HUP0302378A2

HUP0302378A2 - Anti-IL-12 ellenanyagok, készítmények, eljárások és alkalmazások

Info

Publication number: HUP0302378A2
Application number: HU0302378A
Authority: HU
Inventors: Jill Giles-Komar; David M. Knight; David Peritt; Bernard Scallon; David Shealy
Original assignee: Centocor, Inc.
Priority date: 2000-08-07
Filing date: 2001-08-07
Publication date: 2003-10-28
Also published as: NO2011023I1; EP3178934B1; LT3178934T; CY1122505T1; JP2011173884A; JP2015061835A; KR100823576B1; LTPA2020001I1; NZ524145A; JP6076303B2; PL360258A1; NO330903B1; MEP44408A; US7560247B2; US11078267B2; EP2090657B1; EA006673B1; CY2020003I2; LTC1309692I2; CY1109149T1

Abstract

A találmány tárgyát képezi legalább egy anti-IL-12 ellenanyag, alegalább egy anti-IL-12 ellenanyagot kódoló nukleinsavak, IL-12,vektorok, gazdasejtek, transzgenikus állatok vagy növények, éseljárások azok előállítására és alkalmazására, ideértve terápiáskészítményeket, eljárásokat és eszközöket. Ó

Description

KÖZZÉTÉTELI

PÉLDÁNY - 2 ::í í <?

Anti-IL-12 ellenanyagok, készítmények, eljárások és alkalmazások

Ez a bejelentés részben a 2000. augusztus 7-én benyújtott, 60/223 358. számú, és a 2000. szeptember 29-én benyújtott, 60/236 827. számú amerikai egyesült államokbeli 5 ideiglenes bejelentésen alapul, és azok elsőbbségét igényli, amelyek mindegyike teljes mértékben hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.

A találmány tárgyát ellenanyagok képezik - beleértve specifikus részleteket és variánsokat - legalább egy interleukin-12 (IL-12) fehérje vagy annak fragmense ellen, valamint ilyen anti-IL-12 ellenanyagokat kódoló nukleinsavak, komplementer nukleinsavak, 10 vektorok, gazdasejtek, és eljárások azok előállítására és alkalmazására, beleértve terápiás készítményeket, a beadásukat és eszközöket.

Az interleukin-12 (IL-12) egy heterodimer citokin, amely diszulfid híddal összekötött, 35 és 40 kDa méretű glikozilált polipeptidláncokból áll. A citokint antigénprezentáló sejtek, köztük dendrikus sejtek, monociták, makrofágok, B-sejtek, Langerhans-sejek és keratinociták, 15 valamint természetes ölősejtek (NK sejtek) szintetizálják és szekretálják. Az IL-12 számos biológiai folyamatot közvetít, és úgy is nevezték, hogy NK-sejt stimuláló faktor (NKSF), Tsejt stimuláló faktor, citotoxikus T-limfocita maturációs faktor és EBV-transzformált Bsejtvonal faktor [Curfs, J.H.A.J. és mtsai., Clinical Microbiology Reviews, 10, 742-780. old. (1997)].

Az interleukin-12 képes kötődni a sejtek (például T-sejtek, NK-sejtek) plazmamembránján expresszálódó IL-12-receptorhoz, és ezáltal megváltoztat (például iniciál, megakadályoz) biológiai folyamatokat. Például az IL-12 kötődése IL-12-receptorhoz stimulálhatja előaktivált T-sejtek és NK-sejtek proliferációját, fokozhatja citotoxikus T-sejtek (CTL), NK-sejtek és LAK (limfokin-aktivált ölő) sejtek citotoxikus aktivitását, indukálhatja 25 gamma-interferon (IFN-γ) T-sejtek általi és NK-sejtek általi termelését, és indukálhatja naiv ThO-sejtek Th 1-sejtekké történő differenciációját, amelyek IFN-y-t és IL-12-t termelnek [Trinchieri, G., Annual Review of Immunology, 13, 251-276. old. (1995)]. Közelebbről az IL12 létfontosságú citolitikus sejtek (például NK-sejtek, CTL) létrehozásában, és sejtes immunválasz (például Thl-sejtek által közvetített immunválasz) kialakításában.. Az IL-12 30 kritikus fontosságú mind a védő immunitás (például fertőzések megszüntetése), mind a patológiás immunválaszok (például autoimmunitás) kialakításában és szabályozásában [Hendrzak, J. A. és Brunda, Μ. I, Laboratory Investigation 72, 619-637. old. (1995)]. Ennek megfelelően egy immunválasz (például védő vagy patogén) fokozható, szuppresszálható vagy

-2megelőzhető IL-12 biológiai aktivitásának in vivő, például ellenanyag útján történő manipulálásával.

Nem-humán emlős, kiméra, poliklonális (például antiszérumok) és/vagy monoklonális ellenanyagok (Mabs) és fragmensek (például azok proteolitikus emésztési vagy fúziós fehérje termékei) potenciális terápiás ágensek, amelyeket tanulmányoznak bizonyos esetekben bizonyos betegségek kezelésének megpróbálására. Azonban az ilyen ellenanyagok vagy fragmensek immunválaszt válthatnak ki, amikor beadják azokat embereknek. Az ilyen immunválasz az ellenanyagok vagy fragmensek immunkomplex által közvetített kiürítését eredményezheti a keringésből, és az ismételt beadást alkalmatlanná teheti terápiás célra, ezáltal csökkentve a páciensre gyakorolt jótékony terápiás hatást, és korlátozhatja az ellenanyag vagy fragmens újbóli beadását. Például nem humán részleteket tartalmazó ellenanyagok vagy fragmensek ismételt beadása szérumbetegséghez és/vagy túlérzékenységhez vezethet. Annak érdekében, hogy elkerüljük ezeket és más problémákat, számos megközelítési módot megkíséreltek, hogy csökkentsék az ilyen ellenanyagok és ezek részleteinek az immunogenitását, beleértve a kimerizálást és humanizálást, amint az jól ismert a szakterületen. Ezek és más megközelítési módok azonban még mindig olyan ellenanyagokat vagy fragmenseket eredményezhetnek, amelyeknek még mindig van valamennyi immunogenitása, alacsony az affinitása, alacsony az aviditása, vagy problémásak sejttenyészetben, felnagyításban, gyártásban, és/vagy alacsony a kitermelésük. Ily módon az ilyen ellenanyagok vagy fragmensek az ideálisnál kevésbé alkalmasak gyártásra vagy terápiás fehérjeként történő alkalmazásra.

Ennek megfelelően igény van olyan anti-IL-12 ellenanyagok vagy fragmensek biztosítására, amelyek ezen problémák közül egyre vagy többre megoldást nyújtanak, valamint igény van az ismert ellenanyagok vagy azok fragmensei javítására.

A találmány tárgyát izolált humán, főemlős, rágcsáló, emlős, kiméra, humanizált és/vagy CDR-graftolt anti-IL-12 ellenanyagok, immunglobulinok, hasítási termékek és azok más specifikus részletei és variánsai képezik, valamint anti-IL-12 ellenanyag-készítmények, kódoló vagy komplementer nukleinsavak, vektorok, gazdasejtek, készítmények, kiszerelések, eszközök, transzgenikus állatok, transzgenikus növények, és eljárások azok előállítására és alkalmazására, amint ezeket a leírásban leírjuk és feltárjuk, kombinálva mindazzal, ami ismert a szakterületen.

A találmány tárgyát képezi legalább egy izolált, találmány szerinti anti-IL-12 ellenanyag is. Találmány szerinti ellenanyag bármilyen olyan fehérje- vagy peptidtartalmú molekula, amely immunglobulin molekula legalább egy részletét tartalmazza, mint például

-3 nem korlátozó példaként nehézlánc vagy könnyűlánc legalább egy komplementaritást meghatározó régióját (CDR) vagy annak ligandumkötő részletét, nehézlánc vagy könnyűlánc variábilis régióját, nehézlánc vagy könnyűlánc állandó régióját, vázrégiót, vagy azok bármely részletét, amely beépíthető találmány szerinti ellenanyagba. Találmány szerinti ellenanyag tartalmazhat vagy származhat bármilyen emlősből, nem korlátozó példaként emberből, egérből, nyálból, patkányból, rágcsálóból, főemlősből, vagy ezek bármilyen kombinációjából, és hasonlókból.

A találmány tárgyát egy megvalósítási mód szerint olyan izolált nukleinsav-molekulák képezik, amelyek tartalmaznak olyan specifikus anti-IL-12 ellenanyagokat kódoló polinukleotidot, vagy komplementerek azzal vagy hibridizálnak ahhoz, amely legalább egy meghatározott szekvenciát, domént, részletet vagy annak variánsát tartalmazza. A találmány tárgyát képezik továbbá az anti-IL-12 ellenanyag nukleinsav-molekulákat tartalmazó rekombináns vektorok, ilyen nukleinsavakat és/vagy rekombináns vektorokat tartalmazó gazdasejtek, valamint eljárások ilyen ellenanyag-nukleinsavak, vektorok és/vagy gazdasejtek előállítására és/vagy alkalmazására.

Legalább egy találmány szerinti ellenanyag kötődik legalább egy meghatározott epitóphoz, amely specifikus legalább egy IL-12 fehérjére, alegységre, fragmensre, részletre vagy azok bármilyen kombinációjára. A legalább egy epitóp tartalmazhat legalább egy ellenanyagkötő régiót, amely legalább egy részletét tartalmazza a fehérjének, amely epitóp előnyösen annak legalább egy részletének legalább 1-5 aminosavából áll, mint például nem korlátozó példaként a fehérje legalább egy funkcionális, extracelluláris, oldható, hidrofil, külső vagy citoplazmatikus doménját, vagy annak bármely részletét.

A legalább egy ellenanyag adott esetben tartalmazhatja legalább egy komplementaritást meghatározó régió (CDR) (például a nehéz vagy könnyű lánc variábilis régió CDR1, CDR2 vagy CDR3 részlete) legalább egy meghatározott részletét és/vagy legalább egy állandó vagy variábilis vázrégiót vagy annak bármilyen részletét. A legalább egy ellenanyag aminosav-szekvencia továbbá adott esetben tartalmaz legalább egy meghatározott szubsztitúciót, inzerciót vagy deléciót, amint azt a leírásban feltárjuk vagy ismert a szakterületen.

A találmány tárgyát képezi legalább egy találmány szerinti izolált anti-IL-12 ellenanyag is, ahol az ellenanyagnak van legalább egy aktivitása, mint például nem korlátozó példaként: (i) IL-12-indukált IFN-γ szekréció; (ii) LAK-sejtes citotoxicitás gátlása; (iii) IFN-γ mRNS transzkripciójának gátlása; (iv) intracelluláris IFN-γ CD3+ sejtek gátlása; és/vagy (v) CD95 expresszió [lásd például Chan és mtsai., J. Immunoi. 148, 92-98. old. (1992); Chan és

-4mtsai., J. Exp. Med. 173, 869-879. old. (1991); Chehimi és mtsai., J. Exp. Med. 175, 789-796. old. (1992); Medvedev és mtsai , Cytokine 9, 394-404. old. (1997)]. Egy anti-IL-12 ellenanyagot tehát szkrínelhetünk megfelelő aktivitásra ismert módszerek szerint, mint például nem korlátozó példaként legalább egy, IL-12 fehérje iránti biológiai aktivitásra.

A találmány tárgyát képezi továbbá legalább egy IL-12 anti-idiotípus ellenanyag legalább egy találmány szerinti IL-12 ellenanyag ellen. Az anti-idiotípus ellenanyag bármilyen olyan fehérje- vagy peptidtartalmú molekula, amely immunglobulin molekula legalább egy részletét tartalmazza, mint például nem korlátozó példaként nehézlánc vagy könnyűlánc legalább egy komplementaritást meghatározó régióját (CDR) vagy annak ligandumkötő részletét, nehézlánc vagy könnyűlánc variábilis régióját, nehézlánc vagy könnyűlánc állandó régióját, vázrégiót, vagy azok bármely részletét, amely beépíthető találmány szerinti ellenanyagba. Találmány szerinti ellenanyag tartalmazhat vagy származhat bármilyen emlősből, mint például nem korlátozó példaként emberből, egérből, nyúlból, patkányból, rágcsálóból, főemlősből, vagy hasonlókból.

A találmány tárgyát egy megvalósítási mód szerint olyan izolált nukleinsav-molekulák képezik, amelyek tartalmaznak olyan, legalább egy IL-12 anti-idiotípus ellenanyagot kódoló polinukleotidot, vagy komplementerek azzal vagy hibridizálnak ahhoz, amely legalább egy meghatározott szekvenciát, domént, részletet vagy annak variánsát tartalmazza. A találmány tárgyát képezik továbbá az IL-12 anti-idiotípus ellenanyagot kódoló nukleinsav-molekulákat tartalmazó rekombináns vektorok, ilyen nukleinsavakat és/vagy rekombináns vektorokat tartalmazó gazdasejtek, valamint eljárások ilyen anti-idiotípus ellenanyag-nukleinsavak, vektorok és/vagy gazdasejtek előállítására és/vagy alkalmazására.

A találmány tárgyát képezi legalább egy eljárás is legalább egy anti-IL-12 ellenanyag vagy IL-12 anti-idiotípus expresszáltatására gazdasejtben, amely szerint találmány szerinti gazdasejtet tenyésztünk olyan körülmények között, ahol legalább egy anti-IL-12 ellenanyag expresszálódik detektálható és/vagy visszanyerhető mennyiségben.

A találmány tárgyát képezi legalább egy készítmény is, amely (a) találmány szerinti izolált anti-IL-12 ellenanyagot kódoló nukleinsavat és/vagy ellenanyagot és (b) megfelelő hordozót vagy oldószert tartalmaz. A hordozó vagy oldószer adott esetben gyógyászatilag elfogadható lehet, mint például ismert hordozók vagy oldószerek. A készítmény adott esetben továbbá tartalmazhat legalább egy további vegyületet, fehérjét vagy készítményt.

A találmány tárgyát képezi továbbá legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot alkalmazó eljárás vagy készítmény, gyógyászatilag hatásos mennyiségben történő beadásra, hogy moduláljunk vagy kezeljünk legalább egy IL-12-vel összefüggő állapotot sejtben, szövetben,

- 5szervben, állatban vagy páciensben egy kapcsolódó állapotot megelőzően, azt követően vagy annak során, amint azt a jelen leírásban feltárjuk.

A találmány tárgyát képezi legalább egy készítmény, eszköz és/vagy eljárás is, legalább egy találmány szerinti anti-IL-12 ellenanyag gyógyászatilag vagy profilaktikusan hatásos mennyiségben történő beadására.

A találmány tárgyát képezi továbbá legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot alkalmazó eljárás vagy készítmény, legalább egy IL-12-vel összefüggő állapot diagnosztizálására sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben egy kapcsolódó állapotot megelőzően, azt követően vagy annak során, amint azt a jelen leírásban feltárjuk.

A találmány tárgyát képezi legalább egy készítmény, eszköz és/vagy beadási eljárás is, legalább egy találmány szerinti anti-IL-12 ellenanyag diagnosztizálására.

Az 1A. és 1B. ábrákon humán anti-IL-12 monoklonális ellenanyagok koncentrációfuggő kötődését mutatjuk be immobilizált humán IL-12-höz. Anti-IL-12 ellenanyagokat sorozatosan hígítottunk 1% BSA/PBS pufferben és inkubáltuk rhIL-12-vel bevont mikrotiterlemezeken 1 órán keresztül 37 °C-on. A lemezeket kétszer mostuk 0,02% Tween 20 (polioxietilén (20) szorbitán monolaurát) tartalmazó 0,15M sóoldattal, és azután próbáztuk tormaperoxidázzal (HRP) jelzett kecske anti-humán-IgG-kappa-specifikus ellenanyaggal 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. A lemezeket ismét mostuk, előhívtuk o-feniléndiamin (OPD) szubsztráttal, és megmértük az egyes mérőhelyek optikai denzitását (OD) 490 nm-en.

A 2. ábrán az A és a B ábrákon a sávokban balról jobbra humán IL-12, humán IL-12 p40, egér IL-12 és előrefestett molekulatömeg-markerek elemzését mutatjuk be. A 2 A. ábrán összfehérjére festett csíkokat mutatunk be. Az elsődlegescsík az egyes sávokban a humán IL12 (75 kDa), p40 humán IL-12 (40 kDa) és egér IL-12 (75 kDa). A 2B. ábrán a 2A. ábrán bemutatottal azonos gélről készített Westem-blotot mutatunk be. A blotot C340-nel reagáltattuk, majd HRP-vel jelzett kecske anti-humán-IgG-vel, és csak a humán IL-12-t (monomer és multimerek) és a humán IL-12 p40-et detektáltuk specifikusan. HPR-vel jelzett kecske anti-humán-IgG-vel reagáltatott kontroll biot (nem mutatjuk be) nem mutatott semmilyen csíkot.

A 3. ábrán IFN-γ génexpresszió reverz-transzkripciós elemzését mutatjuk be humán PBL-ekben, amelyeket IL-2-vel, IL-12-vel, IL-2+IL- 12-vel kezeltünk, C340,8.6.2 anti-IL-12 ellenanyaggal és izotípus kontroll ellenanyaggal, valamint azok nélkül. Az össz-RNS-t reverztranszkripcióval átírtuk, és PCR-rel amplifikáltuk génspecifikus láncindítókkal. A β-aktin

-6RNS szintjét meghatároztuk mindegyik mintában, ami az mRNS integritásának és mennyiségének kontrolijául szolgált.

A 4. ábrán olyan jisztogramot mutatunk be, amely azt ábrázolja, hogy IL-12 monoklonális ellenanyag (C340) gátolja az interferon-γ (IFN-γ) keletkezését IL-2-vel és IL12-vel stimulált, monocitákra kimerített CD3+ perifériás mononukleáris vérsejtekben (PBMC). PBMC-t tenyésztettünk 5 órán keresztül kontroll tápközegben (hozzáadott citokinek nélkül), IL-12-vel (0,1 ng/ml) plusz IL-2-vel (50 lU/ml) kiegészített tápközegben (IL-12/IL2), C340 monoklonális ellenanyagot tartalmazó (10 pg/ml) kontroll tápközegben és C340 monoklonális ellenanyagot tartalmazó (10 pg/ml) IL-12/IL-2 tápközegben. Mértük az intracelluláris IFN-y-t kétszínű immunfestéssel, CD3-PE és IFN-y-FITC alkalmazásával. Egy donor adatait mutatjuk be.

Az 5. ábrán az IFN-y-szekréció dózisfuggő gátlását ábrázoló grafikont mutatunk be IL-2-vel plusz IL-12-vel stimulált perifériás limfocitákban humán anti-IL-12 monoklonális ellenanyag (C340) két különböző lotjával.. Humán PBL-t (8 x 10⁶/ml) tenyésztettünk 24 órán keresztül 10 U/ml IL-2-vel, IL-2-vel plusz 400 pg/ml IL-12-vel vagy IL-2-vel plusz IL-12-vel és C340 jelű monoklonális ellenanyaggal, amint jelezzük. A tenyészetek felülúszóit eltávolítottuk, és mértük EIA-val IFN-y-ra.

A 6. ábrán IL-12-vel plusz IL-2-vel indukált LAK-sejtek citotoxicitásának humán antiIL-12 monoklonális ellenanyag (C340) általi dózisfuggő gátlását ábrázoló hisztogramot mutatunk be.. LAK effektor sejteket (humán PBL, 8 x 10⁶/ml) tenyésztettünk 24 órán keresztül IL-12-vel (400 pg/ml) plusz IL-2-vel (10 U/ml) és C340 monoklonális ellenanyaggal (5000 ng/ml vagy 50 ng/ml, amint jelezzük). A LAK effektor sejteket mostuk, és tenyésztettük ⁵¹Cr-jelzett Raji célsejtekkel 4 órán keresztül 80:1 effektor:célsejt (E:T) arány mellett, és megmértük a Raji sejtek lízise következtében a tápközegbe felszabaduló ⁵¹Cr mennyiségét. Az eredményeket három normális donor átlaga és szórása alakjában fejezzük ki. Az IL-12 pozitív kontroll (IL-12) effektor sejt IL-12-vel inkubálva ellenanyag nélkül. A háttér (BKGD) effektor sejt IL-12 és ellenanyag nélkül inkubálva.

A 7A. és 7B. ábrákon olyan hisztogramokat mutatunk be, amelyek azt mutatják, hogy a CD95 expressziója IL-12-vel plusz IL-2-vel indukált CD3+ perifériás mononukleáris vérsejteken gátolt humán anti-IL-12 monoklonális ellenanyag (C340) által. PBMC-t tenyésztettünk 72 órán keresztül 0,1 ng/ml IL-12-t és szuboptimális dózisú IL-2-t (50 lU/ml) tartalmazó tápközegben C340 monoklonális ellenanyag (10 pg/ml) jelenlétében vagy hiányában.. A CD95 expresszióját áramlási citometriával mértük anti-CD95-FITC-cel festett

-7sejteken. A kapuzást kétszínű elemzéssel (CD3 vagy CD56-PE vs. CD95-FITC) végeztük, és elülső vs. ortogonális fényszórással.

A 8. ábrán olyan grafikont mutatunk be, amely azt mutatja, hogy humán anti-humánIL-12 ellenanyagok (rC340) a tisztított C340 monoklonális ellenanyagtól megkülönböztethetetlen módon kőtődnek az immolizált IL-12-höz. Meghatároztuk az rC340 koncentrációja három, rC340-et termelő rekombináns sejtvonal felülúszójában, és a felülúszókat ELISA-ban értékeltük IL-12 kötésére. Mikrotiterlemezeket vontunk be 2 pg/ml EL-12-vel, és az eredeti hibridóma (standard) vagy a rekombináns sejtvonalak felülúszójából tisztított C340 monoklonális ellenanyaggal inkubáltuk. Az IL-12-höz kötődött ellenanyagot alkalikus foszfatázzal jelzett kecske anti-humán-IgG (nehézlánc+könnyűlánc) alkalmazásával detektáltuk.

A 9A-9C. ábrákon három függetlenül előállított, rC340-et termelő rekombináns sejtszubklón (9A. ábra, C379B jelű szubklón; 9B. ábra, C381A jelű szubklón; 9C. ábra, 389A jelű szubklón) által szekretált ellenanyag mennyiségét és növekedési kinetikáját ábrázoló grafikonokat mutatunk be.. Rekombináns sejteket oltottunk T75-edényekbe 2 x 10⁵ sejt/ml kiindulási sűrűségben standard tápközegben. At various times, cells were resuspended and the number of live cells and the quantity (, ug/ml) of rC340 in the media were =

A találmány tárgyát izolált, rekombináns és/vagy szintetikus anti-IL-12 humán, főemlős, rágcsáló, emlős, kiméra, humanizált vagy CDR-graftolt ellenanyagok és azok elleni IL-12 anti-idiotípus ellenanyagok képezik, valamint készítmények és kódoló nukleinsavmolekulák, amelyek legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot vagy anti-idiotípus ellenanyagot kódoló legalább egy polinukleotid tartalmaznak. A találmány tárgyát képezi továbbá nem korlátozó példaként eljárások ilyen nukleinsavak és ellenanyagok és anti-idiotípus ellenanyagok előállítására és alkalmazására, beleértve diagnosztikai és terápiás készítményeket, eljárásokat és eszközöket.

A leírás szerinti értelemben „interleukin-12 ellenanyag”, „anti-IL-12 ellenanyag”, „anti-IL-12 ellenanyag részlet” vagy „anti-IL-12 ellenanyag fragmens” és/vagy „anti-IL-12 ellenanyag variáns” és hasonlók alatt bármilyen olyan fehérje- vagy peptidtartalmú molekulát értünk, amely immunglobulin molekula legalább egy részletét tartalmazza, mint például nem korlátozó példaként nehézlánc vagy könnyűlánc legalább egy komplementaritást meghatározó régióját (CDR) vagy annak ligandumkötő részletét, nehézlánc vagy könnyűlánc variábilis régióját, nehézlánc vagy könnyűlánc állandó régióját, vázrégiót, vagy azok bármely részletét, vagy IL-12-receptor vagy kötőfehérje legalább egy részletét, amely beépíthető találmány

-8szerinti ellenanyagba. Ilyen ellenanyag adott esetben továbbá hat egy specifikus ligandumra, mint például nem korlátozó példaként amikor egy ellenanyag modulál, csökkent, növel, antagonizál, agonizál, csillapít, enyhít, gátol, inhibeál, befolyásol és/vagy zavar legalább egy IL-12 aktivitást vagy kötődést, vagy IL-12-receptor aktivitást vagy kötődést, in vitro, in situ vagy in vivo. Nem korlátozó példaként megfelelő találmány szerinti anti-IL-12 ellenanyag, meghatározott részlet vagy variáns kötődhet legalább egy IL-12-höz, vagy annak meghatározott részletéhez, variánsához vagy doménjához. Egy megfelelő anti-IL-12 ellenanyag, meghatározott részelt vagy variáns adott esetben befolyásolhat legalább egy IL-12 ivitást vagy funkciót is, mint például nem korlátozó példaként RNS-, DNS- vagy fehérjeszintézist, IL-12-felszabadulást, IL-12-receptor jeltovábbítást, membrán-IL-12-hasítást, IL-12-aktivitást, IL-12-termelést és/vagy szintézist. Az „ellenanyag” kifejezés alatt értünk továbbá ellenanyagokat, azok emésztési fragmenseit, meghatározott részleteit és variánsait, beleértve ellenanyag mimetikumokat vagy ellenanyagok olyan részleteit tartalmazókat, amelyek utánozzák egy ellenanyag vagy annak meghatározott fragmensének vagy részletének a szerkezetét és/vagy funkcióját, beleértve az egyláncú ellenanyagokat és azok fragmenseit. Funkcionális fragmensek közé tartoznak olyan ellenanyagkötő fragmensek, amelyek emlős IL-12-höz kötődnek. IL-12-höz vagy annak részletéhez kötődni képes ellenanyag-fragmensek találmány tárgykörébe tartozó nem korlátozó példái közé tartozik az Fab (például papaines emésztéssel), Fab’ (például pepszines emésztéssel és részleges redukcióval) és F(ab’)₂(például pepszines emésztéssel), facb (például plazminos emésztéssel), pFc’ (például pepszines vagy plazminos emésztéssel), Fd (például pepszines emésztéssel, részleges redukcióval és reaggregációval), Fv vagy scFv (például molekuláris biológiai módszerekkel) fragmens (lásd például Colligan, „Immunology”, mint fent).

Ilyen fragmenseket enzimatikus hasítással, szintetikus vagy rekombináns módszerekkel állíthatunk elő, amint az ismert a szakterületen és/vagy a leírásban feltárjuk. Ellenanyagok előállíthatok különféle csonkolt formákban is, olyan ellenanyag-gének alkalmazásával, amelyekbe egy vagy több stopkodon lett beépítve a természetes stopkodon helyétől leolvasással ellentétes irányban. Például tervezhetünk F(ab’)₂ nehézlánc részletet kódoló kombinációs gént úgy, hogy tartalmazza a nehézlánc CHi doménját és/vagy csuklórégióját kódoló DNS-szekvenciákat. Ellenanyagok különféle részleteit összekapcsolhatjuk hagyományos kémiai módszerekkel, vagy összefüggő fehérjeként állíthatjuk elő azokat génsebészeti módszerek alkalmazásával.

A leírás szerinti értelemben a „humán ellenanyag” kifejezés alatt olyan ellenanyagot értünk, amelyben a fehérjének lényegében minden részlete [például CDR, vázrégió, Cl, Ch .:λ *” ·”·

-9domének (például CH], CH2, CH3), csukló (Vl, Vh)] lényegében nem immunogén emberekben, és csak apró szekvencia-változásokat vagy variációkat tartalmaznak. Hasonlóképpen, főemlős (majom, pávián, csimpánz, stb.), rágcsáló (egér, patkány, nyúl, tengerimalac, hörcsög és hasonlók) és egyéb emlős megjelölés alatt ilyen faj, alnemzetség, nemzetség, alcsalád és család ellen specifikus ellenanyagokat értünk. Ezenkívül kiméra ellenanyagok alatt értjük a fentiek bármilyen kombinációját. Ilyen változások és variációk adott esetben és előnyösen megtartják vagy csökkentik az immunogenitást emberekben vagy más fajokban a nem módosított ellenanyagokhoz képest. Ily módon egy humán ellenanyag különbözik egy kiméra vagy humanizált ellenanyagtól. Megjegyezzük, hogy humán ellenanyagot elő lehet állítani nem humán állatban vagy olyan prokarióta vagy eukarióta sejtben, amely képes funkcionálisan átrendeződött humán immunglobulin (például nehézlánc és/vagy könnyűlánc) gének expresszálására. Ezenkívül amikor egy humán ellenanyag egyláncú ellenanyag, az tartalmazhat olyan kapcsolópeptidet, amely nem található meg a természetben megtalálható humán ellenanyagokban. Például egy Fv tartalmazhat kapcsolópeptidet, mint például kettő és körülbelül nyolc közötti számú glicint vagy más aminosav-oldalláncot, amelyek összekötik a nehézlánc variábilis régióját és a könnyűlánc variábilis régióját. Ilyen kapcsolópeptideket humán eredetűnek tekintünk.

