[go: up one dir, main page]

HUP0302128A2 - Anti-duális-integrin ellenanyagok, készítmények, eljárások és alkalmazások - Google Patents

Anti-duális-integrin ellenanyagok, készítmények, eljárások és alkalmazások Download PDF

Info

Publication number
HUP0302128A2
HUP0302128A2 HU0302128A HUP0302128A HUP0302128A2 HU P0302128 A2 HUP0302128 A2 HU P0302128A2 HU 0302128 A HU0302128 A HU 0302128A HU P0302128 A HUP0302128 A HU P0302128A HU P0302128 A2 HUP0302128 A2 HU P0302128A2
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
antibody
dual
integrin
cell
seq
Prior art date
Application number
HU0302128A
Other languages
English (en)
Inventor
Jill Giles-Komar
George Heavner
Linda Snyder
Mohit Trikha
Original Assignee
Centocor, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centocor, Inc. filed Critical Centocor, Inc.
Publication of HUP0302128A2 publication Critical patent/HUP0302128A2/hu
Publication of HUP0302128A3 publication Critical patent/HUP0302128A3/hu
Publication of HU229418B1 publication Critical patent/HU229418B1/hu

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P23/00—Anaesthetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P23/00—Anaesthetics
    • A61P23/02—Local anaesthetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
    • A61P5/04—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin for decreasing, blocking or antagonising the activity of the hypothalamic hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A61P5/44—Glucocorticosteroids; Drugs increasing or potentiating the activity of glucocorticosteroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5029—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on cell motility
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70546—Integrin superfamily, e.g. VLAs, leuCAM, GPIIb/GPIIIa, LPAM
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát képezi legalább egy anti-duális-integrinellenanyag, a legalább egy anti-duális-integrin ellenanyagot kódolónukleinsavak, duális integrin, vektorok, gazdasejtek, transzgenikusállatok vagy növények, és eljárások azok előállítására ésalkalmazására, ideértve terápiás készítményeket, eljárásokat éseszközöket. Ó

Description

KÖZZÉTÉTELI ............ ,
P0 3 0 2 1 2 8 PÉLDÁNY ····>// T Λ λ
Anti-duáiis-íntegrin ellenanyagok, készítmények, eljárások és alkalmazások
Ez a bejelentés részben a 2000. augusztus 7-én benyújtott, 60/223 363. számú amerikai egyesült államokbeli ideiglenes bejelentésen alapul, és annak elsőbbségét igényli, 5 amely teljes mértékben hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.
A találmány tárgyát ellenanyagok képezik — beleértve specifikus részleteket és variánsokat — legalább egy alfa-V-béta-3, alfa-V-béta-5 duális integrin (duális integrin) fehérje vagy annak fragmense ellen, valamint ilyen anti-duális-integrin ellenanyagokat kódoló nukleinsavak, komplementer nukleinsavak, vektorok, gazdasejtek, és eljárások azok 10 előállítására és alkalmazására, beleértve terápiás készítményeket, a beadásukat és eszközöket.
Jelenleg figyelemre méltó bizonyíték van arra, hogy a progresszív daganatnövekedés az angiogenezistől, új vérerek kialakulásától függ, hogy a daganatokat ellássa tápanyagokkal és oxigénnel, eltávolítsa a salakanyagokat, és a daganatsejtek távoli helyekre történő metasztázisának vezetékeként működjön [Gastl és mtsai., Oncol. 54, 177-184. old.]. Friss vizsgálatok tovább definiálták az integrinek szerepét az angiogenezis folyamatában. Az integrinek heterodimer transzmembrán fehérjék, amelyek kulcsszerepet játszanak a sejteknek az extracelluláris mátrixhoz (ECM) való adhéziójában, ami pedig közvetíti a sejtek túlélését, proliferációját és migrációját az intracelluláris jeltovábbítás útján. Az angiogenezis folyamán az aktivált endotéliális sejtek felszínén expresszálódó számos integrin szabályozza a kulcsfontosságú kölcsönhatásokat különféle ECM fehérjékkel, szabályozva különböző biológiai eseményeket, mint például a sejtek migrációját, proliferációját és differenciációját.
Közelebbről, a közeli rokon, de különálló ανβ3 és ανβ5 integrinekről kimutatták, hogy független útvonalakat közvetítenek az angiogenezis folyamatában. Az ανβ3 ellen termeltetett ellenanyag blokkolta a bázikus fíbroblaszt növekedési hormon (bFGF) által indukált 25 angiogenezist, míg az ανβί-Γε specifikus ellenanyag gátolta a vaszkuláris endotéliális növekedési faktor (VEGF) által indukált angiogenezist [Eliceiri és mtsai., J. Clin. Invest. 103, 1227-1230. old. (1999); Friedlander és mtsai., Science 270, 1500-1502. old. (1995)].
Nem-humán emlős, kiméra, poliklonális (például antiszérumok) és/vagy monoklonális ellenanyagok (Mabs) és fragmensek (például azok proteolitikus emésztési vagy fúziós fehérje 30 termékei) potenciális terápiás ágensek, amelyeket tanulmányoznak bizonyos esetekben bizonyos betegségek kezelésének megpróbálására. Azonban az ilyen ellenanyagok vagy fragmensek immunválaszt válthatnak ki, amikor beadják azokat embereknek. Az ilyen immunválasz az ellenanyagok vagy fragmensek immunkomplex által közvetített kiürítését eredményezheti a keringésből, és az ismételt beadást alkalmatlanná teheti terápiás célra,
-2ezáltal csökkentve a páciensre gyakorolt jótékony terápiás hatást, és korlátozhatja az ellenanyag vagy fragmens újbóli beadását. Például nem humán részleteket tartalmazó ellenanyagok vagy fragmensek ismételt beadása szérumbetegséghez és/vagy túlérzékenységhez vezethet. Annak érdekében, hogy elkerüljék ezeket és más problémákat, számos megközelítési módot megkíséreltek, hogy csökkentsék az ilyen ellenanyagok és ezek részleteinek az immunogenitását, beleértve a kimerizálást és humanizálást, amint az jól ismert a szakterületen. Ezek és más megközelítési módok azonban még mindig olyan ellenanyagokat vagy fragmenseket eredményezhetnek, amelyeknek még mindig van valamennyi immunogenitása, alacsony az affinitása, alacsony az aviditása, vagy problémásak sejttenyészetben, felnagyításban, gyártásban, és/vagy alacsony a kitermelésük. Ily módon az ilyen ellenanyagok vagy fragmensek az ideálisnál kevésbé alkalmasak gyártásra vagy terápiás fehérjeként történő alkalmazásra.
Ennek megfelelően igény van olyan anti-duális-integrin ellenanyagok vagy fragmensek biztosítására, amelyek ezen problémák közül egyre vagy többre megoldást nyújtanak, valamint igény van az ismert ellenanyagok vagy azok fragmensei javítására.
A találmány tárgyát izolált humán, főemlős, rágcsáló, emlős, kiméra, humanizált és/vagy CDR-graftolt anti-duális-integrin ellenanyagok, immunglobulinok, hasítási termékek és azok más specifikus részletei és variánsai képezik, valamint anti-duális-integrin ellenanyag-készítmények, kódoló vagy komplementer nukleinsavak, vektorok, gazdasejtek, készítmények, kiszerelések, eszközök, transzgenikus állatok, transzgenikus növények, és eljárások azok előállítására és alkalmazására, amint ezeket a leírásban leírjuk és feltárjuk, kombinálva mindazzal, ami ismert a szakterületen.
A találmány tárgyát képezi legalább egy izolált, találmány szerinti anti-duális-integrin ellenanyag is. Találmány szerinti ellenanyag bármilyen olyan fehérje- vagy peptidtartalmú molekula, amely immunglobulin molekula legalább egy részletét tartalmazza, mint például nem korlátozó példaként nehézlánc vagy könnyűlánc legalább egy komplementaritást meghatározó régióját (CDR) vagy annak ligandumkötő részletét, nehézlánc vagy könnyűlánc variábilis régióját, nehézlánc vagy könnyűlánc állandó régióját, vázrégiót, vagy azok bármely részletét, amely beépíthető találmány szerinti ellenanyagba. Találmány szerinti ellenanyag tartalmazhat vagy származhat bármilyen emlősből, nem korlátozó példaként emberből, egérből, nyúlból, patkányból, rágcsálóból, főemlősből, vagy ezek bármilyen kombinációjából, és hasonlókból.
A találmány tárgyát egy megvalósítási mód szerint olyan izolált nukleinsav-molekulák képezik, amelyek tartalmaznak olyan specifikus anti-duális-integrin ellenanyagokat kódoló
-3 polinukleotidot, vagy komplementerek azzal vagy hibridizálnak ahhoz, amely legalább egy meghatározott szekvenciát, domént, részletet vagy annak variánsát tartalmazza. A találmány tárgyát képezik továbbá az anti-duális-integrin ellenanyag nukleinsav-molekulákat tartalmazó rekombináns vektorok, ilyen nukleinsavakat és/vagy rekombináns vektorokat tartalmazó gazdasejtek, valamint eljárások ilyen ellenanyag-nukleinsavak, vektorok és/vagy gazdasejtek előállítására és/vagy alkalmazására.
Legalább egy találmány szerinti ellenanyag kötődik legalább egy meghatározott epitóphoz, amely specifikus legalább egy duális integrin fehérjére, alegységre, fragmensre, részletre vagy azok bármilyen kombinációjára. A legalább egy epitóp tartalmazhat legalább egy ellenanyagkötő régiót, amely legalább egy részletét tartalmazza a fehérjének, amely epitóp előnyösen a duális integrin legalább egy részletének legalább 1-5 aminosavából áll, mint például nem korlátozó példaként sorrendben a 9. ,16. és 17. azonosítószámú szekvenciák (a) 29-48, 58-63, 69-79, 82-85, 88-134, 140-157, 161-183, 186-190, 192-198, 202-212, 215217, 223-237, 240-244, 248-255, 259-268, 287-301, 313-322, 326-328, 332-344, 348-351, 354-365, 376-387, 393-401, 407-414, 417-419, 422-433, 443-451, 458-461, 465-469, 472, (b) 32-41, 46-47, 53-55, 58-69, 72-74, 77-79, 85-88, 91-94, 96-105, 110-113, 117-125, 129-142, 145-153, 155-159, 161-163, 166-170, 172-174, 184-197, 200-209, 215-218, 221-225, 184197, 200-209, 215-218, 221-225, 227-250, 259-261, 263-267, 269-270, 275-281; és (c) 29-35, 43-45, 48-63, 67-69, 72-74, 80-82, 84-87, 95-105, 108-113, 117-142, 145-163, 166-170, 172176, 184-186, 191-201, 204-206, 216-219, 224-226, 229-251, 260-262, 264-268, 276-282, 286-288, 294-299, 301-318, 323-325, 328-330, 338-342, 345-349, 353-358 részletei, vagy mint például nem korlátozó példaként a duális integrin fehérje legalább egy funkcionális, extracelluláris, oldható, hidrofil, külső vagy citoplazmatikus doménja, vagy annak bármely részlete.
A legalább egy ellenanyag adott esetben tartalmazhatja legalább egy komplementaritást meghatározó régió (CDR) legalább egy meghatározott részletét (például a nehézlánc vagy könnyűlánc variábilis régió CDR1, CDR2 vagy CDR3 részletét) és/vagy legalább egy állandó vagy variábilis vázrégiót vagy annak bármilyen részletét. A legalább egy ellenanyag aminosav-szekvencia továbbá adott esetben tartalmazhat legalább egy meghatározott szubsztitúciót, inzerciót vagy deléciót, amint azt a leírásban feltárjuk vagy ismert a szakterületen.
