyett tömegspektrometria is alkalmazható a tömegszám szerinti elválasztásra. A különböző elválasztási módszerek különböző címke-típusokhoz használhatók, pl. gázkromatográfia: kémiailag inért különböző molekulatömegű szerves molekulák, mint pl. alkánok, alkének, arének, halogénezett szénhidrogének, éterek, alkoholok, szilánok, tioéterek, stb., különösen halogénezett vegyületek, amelyek más funkciós csoportokat is tartalmazhatnak, és elektronbefogásos módszerrel, ill. GC-MS módszerrel detektálhatok; kapilláris GCvel kombinált atom-emissziós detektálás: a szokásos szerves vegyületekben ritkábban található elemeket ( mint pl. Sn, Ge ) tartalmazó vegyületek; LC, HPLC ill. TLC: a gázkromatográfiával azonos vegyülettípusok, célszerűen lineáris éterek, ill. radioizotópokkal vagy ezek kombinációval szubsztituált, radioassay típusú detektálásra alkalmas szénhidrogének, ill. elválasztás utáni fluoreszcens detektálásra alkalmas csoportokkal szubsztituált szénhidrogének esetében;

elektroforézis: a fenti vegyületek, különösen elektromosan töltött funkciós csoportokkal mint pl. kationos ill. anionos különösen szerves ill. szervetlen savcsoportokkal szubsztituált vegyületek, ahol a molekula tovább lehet módosítva a detektálást lehetővé tevő radiaktív ill. fluoreszcens csoporttal;

tömegspektroszkópia: a fenti molekulák, különösen a különböző izotópok miatt különböző tömegszámú csoportok, különböző számú azonos funkciós csoportot, ill. különböző funkciós csoportokat tartalmazó csoportok, homológ sorozatok különböző tagjai, ill. ezek kombinációi esetében.

A címkék egymástól való elkülönítése egyedi technikákat, ill. ezek kombinációit igényli, mint pl. kromatográfia és elektroforézis; gázkromatográfia és tömegspektroszkópia; stb.

A találmány szerinti címkék tulajdonságainak lehetővé kell tenniük az igen alcsony, általában nem nagyobb mint nanomólos, előnyösen pikomólos vagy kisebb, még előnyösebben fentomólos vagy kisebb koncentrációban történő detektálást, más akár sokkal nagyobb koncentrációban jelenlévő vegyületek mellett is. Ennek érdekében különléges atomokkal való helyettesítés is felhasználható az alábbiak szerint:

(a) szubsztitúció elektronegatív elemekkel, mint pl. fluor vagy klór, elektronbefogasos detektáláshoz, kapilláris gázkromatográfiával vagy negatív-ion tömegspektoszkópiával összekapcsolva;

(b) szubsztitúció egy nem közönséges elemmel (C, H, és 0 kivételével), atomemissziós detektáláshoz kapilláris gázkromatográfiával összekapcsolva;

(c) szubsztitúcó több különböző nem közönséges elemmel, atomemissziós detektáláshoz az elemek közötti arány meghatározásával;

(d) szubsztitúció radioaktív elemekkel, mint pl. ³H, autoradiográfiás detektáláshoz ill. szcintillációs számláláshoz, LC-vel, TLC-vel, ill. elektroforézissel kombinálva;

(e) szubsztituált nagyszámú különböző sugárzást kibocsátó elemmel, mint pl. ³H és ¹⁴C autoradiográfiás detektáláshoz ill. szcintillációs számláláshoz, a különböző radioaktív elemek arányának meghatározásával.

Egy elemes szubsztitúció esetén (1. a fenti a., b., ill. c. példát), A darab címke elkülöníthető keverékének segítségével, melyeknek jelenléte vagy hiánya detektálható, akár 2^A darab különböző szintézis kódolható. A sok-elemes szubsztitúció esetében (1. a fenti c. ill. e. példát), A darab címke elkülöníthető keverékének segítségével, amelyeknek mindegyike B darab megkülönböztethető egységet tartalmaz (pl. különböző ³H/¹⁴C arányú ill. Si/Sn arányú részegységeket) pedig akár B^A darab különböző szintézis is kódolható.

Számos izotóp ismeretes melyeknek jelenléte vagy hiánya információt szolgáltathat a szintézislépésröl ill. az azon belüli választásról. Az izotópok lehetnek radioaktívak vagy nem radioaktívak. Különösen érdekes izotópok a deutérium, trícium, ¹⁴C, ³²P, ¹³¹I, stb.

Az izotópkeverékek felhasználásával az egy címkéből nyerhető információk menyisége jelentősen megnövelhető az izotópok puszta jelenlétét detektáló rendszerekhez képest. Pl.

•»·· <··ί» előállítható különböző hidrogén/deutérium arányú komponenseket tartalmazó keverék, ahol ezen arányok közti különbség akár csak 10%. A hidrogént egy másik atommal, pl. fluorral helyettesítve, hidrogént, deutériumot, ill. fluort tartalmazó, nagyszámú különböző megkülönböztethető címke keverékét kaphatjuk.

További felhasználható csoportok lehetnek az aromás gyűrűk, amelyek különböző helyeken és különböző funkciós csoportokkal lehetnek szubsztituáltak. így pl. különböző helyeken különböző szubsztituenseket tartalmazó benzol-gyűrűk segítségével nagyszámú megkülönböztethető molekula nyerhető, amelyek a reakciólépésekre, ill. a választékra vonatkozó információkat hordozhatnak. így pl., ha C konstans, a címke detektálható, ill. megkülönböztethető E szubsztitúciójának segítségével, ahol E polihalogénezett aromás gyűrűt jelent.

Fluoreszcens címkék felhasználására is megvan a lehetőség. Ezek egyedül nem alkalmasak számos választási lehetőséggel rendelkező reakciólépések meghatározására, de a fentiek szerint C vagy C' variálásán keresztül megvan a lehetőség a különböző fluoreszcens címkék egyéni észlelésére különböző fluoreszcenciájuk segítségével.

Egy adott hordozóhoz kapcsolt címkék lehasíthatók és elkülöníthetők, így a címkék egyedileg detektálhatok. A címkék elkülönítése után mindegyik saját funkciós csoportjai ill megkülönböztethető tulajdonságai alapján analizálható.

Különböző technikák használhatók az egyes címkék detektálására, mint pl. autoradiográfia, szintillációs számlálás, elektronbefogás, negatív- vagy pozitív-ion tömegspektroszkópia, «· »··· ·*·* * • · » ♦ «· · «» » ·« · «·· « « ·«·· infravörös-, ultraibolya-, ill. elektronspin-rezonanciaspektroszkópia, fluoreszcencia, stb.

Vizsgálati módszerek

A végtermék számunkra érdekes tulajdonságainak meghatározására számos módszer és technika alkalmazható.

Akár az egyedi gyöngyökre, akár azok keverékére nézve meghatározható, hogy mutat(nak)-e aktivitást. A keverékek 10, 100, 1000, vagy több gyöngyöt is tartalmazhatnak. Ekként vegyületekek nagy csoportja átvizsgálható és gyorsan kisebb csoportokra osztható.

Használható technika pl. egy adott biomolekulához, pl. egy receptorhoz való kötődés vizsgálata. A receptor lehet egyszerű molekula, de kötődhet mikroszómához, ill. sejthez is stb. Ha az agonista aktivitás a vizsgálat tárgya, intakt szervezeteket ill. sejteket célszerű használni, és a termék kötődésére adott választ mérni. Néha elegendő a végtermék lehasítása a gyöngyről, különösen ha jelátvitellel kapcsolatos fiziológiai tulajdonságokat vizsgálunk. Különböző berendezések használhatók a sejtválasz mérésére, mint pl. a Molecular Devices (Redwood City, CA) által forgalmazott mikrofiziométer. Ha a kötődést vizsgáljuk, jelzett receptorok is használhatók, ahol a jelző lehet fluoreszcens csoport, enzim, radioizotóp, stb., s így a receptor hordozóhoz kötődése detektálható. Másrészt jelzett antitest is köthető a receptorhoz, így a jel felerősíthető, s elkerülhető a receptor megváltozása, ami megváltoztathatja a receptornak a végtermékhez való kötődését. A kötődés egy a • · »··ν *···· • · · * ·· • · · · ♦ · ·9 ···· · ···» receptorhoz kötődő ligandum jelzett ligandumra való cserélésével is meghatározható.

Bizonyos esetekben kétlépéses vizsgálat is alkalmazható, egy kötődési elővizsgálat, és egy ezt követő élő sejttel végzett biológiai teszt. Rekombináns technika alkalmazásával a sejtek biológiai képességei nagymértékben megváltoztathatóak. így exogén gének, ill. exogén regulációs rendszerek hozhatók létre, s így a felületi membránfehérjéhez kötődés észlelhető jelet, tkp. intracelluláris szignált hoz létre. Pl. a sejtbe bevihető egy leukofesték, amelyet egy a sejtben lévő enzim színes termékké, különösen fluoreszcens termékké konvertálhat. Az enzim a felületi membránhoz való megfelelő kötődés esetében fejeződik ki, mint pl. a β-galaktozidáz és a digalaktozilfluoreszcein. Eképp bizonyos sejtet ill. sejteket összekapcsolva egy adott részecskével, a sejt fluoreszcens tulajdonságait FACS berendezéssel meghatározva, az aktív vegyületekeket hordozó részecskék azonosíthatók. Különböző technikák alkalmazhatók abból a célból, hogy a részecske és a sejt között még akkor is fennmaradjon a kötés, amikor a termék már lehasadt a részecskéről. így pl. antitestek köthetők a részecskék felületére a sejtfelületi membránproteinekhez való kötődés céljából, pl. a sejtfelületen lévő avidinhez a részecskén lévő biotin kapcsolható, stb.

A vizsgálatok reakciólépésenként végezhetők el, egyedi részecskékkel, részecskék csoportjaival, ill. ezek kombinációival. Pl. a kombinatorikus szintézis kivitelezése után, 50 - 10000 részecskét tartalmazó csoportok különíthetők • · ···» *··« • * · · · el különböző reakcióedényekbe. Mindegyik edényben, ill. mindegyik részecskéről felszabadítjuk a kötött termék egy részét. A frakcionált lehasítás akként valósítható meg, hogy a termékmolekulák különbözőképpen vannak kötve a részecskékhez, avagy korlátozott reagensmennyiséget használunk, vagy a reakciókörülményeket alakítjuk megfelelően, stb. Ekként a lehasított termékmolekulák átlagos száma kisebb lesz, mint ezen molekulák átlagos részecskénként! száma. így a termékeket csekély mennyiségben tartalmazó keveréket kaphatunk. Ez azután kötődési vizsgálatokhoz használható fel, ahol a kötődés megnyilvánulhat egy ismert ligandum receptorkötődésének gátlásában, egy sejtbéli metabolikus folyamat aktiválásában, ill. gátlásában stb. A kötődési aktivitást különböző módszerekkel vizsgálhatjuk, amelyeket alább fogunk felsorolni. Ha egy csoport aktívnak mutatkozik, a különböző részecskéket ugynazzal, vagy eltérő módszerrel is vizsgálhatjuk.

Természetesen egy három- vagy négylépéses folyamat során a nagy csoportok számos kisebbre oszthatók, s végül akár az egyedi részecskék is vizsgálhatók. A részecskéken lévő termék egy részét minden esetben lehasítjuk, s a kapott keveréket megfelelő vizsgálatoknak vetjük alá. Ezek lehetnek azonosak vagy különbözőek, a bonyolultabb vagy időigényesebb eljárásokat általában a szintézis végső ill. legutolsó lépéseiben alkalmazzák.

Olyan elrendezés is alkalmazható ahol a részecskéket egy lyukacsos tárolóedényben osztjuk el, akként, hogy egy-egy lyukba 1 ill.O részecske jut.

Az itt leírt módszerrel katalitikus aktivitású vegyületek találhatók, pl. hidrolitikus, pl. észteráz aktivitást mutató részecskék. E célból a gyöngyök egy félszilárd mátrixba ágyazhatok amelyet diffundáló tesztanyag vesz körül. Ha a katalitikus aktivitás lokálisan észlelhető, olyan folyamatok révén amelyek nem zavarják a mátrixot (pl. változások a fényadszorpcióban vagy fluoreszcencia a szubsztrát lehasadásának következtében), a katalitikus aktivitás zónájába eső gyöngyök elkülöníthetők, és címkéik dekódolhatók.

Katalitikus aktivitás helyett aktiváló vagy gátló hatással rendelkező vegyületek is kifejleszthetők. Találhatók olyan vegyületek, melyek pl. gátolnak ill. aktiválnak egy enzimet, vagy blokkolnak egy kötődési reakciót. Abból a célból, hogy a kívánt aktivitást hordozó gyöngyöket detektálhassuk, célszerű, ha a gyöngyökhöz kapcsolódó, kívánt aktivitású terméket felszabadítjuk, s lehetővé tesszük, hogy a környező félszilárd mátrixba ill. szűrőbe diffundáljon, ahol a gátlás, aktiválás, vagy blokkolás észlelhető. A gyöngyök, amelyek egy láthatóvá tett vagy más módon detektálható zónát képeznek, ezután kiemelhetők, és címkéik dekódolhatók. E módszernél követelmény, hogy a termékek egy része hasítható (célszerűen fotolabilis) kötésekkel legyen a gyöngyökhöz kapcsolva, a címkék egy része pedig az előbb említett lehasítás után is a gyöngyökön maradjon, s csak egy későbbi, eltérő reakció során, a gyöngyök kiválasztása után hasadjon le.

Dialízis membrán alkalmazható aból a célból, hogy egy gyöngyréteget elválasszunk egy radioaktívan jelzett ligandum/receptor párt tartalmazó keveréktől. A gyöngy-réteg ultraibolya fénnyel besugározható, a lehasadt termék átdiffundál a fenti párt tartalmazó rétegbe, ahol a jelzett címke a termék receptorkötödésével arányos mértékben fog felszabadulni. A jelzett címke visszadiffundál a gyöngyöket tartalmazó rétegbe. Mivel a jelzett címkék a gyöngyök közelében lesznek, a radioaktív sugárzást mutató gyöngyöket fogják analizálni.

Különösen fontos olyan termékeket találni, amelyek biológiai aktivitást mutatnak. Néha elegendő egy olyan terméket találni, amelynek élő sejtre gyakorolt hatása van, pl. gátolja a mikrobák ill. a vírusok növekedését, vagy aktiválja ill. gátolja a gének kifejeződését. A vegyületek vizsgálata könnyen megvalósítható pl. úgy, hogy a gyöngyöket félszilárd közegbe ágyazzuk, majd a termék-könyvtárat lehasítjuk a gyöngyökről, s míg azok helyben maradnak, a vegyületek a közegbe diffundálnak. A hatás mint pl. plakkok a baktériumtenyésztben, itt válik észlelhetövé. A növekedés aktiválás ill. gátlás, vagy a génkifejezödés zónái ezután vizualizálhatók, s a zóna közepén lévő gyöngyök kiválogathatok, és analizálhatók.