Bispecifikus, heterospecifikus, heterokonjugált vagy hasonló ellenanyagokat is alkalmazhatunk, amelyek lehetnek monoklonális, előnyösen humán vagy humanizált ellenanyagok, amelyeknek legalább két különböző antigén iránt van kötőspecifitása. A jelen esetben az egyik kötőspecifitás legalább egy IL-12 fehérje ellen van, és a másik egy másik antigén ellen. Bispecifikus ellenanyagok előállítására szolgáló eljárások jól ismertek a szakterületen. Hagyományosan a bispecifikus ellenanyagok rekombináns előállítása két immunglobulin nehézlánc-könnyűlánc pár együttes expresszióján alapszik, ahol a két nehézláncnak különböző a specifitása [Milstein és Cuello, Nature 305, 537. old. (1983)]. Az immunglobulin nehéz és könnyűláncok véletlenszerű választéka miatt ezekben a hibridómák (kvadrómák) 10 különböző ellenanyag-molekula potenciális keverékét termelik, amelyek közül csak egynek van meg a helyes bispecifikus szerkezete. A helyes molekula tisztítása, amit általában affinitási kromatográfiás lépésekkel végeznek eléggé fáradságos, és a termék kitermelése alacsony. Hasonló eljárásokat tárnak fel például a WO 93/08829. számú nemzetközi közzétételi iratban, a 6 210 668., 6 193 967., 6 132 992., 6 106 833., 6 060 285., 6 037 453., 6 010 902., 5 989 530., 5 959 084., 5 959 083., 5 932 448., 5 833 985., 5 821 333., 5 807 706., 5 643 759., 5 601 819., 5 582 996., 5 496 549., 4 676 980. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokban, a WO 91/00360., WO 92/00373. számú • · ··· «· ·· • · · · · · · ••w* ···· ·· ·· «« nemzetközi közzétételi iratokban, az EP 03089. számú európai szabadalmi iratban, Traunecker és mtsai., EMBO J. 10, 3655. old. (1991), Suresh és mtsai., Methods in Enzymology 121, 210. old (1986), amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi],

A találmány szerinti eljárásokban és készítményekben alkalmazható anti-IL-12 ellenanyagok (amelyeket IL-12 ellenanyagoknak is nevezünk) adott esetben a IL-12 iránti magas affinitással is jellemezhetők, és adott esetben és előnyösen alacsony a toxicitásuk. Közelebbről találmány szerinti ellenanyag, meghatározott fragmens vagy variáns hasznos a találmány szerint, ha az egyedi komponenseknek - mint például a variábilis régiónak, állandó régiónak és vázrégiónak - egyedileg és/vagy együttesen adott esetben és előnyösen alacsony az immunogenitása. A találmány szerint alkalmazható ellenanyagokat adott esetben az jellemzi, hogy képesek páciensek hosszú időn keresztül tartó kezelésére a tünetek mérhető enyhítésével és alacsony és/vagy elfogadható toxicitással. Az alacsony vagy elfogadható immunogenitás és/vagy magas affinitás, valamint más megfelelő tulajdonságok hozzájárulhatnak az elért terápiás eredményekhez. Az „alacsony immunogenitás”-t úgy definiáljuk a leírás szerinti értelemben, hogy szignifikáns HAHA, HACA vagy HAMA választ vált ki a kezelt pácienseknek kevesebb, mint körülbelül 75%-ában, vagy előnyösen kevesebb, mint körülbelül 50%-ában, és/vagy alacsony titert hoz létre a kezelt páciensekben (kevesebb, mint körülbelül 300-at, előnyösen kevesebb, mint körülbelül 100-at kettős antigén enzimes immunológiai vizsgálati eljárással mérve) [lásd például Elliott és mtsai., Lancet 344, 1125-1127. old. (1994), amely hivatkozás útján teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi].

A Ikalmazhatóság

A találmány szerinti izolált nukleinsavak alkalmazhatók legalább egy anti-IL-12 ellenanyag vagy annak meghatározott variánsának az előállítására, amely alkalmazható legalább egy IL-12-állapot - amely nem korlátozó példaként legalább egy immunológiai rendellenesség vagy betegség, szív- és érrendszeri rendellenesség vagy betegség, fertőző, rosszindulatú és/vagy idegrendszeri rendellenesség vagy betegség bármelyike, vagy bármilyen egyéb ismert IL-12-vel kapcsolatos állapot - mérésére vagy kiváltására egy sejtben, szövetben, szervben vagy állatban (beleértve az emlősöket és az embert), diagnosztizálására, monitorozására, modulálására, kezelésére, enyhítésére, előfordulása megelőzésének elősegítésére vagy tüneteinek a csökkentésére.

Ilyen eljárás szerint legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot tartalmazó készítmény vagy gyógyászati készítmény hatásos mennyiségét beadjuk egy sejtbe, szövetbe, szervbe, állatba • · ··· ·♦ ·· vagy páciensbe, amelynek szüksége van tünetek, hatások vagy mechanizmusok ilyen modulálására, kezelésére, enyhítésére, megelőzésére vagy csökkentésére. A hatásos mennyiség tartalmazhat körülbelül 0,001-500 mg/kg mennyiséget egyetlen (például bólusz), többszörös vagy folyamatos beadásban, vagy 0,01-5000 ég/ml szérumkoncentráció eléréséhez egyetlen, többszörös vagy folyamatos beadásban, vagy bármilyen hatásos tartományt vagy értéket ezek között, amint azt ismert eljárások alkalmazásával elvégezzük és meghatározzuk a leírás szerint, vagy ismert az idevágó szakterületeken.

Referenciák

Az összes, leírásban idézett publikáció és szabadalom teljes teijedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi, minthogy a technika állását mutatják be a jelen találmány idején és/vagy a találmány leírását és megvalósíthatóságát biztosítják. Publikáció alatt bármilyen tudományos vagy szabadalmi publikációt értünk, vagy bármilyen egyéb hozzáférhető információt bármilyen média formátumban, beleértve minden rögzített, elektronikus vagy nyomtatott formátumot. Az alábbi referenciák teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik: „Current Protocols in Molecular Biology”, szerk.: Ausubel, és mtsai., kiad.: John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, szerk.: Sambrook és mtsai., 2. kiadás, kiad.: Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, „Antibodies: A Laboratory Manual”, kiad.: Cold Spring Harbor, NY (1989); „Current Protocols in Immunology”, szerk.: Colligan és mtsai., kiad.: John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); „Current Protocols in Protein Science”, szerk.: Colligan és mtsai., kiad.: John Wiley & Sons, NY, NY (1997-2001).

A találmány szerinti ellenanyagok

Legalább egy találmány szerinti IL-12 ellenanyagot előállíthatunk adott esetben egy sejtvonallal, kevert sejtvonallal, immortalizált sejttel vagy immortalizált sejtek klonális populációjával, amint az jól ismert a szakterületen [lásd például „Current Protocols in Molecular Biology”, szerk.: Ausubel, és mtsai., kiad.: John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, szerk.: Sambrook és mtsai., 2. kiadás, kiad.: Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, „Antibodies: A Laboratory Manual”, kiad.: Cold Spring Harbor, NY (1989); „Current Protocols in Immunology”, szerk.: Colligan és mtsai., kiad.: John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); „Current Protocols in Protein Science”, szerk.: Colligan és mtsai., kiad.: John Wiley & Sons, NY, NY (1997-2001), amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi].

* · *·· ·· ·«

-12Humán IL-12 fehérjékre vagy azok fragmenseire specifikus humán ellenanyagokat termeltethetünk egy megfelelő immunogén antigén ellen, mint például izolált IL-12 fehérje vagy annak részlete ellen (beleértve szintetikus molekulákat, mint például szintetikus peptideket). Más specifikus vagy általános emlős ellenanyagokat hasonlóképpen termeltethetünk. Immunogén antigének előállítását és monoklonális ellenanyagok termelését bármilyen megfelelő módszer alkalmazásával végrehajthatjuk.

Egy megközelítési mód szerint hibridómát állítunk elő alkalmas immortalizált sejtvonal (például mielóma sejtvonal, mint például nem korlátozó példaként Sp2/0, Sp2/0AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, M0LT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A vagy hasonlók, vagy heteromielómák, azok fúziós termékei, vagy bármilyen azokból származó sejt vagy fúziós sejt, vagy bármilyen, a szakterületen ismert alkalmas sejtvonal, lásd például www.atcc.org,www.lifetech.com és hasonlók) fuzionáltatásával ellenanyag-termelő sejtekkel, mint például nem korlátozó példaként izolált vagy klónozott lép, perifériás vér, nyirok, mandula vagy egyéb immun vagy B-sejtet tartalmazó sejtekkel, vagy bármilyen más sejtekkel, amelyek nehéz vagy könnyűlánc állandó vagy variábilis vagy vázrégió vagy CDR szekvenciákat expresszálnak, akár endogén, akár heterológ nukleinsavakként, mint rekombináns vagy endogén, virális, bakteriális, alga, prokarióta, kétéltű, rovar, hüllő, hal, emlős, rágcsáló, lóféle, juhféle, kecske, juh, főemlős, eukarióta, genomiális DNS, cDNS, rDNS, mitokondriális DNS vagy RNS, kloroplasztisz DNS vagy RNS, hnRNS, mRNS, tRNS, egyszálú, kétszálú vagy háromszálú, hibridizált és hasonló, vagy ezek kombinációja formájában [ lásd például Ausubel és mtsai., mint fent és Colligan, „Immunology”, mint fent, 2. fejezet, amelyek teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik].

Ellenanyag-termelő sejteket előállíthatunk jelentőséggel bíró antigénnek immunizált emberek vagy más alkalmas állatok perifériás véréből is, vagy előnyösen a lépükből vagy nyirokcsomóiból. Bármilyen egyéb alkalmas gazdasejtet is alkalmazhatunk heterológ vagy endogén, találmány szerinti ellenanyagot, annak meghatározott fragmensét vagy variánsát kódoló nukleinsav expresszáltatására. A fuzionáltatott sejteket (hibridómák) vagy rekombináns sejteket szelektív tenyésztési körülmények között vagy más alkalmas módszerekkel izolálhatjuk, és korlátozó hígítással vagy sejtválogatással vagy más ismert eljárásokkal klónozhatjuk. A kívánt specifitású ellenanyagokat termelő sejteket alkalmas vizsgálati eljárással (például ELISA-val) szelektálhatjuk ki.

' · ··· ·· ·· - 13 Más, kívánt specifitású ellenanyagok előállítására vagy izolálására alkalmas eljárásokat is alkalmazhatunk, nem korlátozó példaként olyan eljárásokat, amelyek rekombináns ellenanyagot választanak ki peptid vagy fehérje könyvtárból (például nem korlátozó példaként bakteriofág, riboszóma, oligonukleotid, RNS, cDNS vagy hasonló prezentációs könyvtárból; például amelyek beszerezhetők az alábbi cégektől: Cambridge Antibody Technologies, Cambridgeshire, UK; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Scotland, UK; BioInvent, Lund, Sweden; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, CA; Ixsys. lásd például az EP 368 684. számú európai szabadalmi iratot, a PCT/GB91/01134.; PCT/GB92/01755.; PCT/GB92/002240.; PCT/GB92/00883.; PCT/GB93/006O5. számú nemzetközi bejelentéseket; a 08/350260. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentést (1994.12.5); a PCT/GB94/01422.; PCT/GB94/02662.; PCT/GB97/01835. számú nemzetközi bejelentéseket; (CAT/MRC); a WO 90/14443.; WO 90/14424.; WO 90/14430. számú nemzetközi közzétételi iratokat; a PCT/US94/1234. számú nemzetközi bejelentést; a WO 92/18619.; WO 96/07754. számú nemzetközi közzétételi iratokat (Scripps); az EP 614 989. számú európai szabadalmi iratot (MorphoSys); a WO 95/16027. számú nemzetközi közzétételi irat (Biolnvent); WO 88/06630.; WO 90/3809. számú nemzetközi közzétételi iratokat (Dyax); a 4 704 692. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Enzon); a PCT/US91/02989. számú nemzetközi bejelentést (Affymax); a WO 89/06283. számú nemzetközi közzétételi iratot; az EP 371 998.; EP 550 400. számú európai szabadalmi iratokat (Xoma); az EP 229 046. számú európai szabadalmi iratot; a PCT/US91/07149. számú nemzetközi bejelentést (Ixsys)]; vagy véletlenszerűen létrehozott peptideket vagy fehérjéket - lásd az 5 723 323., 5 763 192., 5 814 476., 5 817 483., 5 824 514., 5 976 862. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat, a WO 86/05803. számú nemzetközi közzétételi iratot, az EP 590 689. számú európai szabadalmi iratot (Ixsys, jelenleg Applied Molecular Evolution, ΑΜΕ) -, amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi], vagy amelyek olyan transzgenikus állatok [például SCID egerek, Nguyen és mtsai., Microbiol. Immunoi. 41, 901-907. old. (1997); Sandhu és mtsai., Crit. Rév. Biotechnoi. 16, 95-118. old. (1996); Erén és mtsai., Immunoi. 93, 154-161. old. (1998), amelyek mindegyike, valamint a kapcsolódó szabadalmak és bejelentések teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezi] immunizálásán alapulnak, amelyek képesek humán ellenanyagok készletét előállítani, amint az ismert a szakterületen és/vagy feltárjuk a leírásban. Ilyen módszerek nem korlátozó példaként a riboszóma prezentáció [Hanes és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4937-4942. old. (1997); Hanes és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 14130-14135.

- 14* · · ·· · · »4 ·*-* ·1«* Μ¹ * Ί» * *1«* old. (1998)]; egysejtes, ellenanyagot előállító technológiák [például a szelektált limfocita ellenanyag eljárás (SLAM) (5 627 052. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat, Wen és mtsai., J. Immunoi. 17, 887-892. old. (1987); Babcook és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7843-7848. old. (1996)]; gél-mikrocsepp és áramlási citometria [Powell és mtsai., Biotechnoi. 8, 333-337. old. (1990); One Cell Systems, Cambridge, MA; Gray és mtsai., J. Imm. Meth. 182, 155-163. old. (1995); Kenny és mtsai., Bio/Technol. 13, 787-790. old. (1995)]; B-sejt szelekció [Steenbakkers és mtsai., Molec. Biol. Reports 19, 125-134. old. (1994); Jónak és mtsai., „Progress Biotech”, 5. kötet, „In Vitro Immunization in Hybridoma Technology”, szerk.: Borrebaeck, kiad.: Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, Netherlands (1988)].

Nem humán vagy humán ellenanyagok génsebészeti úton történő módosítására és humanizálására szolgáló eljárásokat is alkalmazhatunk, amelyek jól ismertek a szakterületen. Általában humanizált vagy génsebészeti úton módosított ellenanyag egy vagy több nem humán forrásból származó aminosav-oldalláncot tartalmaz, például nem korlátozó példaként egérből, patkányból, nyúlból, nem humán főemlősből vagy más emlősből származót. Ezeket a humán aminosav-oldalláncokat gyakran „import” oldalláncoknak nevezzük, amelyek tipikusan egy ismert humán szekvencia „import” variábilis, állandó vagy más doménjából származnak. Ismert humán lg szekvenciákat tárnak fel az alábbi helyeken: www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi;www.atcc.org/phage/hdb.html;www.sciquest.com/; www.abcam.com/;www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www. public, iastate. edu/~pedro/researchtools. html; www. mgen.uniheidelberg. de/SD/IT/IT. html; www. whfreeman. com/immunology/CH05/kubyO5. htm;

www. library. thinkquest, org/12429/Immune/Antibody, html;

www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/;www.path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html; www. antibodyresource, com/; mcb. harvard. edu/BioLinks/Immunology. html;

www.immunologylink.com/;pathbox.wustl.edu/~hcenter/index.html; www.biotech.ufl.edu/~hcl/;www.pebio.com/pa/340913/340913.html; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/;www.rn.ehime-u.ac.jp/~yasuhito/Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp;www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html; www.biotech.ufl. edu/~fccl/protocol.html; www.isac/net.org/sit es_geo.html; aximtl. imt.unimarburg.de/~rek/AEPStart.html; baserv.uci.kun.nl/~jraats/linksl.html; www.recab.unihd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html; www. ibt. unam. mx/vir/V_mice. html; imgt. cnusc. fr: 8104/;

www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abs/index.html;antibody.bath.ac.uk/;

- 15/ · *·· · - ·<

abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html;

www.unizh.ch/~honegger/AHOseminar/Slide01.html;www.cryst.bbk.ac.uk/~ubog07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm;

www. path. cam. ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP. html;

www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat aim.html; www. biosci. missouri, edu/smithgp/index.html; www. cryst .bioc. cam. ac.uk/~fmolina/W eb-pages/Pept/spottech. html;

www.jerini.de/fr_products.htm;www.patents.ibm.com/ibm.html, Kábát és mtsai., „Sequences ofProteins of Immunological Interest”, kiad.: U. S. Dept. Health (1983), amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi. Ilyen importált szekvenciákat alkalmazhatunk az immunogenitás csökkentésére, vagy a kötődés, affinitás, „on” sebesség, „off” sebesség, aviditás, specifitás, féléletidő, vagy bármely más alkalmas jellemző csökkentésére, fokozására vagy módosítására, amint az ismert a szakterületen. Általában a nem humán vagy humán CDR-szekvenciák részét vagy egészét megtartjuk, míg a variábilis és állandó régiók nem humán szekvenciáit helyettesítjük humán vagy más aminosavakkal. Ellenanyagokat adott esetben humanizálhatunk az antigén iránti magas affinitás és egyéb kedvező biológiai tulajdonságok megtartásával is. Ezen cél elérése érdekében humanizált ellenanyagokat adott esetben a szülői szekvenciák és különféle konceptuális humanizált termékek elemzése útján állíthatunk elő, a szülői és humanizált szekvenciák háromdimenziós modelljeinek alkalmazásával. Háromdimenziós immunglobulin modellek általánosan hozzáférhetők és ismertek a szakember számára. Beszerezhetők olyan számítógépi programok, amelyek bemutatják és ábrázolják a kiválasztott potenciális immunglobulinszekvenciák valószínű háromdimenziós konformációs szerkezeteit. Ezen ábrázolások tanulmányozása lehetővé teszi az oldalláncok valószínű szerepének az elemzését a potenciális immunglobulin-szekvencia működésében, azaz azon oldalláncok elemzése, amelyek befolyásolják a potenciális immunglobulin képességét az antigénjéhez való kötődésre. Ily módon FR-oldalláncokat választhatunk ki, és kombinálhatjuk azokat a konszenzus és import szekvenciákból, oly módon, hogy elérjük a kívánt ellenanyag-tulajdonságot, mint például a megnövekedett affinitást a célantigén(ek) iránt. Általánosságban a CDR-oldalláncok közvetlenül és leglényegesebb módon részt vesznek az antigénkötés befolyásolásában. A találmány szerinti ellenanyagok humanizálását és génsebészeti úton történő módosítását bármilyen ismert eljárás alkalmazásával elvégezhetjük, mint például nem korlátozó példaként az alábbi irodalmi helyeken leírtakkal: Winter (Jones és mtsai., Nature 321, 522. old. (1986); Riechmann és mtsai. Nature 332, 323. old. (1988); Verhoeyen és mtsai., Science 239, 1534. old. (1988), Sims és mtsai., J. Immunoi. 151, 2296. old. (1993); Chothia és Lesk, J. Mól. Bioi.

196, 901. old. (1987), Carter és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285. old. (1992); Presta és mtsai., J. Immunol. 151, 2623. old. (1993), 5723323,5976862., 0,5824514., 5 824 514., 5 817 483., 5 814 476., 5 763 192., 5 723 323., 5 766 886, 5 714 352, 0,6180370, 6 180 370, 5 693 762, 5 530 101, 5 585 089, 5 225 539.; 4 816 567. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok, PCT/US98/16280, PCT/US96/18978, PCT/US91/09630, PCT/US91/05939, PCT/US94/01234, PCT/GB89/01334,

PCT/GB91/01134, PCT/GB92/01755. számú nemzetközi bejelentések; WO 90/14443, WO 90/14424, WO 90/14430. számú nemzetközi közzétételi iratok, EP 229246. számú európai szabadalmi irat, amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi, beleértve az azokban idézett referenciákat is.

Az anti-IL-12 ellenanyagot adott esetben előállíthatjuk olyan transzgenikus állat (például egér, patkány, hörcsög, nem humán főemlős és hasonlók) immunizálásával is, amely képes humán ellenanyagok készletének termelésére, amint azt a leírásban feltárjuk és/vagy ismert a szakterületen. Humán anti-IL-12 ellenanyagot termelő sejteket izolálhatunk ilyen állatokból, és immortalizálhatjuk azokat megfelelő eljárások alkalmazásával, mint például a leírásban feltárt eljárásokkal.

Humán antigénekhez kötődő humán ellenanyagok készletét termelő transzgenikus egereket ismert eljárásokkal állíthatunk elő [például nem korlátozó példaként az 5 770 428, 5 569 825, 5 545 806, 5 625 126, 5 625 825, 5 633 425, 5 661 016. és 5. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok (Lonberg és mtsai.); Jakobovits és mtsai, WO 98/50433. számú nemzetközi közzétételi irat, Jakobovits és mtsai. WO 98/24893. számú nemzetközi közzétételi irat, Lonberg és mtsai, WO 98/24884. számú nemzetközi közzétételi irat, Lonberg és mtsai, WO 97/13852. számú nemzetközi közzétételi irat, Lonberg és mtsai, WO 94/25585. számú nemzetközi közzétételi irat, Kucherlapate és mtsai,. WO 96/34096. számú nemzetközi közzétételi irat, Kucherlapate és mtsai, EP 0463 151 Bl. számú európai szabadalmi irat, Kucherlapate és mtsai, EP 0710 719 Al. számú európai szabadalmi irat, Surani és mtsai, 5 545 807. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat, Bruggemann és mtsai, WO 90/04036. számú nemzetközi közzétételi irat, Bruggemann és mtsai, EP 0438 474 Bl. számú európai szabadalmi irat, Lonberg és mtsai, EP 0814 259 A2. számú európai szabadalmi irat, Lonberg és mtsai, GB 2 272 440 A. számú brit szabadalmi irat; Lonberg és mtsai, Nature 368, 856-859. old. (1994), Taylor és mtsai, Int. Immunoi. 6, 579-591. old. (1994), Green és mtsai, Nature Genetics 7, 13-21. old. (1994), Mendez és mtsai, Nature Genetics 15, 146-156. old. (1997), Taylor és mtsai, Nucleic Acids Research 20, 6287-6295. old. (1992), Tuaillon és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 3720-3724.

- 17old. (1993), Lonberg és mtsai., Int. Rev. Immunol. 13, 65-93. old. (1995) és Fishwald és mtsai., Nat. Biotechnol. 14, 845-851. old. (1996), amelyek mindegyike telejs terejdelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi]. Általában ezek az egerek legalább egy transzgént tartalmaznak, amely legalább egy humán immunglobulin-lókuszról származó DNS-t tartalmaz, amely funkcionálisan át van rendezve, vagy amely funkcionális átrendeződésen mehet át. Az endogén immunglobulin-lókusz az ilyen egerekben megzavarható vagy deletálható, hogy elimináljuk az állat képességét endogén gének által kódolt ellenanyagok termelésére.

Hasonló fehérjékhez vagy fragmensekhez specifikusan kötődő ellenanyagok szkrínelését kényelmesen elérhetjük peptidprezentációs könyvtárak alkalmazásával. Ez az eljárás magában foglalja peptidek nagy gyűjteményeinek a szkrínelését kívánt funkciójú vagy szerkezetű egyedi tagokra. Peptidkönyvtárak ellenanyag-szkrínelése jól ismert a szakterületen. A prezentált peptidszekvenciák lehetnek 3-5000 vagy több aminosav hosszúságúak, gyakorta 5-100 aminosav hosszúságúak, és gyakran körülbelül 8-25 aminosav hosszúságúak. A peptidkönyvtárak létrehozására szolgáló közvetlen kémia szintetikus eljárások mellett számos rekombináns DNS módszert is leírtak. Az egyik típus peptidszekvencia prezentálását foglalja magában bakteriofág vagy sejt felszínén. Mindegyik bakteriofág vagy sejt tartalmazza az adott prezentált peptidszekvenciát kódoló nukleotidszekvenciát. Ilyen eljárásokat tárnak fel a WO 91/17271., WO 91/18980., WO 91/19818. és WO 93/08278. számú nemzetközi közzétételi iratok. Peptidek könyvtárainak létrehozására szolgáló más rendszereknek vannak in vitro kémiai szintézis és rekombináns vonatkozásai is. Lásd a WO 92/05258., WO 92/14843. és WO 96/19256. számú nemzetközi közzétételi iratokat. Lásd még az 5 658 754. és 5 643 768. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat. Peptidprezentációs könyvtárak, vektorok és szkrínelő reagenskészletek beszerezhetők kereskedelmi forgalomban olyan cégektől, mint például az Invitrogen (Carlsbad, CA) és a Cambridge antibody Technologies (Cambridgeshire, UK). Lásd például a 4 704 692., 4 939 666., 4 946 778., 5 260 203., 5 455 030, 5 518 889, 5 534 621, 5 656 730, 5 763 733, 5 767 260, 5 856 456. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat (Enzon); 5 223 409, 5 403 484, 5 571 698, 5 837 500. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat (Dyax), 5 427 908, 5 580 717. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat (Affymax); 5 885 793. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Cambridge antibody Technologies); 5 750 373. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Genentech), 5 618 920, 5 595 898, 5 576 195, 5 698 435, 5 693 493, 5 698 417. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat (Xoma), Colligan, mint

- 18fent; Ausubel, mint fent; vagy Sambrook, mint fent, amely szabadalmak és publikációk mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.

A találmány szerinti ellenanyagokat előállíthatjuk legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot kódoló nukleinsav alkalmazásával is, transzgenikus állatot előállítva, mint például kecskéket, szarvasmarhákat, lovakat, juhokat és hasonlókat, amelyek ilyen ellenanyagokat termelnek a tejükben. Ilyen állatokat ismert eljárások alkalmazásával biztosíthatunk [ lásd például nem korlátozó példaként az 5 827 690.; 5 849 992.; 4 873 316.; 5 849 992.; 5 994 616.; 5 565 362.; 5 304 489. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat és hasonlókat, amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi].

Találmány szerinti ellenanyagokat továbbá előállíthatunk legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot kódoló nukleinsav alkalmazásával, transzgenikus növényeket és növényi sejteket (például nem korlátozó példaként dohányt és kukoricát) biztosítva, amelyek ilyen ellenanyagokat, meghatározott részleteket és variánsokat termelnek a növényi részekben vagy az azokból kitenyésztett sejtekben. Nem korlátozó példaként rekombináns fehérjét expresszáló transzgenikus dohányleveleket sikeresen alkalmaztak nagy mennyiségű rekombináns fehérje biztosítására, például indukálható promoter alkalmazásával [lásd például Cramer és mtsai., Curr. Top. Microbol. Immunoi. 240, 95-118. old. (1999), és az abban idézett hivatkozásokat]. Ezenkívül transzgenikus kukoricát alkalmaztak emlős fehérjék expresszáltatására kereskedelmi mennyiségben, más rekombináns expressziós rendszerekben előállított vagy természetes forrásból tisztított fehérjékével ekvivalens aktivitással [lásd például Hood és mtsai., Adv. Exp. Med. Bioi. 464, 127-147. old. (1999), és az abban idézett hivatkozásokat]. Ellenanyagokat nagy mennyiségben előállítottak transzgenikus növényi magvakból is, beleértve ellenanyag fragmenseket, mint például egyláncú ellenanyagokat (scFv), például dohánymagokban és burgonyagumókban [lásd például Conrad és mtsai., Plant Mol. Biol. 38, 101-109. old. (1998), és az abban idézett hivatkozásokat]. Ily módon a találmány szerinti ellenanyagokat előállíthatjuk transzgenikus növények alkalmazásával is, ismert eljárások alkalmazásával [lásd még például Fischer és mtsai., Biotechnoi. Appl. Biochem. 30, 99-108. old. (1999), Ma és mtsai., Trends Biotechnoi. 13, 522-527. old. (1995); Ma és mtsai., Plant Physiol. 109, 341-346. old. (1995); Whitelam és mtsai., Biochem. Soc. Trans. 22, 940-944. old. (1994); és az azokban idézett hivatkozásokat]. Lásd továbbá az általánosságban a növényi ellenanyag-expressziós rendszerek nem korlátozó példájaként, A fent idézett referenciák mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.

- 19A találmány szerinti ellenanyagok széles tartományban lévő affinitással (K_D) képesek kötődni humán IL-12-höz. Egy előnyös megvalósítási mód szerint legalább egy találmány szerinti humán monoklonális ellenanyag képes adott esetben magas affinitással kötődni humán IL-12-höz. Például humán monoklonális ellenanyag 10‘⁷ M vagy kisebb K_D-vel kötődhet humán IL-12-höz, mint például nem korlátozó példaként 0,1-9,9 (vagy bármilyen tartomány vagy érték azon belül) X 10’⁷, 10‘⁸, ΙΟ'⁹, ΙΟ’¹⁰, ΙΟ'¹¹, ΙΟ’¹², 10'¹³ vagy bármilyen tartomány vagy érték azon belül.

Egy ellenanyag antigén iránti affinitását vagy aviditását kísérletesen határozhatjuk meg bármilyen megfelelő eljárás alkalmazásával (lásd például Berzofsky és mtsai., „Antibody-Antigen Interactions”, „Fundamental Immunology”, szerk.: Paul, W. E., kiad.: Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis, „Immunology”, kiad.. W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992); és az azokban leírt eljárások]. Egy adott ellenanyagantigén kölcsönhatás mért affinitása változhat, ha különböző körülmények között mérjük (például sókoncentráció, pH). Ily módon az affinitás és egyéb antigén-kötési paraméterek (például K_D, K_a, Kd) mérését előnyösen ellenanyag és antigén standardizált oldataival végezzük, és standardizált pufferrel, mint például a leírásban ismertetett pufferrel.

Nukleinsav-molekulák

A találmány szerinti információ, mint például az 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7., 8. azonosítószámú szekvenciák, azok meghatározott fragmensei, variánsai és konszenzus szekvenciái közül legalább egynek az összefüggő aminosavainak legalább 70-100%-át kódoló nukleotid-szekvenciák, vagy legalább egy ilyen szekvenciát tartalmazó letétbe helyezett vektor alkalmazásával legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot kódoló találmány szerinti nukleinsav-molekula előállítható a leírásban feltárt, vagy a szakterületen ismert eljárás alkalmazásával.

Találmány szerinti nukleinsav-molekulák lehetnek RNS formájában, mint például mRNS, hnRNS, tRNS vagy bármilyen más forma, vagy DNS formájában, nem korlátozó példaként klónozással nyert vagy szintetikusan előállított cDNS vagy genomiális DNS forma, vagy ezek bármilyen kombinációja. A DNS lehet háromszálú, kétszálú vagy egyszálú, vagy ezek bármilyen kombinációja. A DNS vagy RNS legalább egy szálának bármely részlete lehet a kódoló szál, amit szensz szálként is ismerünk, vagy lehet a nem kódoló szál, amit antiszensz szálnak is nevezünk.

Találmány szerinti izolált nukleinsav-molekulák közé tartozhatnak olyan nukleinsavmolekulák, amelyek tartalmaznak egy nyílt leolvasási fázist (ORF), adott esetben egy vagy több intronnal, például nem korlátozó példaként legalább egy nehézlánc (például 1-3.

-20azonosítószámú szekvencia) vagy legalább egy könnyűlánc (például 4-6. azonosítószámú szekvencia) legalább egy CDR-jének, mint például CDR1, CDR2 és/vagy CDR3 legalább egy meghatározott részletét; anti-IL-12 ellenanyag vagy variábilis régió (például 7., 8. azonosítószámú szekvencia) kódoló szekvenciáját tartalmazó nukleinsav-molekulákat; és olyan nukleinsav-molekulákat, amelyek a fent bemutatottaktól lényegesen különböznek, de amelyek a genetikai kód degeneráltsága miatt még mindig legalább egy találmány szerinti és/vagy a szakterületen ismert anti-IL-12 ellenanyagot kódolnak. Természetesen a genetikai kód jól ismert a szakterületen. Ily módón a szakember számára rutin lenne olyan degenerált nukleinsav-variánsokat előállítani, amelyek találmány szerinti specifikus anti-IL-12 ellenanyagokat kódolnak (lásd például Ausubel és mtsai., mint fent), és ilyen nukleinsavvariánsok a találmány tárgyát képezi. Találmány szerinti nukleinsav-molekulák nem korlátozó példái közé tartoznak a 10-15. azonosítószámú szekvenciák, amelyek sorrendben a HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC variábilis régiókat és az LC variábilis régiót kódoló nem korlátozó nukleinsavaknak felelnek meg.

Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát izolált nukleinsav-molekulák képezik, amelyek olyan anti-TNF ellenanyagot kódolnak, amelynek az aminosavszekvenciáját a és néven és ATCC letéti számon, -án letétbe helyezett plazmidokban található nukleinsav kódolja.

Amint a leírásban jelezzük, anti-IL-12 ellenanyagot kódoló nukleinsavat tartalmazó találmány szerinti nukleinsav-molekulák nem korlátozó példái közé tartoznak azok, amelyek magának az ellenanyag-fragmensnek az aminosav-szekvenciáját kódolják; egy teljes ellenanyag vagy részletének a kódoló szekvenciáját, ellenanyag, fragmens vagy részlet, valamint további szekvenciák kódoló szekvenciáját, mint például legalább egy szignál szekvencia vagy fúziós fehérje kódoló szekvenciáját, a fent említett további szekvenciákkal vagy azok nélkül, mint például legalább egy intronnal, együtt további nem kódoló szekvenciákkal, nem korlátozó példaként beleértve átírt nem kódoló 5’ és 3’ szekvenciákat; azokat a nem kódoló szekvenciákat, amelyek szerepet játszanak a transzkripcióban, mRNS-feldolgozásban, beleértve a „splicing”-et és poliadenilációs szignálokat (például riboszóma-kötés és mRNS stabilitása); további aminosavakat kódoló további szekvencia, mint például amelyek további funkciókat biztosítanak. Ily módon egy ellenanyagot kódoló szekvenciát fuzionáltathatunk egy jelző szekvenciához, mint például olyan pepiidet kódoló szekvenciához, amely elősegíti az ellenanyag-fragmenst vagy részletet tartalmazó fuzionáltatott ellenanyag tisztítását.

-21 Találmány szerinti polinukleotidhoz szelektíven hibridizáló polinukleotidok

A találmány tárgyát izolált nukleinsavak képezik, amelyek hibridizálnak szelektív hibridizációs körülmények között találmány szerinti polinukleotidhoz. Ily módon az ezen megvalósítási mód szerinti polinukleotidok alkalmazhatók ilyen polinukleotidokat tartalmazó nukleinsavak izolálására, detektálására és/vagy mennyiségi meghatározására. Például találmány szerinti polinukleotidok alkalmazhatók részleges vagy teljes hosszúságú kiónok azonosítására, izolálására vagy amplifíkálására letétbe helyezett könyvtárban. Bizonyos megvalósítási módok szerint a polinukleotidok izolált, vagy humán vagy emlős nukleinsavkönyvtárból származó cDNS-sel másképpen komplementer genomiális szekvenciák vagy cDNS-szekvenciák.

Előnyösen a cDNS-könyvtár legalább 80% teljes hosszúságú szekvenciát, előnyösen legalább 85% vagy 90% teljes hosszúságú szekvenciát, és előnyösebben legalább 95% teljes hosszúságú szekvenciát tartalmaz. A cDNS-könyvtárat normalizálhatjuk, hogy növeljük a ritka szekvenciák reprezentációját. Tipikusan, de nem kizárólagosan alacsony vagy közepes sztringensségű hibridizációs körülményeket alkalmazunk olyan szekvenciákkal, amelyeknek csökkentett a szekvencia-azonossága komplementer szekvenciákhoz viszonyítva. Adott esetben közepes és magas sztringensségű körülményeket alkalmazhatunk nagyobb azonosságú szekvenciák esetében. Az alacsony sztringensségű körülmények lehetővé teszik körülbelül 70% szekvencia-azonosságú szekvenciák szelektív hibridizálását, és alkalmazhatók ortológ vagy paralóg szekvenciák azonosítására.

Adott esetben találmány szerinti polinukleotidok találmány szerinti polinukleotidok által kódolt ellenanyag legalább egy részletét kódolhatják. A találmány szerinti polinukleotidok olyan nukleinsav-szekvenciákat tartalmaznak, amelyek alkalmazhatók találmány szerinti ellenanyagot kódoló polinukleotidhoz való szelektív hibridizációra lásd például Ausubel, mint fent; Colligan, mint fent, amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.

Nukleinsavak előállítása

A találmány szerinti izolált nukleinsavakat (a) rekombináns eljárások, (b) szintetikus módszerek, (c) tisztítási módszerek, vagy azok kombinációjával állíthatjuk elő, amint az jól ismert a szakterületen.

A nukleinsavak kényelmesen tartalmazhatnak szekvenciákat a találmány szerinti polinukleotid mellett. Például egy vagy több endonukleáz restrikciós helyet tartalmazó többszörös klónozó helyet inzertálhatunk a nukleinsavba, hogy elősegítsük a polinukleotid izolálását. Ezenkívül transzlálható szekvenciákat inzertálhatunk a találmány szerinti transziáit

-22polinukleotid izolálásának elősegítésére. Például egy hexa-hisztidin jelzőszekvencia kényelmes lehetőséget biztosít találmány szerinti fehérjék tisztítására. A találmány szerinti nukleinsav kódoló szekvenciája mellett megtalálható nukleinsav adott esetben egy vektor, adapter vagy kapcsolómolekula a találmány szerinti polinukleotid klónozására és/vagy expresszáltatására.

További szekvenciákat is alkalmazhatunk, mint például klónozó és/vagy expressziós szekvenciákat, hogy optimalizáljuk azok funkcióját a klónozásban és/vagy expresszáltatásban, hogy elősegítsük a polinukleotid izolálását, vagy hogy javítsuk a polinukleotidnak sejtbe történő bejuttatását. Klónozó vektorok, expressziós vektorok, adapterek és kapcsolómolekulák alkalmazása jól ismert a szakterületen (lásd például Ausubel, mint fent; vagy Sambrook, mint fent)

Rekombináns eljárások nukleinsavak előállítására

A találmány szerinti izolált nukleinsav-készítmények, mint például RNS, cDNS, genomiális DNS vagy azok bármilyen kombinációja előállítható biológiai forrásokból, a szakember számára ismert számos klónozási módszer alkalmazásával. Bizonyos megvalósítási módok szerint olyan oligonukleotid-próbákat alkalmazunk a kívánt szekvencia azonosítására cDNS- vagy genomiális könyvtárban, amelyek sztringens körülmények között szelektíven hibridizálnak a találmány szerinti polinukleotidokhoz. RNS izolálása és cDNS- és genomiális könyvtárak készítése jól ismert a szakember számára (lásd például Ausubel, mint fent; vagy Sambrook, mint fent)

Nukleinsav szkrínelési és izolálási eljárások cDNS- vagy genomiális könyvtárat találmány szerinti polinukleotid szekvenciáján alapuló próbával szkrínelhetünk, mint például amilyeneket feltárunk a leírásban. Próbákat alkalmazhatunk genomiális DNS-sel vagy cDNS-szekvenciákkal történő hibridizálásra, hogy homológ géneket izoláljunk ugyanabban vagy különböző organizmusokban. A szakember számára nyilvánvaló, hogy különböző sztringensségű hibridizációt alkalmazhatunk a vizsgálati eljárásban, és vagy a hibridizációs, vagy a mosási közeg lehet sztringens. Ahogyan a hibridizációs körülmények sztringensebbé válnak, nagyobb mértékű komplementaritásnak kell lennie a próba és a célszekvencia között, hogy kialakuljon a duplex. A sztringensség mértékét a hőmérséklet, ionerősség, pH és részlegesen denaturáló oldószerek, mint például formamid közül egy vagy több alkalmazásával szabályozhatjuk. Például a hibridizáció sztringensségét kényelmesen változtathatjuk a reagensoldat polaritásának változtatásával, például a formamid koncentrációjának manipulálásával 0% és 50% közötti tartományban. A

-23 detektálható kötődéshez szükséges komplementaritás mértéke (szekvencia-azonosság) változhat a hibridizációs közeg és/vagy mosási közeg sztringensségének megfelelően. A komplementaritás mértéke optimális esetben 100%, vagy 70-100%, vagy bármely tartomány vagy érték azok között. Azonban nyilvánvaló, hogy a próba és a láncindítók kisebb szekvencia-variációit kompenzálhatjuk a hibridizációs közeg és/vagy mosási közeg sztringensségének csökkentésével.

RNS vagy DNS amplifíkálására szolgáló eljárások jól ismertek a szakterületen, és alkalmazhatók a találmány szerint, indokolatlan kísérletezés nélkül, a leírás szerinti kitanítás és iránymutatás alapján.

Ismert DNS vagy RNS amplifíkációs eljárások nem korlátozó példái közé tartozik a polimeráz-láncreakció (PCR) és azzal rokon amplifíkációs eljárások [lásd például a 4 683 195., 4 683 202., 4 795,699., 4 965 188. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat (Mullis és mtsai); a 4. és 4 921 794. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat (Tabor és mtsai.); az 5 142,033. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Innis); az 5. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Wilson és mtsai.); az 5 091 310. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Innis); az 5 066 584. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Gyllensten és mtsai ); a 4. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Gelfand és mtsai.); a 4 994 370. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Silver és mtsai.); a 4 766 067. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Biswas); a 4 656 134. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Ringold)] , és RNS-közvetített amplifíkáció, amely a célszekvencia elleni antiszensz RNS-t alkalmaz templátként a kétszálú DNS szintéziséhez [5 130 238. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (Malek és mtsai.), kereskedelmi neve NASBA], amely referenciák teljes tartalma hivatkozás útján a kitanítás részét képezi (lásd például Ausubel, mint fent; vagy Sambrook, mint fent).

Például polimeráz-láncreakció (PCR) technológiát alkalmazhatunk találmány szerinti polinukleotidok és rokon gének szekvenciáinak az amplifíkálására közvetlenül genomiális DNS vagy cDNS-könyvtárakból. A PCR és egyéb in vitro amplifíkációs eljárások szintén hasznosak lehetnek például olyan nukleinsav-szekvenciák klónozására, amelyek expresszálandó fehérjéket kódolnak, kívánt mRNS mintában való jelenlétének detektálására szolgáló próbák készítésére, nukleinsav-szekvenálásra, vagy más célokra. Szakember számára az in vitro amplifíkációs eljárások tekintetében elegendő útmutatást nyújtó módszerek példái találhatók az alábbi irodalmi helyeken: Berger, mint fent, Sambrook, mint fent, és Ausubel, mint fent, valamint Mullis és mtsai., 4 683 202. számú amerikai egyesült államokbeli

-24szabadalmi irat (1987); és Innis és mtsai., ”PCR Protocols A Guide to Methods and Applications”, kiad.: Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Kereskedelmi forgalomban kapható reagenskészletek genomiális PCR amplifikációra ismertek a szakterületen [lásd például Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech)]. Ezenfelül például a T4 gene 32 fehérje (Boehringer Mannheim) alkalmazható a hosszú PCR-termékek kitermelésének javítására.

Szintetikus eljárások nukleinsavak előállítására

A találmány szerinti izolált nukleinsavakat előállíthatjuk közvetlen kémiai szintézissel is, ismert eljárások alkalmazásával (lásd például Ausubel, és mtsai., mint fent). A kémiai szintézis általában egyszálú oligonukleotid eredményez, amelyet átalakíthatunk kétszálú DNS-sé komplementer szállal történő hibridizálás útján, vagy DNS-polimerázzal történő polimerizációval, az egyszálú DNS-t templátként alkalmazva. Szakember számára nyilvánvaló, hogy míg a DNS kémiai szintézise korlátozott lehet körülbelül 100 vagy több bázis hosszúságú szekvenciákra, hosszabb szekvenciákat előállíthatunk rövidebb szekvenciák ligálásával.

Rekombináns expressziós kazetták

A találmány tárgyát kepezik továbbá találmány szerinti nukleinsavat tartalmazó rekombináns expressziós kazetták. Találmány szerinti nukleinsavat, például találmány szerinti ellenanyagot kódoló cDNS-t vagy genomiális szekvenciát alkalmazhatunk olyan rekombináns expressziós kazetta előállítására, amelyet bejuttathatunk legalább egy kívánt gazdasejtbe. Egy rekombináns expressziós kazetta tipikusan találmány szerinti polinukleotidot tartalmazhat működőképesen kapcsolva transzkripciós iniciációs szabályozó szekvenciákhoz, amelyek irányíthatják a polinukleotid transzkripcióját a tervezett gazdasejtben. Mind heterológ, mind nem heterológ (azaz endogén) promótereket alkalmazhatunk találmány szerinti nukleinsavak expresszáltatásának irányítására.

Bizonyos megvalósítási módok szerint promóterként, enhancerként vagy más elemként szolgáló izolált nukleinsavakat juttathatunk be megfelelő pozícióban (leolvasással ellentétes irányban, leolvasással megegyező irányban vagy intronként) a találmány szerinti polinukleotid nem heterológ formájához képest, hogy serkentsük vagy gátoljuk találmány szerinti polinukleotid expresszióját. Például endogén promótereket módosíthatunk in vivo vagy in vitro, mutációval, delécióval és/vagy szubsztitúcióval.

Vektorok és gazdasejtek

A találmány tárgyát képezik továbbá olyan vektorok is, amelyek találmány szerinti izolált nukleinsav-molekulákat tartalmaznak, gazdasejtek, amelyek génsebészeti úton módosítva vannak a rekombináns vektorokkal, és legalább egy anti-IL-12 ellenanyag

-25rekombináns módszerekkel történő előállítása, amint az jól ismert a szakterületen ( lásd például Sambrook és mtsai., mint fent; Ausubel és mtsai., mint fent, amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi).

A polinukleotidokat adott esetben összekapcsolhatjuk egy szelektálható markert tartalmazó vektorral, gazdában való szaporítás céljából. Általában plazmidvektort csapadékban juttatunk be, mint például kalcium-foszfátos kicsapással, vagy töltött lipiddel alkotott komplexben. Ha vektor egy vírus, azt in vitro csomagolhatjuk egy megfelelő csomagoló sejtvonal alkalmazásával, és azután transzdukálhatjuk gazdasejtekbe.

A DNS-inzertnek működőképesen kapcsolva kell lennie egy megfelelő promóterhez. Az expressziós konstrukciók továbbá tartalmazhatnak helyeket a transzkripció iniciálására, terminálására, és az átírt régióban egy riboszóma-kötő helyet a transzlációhoz. A konstrukciók által expresszált érett transzkriptumok kódoló részlete előnyösen tartalmazhat egy transzlációs iniciátort az elején, és egy terminációs kodont (például UAA, UGA vagy UAG) megfelelően elhelyezve a transzlálandó mRNS végénél, ahol az UAA és UAG előnyös emlős vagy eukarióta sejtes expresszió esetében.

Expressziós vektorok előnyös - de csak opcionálisan - tartalmazhatnak legalább egy szelektálható markert. Ilyen markerek nem korlátozó példái közé tartozik a metotrexát (MTX), dihidrofolát-reduktáz (DHFR, 4 399 216.; 4 634 665.; 4.; 4 956 288.; 5 149 636.; 5 179 017. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok), ampicillin, neomicin (G418), mikofenolsav vagy glutamin-szintetáz (GS, 5 122 464.; 5 770 359.;· 5 827 739. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok) rezisztencia eukarióta sejttenyészet esetén, és tetraciklin vagy ampicillin rezisztenciagén E. coh-^n^ vagy más baktériumokban vagy prokariótákban történő klónozás esetén (a fenti szabadalmak teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik). Megfelelő tenyésztő tápközegek és körülmények ismertek a szakterületen a fent ismertetett gazdasejtek számára. Alkalmas vektorok nyilvánvalóak a szakember számára. Vektor konstrukció gazdasejtbe történő bejuttatását kalcium-foszfátos transzfekcióval, DEAE-dextrán-közvetített transzfekcióval, kationos lipid által közvetített transzfekcióval, elektroporációval, transzdukcióval, fertőzéssel vagy más eljárásokkal hajthatjuk végre. Ilyen eljárásokat leírtak a szakirodalomban, mint például Sambrook, mint fent, 1-4. és 16-18. fejezet; Ausubel, mint fent, 1., 9., 13., 15. és 16. fejezet.

Legalább egy találmány szerinti ellenanyagot expresszáltathatunk módosított formában, mint például fúziós fehérjeként, és nemcsak szekréciós szignálokat alkalmazhatunk, hanem további heterológ funkcionális régiókat is. Például további aminosavak, különösen töltött aminosavak egy szakaszát adhatjuk egy ellenanyag N

-26terminálisához, hogy javítsuk a stabilitását és megmaradását a gazdasejtben, a tisztítás folyamán vagy az azt követő kezelés és tárolás folyamán. Ezenkívül peptid-molekularészeket is hozzáadhatunk a találmány szerinti ellenanyaghoz, hogy elősegítsük a tisztítását. Az ilyen régiókat eltávolíthatjuk az ellenanyag, vagy legalább annak egy fragmensének végső elkészítését megelőzően. Ilyen eljárásokat sok standard laboratóriumi kézikönyvben ismertettek, mint például Sambrook, mint fent, 17.29-17.42. és 18.1-18.74. fejezet; Ausubel, mint fent, 16., 17. és 18. fejezet.

Az átlagos tudású szakember járatos a találmány szerinti fehérjét kódoló nukleinsav expresszáltatására beszerezhető számos expressziós rendszerben.

Más megoldásképpen találmány szerinti nukleinsavakat expresszáltathatunk gazdasejtben, találmány szerinti ellenanyagot kódoló endogén DNS-t tartalmazó gazdasejt (manipuláció útján történő) bekapcsolásával. Ilyen eljárások jól ismertek a szakterületen, mint például az 5 580 734., 5 641 670., 5 733 746. és 5 733 761. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok feltárása, amelyek mindegyike teljes teijedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.

Az ellenanyagok, meghatározott részeik vagy variánsaik termeltetésére alkalmas szemléltető sejttenyészetek az emlős sejtek. Az emlős sejtes rendszerek gyakran sejtek egysejtes rétegének formájában lehetnek, habár emlőssejt-szuszpenziók vagy bioreaktorok is alkalmazhatók. Számos, intakt glikozilált fehérjék expresszálására képes megfelelő gazdasejtvonalat kifejlesztettek a szakterületen, mint például a COS-1 (például ATCC CRL 1650), COS-7 (például ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (például ATCC CRL-10), CHO (például ATCC CRL 1610) és BSC-1 (például ATCC CRL-26) sejtvonalakat, Cos-7 sejteket, CHO sejteket, hep G2 sejteket, P3X63Ag8.653, SP2/0-Agl4, 293 sejteket, HeLa sejteket és hasonlókat, amelyek könnyen beszerezhetők például az ’American Type Culture Collection’tól (Manassas, Va, www.atcc. org). Előnyös gazdasejtek közé tartoznak a nyirokeredetü sejtek, mint például mielóma és limfóma sejtek. Különösen előnyös gazdasejtek a P3X63Ag8.653 sejtek (ATCC CRL-1580) és SP2/0-Agl4 sejtek (ATCC CRL-1851). Egy különösen előnyös megvalósítási mód szerint a rekombináns sejt P3X63Ab8.653 vagy SP2/0Agl4 sejt.

Az ezekben a sejtekben alkalmazható expressziós vektorok tartalmazhatnak az alábbi nem korlátozó példaként szolgáló expressziós szabályozó szekvenciák közül egyet vagy többet: replikációs origó, promoter [például a késői vagy korai SV40 promoter, az CMV promoter (5 168 062. és 5 385 839. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok), HSV tk promoter, pgk (foszfoglicerát-kináz) promoter, EF-1 alfa promoter (5 266 491. számú

-27• · · · · · · ···· ···· ·· w ·· amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat), legalább egy humán immunglobulin promoter]; enhancer és/vagy feldolgozási információs hely, mint például riboszóma-kötő hely, RNS ’splicing’ hely, poliadenilációs hely (például SV40 nagy T antigén poli-A addíciós hely), és transzkripciós terminátor szekvenciák (lásd például Ausubel, és mtsai., mint fent; Sambrook és mtsai., mint fent). Találmány szerinti nukleinsavak vagy fehérjék előállítására alkalmas egyéb sejtek ismertek és/vagy beszerezhetők például az ’American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas’-tól (www. atcc.org) vagy más ismert vagy kereskedelmi forrásokból.

Amikor eukarióta gazdasejteket alkalmazunk, tipikusan poliadenilációs vagy transzkripciós terminátor szekvenciákat építünk be a vektorba. Terminátor szekvencia egy példája a szarvasmarha növekedési hormon génjéből származó poliadenilációs szekvencia. Szintén alkalmazhatunk a transzkriptum pontos „splicing”jére szolgáló szekvenciákat is. ’Splicing” szekvencia egy példája az SV40-ből származó VP1 intron [Sprague, és mtsai., J. Virol. 45, 773-781. old. (1983)]. Ezenkívül a gazdasejtben történő replikáció szabályozására szolgáló génszekvenciákat is beépíthetünk a vektorba, amint az ismert a szakterületen.

Ellenanyag tisztítása

Anti-IL-12 ellenanyagot jól ismert eljárások alkalmazásával nyerhetünk vissza és tisztíthatunk rekombináns sejttenyészetekből, nem korlátozó példaként protein-A tisztítással, ammónium-szulfátos vagy etanolos kicsapással, savas extrakcióval, anion- vagy kationcserélő kromatográfiával, foszfocellulóz kromatográfiával, hidrofób kölcsönhatási kromatográfiával, affínitási kromatográfiával, hidroxilapatit kromatográfiával és lektin kromatográfiával. Nagyteljesítményű folyadékkromatográfiát („HPLC”) is alkalmazhatunk a tisztításra [lásd például Colligan, „Current Protocols in Immunology”, vagy „Current Protocols in Protein Science”, kiad.: John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001), például az 1., 4., 6., 8., 9., 10. fejezet, amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi],

A találmány szerinti ellenanyagok természetes úton tisztított termékek, kémiai szintézis eljárások termékei, és rekombináns módszerekkel eukarióta gazdából, többek között például élesztő, magasabbrendű növényi, rovar és emlős sejtekből előállított termékek. A rekombináns tenyésztési előállítási alkalmazott gazdától függően a találmány szerinti ellenanyag lehet glikozilált vagy lehet glikozilálatlan, ahol a glikozilált előnyös. Ilyen eljárásokat leírtak sok standard laboratóriumi kézikönyvben, mint például Sambrook, mint fent, 17.37-17.42. szakaszok; Ausubel, mint fent, 10., 12., 13., 16., 18. és 20. szakaszok, Colligan,

-28« · · · · · ♦ ·*·· *· ·* ·· „Protein Science , mint fent, 12-14. szakaszok, amelyek mindegyike teljes teijedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.

Anti-IL-12 ellenanyagok

A találmány szerinti izolált ellenanyagok a találmány szerinti polinukleotidok bármelyike által kódolt ellenanyagot tartalmaznak, amint a leírásban részletesebben is feltárjuk, vagy bármilyen izolált vagy előállított ellenanyagot. Előnyösen a humán ellenanyag vagy antigén-kötő fragmens humán IL-12-t köt, és ezáltal részlegesen vagy lényegében semlegesíti a fehérje legalább egy biológiai aktivitását. Ellenanyag vagy annak meghatározott részlete vagy variánsa, amely részlegesen vagy előnyösen lényegében semlegesíti legalább egy IL-12 fehérje vagy fragmens legalább egy aktivitását, kötheti a fehérjét vagy fragmenst, és ezáltal gátolhatja a IL-12-nek az IL-12-receptorhoz való kötődésén vagy más IL-12-től függő vagy azáltal közvetített mechanizmuson keresztül történő aktivitását. A leírás szerinti értelemben „semlegesítő ellenanyag alatt olyan ellenanyagot értünk, amely képes gátolni egy TNF-fuggő aktivitást körülbelül 20-120%-kal, előnyösen legalább körülbelül 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 0,94, 96, 97, 98, 99, 100%-kal vagy jobban, a vizsgálati eljárástól függően. Egy anti-IL-12 ellenanyag képességét IL-12-függő aktivitás gátlására előnyösen legalább egy alkalmas IL-12-fehérje vagy -receptor vizsgálati eljárással állapítjuk meg, amint azt a leírásban feltárjuk és/vagy ismert a szakterületen. Találmány szerinti humán ellenanyag bármilyen osztályba (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, stb.) vagy izotípusba tartozhat, és tartalmazhat kappa vagy lambda könnyűláncot. Egy megvalósítási mód szerint a humán ellenanyag IgG nehézláncot vagy meghatározott fragmenst tartalmaz, például az IgGl, IgG2, IgG3 vagy IgG4 izotípusok legalább egyikét. Ilyen típusú ellenanyagokat transzgenikus egerek vagy más transzgenikus nem humán emlősök alkalmazásával állíthatunk elő, amelyek legalább egy humán könnyűlánc [például IgG, IgA és IgM (például γΐ, γ2, γ3, γ4)] transzgént tartalmaznak, amint azt a leírásban feltárjuk és/vagy ismert a szakterületen. Egy másik megvalósítási mód szerint az anti-humán IL-12 ellenanyag IgGl nehézláncot és IgGl könnyűláncot tartalmaz.

Legalább egy találmány szerinti ellenanyag kötődik legalább egy meghatározott epitóphoz, amely specifikus legalább egy IL-12 fehérjére, alegységre, fragmensre, részletre vagy azok bármilyen kombinációjára. A legalább egy epitóp legalább egy ellenanyag-kötő régiót tartalmazhat, amely a fehérje legalább egy olyan részletét tartalmazza, amely epitóp előnyösen a fehérje legalább egy extracelluláris, oldható, hidrofil, külső vagy citoplazmatikus részletét tartalmazza. A legalább egy meghatározott epitóp a 9. azonosítószámú szekvencia .♦ j· ”ϊ .*·.

-29összefuggő aminosavainak teljes meghatározott részletének legalább egy 1-3 aminosav hosszúságú legalább egy aminosav-szekvenciájának bármilyen kombinációját tartalmazhatja.

Általában a találmány szerinti humán ellenanyag vagy antigén-kötő fragmens olyan antigén-kötő régiót tartalmazhat, amely legalább egy humán komplementaritást meghatározó 5 régiót (CDR1, CDR2 vagy CDR3), vagy legalább egy nehézlánc variábilis régió variánsát és legalább egy humán komplementaritást meghatározó régiót (CDR1, CDR2 vagy CDR3), vagy legalább egy könnyűlánc variábilis régió variánsát tartalmazhatja. Nem korlátozó példaként az ellenanyag vagy antigén-kötő részlet vagy variáns tartalmazhat legalább egy 3. azonosítószámú szekvencia szerinti nehezlanc CDR3-at es/vagy 6. azonosítószámú 10 szekvencia szerinti könnyűlánc CDR3-at. Egy előnyös megvalósítási mód szerint az ellenanyag vagy antigén-kötő fragmens tartalmazhat egy olyan antigén-kötő régiót, amely legalább egy, a megfelelő 1., 2. és/vagy 3. CDR (például 1., 2. és/vagy 3. azonosítószámú szekvencia) aminosav-szekvenciájával rendelkező nehézlánc CDR (azaz CDR1, CDR2 és/vagy CDR3) legalább egy részletét tartalmazza. Egy másik előnyös megvalósítási mód 15 szerint az ellenanyag vagy antigén-kötő részlet vagy variáns tartalmazhat egy olyan antigénkötő régiót, amely legalább egy, a megfelelő 1., 2. és/vagy 3. CDR (például 4., 5. és/vagy 6. azonosítószámú szekvencia) aminosav-szekvenciájával rendelkező könnyűlánc CDR (azaz CDR1, CDR2 és/vagy CDR3) legalább egy részletét tartalmazza. Egy előnyös megvalósítási mód szerint az ellenanyag vagy antigén-kötő fragmens három nehézlánc CDR-jének és a 20 három könnyűlánc CDR-jének az aminosav-szekvenciája a leírásban feltárt 12B75, C340, vagy bármely egyéb monoklonális ellenanyagok legalább egyikének a megfelelő CDR aminosav-szekvenciája. Ilyen ellenanyagokat előállíthatunk az ellenanyag különböző részleteinek (például CDR, vázrégió) kémiai összekapcsolásával, hagyományos módszerek alkalmazásával, az ellenanyagot kódoló (egy vagy több) nukleinsav-molekula előállításával és expresszáltatásával, rekombináns DNS technológia hagyományos módszereinek alkalmazásával, vagy bármely más alkalmas eljárás alkalmazásával.

Az anti-IL-12 ellenanyag legalább egy, meghatározott aminosav-szekvenciájú nehéz vagy könnyűlánc variábilis régiót tartalmazhat. Például egy előnyös megvalósítási mód szerint az anti-IL-12 ellenanyag legalább egy nehézlánc variábilis régió - amelynek adott 30 esetben a 7. azonosítószámú szekvencia szerinti a szekvenciája - és/vagy legalább egy könnyűlánc variábilis régió - amelynek adott esetben a 8. azonosítószámú szekvencia szerinti a szekvenciája - legalább egyikét tartalmazza. Humán IL-12-höz kötődő ellenanyagok, amelyek meghatározott nehéz és könnyűlánc variábilis régiót tartalmaznak, alkalmas eljárások alkalmazásával állíthatók elő, mint például fágprezentációval [Katsube, Y. és mtsai.,

	-31 -	4 · »·· ·· ··
Egybetűs kód	Hárombetűs kód	Név	Hármas nukleotid kodon(ok)
A	Alá	Alanin	GCA, GCC, GCG, GCU
C	Cys	Cisztein	UGC, UGU
D	Asp	Aszparaginsav	GAC, GAU
E	Glu	Glutaminsav	OÁÁ, Ó AG
F	Phe	Fenilanin	uuc, uuu
G	Gly	Glicin	GGA, GGC, GGG, GGU
H	His	Hisztidin	TÁC, ÓAU
I	He	Izoleucin	AUA, AUC, AUU
K	Lys	Lizin	AAA, AAG
L	Leu	Leucin	UUA, WG, CUA, CUC, CUG, CUU
M	Met	Metionin	AUG
N	Asn	Aszparagin	AAC, AAU
P	Pro	Prolin	CCA, CCC, CCG, CCU
Q	Gin	Glutamin	ÓAA, CAG
R	Arg	Arginin	AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU
S	Ser	Szerin	AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU
T	Thr	Treonin	ÁCA, ACC, ACG, ACU
V	Val	Valin	GUA, GUC, GUG, GUU
w	Trp	Triptofán	UGG
Y	Tyr	Tirozin	UAC, UAU

Találmány szerinti anti-IL-12 ellenanyag tartalmazhat egy vagy több aminosavszubsztitúciót, deléciót vagy addíciót, akár természetes mutáció, akár emberi manipuláció eredményeképpen, amint a leírásban feltárjuk.