A találmány tárgyát képezi legalább egy találmány szerinti izolált anti-duális-integrin ellenanyag is, ahol az ellenanyagnak van legalább egy aktivitása, mint például nem korlátozó példaként vitronektin kötődés gátlása, alfa-v-béta-3 kötődésének gátlása legalább egy alfa-v
-4béta-3 ligandumhoz vagy receptorhoz, alfa-v-béta-5 kötődésének gátlása legalább egy alfa-vbéta-5 ligandumhoz vagy receptorhoz, angiogenezis modulálása, duális integrint vagy egyedi integrint expresszáló sejthez való kötődés gátlása. Egy anti-duális-integrin ellenanyagot tehát szkrínelhetünk megfelelő aktivitásra ismert módszerek szerint, mint például nem korlátozó példaként legalább egy, duális integrin fehérje iránti biológiai aktivitásra.
A találmány tárgyát képezi továbbá legalább egy duális integrin anti-idiotípus ellenanyag legalább egy találmány szerinti duális integrin ellenanyag ellen. Az anti-idiotípus ellenanyag bármilyen olyan fehérje- vagy peptidtartalmú molekula, amely immunglobulin molekula legalább egy részletét tartalmazza, mint például nem korlátozó példaként nehézlánc vagy könnyűlánc legalább egy komplementaritást meghatározó régióját (CDR) vagy annak ligandumkötő részletét, nehézlánc vagy könnyűlánc variábilis régióját, nehézlánc vagy könnyűlánc állandó régióját, vázrégiót, vagy azok bármely részletét, amely beépíthető találmány szerinti ellenanyagba. Találmány szerinti ellenanyag tartalmazhat vagy származhat bármilyen emlősből, mint például nem korlátozó példaként emberből, egérből, nyálból, patkányból, rágcsálóból, főemlősből, vagy hasonlókból.
A találmány tárgyát egy megvalósítási mód szerint olyan izolált nukleinsav-molekulák képezik, amelyek tartalmaznak olyan, legalább egy duális integrin anti-idiotípus ellenanyagot kódoló polinukleotidot, vagy komplementerek azzal vagy hibridizálnak ahhoz, amely legalább egy meghatározott szekvenciát, domént, részletet vagy annak variánsát tartalmazza. A találmány tárgyát képezik továbbá a duális integrin anti-idiotípus ellenanyagot kódoló nukleinsav-molekulákat tartalmazó rekombináns vektorok, ilyen nukleinsavakat és/vagy rekombináns vektorokat tartalmazó gazdasejtek, valamint eljárások ilyen anti-idiotípus ellenanyag-nukleinsavak, vektorok és/vagy gazdasejtek előállítására és/vagy alkalmazására.
A találmány tárgyát képezi legalább egy eljárás is legalább egy anti-duális-integrin ellenanyag vagy duális integrin anti-idiotípus expresszáltatására gazdasejtben, amely szerint találmány szerinti gazdasejtet tenyésztünk olyan körülmények között, ahol legalább egy antiduális-integrin ellenanyag expresszálódik detektálható és/vagy visszanyerhető mennyiségben.
A találmány tárgyát képezi legalább egy készítmény is, amely (a) találmány szerinti izolált anti-duális-integrin ellenanyagot kódoló nukleinsavat és/vagy ellenanyagot és (b) megfelelő hordozót vagy oldószert tartalmaz. A hordozó vagy oldószer adott esetben gyógyászatilag elfogadható lehet, mint például ismert hordozók vagy oldószerek. A készítmény adott esetben továbbá tartalmazhat legalább egy további vegyületet, fehérjét vagy készítményt.
A találmány tárgyát képezi továbbá legalább egy anti-duális-integrin ellenanyagot alkalmazó eljárás vagy készítmény, gyógyászatilag hatásos mennyiségben történő beadásra, hogy moduláljunk vagy kezeljünk legalább egy duális integrinnel összefüggő állapotot sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben egy kapcsolódó állapotot megelőzően, azt követően vagy annak során, amint az ismert a szakterületen és/vagy a jelen leírásban feltárjuk.
A találmány tárgyát képezi legalább egy készítmény, eszköz és/vagy eljárás is, legalább egy találmány szerinti anti-duális-integrin ellenanyag gyógyászatilag vagy profilaktikusan hatásos mennyiségben történő beadására.
A találmány tárgyát képezi továbbá legalább egy anti-duális-integrin ellenanyagot alkalmazó eljárás vagy készítmény, legalább egy duális integrinnel összefüggő állapot diagnosztizálására sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben egy kapcsolódó állapotot megelőzően, azt követően vagy annak során, amint az ismert a szakterületen és/vagy a jelen leírásban feltárjuk.
A találmány tárgyát képezi legalább egy készítmény, eszköz és/vagy beadási eljárás is, legalább egy találmány szerinti anti-duális-integrin ellenanyag diagnosztizálására.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz tartozó ábrákat.
Az 1. ábrán anti-avPs monoklonális ellenanyag felező hígításainak avPa-mal bevont mikrotiterlemezen 1 órán keresztül szobahőmérsékleten történő inkubálását ábrázoló grafikont mutatunk be. A lemezeket kétszer mostuk, és próbáztuk HRP-vel jelzett kecske antui-humán-IgG-kappára specifikus ellenanyaggal, 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. A lemezeket ismét mostuk, és előhívtuk OPD-szubsztráttal és mértük az OD-t 490 nm-en.
A 2. ábrán ellenanyag-mintákkal P1F6 ανβί aszcitesz jelenlétében és anélkül 30 percen keresztül előinkubált, kalceinnel jelzett M21 sejtek grafikonját mutatjuk be, amelyekhez azután vitronektinnel bevont lemezekhez adtunk 45 percre. A nem kötődött M21 sejteket eltávolítottuk két 150 μΐ/mérőhely mosással HBSS + kalcium tápközeggel. A lemezt fluorométerben olvastuk le 485-538 nm-en.
A 3. ábrán sejtadhéziót mutatunk be, ahol MDAMB435L2 sejteket gyűjtöttünk be és inkubáltunk különböző koncentrációjú GenO95-tel 10 percen keresztül. Azután a begyűjtött daganatsejteket vitronektinnel bevont Linbro mikrotiterlemezekre adtuk, és 37 °C-on inkubáltuk 1 órán keresztül. A mérőhelyeket háromszor mostuk, és MTT-alapú Cell Titer AQ festéket adtunk az egyes mérőhelyekhez. A sejtadhéziót ELISA mikrotiterlemez-leolvasóval határoztuk meg, ahol az OD490 egyenesen arányos a sejtek adhéziójával. BSA-val bevont
-6mérőhelyekhez való sejtadhézió szolgált negatív kontrollként (adatokat nem közlünk). Minden adatpont három meghatározás átlaga.
A 4A-4D. ábrákon ellenanyag-kötődést mutatunk be avPs-hoz, ahol a ligandumot előinkubáltuk felező hígításban 10 pg/ml koncentrációtól kezdve 50 mM EDTA-val 1% BSAHBSS pufferben (Ca++ nélkül), vagy 1% BSA-HBSS pufferben (Ca++-al), 30 percen keresztül 37 °C-on. A keverékeket CNTO 95, C372, c7E3 vagy LM609 IgG-vel bevont lemezekre adtuk, és 1 órán keresztül inkubáltuk 37 °C-on. LM609-et vagy CNTO 95-öt adtunk 20 pg/ml koncentrációban a megfelelő pufferben (± Ca++), 30 percre 37 °C-on. A lemezeket próbáztuk kecske anti-egér-IgG-Fc-HRP-vel vagy kecske anti-humán-IgG-Fc-HRP-vel.
A 4E-4G. ábrákon ellenanyag-kötődést mutatunk be avPs-höz, ahol a ligandumot előinkubáltuk felező hígításban 10 pg/ml koncentrációtól kezdve 50 mM EDTA-val 1% BSAHBSS pufferben (Ca++ nélkül), vagy 1% BSA-HBSS pufferben (Ca++-al), 30 percen keresztül 37 °C-on. A keverékeket CNTO 95, C372 vagy c7E3 IgG-vel bevont lemezekre adtuk, és 1 órán keresztül inkubáltuk 37 °C-on. VNR139-et adtunk 10 pg/ml koncentrációban a megfelelő pufferben (± Ca++), 30 percre 37 °C-on. A lemezeket próbáztuk kecske anti-egérIgG-Fc-HRP-vel.
Az 5A-5B. ábrákon a GenO.95 (5A. ábra) és a ReoPro (5B. ábra) telítési kötési görbéjét mutatjuk be avPa-mal bevont mikrotiterlemezeken.
A 6A-6B. ábrákon a GenO.95 (6A. ábra) és a ReoPro (6B. ábra) telítési kötési görbéjét mutatjuk be avPs-tel bevont mikrotiterlemezeken.
A 7A-7C. ábrákon az A375S2 sejtekhez (7A. ábra), HT-29 sejtekhez (7B. ábra) és M21 sejtekhez (7C. ábra) való kötődés telítési görbéjét mutatjuk be. A sejteket két nappal a kísérlet előtt szélesztettük, és 1 x 105 sejt/mérőhely volt a vizsgálat idején. 125I GenO.95-öt (1 pCi/pg) adtunk 1% tenyésztő tápközegben, és 1,5 órán keresztül inkubáltuk 37 °C-on. A nem specifikus kötődést tápközegben lOOx hígított nem radioaktív ellenanyaggal határoztuk meg. A sejteket háromszor mostuk, és számláltuk a megkötődött radioaktivitásra. Mindegyik görbe 4-5 különálló vizsgálatot reprezentál, és a kísérlet mindegyik adatpontja három párhuzamos átlaga volt.
A 8A-8C. ábrákon az A375S2 sejtekhez (8A. ábra), HT-29 sejtekhez (8B. ábra) és M21 sejtekhez (8C. ábra) való kötődés telítési görbéjét mutatjuk be. A sejteket két nappal a kísérlet előtt szélesztettük, és 1 x 105 sejt/mérőhely volt a vizsgálat idején. 125I ReoPro-t (1 gCi/pg) adtunk 1% tenyésztő tápközegben, és 1,5 órán keresztül inkubáltuk 37 °C-on. A nem specifikus kötődést tápközegben lOOx hígított nem radioaktív ellenanyaggal határoztuk meg. A sejteket háromszor mostuk, és számláltuk a megkötődött radioaktivitásra. Mindegyik görbe
4-5 különálló vizsgálatot reprezentál, és a kísérlet mindegyik adatpontja három párhuzamos átlaga volt.
A 9. ábrán endotéliális sejtek mikrokapilláris-kialakítását mutatjuk be fibringélben tenyésztett MC-gyöngyökről. Objektív lencse: 40X. A vizsgálati eljárást a 4. példa ’Eljárások’ részében leírt módon hajtottuk végre.
A 10. ábrán a kapilláris-kialakulás mennyiségi meghatározását mutatjuk be fibringélben, 0,1% szérumban feloldott 30 ng/ml bFGF-t tartalmazó tápközegben. A mikrokapilláris sarjak számának meghatározását a 4. példa ’Eljárások’ részében leírt módon hajtottuk végre. ’Kontroll’ jelzi a hordozó kontrollt, egér (M) és humán (H) IgG szolgált negatív kontrollként. LM-P1F6 az LM609 és P1F6 kombinációja. Mindegyik oszlop 6 mérőhely átlagát reprezentálja (± szórás).