Ismeretes olyan vizsgálati rendszer is, ahol a vizsgálat tárgyai, legyenek azok molekulák vagy sejtek homogénen vannak eloszlatva egy gélben. Különböző gélképzö ágensek használhatók, mint pl. agaróz, poliakril-amid, zselatin stb. A részecskéket ezután eloszlatják a gélben, oly módon hogy az egyedi detektálás lehetséges legyen. Ha pl. a kívánt termék hidrolitikus aktivitású, a gélben olyan szubsztrát van amely fluoreszcens terméket ad. A gél fluoreszcens tesztelése után az aktív részecskék mechanikailag kiválogathatok.

Sejtek is lehetnek a gélbe ágyazva sejttenyészetet eredményező hatások esetén. A részecskék az előbbiekhez hasonlóan oszthatók el. Természetesen olyan rács is elhelyezhető a gél fölött amely elkülöníti a részecskét tartalmazó, ill üres gélrészeket. Ha a kívánt tulajdonság a citotoxicitás, a termék lehasítását megfeleő inkubációs idő követi, majd egy élő sejtek által adszorbeált festék eloszlatása a gélben. A festéket adszorbeáló és nem adszorbeáló sejtek igy megkülönböztethetők.

Mint fentebb említettük, a sejtek genetikailag akként módosíthatók, hogy jelezzék ha bizonyos szignál transzdukciója megtörtént. Számos receptor ismeretes, amelyekről tudott, hogy mely gének kifejeződését aktiválják. Egy exogén gént helyezve olyan helyre, amely egy ilyen receptorért felelős promoter transzkripciós kontrollja alatt áll, s egy detektálható, pl. fluoreszcens jelet adó enzim keletkezhet. A fluoreszkáló sejtekkel asszociált részecskék ezután analizálhatók reakciótörténetükre nézve.

Könyvtárak és készletek

Kényelmi szempontból könyvtárakról és készletekről beszélhetünk. A könyvtárak tartalmazhatják azokat a részecskéket amelyekhez egy termék- és címke könyvtár kötődik, s így lehetővé válik a gyöngyökhöz kötődő termékek elemzése, de könyvtárnak nevezhetjük a gyöngyökről lehasított termékeket is, amelyek egytől akár 10, 100, vagy 1000 tagból álló vizsgálandó csoportot is alkothatnak. Készletek alatt azokat a különböző reagenseket értjük, amelyeket címkeként alkalmazhatunk a könyvtárak szintézisénél. A készletek általában legalább 4, általában 5, még általánosabban legalább 10, de akár 10² különböző vegyületet is tartalmazhat, elkülönített konténerekben, általában azonban nem áll többöl mint 100, még általánosabban mint 36 különböző vegyületböl. A bináris meghatározások esetében a detektálás módja általában megegyezik az analízis módszerével, ez lehet egy közös kromofór, vagy detektálható atom, stb. Mivel mindegyik azonosító előkészített, valamennyi rendelkezik egy megkülönböztethető összetétellel, amely kódolja a választékot és a reakciólépést, ami fizikai mérései határozható meg, és több, vagy vegyületenként legalább egy közös funkciós csoportot tartalmaznak.

Másrészről a készletben lehetnek reaktánsok, melyeknek kombinációjával különböző azonosítók nyerhetők. Ez esetben a készlet számos elkülönített egyfunkciós, gyakrabban kétfunkciós szerves vegyületet tartalmaz, általában négyet vagy többet, általánosságban egyet mindegyik reakciólépéshez, a vegyületeknek van közös funkciós csoportjuk, és megkülönböztethetők legalább egy meghatározható jellemző alapján. Továbbá jelen lehet legalább egy, általában legalább kettő második fajta szer4ves vegyület is, amely reagálni képes a megfelelő funkciós csoportokkal, és a képződő keverékek elkülöníthetők a fenti második vegyület menyisége alapján. Az első vegyület lehet pl. glikol, aminosav, ill glikolsav, ahol e bifunkciós vegyületeket a jelenlévő fluor vagy klóratomok (szubsztituensek) száma különbözteti meg, s ezúton a reakciólépés meghatározható, a második vegyület lehet a jódmetán, ahol az egyik molekula nem tartalmaz radioaktív jelzést, a másik C-gyel, ismét másik egy vagy több H-val van jelezve. Két vagy többféle jód-metán használatával különböző keverékek állíthatók elő, amelyek radioaktív sugárzásuk révén megkülönböztethetők. Másfelől több ilyen második vegyület is használható, s ezúton egy bináris kód alakítható ki.

Mint fentebb jeleztük a címkék lehasítása után azok reagáltathatók egy olyan vegyülettel amely lehetővé teszi a detektálást. Ekként a címkék meglehetősen egyszerűek lehetnek, s ugyanaz lehet a funkciós csoportjuk a hordozóhoz való kapcsolódás és a detektálható vegyülettel való reakció céljára. Pl. egy észtercsoporttal kapcsolt molekulából a hidroxilcsoportot felszabadítva az ismét kapcsolható a detektálható molekulához észter- ill. éterkötéssel. Ha pl. fluorozott ill. klórozott alkil-csoportokat használunk bináris módon, a halogénatomok száma határozza meg a választási lépést, a szénatomok száma pedig a reakciólépést jelzi.

Különösen érdekesek az olyan vegyületcsoportok, amelyek egy kapcsoló-részletet tartalmaznak, amely egy szubsztituált ortonitrobeziloxi-, indaniloxi-, fluoreniloxi-, vagy egyéb csoporthoz kapcsolódnak, amely fotolitikus, vay egyéb szelektív hasítást tesz lehetővé. A kapcsoló csoport lehet egy 2-20 szénatomos alkilén-csoport, polialkilénoxi-, különösen 2-3 szénatomos alkilénoxi-, 4-8 szénatomos cikloalkil-, halogénzett alkil-, különösen 2-20 szénatomos fluor-alkil-csoport, egy vagy több aromás gyűrű, stb., ahol a kapcsolóegység lehetővé teszi az egyes csoportok közötti különbségtételt, mivel különböző számú és/vagy különbözőképpen szubsztituált egységekkel bír.

Az egyedi részecskék, ill. azok csoportjai kereskedelmileg is forgalmazhatók, különösen, ha az adott aktivitás iránt érdeklődés mutatkozik. A kapcsolt címkék segítségével a reakció története dekódolható. Ezután a végtermék nagyléptékű szintézissel is előállítható. A végtermék szerkezete egyértelműen meghatározható a reakció történetéből, s a nagyléptékű szintézishez akár ugyanaz, akár eltérő reakcióút is felhasználható. Ha a reakció történetéből nem határozható meg egyértelműen a végtermék szerkezete, a reakció nagy léptékben megismételhető, s a kapott végtermék szerkezete analizálható. Néhány példa azt mutatja, hogy a nagyléptékű szintézishez nem mindig a kombinatorikus szintézisnél használt reakcióút a legmegfelelőbb.

A találmány tárgya tehát olyan készlet előállítása (is) , amely számos elkülönített szerves vegyületet tartalmaz, melyek mindegyike megkülönböztethető szerkezettel bír, s legalább egy bit különböző információt hordoz, amely fizikai módszerekkel határozható meg, s valamennyien legalább egy közös funkciós csoportot hordoznak. A találmány előnyös megvalósítása egy legalább 4 szerves vegyületet tartalmazó készlet.

Még előnyösebb egy olyan készlet, amelyben a fenti szerves vegyületek képlete:

F^-C-E-C' (i) ahol F -F jelentése kapcsolóegység amely kapcsolható, ill. lehasítható a hordozóhoz/ról, C-E-C jelentése pedig címke, amely fizikai méréssel meghatározható különösen ha a vegyületek különböznek egymástól a metilén-csoportok, és/vagy halogén-, nitrogén-, ill kénatomok számában.

Szintén előnyős az olyan készlet, amelyben a C-E-C részlet fotokémiailag, oxidatívan, hidrolitikusan, termolitikusan, ill. reduktívan hasítható le.

A találmány szerinti vegyületek használhatók fájdalomcsillapítóként és/vagy gyulladásos betegségek kezelésében, különösen az azotriciklusok esetében, amelyek a neurokin 1/bradikinin receptorok antagonistáiként hatnak. A benzodiazepin könyvtárak tagjai izomrelaxánsként és/vagy trankvillánsként és/vagy nyugtatóként alkalmazhatók. A 23 millió tagú Kevert amidkönyvtár tagjai felhasználhatók mint endotelin antagonisták a Raynaud szindróma, ill. magas vérnyomás kezelésére.

A következő példák a találmány szerinti módszer illusztrálására, és nem korlátozására szolgálnak.

A találmány egyik kiviteli alakja egy olyan kompozíció amely legalább 6 különböző komponensből áll, melyek mindegyike rendelkezik egy megkülönböztethető résszel. E komponensek úgy jellemezhetők, hogy kémiailag stabilak ill. inertek, és van egy olyan azonosítható jellemzőjük, amely megkülönböztethető a többi alkotórésztől. Valamennyi ilyen részlet egy kapcsolóegységhez kötődik, amelynek egy kovalens kötés kialakítására képes funkciós csoportja van, amely egy kapcsoló egységen keresztül egyedileg elkülöníthető szilárd felülethez kapcsolódhat, vagy egy olyan csoporthoz, amely 1 nanomólosnál kisebb koncentrációban detektálható. Feltéve, hogy amikor a molekularészletek a kapcsolóegységhez kötődnek, a komponensek fizikalag elválaszthatók. A szilárd hordozók előnyösen gyöngyök lehetnek.

Egy megoldás szerint minden komponens különböző vegyületek molekuláiból áll, amelyek egyedileg elkülöníthető szilárd felületekhez kötődnek. A találmány szerinti egységek előnyösen egy homológ sorozat elemeiként, és/vagy egy törzsmolekula eltérően szubsztituált változatainak sorozataként definiálhatók.

Ugyancsak a találmány tárgyát képezi legalább 100 tagú vegyület-könyvtár előállítása, amely egyedi szilárd hordozókból áll. E könyvtár valamennyi hordozója rendelkezik:

(1) egy egyedi vegyülettel amely főkomponensként van a hordozóhoz kötve; és (2): számos címkével, ezek nem szekvenálható molekulák, hanem egyedileg megkülönböztethető és elkülöníthető molekulák, melyek akként vannak szubsztituálva, hogy nanomólnál kisebb mennyiségben detektálhatok legyenek, vagy olyan funkciós csoporttal rendelkeznek, amely egy fenti töménységben detektálható szubsztituenshez kötődhet. A vegyület-könyvtárban előnyösen mindegyik hordozó legalább 6 címkével rendelkezik. Egy másik megoldás szerint a vegyületkönyvtárban a címkék egy bináris kódot definiálnak, amely a szilárd hordozón lévő vegyületek szintézis-történetét kódolja.

A találmánynak ugyancsak célja egy módszer kifejlesztése szintézis-protokoll meghatározására, amely a fizikailag elkülöníthető különböző címkék sorozatában van kódolva, és bináris kódot határoz meg. E módszernél legalább két címkét alkalmazunk a szintézis-protokoll minden lépésének !

meghatározására, s igy legalább 6 címkére van szükség. A módszer az alábbi lépésekből áll: a címkék elkülönítése fizikai különbségeik segítségével, majd a címkék detektálása, és a bináris kód meghatározása, amely a protokollt kódolja, s amelynek révén a szintézis története meghatározható.

1. PÉLDA

PEPTID KÖNYVTÁR

Annak érdekében, hogy 10 különböző szintézis kódolható legyen, 30 különböző azonosítót kell szintetizálni, melyek mindegyike egyéni címkéket hordoz, amelyek kapilláris gázkromatográfiával különíthetők el egymástól. Csekélyebb számú szintézis kódolására kevesebb azonosító is elegendő. A címkék kereskedelmileg hozzáférhető vegyszerekből készíthetők, pl. az alábbiak szerint, ω-hidroxi-l-alkéneket, melyeknél a metiléncsoportok száma 1 és 5 között változhat, reagáltathatunk jódperfluor-alkánokkal,ahol a CF₂ csoportok száma 3, 4, 6, 8, 10, es 12, lehet. Szabad gyökös katalizátort alkalmazva, a jódperfluor-alkán addícionálódik a kettős kötésre, majd a jód redukálható katalitikus hidrogénezéssel, ill. ón-hidriddel.

Ekként 30 különböző címkét készíthetünk. A kémiai folyamatot az alábbi források írják le: Haszeldine és Steele, J. Chem. Soc. (London), 1199 (1953); Brace, J. Fluor. Chem., 20, 313,(1982).

A nagymértékben fluorozott címkék könnyen detektálhatok elektronbefogással, mivel retenciós idejük különböző, jól elkülöníthetők kapilláris gázkromatográfiával, fluorozottságuk miatt kémiailag inertek, s mindegyikük hordoz egy hidroxil funkciós csoportot, amellyel direkt vagy indirekt módon a részecskékhez kapcsolható.

A vegyületek prekurzorainak felkapcsolása előtt a címkéket (melyeket Tl-T30-cal jelölhetünk), aktiválni kell, olymódon, ami megfelel a kombinatorikus szintézisben akalmazott intermedierek természetének. Ez olyan funkciós csoport hozzáadását jelentheti, amely kémiai kötés révén könnyen kapcsolódhat a vegyületek prekurzoraival, vagy magával a hordozóval. Az aktivációs folyamatot mind a 30 címke estében alkalmazni kell, így válik lehetővé, hogy azok kémiailag, direkt vagy indirekt módon kötődjenek a kombinatorikus szintézis intermedierjeihez. Pl. karbonsavszármazékokat lehet használni, s az aktiválás során keletkezett karboxil-csoportok fognak kötődni a részecskékhez.

Peptidek, vagy egyéb, amid-csoportokkal összekapcsolt részekből álló szerves vegyületek szintézise esetén a kódolási folyamat karbonsav-tartalmú kapcsolóegységek hozzáadásából állhat. Pl. a címkét o-nitro-p-karboxi-benzil-bromid-terc.-butil-észteréhez kapcsolhatjuk, nátrium-hidrid jelenlétében. Az észter ezután hígított trifluor-ecetsavval hidrolizálható.

Az aktivált azonosítók a kombinatorikus szintézis minden lépésében az intermedierekhez kapcsolhatók. Az aktivált azonosítók orto-nitro-benzil része használható a címkék fotokémiai lehasítására, a szintézis befejezése, és a legérdekesebb vegyületek kiválasztása után. A lehasított címkék ezután kapilláris GC és elektronbefogás segítségével dekódolhatók, s így megkapható a szintézis története, azaz a vegyületek előállítása során használt szintézis-lépések sorrendje.

A kombinatorikus vegyület-könyvtárak előállításához felhasználható szintézis-lépések és módszerek száma csaknem határtalan. A kombinatorikus peptid-könyvtáraknak, mint a kódolási módszer alkalmazási példáinak szintézisekor aaminosavak kapcsolását használhatjuk fel. Az alábbi példában egy pentapeptid könyvtár szintézisét szemléltetjük, amely 16 különböző aminosav valamennyi kombinációját tartalmazza, mind az 5 pozícióban. E könyvtárnak 16⁵ tagja van. Ahhoz, hogy mindegyik egyedileg kódolható legyen, 20 darab (T1-T20) lehasítható címkére van szükség.