Természetesen azon aminosav-szubsztitúciók száma, amit a szakember végezne, sok tényezőtől függ, beleértve a fent leírtakat. Általánosságban, az aminosav-szubsztitúciók, inzerciók vagy deléciók száma bármely adott anti-IL-12 ellenanyag, fragmens vagy variáns esetében nem több, mint 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, mint például 1-30, vagy bármely tartomány vagy érték azok között, amint a leírásban meghatározzuk.

Találmány szerinti anti-IL-12 ellenanyag funkció szerint esszenciális aminosavait azonosíthatjuk a szakterületen ismert eljárások alkalmazásával, mint például helyspecifikus .:L .ώ C· ··*’

-32mutagenezissel vagy alanin-pásztázó mutagenezissel [például Ausubel, mint fent, 8., 15. fejezet; Cunningham és Wells, Science 244, 1081-1085. old. (1989)]. Az utóbbi eljárás egyedi alanin mutációkat épít be a molekula minden egyes oldallánca helyett. A kapott mutáns molekulákat azután teszteljük biológiai aktivitásra, mint például nem korlátozó példaként legalább egy IL-12-t semlegesítő aktivitásra. Az ellenanyag-kötés szempontjából kritikus helyeket azonosíthatjuk szerkezet elemzéssel is, mint például kristályosítással, magmágneses rezonanciával vagy fotoaffinitási jelöléssel [Smith és mtsai., J. Mól. Bioi. 224, 899-904. old. (1992) és de Vos és mtsai., Science 255, 306-312. old. (1992)].

Találmány szerinti anti-IL-12 ellenanyag tartalmazhatja - de nem kizárólag - az 1., 2., 3., 4., 5., 6. azonosítószámú szekvenciák legalább egyikének 5-től az összes összefüggő aminosavának számáig terjedő számú legalább egy részletét, szekvenciáját vagy kombinációját.

Találmány szerinti IL-12 ellenanyagok vagy meghatározott részletek vagy variánsok tartalmazhatják -de nem kizárólag - az 1. azonosítószámú szekvencia legalább 3-5 összefüggő aminosavát; a 2. azonosítószámú szekvencia 5-17 összefüggő aminosavát; a 3. azonosítószámú szekvencia 5-10 összefüggő aminosavát; a 4. azonosítószámú szekvencia 511 összefüggő aminosavát; az 5. azonosítószámú szekvencia 5-7 összefüggő aminosavát; a 6. azonosítószámú szekvencia 5-9 összefüggő aminosavát; a 7. azonosítószámú szekvencia Leu21, Lys76, Met83, Ser85 aminosavait.

Anti-IL-12 ellenanyag továbbá tartalmazhatja adott esetben az 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. vagy 8. azonosítószámú szekvenciák 5, 17, 10, 11, 7, 9, 119 vagy 108 összefüggő aminosava legalább egyikének legalább 70-100%-át tartalmazó polipeptidet.

Egy megvalósítási mód szerint immunglobulin lánc vagy részlete (például variábilis régió, CDR) aminosav-szekvenciája körülbelül 70-100%-ban (például 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%, vagy bármely tartomány vagy érték ezek között) azonos a 7. vagy 8. azonosítószámú szekvenciák legalább egyike megfelelő láncának aminosav-szekvenciájával. Például egy könnyűlánc variábilis régió aminosav-szekvenciáját összehasonlíthatjuk a 8. azonosítószámú szekvenciával, vagy egy nehézlánc CDR3 aminosav-szekvenciáját összehasonlíthatjuk a 3. azonosítószámú szekvenciával. Előnyösen a 70-100% amino sav-azonosságot (azaz 90, 91, 92, 93 , 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, vagy bármely tartományt vagy értéket ezek között) alkalmas számítógépi algoritmus alkalmazásával határozhatjuk meg, amint az ismert a szakterületen.

Szemléltető nehézlánc és könnyűlánc variábilis régió szekvenciákat mutatunk be a 7. és 8. azonosítószámú szekvenciákon. A találmány szerinti ellenanyagok vagy azok

-33 * ♦·· ·· ·· .-.•‘μ.··.-* meghatározott variánsai tartalmazhatnak bármilyen számú összefüggő aminosav-oldalláncot egy találmány szerinti ellenanyagból, ahol ez a szám egy anti-IL-12 ellenanyag összefüggő oldalláncai számának 10-100%-a közötti egész számok bármelyike. Adott esetben az összefüggő aminosavak ezen szubszekvenciája legalább körülbelül 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 120 130 140 150 160,170, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 vagy több aminosav hosszúságú, vagy bármely tartomány vagy érték ezek között. Ezenkívül az ilyen szubszekvenciák száma lehet bármilyen egész szám az 1 és 20 között, mint például legalább 2, 3, 4 vagy 5.

Amint a szakember számára nyilvánvaló, a találmány tárgya legalább egy, találmány szerinti biológiailag aktív ellenanyag. A biológiailag aktív ellenanyagoknak az aktivitása legalább 20%-a, 30%-a vagy 40%-a, és előnyösen legalább 50%-a, 60%-a vagy 70%-a, és legelőnyösebben legalább 80%-a, 90%-a vagy 95%-1000%-a a natív (nem szintetikus), endogén vagy rokon és ismert formának. Enzimatikus aktivitás és szubsztrát-specifitás mérésére és mennyiségi meghatározására szolgáló eljárások jól ismertek a szakember számára.

Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát humán ellenanyagok és antigen-köto fragmensek kepezik, amint azokat a leírásban feltárjuk, amelyek egy szerves molekularész kovalens kapcsolásával módosítva vannak. Az ilyen módosítások olyan ellenanyagot vagy antigén-kötő fragmenst eredményezhetnek, amelynek javítottak a farmakokinetikai paraméterei (például megnövekedett in vivo szérum-féléletidő). A szerves molekularész lehet lineáris vagy elágazó hidrofil polimer-csoport, zsírsav-csoport vagy zsírsav-észter-csoport. Előnyös megvalósítási módok szerint a hidrofil polimer-csoportnak a molekulatömege körülbelül 800 és körülbelül 120000 Dalton között lehet, és az polialkánglikol [például polietilén-glikol (PEG), polipropilén-glikol (PPG)], szénhidrát polimer, aminosav polimer vagy polivinil-pirrolidon lehet, és a zsírsav vagy zsírsav-észter csoport körülbelül 8 és körülbelül 40 közötti számú szénatomot tartalmazhat.

A találmány szerinti módosított ellenanyagok és antigén-kötő fragmensek tartalmazhatnak egy vagy több szerves molekularészt, amely kovalensen kötődik az ellenanyaghoz, akár közvetlenül, akár közvetetten. A találmány szerinti ellenanyaghoz vagy antigén-kötő fragmenshez kötött minden egyes szerves molekularész egymástól függetlenül lehet hidrofil polimer-csoport, zsírsav-csoport vagy zsírsav-észter-csoport. A leírás szerinti értelemben a „zsírsav” kifejezés alatt monokarboxil-savakat és dikarboxil-savakat értünk. A leírás szerinti értelemben „hidrofil polimer-csoport” kifejezés alatt olyan szerves polimert értünk, amely jobban oldódik vízben, mint oktánban. Például a polilizin jobban oldódik

-34_M · ··· ·* ·· vízben, mint oktánban. Ily módon polilizin kovalens kapcsolásával módosított ellenanyag a találmány tárgykörébe tartozik. A találmány szerinti ellenanyagok módosítására alkalmas hidrofil polimerek lehetnek lineárisak vagy elágazóak, mint például polialkán-glikolok [például PEG, monometoxi-polietilén-glikol (mPEG), PPG és hasonlók], szénhidrátok (például dextrán, cellulóz, oligoszacharidok, poliszacharidok és hasonlók), hidrofil aminosavak polimerjei (például polilizin, poliarginin, poliaszpartát és hasonlók), polialkánoxidok (például polietilén-oxid, poliprolilén-oxid és hasonlók) és polivinil-pirrolidon. Előnyösen a találmány szerinti ellenanyagot módosító hidrofil polimer molekulatömege körülbelül 800 és körülbelül 150000 Dalton között van különálló molekuláris entitásként. Például PEG5000 és PEGioooo alkalmazható, ahol az alsó index a polimer Daltonban mért átlagos molekulatömege. A hidrofil polimer-csoport szubsztituálva lehet körülbelül 1-6 alkil-, zsírsav- vagy zsírsav-észter-csoporttal. Zsírsav- vagy zsírsav-észter-csoporttal szubsztituált hidrofil polimereket megfelelő eljárások alkalmazásával állíthatunk elő. Például amincsoportot tartalmazó polimert kapcsolhatjuk a zsírsav vagy zsírsav-észter karboxilcsoportjához, és zsírsav vagy zsírsav-észter aktivált karboxilját (például N,N-karbonildiimidazollal aktivált) kapcsolhatjuk a polimer hidroxil-csoportjához.

Találmány szerinti ellenanyagok módosítására alkalmas zsírsavak és zsírsav-észterek lehetnek telítettek, vagy tartalmazhatnak egy vagy több telítetlen kötést. Találmány szerinti ellenanyagok módosítására alkalmas zsírsavak például az alábbiak: n-dodekanoát (Ci₂, laurát), n-tetradekanoát (Ci₄, mirisztát), n-octadekanoát (Ci₈, sztearát), n-eikozanoát (C₂₀, arachidát) n-dokozanoát (C₂₂, behenát), n-triakontanoát (C₃₀), n-tetrakontanoát (C40), cisz-A9oktadekanoát (Ci₈, oleát), összes cisz-Á5,8,11,14-eikozáttraenoát (C₂₀, arachidonát), oktandionsav, tetradekándionsav, oktadekándionsav, dokozándionsav, és hasonlók. Alkalmas zsírsav-észterek közé tartoznak dikarboxilsavak olyan monoészterei, amelyek lineáris vagy elágazó, kisebb szénatomszámú alkil-csoportot tartalmaznak. A kisebb szénatomszámú alkilcsoport tartalmazhat körülbelül 1-12, előnyösen körülbelül 1-6 szénatomot.

A módosított humán ellenanyagokat és antigén-kötő fragmenseket alkalmas eljárások alkalmazásával állíthatjuk elő, mint például egy vagy több módosító reagenssel történő reagaltatassal. A leírás szerinti értelemben „modosito ágens” kifejezés alatt alkalmas szerves csoportot (például hidrofil polimert, zsírsavat, zsírsav-észter) értünk, amely aktiváló csoportot tartalmaz. Az „aktiváló csoport” olyan kémiai molekularész vagy funkciós csoport, amely megfelelő körülmények között - képes reagálni egy második kémiai csoporttal, és ezáltal kovalens kötést kialakítani a módosító ágens és a második kémiai csoport között. Például amin-reaktív aktiváló csoportok közé tartoznak elektrofil csoportok, mint például a tozilát,

-35r»»<· ·1<· »'* ·* * mezilát, halo (kloro, bromo, fluoro, jodo), N-hidroxiszukcinimidil-észterek (NHS) és hasonlók. Tiolokkal reagáló aktiváló csoportok közé tartozik például a maleimid, jodoacetil, akriloil, piridil-diszulfídok, 5-tiol-2-nitrobenzoesav-tiol (TNB-tiol), és hasonlók. Aldehid funkciós csoportot kapcsolhatunk amint vagy hidrazidot tartalmazó molekulákhoz, és azid csoport reagáltatható trivalens foszfor-csoporttal, foszforamidát vagy foszforimid kötéseket kialakítva. Megfelelő eljárások aktiváló csoportok molekulákba történő beépítésére ismertek a szakterületen [lásd például Hermanson, G. T., „Bioconjugate Techniques.”, kiad.: Academic Press: San Diego, CA (1996)]. Aktiváló csoport köthető közvetlenül a szerves csoporthoz (például hidrofil polimerhez, zsírsavhoz vagy zsírsav-észterhez), vagy kapcsolómolekulán keresztül, például divalens C1-C12 csoporton keresztül, amelyben egy vagy több szénatom helyettesíthető heteroatommal, mint például oxigénnel, nitrogénnel vagy kénnel. Megfelelő kapcsolómolekulák közé tartozik például a tetraetilén-glikol, -(CH₂)₃-, -NH-(CH₂)₆-NH-, -(CH₂)₂-NH- és -CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH-NH-. Kapcsolómolekulát tartalmazó módosító ágenseket előállíthatunk például mono-Boc-alkildiamin (például mono-Bocetiléndiamin, mono-Boc-diaminohexán) zsírsavval történő reagáltatásával l-etil-3-(3dimetilaminopropil)-karbodiimid (EDC) jelenlétében, amid-kötést kialakítva a szabad amin és a zsírsav karboxilja között. A Boc védőcsoportot eltávolíthatjuk a termékről trifluorecetsawal (TFA), szabaddá téve a primer amint, amely kapcsolható egy másik karboxilhoz, amint feltártuk, vagy reagáltatható maleinsav-anhidriddel, és a kapott terméket ciklizálhatjuk, a zsírsav aktivált maleimido-származékát előállítva (lásd például Thompson és mtsai., WO 92/16221. számú nemzetközi közzétételi irat, amelynek kitanítása teljes teijedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi],

A találmány szerinti módosított ellenanyagokat előállíthatjuk humán ellenanyag vagy antigén-kötő fragmens módosító ágenssel történő reagáltatásával. Például a szerves molekularészeket köthetjük az ellenanyaghoz nem specifikus módon, amin-reaktív módosító ágens alkalmazásával, például PEG NHS-észterével. Módosított humán ellenanyagokat vagy antigén-kötő fragmenseket előállíthatunk ellenanyag vagy antigén-kötő fragmens diszulfidkötéseinek (például láncon belüli diszulfid-kötéseinek) redukálásával. A redukált ellenanyagot vagy antigén-kötő fragmenst azután reagáltathatjuk tiol-reaktív módosító ágenssel, találmány szerinti módosított ellenanyagot előállítva. Találmány szerinti ellenanyag specifikus helyeihez kötött szerves molekularészt tartalmazó módosított humán ellenanyagokat és antigén-kötő fragmenseket előállíthatunk megfelelő eljárások alkalmazásával, mint például reverz proteolízissel [Fisch és mtsai., Bioconjugate Chem. 3, 147-153. old. (1992); Werlen és mtsai., Bioconjugate Chem. 5, 411-417. old. (1994); Kumaran és mtsai.,

-36Protein Sci. 6, 2233-2241. old. (1997); Itoh és mtsai., Bioorg. Chern. 24,: 59-68. old. (1996); Capellas és mtsai., Biotechnol. Bioeng. 56, 456-463. old. (1997)] és a Hermanson, G. T. által leírt eljárásokkal [„Bioconjugate Techniques.”, kiad.: Academic Press: San Diego, CA (1996)].

Anti-idiotípus ellenanyagok anti-IL-12-Ig eredetű fehérjekészítmények ellen

Monoklonális és kiméra anti-IL-12 ellenanyagok mellett a találmány tárgyát képezi ilyen találmány szerinti ellenanyagokra specifikus anti-idiotípus ellenanyag. Egy antiidiotípus ellenanyag olyan ellenanyag, amely általában egy másik ellenanyag antigén-kötő régiójával kapcsolatos egyedi determinánsokat ismer fel. Az anti-idiotípust forrásként az ellenanyaggal vagy annak CDR-t tartalmazó régiójával azonos fajba tartozó és genetikai típusú állat (például egértörzs) immunizálásával állíthatjuk elő. Az immunizált állat felismeri és válaszol az immunnizáló ellenanyag idiotipikus determinánsaira, és anti-idiotípus ellenanyagot termel. Az anti-idiotípus ellenanyag alkalmazható „immunogénként” is egy másik állatban történő immunválasz indukálására, úgynevezett anti-anti-idiotípus ellenanyagot termelve.

Antí-IL-12-Ig eredetű fehérjekészítmények

A találmány tárgyát képezi legalább egy anti-IL-12 ellenanyag készítmény is, amely legalább egy, legalább kettő, legalább három, legalább négy, legalább öt, legalább hat vagy több találmány szerinti anti-IL-12 ellenanyagot tartalmaz, amint azt a leírásban feltárjuk és/vagy ismert a szakterületen, és amelyek természetben nem előforduló készítményben, keverékben vagy formában vannak. Az ilyen készítmények természetben nem előforduló készítmények, amelyek az 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. vagy 8. azonosítószámú szekvencia vagy annak meghatározott fragmensei, doménjai vagy variánsai összefüggő aminosavai 70-100%-a bármelyike szerinti anti-IL-12 ellenanyag aminosav-szekvencia legalább egy vagy kettő, teljes hosszúságú, C- és/vagy N-terminális deléciós variánsát, doménját, fragmensét vagy meghatározott variánsát tartalmazzák. Előnyös anti-IL-12 eredetű fehérje, fragmens vagy variáns készítmények tartalmaznak legalább egy vagy kettő teljes hosszúságú CDR-tartalmú részletet, amelyek 1,2., 2., 3., 4., 5. vagy 6. azonosítószámú szekvencia, annak meghatározott fragmensei, doménjai vagy variánsai összefüggő aminosavai 70-100%-a bármelyike szerinti anti-IL-12 ellenanyag aminosav-szekvencia részletet tartalmaznak. További előnyös készítmények az 1., 2., 3., 4., 5. vagy 6. azonosítószámú szekvencia vagy annak meghatározott fragmensei, doménjai vagy variánsai 70-100%-a legalább egyikének 40-99%át tartalmazzák. Az ilyen százalékokat folyékony vagy szilárd oldatok, keverékek,

-37szuszpenziók, emulziók vagy kolloidok tömege, térfogata, koncentrációja, molaritása vagy molalitása alapján számítjuk, amint az ismert a szakterületen vagy a leírásban feltárjuk.

Találmány szerinti ellenanyag készítmények továbbá tartalmazhatják legalább egy olyan készítmény vagy gyógyászati készítmény alkalmas és hatásos mennyiségét, amely legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot tartalmaz ilyen modulálást, kezelést vagy terápiát igénylő sejt, szövet, szerv, állat vagy páciens számára, és adott esetben továbbá tartalmaz legalább egyet az alábbiak közül: IL-12 antagonista (például nem korlátozó példaként IL-12 ellenanyag vagy fragmens, oldható IL-12-receptor vagy fragmens, azok fúziós fehérjéje vagy kismolekulás IL-12 antagonista), antireumatikum (például metotrexát, auranofm, aurotioglükóz, azatioprin, etanercept, arany-nátrium-tiomalát, hidroxikloroquin-szulfát, leflunomid, szulfaszalzin), izomrelaxáns, narkotikum, nem szteroid antiinflammatorikus drog (NSAID), fájdalomcsillapító, érzéstelenítő, nyugtató, helyi érzéstelenítő, neuromuszkuláris gátlószer, mikrobaellenes szer (például aminoglikozid, gombaellenes szer, parazitaellenes szer, vírusellenes szer, karbapenem, cefalosporin, flurorquinolon, makrolid, penicillin, szulfonamid, tetraciklin, egyéb mikrobaellenes szer), pikkelysömör elleni szer, kortikoszteroid, anabolikus szteroid, diabétesszel kapcsolatos ágens, ásványi anyag, tápanyag, pajzsmirigy ágens, vitamin, kalciummal kapcsolatos hormon, hasmenés elleni szer, köhögés elleni szer, hányás elleni szer, fekély elleni szer, hashajtó, antikoaguláns, eritropoietin (például epoetin-alfa), filgrasztim (például G-CSF, Neupogen), szargramosztim (GM-CSF, Leukin), immunizáló szer, immunglobulin, immunszuppresszáns (például basiliximab, ciklosporin, daclizumab), növekedési hormon, hormonhelyettesítő drog, ösztrogén-receptor modulátor, pupillatágító szer, cikloplegiás szer, alkiláló ágens, antimetabolit, mitótikus inhibitor, radioterápiás szer, antidepresszáns, antimániás ágens, antipszichotikus szer, anxiolitikum, hipnotikum, szimpatomimetikum, stimuláns, donepezil, takrin, asztmagyógyszer, béta agonista, inhalált szteroid, leukotrién inhibitor, metilxantin, kromolin, epinefrin vagy analógja, dornáz-alfa (Pulmozyme), citokin vagy citokin antagonista. Ilyen citokinek nem korlátozó példaként lehetnek IL-1 és IL-23 között bármelyik. A megfelelő dózisok jól ismertek a szakterületen [ lásd például „Pharmacotherapy Handbook”, 2. kiadás, szerk.: Wells és mtsai., kiad.: Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); „PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition”, kiad.: Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000), amely referenciák mindegyike teljes teqedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.

Az ilyen rákellenes vagy fertőzésellenes szerek tartalmazhatnak toxin molekulákat is, amelyek kapcsolódnak, kötve vannak, együtt vannak kiszerelve vagy együtt vannak beadva

-38legalább egy, találmány szerinti ellenanyaggal. A toxin adott esetben hathat úgy, hogy szelektíven elpusztítja a patológiás sejtet vagy szövetet. A patológiás sejt lehet ráksejt vagy egyéb sejt. Ilyen toxin lehet nem korlátozó példaként tisztított vagy rekombináns toxin vagy toxin-fragmens, amely toxin - például ricin, diftériatoxin, venomtoxin vagy bakteriális toxin legalább egy funkcionális citotoxikus doménját tartalmazza. A toxin kifejezés magában foglal mind endotoxinokat, mind exotoxinokat, amelyeket bármely természetben előforduló, mutáns vagy rekombináns baktérium vagy vírus termel, és amelyek bármilyen patológiás állapotot okozhatnak emberekben és egyéb emlősökben, mint például toxin sokkot, ami halált is eredményezhet. Ilyen toxinok nem korlátozó példái enterotoxigén E. coli hőlabilis enterotoxin (LT), hőstabil enterotoxin (ST), Shigella citotoxin, Aeromonas enterotoxinok, toxikus sokk szindróma toxin-1 (TSST-1), Staphylococcus enterotoxin A (SEA), B (SEB) vagy C (SEC), Streptococcus enterotoxinok és hasonlók. Ilyen baktériumok nem korlátozó példái enterotoxigén E. coli (ETEC), enterohemorrágiás E. coli fajok törzsei (például a 0157:H7 szerotípus törzsei), Staphylococcus fajok (például Staphylococcus aureus. Staphylococcus pyogenes), Shigella fajok (például Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii és Shigella sonnei), Salmonella fajok (például Salmonella typhi, Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), Clostridium fajok (például Clostridium perjringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum), Camphlobacter fajok (például Camphlobacter jejuni, Camphlobacter fetus), Heliobacter fajok (például Heliobacter pylori), Aeromonas fajok (például Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, Vibrios fajok például Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), Klebsiella fajok, Pseudomonas aeruginosa és sztreptokokkuszok [ lásd például „INTERNAL MEDICINE”, 3. kiadás, szerk.: Stein, 1-13. old., kiad.: Little, Brown and Co., Boston, (1990); „Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control”, 2. kiadás, szerk.: Evans és mtsai., 239-254. old., kiad.: Plenum Medical Book Co., New York (1991); Mandell és mtsai., „Principles and Practice of Infectious Diseases”, 3. kiadás, kiad.: Churchill Livingstone, New York (1990); „The Merck Manual”, 16. kiadás, szerk.: Berkow és mtsai., kiad.: Merck and Co., Rahway, N.J. (1992); Wood és mtsai, FEMS Microbiology Immunology 76, 121-134.old. (1991); Marrack és mtsai., Science 248, 705-711. old. (1990), amely referenciák teljes tartalma hivatkozás útján a kitanítás részét képezi].

Találmány szerinti anti-IL-12 ellenanyag vegyületek, készítmények és kombinációk továbbá tartalmazhatnak legalább egy megfelelő kiegészítő anyagot, mint például nem korlátozó példaként oldószert, kötőszert, stabilizálószert, puffereket, sókat, lipofil oldószereket, tartósítószereket, adjuvánsokat és hasonlókat. Gyógyászatilag elfogadható

-39kiegészítő anyagok az előnyösek. Ilyen steril oldatok, és előállításukra szolgáló eljárások nem korlátozó példái jól ismertek a szakterületen, mint például nem korlátozó példaként „Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 18. kiadás, szerk.. Gennaro, kiad.: Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Rutinszerűen választhatunk ki olyan gyógyászatilag elfogadható hordozókat, amelyek alkalmasak az anti-IL-12 ellenanyag, fragmens vagy variáns készítmény beadásának módja, oldhatósága és/vagy stabilitása szerint, amint az jól ismert a szakterületen vagy feltárjuk a leírásban.

A találmány szerinti készítményben hasznos gyógyászati kötőanyagok és adalékanyagok nem korlátozó példái közé tartoznak fehérjék, peptidek, aminosavak, lipidek és szénhidrátok (például cukrok, köztük monoszacharidok, di-, tri-, tetra- és oligoszacharidok; derivatizált cukrok, mint például alditolok, aldonsavak, észterifíkált cukrok és hasonlók; és poliszacharidok vagy cukorpolimerek), amelyek egyedül vagy kombinációban lehetnek jelen, 1-99,99 Λ mennyiségben egyedül vagy kombinációban tömeg vagy térfogat szerint. Szemléltető fehérje kötőanyagok lehetnek a szérumalbuminok, mint például humán szérumalbumin (HSA), rekombináns humán albumin (rHA), zselatin, kazein és hasonlók. Reprezentatív aminosav/ellenanyag komponensek - amelyek pufferként is működhetnek lehetnek alanin, glicin, arginin, bétáin, hisztidin, glutaminsav, aszparaginsav, cisztein, lizin, leucin, izoleucin, valin, metionin, fenilalanin, aszpartám és hasonlók. Egy előnyös aminosav a glicin.

A találmány szerint megfelelően alkalmazható szénhidrát kötőanyagok például a monoszacharidok, mint például fruktoz, maltoz, galaktóz, glükóz, D-mannóz, szorbóz és hasonlók; diszacharidok, mint például laktóz, szukróz, trehalóz, cellobióz és hasonlók; poliszacharidok, mint például raffinóz, melezitóz, maltodextrinek, dextránok, keményítők és hasonlók; és alditolok, mint például mannitol, xilitol, maltitol, laktitol, xilitol szorbitol (glucitol), mioinozitol és hasonlók. A találmány szerinti alkalmazható előnyös szénhidrát kötőanyagok a mannitol, trehalóz és raffinóz.

Anti-IL-12 ellenanyag készítmények tartalmazhatnak puffért vagy pH-állító ágenseket is; tipikusan a puffer szerves savból vagy bázisból készített só. Reprezentatív pufferek közé tartoznak szerves savak sói, mint például citromsav, aszkorbinsav, glukonsav, szénsav borkősav, borostyánkősav, ecetsav vagy ftálsav sói, Tris, trometamin-hidroklorid vagy foszfát pufferek. A találmány szerinti készítményekben történő alkalmazásra előnyös pufferek szerves savak sói, mint például citrát.

Ezenfelül a találmány szerinti anti-TNF ellenanyag készítmények tartalmazhatnak polimer kötőanyagokat/adalékanyagokat, mint például polivinil-pirrolidonokat, fícoll-okat .u.

(polimer cukor), dextránokat (például ciklodextrineket, mint például 2-hidroxipropil-áciklodextrint), polietilén-glikolokat, ízesítőszereket, mikrobaellenes szereket, édesítőszereket, antioxidánsokat, antisztatikus ágenseket, felületaktív anyagokat (például poliszorbátokat, mint például „TWEEN 20”-at és „TWEEN 80”-at), lipideket (például foszfolipideket, zsírsavakat), szteroidokat (például koleszterint) és komplexképző ágenseket (például EDTA-t).

Ezek és további, találmány szerinti anti-TNF ellenanyag, részlet vagy variáns készítményekben történő alkalmazásra megfelelő, ismert gyógyászati kötőszerek és/vagy adalékanyagok ismertek a szakterületen, például amint a „Remington: The Science & Practice of Pharmacy” [19. kiadás szerk: Williams & Williams (1995)] és a „Physician's Desk Reference” [52. kiadás, kiad.: Medical Economics, Montvale, NJ (1998)] felsorolja, amely referenciák teljes tartalma hivatkozás útján a kitanítás részét képezi. Előnyös hordozó vagy kötőszer anyagok szénhidrátok (például szacharidok és alditolok) és pufferek (például citrát) vagy polimer ágensek.

Kiszerelések

Amint fent megjegyeztük, a találmány tárgyát stabil készítmények képezik, ami előnyösen foszfát-puffer sóoldattal vagy egy kiválasztott sóval, valamint tartósított oldatok és kiszerelések, amelyek tartósítószert valamint többszörös felhasználású tartósított kiszereléseket tartalmaz, amelyek alkalmasak gyógyászati vagy állatgyógyászati alkalmazásra, és amelyek legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot tartalmaznak gyógyászatilag elfogadható kiszerelésben. Tartósított kiszerelések legalább egy ismert tartósítószert tartalmaznak, vagy adott esetben legalább egyet az alábbiak közül: fenol, m-krezol, p-krezol, o-krezol, klorokrezol, benzilalkohol, fenil-higany-nitrit, fenoxietanol, formaldehid, klorobutanol, magnézium-klorid (például hexahidrát), alkilparabén (metil, etil, propil, butil és hasonlók), benzalkónium-klorid, benzetónium-klorid, nátrium-dehidroacetát vagy timerozál, vagy azok keveréke vizes oldószerben. Bármilyen megfelelő koncentrációt vagy keveréket alkalmazhatunk, amint az ismert a szakterületen, mint például 0,001-5%, vagy bármilyen tartomány vagy érték ezek között, mint például nem korlátozó példaként 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 6,1, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, vagy bármilyen tartomány vagy érték ezek között. Nem korlátozó példa lehet: tartósítószer nélkül, 0,1-2% m-krezol (például 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,1-3% benzil-alkohol (például 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%), 0,001-0,5% timerozál (például 0,005, 0,01), 0,001-2,0% fenol (például 0,05, 0,25, 0,28, 0,5,

-41 0,9, 1,0%), 0,0005-1,0% alkilparabén(ek) (például 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%), és hasonlók.

Amint fent megjegyeztük, a találmány tárgyát képezi gyártott termék, amely csomagolóanyagot és legalább egy fiolát tartalmaz, amely fiola legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot tartalmaz az előírt pufferekkel és/vagy tartósítószerekkel, adott esetben vizes oldószerben, és a csomagolóanyag olyan címkét tartalmaz, amely jelzi azt, hogy az oldat tárolható 1, 2, 3, 4, 5 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 órán keresztül vagy tovább. A találmány tárgyát képezi továbbá gyártott termék, amely csomagolóanyagot, egy első, legalább egy liofílizált anti-IL-12 ellenanyagot tartalmazó fiolát, és egy második, előírt puffer vagy tartósítószer vizes oldatát tartalmazó fiolát tartalmaz, és a csomagolóanyag olyan címkét tartalmaz, amely utasítja a pácienst arra, hogy oldja fel a legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot a vizes oldószerben olyan oldatot előállítva, amely 24 órán keresztül vagy tovább tárolható.