A 11. ábrán a kapilláris-kialakulás mennyiségi meghatározását mutatjuk be fibringélben, teljes tápközegben. A mikrokapilláris sarjak számának meghatározását a 4. példa Eljárások részében leírt módon hajtottuk végre. ’Kontroll’ jelzi a hordozó kontrollt, egér (M) és humán (H) IgG szolgált negatív kontrollként. LM-P1F6 az LM609 és P1F6 kombinációja. Mindegyik oszlop 6 mérőhely átlagát reprezentálja (± szórás).
A 12. ábrán HT29 sejteket mutatunk be (12A., 12B. és 12C. ábra), amelyek avPs-öt expresszálnak a felszínükön, de avPs-at nem. A HUVEC (12D., 12E. és 12F. ábrák) és A375S.2 (12G., 12H. és 121. ábrák) sejtek ανβ5 és ανββ integrineket expresszálnak a felszínükön. A daganatsejteket és endotéliális sejteket immunfluoreszcenciával festettük, és áramlási citometriával elemeztük. A baloldalon látható hisztogram a háttér-fluoreszcenciát reprezentálja, izotípus szerint illeszkedő ellenanyag jelenlétében. A jobboldalon látható hisztogram a pozitív festődést mutatja. A, D, G: LM609 (ανβ3 elleni monoklonális ellenanyag, 10 pg/ml); B, E, H: P1F6 (ανβ5 elleni monoklonális ellenanyag, 10 pg/ml) és C, F, I: GenO95 (10 pg/ml).
A 13. ábrán HUVEC sejteknek mátrixfehérjékkel bevont mikrotiterlemezekhez történő adhézióját mutatjuk be. Az adhéziós vizsgálati eljárást a 5. példa ’Eljárások’ részében leírt módon hajtottuk végre. A lemezt fluorométerben olvastuk le 485-538 nm-en. BSA-val bevont mérőhelyekhez való sejtadhézió szolgált negatív kontrollként. A 13. ábrán a sejtadhézió különböző koncentrációjú ellenanyag jelenlétében mért értékét ábrázoltuk sejtadhéziónak ellenanyag hiányában mért értékének százalékaként, amit 100%-nak tekintettük. Minden adatpont három meghatározás átlaga (± szórás).
A 14. ábrán humán melanoma sejteknek mátrixfehérjékkel bevont mikrotiterlemezekhez történő adhézióját mutatjuk be. Az adhéziós vizsgálati eljárást az ·* · ,·» «...
eljárásoknál leírt módon hajtottuk végre. BSA-val bevont mérőhelyekhez való sejtadhézió szolgált negatív kontrollként. A 14. ábrán a sejtadhézió különböző koncentrációjú ellenanyag jelenlétében mért értékét ábrázoltuk sejtadhéziónak ellenanyag hiányában mért értékének százalékaként, amit 100%-nak tekintettük. Minden adatpont három meghatározás átlaga (± szórás).
A 15. ábrán HT29 humán kolónkarcinóma sejtek adhézióját mutatjuk be vitronektinhez. Az adhéziós vizsgálati eljárást az eljárásoknál leírt módon hajtottuk végre. BSA-val bevont mérőhelyekhez való sejtadhézió szolgált negatív kontrollként. A 15. ábrán ábrázolt adatokat a maximális kötődés (ellenanyag nélkül) százalékában ábrázoltuk, és három párhuzamosban végzett meghatározások átlagai (± szórás).
A 16A-16D. ábrákon HUVEC sejtek migrációját mutatjuk be 2 pg/ml vitronektin irányába. A vizsgálati eljárást az eljárásoknál leírt módon hajtottuk végre, és a sejteket 6 órán keresztül hagytuk migrálni. A mikrofotográfiák reprezentatív látótér (lOx objektív lencse) képek a sejtmigrációról, 16A. ábra, ellenanyag nélkül, (16B. ábra, GenO95 (5 pg/ml), 16C. ábra, GenO95 (40 pg/ml). A 16D. ábrán a sejtmigráció grafikus ábrázolását mutatjuk be GenO95 különböző koncentrációinak jelenlétében. Az adatokat normalizáltuk a kontroll (ellenanyag nélkül) százalékára, amit 100%-nak tekintettünk, és mindegyik pont 3 transwell szűrő átlaga (± szórás).
A 17. ábrán HUVEC sejtek migrációját mutatjuk be 2 pg/ml vitronektin irányába avp3 és avPs elleni ellenanyagok jelenlétében. A vizsgálati eljárást az eljárásoknál leírt módon hajtottuk végre, és a sejteket 6 órán keresztül hagytuk migrálni. Az LM609 és P1F6 monoklonális ellenanyagok sorrendben az ανβ3 és ανβί ellen irányulnak. A 17. ábrán bemutatott adatokat normalizáltuk a kontroll (ellenanyag nélkül) százalékára, amit 100%-nak tekintettünk, és mindegyik oszlop 3 transwell szűrő átlaga (± szórás). BSA, egér IgG és humán IgG szolgált negatív kontrollként. LM609-P1F6 mindkét ellenanyag kombinációját jelenti. Az ellenanyagokat és aBSA-t 10 pg/ml koncentrációban alkalmaztuk.
A 18A-18E. ábrákon HUVECS migrációját mutatjuk be 2% FBS irányába. A migrációs vizsgálati eljárást 4 órán keresztül hagytuk folyni, és az adatokat az eljárásoknál leírt módon gyűjtöttük. A 18 A. ábrán az LM609, P1F6, LM609+P1F6 kombináció és izotípus szerint illeszkedő kontroll ellenanyagok (humán és egér) jelenlétében mért sejtmigrációt mutatjuk be. Az ellenanyagokat és a fehérjéket 10 pg/ml koncentrációban alkalmaztuk. A 18B. ábrán a sejtmigráció grafikus ábrázolását mutatjuk be ReoPro és GenO95 jelenlétében. A mikrofotográfiák reprezentatív látótér (lOx objektív lencse) képek a sejtmigrációról, 18C. ábra, ellenanyag nélkül, 18D. ábra, GenO95 (5 gg/ml) és 18E. ábra, GenO95 (20 μg/ml). Az
-9adatokat normalizáltuk a kontroll (ellenanyag nélkül) százalékára, amit 100%-nak tekintettünk, és mindegyik pont 3 transwell szűrő átlaga (± szórás).
A 19A-19E. ábrákon az A375S.2 sejtek migrációját mutatjuk be 10% FBS irányába. A migrációs vizsgálati eljárást 4 órán keresztül hagytuk folyni, és az adatokat az eljárásoknál leírt módon gyűjtöttük. Az ellenanyagokat 10 pg/ml koncentrációban alkalmaztuk. A 19A. ábrán a sejtmigráció grafikus ábrázolását mutatjuk be GenO95 különböző koncentrációinak jelenlétében. A 19B. ábrán az LM609, P1F6, LM609+P1F6 kombináció és izotípus szerint illeszkedő kontroll ellenanyagok (humán és egér) jelenlétében mért sejtmigrációt mutatjuk be. Az adatokat normalizáltuk a kontroll százalékára, amit 100%-nak tekintettünk, és mindegyik pont 3 transwell szűrő átlaga (± szórás). A mikrofotográfíák reprezentatív látótér (lOx objektív lencse) képek a sejtmigrációról, 19C. ábra, ellenanyag nélkül, 19D. ábra, GenO95 (5 pg/ml) és 19E. ábra, GenO95 (20 pg/ml).
A 20A-20E. ábrán HUVEC sejtek migrációját mutatjuk be vitronektin irányába bFGF jelenlétében. A migrációs kamrák szűrőinek alsó oldalát 2 pg/ml vitronektinnel vontuk be, és a vizsgálati eljárást az eljárásoknál leírt módon hajtottuk végre. A sejtek migrációját 6 órán keresztül hagytuk folyni. A 20A-20E. ábrákon minden egyes adatpont 3 transwell szűrő átlaga (± szórás). 20A. ábra, bFGF; 20B. ábra, GenO95 (5 pg/ml); 20C. ábra, GenO95 (40 pg/ml); 20D. ábra, bFGF nélkül. A 20E. ábrán sejtmigráció gátlását mutatjuk be grafikusan különböző ellenanyagok jelenlétében.
A 21A-21D. ábrákon A375S.2 sejtek invázióját mutatjuk be fibringélen keresztül (5 mg/ml). Az inváziós vizsgálati eljárást 24 órán keresztül hagytuk folyni, és az adatokat az eljárásoknál leírt módon gyűjtöttük. A mikrofotográfíák reprezentatív látótér (4x objektív lencse) képek a sejtmigrációról, 21A. ábra, ellenanyagok nélkül, 21B. ábra, GenO95 (10 pg/ml), 21C. és 21D. ábra, GenO95, 10E5 F(ab’)2, LM609, P1F6, LM-P1F6 (LM609+P1F6), humán és egér IgG-k (H-IgG és M-IgG) jelenlétében. 21D. ábra: mindegyik ellenanyag és fehérje koncentrációja 10 pg/ml. Az adatokat normalizáltuk a kontroll (ellenanyag nélkül) százalékára, amit 100%-nak tekintettünk, és mindegyik pont 3 transwell szűrő átlaga (± szórás).
A találmány tárgyát izolált, rekombináns és/vagy szintetikus anti-duális-integrin humán, főemlős, rágcsáló, emlős, kiméra, humanizált vagy CDR-graftolt ellenanyagok és azok elleni duális integrin anti-idiotípus ellenanyagok képezik, valamint készítmények és kódoló nukleinsav-molekulák, amelyek legalább egy anti-duális-integrin ellenanyagot vagy anti-idiotípus ellenanyagot kódoló legalább egy polinukleotid tartalmaznak. A találmány
tárgyát képezik továbbá nem korlátozó példaként eljárások ilyen nukleinsavak és ellenanyagok és anti-idiotípus ellenanyagok előállítására és alkalmazására, beleértve diagnosztikai és terápiás készítményeket, eljárásokat és eszközöket.
A leírás szerinti értelemben „anti alfa-béta-3, alfa-béta-5 duális integrin ellenanyag”, „anti-duális-integrin ellenanyag”, „anti-duális-integrin ellenanyag-részlet” vagy „anti-duálisintegrin ellenanyag-fragmens” és/vagy „anti-duális-integrin ellenanyag-variáns” és hasonlók alatt bármilyen olyan fehérje- vagy peptidtartalmú molekulát értünk, amely immunglobulin molekula legalább egy részletét tartalmazza, mint például nem korlátozó példaként nehézlánc vagy könnyűlánc legalább egy komplementaritást meghatározó régióját (CDR) vagy annak ligandumkötő részletét, nehézlánc vagy könnyűlánc variábilis régióját, nehézlánc vagy könnyűlánc állandó régióját, vázrégiót, vagy azok bármely részletét, vagy duális-integrinreceptor vagy kötőfehérje legalább egy részletét, amely beépíthető találmány szerinti ellenanyagba. Ilyen ellenanyag adott esetben továbbá hat egy specifikus ligandumra, mint például nem korlátozó példaként amikor egy ellenanyag modulál, csökkent, növel, antagonizál, agonizál, csillapít, enyhít, gátol, inhibeál, befolyásol és/vagy zavar legalább egy duális integrin aktivitást vagy kötődést, vagy duális-integrin-receptor aktivitást vagy kötődést, in vitro, in situ vagy in vivo. Nem korlátozó példaként megfelelő találmány szerinti antiduális-integrin ellenanyag, meghatározott részlet vagy variáns kötődhet legalább egy duális integrinhez, vagy annak meghatározott részletéhez, variánsához vagy doménjához. Egy megfelelő anti-duális-integrin ellenanyag, meghatározott részlet vagy variáns adott esetben befolyásolhat legalább egy duális integrin aktivitást vagy funkciót is, mint például nem korlátozó példaként RNS-, DNS- vagy fehérjeszintézist, duális-integrin-felszabadulást, duálisintegrin-receptor jeltovábbítást, membrán-duális-integrin-hasítást, duális-integrin-aktivitást, duális-integrin-termelést és/vagy szintézist. Az „ellenanyag” kifejezés alatt értünk továbbá ellenanyagokat, azok emésztési fragmenseit, meghatározott részleteit és variánsait, beleértve ellenanyag mimetikumokat vagy ellenanyagok olyan részleteit tartalmazókat, amelyek utánozzák egy ellenanyagnak vagy meghatározott fragmensének vagy részletének a szerkezetét és/vagy funkcióját, beleértve az egyláncú ellenanyagokat és azok fragmenseit. Funkcionális fragmensek közé tartoznak olyan ellenanyagkötő fragmensek, amelyek emlős duális integrinhez kötődnek. Duális integrinhez vagy annak részletéhez kötődni képes ellenanyag-fragmensek találmány tárgykörébe tartozó nem korlátozó példái közé tartozik az Fab (például papaines emésztéssel), Fab’ (például pepszines emésztéssel és részleges redukcióval) és F(ab’)2 (például pepszines emésztéssel), facb (például plazminos emésztéssel), pFc’ (például pepszines vagy plazminos emésztéssel), Fd (például pepszines
- 11 emésztéssel, részleges redukcióval és reaggregációval), Fv vagy scFv (például molekuláris biológiai módszerekkel) fragmens (lásd például Colligan, „Immunology”, mint fent).