A kódolt peptid-könyvtár szintéziséhez nagyszámú (>10⁶ ) , a Merrifield féle szintézishez használatos polimer gyöngyből indulunk ki, ameyeket szabad amino-csoportokkal funkcionalizálunk. A gyöngyöket 16 egyenlő csoportba osztjuk, s 16 elkülönített reakcióedénybe helyezzük, a 16 hozzáadandó aminosavnak megfelelően. Ezután csekély mennyiségű (kb. 1 mól% ) azonosítót adunk mindegyik aminosav származékhoz (pl. Fmoc aminosavak), amelyeket a kombinatorikus szintézis első lépésében fogunk kapcsolni. Az azonosítókban található címkék sajátos kombinációja egy bináris kódot alkot, amely meghatározza a szintézis első lépésében használt 16 aminosavat. A 16 aminosavat az 1-16 számokkal jelezzük, ezek kémiailag az első négy címke (T1-T4) kombinációjával reprezentálhatok. A 2. és 3. táblázatban egy tipikus kódoló rendszert tüntettünk fel, ahol az 1 ill. 0 számok egy címke jelenlétére ill. hiányára utalnak. A T betű a címkét, és az azt magában foglaló azonosítót is jelölheti.

2. Táblázat Egy tipikus kódrendszer

Az első lépésben hozzáadott aminosavak	T4	T3	T2	TI
1. (pl. glicin)	0	0	0	0
2. (pl- alanin)	0	0	0	1
3. (pl. valin )	0	0	1	0
4. (pl. szerin)	0	0	1	1
5. (ol. treonin)	0	1	0	0
16. (pl. triptofán)	1	1	1	1

Ezután egy szokásos diciklohexil-karbodiimides (DCC) peptidkapcsolást végzünk a mind a 16 edényben, az Fmoc aminosavak és a fentebb leírt kismennyiségű aktivált azonosító között. A kapcsolások alatt az aminosavak, valamint az azonosítók csekély (kb. 1%) mennyisége kémiailag kötődik a hordozóhoz kapcsolt intermedierekhez.

A kővetkező lépésben a gyöngyöket összekeverjük, majd ismét 16 porcióra osztjuk, melyeket ismét 16 reakcióedénybe helyezünk.

Ezután valamennyi edénybe a második, megfelelő aktivált új azonosítókkal (T5-T8) összekevert aminosavat adagoljuk, és az előbbiek szerinti DCC-s kapcsolást végzünk. A beépített azonosítók keveréke kombinatorikus szintézisnek ebben a • · « második lépésében ismét egy egyszerű bináris kód szerint reprezentálja a 2. pozícióba beépített aminosavakat.

3. Táblázat Egy tipikus kódrendszer

A második lépésben hozzáadott aminosavak	T8	T7	T6	T5
1 . (pl. glicin)	0	0	0	0
2. (pl. alanin)	0	0	0	1
3. (pl. valin )	0	0	1	0
4 · (pl. szerin)	0	0	1	1
5. (pl. treonin)	0	1	0	0
16. (pl. triptofán)	1	1	1	1 ;

A 16 kapcsolás után a szintézis 2. lépése befejeződik, a gyöngyöket ismét összekeverjük, és a harmadik lépéshez ismét 16 adagra osztjuk. E lépésnél a T9-T12 azonosítókat használjuk, a kódrendszer megegyezik az első két lépésben használttal. A harmadik kapcsolás után a folyamatot még kétszer megismételjük, a negyedik pozícióban lévő aminosavaknál a T13-T16, az ötödik esetben pedig a T17-T20 azonosítókat felhasználva, végül megkapjuk az egész könyvtárat, amely 1 048 576 különböző hordozóhoz kötött peptidet tartalmaz.

Bár a kapott gyöngyök vizuálisan megkülönböztethetetlenek, bármelyikük kiválasztható (pl. a hozzájuk kötött peptidek vagy egyéb molekulák érdeklődésre számot tartó kémiai ill. biológiai tulajdonságai alapján), és szintézis-történetük megismerhető lehasítás és a hozzájuk kapcsolt címkék elemzése útján.

A konkrét lehasítási módszer a kombinatorikus szintézisben használt kapcsolóegység minőségétől függ, amely az adott itermediert a hordozóhoz kapcsolja. A fenti példa szerinti orto-nitrobenzil-karbonát kapcsolóegységről ismert (Ohtsuka, et. al., JACS, 100, 8210 [ 1978] ), hogy 300 nm-nél kisebb hullámhosszúságú fényre instabil, ezért a gyöngyök fotokémiai besugárzásával lehasítható. A lehasított címkék ezután szabadon diffundálhatnak a gyöngyöket körülvevő oldatba, amely ezután egy érzékeny elektronbefogó detektorral felszerelt kapilláris gázkromatográfba injektálható. Mivel a T1-T20 címkék sorrendje és standard körülmények közt mért retenciós ideje az előzetes mérésekből ismert, a T1-T20 címkék bármelyikének jelenléte vagy hiánya közvetlenül meghatározható a gázkromatográfiás csúcsokból. Ha 1-gyel ill. 0-val jelöljük a Tl~T20-nak megfelelő csúcsok meglétét ill hiányát, a kromatogram egy 20 jegyű bináris számnak tekinthető, ami egyértelműen reprezentál minden lehetséges szintézist, amely a peptid-könyvtár bármely tagjának előállítására vezetnek. A halogénezett szénhidrogének használata, melyek biztonságosak, gazdaságosak, és pikomólnál kisebb töménységben is detektálhatok elektronbefogás segítségével, a kapilláris gázkromatográfiát alkalmazó eljárást a célnak különösen megfelelő kódolási módszerré teszi.

A kódrendszer alkalmazásának példájaként a fenti peptidkönyvtárra, a hordozó egy részét besugározzuk a címkék lehasítása végett, s a lehasított címkékből keletkezett oldatot kapilláris gázkromatográfba injektálva az alábbi kromatogramot nyerjük (a csúcs jelenlétét vonal jelzi):

Címke

Csúcs

Bináris kód

Szintézislépés

19 18 17

Ilii

1111

----5......

15 14 13

10 0

Aminosav

Triptofán

Treonin

12	11 10 9 1 I	8	7 6 5	4 3	2 1
0	1 í 0 1 1	0	1 0 0 1	0 0	1 0

.....2..........1

Szerin Alanin

Valin

GC injektálás (Az injektálást a jobb oldalon jeleztük, így a retenciós idő jobbról balra nő!)

A táblázatból leolvasható hogyan határozható meg a kapott kromatogramból a bináris kód segítségével a végtermék aminosavösszetétele. A kapott kép természetesen csak akkor ilyen egyértelmű, ha a címkék megfelelő megválasztásával elérhető, hogy azok retenciós ideje Tl-töl T20-ig növekedjék.

2. PÉLDA

RADIOAKTÍVAN JELZETT CÍMKÉK

Ebben az illusztratív példában az alkalmazott címkék lineáris α-ω-alkil-diolok monometiléterei. A diói N+2 szénatomot tartalmazhat, ahol N jelzi a reakciólépés számát. A metilcsoport radioaktívan jelzett lehet, előfordulhat benne bármely ³H/¹⁴C variáció l/l-től m/l-ig, ahol m jelzi a választási lehetőségek számát. A kétszeres radioaktív jelzés lehetővé teszi a címkében lévő trícium mennyiségének pontos »··* ···£ meghatározását. 10 különböző alkilén-csoport, és 10 különböző címke-arány esetén 1O¹⁰ darab tíztagú, egyedi címke-család hozható létre. A címkék első kapcsolása aktiváló ágensekkel, mint pl. foszgénnel való reakción keresztül valósítható meg, ekkor kloroformátok képződnek; ezt az F^L-F² komponenssel való reakció követi. Ez esetben F -F terc-butil-észter formájában védett o-nitro-p-karboxi-benzil alkohol lehet. Az észtercsoportjától megszabadított azonosítót mindegyik reakciólépésben közvetlenül a kovalensen kötött amin- ill. hidroxil-csoportokat tartalmazó hordozóhoz kötjük, amidok ill. észterek keletkezése közben, a szokásos aktív savszármazékokat alkalmazó kapcsolási módszerek, pl. karbodiimides kapcsolás segítségével. A szekvenciális szintézis végén a gyöngyöket különböző receptorokkal, ill. enzimekkel teszteljük sajátos jellemzőik meghatározása végett. Az aktivitást mutató gyöngyök elkülöníthetők, a címkék lehasíthatók, és HPLC-vel szétválaszthatok, ekként egy sorozat glikol-monometil-étert nyerünk, melyeknek radioaktivitása standard módszerekkel analizálható. Pl. ha az első, ill. a második címke 5:1 ill. 7:1 ³H/¹⁴C aránnyal eluálódik a HPLC oszlopról, az aktivitást mutató végtermék az első lépésben az 5. míg a másodikban a 7. reagens felhasználásával keletkezett.

3. PÉLDA

2401 tagú peptid-könyvtár

Az alkalmazott azonosítók: 2-nitro-4-karboxibenzil, 0-arilszubsztituált ω-hidroxialkil-karbonátok, ahol az csoport 3-12 szénatomot tartalmaz, az aril csoport pedig a következő lehet: (A) pentaklórfenil-, (B) 2,4,6-triklórfenil-, vagy (C) 2,6 diklór-4-fluor-fenil-csoport. A címkéket NAr-ral jelöljük, ahol N a metilén-csoportok kettővel csökkentett számát, Ar pedig az aril-csoportot jelöli. így pl. 2A a pentaklórfenil-csoporthoz oxigénen keresztül kötött butilén-csoportot jelöl. Ezek a címkék elektronbefogással kombinált GC-vel könnyen detektálhatok kb. 100 fmól mennyiségben.

Ebben az analízisben a címke-molekulák GC elúciójuk sorrendjében rendeződnek. így a leghosszabb ideig az oszlopon maradó címke (jele: TI) kapcsolódik a legkevésbé szignifikáns bithez a szintézis kódszámrendszerében, a következő leghosszabb ideig az oszlopon maradó címke a T2 jelölést kapja, s a második legkevésbé szignifikáns bithez kapcsolódik, stb. 0,2mm x 20m-es metil-szilikon kapilláris GC oszlopot használva 18 jól eválasztható címke detektálható, ahol a T1-T18 címke a 10A, 9A, 8A, 7A, 6A, 5A, 4A, 3A, 6B, 2A, 5B, 1A, 4B, 3B, 2B, 1B, 2C, és IC komponenseknek felel meg.

2401 peptidet tartalmazó kombinatorikus könyvtárat állítottunk elő. Az aminosavak sorrendje NH₂-XXXXEEDLGGGG-hordozó, ahol a változó X egységek a D, E, I, K, L, Q, vagy S egybetűs kódokkal jelölt aminosavakat jelölik. A 4 glicin egység távtartóként szolgál a hordozó és a kódolt aminosav-szekvencia között. A kombinatorikus könyvtár tartalmazza a H₂N-KLISEEDL szekvenciát is, amely része annak a 10 aminosavat tartalmazó epitópnak, amelyről ismert, hogy kötődik a 9E10 jelű monoklonális antitesthez, amely az emberi C-myc gén terméke ellen irányul. E könyvtár kódolásakor 3 bináris bit elegendő a reakciólépésenként lehetséges hét alternatív reagens kódolására. A kódok a következők: 001 = S; 010 = I; 011 = K100 = L; 101 = Q; 110 = E; 111 = D.

E könyvtár szintézisekor először a konstans H₂N-EEDLGGGGhordozó szegmenst szintetizáltuk, l,5g 50-90 mikronos, aminometil funkciós csoportokkal (1,1 mekv/g) ellátott polisztirol szintézis-gyöngyön, standard szilárd-fázisú szintézismódszerekkel, oldalláncvédelemre terc-butil-, a fölánc védelmére pedig Fmoc csoportokat használva (Stewart and Young,

Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Co., 1984).Az Fmoc csoportok dietil-aminal történő lehasitása után, a gyöngyöket hét, egyenként 200 mg-os frakcióra osztottuk, és mindegyiket külön Merrifield-féle szintézis edénybe helyezzük, amely rázógépre van erősítve. Ezután az edényekben lévő gyöngyöket az alábbi táblázat szerinti reakcióknak vetjük alá. (A T jelentése címke ill. az azt magában foglaló azonosító. )

3-1 TÁBLÁZAT

Edény száma	1.lépés	2.lépés	3 . lépés	4 . lépés
1	1%T1	DIC, mosás	Fmoc(tBu)S, Anh.	mosás
2	1%T2	11	FmocI, Anh.	II
3	1%T1,T2	fi	Fmoc(Boc)K, Anh.	II
4	1%T3	If	FmocL, Anh.	II
5	1%T1,T3	II	Fmoc(tritil)Q, Anh.	II
6	1%T2,T3	II	Fmoc(t-butil)E, Anh.	υ
7	1%T1,T2,T3	II	Fmoc(tBu)D, Anh.	Π i

A fenti folyamattal összhangban, a felsorolt azonosítók megfelelő mennyiségét, karboxilcsoportjukon keresztül, diizopropil-karbodiimiddel, valamennyi edényben, a gyöngyök szabad amino-csoportjainak mintegy 1%-ához kapcsoltuk. A maradék szabad amino-csoportokat valamennyi gyöngyön a 3. lépés szerint N-védett aminosav-anhidridekkel kapcsoltuk. Ezt metilén-kloridos, izopriopanolos, majd N,N-dimetil-formamidos mosás követte, majd a hét edény tartalmát összekevertük. Ekkor a könyvtárnak 7 tagja volt. Az Fmoc csoport dietil-aminnal történő lehasítása után a gyöngyöket ismét 7 edénybe osztjuk szét, s az előző lépésnek megfelelő folyamatot hajtjuk végre, azzal a különbséggel, hogy ezúttal a második lépéshez rendelt azonosítókat (T4-6) kapcsoljuk a gyöngyökhöz. A folyamatot még kétszer megismételve, a T7-9, ill. a T10-12 azonosítók felhasználásával, végül 7⁴=2401 különböző, egyedileg kódolt peptidet tartalmazó könyvtárat nyertünk, mindössze 12 azonosító felhasználásával.

Ahhoz, hogy egy kiválasztott gyöngyről a szintézis történetét leolvassuk, azt először egy kis centrifugacsöben 4 x 100 mikroliter DMF-dal mostuk, majd egy Pyrex kapillárisban ismét szuszpendáltuk 1 mikroliter DMF-dal. 2 órás fotolízís után (fényforrás: Rayonet, 350 nm), a kötött azonosítóról lehasított címkéket 0,1 mikroliter bisz-trimetil-szilil-acetamiddal szilileztük, majd az oldatot egy 0,2mm X 20m-es, metilszilikonnal borítottt szilikagéllel töltött kapilláris oszloppal, és elektronbefogási detektorral ellátott, Hewlett Packard gázkromatográfba injektáljuk. A kiválasztott gyöngy * · · · F ···· 9 9 9

Ί9 bináris szintézis-kódja a címkék kapott kromatogramjából közvetlenül meghatározható.