A találmány szerint alkalmazott legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot rekombináns úton állíthatjuk elő, beleértve emlős sejtekből vagy transzgenikus készítményekből, vagy tisztíthatjuk más biológiai forrásokból, amint azt a leírásban feltárjuk vagy ismert a szakterületen.

A találmány szerinti termékben található legalább egy anti-IL-12 ellenanyag koncentráció-tartománya olyan mennyiségeket tartalmaz, hogy egy nedves/száraz rendszerben a feloldást követően az körülbelül 1,0 pg/ml és körülbelül 1000 mg/ml között van, habár alacsonyabb és magasabb koncentrációk is működőképesek, és a tervezett bejuttató eszköztől függenek, például oldat kiszerelések különbözhetnek transzdermális, pulmonáris, nyálkahártyái vagy ozmotikus pumpa vagy mikropumpa eljárások esetében.

Előnyösen a vizes oldószer adott esetben továbbá tartalmaz gyógyászatilag elfogadható tartósítószert is. Előnyös tartósítószerek közé tartoznak az m-krezol, p-krezol, okrezol, klorokrezol, benzil-alkohol, alkilparabén (metil, etil, propil, butil és hasonlók), benzalkónium-klorid, benzetónium-klorid, nátrium-dehidroacetát vagy timerozál, vagy ezek keverékei. A kiszerelésben alkalmazott tartósítószer koncentrációja olyan, hogy elegendő legyen mikrobaellenes hatás kifejtéséhez. Az ilyen koncentráció függ a kiválasztott tartósítószertől, és szakember számára könnyedén meghatározható.

Más kötőanyagok, például izotóniás ágensek, pufferek, antioxidánsok, tartósítószert segítő anyagok adhatók adott esetben és előnyösen az oldószerhez. Izotóniás ágenst, mint például glicerint általánosan alkalmaznak ismert koncentrációkban. Előnyösen fiziológiailag tolerált puffer is adhatunk javított pH-szabályozás biztosítására. A kiszerelések széles pH

-42tartományt felölelhetnek, mint például körülbelül pH 4 és körülbelül pH 10 között, és előnyös tartomány a körülbelül pH 5 és körülbelül pH 9 közötti, és legelőnyösebb tartomány a körülbelül 6,0 és körülbelül 8,0 közötti. Előnyösen a találmány szerinti kiszerelések pH-ja körülbelül 6,8 és körülbelül 7,8 közötti. Előnyös pufferek közé tartoznak a foszfát-pufferek, legelőnyösebben nátrium-foszfát, különösen előnyösen a foszfát-pufferelt sóoldat (PBS).

Más adalékanyagok, mint például gyógyászatilag elfogadható szolubilizáló szerek, mint például Tween20 [polioxietilén (20) szorbitán monolaurát], Tween 40 [polioxietilén (20) szorbitán monopalmitát], Tween 80 [polioxietilén (20) szorbitán monooleát], Pluronic F68 (polioxietilén polioxipropilén blokk-kopolimerek) és PEG (polietilén-glikol) vagy nem ionos felületaktív anyagok, mint például poliszorbát 20 vagy 80 vagy poloxamer 184 vagy 188, Pluronic® poliolok, egyéb blokk-kopolimerek és komplexképzők, mint például EDTA és EGTA adható adott esetben hozzá a kiszerelésekhez vagy kompozíciókhoz az aggregáció csökkentésére. Ezek az adalékanyagok különösen hasznosak, ha pumpás vagy műanyag tartályt alkalmazunk a kiszerelés beadására. A gyógyászatilag elfogadható felületaktív anyag jelenléte csökkenti a fehérje aggregációra való hajlamát.

A találmány szerinti kiszereléseket olyan eljárással állíthatjuk elő, amely során legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot összekeverünk vizes oldószerben az alábbi tartósítószerek bármelyikével: fenol, m-krezol, p-krezol, o-krezol, klorokrezol, benzil-alkohol, alkilparabén (metil, etil, propil, butil és hasonlók), benzalkónium-klorid, benzetónium-klorid, nátrium-dehidroacetát vagy timerozál vagy ezek keverékei. A legalább egy anti-IL-12 ellenanyag és tartósítószer vizes oldószerben történő összekeverését hagyományos feloldási és keverési módszerekkel hajtjuk végre. Alkalmas kiszerelések előállításához például legalább egy anti-IL-12 ellenanyag puffereit oldatban lemért mennyiségét kombináljuk puffereit oldatban lévő kívánt tartósítószerrel olyan mennyiségben, hogy az megfelelő legyen a fehérje és a tartósítószer kívánt koncentrációjának a biztosítására. Ezen eljárás variációi nyilvánvalóak az átlagos képességű szakember számára. Például a komponensek hozzáadásának a sorrendje, további adalékanyagok alkalmazása, a hőmérséklet és a pH, amelyen a kiszerelést előállítjuk, mind olyan tényezők, amelyek optimalizálhatok a koncentráció és az alkalmazott beadási mód függvényében.

A találmány szerinti kiszereléseket áttetsző oldatként biztosíthatjuk a páciensek számára, vagy dupla fiolaként, amelyek egyike legalább egy liofilizált anti-IL-12 ellenanyagot tartalmaz, amelyet feloldandó egy második fiolában, amely vizet, tartósítószert és/vagy kötőanyagokat tartalmaz, előnyösen foszfát-puffért és/vagy sóoldatot vagy kiválasztott sót vizes oldószerben. Akár az egyetlen oldószeres fiola, akár a feloldást igénylő dupla fiola

-43 újrafelhasználható több alkalommal, és elegendő lehet a páciens kezelésének több ciklusára, és ily módon kényelmesebb kezelési rendet tehet lehetővé, mint a jelenleg rendelkezésre állók.

A találmány szerinti gyártott termékek azonnalitól 24 órán belül vagy később történő beadásra alkalmazhatók. Ennek megfelelően a találmány szerinti gyártott termékek szignifikáns előnyöket biztosítanak a páciens számára. A találmány szerinti kiszereléseket adott esetben biztonságosan tárolhatjuk körülbelül 2 és körülbelül 40°C között, és megtartják a fehérje biológiai aktivitását hosszú időn keresztül, ily módon lehetővé tesznek egy olyan címkét a csomagon, amely azt jelzi, hogy az oldat tárolható és/vagy felhasználható 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 vagy 96 órán keresztül vagy tovább. Ha tartósított oldószert alkalmazunk, az ilyen címke 1-12 hónapos, fél éves, másfél éves és/vagy két éves felhasználást tartalmazhat.

A legalább egy találmány szerinti anti-IL-12 ellenanyag oldatait olyan eljárással állíthatjuk elő, amely során legalább egy ellenanyagot elkeverünk vizes oldószerben. Az elkeverést hagyományos feloldási és keverési módszerek alkalmazásával hajtjuk végre. Alkalmas oldószer előállításához például legalább egy ellenanyag mért mennyiségű vizes vagy pufferes oldatát kombináljuk olyan mennyiségben, amely megfelelő a fehérje és adott esetben tartósítószer vagy puffer kívánt koncentrációjának biztosítására. Ezen eljárás variációi nyilvánvalóak az átlagos képességű szakember számára. Például a komponensek hozzáadásának a sorrendje, további adalékanyagok alkalmazása, a hőmérséklet és a pH, amelyen a kiszerelést előállítjuk, mind olyan tényezők, amelyek optimalizálhatok a koncentráció és az alkalmazott beadási mód függvényében.

A találmány szerinti termékeket áttetsző oldatként biztosíthatjuk a páciensek számára, vagy dupla fiolaként, amelyek egyike legalább egy liofilizált anti-IL-12 ellenanyagot tartalmaz, amely feloldandó egy második fiolában, amely vizes oldószert tartalmaz. Akár az egyetlen oldószeres fiola, akár a feloldást igénylő dupla fiola újrafelhasználható több alkalommal, és elegendő lehet a páciens kezelésének több ciklusára, és ily módon kényelmesebb kezelési rendet tesz lehetővé, mint a jelenleg rendelkezésre állók.

A találmány szerinti termékeket közvetve biztosíthatjuk a páciensek számára gyógyszertárak, klinikák vagy egyéb ilyen intézetek és intézmények útján, áttetsző oldatként vagy dupla fiolaként, amelyek egyike legalább egy liofilizált anti-IL-12 ellenanyagot tartalmaz, amely feloldandó egy második fiolában, amely vizes oldószert tartalmaz. Ebben az esetben az áttetsző oldat akár egy liter vagy több is lehet, nagyobb készletet biztosítva, amelyből a legalább egy ellenanyag kisebb részleteit ki lehet venni egy vagy több • I*·

-44alkalommal, kisebb fiolákba áttéve, és a gyógyszertár vagy klinika biztosítja azokat a vásárlóik és/vagy pácienseik számára.

Ezeket az egyszeres fiolákat tartalmazó ismert eszközök közé tartoznak az oldat bejuttatására szolgáló toll-injektoros eszközök, mint például BD Pen, BD Autojector®, Humaject®, NovoPen®, B-D®Pen, AutoPen® és OptiPen®, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, Biojector®, iject®, J-tip Needle-Free Injector®, Intraject®, Medi-Ject®, amelyket például az alábbi cégek készítenek és fejlesztettek ki: Becton Dickensen (Franklin, Lakes, NJ, www.bectondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Switzerland, www.disetronic.com); Bioject (Portland, Oregon, www.bioject.com); National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, UK, www.weston-medical.com), Medi-Ject Corp. (Minneapolis, MN, www.mediject.com). Dupla fiolás rendszert tartalmazó ismert eszközök a liofilizált drog kazettában történő feloldására, és az oldat bejuttatására szolgáló toll-injektor rendszerek, mint például a HumatroPen®.

A találmány szerinti termékek csomagolóanyagot tartalmaznak. A csomagolóanyag - a hatóságok által megkövetelt információk mellett - ismerteti azokat a körülményeket, amelyek között a termék alkalmazható. A találmány szerinti csomagolóanyag utasításokat biztosít a páciens számára a legalább egy anti-IL-12 ellenanyag feloldására a vizes oldószerben oldat kialakítása végett, és az oldat alkalmazására 2-24 órás vagy hosszabb időtartamon belül a kétfiolás, nedves/száraz termék esetén. Az egyfiolás, oldat termék esetében a címke jelzi, hogy az ilyen oldat 2-24 órán keresztül vagy tovább is felhasználható. A találmány szerinti termékek alkalmazhatók humán gyógyászati alkalmazásra.

A találmány szerinti kiszereléseket legalább egy anti-IL-12 ellenanyag és kiválasztott puffer, előnyösen sóoldatot vagy kiválasztott sót tartalmazó foszfát-puffer összekeverését tartalmazó eljárással lehet előállítani. A legalább egy ellenanyag és puffer vizes oldószerben történő összekeverését hagyományos feloldási és keverési módszerekkel hajtjuk végre. Alkalmas kiszerelések előállításához például legalább egy ellenanyag vizes vagy pufferes lemért mennyiségét kombináljuk a kívánt pufferelő ágenssel olyan mennyiségben, hogy az megfelelő legyen a fehérje és a puffer kívánt koncentrációjának a biztosítására. Ezen eljárás variációi nyilvánvalóak az átlagos képességű szakember számára. Például a komponensek hozzáadásának a sorrendje, további adalékanyagok alkalmazása, a hőmérséklet és a pH, amelyen a kiszerelést előállítjuk, mind olyan tényezők, amelyek optimalizálhatok a koncentráció és az alkalmazott beadási mód függvényében.

A találmány szerinti stabil vagy tartósított kiszereléseket áttetsző oldatokként biztosíthatjuk a páciensek számára, vagy dupla fiolaként, amelyek egyike legalább egy

-45liofílizált anti-IL-12 ellenanyagot tartalmaz, amelyet feloldandó egy második fiolában, amely tartósítószert vagy puffer és kötőanyagokat tartalmaz vizes oldószerben. Akár az egyetlen oldószeres fiola, akár a feloldást igénylő dupla fiola újrafelhasználható több alkalommal, és elegendő lehet a páciens kezelésének több ciklusára, és ily módon kényelmesebb kezelési rendet tesz lehetővé, mint a jelenleg rendelkezésre állók.

A legalább egy, találmány szerinti stabil vagy tartósított kiszerelésekben vagy oldatokban lévő anti-IL-12 ellenanyagot a találmány szerint beadhatjuk a páciensnek számos különféle beadási eljárás alkalmazásával, mint például SC vagy IM injekcióval; transzdermális, pulmonáris, transzmukózális, implantátum, ozmotikus pumpa, kazetta, mikropumpa, vagy egyéb, szakember számára ismert módon, amint az ismert a szakterületen.

Terápiás alkalmazások

A találmány tárgyát képezi eljárás is legalább egy immunológiai betegség modulálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben, amelynek nem korlátozó példája az alábbiak közül legalább egy: reumatoid artritisz, fiatalkori reumatoid artritisz, szisztémás kialakulású fiatalkori reumatoid artritisz, sömörös artritisz, összenövéses csigolyagyulladás, gyomorfekély, szeronegatív izületi betegségek, oszteoartritisz, gyulladásos bélbetegség, fekélyes bélgyulladás, szisztémás lupusz eritematozus, anti-foszfolipid szindróma, szivárványhártya gyulladás/uveitisz/szemideg gyulladás, idiopátiás pulmonáris fibrózis, szisztémás érgyulladás/Wegener-féle granulomatózis, szarkoidózis, heregyulladás/vazektómiát megfordító eljárások, allergiás/atópiás betegségek, asztma, allergiás ormyálkahártya gyulladás, ekcéma, allergiás érintéses bőrgyulladás, allergiás kötőhártya gyulladás, hiperszensitivitásos tüdőgyulladás, transzplantálás, szervátültetési kilökődés, „graft-versus-host” betegség, szisztémás gyulladásos szindróma, szepszis szindróma, grampozitív szepszis, gram-negatív szepszis, tenyésztésre negatív szepszis, gombás szepszis, neutropéniás láz, uroszepszis, meningokokcémia, trauma/vérzés, égések, ionizáló sugárzás hatása, heveny hasnyálmirigy gyulladás, felnőttkori légzőszervi disztressz szindróma, reumatoid artritisz, alkohol-indukált hepatitisz, krónikus gyulladásos betegségek, szarkoidózis, Crohn-féle betegség, sarlósejtes vérszegénység, diabétesz, nefrózis, atopiás betegségek, hiperszenzitivitási reakciók, allergiás ormyálkahártya gyulladás, szénanátha, állandó ormyálkahártya gyulladás, kötőhártya gyulladás, méhnyálkahártya gyulladás, asztma, csalánkiütés, szisztémás anafilaxis, bőrgyulladás, vészes vérszegénység, hemolitikus betegség, trombocitopénia, szöveti vagy szervi graft kilökődése, vese transzplantátum kilökődése, szív transzplantátum kilökődése, máj transzplantátum kilökődése, hasnyálmirigy transzplantátum kilökődése, tüdő transzplantátum kilökődése, csontvelő transzplantátum

-46(BMT) kilökődése, bőr allograft kilökődése, porc transzplantátum kilökődése, csont graft kilökődése, vékonybél transzplantátum kilökődése, magzati csecsemőmirigy inplantátum kilökődése, mellékpajzsmirigy transzplantátum kilökődése, szöveti vagy szervi xenograft kilökődés, allograft kilökődése, anti-receptor hiperszenzitivitási reakciók, Graves-betegség, Raynoud-féle betegség, B típusú inzulin-rezisztens diabétesz, asztma, miaszténia grávisz, ellenanyag-közvetített citotoxicitás, III. típusú hiperszenzitivitási reakciók, szisztémás lupusz eritematózus, POEMS szindróma (polineuropátia, organomegália, endokrinopátia, monoklonális gammopátia és bőrelváltozási szindróma), polineuropátia, organomegália endokrinopátia, monoklonális gammopátia, bőrelváltozási szindróma, anti-foszfolipid szindróma, pemfigusz, szkleroderma, kevert kötőszöveti betegség, idiopátiás Addison-féle betegség, diabétesz mellitusz, krónikus aktív hepatitisz, elsődleges epezsugorodás, vitiligo, érgyulladás, poszt-MI cardiotómiás szindróma, IV. típusú hiperszenzitivitás, érintéses bőrgyulladás, hiperszenzitivitásos tüdőgyulladás, allograft kilükődése, intracelluláris organizmusok miatti granulómák, gyógyszerérzékenység, metabolikus/idiopátiás, Wilson-féle betegség, hemakromatózis, alfa-l-antitripszin hiány, diabetikus retinopátia, Hashimoto-féle pajzsmirigy gyulladás, oszteoporózis, hipotalamikus-hipofizis-adrenális tengely értékelése, elsődleges epezsugorodás, pajzsmirigy gyulladás, enkefalomielitisz, cachexia, cisztás fibrózis, csecsemőkori krónikus tüdőbetegség, krónikus obstruktív tüdőbetegség (COPD), örökletes hematofagocitikus limfohisztiocitózis, bőrgyógyászati betegségek, pikkelysömör, hajhullás, nefrózisos szindróma, vesegyulladás, glomeruláris vesegyulladás, heveny veseelégtelenség, hemodialízis, urémia, toxicitás, rángógörcs, okt3 terápia, anti-CD3 terápia, citokin terápia, kemoterápia, radioterápia (például nem korlátozó példaként toaszténia, anémia, cachexia és hasonlók), krónikus szalicilát mérgezés, és hasonlók [lásd például „Merck Manual”, 12-17. kiadások, kiad.: Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), „Pharmacotherapy Handbook”, szerk.: Wells és mtsai., 2. kiadás, kiad.. Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998,2000), amelyek mindegyike teljes teijedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi],

A találmány tárgyát képezi eljárás is legalább egy szív- és érrendszeri betegség modulálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben, amelynek nem korlátozó példája az alábbiak közül legalább egy: szívbénulás szindróma, szívinfarktus, szívszélhűdés, szélütés, isémiás szélütés, vérzés, arterioszklerózis, ateroszklerozis, resztenózis, diabetikus aterioszklerózisos betegség, magas vérnyomás artériás magas vérnyomás, renovaszkuláris magas vérnyomás, szívkihagyás, sokk, szív- és érrendszeri szifilisz, szívelégtelenség, cor pulmonale _y elsődleges tüdői magas vérnyomás, szív

-47.:.. .u. ..· · • ·♦ ·· ··*· • · ··· ·· ···· ·!·· »·· ^β aritmia, átriális ektópiás szívverés, átriális szívdobogás, átriális fibrilláció (állandó vagy rohamokban fellépő), perfúzió utáni szindróma, kardiopulmonáris bypass gyulladásos reakció, kaotikus vagy többközpontú átriális tachikardia, szabályos szűk QRS tachikardia, specifikus aritmia, ventrikuláris fibrilláció, His-köteg aritmia, atrioventrikuláris blokk, kötegelágazás blokk, miokardiális isémiás rendellenességek, koszorúér betegség, angina pektorisz, szívinfarktus, kardiomiopátia, kitágult vértolulásos kardiomiopátia, korlátozott kardiomiopátia, billentyűi szívbetegségek, endokarditisz, perikardiális betegség, szívdaganatok, aorai és perifériás aneurizmus, aortametszés, aorta gyulladása, abdominális aorta és ágainak elzáródása, perifériás érrendszeri rendellenességek, artériaelzáródásos rendellenességek, perifériás aterloszklerózisos betegség, tromboangitisz obliteransz, funkcionális perifériás artériás rendellenességek, Raynaud-féle jelenség és betegség, akrocianózis, eritromelalgia, vénás betegségek, vénás trombózis, viszértágulás, arteriovenózus fisztula, limfödema, lipödema, nem stabil angina, reperfóziós sérülés, pumpa utáni szindróma, isémiás reperfúziós sérülés és hasonlók. Ilyen eljárás adott esetben tartalmazhatja legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot tartalmazó készítmény vagy gyógyászati készítmény hatásos mennyiségének a beadását egy sejtbe, szövetbe, szervbe, állatba vagy páciensbe, amelynek szüksége van ilyen modulálásra, kezelésre vagy terápiára.

A találmány tárgyát képezi eljárás is legalább egy fertőző betegség modulálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben, amelynek nem korlátozó példája az alábbiak közül legalább egy: heveny vagy krónikus bakteriális fertőzés, heveny vagy krónikus parazitikus vagy fertőző folyamatok, köztük bakteriális, virális és gombás fertőzések, HIV-fertőzés/HIV-neuropátia, meningitisz, hepatitisz (A, B vagy C, vagy hasonlók), szeptikus artritisz, peritonitisz, tüdőgyulladás, gégefögyulladás, E. coli 0157:h7, hemolitikus uremiás szindróma/trombolitikus trombocitopéna purpura, malária, dengue hemorrágiás láz, leismaniázis, lepra, toxikus sokk szindróma, sztreptokokkuszos izomgyulladás, gázos üszkösödés, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium intracellulare, Pneumocystis carinii tüdőgyulladás, medencei gyulladásos betegség, heregyulladás/mellékheregyulladás, Legionella, Lyme betegség, influenza A, Epstein-Barr vírus, virális hemafagocitótikus szindróma, virális enkefalitisz/aszeptikus meningitisz, és hasonlók.

A találmány tárgyát képezi eljárás is legalább egy rosszindulatú betegség modulálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben, amelynek nem korlátozó példája az alábbiak közül legalább egy: leukémia, heveny leukémia, heveny limfoblasztikus leukémia (ALL), B-sejtes, T-sejtes vagy FAB ALL, heveny mieloid .1..

*··♦ ·1»· ·· · *« · ’

-48leukémia (AML), krónikus mielocitikus leukémia (CML), krónikus limfocitikus leukémia (CLL), szőrsejt leukémia, mielodiplasztikus szindróma (MDS), limfóma, Hodgkin-betegség, rosszindulatú limfóma, nem-hodgkin-limfóma, Burkitt-limfóma, töbsszörös mielóma, Kaposiszarkóma, kolorektális karcinóma, pankreatikus karcinóma, nazofaringeális karcinóma, rosszindulatú hisztiocitózis, paraneoplasztikus szindróma/rosszindulatú elváltozás hiperkalcémiája, szilárd daganatok, adenokarcinómák, szarkómák, rosszindulatú melanoma, hemangioma, áttétes betegseg, rakkal kapcsolatos csontfelszivódás, rákkal kapcsolatos csontfájdalom, és hasonlók.

A találmány tárgyát képezi eljárás is legalább egy idegrendszeri betegség modulálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben, amelynek nem korlátozó példája az alábbiak közül legalább egy: neurodegeneratív betegségek, szklerózis multiplex, migrénes fejfájás, AIDS demencia komplex, demielinációs betegségek, mint például szklerózis multiplex és heveny transzverz mielitisz; extrapiramidális és cerebelláris rendellenességek, mint például a kortikospinális rendszer sérülései; a bazális ganglionok rendellenességei vagy cerebelláris rendellenességek; hiperkinetikus mozgási rendellenességek, mint például Huntington-féle vitustánc és öregkori vitustánc; gyógyszerindukált mozgási rendellenességek, mint például a CNS dopamin-receptorokat gátló gyógyszerekkel indukáltak; hipokinetikus mozgási rendellenességek, mint például Parkinsonkór; progresszív szupranukleáris bénulás; a cerebellum szerkezeti sérülései; spinocerebelláris degenerációk, mint például spinális ataxia, Friedreich-féle ataxia, cerebelláris kortikális degenerációk, több rendszert érintő degenerációk (Mencel, Dejerihe-Thomas, Shi-Drager és Machado-Joseph); szisztémás rendellenességek (Refsum-féle betegség, abétalipoprotémia, ataxia, telangiektázia és mitokondriális több rendszert érintő rendellenességek); demielinációs mag rendellenességek, mint például szklerózis multiplex, heveny transzverz mielitisz; és a motoros egységek rendellenességei, mint például neurogén muszkuláris atrófiák (anterior szarvsejtek degenerációja, mint például amiotrofikus laterális szklerózis, gyermekkori spinális muszkuláris atrófia és fiatalkori spinális muszkuláris atrófia); Alzheimer-kór; középkorban fellépő Down szindróma; diffúz Lewy-féle testbetegség; öregkori Lewy-féle elmebaj; Wemicke-Korsakoff szindróma; krónikus alkoholizmus; Creutzfeldt-Jakob betegség; szubakut szklerózisos panenkefalitisz, Hallerrorden-Spatz betegség és dementia pugilistica, és hasonlók. Ilyen eljárás adott esetben tartalmazhatja legalább egy TNF ellenanyagot vagy meghatározott részletet vagy variánst tartalmazó készítmény vagy gyógyászati készítmény hatásos mennyiségének a beadását egy sejtbe, szövetbe, szervbe, állatba vagy páciensbe,

-49amelynek szüksége van ilyen modulálásra, kezelésre vagy terápiára lásd például Merck Manual”, 16.kiadás, kiad.: Merck & Company, Rahway, NJ (1992)].

Bármilyen találmány szerinti eljárás tartalmazhatja legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot tartalmazó készítmény vagy gyógyászati készítmény hatásos mennyiségének a beadását egy sejtbe, szövetbe, szervbe, állatba vagy páciensbe, amelynek szüksége van ilyen modulálásra, kezelésre vagy terápiára. Ilyen eljárás adott esetben továbbá tartalmazhat ilyen immunológiai betegségek kezelésére szolgáló együttes beadást vagy kombinált terápiát, amely esetben a legalább egy anti-IL-12 ellenanyag, annak meghatározott részlete vagy variánsa beadása előtt, azzal egy időben és/vagy azután legalább egyet beadunk az alábbiak közül: IL-12 antagonista (például nem korlátozó példaként IL-12 ellenanyag vagy fragmens, oldható IL-12-receptor vagy fragmens, azok fúziós fehérjéje vagy kismolekulás IL-12 antagonista), antireumatikum (például metotrexát, auranofin, aurotioglükóz, azatioprin, etanercept, arany-nátrium-tiomalát, hidroxikloroquin-szulfát, leflunomid, szulfaszalzin), izomrelaxáns, narkotikum, nem szteroid antiinflammatorikus drog (NSAID), fájdalomcsillapító, érzéstelenítő, nyugtató, helyi érzéstelenítő, neuromuszkuláris gátlószer, mikrobaellenes szer (például aminoglikozid, gombaellenes szer, parazitaellenes szer, vírusellenes szer, karbapenem, cefalosporin, flurorquinolon, makrolid, penicillin, szulfonamid, tetraciklin, egyéb mikrobaellenes szer), pikkelysömör elleni szer, kortikoszteroid, anabolikus szteroid, diabétesszel kapcsolatos ágens, ásványi anyag, tápanyag, pajzsmirigy ágens, vitamin, kalciummal kapcsolatos hormon, hasmenés elleni szer, köhögés elleni szer, hányás elleni szer, fekély elleni szer, hashajtó, antikoaguláns, eritropoietin (például epoetin-alfa), filgrasztim (például G-CSF, Neupogen), szargramosztim (GM-CSF, Leukin), immunizáló szer, immunglobulin, immunszuppresszáns (például basiliximab, ciklosporin, daclizumab), növekedési hormon, hormonhelyettesítő drog, ösztrogén-receptor modulátor, pupillatágító szer, cikloplegiás szer, alkiláló ágens, antimetabolit, mitótikus inhibitor, radioterápiás szer, antidepresszáns, antimániás ágens, antipszichotikus szer, anxiolitikum, hipnotikum, szimpatomimetikum, stimuláns, donepezil, takrin, asztmagyógyszer, béta agonista, inhalált szteroid, leukotrién inhibitor, metilxantin, kromolin, epinefrin vagy analógja, dornáz-alfa (Pulmozyme), citokin vagy citokin antagonista. A megfelelő dózisok jól ismertek a szakterületen [ lásd például „Pharmacotherapy Handbook”, 2. kiadás, szerk.: Wells és mtsai., kiad.: Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); „PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition”, kiad.: Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000), amely referenciák mindegyike teljes teijedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.

-50Találmány szerinti készítményekben, kombinációs terápiákban, eszközökben és/vagy eljárásokban alkalmazható TNF-antagonisták (amelyek továbbá tartalmaznak legalább egy találmány szerinti ellenanyagot, annak meghatározott részletét vagy variánsát) nem korlátozó példái közé tartoznak anti-TNF ellenanyagok, azok antigén-kötő fragmensei, és olyan receptor-molekulák, amelyek specifikusan kötődnek TNF-hez; olyan vegyületek, amelyek megelőzik és/vagy gátolják TNF szintézisét, TNF felszabadulását vagy annak hatását célsejteken, mint például thalidomide, tenidap, foszfodiészteráz inhibitorok (például pentoxifylline vagy rolipram), A2b-adenozin-receptor agonisták és A2b-adenozin-receptor enhancerek; olyan vegyületek, amelyek megelőzik és/vagy gátolják a TNF-receptor jeltovábbítását, mint például a mitogén-aktivált protein -(MAP)- kináz inhibitorok; olyan vegyületek, amelyek blokkolják és/vagy gátolják a membrán-TNF hasítását, mint például metalloproteináz inhibitorok; olyan vegyületek, amelyek blokkolják és/vagy gátolják a TNF aktivitását, mint például angiotenzin-konvertáló-enzim (ACE) inhibitorok (például captopril); és olyan vegyületek, amelyek blokkolják és/vagy gátolják a TNF termelését és/vagy szintézisét, mint például MAP-kináz inhibitorok.

A leírás szerinti értelemben „tumomekrózis-faktor ellenanyag”, „TNF ellenanyag”, „TNF-á ellenanyag” vagy fragmens és hasonló csökkenti, blokkolja, gátolja, megszünteti vagy zavarja a TNF aktivitását in vitro, in situ és/vagy előnyösen in vivo. Például megfelelő találmány szerinti TNF humán ellenanyagok kötődhetnek TNF-a-hoz, és lehetnek anti-TNF ellenanyagok, azok antigén-kötő fragmensei, és azok meghatározott mutánsai vagy doménjai, amelyek specifikusan kötődnek a TNF-a-hoz. Megfelelő TNF ellenanyag vagy fragmens csökkentheti, blokkolhatja, megszüntetheti, zavarhatja, megelőzheti és/vagy gátolhatja TNF RNS-, DNS- vagy fehérjeszintézisét, TNF felszabadulását, TNF-receptor jeltovábbítását, membrán-TNF hasítását, TNF aktivitását, TNF termelését és/vagy szintézisét.