Ilyen fragmenseket enzimatikus hasítással, szintetikus vagy rekombináns módszerekkel állíthatunk elő, amint az ismert a szakterületen és/vagy a leírásban feltárjuk. Ellenanyagok előállíthatok különféle csonkolt formákban is, olyan ellenanyag-gének alkalmazásával, amelyekbe egy vagy több stopkodon lett beépítve a természetes stopkodon helyétől leolvasással ellentétes irányban. Például tervezhetünk F(ab’)2 nehézlánc részletet kódoló kombinációs gént úgy, hogy tartalmazza a nehézlánc CHj doménját és/vagy csuklórégióját kódoló DNS-szekvenciákat. Ellenanyagok különféle részleteit összekapcsolhatjuk hagyományos kémiai módszerekkel, vagy összefüggő fehérjeként állíthatjuk elő azokat génsebészeti módszerek alkalmazásával.
A leírás szerinti értelemben a „humán ellenanyag” kifejezés alatt olyan ellenanyagot értünk, amelyben a fehérjének lényegében minden részlete [például CDR, vázrégió, Cl, Ch domének (például CHb CH2, CH3), csukló (VL, VH)] lényegében nem immunogén emberekben, és csak apró szekvencia-változásokat vagy variációkat tartalmaznak. Hasonlóképpen, főemlős (majom, pávián, csimpánz, stb.), rágcsáló (egér, patkány, nyúl, tengerimalac, hörcsög és hasonlók) és egyéb emlős megjelölés alatt ilyen faj, alnemzetség, nemzetség, alcsalád és család ellen specifikus ellenanyagokat értünk. Ezenkívül kiméra ellenanyagok alatt értjük a fentiek bármilyen kombinációját. Ilyen változások és variációk adott esetben és előnyösen megtartják vagy csökkentik az immunogenitást emberekben vagy más fajokban a nem módosított ellenanyagokhoz képest. Ily módon egy humán ellenanyag különbözik egy kiméra vagy humanizált ellenanyagtól. Megjegyezzük, hogy humán ellenanyagot elő lehet állítani nem humán állatban vagy olyan prokarióta vagy eukarióta sejtben, amely képes funkcionálisan átrendeződött humán immunglobulin (például nehézlánc és/vagy könnyűlánc) gének expresszálására. Ezenkívül amikor egy humán ellenanyag egyláncú ellenanyag, az tartalmazhat olyan kapcsolópeptidet, amely nem található meg a természetben megtalálható humán ellenanyagokban. Például egy Fv tartalmazhat kapcsolópeptidet, mint például kettő és körülbelül nyolc közötti számú glicint vagy más aminosav-oldalláncot, amelyek összekötik a nehézlánc variábilis régióját és a könnyűlánc variábilis régióját. Ilyen kapcsolópeptideket humán eredetűnek tekintünk.
Bispecifíkus, heterospecifikus, heterokonjugált vagy hasonló ellenanyagokat is alkalmazhatunk, amelyek lehetnek monoklonális, előnyösen humán vagy humanizált ellenanyagok, amelyeknek legalább két különböző antigén iránt van kötőspecifitása. A jelen esetben az egyik kötőspecifítás legalább egy duális integrin fehérje ellen van, és a másik
- 12bármilyen más antigén ellen. Bispecifikus ellenanyagok előállítására szolgáló eljárások jól ismertek a szakterületen. Hagyományosan a bispecifikus ellenanyagok rekombináns előállítása két immunglobulin nehézlánc-könnyűlánc pár együttes expresszióján alapszik, ahol a két nehézláncnak különböző a specifítása [Milstein és Cuello, Nature 305, 537. old. (1983)]. Az immunglobulin nehéz- és könnyűláncok véletlenszerű választéka miatt ezek a hibridómák (kvadrómák) 10 különböző ellenanyag-molekula potenciális keverékét termelik, amelyek közül csak egynek van meg a helyes bispecifikus szerkezete. A helyes molekula tisztítása, amit általában affinitási kromatográfiás lépésekkel végeznek eléggé fáradságos, és a termék kitermelése alacsony. Hasonló eljárásokat tárnak fel például a WO 93/08829. számú nemzetközi közzétételi iratban, a 6 210 668., 6 193 967., 6 132 992., 6 106 833., 6 060 285., 6 037 453., 0,5932448., 5 989 530., 5 959 084., 5 959 083., 5 932 448., 5 833 985., 5 821 333., 5 807 706., 5 643 759., 5 601 819., 5 582 996., 5 496 549., 4 676 980. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokban, a WO 91/00360., WO 92/00373. számú nemzetközi közzétételi iratokban, az EP 03089. számú európai szabadalmi iratban, Traunecker és mtsai., EMBO J. 10, 3655. old. (1991), Suresh és mtsai., Methods in Enzymology 121, 210. old (1986), amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.
A találmány szerinti eljárásokban és készítményekben alkalmazható anti-duálisintegrin ellenanyagok (amelyeket duális integrin ellenanyagoknak is nevezünk) adott esetben a duális integrin iránti magas affinitással is jellemezhetők, és adott esetben és előnyösen alacsony a toxicitásuk. Közelebbről találmány szerinti ellenanyag, meghatározott fragmens vagy variáns hasznos a találmány szerint, ha az egyedi komponenseknek — mint például a variábilis régiónak, állandó régiónak és vázrégiónak — egyedileg és/vagy együttesen adott esetben és előnyösen alacsony az immunogenitása. A találmány szerint alkalmazható ellenanyagokat adott esetben az jellemzi, hogy képesek páciensek hosszú időn keresztül tartó kezelésére a tünetek mérhető enyhítésével és alacsony és/vagy elfogadható toxicitással. Az alacsony vagy elfogadható immunogenitás és/vagy magas affinitás, valamint más megfelelő tulajdonságok hozzájárulhatnak az elért terápiás eredményekhez. Az „alacsony immunogenitás”-t úgy definiáljuk a leírás szerinti értelemben, hogy szignifikáns HAHA, HACA vagy HAMA választ vált ki a kezelt pácienseknek kevesebb, mint körülbelül 75%ában, vagy előnyösen kevesebb, mint körülbelül 50%-ában, és/vagy alacsony titert hoz létre a kezelt páciensekben (kevesebb, mint körülbelül 300-at, előnyösen kevesebb, mint körülbelül 100-at kettős antigén enzimes immunológiai vizsgálati eljárással mérve) (Elliott és mtsai.,
- 13 Lancet 344, 1125-1127. old. (1994), , amely hivatkozás útján teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi],
A Ikalmazhatóság
A találmány szerinti izolált nukleinsavak alkalmazhatók legalább egy anti-duálisintegrin ellenanyagnak vagy meghatározott variánsának az előállítására, amely alkalmazható legalább egy duális-integrin-állapot — amely nem korlátozó példaként legalább egy immunológiai rendellenesség vagy betegség, szív- és érrendszeri rendellenesség vagy betegség, fertőző, rosszindulatú és/vagy idegrendszeri rendellenesség vagy betegség bármelyike, vagy bármilyen egyéb ismert, duális integrinnel kapcsolatos állapot — mérésére vagy kiváltására, diagnosztizálására, monitorozására, modulálására, kezelésére, enyhítésére, előfordulása megelőzésének elősegítésére vagy tüneteinek a csökkentésére egy sejtben, szövetben, szervben vagy állatban (beleértve az emlősöket és az embert).
Ilyen eljárás szerint legalább egy anti-duális-integrin ellenanyagot tartalmazó készítmény vagy gyógyászati készítmény hatásos mennyiségét beadjuk egy sejtbe, szövetbe, szervbe, állatba vagy páciensbe, amelynek szüksége van tünetek, hatások vagy mechanizmusok ilyen modulálására, kezelésére, enyhítésére, megelőzésére vagy csökkentésére. A hatásos mennyiség tartalmazhat körülbelül 0,001-500 mg/kg mennyiséget egyetlen (például bólusz), többszörös vagy folyamatos beadásban, vagy 0,01-5000 pg/ml szérumkoncentráció eléréséhez egyetlen, többszörös vagy folyamatos beadásban, vagy bármilyen hatásos tartományt vagy értéket ezek között, amint azt ismert eljárások alkalmazásával elvégezzük és meghatározzuk a leírás szerint, vagy ismert az idevágó szakterületeken.
Referenciák
Az összes, leírásban idézett publikáció és szabadalom teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi, minthogy a technika állását mutatják be a jelen találmány idején és/vagy a találmány leírását és megvalósíthatóságát biztosítják. Publikáció alatt bármilyen tudományos vagy szabadalmi publikációt értünk, vagy bármilyen egyéb hozzáférhető információt bármilyen média formátumban, beleértve minden rögzített, elektronikus vagy nyomtatott formátumot. Az alábbi referenciák teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik: „Current Protocols in Molecular Biology”, szerk.: Ausubel, és mtsai., kiad.: John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, szerk.: Sambrook és mtsai., 2. kiadás, kiad.: Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, „Antibodies: A Laboratory Manual”, kiad.: Cold Spring Harbor, NY (1989); „Current Protocols in Immunology”, szerk.: Colligan és mtsai.,
- 14kiad.: John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); „Current Protocols in Protein Science”, szerk.: Colligan és mtsai., kiad.: John Wiley & Sons, NY, NY (1997-2001).
A találmány szerinti ellenanyagok
Legalább egy találmány szerinti anti-duális-integrin ellenanyagot előállíthatunk adott esetben egy sejtvonallal, kevert sejtvonallal, immortalizált sejttel vagy immortalizált sejtek klonális populációjával, amint az jól ismert a szakterületen [lásd például „Current Protocols in Molecular Biology”, szerk.: Ausubel, és mtsai., kiad.: John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, szerk.: Sambrook és mtsai., 2. kiadás, kiad.: Cold Spring Harbor, NY (1989) ; Harlow and Lane, „Antibodies: A Laboratory Manual”, kiad.: Cold Spring Harbor, NY (1989); „Current Protocols in Immunology”, szerk.: Colligan és mtsai., kiad.: John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); „Current Protocols in Protein Science”, szerk.: Colligan és mtsai., kiad.: John Wiley & Sons, NY, NY (1997-2001), amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi].