4. PÉLDA

Benzodiazepin könyvtár

Egy 30 tagú, a^VIIl) képletü benzodiazepineket

ahol R jelentése CH₃, CH(CH₃)₂, CH₂CO₂H, (CH₂)₄NH₂, CH₂C₆H₄OH, vagy CH₂C₆H₅, és

R¹ jelentése H, CH₃, C^, CH₂CH=CH₂, vagy CH₂C_SH₅, tartalmazó könyvtár állítható elő az alábbi vázlat szerint:

ν· ··*· ···· • « « ·

V ·· • ·· ···· ··

DEAD. PPh₃. PMle

A LÉPÉS

D1C. BOBt

DKF

C LÉPÉS

Cl

III

-c

20% PIPERIDIN/DMF

R

A co

I

F

FmocN

C

E LÉPÉS

F LÉPÉS

1) LÍTIUM-5(FENILMETIL)-2OXAZOLIDINON

THF, -79 C

2) Π, DMF

X= BRÓM VAGY JÓD

3) TFA:H₂0:dimetil-szulfid

95:5 10

F LÉPÉS

G LÉPÉS hv (350 ni)

D1ÍF

+

G LÉPÉS

H LÉPÉS

A^VIIlj. képletü benzodiazepinek polsztirol hordozón építhetők fel, Bunin és Ellman módszere szerint (JACS, 114, 10997-10998 [ 1992] ), azzal az eltéréssel, hogy a benzodiazepin molekulák és a hordozó közé egy kapcsolóegységet építünk be (1. az A, B, és C lépést), ami lehetővé teszi, hogy a G lépésben a benzodiazepin ne hidrolitikus úton, hanem UV fénnyel (350 nm,

DMF, lOperc-töl 12 óráig terjedő reakcióidő), legyen lehasítható.

Továbbá a D és E lépéskben bináris kódokat vezetünk be, hogy pontosan meghatározhatóak legyenek a 6 helyzetű R', ill. az 5 helyzetű R¹' szubsztituensek beépítésére használt reakciósorozatok. A címkék H lépés szerinti eltávolítása után, az elektronbefogással detektált GC analízist követően, az egyedi R és R^L csoportok természete meghatározható.

A D, E, és az F lépésben ugyancsak Bunin és Ellman eljárását követjük, de a D lépésben beépítjük a IXa-c, az E lépésben pedig a IXd-f azonosítókat. Az azonosítók szerkezetét a (IX képlet mutatja be.

ahol
	jelentése	n=6;
	j elentése	n=5 ;
IXC	jelentése	n=4;
	j elentése	n=3 ;
IXe	jelentése	n=2 ;
IXf	jelentése	n=l .

és

Az R, ill R^L csoportok kódjait a 4-1 táblázat mutatja be.

4-1 Táblázat

ix	R
a	ch3
b	CH(CH3)2
a,b	ch2cq2h
’ c	(CH2)4NH2
a, c	CH2-C6H4-4 -OH
b, c	ch2c6h5
IX	e!
d	H
e	ch3
d,e	c2h5
f	ch2ch=ch2
d,f	ch2c6h5

A lépés ekvivalens I vegyület 0,5 M töménységű toluolos oldatához Fmoc-védett 2-amino-5-klór-4'-hidroxi-benzofenont (1,3 ekvivales), dietil-aza-dikarboxilátot ( 1,3 ekvivales ), és trifenil-foszfint (1,3 ekvivales), adunk. Az eelegyet szobahőmérsékleten 24 óráig keverjük. Az oldószert vákuumban lepároljuk, a maradékot éterrel kezeljük, majd az étert is vákuumban lepároljuk. A kapott II terméket szilikagélen végzett kromatográfiával tisztítjuk.

B lépés

A II vegyület DCM-es oldatához (0,2 M), szobahőmérsékleten kevertetett oldatához 3 ekvivalens trifluor-ecetsavat adunk, és 12 óráig kevertetjük. Az oldószert vákuumban szárazra pároljuk, a maradékot diklór-metánban oldjuk, konyhasó-oldattal egyszer mossuk, majd nátrium-szulfát felett szárítjuk. Szűrés, és az oldószer lepárlása után kapjuk a III. terméket.

C lépés

Aminometil funkciós csoportokat (1,1 mekv/g ) tartalmazó, 50 mikronos polisztirol-divinil-benzol gyöngyöket (keresztkötés: 1% ) szuszpendálunk dimetil-formamidban, egy Merrifield-féle reakcióedényben. 2 ekvivalens Ill-at és 3 ekvivalens HOBt-t adunk hozzá DMF-ben oldva, és az edényt 10 percig rázatjuk. 3 ekvivalens DIC-t adunk az elegyhez, majd a reakció befejeződését jelző negatív ninhidrin-próba eléréséig rázatjuk (12 óra). Az oldószert lepároljuk, majd a gyantát még 5x mossuk DMF-el és 5x DCM-el, majd vákuumban szárítjuk.

D lépés

A száraz gyantát 6 reakcióedénybe osztjuk és DCM-ben szuszpendáljuk. A IX_a__c azonosítók (1. 4-1 táblázat) megfelelő kombinációit adjuk az edényekbe, és 1 óráig rázatjuk azokat. Valamennyi edénybe Rh(TFA)₂ katalizátort ( 1 mól%) adagolunk, es további 2 óráig rázatjuk. Ezután az oldószert eltávolítjuk, és a gyantát 5x mossuk diklór-metánnal. A gyantát 0,01 M TFA/DCM oldattal kezeljük (30 perc rázatás), majd ismét 3x mossuk DCM-el, és 2x DMF-el. Ezután a gyantát 20%-os DMF-es piperidin oldattal rázatjuk 30 percig, majd 3x mossuk DMF-el és 3x DCM-el.

Mindegyik edénybe 3 ekvivalens Fmoc védett aminosav-fluoridot adagolunk (szükség esetén az oldalláncok védettek, mint pl. terc-butil-észter az Asp, terc-butil-éter a Tyr, ill. BOC a Lys esetében), 10 ekvivalens 2,6-diterc-butil-4-metil-piridinnel együtt, és az edényeket éjszakán át, ill. negatív ninhidrin-próba eléréséig rázatjuk. A gyantát ezután egyszer DCM-el, majd a hat edény összekevert tartalmát meg 5x DCM-el mossuk, majd vákuumban szárítjuk.

E lépés

A száraz gyantát 5 edénybe osztjuk, és DCM-ben szuszpendáljuk.

A IX_d._f azonosítók (1. 4-1 táblázat) megfelelő kombinációit adjuk az edényekbe, és 1 óráig rázatjuk azokat. Valamennyi edénybe Rh(TFA)₂ katalizátort ( 1 mól%) adagolunk, es további 2 óráig rázatjuk. Ezután az oldószert eltávolítjuk, és a gyantát 5x mossuk diklór-metánnal. A gyantát 0,01 M TFA/DCM oldattal kezeljük (30 perc rázatás), majd ismét 3x mossuk DCM-el, és 2x DMF-el. Ezután a gyantát 20%-os DMF-es piperidin oldattal rázatjuk 30 percig, majd 3x mossuk DMF-el és 3x DCM-el.

Valamennyi edénybe 5%-os DMF-es ecetsav oldatot adunk, és a keveréket 60 °C-on éjszakán át rázatjuk. Az oldószert eltávolítjuk, és a gyantát 5x mossuk DMF-el.

F lépés

Mindegyik gyanta-adagot THF-ben szuszpendáljuk, és az edényeket -78 °C-ra hűtjük. Az edényekbe 2 ekvivalens 5-(fenil-metil)-2oxazolidinon lítium-származékát adagoljuk, és a fenti hőmérsékleten 1 óráig kevertetjük. A megfelelő alkilezö ágensből (1. 4-2 táblázat) 4 ekvivalenst, majd katalitikus mennyiségű DMF-et adunk az edényekbe, majd hagyjuk azokat a környezet hőmérsékletére melegedni, s e hőfokon 5 órát rázatjuk. Az oldószert szűréssel eltávolítjuk, a gyantát lx THF-el mossuk, majd vákuumban szárítjuk. Az adagokat ezután összekeverjük, 2x THF-el, majd 2x DCM-el mossuk, majd a keveréket 2 óráig mossuk TFA : víz : dimetil-szulfid 95 : 5 : 10 arányú elegyével a oldalláncvédö csoportok eltávolítása végett.

4-2 Táblázat

AZONOSÍTÓ	ALKILEZÖ
ÁGENS
e	h3ci
d,e	C2H5Br
f	BrCH2-CH=CH2
d,f	BrCH2C6H5

G lépés

A benzodiazepin végtermék lehasítható a polisztirol hordozóról a gyöngyöket DMF-ben szuszpendálva, és az elegyet UV fénnyel (350 nm) 12 óráig besugározva.

·«·« »··«

H lépés

Az érdeklődésre számot tartó gyöngyöt üveg kapilláriscsöbe helyezzük. A csőbe 1 mikroliter 1 M vizes cérium(IV)ammóniumszulfát (CAN) oldatot, 1 mikroliter acetonitrilt, és 2 mikroliter hexánt injektálunk. A csövet leforrasztjuk, majd centrifugáljuk, abból a célból, hogy a gyöngyök bizonyosan belemerüljenek a reagensoldatba. A csövet ultrahang-fürdőbe helyezzük, és 1-10, előnyösen 2-6 órán keresztül ultrahang hatásának tesszük ki. Ezután a csövet feltörjük, s a hexános felülúszóból kb. 1 mikrolitert összekeverünk kb. 2 mikroliter bisz(trimetil-szilil)acetamiddal (BSA), a gázkromatográfba való injektálás előtt. A címkék származékai ezután elektronbefogásos detektorral meghatározhatók. A reakciósorozatot a következő oldalon látható séma illusztrálja.

···* ··♦»

Β5Α

GÁZKROMATOGRÁFBA líe

I ne-SiI ne

Cl

Cl

Cl «· ·«*« * · «

5. PÉLDA

117 649 tagú peptidkönyvtár

117 649 tagú kódolt peptidkönyvtárat állítottunk elő. Az alapszekvencia a következő: H₂N-XXXXXXEEDLGGGG-hordozó, ahol a változó X csoport jelentése D, E, I, K, L, Q, vagy S. A könyvtárat a 3. példa szerinti 18 azonosítóval kódoltuk; 3 bináris kód elegendő volt a 7 felhasznált aminosav kódolására mindegyik lépésben. A kód a következő volt: 001=S; 010=1; 011=K; 100=L; 101=Q; 110=E; és 111=D, ahol 1 ill. 0 jelzi a címke jelenlétét ill. hiányát.

A könyvtár alapszekvenciáját ( H₂N-XXXXXXEEDLGGGG-hordozó) l,5g, 1,1 mekv/g aminometil funkciós csoportot tartalmazó Merrifield gyantán szintetizáltuk, standard szilárd fázisú módszerekkel, tere.-buti! oldallánc-, il. Fmoc fölánc védelemmel. Az N-terminális Fmoc védőcsoport dietil-aminos lehasítása után a gyöngyöket 7, egyenként 200 mg-os adagra osztjuk, s mindegyiket egy-egy rázógépre szerelt Merrifield féle szintézis-edénybe helyezzük.

Ezután valamennyi edény tartalmát a 3-1 táblázat szerinti folyamaton visszük keresztül, az azonosító-készletek (T1-T3), s a nekik megfelelő aminosavak felkapcsolása céljából, azzal a különbséggel, hogy az aktiválásra DIC helyett izobutilkloroformátot használunk.

A folyamat a következő: először a megfelelő azonosítók csekély mennyiségeit, karboxil-csoportjukon keresztül a hordozóhoz kapcsoljuk. Ezt a karboxil-csoportok vegyes-anhidrid módszer szerinti, izobutil-kloroformáttal történő aktiválásával érjük el, majd a szabad amino-csoportok 1%-ának megfelelő mennyiségű «« «««· ’Ή ♦ · · V • · * · ···· · * ··· azonosítót a gyöngyökhöz kapcsolunk. Ekként a szabad aminocsoportok kb. 1-1%-a van blokkolva egy-egy felhasznált azonosítóval. A maradék szabad amino-csoportokat ezután a megfelelő védett, és szimmetrikus anhidridjük formájában aktivált aminosavakkal kapcsoljuk.

Mosás után a 7 adagot összekeverjük, és az Fmoc védőcsoportokat dietil-aminos kezeléssel lehasítjuk. A gyöngyöket ismét 7 adagra osztjuk és az előző folyamatnak vetjük alá, azzal a különbséggel, hogy a megfelelő azonosítókat hordozó címkéket (T4, T5, ill. T6), adagoljuk az edényekbe.

A szétosztás, jelzés, kapcsolás, aminosav-fölánc felszabadítás teljes folyamatát hatszor ismételjük meg, a T1-T18 címkéket hordozó azonosítókat felhasználva, a kódolt peptidkönyvtár 117 649 különböző tagjának megfelelően.

Tipikus azonosító szintézis

0,91 g (4,35 mmól) 8-bróm-l-oktanol, és 1,03 g (5,22 mmól)

2,4,6-triklór-fenol 5 ml DMF-es oldatához 1,70 g (5,22 mmól) cézium-karbonátot adunk, gázfejlődés és fehér csapadék keletkezése tapasztalható. A reakcióelegyet 80 °C-on 2 óráig kevertetjük. Ezután az elegyet 50 ml toluollal hígítjuk, és egy választótölcsérbe öntjük, és 2x 50 ml N nátrium-hidroxiddal, 2x 50 ml N sósavval, majd 50 ml vízzel mossuk, és a szerves fázist magnézium-szulfát felett szárítjuk. Az oldószer lepárlása után a címkét tiszta olaj formájában kapjuk meg ( 1,24 g, 87%-os kitermelés).

»· »··· • · e · * · • · « • · · · ··*· · <· ·«·

A fenti címke 0,81 g-ját (2,5 mmól) 15 ml 2 M töménységű toluolos foszgén oldathoz adjuk, majd szobahőmérsékleten 1 óráig kevertetjük. A toluolt és a foszgén fölöslegét vákuumban lepároljuk, és a maradék nyers kloroformátot 5 ml DCM és 0,61 ml (7,5 mmól) piridin keverékében oldjuk. Az elegyhez 0,5 g (1,98 mmól) terc-butil-4-hidroxi-metil-3-nitrobenzoátot (Bárány and Albericio, JACS, 107, 4936-4942, [ 1985] ) adunk, és a reakcióelegyet 3 órán át kevertetjük szobahőmérsékleten. Az oldatot ezután 75 ml etil-acetáttal hígítjuk, és egy választótölcsérbe öntjük. 3x 35 ml IN sósavval, 2x 35 ml telített NaHCO₃ oldattal, végül 35 ml NaCl oldatai mossuk, majd a szerves fázist magnézium-szulfát felett szárítjuk. Az oldószert vákuumban lepároljuk, s a maradékot kromatográfiával (szilikagél, 5-7,5% etil-acetát petroléterben) tisztítjuk, így végül 0,95 g-ot (79%-os kitermelés) kapunk az azonosító tercbutil-észteréböl, tiszta olaj formájában.