A cA2 kiméra ellenanyag tartalmazza az A2 jelű, magas affinitású semlegesítő egér anti-humán-TNF-á IgGl ellenanyag antigén-kötő variábilis régióját, és a humán IgGl kappa immunglobulin állandó régióját. A humán IgGl Fc-régió javítja az ellenanyagok allogeneikus effektor funkcióit, növeli a keringési féléletidejüket és csökkenti az immunogenitásukat. A cA2 kiméra ellenanyag aviditása és epitóp-specifitása az A2 egér ellenanyag variábilis régiójától származik. Egy előnyös megvalósítási mód szerint az A2 egér ellenanyag variábilis régióját kódoló nukleinsav előnyös forrása az A2 hibridóma sejtvonal.

A kiméra A2 ellenanyag (cA2) dózisfuggő módon semlegesíti mind a természetes eredetű, mind a rekombináns humán TNF-α citotoxikus hatásait. A cA2 kiméra ellenanyag és rekombináns humán TNF-α kötési vizsgálataiból a cA2 kiméra ellenanyag affinitási állandója

-51 1,Ο4χ1Ο¹⁰ M’¹ értékűnek adódott. Monoklonális ellenanyag specifitásának és affinitásának meghatározására szolgáló előnyös kompetitív inhibiciós eljárások megtalálhatók az alábbi irodalmi helyeken: Harlow és mtsai., „Antibodies: A Laboratory Manual”, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, (1988); „Current Protocols in Immunology”, szerk.: Colligan és mtsai., kiad.: Greene Publishing Assoc, and Wiley Interscience, New York (1992-2000); Kozbor és mtsai., Immunol. Today, 4, 72-79. old. (1983); „Current Protocols in Molecular Biology”, szerk.: Ausubel és mtsai., kiad.: Wiley Interscience, New York (1987-2000); és Muller, Meth. Enzymol. 92, 589-601. old. (1983), amely referenciák teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik.

Egy előnyös megvalósítási mód szerint az A2 egér monoklonális ellenanyagot a C134A jelű sejtvonal termeli. A cA2 kiméra ellenanyagot a cl68A jelű sejtvonal termeli.

A találmány szerint alkalmazható monoklonális anti-TNF ellenanyagok további példáit feltárják a szakirodalomban [lásd például a 5 231 024. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot; Moller A. és mtsai., Cytokine 2, 162-169. old. (1990); 07/943 852. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (benyújtva 1992. szeptember 11-én); Rathjen és mtsai., WO 91/02078. számú nemzetközi közzétételi irat (közzétéve 1991. február 21-én); Rubin és mtsai., 0 218 868. számú európai közzétételi irat (közzétéve 1987. április 22-én); Yone és mtsai., 0 288 088. számú európai közzétételi irat (közzétéve 1988. október 26-án); Liang és mtsai., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137, 847854. old. (1986); Meager és mtsai., Hybridoma 6, 305-311. old. (1987); Fendly és mtsai., Hybridoma 6, 359-369. old. (1987); Bringman és mtsai., Hybridoma 6, 489-507. old. (1987); és Hirai és mtsai., J. Immunol. Meth. 96, 57-62. old. (1987), amely referenciák teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik],

TNF-receptor molekulák

A találmány szerint alkalmazható előnyös TNF-receptor molekulák azok, amelyek magas affinitással kötődnek a TNF-hez [lásd például Feldmann és mtsai., WO 92/07076. számú nemzetközi közzétételi irat (közzétéve 1992. április 30-án); Schall és mtsai., Cell 61, 361-370. old. (1990); és Loetscher és mtsai., Cell 61, 35l-359.old. (1990), amely referenciák teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik] , és adott esetben alacsony immunogenitásúak. Közelebbről az 55 kDa (p55 TNF-R) és a 75 kDa (p75 TNF-R) sejtfelszíni TNF-receptorok alkalmazhatók a találmány szerint. Ezeknek a receptoroknak a csonkolt formái, amelyek a receptorok extracelluláris dománjait (ECD) vagy azok funkcionális részleteit tartalmazzák [lásd például Corcoran és mtsai., Eur. J. Biochem. 223, 831-840. old. (1994)], szintén alkalmazhatók a találmány szerint. A TNF-receptorok ECD-t

-52tartalmazó csonkolt formáit detektálták vizeletben és szérumban, mint 30 kDa és 40 kDa TNF inhibitorikus kötőfehérjéket [Engelmann H. és mtsai., J. Biol. Chem. 265, 1531-1536.old. (1990)]. Multimer TNF-receptor molekulák és TNF-immunreceptor fúziós molekulák és azok származékai és fragmensei vagy részletei további példái a találmány szerinti eljárásokban és készítményekben alkalmazható TNF-receptor molekuláknak. A találmány szerint alkalmazható TNF-receptor molekulákat az jellemzi, hogy képesek páciensek hosszú időn keresztül történő kezelésére, a tünetek jó és kiváló enyhítésével és alacsony toxicitással. Az alacsony immunogenitás és/vagy magas affinitás, valamint más meg nem határozott tulajdonságok hozzájárulhatnak az elért terápiás eredményekhez.

A találmány szerint alkalmazható TNF-receptor multimer molekulák tartalmazzák két vagy több TNF-receptor ECD-jének az egészét vagy funkcionális részletét egy vagy több polipeptid kapcsolómolekulával vagy nem pepiid kapcsolómolekulával, mint például polietilén-glikollal (PEG) összekötve. A multimer molekulák továbbá tartalmazhatják szekretált fehérje szignálpeptidjét, hogy az irányítsa a multimer molekula expresszióját. Ezeket a multimer molekulákat és az előállításukra szolgáló eljárásokat a 08/437 533. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben tárták fel (benyújtva 1995. május 9én), amelynek a tartalma teljes teijedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.

A találmány szerinti eljárásokban és készítményekben alkalmazható TNFimmunreceptor fúziós molekulák egy vagy több immunglobulin molekula legalább egy részletét, és egy vagy több TNF-receptor egészét vagy funkcionális részletét tartalmazzák. Ezeket az immunreceptor fúziós molekulákat monomerekként vagy hetero- vagy homomultimerekként állíthatjuk össze. Az immunreceptor fúziós molekulák lehetnek monovalensek vagy multivalensek is. Ilyen TNF-immunreceptor fúziós molekula egy példája a TNF-receptor/IgG fúziós fehérje. TNF-immunreceptor fúziós molekulákat és azok előállítására szolgáló eljárásokat feltártak a szakirodalomban [Lesslauer és mtsai., Eur. J. Immunoi. 21, 2883-2886. old. (1991); Ashkenazi és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535-10539. old. (1991); Peppel és mtsai., J. Exp, Med. 174, 1483-1489. old. (1991); Kolls és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 215-219.old. (1994); Butler és mtsai., Cytokine 6, 616-623. old. (1994); Baker és mtsai., Eur. J. Immunoi. 24, 2040-2048.old. (1994); Beutler és mtsai., 5 447 851. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; és 08/442 133. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (benyújtva 1995. május 16-án), amely referenciák teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik]. Eljárások immunreceptor fúziós molekulák előállítására megtalálhatók az alábbi irodalmi helyeken is: Capon és mtsai., 5 116 964. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; Capon és •k. «1»« * • · ♦ · ♦ * · · · * **·· «1«« ♦»* *·»·¹-53- mtsai., 5 225 538. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; és Capon és mtsai., Nature 337, 525-531. old. (1989), amely referenciák teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik.

TNF-receptor molekula funkcionális ekvivalense, származéka vagy régiója alatt a TNF-receptor molekula olyan részletét, vagy a TNF-receptor molekulát kódoló TNF-receptor molekula szekvencia olyan részletét értjük, amely elegendő méretű és szekvenciájú ahhoz, hogy funkcionálisan hasonlítson találmány szerint alkalmazható TNF-receptor molekulákhoz (például magas affinitással köti a TNF-et és alacsony az immunogenitása). TNF-receptor molekula funkcionális ekvivalense lehet módosított TNF-receptor molekula is, amely funkcionálisan hasonlít találmány szerint alkalmazható TNF-receptor molekulákra (például magas affinitással köti a TNF-et és alacsony az immunogenitása). Például TNF-receptor molekula funkcionális ekvivalense tartalmazhat „SILENT” kodont vagy egy vagy több aminosav-szubsztitúciót, deléciót vagy addíciót (például egy savas aminosav szubsztitúcióját egy másik savas aminosavval; vagy azonos vagy különböző hidrofób aminosavat kódoló kodon szubsztitúcióját hidrofób aminosavat kódoló másik kodonnal). [lásd Ausubel és mtsai., „Current Protocols in Molecular Biology”, kiad.: Greene Publishing Assoc, and WileyInterscience, New York (1987-2000)].

Citokin lehet bármilyen ismert citokin (lásd például www.CopewithCytokines.com). Citokin antagonisták nem korlátozó példái közé tartozik bármilyen ellenanyag, fragmens vagy mimetikum, bármilyen oldható receptor, fragmens vagy mimetikum, bármilyen kismolekulás antagonista, vagy ezek bármilyen kombinációja.

Terápiás kezelések. Bármilyen találmány szerinti eljárás lehet IL-12-közvetített rendellenesség kezelésére szolgáló eljárás, amely tartalmazza legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot tartalmazó készítmény vagy gyógyászati készítmény hatásos mennyiségének a beadását egy sejtbe, szövetbe, szervbe, állatba vagy páciensbe, amelynek szüksége van ilyen modulálásra, kezelésre vagy terápiára. Ilyen eljárás adott esetben továbbá tartalmazhat ilyen immunológiai betegségek kezelésére szolgáló együttes beadást vagy kombinált terápiát, amely esetben a legalább egy anti-IL-12 ellenanyag, annak meghatározott részlete vagy variánsa beadása előtt, azzal egy időben és/vagy azután legalább egyet beadunk az alábbiak közül: IL-12 antagonista (például nem korlátozó példaként IL-12 ellenanyag vagy fragmens, oldható IL-12-receptor vagy fragmens, azok fúziós fehérjéje vagy kismolekulás IL-12 antagonista), antireumatikum (például metotrexát, auranofín, aurotioglükóz, azatioprin, etanercept, arany-nátrium-tiomalát, hidroxikloroquin-szulfát, leflunomid, szulfaszalzin), izomrelaxáns, narkotikum, nem szteroid antiinflammatorikus drog (NSAID), »1». r*

Χ.Χ.

-54fájdalomcsillapító, érzéstelenítő, nyugtató, helyi érzéstelenítő, neuromuszkuláris gátlószer, mikrobaellenes szer (például aminoglikozid, gombaellenes szer, parazitaellenes szer, vírusellenes szer, karbapenem, cefalosporin, flurorquinolon, makrolid, penicillin, szulfonamid, tetraciklin, egyéb mikrobaellenes szer), pikkelysömör elleni szer, kortikoszteroid, anabolikus szteroid, diabétesszel kapcsolatos ágens, ásványi anyag, tápanyag, pajzsmirigy ágens, vitamin, kalciummal kapcsolatos hormon, hasmenés elleni szer, köhögés elleni szer, hányás elleni szer, fekély elleni szer, hashajtó, antikoaguláns, eritropoietin (például epoetin-alfa), filgrasztim (például G-CSF, Neupogen), szargramosztim (GM-CSF, Leukin), immunizáló szer, immunglobulin, immunszuppresszáns (például basiliximab, ciklosporin, daclizumab), növekedési hormon, hormonhelyettesítő drog, ösztrogén-receptor modulátor, pupillatágító szer, cikloplegiás szer, alkiláló ágens, antimetabolit, mitótikus inhibitor, radioterápiás szer, antidepresszáns, antimániás ágens, antipszichotikus szer, anxiolitikum, hipnotikum, szimpatomimetikum, stimuláns, donepezil, takrin, asztmagyógyszer, béta agonista, inhalált szteroid, leukotrién inhibitor, metilxantin, kromolin, epinefrin vagy analógja, dornáz-alfa (Pulmozyme), citokin vagy citokin antagonista.

Tipikusan patológiás állapot kezelését legalább egy anti-IL-12 ellenanyag készítmény hatásos mennyiségének vagy dózisának beadásával végezzük, amelynek az összmennyisége átlagosan legalább körülbelül 0,01 és 500 mg közötti tartományba esik legalább egy anti-IL12 ellenanyagra vonatkoztatva a páciens kg-jaira dózisonként, és előnyösen legalább körülbelül 0,1 és 100 mg ellenanyag/kg közötti egyszeri vagy többszöri beadásonként, a készítményben található specifikus aktivitástól függően. Más megoldásképpen a hatásos szérumkoncentráció 0,1-5000 pg/ml szérumkoncentráció lehet egyszeri vagy többszöri beadásonként. A megfelelő dózisok ismertek a gyakorló orvos számára, és - természetesen függhetnek az adott betegség állapotától, a beadott készítmény specifikus aktivitásától és a kezelés alatt álló pácienstől. Bizonyos esetekben a kívánt terápiás mennyiség eléréséhez szükséges lehet ismételt beadást alkalmazni, azaz egy monitorozott vagy mért dózis ismételt egyedi beadásaira van szükség, amikor az egyedi beadásokat addig ismételjük, amíg a kívánt napi dózist vagy hatást el nem érjük.

Előnyös dózisok adott esetben tartalmazhatnak 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,

29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53,

54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79,

80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 és/vagy 100-500 mg/kg-ot beadásonként, vagy bármilyen tartományt vagy értéket ezek között, vagy 0,1, 0,5, •4»» ·!·>

· ··· ··

-550,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5, 2,9, 3,0, 3,5, 3,9, 4,0, 4,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 20, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14,0, 14,5, 4,9, 5,0, 5,5,, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 12, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14, 14,5, 15, 0,15, 15,9, 16, 16,5, 16,9, 17, 17,5, 17,9, 18, 18,5, 18,9, 19, 19,5, 19,9, 20, 20,5, 20,9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 és/vagy 5000 pg/ml szérumkoncentráció elérését egyszeri vagy többszöri beadásonként, vagy bármilyen tartományt vagy értéket ezek között.

Más megoldásképpen a beadott dózis változhat ismert tényezők függvényében, mint például az adott ágens farmakodinamikai jellegzetességei, a beadásának módja és útja; a befogadó kora, egészségi állapota és tömege; a tünetek természete és mértéke, az egyidejű kezelések típusa, a kezelés gyakorisága, és a kívánt hatás. Általában a hatóanyag dózisa körülbelül 0,1-100 mg/testtömeg-kg lehet. Rendszerint 0,1-50, és előnyösen 0,1-10 mg/kg/beadás vagy fenntartott felszabadulású forma hatásos a kívánt eredmények elérésére.

Nem korlátozó példaként emberek vagy állatok kezelését biztosíthatjuk legalább egy, találmány szerinti ellenanyag egyszeri vagy periodikus dózisával 1-100 mg/kg között, mint például 0, 5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 vagy 100 mg/kg naponta, legalább az 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7., 8., 9., 10., 11., 12., 13., 14., 15., 16., 17., 18., 19., 20., 21.,

22. , 23., 24., 25., 26., 27., 28., 29., 30., 31., 32., 33., 34., 35., 36., 37., 38., 39. vagy 40. nap legalább egyikén, vagy más megoldásképpen vagy ezenfelül az 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7., 8., 9., 10., 11., 12., 13., 14., 15., 16., 17., 18., 19., 20., 21., 22., 23., 24., 25., 26., 27., 28., 29., 30.,

31. , 32., 33., 34., 35., 36., 37., 38., 39., 40., 41., 42., 43., 44., 45., 46., 47., 48., 49., 50., 51.

vagy 52. hét legalább egyikén, vagy más megoldásképpen vagy ezenfelül az 1., 2., 3., 4., 5., 6., ., 7., 8., 9., 10., 11., 12., 13., 14., 15., 16., 17., 18., 19. vagy 20. év legalább egyikén, vagy ezek bármilyen kombinációján, egyszeri, infúziós vagy ismétel dózis alkalmazásával.

A belsőleg történő beadásra alkalmas adagolási alak (készítmény) általában körülbelül 0,1 mg és körülbelül 500 mg hatóanyagot tartalmaz egységenként vagy tartályonként. Ezekben a gyógyászati készítményekben a hatóanyag rendszerint körülbelül 0,5-99,999 tömeg% mennyiségben lehet jelen a készítmény össztömege alapján.

Parenterális beadás esetében az ellenanyagot oldat, szuszpenzió, emulzió vagy liofílizált por formájában szerelhetjük ki, együtt vagy külön gyógyászatilag elfogadható parenterális hordozóeszköztől. Ilyen hordozóeszközök példái a víz, sóoldat, Ringer-oldat, ♦ * * · * « · J - .

!?<··::

- 56dextróz oldat és 1-10% humán szérumalbumin. Liposzómákat és nemvizes hordozóeszközöket, mint például rögzített olajokat is alkalmazhatunk. A hordozóeszköz vagy liofilizált por tartalmazhat olyan adalékanyagokat, amelyek fenntartják az izotóniásságot (például nátrium-klorid, mannitol) és a kémiai stabilitást (például pufferek és tartósítószerek). A kiszereléseket ismert vagy megfelelő módszerekkel sterilizáljuk.

Megfelelő gyógyászati hordozókat ír le a Remington's Pharmaceutical Sciences” című könyv (A. Osol), amely egy a szakterületen alkalmazott szokásos kézikönyv.

Alternatív beadási módok

A találmány szerint sok ismert és kifejlesztett módot alkalmazhatunk legalább egy találmány szerinti anti-IL-12 ellenanyag gyógyászatilag hatásos mennyiségeinek a beadására. Míg pulmonáris beadást alkalmazunk a következő leírásban, a beadás más módjait is alkalmazhatjuk megfelelő eredménnyel a találmány szerint.

Találmány szerinti IL-12 ellenanyagokat bejuttathatunk hordozóban oldatként, emulzióként, kolloidként vagy szuszpenzióként, vagy száraz porként, bármilyen, inhalációs vagy más módon történő beadásra alkalmas különféle eszközök és eljárások alkalmazásával, amint azt feltárjuk a leírásban vagy ismert a szakterületen.

Parenterális kiszerelések és beadás

Parenterális beadásra szolgáló kiszerelések közönséges kötőanyagot, mint például steril vizet vagy sóoldatot, polialkán-glikolokat, mint például polietilén-glikolt, növényi eredetű olajokat, hidrogénezett naftaléneket és hasonlókat tartalmazhatnak. Injektálásra szolgáló vizes vagy olajos szuszpenziókat megfelelő emulgeálószer vagy nedvesítőszer és szuszpendáló ágens alkalmazásával állíthatunk elő ismert eljárások szerint. Injektálásra szolgáló ágensek lehetnek nem toxikus, nem orálisan beadható hígító ágensek, mint például vizes oldat vagy steril injektálható oldat vagy szuszpenzió egy oldószerben. Alkalmazható hordozóeszközként vagy oldószerként víz, Ringer-oldat, izotóniás sóoldat, stb. engedélyezett, szokványos oldószerként vagy szuszpendáló oldószerként steril nem illékony olajat alkalmazhatunk. Ezekre a célokra bármilyen típusú nem illékony olajat és zsírsavat alkalmazhatunk, beleértve természetes vagy szintetikus vagy szemiszintetikus zsírolajokat vagy zsírsavakat, természetes vagy szintetikus vagy szemiszintetikus mono- vagy di- vagy triglicerideket. A parenterális beadás ismert a szakterületen, és magában foglalja nem korlátozó példaként az injekciók hagyományos formáit, gáznyomásos tűmentes injekciós eszközt, amint azt az 5 851 198. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat feltárja, és lézer perforátor eszközt, amint az 5 839 446. számú amerikai egyesült államokbeli

-57szabadalmi irat feltárja, amelyek teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik.

Alternatív bejuttatás

A találmány tárgyát képezi továbbá legalább egy anti-IL-12 ellenanyag beadása parenterális, szubkután, intramuszkuláris, intravénás, intrartikuláris, intrabronchiális, intraabdominális, intrakapszuláris, intrakartilagiális, intrakavitális, intraceliális, intracelebelláris, intracerebroventrikuláris, intrakolikus, intracervikális, intragasztrikus, intrahepatikus, intramiokardiális, intraoszteális, intrapelvikus, intraperikardiális, intraperitoneális, intrapleurális, intraprosztatikus, intrapulmonáris, intrarektális, intrarenális, intraretinális, intraspinális, intraszinoviális, intratoracikus, intrauterin, intravezikális, bólusz, vaginális, rektális, bukkális, szublingvális, intranazális vagy transzdermális úton. Legalább egy anti-IL-12 ellenanyag készítményt előállíthatunk parenterális (szubkután, intramuszkuláris vagy intravénás) beadásra, vagy bármilyen egyéb beadásra, előnyösen folyékony oldatok vagy szuszpenziók formájában; vaginális vagy rektális beadásra, előnyösen félszilárd formában, mint például nem korlátozó példaként krém vagy kúp formájában; bukkális vagy szublingvális beadásra, mint például nem korlátozó példaként tabletták vagy kapszulák formájában; vagy intranazális beadásra, mint például nem korlátozó példaként porok, orrcseppek vagy aeroszolok vagy bizonyos ágensek formájában; vagy transzdermális beadásra, mint például nem korlátozó példaként gél, kenőcs, lemosó, szuszpenzió vagy tapasz bejuttatási rendszer formájában, kémiai enhancerekkel, mint például dimetil-szulfoxiddal, hogy módosítsuk a bőr szerkezetét vagy hogy növeljük a drog koncentrációját a transzdermális tapaszban [Junginger és mtsai., „Drug Permeation Enhancement”, szerk.: Hsieh, D.S., 59-90. old. kiad.: Marcel Dekker, Inc. New York (1994), amely teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi], vagy oxidálószerekkel, amelyek lehetővé teszik fehérjéket és peptideket tartalmazó kiszerelések bőrre történő bejuttatását (WO 98/53847. számú nemzetközi közzétételi irat), vagy elektromos mezők alkalmazását, hogy tranziens transzport útvonalat hozzunk létre, mint például elektroporációval, vagy hogy növeljük a feltöltött drogok mobilitását a bőrön keresztül, mint például iontoforézissel, vagy ultrahang alkalmazását, mint például szonoforézissel (4 309 989. és 4 767 402. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok) (a fenti publikációk és szabadalmak teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik).

Pulmonáris/nazális beadás

Pulmonáris beadás esetén előnyös legalább egy anti-IL-12 ellenanyag készítményt bejuttatunk olyan méretű részecskékben, amelyek hatásosak a tüdő vagy a szinuszok alsó

-58légutainak elérésére. A találmány szerint legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot bejuttathatunk a szakterületen terápiás ágens inhalációval történő bejuttatására ismert bármilyen inhalációs vagy nazális eszköz alkalmazásával. Aeroszolizalt kiszereléseknek a páciens szinuszüregeibe vagy alveolusaiba történő bejuttatására képes ilyen eszközök közé tartoznak mért dózisú inhalátorok, nebulizátorok, szárazpor generátorok, permetezők és hasonlók. Ellenanyagok pulmonáris vagy nazális beadását irányító más alkalmas eszközök szintén ismertek a szakterületen. Minden ilyen eszköz az ellenanyagnak aeroszolban történő eloszlatásával történő beadásra alkalmas kiszerelést alkalmaz. Ilyen aeroszolok vagy oldatokat (mind vizes, mind nem vizes), vagy szilárd részecskéket tartalmazhatnak. Mért dózisú inhalátorok, mint például a Ventolin® mért dózisú inhalátor tipikusan hajtógázt alkalmaznak, és meghajtást igényelnek a belégzés során (lásd például a WO 94/16970., WO 98/35888. számú nemzetközi közzétételi iratokat). A száraz poros inhalátorok, mint a Turbuhaler® (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), Spiros™ inhalátor (Dura), az Inhale Therapeutics által forgalmazott eszközök és a Spinhaler® poros inhalátor (Fisons), kevert por lélegzettel való meghajtását alkalmazzák [4 668 218. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (Astra), EP 237 507. számú európai szabadalmi irat (Astra), WO 97/25086. számú nemzetközi közzétételi irat (Glaxo), WO 94/08552. számú nemzetközi közzétételi irat (Dura), 5 458 135. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (Inhale), WO 94/06498. számú nemzetközi közzétételi irat (Fisons), amelyek teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik], Nebulizátorok, mint az AERx™Aradigm, az Ultravent® nebulizátor (Mallinckrodt) és az Acorn II® nebulizátor (Marquest Medical Products) (5 404 871. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat, Aradigm, WO 97/22376. számú nemzetközi közzétételi irat, amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi) aeroszolokat hoznak létre folyadékokból, míg a mért dózisú inhalátorok, száraz poros inhalátorok, stb. kis részecskeméretü aeroszolokat hoznak létre. A kereskedelmi forgalomban kapható inhalációs eszközök ezen specifikus példáit csak a találmány gyakorlatba vételéra alkalmas specifikus eszközök reprezentációjának szánjuk, és nem a találmány oltalmi körét korlátozónak. Előnyösen a legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot tartalmazó készítményt száraz poros inhalátorral vagy permetezővel juttatjuk be. A találmány szerinti legalább egy ellenanyag beadására szolgáló inhalációs eszköznek számos kívánatos tulajdonsága van. Például az inhalációs eszköz általi bejuttatás előnyösen megbízható, reprodukálható és pontos. Az inhalációs eszköz adott esetben kis száraz részecskéket juttathat be, például kisebb, mint körülbelül 10 pm, előnyösen körülbelül 1-5 pm, a jó lélegezhetőség érdekében.

- 59IL-12 ellenanyag-készítmények beadása sprayként

IL-12 ellenanyag-készítmény fehérjét tartalmazó sprayt előállíthatunk legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot tartalmazó szuszpenzió vagy oldat fúvókán keresztül nyomás alatt történő átpréselésével. A fúvóka méretét és konfigurációját, az alkalmazott nyomást és a folyadék adagolási sebességét úgy választhatjuk meg, hogy a kívánt kimenetet és részecskeméretet kapjuk. Elekrtosprayt állíthatunk elő például kapillárisos vagy fúvókán keresztüli áramlattal kapcsolatban lévő elektromos mezővel. Előnyösen a porlasztóval bejuttatott, legalább egy anti-IL-12 ellenanyag készítmény részecskéinek a részecskemérete kisebb, mint körülbelül 10 pm, előnyösen a körülbelül 1 pm és körülbelül 5 pm közötti tartományban van, és legelőnyösebben körülbelül 2 pm és körülbelül 3 pm közötti.

A porlasztóval történő alkalmazásra megfelelő legalább egy anti-IL-12 ellenanyag készítmény fehérje kiszerelései vizes oldatban lévő ellenanyag-készítmény fehérjét tartalmaznak az oldat ml-eiként a legalább egy anti-IL-12 ellenanyag készítmény körülbelül 0,1 mg és körülbelül 100 mg közötti koncentrációjában, vagy mg/g, vagy bármilyen tartomány vagy érték ezek között, például nem korlátozó példaként 1,. 2.,. 3,. 4,. 5,. 6,. 7,. 8,. 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 vagy 100 mg/ml vagy mg/g. A kiszerelés tartalmazhat ágenseket, mint például kötőszert, puffért, izotóniás ágenst, tartósítószert felületaktív anyagot és - előnyösen - cinket. A kiszerelés tartalmazhat az ellenanyag-készítmény fehérje stabilizálására szolgáló kötőszert vagy ágenst is, mint például puffért, redukálószert, fehérjét vagy szénhidrátot. Ellenanyag-készítmények kiszerelésében alkalmazható fehérjék közé tartozik az albumin, protamin vagy hasonlók. Ellenanyag-készítmény fehérjék kiszerelésében alkalmazható tipikus szénhidrátok közé tartozik a szukróz, mannitol, laktóz, trehalóz, glükóz vagy hasonlók. Az ellenanyag-készítmény fehérje kiszerelés tartalmazhat felületaktív anyagot is, amely csökkentheti vagy megelőzheti az ellenanyag-készítmény fehérje felszíni aggregációját, amelyet az oldat aeroszol létrehozása során bekövetkező atomizációja okoz. Különféle hagyományos felületaktív anyagokat alkalmazhatunk, mint például polioxietilénzsírsav-észtereket és -alkoholokat, és polioxietilén-szorbitol-zsírsav-észtereket. A mennyiségük általában a 0,001 és 14 tömeg% közötti tartományba eshet. Különösen előnyös felületaktív anyag a találmány szerinti alkalmazásra a polioxietilén-monooleát, poliszorbát 80, poliszorbát 20 vagy hasonlók. Fehérje, mint például IL-12-ellenanyagok vagy azok meghatározott részletei vagy variánsai kiszerelésének a szakterületén ismert további ágensek is alkalmazhatók a kiszerelésben.

-60IL-12 ellenanyag-készítmények beadása nebulizátorrai

Ellenanyag-készítmény fehérjét beadhatunk nebulizátorrai, mint például sugárhajtású nebulizátorrai vagy ultrahangos nebulizátorrai. Tipikusan egy sugárhajtású nebulizátorban kompresszált levegő forrást alkalmazunk nyíláson keresztül kilépő nagysebességű levegősugár létrehozására. Ahogyan a gáz kitágul a fúvóka után, alacsony nyomású régió jön létre, ami ellenanyag-készítmény fehérje oldatát szívja át a folyadéktartályhoz kapcsolódó kapilláriscsövön. A kapilláriscsőből kilépő folyadékáram instabil szálakká és cseppeké nyíródik szét, aeroszolt hozva létre. Különféle konfigurációkat, áramlási sebességeket és terelőtípusokat alkalmazhatunk egy adott sugárhajtású nebulizátor kívánt teljesítményi jellemzőinek eléréséhez. Ultrahangos nebulizátorban magas frekvenciájú elektromos energiát alkalmazunk mechanikus rezgési energia létrehozására, tipikusan piezoelektromos transzduktor alkalmazásával. Ezt az energiát visszük át az ellenanyag-készítmény fehérje kiszerelésre akár közvetlenül, akár kapcsolófolyadékon keresztül, az ellenanyag-készítmény fehérjét tartalmazó aeroszolt hozva létre. Előnyösen a nebulizátorrai bejuttatott ellenanyagkészítmény fehérje részecskéinek a részecskemérete kisebb, mint körülbelül 10 pm, előnyösen a körülbelül 1 pm és körülbelül 5 pm közötti tartományban van, és legelőnyösebben körülbelül 2 pm és körülbelül 3 pm közötti.