Humán duális integrin fehérjékre vagy azok fragmenseire specifikus humán ellenanyagokat termeltethetünk egy megfelelő immunogén antigén ellen, mint például izolált duális integrin fehérje vagy annak részlete ellen (beleértve szintetikus molekulákat, mint például szintetikus peptideket). Más specifikus vagy általános emlős ellenanyagokat hasonlóképpen termeltethetünk. Immunogén antigének előállítását és monoklonális ellenanyagok termelését bármilyen megfelelő módszer alkalmazásával végrehajthatjuk.
Egy megközelítési mód szerint hibridómát állítunk elő alkalmas immortalizált sejtvonal (például mielóma sejtvonal, mint például nem korlátozó példaként Sp2/0, Sp2/0AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A vagy hasonlók, vagy heteromielómák, azok fúziós termékei, vagy bármilyen azokból származó sejt vagy fúziós sejt, vagy bármilyen, a szakterületen ismert alkalmas sejtvonal, lásd például www.atcc.org,www.lifetech.com és hasonlók) fuzionáltatásával ellenanyag-termelő sejtekkel, mint például nem korlátozó példaként izolált vagy klónozott lép, perifériás vér, nyirok, mandula vagy egyéb immun vagy B-sejtet tartalmazó sejtekkel, vagy bármilyen más sejtekkel, amelyek nehéz vagy könnyűlánc állandó vagy variábilis vagy vázrégió vagy CDR szekvenciákat expresszálnak, akár endogén, akár heterológ nukleinsavakként, mint rekombináns vagy endogén, vitális, bakteriális, alga, prokarióta, kétéltű, rovar, hüllő, hal, emlős, rágcsáló, lóféle, juhféle, kecske, juh, főemlős, eukarióta, genomiális DNS, cDNS, rDNS, mitokondriális DNS vagy RNS, kloroplasztisz DNS vagy RNS, hnRNS, mRNS, tRNS, egyszálú, kétszálú vagy háromszálú, hibridizált és
- 15 hasonló, vagy ezek kombinációja formájában (lásd például Ausubel és mtsai., mint fent és Colligan, „Immunology”, mint fent, 2. fejezet, amelyek teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik).
Ellenanyag-termelő sejteket előállíthatunk jelentőséggel bíró antigénnel immunizált emberek vagy más alkalmas állatok perifériás véréből is, vagy előnyösen a lépükből vagy nyirokcsomóiból. Bármilyen egyéb alkalmas gazdasejtet is alkalmazhatunk heterológ vagy endogén, találmány szerinti ellenanyagot, annak meghatározott fragmensét vagy variánsát kódoló nukleinsav expresszáltatására. A fuzionáltatott sejteket (hibridómák) vagy rekombináns sejteket szelektív tenyésztési körülmények között vagy más alkalmas módszerekkel izolálhatjuk, és korlátozó hígítással vagy sejtválogatással vagy más ismert eljárásokkal klónozhatjuk. A kívánt specifitású ellenanyagokat termelő sejteket alkalmas vizsgálati eljárással (például ELISA-val) szelektálhatjuk ki.
Más, kívánt specifitású ellenanyagok előállítására vagy izolálására alkalmas eljárásokat is alkalmazhatunk, nem korlátozó példaként olyan eljárásokat, amelyek rekombináns ellenanyagot választanak ki peptid vagy fehérje könyvtárból [például nem korlátozó példaként bakteriofág, riboszóma, oligonukleotid, RNS, cDNS vagy hasonló prezentációs könyvtárból; például amelyek beszerezhetők az alábbi cégektől: Cambridge Antibody Technologies, Cambridgeshire, UK; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Scotland, UK; BioInvent, Lund, Sweden; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, CA; Ixsys; lásd például az EP 368 684. számú európai szabadalmi iratot, a PCT/GB91/01134.; PCT/GB92/01755.; PCT/GB92/002240.; PCT/GB92/00883.; PCT/GB93/00605. számú nemzetközi bejelentéseket; a 08/350260. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentést (1994.12.5); a PCT/GB94/01422., PCT/GB94/02662.; PCT/GB97/01835. számú nemzetközi bejelentéseket; (CAT/MRC); a WO 90/14443.; WO 90/14424.; WO 90/14430. számú nemzetközi közzétételi iratokat; a PCT/US94/1234. számú nemzetközi bejelentést; a WO 92/18619.; WO 96/07754. számú nemzetközi közzétételi iratokat (Scripps); az EP 614 989. számú európai szabadalmi iratot (MorphoSys); a WO 95/16027. számú nemzetközi közzétételi irat (Biolnvent); WO 88/06630.; WO 90/3809. számú nemzetközi közzétételi iratokat (Dyax); a 4 704 692. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Enzon); a PCT/US91/02989. számú nemzetközi bejelentést (Affymax); a WO 89/06283. számú nemzetközi közzétételi iratot; az EP 371 998.; EP 550 400. számú európai szabadalmi iratokat (Xoma); az EP 229 046. számú európai szabadalmi iratot; a PCT/US91/07149. számú nemzetközi bejelentést (Ixsys)]; vagy véletlenszerűen létrehozott peptideket vagy fehérjéket [lásd az 5 723 323., 5 763 192.,
814 476., 5 817 483., 5 824 514., 5 976 862. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat, a WO 86/05803. számú nemzetközi közzétételi iratot, az EP 590 689. számú európai szabadalmi iratot (Ixsys, jelenleg Applied Molecular Evolution, ΑΜΕ), amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi], vagy amelyek olyan transzgenikus állatok [például SCID egerek, Nguyen és mtsai., Microbiol. Immunoi. 41, 901-907. old. (1997); Sandhu és mtsai., Crit. Rév. Biotechnoi. 16, 95-118. old. (1996); Erén és mtsai., Immunoi. 93, 154-161. old. (1998), amelyek mindegyike, valamint a kapcsolódó szabadalmak és bejelentések teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezi] immunizálásán alapulnak, amelyek képesek humán ellenanyagok készletét előállítani, amint az ismert a szakterületen és/vagy feltárjuk a leírásban. Ilyen módszerek nem korlátozó példaként a riboszóma prezentáció [Hanes és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4937-4942. old. (1997); Hanes és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 14130-14135. old. (1998)]; egysejtes, ellenanyagot előállító technológiák [például a szelektált limfocita ellenanyag eljárás (SLAM) (5 627 052. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat, Wen és mtsai., J. Immunoi. 17, 887-892. old. (1987) ; Babcook és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7843-7848. old. (1996)]; gél-mikrocsepp és áramlási citometria [Powell és mtsai., Biotechnoi. 8, 333-337. old. (1990); One Cell Systems, Cambridge, MA; Gray és mtsai., J. Imm. Meth. 182, 155-163. old. (1995); Kenny és mtsai., Bio/Technol. 13, 787-790. old. (1995)]; B-sejt szelekció [Steenbakkers és mtsai., Molec. Biol. Reports 19, 125-134. old. (1994); Jónak és mtsai., „Progress Biotech”, 5. kötet, „In Vitro Immunization in Hybridoma Technology”, szerk.: Borrebaeck, kiad.: Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, Netherlands (1988)].
Nem humán vagy humán ellenanyagok génsebészeti úton történő módosítására és humanizálására szolgáló eljárásokat is alkalmazhatunk, amelyek jól ismertek a szakterületen. Általában humanizált vagy génsebészeti úton módosított ellenanyag egy vagy több nem humán forrásból származó aminosav-oldalláncot tartalmaz, például nem korlátozó példaként egérből, patkányból, nyálból, nem humán főemlősből vagy más emlősből származót. Ezeket a humán aminosav-oldalláncokat gyakran „import” oldalláncoknak nevezzük, amelyek tipikusan egy ismert humán szekvencia „import” variábilis, állandó vagy más doménjából származnak. Ismert humán lg szekvenciákat tárnak fel az alábbi helyeken: www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi;www.atcc.org/phage/hdb.html;www.sciquest.com/; www.abcam.com/;www.antibodyresource.com/onlinecomp.html;
www.public.iastate.edu/~pedro/researchtools.html;www.mgen.uniheidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.hím;
- 17 www. library. thinkquest. org/12429/Immune/Antibody. html;
www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/;www.path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html; www.antibodyresource.com/;mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html;
www.immunologylink.com/;pathbox.wustl.edu/~hcenter/index.html;
www.biotech.ufl. edu/~hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html;
www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u.ac.jp/~yasuhito/Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp;www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html;
www.biotech.ufl.edu/~fccl/protocol.html; www.isac/net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.unimarburg.de/~rek/AEPStart.html; baserv.uci.kun.nl/~jraats/linksl.html; www.recab.unihd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html;
www.ibt.unam.mx/vir/V_mice. html; imgt. cnusc.fr:8104/;
www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abs/index.html;antibody.bath.ac.uk/;
abgen. cvm.tamu. edu/lab/wwwabgen.html;
www.unizh.ch/~honegger/AHOseminar/Slide01.html;www.cryst.bbk.ac.uk/~ubogc7s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm;
www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html;
www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html;www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/~fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html;
www.jerini.de/fr_products.htm;www.patents.ibm.com/ibm.html, Kábát és mtsai., „Sequences of Proteins of Immunological Interest”, kiad.: U. S. Dept. Health (1983), amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.
Ilyen importált szekvenciákat alkalmazhatunk az immunogenitás csökkentésére, vagy a kötődés, affinitás, „on” sebesség, ,,off’ sebesség, aviditás, specifitás, féléletidö vagy bármely más alkalmas jellemző csökkentésére, fokozására vagy módosítására, amint az ismert a szakterületen. Általában a nem humán vagy humán CDR-szekvenciák részét vagy egészét megtartjuk, míg a variábilis és állandó régiók nem humán szekvenciáit helyettesítjük humán vagy más aminosavakkal. Ellenanyagokat adott esetben humanizálhatunk az antigén iránti magas affinitás és egyéb kedvező biológiai tulajdonságok megtartásával is. Ezen cél elérése érdekében humanizált ellenanyagokat adott esetben a szülői szekvenciák és különféle konceptuális humanizált termékek elemzése útján állíthatunk elő, a szülői és humanizált szekvenciák háromdimenziós modelljeinek alkalmazásával. Háromdimenziós immunglobulin modellek általánosan hozzáférhetők és ismertek a szakember számára. Beszerezhetők olyan számítógépi programok, amelyek bemutatják és ábrázolják a kiválasztott potenciális immunglobulin-szekvenciák valószínű háromdimenziós konformációs szerkezeteit. Ezen
- 18ábrázolások tanulmányozása lehetővé teszi az oldalláncok valószínű szerepének az elemzését a potenciális immunglobulin-szekvencia működésében, azaz azon oldalláncok elemzését, amelyek befolyásolják a potenciális immunglobulin képességét az antigénjéhez való kötődésre. Ily módon FR-oldalláncokat választhatunk ki, és kombinálhatjuk azokat a konszenzus és import szekvenciákból, oly módon, hogy elérjük a kívánt ellenanyagtulajdonságot, mint például a megnövekedett affinitást a célantigén(ek) iránt. Általánosságban a CDR-oldalláncok közvetlenül és leglényegesebb módon részt vesznek az antigénkötés befolyásolásában. A találmány szerinti ellenanyagok humanizálását és génsebészeti úton történő módosítását bármilyen ismert eljárás alkalmazásával elvégezhetjük, mint például nem korlátozó példaként az alábbi irodalmi helyeken leírtakkal: Winter (Jones és mtsai., Nature 321, 522. old. (1986); Riechmann és mtsai. Nature 332, 323. old. (1988); Verhoeyen és mtsai., Science 239, 1534. old. (1988); Sims és mtsai., J. Immunoi. 151, 2296. old. (1993); Chothia és Lesk, J. Mól. Bioi. 196, 901. old. (1987); Carter és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89, 4285. old. (1992); Presta és mtsai., J. Immunoi. 151, 2623. old. (1993); az
723 323., 5 976 862., 5 824 514., 5 817 483., 5 814 476., 5 763 192., 5 723 323., 5 766 886.,
714 352., 6180370., 6 180 370., 5 693 762., 5 530 101., 5 585 089., 5 225 539.; 4 816 567.
számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok, PCT/US98/16280., PCT/US96/18978., PCT/US91/09630., PCT/US91/05939., PCT/US94/01234.,
PCT/GB89/01334., PCT/GB91/01134., PCT/GB92/01755. számú nemzetközi bejelentések; WO 90/14443., WO 90/14424., WO 90/14430. számú nemzetközi közzétételi iratok, EP 229246. számú európai szabadalmi irat, amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi, beleértve az azokban idézett referenciákat is.