0,95 g (1,57 mmól) fenti észer 30 ml diklór-metánnal készült oldatához 3 ml trifluor-ecetsavat adunk, a kapcsoló sav felszabadítasának céljából (F -F az I képlet szerint), és az oldatot 7 órán át kevertetjük szobahőmérsékleten. Ezután az oldószert lepároljuk, s a száraz maradékot újra feloldjuk 30 ml diklór-metánban. Az oldatot 20 ml NaCl oldattal mossuk, és a szerves fázist magnézium-szulfát felett szárítjuk. Az oldószer eltávolítása után 0,75 g (87%) 6B jelű azonosítót kapunk, halványsárga szilárd anyag formájában. (A címkék nomenklatúrája a 3. példa szerinti.)

Tipikus kódolt könyvtár szintézislépés

Na-Fmoc-E(tBu)-E (tBu)-D(tBu)-L-G4-NH-gyantát 20 ml DMF-ben szuszpendálunk, és 2 percig rázatjuk. Szűrés után 40 ml 1:1 dietil-amin : DMF elegyet adunk a gyantához, és azt 1 óráig rázatjuk, az Fmoc védöcsoportok eltávolítása végett. A gyantát kiszűrjük, 2x 2 percig mossuk 20-20 ml DMF-el, 2x 5 percig 2020 ml 2:1 dioxán : viz eleggyel, 3x 2 percig ismét 20-20 ml DMF-el, végül 3x 2 percig 20-20 ml diklór metánnal, majd 25 °C-on vákuumban szárítjuk. (A gyanta, a pikrinsavas titrálás szerint ebben a lépésben 0,4 mmól/g amino-csoportot tartalmaz.)

A gyanta 150 mg-os adagjait 7 Merrifield-féle edénybe helyezzük, és 5-5 ml diklór-metánban szuszpendáljuk. A megfelelő azonosítókat - az első kapcsoláshoz - savkarbonátjaik alakjában aktiváljuk a következők szerint: 6,6 mg (0,0098 mmól) TI azonosítót 2 ml absz. éterben oldunk, majd 10 mikroliter piridint adunk az elegyhez. Ezután 0,1 ml absz éterben oldott 1,3 mikroliter (0.0096 mmól) izobutil-klroformátot adagolunk.

Az elegyet 25 °C-on 1 óráig kevertetjük, ekkor szép fehér csapadék képződik. Ezt a keverést leállítva hagyjuk formálódni 30 percig. A T2 és T3 címkék megfelelő származékai ugyanezen a módon állíthatók elő. Az aktivált azonosítók felülúszóinak 0,25 ml-es alikvotjait összekeverjük, hogy a megfelelő 3 bites bináris címke-kódot nyerjük, majd a megfelelő azonosítók kódoló keverékét beadagoljuk valamennyi szintézis-edénybe. Az edényeket sötétben 12 óráig rázatjuk, majd mindegyik tartalmát 4x 2 percig mossuk 10-10 ml diklór-metánnal. Ezután egy Nct~ Fmoc-aminosav diklór-metános oldatát (3 ekv/10 ml) adjuk a megfelelő kódolt gyanta-adagokhoz, és 20 percig rázatjuk.

Ezután 1 ml 5%-os diklór-metános N,N-diizopropil-etil-amin oldatot adunk az elegyhez, és addig rázatjuk, mig a gyanta negatív Kaiser tesztet nem mutat.

A gyanta-adagokat kiszűrjük, összekeverjük, majd 4x 2 percig 20-20 ml DCM-nal, 2x 2 percig 20-20 ml izopropanollal, végül 4x 2 percig ismét 20-20 ml diklór metánnal mossuk. A kővetkező jelzés/kapcsolási ciklust ismét az Fmoc csoportok fentiek szerinti lehasításával indítjuk. Az utolsó pozícióban lévő Fmoc csoport lehasítása után az oldallánc-védö csoportokat távolítjuk el, a gyantát 10 ml diklór-metánban szuszpendálva, 2 ml tio-anizol, 0,5 ml etán-ditiol, és 10 ml trifluor-ecetsav adagolásával, az elegyet 1 óráig 25°C-on rázatva. Végül a gyantát 6x 2percig 20-20 ml DCM-nal mossuk, majd szárítjuk.

Elektronbefogásos gázkromatográfiás cimkeolvasás

Egy egyedi, kiválasztott gyöngyöt Pyrex kapilláriscsöbe helyezünk, és 5x 10 mikroliter DMF-el mosunk. Ezután a gyöngyöt 1 mikroliter DMF-ben szuszpendáljuk, és a csövet leforrasztjuk. A gyöngyöt 3 óráig 366 nm-es fényei besugározzuk, hogy a címkealkoholokat felszabadítsuk, majd a csövet 3 órára 90 °C-os homokfürdőbe helyezzük. Ezután a felnyitjuk a csövet, és 0,1 ml bisz-trimetil-szilil-acetamidot adagolunk, a címkék trimetilszililezésének céljából. 2 perces centrifugálás után, a gyöngyök fölötti címke-oldatot közvetlenül az elektronbefogásos detektorral felszerelt kapilláris gázkromatográfba injektáljuk. A gázkromatográfiás elemzést egy HPS II Model 5890 típusú, 0,2 mmx20 m-es, metil-szilikonnal borított szilikagél töltésű kapilláris oszloppal ellátott készüléken hajtjuk végre. A fotolitikus reakciót egy UVP Black Ray model UVL 56 típusú, 366 nm-en sugárzó kézi UV lámpával folytatjuk le.

Antitest affinitás vizsgálati módszerek

A 9E10 jelű anti-C-myc peptid monoklonális antitestet ascites folyadékból állították elő (Evans et. al., Mól. Cell. Bioi., _5, 3610-16, [ 1985] , ill. Munro and Pelham, Cell, 48, 899-907, [ 1987] ) . A gyöngyök 9E10-hez való kötődésének vizsgálatára azokat TBST-ben [ 20 mmól Tris-HCl (pH 7,5), 500 mmól NaCl, és 0,05% Tween-20] inkubáljuk, amely puffer 1% marha szérumalbumint is tartalmaz, a nem-specifikus peptidkötöhelyek blokkolására. Ezután a gyöngyöket centrifugáljuk, majd újra szuszpendáljuk egy 1:200 higításu 9E10 ascites folyadék/TBST + 1% marha szérum-albumin oldatban, és éjszakán át 4 °C-on inkubáljuk. Ezután a gyöngyöket 3x mossuk TBST-vel, majd szobahön 90 percig inkubáljuk alkalikus foszfatázzal kapcsolt kecske antimouse IgG antitestekkel, (Bio-Rad Laboratories), amelyek l;3000 hígításban , 1% marha szérum-albumin tartalmú TBST pufferben vannak jelen. Ezt kétszeres TBST-s, majd egyszeres foszfatáz pufferrel [ 100 mmól Tris-HCl (pH 9,5), 100 mmól NaCl, és 5 mmól MgCl₂J történő mosás követi, majd a gyöngyöket 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk a fenti pufferrel, amely 1-1 századrészt tartalmaz az AP Color Reagents A & B (Bio-Rad Laboratories), valamennyi komponenséből. A reakciót megállítandó ezután 2x mossuk a gyöngyöket 20 mmól-os Na EDTA oldattal (pH 7,4). A különböző peptidek és a 9E10 közötti oldatfázisú aktivitást ezután egy módosított kompetitív ELISA teszttel vizsgáljuk (Harlow et. al., Antibodies: a

Laboratory Manual, 570-73, Cold Sprnig Harbor Press, Cold Sprnig Harbor, N.Y.).

A kombinatorikus könyvtár 30 mg-os mintájából 40 egyedi gyöngy festödött meg az anti-C-myc monoklonális antitesstel végzett teszt során. A pozitívan reagáló gyöngyökön lévő ligandumokat dekódolva megkapjuk a myc epitópot (EQKLISEEDL), ill. az attól a 3 N-terminális aminosav esetében 1 vagy 2 aminosavval különböző szekvenciákat.

6. PÉLDA

540 625 tagú kevert amidkönyvtár

A kódolási technikát tovább teszteltük egy 23 540 625 tagú kombinatorikus könyvtár előállításával, amely peptideket és egyéb amidvegyületeket tartalmaz.

A szintézis során 5 lépésen keresztül 15 különböző reagenst, a hatodik lépésben pedig 31 különböző reagenst használtunk. Az első 5 lépésben 4-4 azonosítót használtunk a 15 reagenshez, a hatodikban ötöt a 31-hez. Ezért egy 25 azonosítót tartalmazó készletet állítottunk elő. 2-Nitro-4-karboxi-benzil, O-arilhelyettesített ω-hidroxialkil-karbonát azonosítókat alkalmaztunk, ahol a címke komponensek az alábbiak: 3-12 szénatomos alkil-csoport, és az aril-csoportok a következők: (A) pentaklórfenil, (B) 2,4,5-triklórfenil, (C) 2,4,6triklórfenil, vagy (D) 2,6-diklór-4-fluor-fenil. A 25 azonosítót tartalmazó készlet előállításához a megfelelő lánchosszúságú alkil-csoportokat használtuk fel, a fenti A, B, C, ill. D csoportokkal kombinálva. A címkék elkülönítésére egy 0,2 mmx25 m-es metil-szilikon GC oszlop használható. A T1-T25

100 címkék kémiai összetételét (ahol TI jelöli a leghosszabb, és T25 a legrövidebb retenciós idejű címkét ) az alábbi táblázat foglalj a össze.

TI	10A	T6	10C	Τ1Ί	7B	T16	5C	T21	2B
T2	9A	T7	9B	T12	7C	T17	4B	T2 2	2C
T3	8A	T8	9C	T13	6B	T18	4C	T2 3	1B
T4	7A	T9	8B	T14	6C	T19	3B	T24	IC
T5	10B	T10	8C	T15	5B	T2 0	3C	T25	2D

A 10A, 9A, stb. jelölések értelmezése azonos a 3. példában alkalmazottal.

Az első öt lépésben használt 15 reagenst, és azonosító kódjukat az alábbi táblázat foglalja össze, ahol 1 jelöli a címke jelenlétét, 0 pedig a hiányát.

101

REAGENS	KÓD
L-szerin	(0001)
D-szerin	(0010)
L-glutaminsav	(0011)
D-glutaminsav	(0100)
L-glutamin	(0101)
D-glutamin	(0110)
L-lizin	(0111)
D-lizin	(1000)
t-prolin	(1001)
D-prolin	(1010)
L-fenilalanin	(1011)
D-fenilalanin	(1100)
3-amino-benzoe- sav	(1101)
4-aminofenil- ecetsav	(1110)
3,5-diamino- benzoesav	(1111)

A 6 lépésben felhasznált 31 reagenst és kódjukat az alábbi táblázat mutatja be:

102

REAGENS	KÓD
L-szerin	(00001)
D-szerin	(00010)
L-glutaminsav	(00011)
D-glutaminsav	(00100)
L-glutamin	(00101)
D-glutamin	(00110)
L-lizin	(00111)
D-lizin	(01000)
L-prolin	(01001)
D-prolin	(01010)
L-fenilalanin	(01011)
D-fenilalanin	(01100)
3-amino-benzoesav	(01101)
4-aminoienii-ecetsav	(01110)
3,5-diamino-benzoesav	(01111)
borostyánkösav-anhidrid	(10000)
tiglinsav	(10001)
2-pirazin-karbonsav	(10010)

103

( + )tioktinsav	(10011)
1-piperidin-propionsav	(10100)
piperonilsav	(10101)
6-metil-nikotinsav	(10110)
3- (2-tienil)-akrilsav	(10111)
metil-j odid	(11000)
tozil-klorid	(11001)
p-toluolszulfonil-izocianát	(11010)
3-ciano-benzoesav	(11011)
ftálsav-anhidrid	(11100)
ecetsavanhidrid	(11101)
etil-kloroformát	(11110)
mezil-klorid	(11111)

A hordozón S glicin egységből álló távtartót szintetizáltunk, standard módszerekkel. A változtatható régióban butil oldallánc védelmet alkalmaztunk, a főlánc amino-csoportjait Fmoc csoportokkal védjük. Az amid kötéseket a karbonsavak DIC-vel ill. HOBt-vel végrehajtott aktiválásával hozzuk létre.

104

7. PÉLDA

Heterociklusos Diels-Alder könyvtár

Egy 42 tagból álló, az alábbi képletnek megfelelő szerkezetű heterociklusos Diels-Alder könyvtárat

H ahol :

R~ jelentése	H,	ch3o, f3c, f3co, h5c6o,	vagy CóHn '
R jelentése	H,	CH-., vagy CH3O ;
R' jelentése	H	(ha n=2), vagy CH3 (ha	n=l); és

Ar =

R = H vagy Cl

állítottunk elő az alábbi séma szerint:

105

TF* ^{B LÉgÉS}

DC«

1) ^ra2

D1C. HOBt, DUF <F----------·.--------------------------2) Azonosítók X_a/D C LÉPÉS

106

Toluol

Δ

2) Azonosítók X_c__e

DCM

E LÉPÉS

107

E LÉPÉS

G LÉPÉS _Ce(NH_<)₂(NO₃)₆

108

A (VI) képletű azatriciklusos termékeket a polisztirol hordozón szintetizáltuk, és a hordozóhoz egy fotolabilis kapcsolóegységgel kapcsoltuk, ami lehetővé tette, hogy a (VII) képletű azatriciklus lehasítható legyen a hordozóról UV besugárzással (350 nm/DMF). A bináris kódokat a C, D , és E lépésekben építjük be, ezek lehetővé teszik az ArR, R‘, R² és R^J csoportok beépítésére használt reakciósorozat egyértelmű meghatározását. A kódoló címkék lehasítását a G lépés szerint végezzük meghatározásukat pedig gázkromatográfiát követő elektronbefogásos detektálással.

X
a	j elentese	n=10
	jelentése	n=9
Xc	jelentése	n=8
xd	jelentése	n=7
Xe	j elentése	n=6
Xf	jelentése	n=5
χ 9	jelentése	n=4
R,	R, R2, és	3 R kódjai a következők

109 a,b

7-1 TÁBLÁZAT

R = Cl

Ar =

c	R1=H	r2=h
d	R1=H	r2=ch3
d, c	r’=och3	r2=och3
e	r’=cf3	r2=h
e,c	r1=c6h5o	r2=h
e, d	r1=f3co	r2=h
e,d, c	R’-c4h„	r2=h
f	r3=ch3	n=l
9	r3»h	n=2

110

A lépés

2,03 g (8 mmól) I képletü vegyület, 1,17 g (9,6 mmól) 4hidroxi-benzaldehid és 2,73 g (9,6 mmól) trifenil-fosztin 20 ml toluollal készült 0 °C-on kevertetett oldatához 30 percen keresztül dietil-azo-dikarboxilátot adunk. Az oldatot 1 órán át kevertetjük, s közben hagyjuk a környezet hőmérsékletére melegedni. Az oldatot az oldószer mintegy felének lepárlásával betöményítjük, majd éterrel kezeljük. Ezután az oldószert vákuumban eltávolítjuk, s a maradékot szilikagélen végrehajtott kromatográfiával (oldószer: 15% etil-acetát/hexán) tisztítjuk, végül l,3g Ha étert kapunk (kitermelés: 47%) .

A 2-klór-4-hidroxi-benzaldehidet ill. a 2-hidroxi-lnaftaldehidet analóg módon kapcsoljuk az I vegyülethez, s így nyerjük a Ilb, ill. IIc étereket, 91 ill. 67%-os kitermeléssel.