A nebulizátorrai - akár sugárhajtású, akár ultrahangos - történő alkalmazásra megfelelő legalább egy anti-IL-12 ellenanyag kiszerelései tipikusan az oldat ml-eiként a legalább egy anti-IL-12 ellenanyag-készítmény fehérje körülbelül 0,1 mg és körülbelül 100 mg közötti koncentrációjában. A kiszerelés tartalmazhat ágenseket, mint például kötőszert, puffért, izotóniás ágenst, tartósítószert felületaktív anyagot és - előnyösen - cinket. A kiszerelés tartalmazhat a legalább egy anti-IL-12 ellenanyag-készítmény fehérje stabilizálására szolgáló kötőszert vagy ágenst is, mint például puffért, redukálószert, fehérjét vagy szénhidrátot. A legalább egy anti-IL-12 ellenanyag-készítmény kiszerelésében alkalmazható fehérjék közé tartozik az albumin, protamin vagy hasonlók. A legalább egy anti-IL-12 ellenanyag kiszerelésében alkalmazható tipikus szénhidrátok közé tartozik a szukróz, mannitol, laktóz, trehalóz, glükóz vagy hasonlók. A legalább egy anti-IL-12 ellenanyag kiszerelés tartalmazhat felületaktív anyagot is, amely csökkentheti vagy megelőzheti a legalább egy anti-IL-12 ellenanyag felszíni aggregációját, amelyet az oldat aeroszol létrehozása során bekövetkező atomizációja okoz. Különféle hagyományos felületaktívanyagokat alkalmazhatunk, mint például polioxietilén-zsírsav-észtereket és -alkoholokat, és polioxietilén-szorbitol-zsírsav-észtereket. A mennyiségük általában a 0,001 és 4 tömeg% közötti tartományba eshet. Különösen előnyös felületaktív anyag a találmány szerinti

-61 alkalmazásra a polioxietilén-monooleát, poliszorbát 80, poliszorbát 20 vagy hasonlók. Fehérje, mint például ellenanyag fehérje kiszerelésének a szakterületén ismert további ágensek is alkalmazhatók a kiszerelésben.

IL-12 ellenanyag-készítmények beadása mért dózisú inhalátorral

Mért dózisú inhalátorban (MDI) hajtógáz, legalább egy anti-IL-12 ellenanyag, és bármilyen kötőszer vagy egyéb adalékanyag található fémdobozban, cseppfolyósított kompresszált gázt tartalmazó keverékként. A mérőszelep beindítása a keveréket aeroszolként szabadítja fel, amely előnyösen kisebb, mint körülbelül 10 pm, előnyösen a körülbelül 1 pm és körülbelül 5 pm közötti tartományban van, és legelőnyösebben körülbelül 2 pm és körülbelül 3 pm közötti méretű részecskéket tartalmaz. A kívánt aeroszol részecskeméretet előállíthatjuk szakember számára ismert különféle módokon - mint például ,jet-milling”, spray-szárítás, kritikus ponti kondenzáció vagy hasonlók - előállított ellenanyag-készítmény fehérje kiszerelés alkalmazásával. Előnyös mért dózisú inhalátorok közé tartoznak a 3M és Glaxo által gyártottak, amelyekben hidrofluorokarbon hajtógázt alkalmaznak.

A legalább egy anti-IL-12 ellenanyag mért dózisú inhalátor eszközzel történő alkalmazására szolgáló kiszerelései általában finom eloszlású port tartalmazhatnak, amely legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot tartalmaz szuszpenzióként nem vizes közegben, például felszuszpendálva a hajtógázban felületaktív anyag segítségével. A hajtógáz lehet bármilyen erre a célra hagyományosan alkalmazott anyag, mint például klorofluorokarbon, hidroklorofluorokarbon, hidrofluorokarbon vagy szénhidrogén, beleértve triklorofluorometánt, diklorodifluorometánt, diklorotetrafluoroetanolt és 1,1,1,2-tetrafluoroetánt, HFA134a-t (hidrofluroalkán-134a), HFA-227-et (hidrofluroalkán-227), vagy hasonlókat. Előnyösen a hajtógáz hidrofluorokarbon. A felületaktív anyagot úgy választhatjuk meg, hogy stabilizálja a hajtógáz-szuszpenzióban a legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot, védje a hatóanyagot a kémiai degradációval szemben, és hasonlók. Alkalmas felületaktív anyagok közé tartozik a szorbitán-trioleát, szójalecitin, olajsav vagy hasonlók. Bizonyos esetekben oldat aeroszolok előnyösek, oldószerként például etanol alkalmazásával. Fehérje, mint például ellenanyag fehérje kiszerelésének a szakterületén ismert további ágensek is alkalmazhatók a kiszerelésben.

Átlagos képességű szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti eljárásokat megvalósíthatjuk legalább egy anti-IL-12 ellenanyag a leírásban nem feltárt eszközzel történő pulmonáris beadásával is.

-62Orális kiszerelések és beadás

Orális beadásra szolgáló kiszerelések adjuvánsok (például rezorcinolok és nemionos felületaktív anyagok, mint például polioxietilén-oleil-éter és n-hexadecil-polietilén-éter) együttes beadásán alapulnak, amelyek mesterségesen növelik a bélrendszer falának a permeabilitását, valamint enziminhibitorok [például hasnyálmirigy tripszin inhibitorok, diizopropil-fluorofoszfát (DFP) és trazilol] együttes beadásán alapulnak, amelyek gátolják az enzimatikus degradációt. Orális beadásra szolgáló szilárd adagolási forma hatóanyag komponensét összekeverhetjük legalább egy adalékanyaggal, mint például szukrózzal, laktózzal, cellulózzal, mannitollal, trehalózzal, raffmózzal, maltitollal, dextránnal, keményítőkkel, agarral, arginátokkal, kitinekkel, kitozánokkal, pektinekkel, tragakant gumival, gumiarábikummal, zselatinnal, kollagénnel, kazeinnel, albuminnal, szintetikus vagy szemiszintetikus polimerekkel és gliceridekkel. Ezek az adagolási formák tartalmazhatnak más típusú adalékanyagokat is, például inaktív hígító ágenseket, kenőanyagokat, mint például magnézium-sztearátot, parabént, tartósító ágenseket, mint például szorbinsavat, aszkorbinsavat, alfa-tokoferolt, antioxidánst, mint például ciszteint, bomlasztószert, kötőanyagot, pufferelő ágenst, édesítőszert, ízesítőszert, illatosító szert, stb.

Tablettákat és pirulákat továbbalakíthatunk enterikus bevonatú készítményekké. Az orális beadásra szolgáló folyékony készítmények közé tartoznak a gyógyászati alkalmazásra engedélyezhető emulzió, szirup, elixir, szuszpenzió és oldat készítmények. Ezek a készítmények a szakterületen rendszeresen alkalmazott inaktív hígító ágenseket tartalmazhatnak, mint például vizet. Liposzómákat is leírtak drogszállító rendszerként inzulin és heparin esetében (4 239 754. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat). Újabban kevert aminosavak mesterséges polimerjeiből (proteinoid) készült mikrogömböket is alkalmaztak gyógyászati készítmények bejuttatására (4 925 673. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat). Ezenkívül az 5 879 681. és 5 871 753. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokban feltárt hordozóvegyületeket is alkalmazzák biológiailag aktív ágensek orális bejuttatására.

Mukózális kiszerelések és beadás

A nyálkahártyái felszíneken keresztül történő abszorpció esetében a legalább egy antiIL-12 ellenanyag beadására szolgáló készítmények és eljárások tartalmazhatnak olyan emulziót, amely sok szubmikron részecskét, mukoadhezív makromolekulát, bioaktív pepiidet, és egy összefüggő vizes fázist tartalmaz, ami elősegíti a nyálkahártya-felszíneken keresztül történő abszorpciót, az emulzió részecskéinek mukoadhéziójának elérésével (5 514 670. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat). A találmány szerinti emulziók

-63 felvitelére alkalmas nyálkahártya-felszínek lehetnek szaruhártyai, kötőhártyai, bukkális, szublingvális, nazális, vaginális, pulmonáris, gyomorbeli, intesztinális és rektális beadási utak. Vaginális vagy rektális beadásra szolgáló kiszerelések, például kúpok tartalmazhatnak kötőszereket, például polialkán-glikolokat, vazelint, kakaóvajat és hasonlókat. Intranazális beadásra szolgáló kiszerelések lehetnek szilárdak, és kötőszert tartalmazhatnak, mint például laktózt, vagy lehetnek vizes vagy olajos orrcseppek. Bukkális beadás esetén a kötőszerek lehetnek cukrok, kalcium-sztearát, magnézium-sztearát, előre zselatinizált keményítő és hasonlók (5 849 695. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat).

Transzdermális kiszerelések és beadás

Transzdermális beadás esetében a legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot szállítóeszközbe, mint például liposzómába vagy polimer nanorészecskékbe, mikrorészecskébe, mikrokapszulába vagy mikrogömbökbe (amelyeket együttesen mikrorészecskéknek nevezünk, amennyiben másképp nem jelezzük) burkoljuk be. Számos alkalmas eszköz ismert, például szintetikus polimerekből, mint például polihidroxi-savakból, mint például politejsavból, poliglikolsavból és azok kopolimerjeiből, poliortoészterekből, polianhidridekből és polifoszfazénekből, és természetes polimerekből, mint például kollagénből, poliaminosavakból, albuminból és egyéb fehérjékből, alginátból és egyéb poliszacharidokból, és ezek kombinációiból készített mikrorészecskék (5 814 599. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat).

Tartós beadás és kiszerelések

Bizonyos esetekben kívánatos lehet a találmány szerinti vegyületeket hosszan tartó időszakon keresztül beadni az alanynak, például egy beadásból egy hét és egy év közötti időtartam alatt. Különféle lassú felszabadulású, depó és implantátum formákat alkalmazhatunk. Például egy adagolási forma tartalmazhatja a vegyület gyógyászatilag elfogadható nem toxikus sóját, amelynek alacsony az oldhatósága a testfolyadékokban, például (a) savaddíciós só polibázisos savval, mint például foszforsavval, kénsavval, citromsavval, borkősavval, csersavval, pamoinsawal, algasavval, poliglutaminsawal, naftalén-mono- vagy diszulfonsavval, poligalakturonsavval és hasonlókkal; (b) polivalens fémkation sója, mint például cink, kalcium, bizmut, bárium, magnézium, alumínium, réz, kobalt, nikkel, kadmium és hasonlók, vagy szerves kation sója, például Ν,Ν'-dibenzil-etiléndiamin vagy etiléndiamin; vagy (c) (a) és (b) kombinációi, mint például cink csersav sója. Ezenkívül a találmány szerinti vegyületeket - vagy előnyösen - egy előbb ismertetett viszonylag oldhatatlan sót kiszerelhetünk gélben, például alumínium-monosztearát gélben, például injektálásra alkalmas szezámolajjal. Különösen előnyös sók a cink sók, cink csersav sók, pamoát sók és hasonlók.

-64Az injektálásra szolgáló lassú felszabadulású depó kiszerelések egy másik típusa a vegyületet vagy sót diszpergálva tartalmazná lassan degradálódó, nem toxikus, nem antigénhatású polimerben, mint például polilakát/poliglikolát polimerben, például ahogyan a 3 773 919. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat feltárja. A vegyületeket vagy - előnyösen a feltárt viszonylag oldhatatlan sókat szilasztikus koleszterin pelletben is kiszerelhetjük, különösen állati alkalmazásra. További lassú felszabadulású, depó vagy implantátum kiszerelések, például gáz vagy folyadék liposzómák ismertek a szakirodalomban [5 770 222. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat és „Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems”, szerk.: J. R. Robinson, kiad.: Marcel Dekker, Inc., N. Y. (1978)].

A találmány általános ismertetését követően az könnyebben is érthető lesz a következő példákra való hivatkozással, amelyeket a szemléltetés érdekében mutatunk be, és nem tekintjük azokat korlátozónak.

1. példa: IL-12 ellenanyag klónozása és expresszáltatása emlős sejtekben

Egy tipikus emlős expressziós vektor legalább egy promoter elemet tartalmaz, amely irányítja az mRNS-nek, az ellenanyag kódoló szekvenciájának és a transzkripció terminációjához és a transzkriptum poliadenilációjához szükséges szignálok transzkripciójának az iniciációját. További elemek közé tartoznak enhancerek, Kozák-szekvenciák, és RNS-splicing-re szolgáló donor és akceptor helyekkel szegélyezett közbenső szekvenciák. Nagyon hatékony transzkripciót érhetünk el az SV40-ből származó korai és késői promóterekkel, a retrovírusok, például RSV, HTLVI, HIVI hosszú terminális ismétlődéseivel (LTR) és a citomegalovírus (CMV) korai promóterével. Azonban sejtbeli elemeket is alkalmazhatunk (például a humán aktin-promótert). Megfelelő expressziós vektor a találmány gyakorlatba vételéhez például olyan vektorok, mint a pIRESlneo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN vagy pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, CA), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-) vagy pcDNA3.1/Hygro (+/-) (Invitrogen), PSVL és PMSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) és pBC12MI (ATCC 67109). Az alkalmazható emlős gazdasejtek közé tartoznak a humán Hela 293, H9 és Jurkat sejtek, egér NIH3T3 és Cl27 sejtek, Cos 1, Cos 7 és CV 1, fúrj QC1-3 sejtek, egér L sejtek és kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtek.

Más megoldásképpen a gént stabil sejtvonalakban is expresszáltathatjuk, amelyek tartalmazzák a gént a kromoszómába integrálódva. Együttes transzfektálás szelektálható markerrel - mint például dhfr, gpt, neomicin vagy higromicin - lehetővé teszi a transzfektált sejtek azonosítását és izolálását.

-65A transzfektált géneket amplifíkalhatjuk is, hogy a kodolt ellenanyag nagy mennyiségét expresszáltassuk. A DHFR (dihidrofolát-reduktáz) marker alkalmazható olyan sejtvonalak kifejlesztésére, amelyek a jelentőséggel bíró gén több száz vagy több ezer példányát hordozzák. Egy másik alkalmazható szelekciós marker a glutamin-szintáz (GS) enzim [Murphy és mtsai., Biochem. J. 227, 277-279. old. (1991); Bebbington és mtsai., Bio/Technology 10, 169-175. old. (1992)]. Ezeknek a markereknek az alkalmazásával az emlős sejteket szelektív tápközegben tenyésztjük, és legmagasabb rezisztenciájú sejteket szelektáljuk ki. Ezek a sejtvonalak az amplifíkált gént a kromoszómába integrálódva tartalmazzák. Kínai hörcsög petefészek (CHO) és NSO sejteket gyakran alkalmaznak ellenanyagok termeltetésére.

A pCl és pC4 expressziós vektorok a Rous Sarcoma Virus erős promóterét (LTR) tartalmazzák [Cullen és mtsai., Molec. Cell. Bioi. 5, 438-447. old. (1985)] és a CMVenhancer egy fragmensét [Boshart és mtsai., Cell 41, 521-530. old. (1985)]. Többszörös klónozó helyek, például a BamHI, Xbal és Asp718 helyeket tartalmazók elősegítik a jelentőséggel bíró gén klónozását. A vektorok ezenfelül tartalmazzák a patkány preproinzulin génjének a 3’ intronját, poliadenilációs és terminációs szignálját.

Klónozás és expresszáltatás CHO sejtekben

A pC4 vektort alkalmazzuk IL-12 ellenanyag expresszáltatására. A pC4 plazmid a pSV2-dhfr (ATCC elérési szám: 37146) származéka. A plazmid tartalmazza az egér DHFR génjét az SV40 korai promóterének a szabályozása alatt. Kínai hörcsög petefészek sejtek, vagy más, dihidrofolát aktivitás nélküli sejtek, amelyek transzfektálva vannak ezekkel a plazmidokkal, szelektálhatok a sejteknek metotrexát kemoterápiás szerrel kiegészített szelektív tápközegen (például alfa mínusz MEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD) történő tenyésztésével. A DHFR gének amplifíkácioját metotrexátra (MTX) rezisztens sejtekben részletesen dokumentálták [lásd például F. W. Alt és mtsai., J. Biol. Chem. 253, 1357-1370. old. (1978); J. L. Hamlin és C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097, 107-143. old. (1990); és M. J. Page és M. A. Sydenham, Biotechnology 9, 64-68. old. (1991)]. Növekvő koncentrációjú MTX-en tenyésztett sejtekben rezisztencia alakul a drogra a célenzim, a DHFR túltermelése mellett, a DHFR gén amplifikációja eredményeképpen. Ha egy másik gén is kapcsolódik a DHFR génhez, akkor általában az is együtt amplifíkálódik és túltermelődik. Ismert a szakterületen, hogy ez a megközelítési mód alkalmazható az amplifíkált gén(ek) több mint 1000 példányát hordozó sejtvonalak kifejlesztésére. Azt követően - amikor a metotrexátot elvonjuk - olyan sejtvonalakat kapunk, amelyek tartalmazzák az amplifíkált gént a gazdasejt egy vagy több kromoszómájába integrálódva.

-66A pC4 plazmid a jelentőséggel bíró gén expresszáltatásához tartalmazza a Rous Sarcoma Vírus hosszú terminális ismétlődésének (LTR) az erős promóterét [Cullen és mtsai., Molec. Cell. Bioi. 5, 438-447. old. (1985)] és egy izolált fragmenst a humán citomegalovírus (CMV) azonnali korai génjének az enhanceréből [ (Boshart és mtsai., Cell 41, 521-530. old. (1985)]. A promótertől leolvasással megegyező irányban BamHI, Xbal és Asp718 restrikciós enzim helyek találhatók, amelyek lehetővé teszik a gének integrálását. Ezek mögött a klónozó helyek mögött a plazmid a patkány preproinzulin génjének a 3’ intronját és poliadenilációs helyét tartalmazza. Más nagyon hatékony promótereket is alkalmazhatunk az expresszáltatásra, mint például a humán á-aktin promótert, az SV40 korai vagy késői promóterét, vagy a hosszú terminális ismétlődéseket más retrovírusokból, például HIV-ből és HTLVI-ből. A Clontech Tet-Off és Tet-On génexpressziós rendszerei és hasonló expressziós rendszerek is alkalmazhatók IL-12 szabályozott expresszáltatására emlős sejtekben [M. Gossen és H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-5551. old. (1992)]. Az mRNS poliadenilálására más szignálokat, például a humán növekedési hormon génből vagy globin génekből származókat is alkalmazhatunk. A jelentőséggel bíró gént a kromoszómákba integrálódva hordozó stabil sejtvonalakat kiszelektálhatunk szelektálható markerrel, mint például gpt-vel, G418-cal vagy higromicinnel történő együtt transzfektálást követően. Előnyös kezdetben egynél több szelektálható markert alkalmazni, például G418-at és metotrexátot.

A pC4 plazmidot restrikciós enzimekkel emésztjük, és azután defoszforiláljuk borjú intesztinális foszfatázzal a szakterületen ismert eljárások alkalmazásával. A vektort azután 1%-os agarózgélből izoláljuk. ·

Az IL-12 ellenanyag teljes szekvenciáját kódoló DNS-szekvenciát alkalmazzuk ismert eljárási lépések szerint, amint azt például az 1. azonosítószámú szekvencián és a 2. azonosítószámú szekvencián bemutatjuk, amelyek sorrendben megfelelnek egy találmány szerinti IL-12 ellenanyag HC és LC variábilis régiójának. Megfelelő humán állandó régiókat (azaz HC és LC régiókat) kódoló izolált nukleinsavakat is alkalmazunk ebben a konstrukcióban (például a pl351 vektorban)

A variábilis és állandó régiót kódoló izolált DNS-t és a defoszforilált vektort azután T4 DNS-ligázzal összeligáljuk. Azután E. coli HB 101 vagy XL-1 Blue sejteket transzformálunk, és olyan baktériumokat azonosítunk például restrikciós enzimes elemzés alkalmazásával, amelyek tartalmazzák a fragmenst a pC4 plazmidba inzertálva.

Aktív DHFR gént nem tartalmazó kínai hörcsög petefészek (CHO) sejteket alkalmazunk a transzfektáláshoz. A pC4 expressziós plazmid 5 g-ját együtt transzfektáljuk 0,5

-67g pSV2-neo plazmiddal lipofektin alkalmazasaval. A pSV2neo plazmid egy domináns szelektálható markert tartalmaz, a Tn5 neo génjét, amely antibiotikumok egy csoportjára, köztük a G418-ra való rezisztenciát okoz. A sejteket 1 g/ml G418-cal kiegészített alfa mínusz MÉM tápközegre oltjuk le. Két nap múlva a sejteket tripszinizáljuk, és leoltjuk hibridóma klónozó lemezekre (Greiner, Germany) 10, 25 vagy 50 ng/ml metotrexáttal és 1 g/ml G418cal kiegészített alfa mínusz MÉM tápközegben. Körülbelül 10-14 nap elteltével egyedi kiónokat tripszinizálunk, és azután leoltjuk azokat 6-mérőhelyes csészékre vagy 10 ml-es edényekbe metotrexát különböző koncentrációinak (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM) az alkalmazásával. A metotrexát legmagasabb koncentrációján növekvő kiónokat azután átvisszük új 6-mérőhelyes lemezekre, amelyek metotrexát még magasabb koncentrációját (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM) tartalmazzák. Ugyanezt az eljárást ismételjük addig, amíg olyan kiónokat állítunk elő, amelyek növekednek 100-200 mM koncentráción. Elemezzük a kívánt gén expresszióját, például SDS-PAGE és Western-blot vagy fordított fázisú HPLC elemzéssel.

2. példa: Humán TNF-fel reagáló magas affinitású humán IgG monoklonális ellenanyagok előállítása transzgenikus egerek alkalmazásával

Összefoglalás

Humán nehéz és könnyűlánc immunglobulin géneket tartalmazó transzgenikus egereket alkalmaztunk magas affinitású, teljesen humán monoklonális ellenanyagok létrehozására, amelyek terápiásán alkalmazhatók a IL-12 hatásának gátlására egy vagy több TNF által közvetített betegség kezelésében. (A nehézlánc és könnyűlánc humán variábilis és állandó régió ellenanyag-transzgénjeit tartalmazó (CBA/J x C57/BL6/J) F₂ hibrid egereket immunizáltunk humán rekombináns IL-12-vel [Taylor és mtsai., Inti. Immunoi. 6, 579-591. old. (1993); Lonberg és mtsai., Nature 368, 856-859. old. (1994); Neuberger, M., Nature Biotech. 14, 826. old. (1996); Fishwild és mtsai., Nature Biotechnology 14, 845-851. old. (1996)]. Számos fúzió eredményezett egy vagy több teljesen humán, IL-12-vel reagáló IgG monoklonális ellenanyag-panelt. A teljesen humán anti-IL-12 ellenanyagokat tovább jellemezzük. Az ilyen ellenanyagokról azt találjuk, hogy az affinitási állandójuk valahol IxlO⁹ és 9xl0¹² között van. Ezeknek az teljesen humán monoklonális ellenanyagoknak a váratlanul magas affinitása alkalmas jelöltté teszi azokat terápiás alkalmazásokban IL-12-vel kapcsolatos betegségek, patológiák vagy rendellenességek esetében.

-68Rövidítések

BSA - marhaszérum-albumin

COj - szén-dioxid

DMSO - dimetil-szulfoxid

EIA- enzimes immunológiai vizsgálati eljárás

FBS - magzati marhaszérum

H2O2 - hidrogén-peroxid

HRP - tormaperoxidáz

ID - interadermális lg - immunglobulin IL-12 - interleukin-12 IP - intraperitoneális IV - intravénás

Mab - monoklonális ellenanyag

OD - optikai denzitás

OPD - o-feniléndiamin dihidroklorid

PEG - polietilén-glikol

PSA - penicillin, sztreptomicin, amfotericin

RT - szobahőmérséklet

SQ - szubkután v/v - térfogat/térfogat w/v - tömeg/térfogat

Anyagok és eljárások

Állatok

Humán ellenanyagok expresszálására képes transzgenikus egerek ismertek a szakterületen (és kereskedelmi forgalomban kaphatók például az alábbi cégektől: GenPharm International, San Jose, CA; Abgenix, Freemont, CA, és mások), amelyek humán immunglobulinokat expresszálnak, és egér IgM-et vagy Ig-t nem. Például ilyen transzgenikus egerek V(D)J kapcsoláson, nehézlánc osztályváltozásán és szomatikus mutációkon keresztülmenő humán szekvenciájú transzgéneket tartalmaznak, humán szekvenciájú immunglobulinok készletét hozva létre [Lonberg és mtsai., Nature 368, 856-859. old. (1994)). A könnyűlánc transzgéneket például részben élesztő mesterséges kromoszómáról származtathatjuk, amely tartalmazza a csíravonal humán V-régiónak majdnem a felét.

-69Ezenfelül a nehézlánc transzgén mind humán μ, mind humán 1 [Fishwild és mtsai.. Nature Biotechnology 14, 845-851. old. (1996)] és/vagy 3 állandó régiókat kódolhat. Megfelelő genotípusos leszármazási vonalból származó egereket alkalmazhatunk az immunizálásban és fúziós eljárásokban, teljesen humán IL-12 elleni monoklonális ellenanyagokat hozva létre.

Immunizálás

Egy vagy több immunizálási rendet alkalmazhatunk az anti-IL-12 humán hibridómák létrehozásához. Az első néhány fúziót az alábbi szemléltető immunizálási protokoll szerint hajthatjuk végre, de más hasonló ismert protokollokat is alkalmazhatunk. Számos 14-20 hetes nőstény és/vagy műtétileg ivartalanított transzgenikus hím egeret immjunizálunk IP és/vagy ID 1-1000 pg rekombináns humán IL-12-vel, azonos térfogatú ΠΤΕΕΜΑΧ-szal vagy komplett Freund-féle adjuvánssal emulgeálva 100-400 μΐ (például 200 μΐ) végtérfogatban. Mindegyik egér opcionálisan kaphat 1-10 pg-ot 100 pl fiziológiás sóoldatban a 2 SQ hely mindegyikén. Az egereket azt követően immunizálhatjuk 1-7, 5-12, 10-18, 17-25 és/vagy 2134 nappal később IP (1-400 pg) és SQ (1-400 pg x 2) IL-12-vel, azonos térfogatú TITERMAX-szal vagy inkomplett Freund-féle adjuvánssal emulgeálva. Az egereket 12-25 és 25-40 nappal később véreztethetjük retro-orbitális szúrással, véralvadás elleni szer nélkül. A vért azután hagyjuk megalvadni RT egy órán keresztül, és a szérumot összegyűjtjük és titráljuk IL-12 EIA vizsgálati eljárás alkalmazásával ismert módszerek szerint. Akkor végezzük el a fúziót, amikor a megismételt injekciók nem okozzák a titerek emelkedését. Ekkor az egerek egy végső IV megerősítő injekciót kaphatnak 1-400 pg IL-12-vel, 100 pl fiziológiás sóoldatban hígítva. Három nappal később az egerek eutanizálhatjuk a nyak kitekerésével, és a lépeket aszeptikusán eltávolítjuk és 10 ml, hideg foszfát-pufferelt sóoldatba (PBS) tesszük, amely 100 U/ml penicillint, 100 pg/ml sztreptomicint és 0,25 pg/ml amfotericin B-t (PSA) tartalmaz. A lépsejteket sterilen begyűjtjük a lépnek PSA-PBS-sel történő perfuziójával. A sejteket egyszer megmossuk hideg PSA-PBS-sel, megszámoljuk tripánkék festékkizárás alkalmazásával, és újra felszuszpendáljuk 25 mM Hepes-t tartalmazó RPMI 1640 tápközegben.

Sejtfúzió

A fúziót 1:1 - 1:10 arányban lévő egér mielóma sejt és életképes lépsejt alkalmazásával hajthatjuk végre ismert módszerek szerint, például amint az ismert a szakterületen. Nem korlátozó példaként lépsejteket és mielóma sejteket együtt csapadékba vihetünk. A csapadékot azután lassan újra felszuszpendálhatjuk - 30 másodperc alatt - 1 ml 50% (w/v) PEG/PBS oldatban (a PEG molekulatömege 1, Sigma) 37 °C-on. A fúziót azután leállíthatjuk 10,5 ml, 25 mM Hepes-t tartalmazó RPMI 1640 tápközeg lassú, 1 percen keresztül történő

-70• · ·· · * hozzáadásával (37 °C-on). A fiizionáltatott sejteket lecentrifugáljuk 5 percen keresztül 5001500 rpm-en. A sejteket azután újra felszuszpendáljuk HAT tápközegben (RPMI 1640 tápközeg, amely 25 mM Hepes-t, 10% Fetal Clone I szérumot (Hyclone), 1 mM nátriumpiruvátot, 4 mM L-glutamint, 10 pg/ml gentamicint, 2,5% Origen culturing supplement(Fisher), 10% 653-kondicionált RPMI 1640/Hepes tápközeget, 50 μΜ 2-merkaptoetanolt, 100 μΜ hipoxantint, 0,4 μΜ aminopterint és 16 μΜ timidint tartalmaz), és azután szélesztjük azokat 200 μΐ/mérőhely mennyiségben 15 darab 96-mérőhelyes, lapos fenekű szövettenyésztő mikrotiterlemezre. A lemezeket azután 7-10 napra párásított 37°C-os inkubátorba helyezzük, amely 5% CO₂-t és 95% levegőt tartalmaz.

Humán IgG anti-IL-12 ellenanyagok detektálása egér szérumban

Szilárdfázisú EIA-t alkalmazhatunk az egérszérumok humán IL-12-re specifikus humán IgG ellenanyagokra történő szkrínelésére. Röviden, lemezeket vonhatunk be 2 μg/ml koncentrációjú IL-12-vel éjszakán keresztül PBS-ben. Miután mossuk 0,02% (v/v) Tween 20at tartalmazó 0,15 M sóoldattal, a mérőhelyeket blokkolhatjuk 1% (w/v) BSA-val PBS-ben, 200 μΐ/mérőhely mennyiségben, 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. A lemezeket azonnal felhasználjuk, vagy lefagyasztjuk -20°C-on későbbi alkalmazásra. Egérszérum hígításokat inkubálunk az IL-12-vel bevont lemezeken 50 μΐ/mérőhely mennyiségben, 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. A lemezeket mossuk, és azután próbázzuk 50 μΐ/mérőhely HRP-vel jelölt, Fc-specifikus kecske anti-humán-IgG-vel, l:30000-szeres hígításban 1% BSA-PBSben, 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. A lemezeket megint moshatjuk, és 100 μΐ/mérőhely citrát-foszfát szubsztrát-oldatot (0,1 M citromsav és 0,2 M nátrium-foszfát, 0,01% H₂0₂ és 1 mg/ml OPD) adunk hozzájuk 15 percre szobahőmérsékleten. Azután leállító oldatot (4 N kénsav) adunk a mérőhelyekre 25 μΐ/mérőhely mennyiségben, és leolvassuk az OD-t 490 nm-en automatikus spektrofotométer alkalmazásával.

Teljesen humán immunglobulinok detektálása hibridóma feliilúszókban

Teljesen humán immunglobulinokat szekretáló, pozitív növekedésű hibridómákat megfelelő EIA alkalmazásával detektálhatunk. Röviden, 96-mérőhelyes ’pop-out’ mikrotiterlemezeket (VWR, 610744) 10 μg/ml kecske anti-humán-IgG-Fc-vel vonhatunk be nátrium-karbonát pufferben éjszakán keresztül 4°C-on. A lemezeket mossuk és blokkoljuk 1% BSA-PBS-sel 1 órán keresztül 37°C-on, és azonnal felhasználjuk vagy -20 °C-on lefagyasztjuk. A hígítatlan hibridóma felülúszókat inkubáljuk a lemezen, 1 órán keresztül 37 °C-on. A lemezeket mossuk, és próbázzuk HRP-vel jelölt kecske anti-humán-kappával, LlOOOO-szeresre hígítva 1% BSA-PBS-ben, 1 órán keresztül 37 °C-on. A lemezeket azután szubsztrát oldattal inkubáljuk, amint fent leírtuk.