Az anti-duális-integrin ellenanyagot adott esetben előállíthatjuk olyan transzgenikus állat (például egér, patkány, hörcsög, nem humán főemlős és hasonlók) immunizálásával is, amely képes humán ellenanyagok készletének termelésére, amint azt a leírásban feltárjuk és/vagy ismert a szakterületen. Humán anti-duális-integrin ellenanyagot termelő sejteket izolálhatunk ilyen állatokból, és immortalizálhatjuk azokat megfelelő eljárások alkalmazásával, mint például a leírásban feltárt eljárásokkal.
Humán antigénekhez kötődő humán ellenanyagok készletét termelő transzgenikus egereket ismert eljárásokkal állíthatunk elő [például nem korlátozó példaként az 5 770 428., 5 569 825., 5 545 806., 5 625 126., 5 625 825., 5 633 425., 5 661 016. és 5 789 650. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok (Lonberg és mtsai.); Jakobovits és mtsai., WO 98/50433. számú nemzetközi közzétételi irat, Jakobovits és mtsai. WO 98/24893. számú nemzetközi közzétételi irat, Lonberg és mtsai., WO 98/24884. számú nemzetközi közzétételi
- 19irat, Lonberg és mtsai., WO 97/13852. számú nemzetközi közzétételi irat, Lonberg és mtsai., WO 94/25585. számú nemzetközi közzétételi irat, Kucherlapate és mtsai., WO 96/34096. számú nemzetközi közzétételi irat, Kucherlapate és mtsai., EP 0463 151 Bl. számú európai szabadalmi irat, Kucherlapate és mtsai., EP 0710 719 Al. számú európai szabadalmi irat, Surani és mtsai., 5 545 807. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat, Bruggemann és mtsai., WO 90/04036. számú nemzetközi közzétételi irat, Bruggemann és mtsai., EP 0438 474 Bl. számú európai szabadalmi irat, Lonberg és mtsai., EP 0814 259 A2. számú európai szabadalmi irat, Lonberg és mtsai., GB 2 272 440 A. számú brit szabadalmi irat; Lonberg és mtsai., Nature 368, 856-859. old. (1994), Taylor és mtsai., Int. Immunoi. 6, 579-591. old. (1994), Green és mtsai., Nature Genetics 7, 13-21. old. (1994), Mendez és mtsai., Nature Genetics 15, 146-156. old. (1997), Taylor és mtsai., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295. old. (1992), Tuaillon és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 3720-3724. old. (1993), Lonberg és mtsai., Int. Rev. Immunol. 13, 65-93. old. (1995) és Fishwald és mtsai., Nat. Biotechnol. 14, 845-851. old. (1996), amelyek mindegyike telejs terejdelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi]. Általában ezek az egerek legalább egy transzgént tartalmaznak, amely legalább egy humán immunglobulin-lókuszról származó DNS-t tartalmaz, amely funkcionálisan át van rendezve, vagy amely funkcionális átrendeződésen mehet át. Az endogén immunglobulin-lókusz az ilyen egerekben megzavarható vagy deletálható, hogy elimináljuk az állat képességét endogén gének által kódolt ellenanyagok termelésére.
Hasonló fehérjékhez vagy fragmensekhez specifikusan kötődő ellenanyagok szkrínelését kényelmesen elérhetjük peptidprezentációs könyvtárak alkalmazásával. Ez az eljárás magában foglalja peptidek nagy gyűjteményeinek a szkrínelését kívánt funkciójú vagy szerkezetű egyedi tagokra. Peptidkönyvtárak ellenanyag-szkrínelése jól ismert a szakterületen. A prezentált peptidszekvenciák lehetnek 3-5000 vagy több aminosav hosszúságúak, gyakorta 5-100 aminosav hosszúságúak, és gyakran körülbelül 8-25 aminosav hosszúságúak. A peptidkönyvtárak létrehozására szolgáló közvetlen kémia szintetikus eljárások mellett számos rekombináns DNS módszert is leírtak. Az egyik típus peptidszekvencia prezentálását foglalja magában bakteriofág vagy sejt felszínén. Mindegyik bakteriofág vagy sejt tartalmazza az adott prezentált peptidszekvenciát kódoló nukleotidszekvenciát. Ilyen eljárásokat tárnak fel a WO 91/17271., WO 91/18980., WO 91/19818. és WO 93/08278. számú nemzetközi közzétételi iratok. Peptidek könyvtárainak létrehozására szolgáló más rendszereknek vannak in vitro kémiai szintézis és rekombináns vonatkozásai is. Lásd a WO 92/05258., WO 92/14843. és WO 96/19256. számú nemzetközi közzétételi
-20iratokat. Lásd még az 5 658 754. és 5 643 768. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat. Peptidprezentációs könyvtárak, vektorok és szkrínelő reagenskészletek beszerezhetők kereskedelmi forgalomban olyan cégektől, mint például az Invitrogen (Carlsbad, CA) és a Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK). Lásd például a 4 704 692., 4 939 666., 4 946 778., 5 260 203., 5 455 030., 5 518 889., 5 534 621., 5 656 730., 5 763 733., 5 767 260., 5 856 456. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat (Enzon); 5 223 409., 5 403 484., 5 571 698., 5 837 500. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat (Dyax), 5 427 908., 5 580 717. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat (Affymax); 5 885 793. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Cambridge Antibody Technologies); 5 750 373. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Genentech), 5 618 920., 5 595 898., 5 576 195., 5 698 435., 5 693 493., 5 698 417. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat (Xoma); Colligan, mint fent; Ausubel, mint fent; vagy Sambrook, mint fent, amely szabadalmak és publikációk mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.
A találmány szerinti ellenanyagokat előállíthatjuk legalább egy anti-duális-integrin ellenanyagot kódoló nukleinsav alkalmazásával is, transzgénikus állatot előállítva, mint például kecskéket, szarvasmarhákat, lovakat, juhokat és hasonlókat, amelyek ilyen ellenanyagokat termelnek a tejükben. Ilyen állatokat ismert eljárások alkalmazásával biztosíthatunk [lásd például nem korlátozó példaként az 5 827 690.; 5 849 992 849 992.; 4 873 316.; 5 849 992.; 5 994 616.; 5 565 362.; 5 304 489. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat és hasonlókat, amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi].
Találmány szerinti ellenanyagokat továbbá előállíthatunk legalább egy anti-duálisintegrin ellenanyagot kódoló nukleinsav alkalmazásával, transzgénikus növényeket és növényi sejteket (például nem korlátozó példaként dohányt és kukoricát) biztosítva, amelyek ilyen ellenanyagokat, meghatározott részleteket és variánsokat termelnek a növényi részekben vagy az azokból kitenyésztett sejtekben. Nem korlátozó példaként rekombináns fehérjét expresszáló transzgénikus dohányleveleket sikeresen alkalmaztak nagy mennyiségű rekombináns fehérje biztosítására, például indukálható promoter alkalmazásával [lásd például Cramer és mtsai., Curr. Top. Microbol. Immunoi. 240, 95-118. old. (1999), és az abban idézett hivatkozásokat]. Ezenkívül transzgénikus kukoricát alkalmaztak emlős fehérjék expresszáltatására kereskedelmi mennyiségben, más rekombináns expressziós rendszerekben előállított vagy természetes forrásból tisztított fehérjékével ekvivalens aktivitással [lásd
-21 például Hood és mtsai., Adv. Exp. Med. Biol. 464, 127-147. old. (1999), és az abban idézett hivatkozásokat]. Ellenanyagokat nagy mennyiségben előállítottak transzgenikus növényi magvakból is, beleértve ellenanyag fragmenseket, mint például egyláncú ellenanyagokat (scFv), például dohánymagokban és burgonyagumókban [lásd például Conrad és mtsai., Plant Mol. Biol. 38, 101-109. old. (1998), és az abban idézett hivatkozásokat]. Ily módon a találmány szerinti ellenanyagokat előállíthatjuk transzgenikus növények alkalmazásával is, ismert eljárások alkalmazásával [lásd még például Fischer és mtsai., Biotechnoi. Appl. Biochem. 30, 99-108. old. (1999), Ma és mtsai., Trends Biotechnoi. 13, 522-527. old. (1995); Ma és mtsai., Plánt Physiol. 109, 341-346. old. (1995); Whitelam és mtsai., Biochem. Soc. Trans. 22, 940-944. old. (1994); és az azokban idézett hivatkozásokat]. Lásd továbbá az általánosságban a növényi ellenanyag-expressziós rendszerek nem korlátozó példájaként, A fent idézett referenciák mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.
A találmány szerinti ellenanyagok széles tartományban lévő affinitással (Kd) képesek kötődni humán duális integrinhez. Egy előnyős megvalósítási mód szerint legalább egy találmány szerinti humán monoklonális ellenanyag képes adott esetben magas affinitással kötődni humán duális integrinhez. Például humán monoklonális ellenanyag ΙΟ'7 M vagy kisebb KD-vel kötődhet humán duális integrinhez, mint például nem korlátozó példaként 0,19,9 (vagy bármilyen tartomány vagy érték azon belül) X 10'7, ΙΟ'8, ΙΟ’9, 10’10, 10'11, 10'12, 10'13 vagy bármilyen tartomány vagy érték azon belül.
Egy ellenanyag antigén iránti affinitását vagy aviditását kísérletesen határozhatjuk meg bármilyen megfelelő eljárás alkalmazásával (lásd például Berzofsky és mtsai., „Antibody-Antigen Interactions”, „Fundamental Immunology”, szerk.: Paul, W. E., kiad.: Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis, „Immunology”, kiad.: W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992); és az azokban leírt eljárások]. Egy adott ellenanyagantigén kölcsönhatás mért affinitása változhat, ha különböző körülmények között (például sókoncentráció, pH) mérjük. Ily módon az affinitás és egyéb antigén-kötési paraméterek (például Kd, Ka, Kd) mérését előnyösen ellenanyag és antigén standardizált oldataival végezzük, és standardizált pufferrel, mint például a leírásban ismertetett pufferrel.
Nukleinsav-molekulák
A találmány szerinti információ, mint például az 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7., 8. azonosító számú szekvenciák, azok meghatározott fragmensei, variánsai és konszenzus szekvenciái közül legalább egynek az összefüggő aminosavainak legalább 70-100%-át kódoló nukleotid-szekvenciák, vagy legalább egy ilyen szekvenciát tartalmazó letétbe helyezett
-22vektor alkalmazásával legalább egy anti-duális-integrin ellenanyagot kódoló találmány szerinti nukleinsav-molekula előállítható a leírásban feltárt, vagy a szakterületen ismert eljárás alkalmazásával.