B lépés

0,407 g (1,14 mmól) Ha éter 20 ml diklór-metánnal készült, szobahőmérsékleten kevertetett oldatához 8 ml trifluorecetsavat adunk. Az oldatot 6 óráig kevertetjük, majd vákuumban szárazra pároljuk, így 0,343 g Illa savat nyerünk (kitermelés: 100%). A Ilb ill. IIc éterekből analóg módon állíthatók elő 92 ill.100% kitermeléssel a Illb ill. lile képletü savak.

C lépés

Egy Merrifield féle reakcióedénybe 200 mg 1% divinil-benzollal keresztkötött, 1,1 mekv/g aminometil funkciós csoportot tartalmazó polisztirol gyantát mérünk be. A gyantát 2 ml DMFben szuszpendáljuk, majd 20 percig rázatjuk. 38 mg (2 ekv) Illa savat, 40 mg (2 ekv) 1-hidroxi-beztriazolt és 38 mg (2 ekv)

111 diizopropil-karbodiimidet adunk hozzá, és addig rázatjuk (22 óra), amíg negatív ninhidrin tesztet nem kapunk. Az oldószert kiszűrjük és a gyantát 8x10 ml diklór-metánnal mossuk.

A gyantát ismét szuszpendáljuk 5 ml diklór-metánban 15 mg Xa azonosítót adunk hozzá, és az edényt 1 óráig rázatjuk. Ezután 1 mól% Rh(TFA)₂ katalizátort adunk az elegyhez, s azt 2 óráig rázatjuk. Az oldószert szűréssel eltávolítjuk, s a gyantát 5 ml diklór-metánban reszuszpendáljuk. Egy csepp trifluor-ecetsavat adunk az edénybe, s azt 20 percig rázatjuk. Az oldószert kiszűrjük és a gyantát 8x10 ml diklór-metánnal mossuk.

Analóg módon kapcsoljuk a Illb ill. lile savakat a gyantához majd kódoljuk a megfelelő azonosítóval, azaz a Illb vegyületet a Xb, a Illa-t pedid a Xa és a Xb kódokkal. A három gyantaadagot összekeverjük, mossuk, szárítjuk.

D lépés

A száraz gyantát hét egyenként 87 mg-os adagra osztjuk, ezeket

Merrifield féle edénybe helyezzük, melyeket fűtőszálakkal burkolunk. Valamennyi edényben 10 ml toluolban szuszpendáljuk a gyantát, és 20 percig rázatjuk. Ezután mindegyik edénybe a 7 2 táblázat szerinti anilin-származékok valamelyikét adagoljuk.

112 ·· *·* *··· » • · *« • · * • »t •· · «

7-2 TÁBLÁZAT

EDÉNY	ANILIN-SZÁRMAZÉK	MENNYISÉG
1	anilin	3 ml
2	3,5-dimetil-anilin	3 ml
3	3,4,5-trimetoxi-anilin	2 g
4	4-trifluor-metil-anilin	3 ml
5	4-fenoxi-anilin	2 g
6	4-trifluor-metoxi-anilin	3 ml
7	4-ciklohexil-anilin	2 g

A fűtőszálakat 70 °C-ra melegítjük, és e hőmérsékleten rázatjuk az edényeket 18 órán keresztül. A hevítés befejezése után az oldószert szűréssel eltávolítjuk, s mindegyik gyanta-adagot 4x10 ml absz. diklór-metánnal, 10 ml éterrel, 10 ml toluollal, majd ismét 2x lo ml diklór-metánnal mossuk. Ezután az adagokat

5-5 ml diklór-metánban szuszpendáljuk, és mindegyik edénybe a megfelelő azonosítót (X_c__e 15 mg, 1. 7 - 1 táblázat), adagoljuk, az edényeket 1 óráig rázatjuk, majd midegyikbe 1 mól% Rh(TFA)_; katalizátort adagolunk, s két órán keresztül folytatjuk a rázatást.

Ezután eltávolítjuk az oldószert, és az adagokat 5-5 ml 1 csepp trifluor-ecetsavat tartalmazó diklór-metánban ismét szuszpendáljuk. Az elegyeket 20 percig rázatjuk, majd a gyantát kiszűrjük. Ezután az adagokat lx 10 ml diklór-metánnal mossuk, majd egyesítjük őket, ismét mossuk 3x 10 ml diklór-metánnal, majd vákuumban szárítjuk.

113

E lépés

A száraz gyantát ezután két egyenlő, 0,3 g-os részre osztjuk és mindegyiket egy peptid-reakcióedénybe helyezzük. Ezután 2x 10 ml diklór metánnal mossuk, majd 5-5 ml diklór-metánban reszuszpendáljuk az adagokat. Az egyik edénybe 15 mg Xf azonosítót, míg a másikba ugyanennyi Xg azonosítót teszünk. Ezután az elegyet további 1 óráig rázatjuk majd 1 mól% Rh(TFA)₂ katalizátort teszünk hozzá, és további 2 óráig rázatjuk, majd az oldószert szűréssel eltávolítjuk. Ezután mindkét gyantaadagot 3x 10 ml diklór metánnal mossuk, majd 5-5 ml diklórmetánban reszuszpendáljuk.

1-1 ml-t adagolunk a 7 - 1 táblázat szerinti megfelelő enoléterből, majd 30 percig rázatjuk őket. Mindkét edénybe 0,5 ml 5%-os diklór-metános BF₃’OEt₂ oldatot adunk, és az edényeket 24 óráig rázatjuk. Ezután a gyöngyöket további 5x lo ml DCMnal, 2x 10 ml DMF-el, 2x 10 ml metanollal, majd ismét 2x 10 ml diklór-metánnal mossuk, majd vákuumban szárítjuk.

F lépés

Abból a célból hogy a Diels-Alder könyvtár tagjainak szerkezetét meghatározzuk egy nagyobb léptékű szintézist is végrehajtottunk, hogy a termékeket spektroszkópiás analízisnek lehessen alávetni. A folyamat alapjában megegyezik a kombinatorikus könyvtárnál leírtakkal. Az A lépésben 4-hidroxibenzaldehidet kapcsoltunk a fotolabilis csoporthoz. A D lépésben anilint kondenzáltunk az aldehiddel, míg az E lépésben az enolétert 4,5-dihidro-2-metil-furánnal alakítottuk ki.

ν« *··· ···· * * · * ·· • · · · ···· · · ’··

114

A vegyület fotolízisét (F lépés) úgy hajtottuk végre, hogy 100 mg gyöngyöt szuszpendáltunk 0,3 ml DMF-ben és 16 órán keresztül UV fénnyel besugároztuk egy UVP Black Ray model UVL 56 típusú, 366 nm-en sugárzó kézi UV lámpával. A DMF-et egy oldalon pipettával eltávolítjuk, s a gyöngyöket további 2x 3ml DMF-el mossuk. Az oldatot és a mosófolyadékot egyesítjük, és az oldószert vákuumban lepároljuk. A végtermék NMR analízise szerint az a kívánt azatriciklust tartalmazza a kiindulási anyaggal összehasonlítva.

G lépés

Az érdeklődésre számot tartó gyöngyöt (vagy gyöngyöket) egyik végén leforrasztott Pyrex üvegkapillárisba helyezzük. 1 mikroliter 1M vizes cérium(IV)ammónium-nitrát oldat és acetonitril 1:1 arányú elegyét injektáljuk a csőbe, majd centrifugáljuk, így a gyöngyök végül a cső alján helyezkednek el, reagensoldattal borítva. A csőbe 2 mikroliter hexánt injektálunk, és ismét centrifugáljuk. A kapilláris nyitott végét leforrasztjuk, és 4 órára ultrahangfürdőbe helyezzük, ezután a kapillárist fordítva a centrifugába helyezzük, s ezzel a vizes réteget keresztülkényszerítjük a hexános rétegen a cső feneke felé haladtában. Ezt az extrakciós folyamatot 3-4-szer megismételjük, s végül kinyitjuk a csövet. Az 1,5 mikroliter térfogatú hexános réteget ezután injekcióstűvel egy másik, 0,2 mikroliter BSA-t tartalmazó kapillárisba visszük. A csövet leforrasztjuk és a reagesek összekeveredéséig centrifugáljuk. Ezután az oldat kb. egy mikroliteres részletét egy 0,2 mmx25 mes, metil-szilikonnal borított szilikagél töltésű kapilláris oszloppal és elektronbefogásos detektorral ellátott «* W·115 gázkromatográfba injektáljuk a címkék elkülönítése és azonosítása végett.

A mintát 200 °C-on, 25 psi hélium hordozógáz nyomás mellett visszük az oszlopra. Egy perc múlva a hőmérsékletet 20 °C/perc sebességgel 320 4-ra emeljük, a nyomást pedig 2 psi/perc sebességgel 40 psi-re. A körülményeket a következő diagram tünteti fel:

GC KÖRÜLMÉNYEK hőmérséklet

c

nyomás

perc

116

Négy véletlenül kiválasztott gyöngynél a kővetkező eredményeket kaptuk:

1. gyöngy

	DETEKÁLT CÍMKI	2
	Xf	Xe Xd Xc	Xb Xa
Ar			2-hidroxi- naftil.
R1
R2		H
R3	CH, (n=l)

2. gyöngy

—	DETEKÁLT CÍMKE
Xg	Xe Xd Xc	Xb
Ar			2-klór-4- hidroxifenil
R1
R2		H
R3	H (n=2)		II I, 1 1 ,11 ------- . _ J

3. gyöngy

		DETEKÁLT CÍMKE
	Xg	Xe Xd	Xb Xa ·
Ar			2-hidroxi- na^.^il
R1		FTCO
R2		H
R3	H (n=2)

117

4. gyöngy

	DETEKALT CÍMKE
Xf	Xe Xd	Xb
1Ar			2-klór-4- hidroxifenil
R1		F^CO
R2		H
I R3	CH? (n=l)

PÉLDA

Benzodiazepin könyvtár

A 4. példa szerinti eljárást követve kombinatorikus könyvtárat

X állítottunk elő a(XJ/képletű vegyületből

ahol:

R jelentése természetes eredetű D vagy L aminosav;

R‘ jelentése H, C_r-C₆ alkil-csoport, kis szénatomszámú alkenilcsoport, C^Cg alkil-amin, karboxi-C₁-C₆ alkil-csoport, vagy fenil-Cj.-Cg alkil-csoport, ahol a fenil-csoport szubsztituálva lehet kis szénatomszámú alkil-csoporttal, F, Cl, Br, OH, NH₂, CO₂H, vagy O-(kis szénatomszámú)alkil-csoporttal;

118

R jelentése H vagyCO

R₃ jelentése H vagyOH;

R jelentése H vagyCikázzál a feltétellel, hogy ha R₃ jelentése OH jelentése H, és ha R jelentése CO₂H R₃ jelentése H.

A könyvtár tagjai a kódolt gyöngyök sokaságáról a X képlettel ábrázolható szerkezettel szabadulnak fel, ahol

IX- jelentése az la képletü azonosítók sokasága, ahol e sokaság egy kódolt rendszert jelent;

S jelentése szubsztrát;

F -F jelentése az la képletü vegyület kapcsoló-egységének maradéka;

és az R-R⁴ szubsztituensek jelentését fentebb megadtuk.

PÉLDA

Tipikus azonosító-szintézis

A gyantához karbén formában kapcsolt diazo-vegyület jellegű azonosítók az alábbi módon szintetizálhatok:

A vegyületek általános képlete:

OMe *

119 ahol n jelentése 0-10 és

Ar jelentése pentaklór-fenol, 2,4,6-triklór-fenol,

2,4,5-triklór-fenol, vagy 2,6-diklór-4-fluor-fenol, s az alábbi módon állítottuk elő őket:

0,38 g (1,5 mmól)l-hidroxi-4-(2, 6-diklór-4-fluor-fenoxi)bután, o,228 g (1,5 mmól) metil-izovanilinát, és 0,393 g (1,5 mmól) trifenil-foszfin 8 ml THF-nal készült oldatához 0,287 g (1,7 mmól) dietil-azo-dikarboxilátot adunk. Az oldatot 36 órán át kevertetjük szobahőmérsékleten. Az oldószert vákuumban eltávolítjuk, és a maradékot szilikagélen kromatografáljuk (eluens: 20% etil-acetát/80% petroléter), végül 0,45 g (77%) aldehidet nyerünk.

100 mg (0,26 mmól) fenti aldehidet 8 ml acetonban feloldunk, és 61 mg (0,39 mmól) KMnO₄ 4 ml acetonnal készült oldatát, és 4ml vizet adunk hozzá, és a reakcióelegyet 13 órán át szobahőmérsékleten kevertetjük. Ezután az elegyet 100 ml etilacetáttal és 50 ml vízzel hígítjuk, es a rétegeket szétválasztjuk. A vizes réteget további 2x 100 ml etilacetáttal kirázzuk. Az egyesített szerves rétegeket 50 ml vízzel mossuk, majd magnézium-szulfát felett szárítjuk. Az oldószer eltávolítása után 109 mg (93%) benzoesav-származékot kapunk.

A fenti sav 76 mg (o,188 mmól) 2 ml metilén-kloriddal készült oldatához 36 mg (0,28 mmól) oxaloil-kloridot,és katalitikus mennyiségű DMF-et adunk. 10 perces szobahőmérsékletű kevertetés után lassú, állandó gázfejlödés észlelhető. A keverést 2 órán

120 keresztül folytatjuk, majd az oldatot 15 ml diklór-metánnal hígítjuk, és 5 ml telített vizes nátrium-hidrogén-karbonáttal mossuk. A rétegeket elválasztjuk, a szerves réteget nátriumszulfát felett szárítjuk, s az oldószer lepárlása után halványsárga kristályok formájában kapjuk a benzoil-kloridszármazékot.

Ezt 5 ml metilén-kloridban feloldjuk, és éteres diazometán -78 °C-on kevertetett oldatához adjuk. A hűtöfürdöt hagyjuk felmelegedni, s az elegyet 5 órán át kevertetjük szobahőmérsékleten. Az oldószert és a fölös diazometánt vákuumban lepároljuk, s a maradékot szilikagélen kromatografáljuk, gradiens elúciót alkalmazva (10-40% etilacetát/hexán), végül 48 mg (60%) diazo-vegyületet nyerünk.

Egy másik, példa szerinti vegyület szintézise:

0,729 g (4,0 mmól) metil-vanilátot, 1,634 g (4,8 mmól) 1hidroxi-9-(2,3,4,5,6-pentaklór-fenoxi)nonánt, és 1,259 g (4,8 mmól) trifenil-foszfint felodunk 20 ml absz. toluolban. 0,76 ml (0,836 g, 4,8 mmól) DEAD-t adagolunk cseppenként az elegyhez, és azt 25 °C-on 1 óráig kevertetjük. Az oldatot felére betöményítjük, és flash-kromatográfiával tisztítjuk (eluens: diklór-metán), 1,0 g (1,7 mmól, 43%) fehér kristályos terméket nyerünk.