-71 Teljesen humán anti-IL-12 ellenanyag reaktivitásának meghatározása

A hibridómákat - mint fent - egyidejűleg vizsgálhatjuk IL-12 elleni reaktivitásra is megfelelő RIA vagy egyéb vizsgálati eljárás alkalmazásával. Például felülúszókat inkubálunk kecske anti-humán-IgG-Fc lemezeken mint fent, mossuk azokat, és próbázzuk mérőhelyenként megfelelő beütésszámú radioaktivan jelölt IL-12-vel 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. A mérőhelyeket kétszer mossuk PBS-sel, és a kötődött radioaktivan jelölt IL12 mennyiségét meghatározzuk megfelelő számláló alkalmazásával.

Anti-IL-12 humán IgGl-et szekretáló hibridómákat sejttenyészetben felszaporíthatunk, és sorozatosan szubklónozhatunk korlátozó hígítással. A kapott klonális populációkat felszaporíthatjuk, és fagyasztva tartósíthatjuk fagyasztó tápközegben (95% FBS, 5% DMSO), és folyékony nitrogénben tárolhatjuk.

Izotipizálás

Az ellenanyagok izotípusának meghatározását EIA alkalmazásával hajthatjuk végre, az egérszérumok specifikus titereinek szkrínelésére alkalmazotthoz hasonló formátumban. 96mérőhelyes mikrotiterlemezeket IL-12-vel vonhatunk be, amint fent leírtuk, és 2 μg/ml koncentrációjú tisztított ellenanyagot inkubálhatunk a lemezen 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. A lemezt mossuk, és próbázzuk HRP-vel jelölt kecske anti-humán-IgGi-gyel, vagy HRP-vel jelölt kecske anti-humán-IgG₃-mal, 1 órán keresztül szobahőmérsékleten 1:4000-szeresre hígítva 1% BSA-PBS-ben. A lemezt ismét mossuk, és szubsztrát oldattal inkubáljuk, amint fent leírtuk.

Humán anti-humán-IL-12 ellenanyag kötési kinetikája humán IL-12-höz

Ellenanyagok kötési jellegzetességeit alkalmasan megállapíthatjuk például IL-12befogási EIA-val és BIAcore technológiával. Tisztított humán IL-12-ellenanyagok mért koncentrációit értékelhetjük 2 pg/ml IL-12-vel bevont EIA-lemezekhez való kötődés tekintetében, a fent leírt vizsgálati eljárásokban. Az OD-kat azután szemi-logaritmikus grafikonokon ábrázolhatjuk, mutatva a relatív kötési hatékonyságokat.

Kvantitatív kötési állandókat nyerhetünk például az alábbiak szerint, vagy bármilyen megfelelő ismert eljárás alkalmazásával. Egy BIAcore CM-5 (karboximetil) chipet helyezünk BIAcore 2000 készülékbe. HBS puffért (0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% v/v P20 felületaktív anyag, pH 7,4) áramoltatunk át a chip átfolyó küvettáján, 5 él/perc sebességgel, amíg stabil alapvonalat nem kapunk. 15 mg EDC [N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidroklorid] 200 μΐ vízben készített oldatát (100 μΐ-t) hozzáadjuk 2,3 mg NHS (N-hidroxiszukcinimid) 200 μΐ vízben készített oldatához (100 μΐ-hez). A kapott oldat 40 μΐ-ét injektáljuk a chipre. Humán IL-12 oldatának (15 pg/ml 10 mM nátrium.te. .· ·.-*

-72acetátban, pH 4,8) 6 μΐ-ét injektáljuk a chipre, körülbelül 500 RU növekedést eredményezve. A puffért lecseréljük TBS/Ca/Mg/BSA futtató pufferre (20 mM Tris, 0,15 M nátrium-klorid, 2 mM kalcium-klorid, 2 mM magnézium-acetát, 0,5% Triton X-100, 25 pg/ml BSA, pH 7,4), és átáramoltatjuk a chipen éjszakán keresztül, hogy ekvilibráljuk azt, és hidrolizáljunk vagy 5 blokkoljunk minden el nem reagált szukcinimid-észtert.

Ellenanyagot oldunk fel a futtató pufferben 33,33, 16,67, 8,33 és 4,17 nM koncentrációban. Az áramlási sebességet 30 μΐ/percre állítjuk be, és a készülék hőmérsékletét 25°C-ra. Két átfolyó küvettát alkalmazunk a kinetikus mérésekhez, az egyikhez IL-12-t immobilizáltunk (minta), és egy második, nem reagáltatott átfolyó küvettát (vak). Mindegyik 10 ellenanyag-koncentrációból 120 μΐ-t injektálunk az átfolyó küvettába 30 μΐ/perc sebességgel (asszociációs fázis), majd megszakítás nélkül 360 másodpercen keresztül puffért áramoltatunk (disszociációs fázis). A chip felszínét regeneráljuk (az interleukin-12/ellenanyag komplex disszociálódik) 30 μΐ 2 M guanidin-tiocianát két egymást követő injekciójával.

Az adatok elemzését a BIA evaluation 3.0 vagy CLAMP 2 alkalmazásával végezzük, 15 amint az ismert a szakterületen. Mindegyik ellenanyag-koncentrációra a vak szenzogramját kivonjuk a minta szenzogramjából. Globális illesztést végzünk mind a disszociációra (kd, sec ), mind az asszociációra (k_a, mól sec ^!), és kiszámítjuk (kd/ka) a disszociációs állandót (Kd, mól). Ha az ellenanyag affinitása olyan magas, hogy a befogott ellenanyag RU-értéke >100, az ellenanyag további hígításait is megfuttatjuk.

Eredmények és diszkusszió

Antí-humán-IL-12 monoklonális ellenanyagok létrehozása

Számos fúziót végzünk, és minden egyes fúziót 15 mikrotiterlemezre oltunk le (1440 mérőhely/fuzió), ami több tucat, humán IL-12-re specifikus ellenanyagot eredményez. Ezek közül néhányról azt találjuk, hogy humán és egér Ig-láncok kombinációját tartalmazza. A 25 fennmaradó hibridómák kizárólag humán nehéz- és könnyűláncokat tartalmazó anti-IL-12 ellenanyagokat szekretálnak. A humán hibridómáktól azt várjuk, hogy mindegyik IgGl legyen.

Humán anti-humán-IL-12 ellenanyagok kötési kinetikája

ELISA elemzés megerősíti, hogy ezeknek a hibridómáknak a legtöbbjéből tisztított 30 ellenanyag koncentráció-fuggő módon kötődik IL-12-höz. Az 1-2. ábrán ezeknek az ellenanyagoknak a relatív kötési hatékonyságát mutatjuk be. Ebben az esetben az ellenanyagnak a hozzátartozó antigénjéhez (epitópjához) való aviditását mérjük. Meg kell jegyeznünk, hogy az IL-12 közvetlen kötődése az EIA mikrotiterlemezhez a fehérje denaturációját okozhatja, és a látszólagos kötési affinitások nem tükrözhetik a denaturálatlan

-73 fehérjéhez való kötődést. Ötvenszázalékos kötődést találtunk a koncentrációk egy tartományában.

Kvantitatív kötési állandókat nyerünk a humán ellenanyagok BIAcore elemzésének alkalmazásával, és kiderül, hogy több humán monoklonális ellenanyag nagyon magas affinitású, IxlO⁹ és 7xl0¹² közötti K_D-vel.

Konklúzió

Több fúziót végzünk humán variábilis és állandó régiós ellenanyag transzgéneket tartalmazó, humán IL-12-vel immunizált hibrid egerekből származó lépsejtek alkalmazásával. Számos, IL-12-re reagáló, teljesen humán, IgGl izotípusba tartozó IgG monoklonális ellenanyagot hozunk létre. A teljesen humán anti-IL-12 ellenanyagokat tovább jellemezzük. A keletkezett ellenanyagok közül többnek IxlO⁹ és 9xl0¹² között van az affinitási állandója. Ezeknek az teljesen humán monoklonális ellenanyagoknak a váratlanul magas affinitása alkalmassá teszi azokat terápiás alkalmazásokra IL-12-fuggő betegségek, patológiák vagy kapcsolódó állapotokban.

3. példa: A C340 egy semlegesítő humán monoklonális ellenanyag

Kimutattuk, hogy az IL-12 bioaktivitását semlegesíti a C340 különféle JL-12-fuggő aktivitási vizsgálati eljárásokban. Mivel az IL-12 fokozza az NK-sejtek és T-limfociták IFNγ-termelését, megvizsgáltuk a C340 ellenanyag hatását az IFN-γ mRNS szabályozására és az IFN-γ fehérje termelésére [Trinchieri, G., Current Opinion in Immunology 9, 17-23. old. (1997), Morris, S. C. és mtsai., Journal of Immunology 152, 1047-1056. old. (1994)]. Szintén vizsgáltuk ezekben a vizsgálatokban a C340 képességét a limfokin-aktivált ölősejtek (LAK) aktivitásának IL-12-irányított indukálására [Kutza, J. és Murasko, D. M., Mechanisms of Ageing and Development 90, 209-222. old. (1996), Stem, A. S. és mtsai., Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 87, 6808-6812. old. (1990)]. Végezetül, teszteltük a C340 hatását CD95 sejtelszíni expressziójának IL-12-közvetített serkentésére Tés NK-sejteken [Medvedev, A. E. és mtsai., Cytokine 9, 394-404. old. (1997)].

Az IFN-γ mRNS transzkripciójának gátlása

Annak meghatározására, hogy a C340 gátolja-e az IL-12-, IL-2-indukált IFN-γ géntranszkripciót humán PBL-ben, reverz-transzkripciós PCR-t hajtottunk végre, β-aktinra (kontroll az mRNS integritására és mennyiségére) és IFN-y-ra specifikus láncindítókat alkalmaztunk a stimulált PBL-ből származó cDNS amplifikálására. A 3. ábrán azt mutatjuk be, hogy a 340 gátolja az IFN-γ mRNS-t IL-12/IL-2-vel aktivált (2 órán keresztül) PBMCben.

-74Intracelluláris IFN-γ gátlása áramlási citometriával mérve

Különféle jelekre adott válaszként és az aktiválás mérésére T-sejteket és NK-sejteket indukálhatunk citokinek szekretálására. Közelebbről IL-2-vel és IL-12-vel kezelt PBL IFN-γ tekintélyes mértékű szintézisét indítja meg 48 órán belül a stimulálást követően. Ezt a termelést detektálhatjuk Brefeldin-A-vaX kezelt PBL citoplazmájában áramlási citometriával. A 4. ábrán azt mutatjuk be, hogy az ilyen tenyészetekben 60%-kal csökkent az IFN-γtermelés, amikor C340 IL-12 ellenanyagot adtunk IL-12-vel együtt 5 órán keresztül.

Az IL-12-vel indukált IFN-y-szekréció gátlása

Az 5. ábrán világosan láthatjuk, hogy a C340 két különböző ’lot’-ja dózisfuggő módon gátolta az IFN-γ szekrécióját perifériás limfocitákban. 400 pg IL-12-t előzetesen összekevertünk különböző mennyiségű C340-nel, és azután hozzáadtuk IL-2-vel stimulált PBL-tenyészetekhez. Amikor mértük 18-24 órás inkubálás után EIA-val az IFN-γ-ί, kifejezetten csökkent mennyiségű IFN-γ-ί detektáltunk, még akár csak 1 pg/ml C340 ellenanyaggal is.

Az IL-12 gátlása LAK-sejtes citotoxicitást indukált

A Raji sejtek - amely egy IL-12-re érzékeny, Burkitt-limfóma eredtű sejtvonal - egy NK-sejtekre rezisztens, LAK-sejtekre érzékeny sejtvonal. Raji sejteket - három párhuzamosban - tenyésztettünk 4 órán keresztül LAK-sejtekkel, amelyeket előzőleg aktiváltunk 400 pg/ml IL-12-vel és 10 U/mL IL-2-vel C340 humán monoklonális ellenanyag jelenlétében (5000 ng/ml vagy 50 ng/ml) vagy anélkül. A 6. ábrán három normális, egészséges donor eredményeit mutatjuk be. Az effektor sejtek IL-12 + IL-2 aktiválása megnövekedett citotoxikus aktivitást eredményezett az egyedül csak IL-2-vel aktivált sejtekhez viszonyítva. A C340 ellenanyag gátolta ezt az IL-12-fiiggő hatást. A gátlás nagyságrendjét összefüggésbe hoztuk az ellenanyag koncentrációjával, és a legmagasabb tesztelt koncentráció a citotoxicitást a háttér szintjére csökkentette.

CD95 serkentésének gátlása

Beszámoltak a CD95 IL-12-indukált serkentéséről nagyon tiszta CD56+ PBL felszínén. Amint a 7A. és 7B. ábrákon láthatjuk, az eloszlási áramlási citometriás elemzés feltárta, hogy a CD95 expresszió szignifikánsan serkentett CD3+ T-sejteken és CD56+ NKsejteken, 72 órás kezelés után IL-12-vel plusz IL-2-vel. Egyidejű IL-12-kezelés gátolta a CD95 expressziót mind CD3+, mind CD65+ populációkban. A CD3+ sejtek 50%-kal gátoltak (7A. ábra), míg a CD56+ sejtek 85%-kal voltak gátoltak (7B. ábra), amit a lecsökkent MFI index is bizonyít (százalékkal nagyobb, mint a stimulálatlan kontroll).

4. példa: Gén klónozása és jellemzése

A C340 nehézlánc génjét vagy a C340 könnyülánc génjét tartalmazó genomiális DNSfragmenseket klónoztunk és tisztítottunk. C340 hibridóma sejtekből tisztított genomiális DNS-t részlegesen emésztettünk Sau3A restrikciós enzimmel, és méret szerint elválasztottuk centrifugális frakcionálással 10-40% szukróz-gradiensen. 15-23 kb méretű DNS-fragmenseket klónoztunk az EMBL3 bakteriofág vektorba, és fágrészecskékbe pakoltuk. Több pakolási reakció 1 millió bakteriofág kiónt tartalmazó könyvtárat eredményezett. A könyvtár megközelítőleg 600000 kiónját szkríneltük tarfolt-hibridizációval, ³²P-vel jelzett genomiális DNS-fragmensek alkalmazásával, amelyek vagy humán IgGl nehézlánc állandó régió szekvenciákat, vagy humán kappa könnyűlánc állandó régió szekvenciákat tartalmaztak próbaként. 13 nehézlánc és 9 könnyűlánc kiónt detektáltunk. Ezek közül 3 nehézlánc és 4 könnyűlánc kiónt megtisztítottunk két további szkrínelési menettel. A nehézlánc kiónok egyikéről és kettőről a könnyűlánc kiónok közül kimutattuk a bakteriofág DNS PCRelemzésével, hogy tartalmazzák a kódoló szekvencia 5’ és 3’ végét. A H4 nehézlánc (HC) klón DNS-inzertje 16 kb méretű volt, és egy 3,6 kb méretű 5’ szegélyező és legalább 2 kb méretű 3’ szegélyező szekvenciát tartalmaz. Az LC1 nehézlánc (LC) klón DNS-inzertje 15 kb méretű volt, és egy 4,4 kb méretű 5’ szegélyező és 6,0 kb méretű 3’ szegélyező szekvenciát tartalmaz. Az egész inzerteket eltávolítottuk a bakteriofág vektorokból Sáli fragmensként, és a pl351 expressziós vektor Xhol és Sáli helyei közé klónoztuk, ami biztosítja a gpt szelektálható markergént. Mivel volt egy belső Sáli hely a nehézlánc variábilis régió kódoló szekvenciájában, két Sáli fragmenst kellett átvinni a H4 bakteriofág vektorból a pl351 expressziós vektorba. A kapott nehézlánc és könnyűlánc expressziós plazmidokat sorrendben pl560-nak és pl558-nak neveztük. A nehézlánc és könnyűlánc gének p!351 vektorszekvenciákhoz viszonyított irányítottságát a két plazmidban sorrendben restrikciós enzimes elemzés és PCR alkalmazásával határoztuk meg. Mindkét esetben olyan volt az irányítottság, hogy az Ab génfragmens 5’ vége a gpt gén 3’ vége mellett volt. A klónozott gének kódoló régióinak mindkét szálát megszekvenáltuk. A pl560 és p!558 plazmidok szekvenciáit sorrendben a 11 A-l 1K. ábrákon és 13A-13J. ábrákon mutatjuk be.

5. példa: Rekombináns sejtvonal előállítása

A pl560 nehézlánc plazmidot Pvul restrikciós enzimes emésztéssel linearizáltuk, és a pl 558 könnyűlánc plazmidot Sáli restrikciós enzim alkalmazásával linearizáltuk. p3X63Ag8.653 (653) és SP2/0-Agl4 (SP2/0) sejteket külön-külön transzfektáltuk az előzetesen összekevert linearizált plazmidokkal elektroporációval, a sejteket tenyésztettük, és

-76transzfektánsokat szelektáltunk ki mikofenolsav alkalmazásával, amint azt leírták [Knight és mtsai., Molecular Immunology 30, 1443-1453. old. (1993)]. A mikofenolsavra rezisztens sejtfelülúszó kolóniákat megközelítőleg két héttel később lemértük humán IgG-re [azaz rekombináns C340-nel (rC340)]. Ebből a célból sejtfelülúszókat 96-mérőhelyes ELISA mikrotiterlemezeken, amelyeket humán IgG Fc-részletére specifikus kecske ellenanyagokkal voltak bevonva. A bevont lemezekhez kötődő humán IgG-t alkalikus foszfatázzal konjugált kecske anti-humán-IgG (nehézlánc + könnyűlánc) ellenanyag és alkalikus foszfatáz szubsztrát alkalmazásával detektáltuk, amint leírták [Knight és mtsai., Molecular Immunology 30, 14431453. old. (1993)]. A jobban termelő kiónok sejtjeit átvittük 24-mérőhelyes tenyésztő tálcákra standard tápközegben, és fel szaporítottuk azokat (IMDM, 5% FBS, 2 mM glutamin, mikofenolsav szelekciós keverék). A termelt (azaz a kimerült tenyészetek tápközegébe szekretált) ellenanyag mennyiségét körültekintően meghatároztuk ELISA-val, amelyben tisztított C340 monoklonális ellenanyagot alkalmaztunk standardként. Azután kiválasztott kiónokat felszaporítottunk T75-edényekben, és ezen kiónok humán IgG termelését ELISA-val meghatároztuk. Ezen értékek alapján hat független 653-as transzfektánst és három független SP2/0 transzfektánst szubklónoztunk (átlagosan mérőhelyenként egy sejtet leoltva 96mérőhelyes lemezeken), és meghatároztuk a szubklónok által termelt ellenanyag mennyiségét az egyedi szubklón kolóniákból származó felülúszók (ELISA) mérésével. Három szubklónt, a 653-as transzfektáns 19-20-at (C379B) és az SP2/0 transzfektáns 84-81-et (C381A) és 22-56ot (C389A) választottunk ki további elemzésre.

rC340 antigén-kötésének vizsgálata

A fent kiválasztott sejtvonal szubklónozását megelőzően a három szülői vonaltól (a 653-aminosav transzfektáns 2-es és 18-as klón és az SP2/0 transzfektáns 1-es klón) származó felülúszókat alkalmaztunk az rC340 antigén-kötési tulajdonságainak meghatározására. Az rC340 koncentrációját a három sejtfelülúszó mintáiban először ELISA-val határoztuk meg. Azután a felülúszó-minták vagy tisztított C340 pozitív kontroll titrálási mennyiségeit inkubáltuk 2 pg/ml humán IL-12-vel bevont 96-mérőhelyes mikrotiterlemezeken. A kötött monoklonális ellenanyagot azután alkalikus foszfatázzal konjugált kecske anti-humán-IgG (nehézlánc + könnyűlánc) ellenanyaggal és a megfelelő alkalikus foszfatáz szubsztráttal detektáltuk. Amint a 8. ábrán bemutatjuk, az rC340 specifikusan kötődött a humán IL-12-höz, megkülönböztethetetlen módon az eredeti C340 monoklonális ellenanyagtól.

A kiválasztott sejtvonalak jellemzése

Növekedési görbe elemzést végeztünk a C379B, C381A és C389A sejtvonalakon T75edények beoltásával 2 X 10⁵ sejt/ml kezdeti sűrűség mellett standard tápközegben vagy SFM-ΊΊ5 szérummentes tápközegben, és azután naponta követtük a sejtek számát és az rC340 koncentrációját, mindaddig, amíg a tenyészetek kimerültek. A standard tápközegben lévő tenyészetek eredményeit a 9A-9C. ábrákon mutatjuk be. A C379B, C381A és C389A maximális C340 monoklonális ellenanyag termelés szintje sorrendben 135 pg/ml, 150 pg/ml 5 és 110 pg/ml volt. A próbálkozások a C379B sejtek adaptálására SFM-5 tápközeghez nem voltak sikeresek. A C381A sejtek ugyanolyan mennyiségű rC340-et termeltek SFM-5 tápközegben, mint standard tápközegben, míg a C389A sejtek csak feleannyi rC340-et termeltek SFM-5 tápközegben, mint standard tápközegben.

Az rC340 monoklonális ellenanyag termelésének időbeli stabilitását a három szubklón 10 esetében a sejteknek 24-mérőhelyes lemezeken különböző időn keresztül történő tenyésztésével állapítottuk meg standard tápközeggel vagy mikofenolsavas szelekció nélküli standard tápközeggel. Azt figyeltük meg, hogy a C379B és C381A sejtvonalakat stabilan termelik az rC340-et szelekció jelenlétében vagy hiányában sorrendben 30 napon és 75 napon keresztül (ez volt a maximális tesztelt idő). A C389A sejtvonal instabil volt, és 43 napnyi 15 tenyésztés elteltével csak 20%-át termelte, mint a vizsgálat kezdetekor.

Nyilvánvaló, hogy a találmányt másképpen is gyakorlatba lehet venni, mint ahogyan azt részletesen feltártuk a fenti leírásban és példákban.

A találmány számos módosítása és variációja lehetséges a fenti kitanítás fényében, és ezek a csatolt igénypontok oltalmi körébe esnek.

Claims

-78Szabadalmi igénypontok

1. Legalább egy izolált emlős anti-IL-12 ellenanyag, amely legalább egy, 7. vagy 8. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó variábilis régiót tartalmaz.
2. Izolált nukleinsav, amely legalább egy, 7. vagy 8. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó variábilis régióval rendelkező legalább egy izolált emlős anti-IL-12 ellenanyagot kódol.
3. Prokarióta vagy eukarióta gazdasejt, amely 2. igénypont szerinti izolált nukleinsavat tartalmaz.
4. Készítmény, amely legalább egy, 7. vagy 8. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó variábilis régióval rendelkező legalább egy izolált emlős anti-IL-12 ellenanyagot és legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy oldószert tartalmaz.
5. Eljárás IL-12-vel kapcsolatos állapot diagnosztizálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben vagy állatban, azzal jellemezve, hogy legalább egy, 7. vagy 8. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó variábilis régióval rendelkező legalább egy izolált emlős anti-IL-12 ellenanyag hatásos mennyiségét tartalmazó készítményt érintkezésbe hozunk a sejttel, szövettel vagy állattal, vagy azt beadjuk annak.
6. Legalább egy izolált emlős anti-IL-12 ellenanyag, amely vagy (i) a 7., 8. és 9. azonosítószámú szekvencia szerinti nehézlánc komplementaritást meghatározó régió (CDR) aminosav-szekvenciák mindegyikét, vagy (ii) a 10., 11. és 12. azonosítószámú szekvencia szerinti könnyűlánc CDR aminosav-szekvenciák mindegyikét tartalmazza
7. Izolált nukleinsav, amely vagy (i) a 7., 8. és 9. azonosítószámú szekvencia szerinti nehézlánc CDR aminosav-szekvenciák mindegyikét, vagy (ii) a 10., 11. és 12 azonosítószámú szekvencia szerinti könnyűlánc CDR aminosav-szekvenciák mindegyikét tartalmazó legalább egy izolált emlős anti-TNF ellenanyagot kódol.
8. Prokarióta vagy eukarióta gazdasejt, amely 7. igénypont szerinti izolált nukleinsavat tartalmaz.
9. Készítmény, amely vagy (i) a 7., 8. és 9. azonosítószámú szekvencia szerinti nehézlánc CDR aminosav-szekvenciák mindegyikét, vagy (ii) a 10., 11. és 12. azonosítószámú szekvencia szerinti könnyűlánc CDR aminosav-szekvenciák mindegyikét tartalmazó legalább egy izolált emlős anti-IL-12 ellenanyagot és legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy oldószert tartalmaz.
10. Eljárás IL-12-vel kapcsolatos állapot diagnosztizálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben vágy állatban, azzal jellemezve, hogy vagy (i) a 7., 8. és 9

-79azonosítószámú szekvencia szerinti nehézlánc CDR aminosav-szekvenciák mindegyikét, vagy (ii) a 10., 11. és 12. azonosítószámú szekvencia szerinti könnyűlánc CDR aminosavszekvenciák mindegyikét tartalmazó legalább egy izolált emlős anti-IL-12 ellenanyag hatásos mennyiségét tartalmazó készítményt érintkezésbe hozunk a sejttel, szövettel, szervvel vagy állattal, vagy azt beadjuk annak.
11. Legalább egy izolált emlős anti-IL-12 ellenanyag, amely az 1., 2., 3., 4., 5. vagy 6. azonosítószámú szekvenciák legalább egyike szerinti aminosav-szekvenciával rendelkező legalább egy nehézlánc vagy könnyűlánc CDR-t tartalmaz.
12. Izolált nukleinsav, amely az 1., 2., 3., 4., 5. vagy 6. azonosítószámú szekvenciák legalább egyike szerinti aminosav-szekvenciával rendelkező legalább egy nehézlánc vagy könnyűlánc CDR-rel rendelkező legalább egy izolált emlős anti-IL-12 ellenanyagot kódol.
13. Prokarióta vagy eukarióta gazdasejt, amely 12. igénypont szerinti izolált nukleinsavat tartalmaz.
14. Készítmény, amely az 1., 2., 3., 4., 5. vagy 6. azonosítószámú szekvenciák legalább egyike szerinti aminosav-szekvenciával rendelkező legalább egy nehézlánc vagy könnyűlánc CDR-rel rendelkező legalább egy izolált emlős anti-IL-12 ellenanyagot és legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy oldószert tartalmaz.
15. Eljárás IL-12-vel kapcsolatos állapot diagnosztizálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben vagy állatban, azzal jellemezve, hogy az 1., 2., 3., 4., 5. vagy 6. azonosítószámú szekvenciák legalább egyike szerinti aminosav-szekvenciával rendelkező legalább egy nehézlánc vagy könnyűlánc CDR-rel rendelkező legalább egy izolált emlős antiIL-12 ellenanyag hatásos mennyiségét tartalmazó készítményt érintkezésbe hozunk a sejttel, szövettel vagy állattal, vagy azt beadjuk annak.
16. Legalább egy izolált emlős anti-IL-12 ellenanyag, amely IL-12 fehérjének ugyanazon régiójához kötődik, mint az 1., 2., 3., 4., 5. vagy 6. azonosítószámú szekvenciák legalább egyike szerinti aminosav-szekvenciával rendelkező legalább egy nehézlánc vagy könnyűlánc CDR-t tartalmazó ellenanyag.
17. Izolált nukleinsav, amely IL-12 fehérjének az 1., 2., 3., 4., 5. vagy 6. azonosítószámú szekvenciák legalább egyike szerinti aminosav-szekvenciával rendelkező legalább egy nehézlánc vagy könnyűlánc CDR-t tartalmazó ellenanyaggal megegyező régiójához kötődő legalább egy izolált emlős anti-IL-12 ellenanyagot kódol.
18. Prokarióta vagy eukarióta gazdasejt, amely 17. igénypont szerinti izolált nukleinsavat tartalmaz.
19. Készítmény, amely IL-12 fehérjének az 1., 2., 3., 4., 5. vagy 6. azonosítószámú szekvenciák legalább egyike szerinti aminosav-szekvenciával rendelkező legalább egy nehézlánc vagy könnyűlánc CDR-rel rendelkező ellenanyagéval megegyező régiójához kötődő legalább egy izolált emlős anti-IL-12 ellenanyagot és legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy oldószert tartalmaz.
20. Eljárás IL-12-vel kapcsolatos állapot diagnosztizálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben vagy állatban, azzal jellemezve, hogy IL-12 fehérjének az 1., 2., 3., 4., 5. vagy 6. azonosítószámú szekvenciák legalább egyike szerinti aminosav-szekvenciával rendelkező legalább egy nehézlánc vagy könnyűlánc CDR-rel rendelkező ellenanyagéval megegyező régiójához kötődő legalább egy izolált emlős anti-IL-12 ellenanyag hatásos mennyiségét tartalmazó készítményt érintkezésbe hozunk a sejttel, szövettel, szervvel vagy állattal, vagy azt beadjuk annak.
21. Legalább egy izolált emlős anti-IL-12 ellenanyag, amely legalább egy humán CDR-t tartalmaz, és amely specifikusan kötődik a 9. azonosítószámú szekvencia legalább egy 1-3 amino savát tartalmazó epitóphoz.
22. Legalább egy izolált nukleinsav, amely a 9. azonosítószámú szekvencia legalább egy 1-3 aminosavát tartalmazó epitóphoz specifikusan kötődő és legalább egy humán CDR-t tartalmazó legalább egy emlős anti-IL-12 ellenanyagot kódol.
23. Prokarióta vagy eukarióta gazdasejt, amely 22. igénypont szerinti izolált nukleinsavat tartalmaz.
24. Készítmény, amely a 9. azonosítószámú szekvencia legalább egy 1-3 aminosavát tartalmazó epitóphoz specifikusan kötődő és legalább egy humán CDR-t tartalmazó legalább egy emlős anti-IL-12 ellenanyagot és legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy oldószert tartalmaz.
25. Eljárás IL-12-vel kapcsolatos állapot diagnosztizálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben vagy állatban, azzal jellemezve, hogy a 9. azonosítószámú szekvencia legalább egy 1-3 aminosavát tartalmazó epitóphoz specifikusan kötődő és legalább egy humán CDR-t tartalmazó legalább egy emlős anti-IL-12 ellenanyag hatásos mennyiségét tartalmazó készítményt érintkezésbe hozunk a sejttel, szövettel vagy állattal, vagy azt beadjuk annak.