Találmány szerinti nukleinsav-molekulák lehetnek RNS formájában, mint például mRNS, hnRNS, tRNS vagy bármilyen más forma, vagy DNS formájában, nem korlátozó példaként klónozással nyert vagy szintetikusan előállított cDNS vagy genomiális DNS forma, vagy ezek bármilyen kombinációja. A DNS lehet háromszálú, kétszálú vagy egyszálú, vagy ezek bármilyen kombinációja. A DNS vagy RNS legalább egy szálának bármely részlete lehet a kódoló szál, amit szensz szálként is ismerünk, vagy lehet a nem kódoló szál, amit antiszensz szálnak is nevezünk.
Találmány szerinti izolált nukleinsav-molekulák közé tartozhatnak olyan nukleinsavmolekulák, amelyek tartalmaznak egy nyílt leolvasási fázist (ORF), adott esetben egy vagy több intronnal, például nem korlátozó példaként legalább egy nehézlánc (például 1-3. azonosító számú szekvencia) vagy legalább egy könnyűlánc (például 4-6. azonosítószámú szekvencia) legalább egy CDR-jének, mint például CDR1, CDR2 és/vagy CDR3 legalább egy meghatározott részletét; anti-duális-integrin ellenanyag vagy variábilis régió (például 7., 8. azonosítószámú szekvencia) kódoló szekvenciáját tartalmazó nukleinsav-molekulákat; és olyan nukleinsav-molekulákat, amelyek a fent bemutatottaktól lényegesen különböznek, de amelyek a genetikai kód degeneráltsága miatt még mindig legalább egy találmány szerinti és/vagy a szakterületen ismert anti-duális-integrin ellenanyagot kódolnak. Természetesen a genetikai kód jól ismert a szakterületen. Ily módón a szakember számára rutin lenne olyan degenerált nukleinsav-variánsokat előállítani, amelyek találmány szerinti specifikus antiduális-integrin ellenanyagokat kódolnak (lásd például Ausubel és mtsai., mint fent), és ilyen nukleinsav-variánsok a találmány tárgyát képezi.
Találmány szerinti nukleinsav-molekulák nem korlátozó példái közé tartoznak a 10., 11„ 12., 13., 14., 15. azonosítószámú szekvenciák, amelyek sorrendben a HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC variábilis régiókat és az LC variábilis régiót kódoló nem korlátozó nukleinsavaknak felelnek meg.
Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát izolált nukleinsav-molekulák képezik, amelyek olyan anti-duális-integrin ellenanyagot kódolnak, amelynek az aminosavszekvenciáját a néven és ATCC letéti számon, -án letétbe helyezett plazmidokban található nukleinsav kódolja.
-23 Amint a leírásban jelezzük, anti-duális-integrin ellenanyagot kódoló nukleinsavat tartalmazó találmány szerinti nukleinsav-molekulák nem korlátozó példái közé tartoznak azok, amelyek magának az ellenanyag-fragmensnek az aminosav-szekvenciáját kódolják; egy teljes ellenanyag vagy részletének a kódoló szekvenciáját, ellenanyag, fragmens vagy részlet, valamint további szekvenciák kódoló szekvenciáját kódolják, mint például legalább egy szignálszekvencia vagy fúziós fehérje kódoló szekvenciáját, a fent említett további szekvenciákkal vagy azok nélkül, mint például legalább egy intronnal, együtt további nem kódoló szekvenciákkal, nem korlátozó példaként beleértve átírt nem kódoló 5’ és 3’ szekvenciákat, azokat a nem kódoló szekvenciákat, amelyek szerepet játszanak a transzkripcióban, mRNS-feldolgozásban, beleértve a „splicing”-et és poliadenilációs szignálokat (például riboszóma-kötés és mRNS stabilitása); további aminosavakat kódoló további szekvenciát kódolnak, mint például amelyek további funkciókat biztosítanak. Ily módon egy ellenanyagot kódoló szekvenciát fuzionáltathatunk egy jelző szekvenciához, mint például olyan pepiidet kódoló szekvenciához, amely elősegíti az ellenanyag-fragmenst vagy részletet tartalmazó fuzionáltatott ellenanyag tisztítását.
Találmány szerinti polinukleotidhoz szelektíven hibridizáló polinukleotidok
A találmány tárgyát izolált nukleinsavak képezik, amelyek hibridizálnak szelektív hibridizációs körülmények között találmány szerinti polinukleotidhoz. Ily módon az ezen megvalósítási mód szerinti polinukleotidok alkalmazhatók ilyen polinukleotidokat tartalmazó nukleinsavak izolálására, detektálására és/vagy mennyiségi meghatározására. Például találmány szerinti polinukleotidok alkalmazhatók részleges vagy teljes hosszúságú kiónok azonosítására, izolálására vagy amplifikálására letétbe helyezett könyvtárban. Bizonyos megvalósítási módok szerint a polinukleotidok izolált, vagy humán vagy emlős nukleinsavkönyvtárból származó cDNS-sel másképpen komplementer genomiális szekvenciák vagy cDNS-szekvenciák.
Előnyösen a cDNS-könyvtár legalább 80% teljes hosszúságú szekvenciát, előnyösen legalább 85% vagy 90% teljes hosszúságú szekvenciát, és előnyösebben legalább 95% teljes hosszúságú szekvenciát tartalmaz. A cDNS-könyvtárat normalizálhatjuk, hogy növeljük a ritka szekvenciák reprezentációját. Tipikusan, de nem kizárólagosan alacsony vagy közepes sztringensségű hibridizációs körülményeket alkalmazunk olyan szekvenciákkal, amelyeknek csökkentett a szekvencia-azonossága komplementer szekvenciákhoz viszonyítva. Adott esetben közepes és magas sztringensségű körülményeket alkalmazhatunk nagyobb azonosságú szekvenciák esetében. Az alacsony sztringensségű körülmények lehetővé teszik ··.* L: f
-24körülbelül 70% szekvencia-azonosságú szekvenciák szelektív hibridizálását, és alkalmazhatók ortológ vagy paralóg szekvenciák azonosítására.
Adott esetben találmány szerinti polinukleotidok találmány szerinti polinukleotidok által kódolt ellenanyag legalább egy részletét kódolhatják. A találmány szerinti polinukleotidok olyan nukleinsav-szekvenciákat tartalmaznak, amelyek alkalmazhatók találmány szerinti ellenanyagot kódoló polinukleotidhoz való szelektív hibridizációra (lásd például Ausubel, mint fent; Colligan, mint fent, amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi).
Nukleinsavak előállítása
A találmány szerinti izolált nukleinsavakat (a) rekombináns eljárások, (b) szintetikus módszerek, (c) tisztítási módszerek, vagy azok kombinációjával állíthatjuk elő, amint az jól ismert a szakterületen.
A nukleinsavak kényelmesen tartalmazhatnak szekvenciákat a találmány szerinti polinukleotid mellett. Például egy vagy több endonukleáz restrikciós helyet tartalmazó többszörös klónozó helyet inzertálhatunk a nukleinsavba, hogy elősegítsük a polinukleotid izolálását. Ezenkívül transzlálható szekvenciákat inzertálhatunk a találmány szerinti transziáit polinukleotid izolálásának elősegítésére. Például egy hexa-hisztidin jelzőszekvencia kényelmes lehetőséget biztosít találmány szerinti fehérjék tisztítására. A találmány szerinti nukleinsav kódoló szekvenciája mellett megtalálható nukleinsav adott esetben egy vektor, adapter vagy kapcsolómolekula a találmány szerinti polinukleotid klónozására és/vagy expresszáltatására.
További szekvenciákat is alkalmazhatunk, mint például klónozó és/vagy expressziós szekvenciákat, hogy optimalizáljuk azok funkcióját a klónozásban és/vagy expresszáltatásban, hogy elősegítsük a polinukleotid izolálását, vagy hogy javítsuk a polinukleotidnak sejtbe történő bejuttatását. Klónozó vektorok, expressziós vektorok, adapterek és kapcsolómolekulák alkalmazása jól ismert a szakterületen (lásd például Ausubel, mint fent; vagy Sambrook, mint fent).
Rekombináns eljárások nukleinsavak előállítására
A találmány szerinti izolált nukleinsav-készítmények, mint például RNS, cDNS, genomiális DNS vagy azok bármilyen kombinációja előállítható biológiai forrásokból, a szakember számára ismert számos klónozási módszer alkalmazásával. Bizonyos megvalósítási módok szerint olyan oligonukleotid-próbákat alkalmazunk a kívánt szekvencia azonosítására cDNS- vagy genomiális könyvtárban, amelyek sztringens körülmények között szelektíven hibridizálnak a találmány szerinti polinukleotidokhoz. RNS izolálása és cDNS- és
- 25 genomiális könyvtárak készítése jól ismert a szakember számára (lásd például Ausubel, mint fent; vagy Sambrook, mint fent).
Nukleinsav szkrínelési és izolálási eljárások cDNS- vagy genomiális könyvtárat találmány szerinti polinukleotid szekvenciáján alapuló próbával szkrínelhetünk, mint például amilyeneket feltárunk a leírásban. Próbákat alkalmazhatunk genomiális DNS-sel vagy cDNS-szekvenciákkal történő hibridizálásra, hogy homológ géneket izoláljunk ugyanabban vagy különböző organizmusokban. A szakember számára nyilvánvaló, hogy különböző sztringensségű hibridizációt alkalmazhatunk a vizsgálati eljárásban, és vagy a hibridizációs, vagy a mosási közeg lehet sztringens. Ahogyan a hibridizációs körülmények sztringensebbé válnak, nagyobb mértékű komplementaritásnak kell lennie a próba és a célszekvencia között, hogy kialakuljon a duplex. A sztringensség mértékét a hőmérséklet, ionerősség, pH és részlegesen denaturáló oldószerek, mint például formamid közül egy vagy több alkalmazásával szabályozhatjuk. Például a hibridizáció sztringensségét kényelmesen változtathatjuk a reagensoldat polaritásának változtatásával, például a formamid koncentrációjának manipulálásával 0% és 50% közötti tartományban. A detektálható kötődéshez szükséges komplementaritás mértéke (szekvencia-azonosság) változhat a hibridizációs közeg és/vagy mosási közeg sztringensségének megfelelően. A komplementaritás mértéke optimális esetben 100%, vagy 70-100%, vagy bármely tartomány vagy érték azok között. Azonban nyilvánvaló, hogy a próba és a láncindítók kisebb szekvencia-variációit kompenzálhatjuk a hibridizációs közeg és/vagy mosási közeg sztringensségének csökkentésével.
RNS vagy DNS amplifikálására szolgáló eljárások jól ismertek a szakterületen, és alkalmazhatók a találmány szerint, indokolatlan kísérletezés nélkül, a leírás szerinti kitanítás és iránymutatás alapján.
Ismert DNS vagy RNS amplifikációs eljárások nem korlátozó példái közé tartozik a polimeráz-láncreakció (PCR) és azzal rokon amplifikációs eljárások [lásd például a 4 683 195., 4 683 202., 4 800 159., 4 965 188. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat (Mullis és mtsai.); a 4 795 699. és 4 921 794. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat (Tabor és mtsai.); az 5 142 033. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Innis); az 5 122 464. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Wilson és mtsai.); az 5 091 310. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Innis); az 5 066 584. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Gyllensten és mtsai.); a 4 889 818. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Gelfand és mtsai.); a 4 994 370. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot
- · ‘-C %* J
- 26 (Silver és mtsai.); a 4 766 067. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Biswas); a 4 656 134. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Ringold)] , és RNS-közvetített amplifíkáció, amely a célszekvencia elleni antiszensz RNS-t alkalmaz templátként a kétszálú DNS szintéziséhez [5 130 238. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (Malek és mtsai.), kereskedelmi neve NASBA], amely referenciák teljes tartalma hivatkozás útján a kitanítás részét képezi (lásd például Ausubel, mint fent; vagy Sambrook, mint fent).