1,0 g (1,7 mmól) fenti metil-észtert feloldunk 50 ml THF-ben, ml vizet, majd 1,2 g (50 mmól) lítium hidroxidot adunk hozzá. Az elegyet 25 °C-on 1 óra hosszat keverjük, majd 5 órán keresztül refluxoltatjuk. Az elegyet 25 °C-ra hűtjük, majd

121

200 ml etil-acetátra öntjük, s ezután 3x 50 ml 1 M HCl-dal, majd lx 50 ml telített vizes konyhasóoldattal mossuk, s végül nátrium-szulfát felett szárítjuk. Az oldószert eltávolítjuk, és a nyers savat toluollal egyszer azeotroposan desztilláljuk.

A fenti nyersterméket 100 ml toluolban oldjuk. 10 ml (1,63 g , 14 mmól) tionil-kloridot adunk hozzá, és az elegyet 90 percig refluxoltatjuk. Az oldószer lepárlásával az oldat térfogatát kb. 30 ml-re csökkentjük, majd a maradék toluolt vákuumban elpárolgtat juk. A szennyezett sav-k'loridot 20 ml száraz diklórmetánban oldjuk, és argon atmoszférában -78 °C-ra hűtjük, és kb. 10 mmól diazometán 50 ml absz. éterrel készült oldatát adjuk hozzá. Az elegyet szobahőmérsékletre melegítjük, és 90 percig kevertetjük. Az oldaton 10 percig argont buborékoltatunk keresztül, majd az oldószert lepároljuk, és a szennyezett anyagot flash-kromatográfiával (eluens: 10-20% etilacetát/hexán) tisztítjuk. 0,85 g (1,4 mmól, 82%-os kitermelés a három lépésre vetítve) halványsárga szilárd diazoketont nyerünk.

A fenti módon a következő azonosítókat állítottuk elő:

Fotolabilis hasítás

50, az alábbi képletnek megfelelő azonosítót szintetizáltunk:

HO

Ar

122

ahol

Ar jelentése:

Cl

Cl

Cl Cl Cl

I típusú oxidativ hasítás alábbi képletű azonosítót állítottunk elő:

ahol

och₃ — Ar

Ar jelentése:

Cl

Cl és n jelentése 4, 5, 6, 7, 8,

9, és 10.

II típusú oxidativ hasítás alábbi képletű azonosítót állítottunk elő:

n

*« ··9 « ··* *

123 ahol

Ar jelentése:

és n jelentése 1, 2, 3, és ahol

3Ar jelentése:

és n jelentése 0, 3, és

	Cl |
Cl.
Cl'	Cl
4, 5,	6, 7, 8, 9, és 10;
F.	^ci
	A
9.	Cl

A fenti leírásból nyilvánvaló, hogy a találmány egy hajlékony és egyszerű módszert ír le a vegyületek azonosítására olyan körülmények között, amikor a jelenlévő vegyületek csekély mennyisége eleve kizárja, hogy reakció-törtenetükröl közvetlenül korrekt információkat lehessen szerezni. A módszer lehetővé teszi, hogy igen nagyszámú különböző vegyületet állítsunk elő, amelyeket különböző vizsgálati technikákkal tesztelhetünk az érdeklődésre számot tartó tulajdonságok szempontjából. A szintézis körülményei között inért címkék alkalmazása lehetővé teszi, hogy a termékek szintézisére a legváltozatosabb körülményeket alkalmazhassuk, a címkék könnyen szintetizálhatok, és analizálhatóságuk miatt a termékek összetétele pontosan meghatározható.

•« ««·<···« * • · · · · · • · · • · · · ···· 4 · ···

124

A bejelentésben idézett más bejelentések ill. publikációk pusztán hivatkozásul szolgálnak.

A felsorolt példák és illusztrációk csupán a könnyebb megértést szolgálták, a szakmában járatos személy számára nyilvánvaló, hogy a leirt módszerekben számos változtatás ill. módosítás elképzelhető, az igényelt oltalmi körön belül maradva.

• ·w· ·· ·«

125

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (68)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás nagyszámú egyedi szilárd hordozón végbemenő reakciósorozatok reakció-történetének rögzítésére, amely reakciósorozatok legalább két, eltérő ágenseket, ill. reakciókörülményeket igénylő reakciólépésből állnak, a fenti hordozókon számos változást, valamint a különböző egyedi szilárd hordozókon nagyszámú különböző végterméket eredményeznek, azonosítók kombinációját alkalmazva a reakciók történetének rögzítésére, amely azonosítók meghatározzák a választott ágenst, reakciókörülményeket, ill. a reakciólépést, és egyaránt analizálhatók a reakciólépésre ill. a választásra vonatkozóan, azzal jellemezve, hogy a fenti reakciósorozatok első vagy átmeneti lépésében különböző ágenseket reagáltatunk, ill. különböző reakciókörülményeket alkalmazunk az egyedi szilárd hordozók mindegyik csoportjára nézve, amely csoportok legalább egy szilárd hordozó-részecskét, valamint azonosítók kombinációját tartalmazzák, amely kombináció meghatározza a választott ágenst, ill. a reakciólépést a fenti reakciósorozatban az adott csoportra vonatkoztatva, s mindegyik azonosító közvetlenül, ill. egy másik, eltérő azonosítón keresztül kötődik a hordozóhoz;

   a csoportokat összekeverjük, majd a nagyszámú egyedi szilárd hordozót számos csoportba osztjuk egy következő átmeneti ill. végső lépéshez, és

   126 a fenti folyamatot legalább egyszer megismételve, végtermékek sokaságát nyerjük, különbözöeket a különböző egyedi szilárd hordozórészecskéken.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy legalább 100 egyedi szilárd hordozót, és legalább 2 csoportot alkalmazunk mindegyik reakcióban.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy kiegészítő lépésként magában foglalja az egyedi szilárd hordozókhoz kötött végtermékek analízisét az érdeklődésre számot tartó tulajdonságok szempontjából, valamint legalább egy ilyennek bizonyult végtermék esetében a reakció-történet meghatározását.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a végterméket lehasítjuk a szilárd hordozóról, s azután teszteljük a 3. igénypont szerinti módon.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az azonosítókat akként kezeljük hogy a címke-vegyületeket lehasítjuk a szilárd hordozóról, és olyan reagenseket kapcsolunk hozzájuk amelyek lehetővé teszik a fluoreszcens, ill. elektronbefogásos detektálást.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a lehasítást fotokémiai ill. oxidatív úton végezzük, és a detektálható csoport danzil-származék, ill. polihalogénzett-benzoil-haloid.

   127
7. 7. Az 5. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a cimke-vegyületekeknek két jellemzőjük van, melyek közül az egyik az elkülönítést, míg a másik a detektálást teszi lehetővé.
8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a detektálást lehetővé tevő jellemző elektronbefogásos detektálást tesz lehetővé.
9. 9. A 7. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a detektálást lehetővé tevő jellemző tömegspektroszkópiás detektálást tesz lehetővé.
10. 10. A 7. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a detektálást lehetővé tevő jellemző a radioaktivitás.
11. 11. A 7. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a detektálást lehetővé tevő jellemző a fluoreszcencia.
12. 12. A 7. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a címkéket kromatográfiás úton választjuk szét.
13. 13. Készlet, amely számos különböző elkülönített szerves vegyületet tartalmaz, melyek mindegyike megkülönböztethető összetétellel jellemezhető, legalább 1 bit különböző információval kódolva, amely fizikai mérésekkel meghatározható, és legalább egy közös funkciós csoportot tartalmaznak.

    128
14. 14. A 13. igénypont szerinti készlet azzal jellemezve, hogy legalább 4 különböző szerves vegyületet tartalmaz.
15. 15. A 13 igénypont szerinti készlet azzal jellemezve, hogy a szerves vegyületek képlete az alábbi:

    F^FZ-C-E-C'

    1 2 ahol F -F jelentése kapcsolóegység amely lehetővé teszi a hordozórészecskékhez való kapcsolódást, ill. az arról való lehasitást; és C-E-C'jelentése egy címke, amely fizikai mérésekkel meghatározható.
16. 16. A 15. igénypont szerinti készlet azzal jellemezve, hogy a szerves vegyületek a bennük lévő metilén-csoportok, és/vagy halogén-, nitrogén-, ill. kénatomok számában különböznek egymástól.
17. 17. A 15. igénypont szerinti készlet azzal jellemezve, hogy a

    C-E-C'csoport fotokémiailag távolítható el.
18. 18. 17. A 15. igénypont szerinti készlet azzal jellemezve, hogy a C-E-C'csoport oxidatív, hidrolitikus, termolitikus, ill. reduktív lehasításssal távolítható el.
19. 19. Szilárd hordozó, azzal jellemezve, hogy egy ligandum, valamint azonosítók kombinácója van hozzá kötve.
20. 20. A 19. igénypont szerinti szilárd hordozó, azzal jellemezve, hogy a ligandum egy oligomer, amely lehet oligopeptid, oligonukleotid, oligoszacharid, polilipid, poliészter, poliamid, poliuretán, polikarbamid, poliéter,

    129 poli-(foszforvegyület), ami lehet foszfát, foszfonát, foszforamid, foszfonamidát, foszfit, vagy foszfinamid, poli(kénvegyület), ami lehet szulfon, szulfonát, szulfát, szulfonamid, vagy szulfénamid, ahol a foszfor-, ill. kénszármazékoknál a heteroatom kötődhet C, Η, N, ill. 0 atomhoz, ill. ezek kombinációi.
21. 21. A 19. igénypont szerinti szilárd hordozó, azzal jellemezve, hogy a ligandum nem oligomer hanem alkilcsoport, heterciklusos-csoport, alifás-csoport, aliciklusos-csoport, aromás-csoport, ill. ezek kombinációi.
22. 22. A 21. igénypont szerinti szilárd hordozó, azzal jellemezve, hogy a nem oligomer ligandum egy diazabiciklusos, azatriciklusos, ill. elágazó láncú amidvegyület.
23. 23. A 19. igénypont szerinti szilárd hordozó, azzal jellemezve, hogy a ligandum a hordozóhoz egy nem-labilis kapcsolóegységen keresztül kapcsolódik.
24. 24. A 19. igénypont szerinti szilárd hordozó, azzal jellemezve, hogy a ligandum a hordozóhoz egy lehasitható kapcsolóegységen keresztül kapcsolódik.
25. 25. A 19. igénypont szerinti szilárd hordozó, azzal jellemezve, hogy azonosító címkéket tartalmaz, amelyek

    130 lehetnek radioizotópok, haloalkil-, ill. halo-aril-alkil tartalmú vegyületek.
26. 26. A 19. igénypont szerinti szilárd hordozó, azzal jellemezve, hogy kb. 10-2000 mikrométer átmérőjű gyöngyökből áll, és az azonosítók olyan címkekomponenseket tartalmaznak, amelyek a gyöngyökről való lehasítás után elektronbefogásos detektálással felszerelt gáz- ill. folyadék-kromatográfiával, tömegspektroszkópiával, fluoreszcens, ill. atom-emissziós technikákkal különíthetők el.
27. 27. Egy könyvtár amely a 22. igénypont szerinti hordozók soksaságat tartalmazza.
28. 28. A 27. igénypont szerinti könyvtár azzal jellemezve, hogy a végtermékek le vannak hasítva a szilárd hordozóról.
29. 29. A 27. igénypont szerinti könyvtár azzal jellemezve, hogy a végtermékek diaza-biciklusos, azatriciklusos, ill. elágazó láncú amid-vegyületek.
30. 30. Eljárás az erdeklődesre számot tartó tulajdonságokkal bíró vegyületek meghatározására, azzal jelemezve, hogy egy 27. igénypont szerinti könyvtárt tesztelünk.
31. 31. A 30. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a vegyületek le vannak hasítva a szilárd hordozóról.

    131
32. 32. A 31. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a vegyületek diaza-biciklusos, azatriciklusos, ill. elágazó láncú amidvegyületek.
33. 33. Eljárás ligandum előállítására, azzal jellemezve, hogy a reakciósorozatok reakció-történetét rögzítő módszert alkalmazunk a nagyszámú egyedi szilárd hordozón végbemenő különböző reakciósorozatok mindegyikénél, ahol a fenti reakciósorozatok legalább két, különböző ágenseket, és/vagy reakciókörülményeket igénylő reakciólépést tartalmaznak, amelyek különböző módosításokat eredményeznek a nagyszámú egyedi szilárd hordozón, ill. nagyszámú különböző végterméket eredményeznek a fenti hordozókhoz kapcsolva, azonosítók kombinációit alkalmazva a fenti reakciósorozatok történetének rögzítésére, amely azonosítókra jellemző, hogy segítségükkel meghatározható az ágens ill. reakciókörülmények választása, ill. a fenti sorozatbéli reakciólépés, és az alábbi módszer szerint analizálhatók a választás, ill. a reakciólépés szempontj ából:

    a fenti sorozatok egy első, ill. átmeneti lépésében különböző ágenseket reagáltatunk, ill. különböző reakciókörülményeket alkalmazunk a fenti egyedi szilárd hordozók mindegyik csoportjánál, amely csoportok legalább egy fenti egyedi szilárd hordozót tartalmaznak, és azonosítók kombinációit, amely kombinációk meghatározzák az ágens-választást, ill. a reakciólépést a fenti sorozatokban, mivel mindegyik fenti egyedi szilárd hordozó

    132 csoporthoz közvetlenül ill. egy másik, különböző azonosítón keresztül kötve van egy fenti azonosító; a fenti csoportokat összekeverjük, és egy másik közbülső, ill. végső lépéshez az egyedi szilárd hordozókat ismét számos csoportra osztjuk;

    a fenti reakciósorozatot legalább egyszer megismételve számos különböző terméket nyerünk, különbözöeket a különböző egyedi szilárd hordozókon; és a reakciótörténetet legalább egy kiválasztott egyedi szilárd hordozón meghatározzuk.
34. 34. A 33. igénypont szerinti ligandum azzal jellemezve, hogy az azonosítás magában foglalja a ligandum tesztelését egy érdeklődésre számot tartó tulajdonság szemponjából.
35. 35. Eljárás ligandum előállítására, azzal jellemezve, hogy a reakciósorozatok reakció-történetét rögzítő módszert alkalmazunk a nagyszámú egyedi szilárd felületeken végbemenő különböző reakciósorozatok mindegyikénél, ahol a fenti reakciósorozatok legalább két, különböző ágenseket, és/vagy reakciókörülményeket igénylő reakciólépést tartalmaznak, amelyek különböző módosításokat eredményeznek a nagyszámú egyedi szilárd felületen ill. nagyszámú különböző ligandumot eredményeznek a fenti felületekhez kapcsolva, azonosítók kombinációit alkalmazva a fenti reakciósorozatok történetének rögzítésére, amely kombinációkra jellemző, hogy segítségükkel meghatározható az ágens és/vagy reakciókörülmények választása, ill. a fenti sorozatbéli reakciólépés, és az alábbi módszer

    133 szerint analizálhatók a választás, il. a reakciólépés szempontjából:

    a fenti sorozatok egy első, ill. átmeneti lépésében különböző ágenseket reagáltatunk, és/vagy különböző reakciókörülményeket alkalmazunk a fenti egyedi szilárd felületek mindegyik csoportjánál, amely csoportok legalább egy fenti egyedi szilárd felületet tartalmaznak, és azonosítók kombinációi, amely kombinációk meghatározzák az ágens-választást, és/vagy a reakciólépést a fenti sorozatokban, mivel mindegyik fenti egyedi szilárd felület-csoporthoz egy másik, különböző azonosítón keresztül lehasítható kapcsolóegységgel kötve van egy fenti azonosító;

    a fenti csoportokat összekeverjük, és egy másik közbülső, ill. végső lépéshez az egyedi szilárd felületeket ismét számos csoportra osztjuk;

    a fenti reakciósorozatot megismételve számos különböző ligandumot nyerünk, különbözöeket a különböző egyedi szilárd hordozókon; számos fenti egyedi szilárd felületen teszteljük a ligandumokat egy érdeklődésre számot tartó tulajdonság szemponjából; és a reakció-történetet legalább egy kiválasztott egyedi szilárd felületen, amely egy érdeklődésre számot tartó tulajdonsággal rendelkezik, a címkéknek a fenti egyedi szilárd felületről való lehasításával, és a fenti címkék különböző jellemzőkön keresztül való meghatározásával meghatározzuk.
36. 36. A 35. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a címkék egy homológ sorozat különböző tagjai, és

    134 detektálásuk elektronbefogásos érzékeléssel kombinált gázkromatográfiával, ill. tömegspektroszkópiával történik.
37. 37. Az (I) képletü vegyület:

    f¹-f²-c-e-c ’ I ahol F -F jelentése kapcsolóegység, amely lehetővé teszi a hordozórészecskékhez való kapcsolódást, ill. az arról való ill. lehasitást; és C-E-C'jelentése egy címke, amely analizálható;

    E egy címke-komponens, amely detektálható, ill. különböző szubsztitúciók eredményeként lehetővé teszi a detektálást, il. a szétválasztást;

    C és C' címke-komponensek, amelyek lehetővé teszik az egyedi deteküálást;

    F^ kapcsolóegység, amely szelektíven lehasítható a címkekomponensekről; és

    F¹ funkciós csoport, amely a vegyület készséges kapcsolódását teszi lehetővé a szintézis-hordozóhoz.
38. 38. A 37. igénypont szerinti, alábbi képletü vegyület:

    F^L-F²-[ C(E-C' ) J _b ahol:

    F¹ jelentése

    COjH, ch₂x, nr’r¹, C(O)R\ S(O₂)C1, S(O₂)CHN₂, n₃, no₂, C(O)X, NCO, vagy NCS;

    F² jelentése

    OH, CHN₂, SH,

    NO, S(O₂)N₃,

    C (0)chn₂,

    OC(0)x,

    A^- — SiíR¹ )₂λ— — Si(R* )ö—

    A— továbbá!

    135

    -NC(O)O-. CR¹—— crÍ-ÍCR'^— . __CR.---_CRi--_C(r1) — Si(CH₃Jf-(CE'₂)j·

    R (CB’₂ )₂ λ — S—C(r‘)₂ λ — CtZlR¹--C(R¹)₂ A— — C(OH)

    C(R^l)jA—.

    — C(0H)R — C(CH₂X)5 — — C(OS)íb— CíR^z—CCXJR¹ .

    — CfOHXCHnCHjX)—

    136 továbbá F² jelentése lehet még:

    azzal a feltétellel, hogy ha F jelentése kötés, A jelentése OH vagy COOH;

    A jelentése-O, -0C(0)0-, -0C(0)~, vagy -NHC(O)-;

    C jelentése kötés, C₁-C₂₀ alkilén-csoport, ami szubsztituálva lehet 1-40 darab F, Cl, Br, C_L-C., alkoxi-, -NR⁴R⁴, -OR⁴, vagy -NR⁴, vagy

    -{ [ C (R⁴) 2] m-Y-Z-Y-[ C (R⁴) 2] _nY-Z-Y} _p- csoporttal; azzal a feltétellel, hogy a szénatomok maximális száma C+C' esetében 20;

    C'jelentése H; F; Cl; C_L-C₂₀ alkilén-csoport, ami szubsztituálva lehet 1-40 darab F, Cl, Br, C_L-C_S alkoxi-, -NR⁴R⁴, -OR⁴, vagy -NR⁴, vagy

    -{ [ C (R⁴) 2] m-Y-Z-Y-[ C (R⁴) 2] _nY-Z-Y} p— csoporttal; azzal a feltétellel, hogy a szénatomok maximális száma C+C' esetében 20;

    E jelentése C,-C,_c alkil-csoport ami 1-20 F, Cl vagy Br atommal van szubsztituálva; Q-aril csoport, ahol az aril csoport 1-7 F, Cl, -NO₂, -SO₂R^O csoporttal van

    137 szubsztituálva, vagy 1-5 F, Cl, -N0₂, -S0₂R⁵ csoporttal szubsztituált fenil-csoport;

    E-C' lehet -H, -OH, vagy amino-csoport ;

    R¹ jelentése H vagy C_T-C₆ alkil-csoport;

    R³ jelentése -C=O, -C(O)O, -C^NR¹, -S, -SO, vagy -S0₂ csoport;

    R jelentése H vagy C_L-C₆ alkil-csoport;

    R⁵ jelentése C,_t-Cg alkil-csoport;

    a jelentése 1-5;

    b jelentése 1-3;

    m és n mindegyikének jelentése 0-20;

    p jelentése 1-7;

    Q jelentése kötés, -0, -S, -NR⁴, -C=O, -C(O)NR⁵, -NR⁵C(O)-, —C(0)0 —, vagy -OC (0)0R⁵-csoport;

    X jelentése távozó csoport, mint Br, Cl, triflát, mezilát, tozilát vagy -OC (0) 0R^S-csoport;

    Y jelentese kötés, -0, -S, vagy NR -csoport;

    Z jelentése kötés; fenil-csoport, ami szubsztituálva lehet

    1-4 F, Cl, Br, atommal A-Cg alkil-csoport, ami szubsztituálva lehet 1-13 F vagy Cl atommal vagy C_x-C₆ alkoxi-csoport, ami szubsztituálva lehet 1-13 F, Cl, vagy Br atommal; -{ C (R⁴) 2} 1_2o^_csoP^ort; vagy - (CF2)-^o-csoport; azzal a feltétellel, hogy amikor Z jelentése kötés, a vele szomszédos Y' csoportok közül az egyik szintén kötés, és az aril-csoport mono- vagy biciklusos aromás gyűrű legfeljebb 10 szénatommal, ill. legfeljebb 2 heteroatommal az alábbiak közül: 0, S, és N.
39. 39. Egy 38. igénypont szerinti vegyület azzal jellemezve, hogy

    138

    F^l j elentése:

    CH₂X

    CO₂H. OE. CHN₂. C(O)CHN₂. C(O)X. NCS. vagy

    A— A

    C és C' jelentése egymástól függetlenül C^C^ alkiléncsoport, ami szubsztituálva lehet 1-40 darab F il. Cl atommal vagy -[ 0-(CH₂) 2-3] _p-csoporttal ;

    E jelentése C₁₀ alkil-csoport ami 1-20 F, vagy Cl atommal van szubsztituálva; Q-aril csoport, ahol az arilcsoport egy bciklusos aromás gyűrű, ami 1-7 F, vagy Cl, atommal van szubsztituálva; vagy 1-5 F, Cl, -N0₂, vagy SO₂R⁵ csoporttal szubsztituált Q-fenil csoport; és

    Q jelentése kötés, 0, -NR⁵C(O)- , vagy -OC (0)-csoport.

    139
40. 40 .

    Egy 38. igénypont szerinti vegyület melynek képlete az alábbi:

    neo

    VAGY

    140 ahol Ar jelentése pentafluor-, pentaklór- vagy pentbrómfenil-csoport, 2,3,5,6-tetrafluor-4(2,3,4,5,6-pentafluorfenil)fenil, 2,4,6-triklórfenil, 2,4,5-triklórfenil, 2,6diklór-4-fluor-fenil, vagy 2,3,5,6-tetrafluor-fenil.
41. 41. Egy 38. igénypont szerinti vegyület ahol

    E-C' jelentése H, OH, vagy NH₂.
42. 42. Az alábbi képletű kompozíció:

    S-F^r-F²-C-E-C' ahol:

    S jelentése egy oldható vagy szilárd hordozó;

    C-E-C' jelentése analizálható címke,

    E jelentése címke-komponens amely (a) lehetővé teszi a detektálást, mint egy gázkromatográfiával ill. tömegspektroszkópiával analizálható elektrofór csoport, vagy (b) lehetővé teszi a detektálást, és az elkülönítést is, a különböző szubsztitúciók segítségével;

    C és C' címke-komponensek, amelyek lehetővé teszik egy címkének az összes többitöl való megkülönböztetését, ahol az elkülönítés általában különböző lánchosszak, ill. szubsztitúciók segítségével hajtható végre, amelyek eredményeképp módosul a kromatográfiás retenciós idő, il. a tömegspektroszkópiás Z/e arány;

    F jelentése kapcsolóegység, amely szelektíven hasítható a címke felszabadításának céljából; és

    141

    F¹' jelentése funkciós csoport, amely a hordozóhoz való kapcsolódást ill. az arról való lehasítást teszi lehetővé.
43. 43. A 42. igénypont szerinti kompozíció, ahol:

    S jelentése egy kapilláris, üreges rost, tű, szilárd rost, cellulóz-gyöngy, porózus üveggyöngy, szilikagél, polisztirol gyöngy, ami divinil-benzollal keresztkötött lehet, ojtott kopolimer-gyöngy, poli-akril-amid gyöngy, latex-gyöngy, dimetil-akril-amid gyöngy, ami Ν,Ν'-biszakriloí1-etilén-díaminnal keresztkötött lehet, hidrofób polimerrel borított üvegrészecskék, vagy alacsony molekulatömegű, nem-keresztkötött polisztirol;

    és

    1 ' 2

    F -F -C-E-C' az (I) képletű vegyület S-hez kapcsolódó maradéka.
44. 44. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az azonosítók kombinációja egy bináris kódrendszert határoz meg.
45. 45. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az azonosítók a 37. igénypont szerintiek.
46. 46. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az azonosítók a 38. igénypont szerintiek.
47. 47. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az azonosítók a 39. igénypont szerintiek.

    • * · «

    142
48. 48. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az azonosítók a 41. igénypont szerintiek.
49. 49. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy magában foglalja a címkéknek az egyedi szilárd hordozókról való lehasítását is.
50. 50. A 49. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a címkéket fotokémiai-, oxidatív-, hidrolitikus-, termolitikus-, ill. reduktív úton hasítjuk le.
51. 51. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy magában foglalja a nem-oligomer ligandumoknak a fenti egyedi szilárd hordozóról való lehasítását is.
52. 52. Az alábbi képletű vegyület:

    ahol:

    P jelentése polisztirol gyanta;

    IX_a__f jelentése az alábbi általános képletű csoport:

    • · · * · 9 *

    143 ahol : η jelentése 1-6

    R jelentése ch₃, ch(ch₃)₂, ch₂co₂h, (ch₂)₄nh₂, ch₂-c₆h₄-oh, vagy CH₂C₆H₅; és

    R' jelentése CH₂CH=CH₂, vagy CH₂C_SH₅ .
53. 53. Eljárás vegyületek előállítására akként, hogy ezek szerkezete könnyen meghatározható legyen, azzal jellemezve, hogy a vegyületeket egy szilárd hordozó felületén szintetizáljuk olyan körülmények között, hogy a szintézis végrehajtása során számos azonosítót kötünk a szilárd hordozóhoz, amelyek kódolják a szintézis során lezajlott reakciólépéseket.
54. 54. Eljárás vegyulet-könyvtárak előállítására akként, hogy azok mindegyik tagjának szerkezete könnyen meghatározható legyen, azzal jellemezve, hogy valamennyi vegyületet egy egyedi szilárd hordozó felületén szintetizáljuk olyan körülmények között, hogy mindegyik ilyen hordozóhoz a szintézis végrehajtása során számos azonosítót kötünk, amelyek kódolják a hordozókhoz kötött vegyületek szintézise során lezajlott reakciólépéseket.

    9 9 ···>» ·♦♦· ·· ····

    144
55. 55. Eljárás vegyületek szerkezetének meghatározására, azzal jellemezve, hogy az 53. ill. 54. igénypont szerint előállított vegyületek esetében a szilárd hordozót elkülönítjük, majd lehasítással felszabadítjuk róla a címke-komponenseket, s valamennyi ilyen komponens szerkezetét és/vagy mennyiségét meghatározzuk, s ebből levezetjük az adót vegyületek szerkezetét.
56. 56. Eljárás egy kívánt tulajdonsággal bíró vegyület azonosítására, azzal jellemezve, hogy egy 54. igénypont szerinti eljárással előállított vegyület-könyvtár valamennyi tagját elkülönítve teszteljük egy olyan módszer segítségével, mellyel a kívánt sajátságot mutató vegyületek azonosíthatók, akár ha csak egy is van közülük a könyvtár tagjai között.
57. 57. Az 56. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az azonosított vegyületek szerkezetének meghatározását is magában foglalja.
58. 58. Vegyület-könyvtár, melynek minden tagja egy egyedi szilárd hordozóhoz van kötve, és minden ilyen hordozóhoz számos azonosító is kapcsolódik, amelyek kódolják a hordozóhoz kötött vegyületek szintézise során lezajlott reakciólépéseket.
59. 59. Az 58. igénypont szerinti könyvtár azzal jellemezve, hogy tagjai diaza-biciklusos vegyületek.

    «V ···· 1·*·

    145
60. 60. Az 58. igénypont szerinti könyvtár azzal jellemezve, hogy azatriciklusos vegyületek.
61. 61. Az 58. igénypont szerinti könyvtár azzal jellemezve, hogy tagjai elágazó láncú amid-vegyületek.
62. 62. Az 58. igénypont szerinti könyvtár azzal jellemezve, hogy tagjai peptidek.
63. 63. Eljárás egy kívánt tulajdonsággal bíró vegyület azonosítására, azzal jellemezve, hogy egy 571 igénypont szerinti eljárással előállított vegyület-könyvtárat olyan módszerrel vizsgálunk, amely azonosítja a kívánt tulajdonsággal bíró vegyületeket, s így mindegyik vegyület azonosítható amely a könyvtárban a kívánt tulajdonsággal rendelkezik.
64. 64. A 63. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az azonosított vegyület szerkezetének meghatározását is magában foglalja.
65. 65. Egy a 62. igénypont szerinti eljárással azonosított vegyület.
66. 66. A 63. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kívánt tulajdonság a humán neurokinin 1/bradikinin receptorral szembeni antagonizmus, a könyvtár pedig azatriciklusos vegyületeket tartalmaz.

    ·η· ··*· • · » * ·· • * · ·

    9 W · · «·»· 9 · ···

    146
67. 67. A 63. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kívánt tulajdonság az izomrelaxánsként, trankvillánsként, ill. nyugtatóként való alkalmazhatóság, a könyvtár pedig benzodiazepineket tartalmaz.
68. 68. A 63. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kívánt tulajdonság a magas vérnyomás, ill. a Raynaud szindróma kezelésében való alkalmazhatóság, a könyvtár pedig elágazó láncú amidokat tartalmaz.