Például polimeráz-láncreakció (PCR) technológiát alkalmazhatunk találmány szerinti polinukleotidok és rokon gének szekvenciáinak az amplifikálására közvetlenül genomiális DNS- vagy cDNS-könyvtárakból. A PCR és egyéb in vitro amplifikációs eljárások szintén hasznosak lehetnek például olyan nukleinsav-szekvenciák klónozására, amelyek expresszálandó fehérjéket kódolnak, kívánt mRNS mintában való jelenlétének detektálására szolgáló próbák készítésére, nukleinsav-szekvenálásra, vagy más célokra. Szakember számára az in vitro amplifikációs eljárások tekintetében elegendő útmutatást nyújtó módszerek példái találhatók az alábbi irodalmi helyeken: Berger, mint fent, Sambrook, mint fent, és Ausubel, mint fent, valamint Mullis és mtsai., 4 683 202. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (1987); és Innis és mtsai., ”PCR Protocols A Guide to Methods and Applications”, kiad.: Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Kereskedelmi forgalomban kapható reagenskészletek genomiális PCR amplifikációra ismertek a szakterületen [lásd például Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech)]. Ezenfelül például a T4 gene 32 fehérje (Boehringer Mannheim) alkalmazható a hosszú PCR-termékek kitermelésének javítására.
Szintetikus eljárások nukleinsavak előállítására
A találmány szerinti izolált nukleinsavakat előállíthatjuk közvetlen kémiai szintézissel is, ismert eljárások alkalmazásával (lásd például Ausubel, és mtsai., mint fent). A kémiai szintézis általában egyszálú oligonukleotid eredményez, amelyet átalakíthatunk kétszálú DNS-sé komplementer szállal történő hibridizálás útján, vagy DNS-polimerázzal történő polimerizációval, az egyszálú DNS-t templátként alkalmazva. Szakember számára nyilvánvaló, hogy míg a DNS kémiai szintézise korlátozott lehet körülbelül 100 vagy több bázis hosszúságú szekvenciákra, hosszabb szekvenciákat előállíthatunk rövidebb szekvenciák ligálásával.
Rekombináns expressziós kazetták
A találmány tárgyát képezik továbbá találmány szerinti nukleinsavat tartalmazó rekombináns expressziós kazetták. Találmány szerinti nukleinsavat, például találmány szerinti ellenanyagot kódoló cDNS-t vagy genomiális szekvenciát alkalmazhatunk olyan rekombináns
-27 expressziós kazetta előállítására, amelyet bejuttathatunk legalább egy kívánt gazdasejtbe. Egy rekombináns expressziós kazetta tipikusan találmány szerinti polinukleotidot tartalmazhat működőképesen kapcsolva transzkripciós iniciációs szabályozó szekvenciákhoz, amelyek irányíthatják a polinukleotid transzkripcióját a tervezett gazdasejtben. Mind heterológ, mind nem heterológ (azaz endogén) promótereket alkalmazhatunk találmány szerinti nukleinsavak expresszáltatásának irányítására.
Bizonyos megvalósítási módok szerint promóterként, enhancerként vagy más elemként szolgáló izolált nukleinsavakat juttathatunk be megfelelő pozícióban (leolvasással ellentétes irányban, leolvasással megegyező irányban vagy intronként) a találmány szerinti polinukleotid nem heterológ formájához képest, hogy serkentsük vagy gátoljuk találmány szerinti polinukleotid expresszióját. Például endogén promótereket módosíthatunk in vivo vagy in vitro, mutációval, delécióval és/vagy szubsztitúcióval.
Vektorok és gazdasejtek
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan vektorok is, amelyek találmány szerinti izolált nukleinsav-molekulákat tartalmaznak, gazdasejtek, amelyek génsebészeti úton módosítva vannak a rekombináns vektorokkal, és legalább egy anti-duális-integrin ellenanyag rekombináns módszerekkel történő előállítása, amint az jól ismert a szakterületen (lásd például Sambrook és mtsai., mint fent; Ausubel és mtsai., mint fent, amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi).
A polinukleotidokat adott esetben összekapcsolhatjuk egy szelektálható markert tartalmazó vektorral, gazdában való szaporítás céljából. Általában plazmidvektort csapadékban juttatunk be, mint például kalcium-foszfátos kicsapással, vagy töltött lipiddel alkotott komplexben. Ha a vektor egy vírus, azt in vitro csomagolhatjuk egy megfelelő csomagoló sejtvonal alkalmazásával, és azután transzdukálhatjuk gazdasejtekbe.
A DNS-inzertnek működőképesen kapcsolva kell lennie egy megfelelő promóterhez. Az expressziós konstrukciók továbbá tartalmazhatnak helyeket a transzkripció iniciálására, terminálására, és az átírt régióban egy riboszóma-kötő helyet a transzlációhoz. A konstrukciók által expresszált érett transzkriptumok kódoló részlete előnyösen tartalmazhat egy transzlációs iniciátort az elején, és egy terminációs kodont (például UAA, UGA vagy UAG) megfelelően elhelyezve a transzlálandó mRNS végénél, ahol az UAA és UAG előnyös emlős vagy eukarióta sejtes expresszió esetében.
Expressziós vektorok előnyösen - de csak opcionálisan - tartalmazhatnak legalább egy szelektálható markert. Ilyen markerek nem korlátozó példái közé tartozik a metotrexát (MTX), dihidrofolát-reduktáz (DHFR, 4 399 216.; 4 634 665.; 4 656 134.; 4 956 288.;
-285 149 636.; 5 179 017. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok), ampicillin, neomicin (G418), mikofenolsav vagy glutamin-szintetáz (GS, 5 122 464.; 5 770 359.; 5 827 739. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok) rezisztencia eukarióta sejttenyészet esetén, és tetraciklin vagy ampicillin rezisztenciagén E. coh-bm^ vagy más baktériumokban vagy prokariótákban történő klónozás esetén (a fenti szabadalmak teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik). Megfelelő tenyésztő tápközegek és körülmények ismertek a szakterületen a fent ismertetett gazdasejtek számára. Alkalmas vektorok nyilvánvalóak a szakember számára. Vektorkonstrukció gazdasejtbe történő bejuttatását kalcium-foszfátos transzfekcióval, DEAE-dextrán-közvetített transzfekcióval, kationos lipid által közvetített transzfekcióval, elektroporációval, transzdukcióval, fertőzéssel vagy más eljárásokkal hajthatjuk végre. Ilyen eljárásokat leírtak a szakirodalomban, mint például Sambrook, mint fent, 1-4. és 16-18. fejezet; Ausubel, mint fent, 1., 9., 13., 15. és 16. fejezet.
Legalább egy találmány szerinti ellenanyagot expresszáltathatunk módosított formában, mint például fúziós fehérjeként, és nemcsak szekréciós szignálokat alkalmazhatunk, hanem további heterológ funkcionális régiókat is. Például további aminosavak, különösen töltött aminosavak egy szakaszát adhatjuk egy ellenanyag Nterminálisához, hogy javítsuk a stabilitását és megmaradását a gazdasejtben, a tisztítás folyamán vagy az azt követő kezelés és tárolás folyamán. Ezenkívül peptid-molekularészeket is hozzáadhatunk a találmány szerinti ellenanyaghoz, hogy elősegítsük a tisztítását. Az ilyen régiókat eltávolíthatjuk az ellenanyagnak, vagy legalább annak egy fragmensének végső elkészítését megelőzően. Ilyen eljárásokat sok standard laboratóriumi kézikönyvben ismertettek, mint például Sambrook, mint fent, 17.29-17.42. és 18.1-18.74. fejezet; Ausubel, mint fent, 16., 17. és 18. fejezet.
Az átlagos tudású szakember járatos a találmány szerinti fehérjét kódoló nukleinsav expresszáltatására beszerezhető számos expressziós rendszerben. Más megoldásképpen találmány szerinti nukleinsavakat expresszáltathatunk gazdasejtben, találmány szerinti ellenanyagot kódoló endogén DNS-t tartalmazó gazdasejt (manipuláció útján történő) bekapcsolásával. Ilyen eljárások jól ismertek a szakterületen, mint például az 5 580 734., 5 641 670., 5 733 746. és 5 733 761. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok feltárása, amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.
Az ellenanyagok, meghatározott részeik vagy variánsaik termeltetésére alkalmas szemléltető sejttenyészetek az emlőssejtek. Az emlőssejtes rendszerek gyakran sejtek egysejtes rétegének formájában lehetnek, habár emlőssejt-szuszpenziók vagy bioreaktorok is
-29alkalmazhatók. Számos, intakt glikozilált fehérjék expresszálására képes megfelelő gazdasejtvonalat kifejlesztettek a szakterületen, mint például a COS-1 (például ATCC CRL-1650), COS-7 (például ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (például ATCC CRL-10), CHO (például ATCC CRL-1610) és BSC-1 (például ATCC CRL-26) sejtvonalakat, Cos-7 sejteket, CHO sejteket, hep G2 sejteket, P3X63Ag8.653, SP2/0-Agl4, 293 sejteket, HeLa sejteket és hasonlókat, amelyek könnyen beszerezhetők például az ’American Type Culture Collection’tól (Manassas, Va, www.atcc.org). Előnyös gazdasejtek közé tartoznak a nyirokeredetű sejtek, mint például mielóma és limfóma sejtek. Különösen előnyös gazdasejtek a P3X63Ag8.653 sejtek (ATCC CRL-1580) és SP2/0-Agl4 sejtek (ATCC CRL-1851). Egy különösen előnyös megvalósítási mód szerint a rekombináns sejt P3X63Ab8.653 vagy SP2/0-Agl4 sejt.
Az ezekben a sejtekben alkalmazható expressziós vektorok tartalmazhatnak az alábbi nem korlátozó példaként szolgáló expressziós szabályozó szekvenciák közül egyet vagy többet: replikációs origó, promoter [például a késői vagy korai SV40 promoter, az CMV promoter (5 168 062.; 5 385 839. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok), HSV tk promoter, pgk (foszfoglicerát-kináz) promoter, EF-1 alfa promoter (5 266 491. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat), legalább egy humán immunglobulin promoter]; enhancer és/vagy feldolgozási információs hely, mint például riboszóma-kötő hely, RNS ’splicing’ hely, poliadenilációs hely (például SV40 nagy T antigén poli-A addíciós hely), és transzkripciós terminátor szekvenciák (lásd például Ausubel, és mtsai., mint fent; Sambrook és mtsai., mint fent). Találmány szerinti nukleinsavak vagy fehérjék előállítására alkalmas egyéb sejtek ismertek és/vagy beszerezhetők például az ’American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas’-tól (www.atcc.org) vagy más ismert vagy kereskedelmi forrásokból.
Amikor eukarióta gazdasejteket alkalmazunk, tipikusan poliadenilációs vagy transzkripciós terminátor szekvenciákat építünk be a vektorba. Terminátor szekvencia egy példája a szarvasmarha növekedési hormon génjéből származó poliadenilációs szekvencia. Szintén alkalmazhatunk a transzkriptum pontos „splicing”-]éré szolgáló szekvenciákat is. ’Splicing” szekvencia egy példája az SV40-ből származó VP1 intron [Sprague, és mtsai., J. Virol. 45, 773-781. old. (1983)]. Ezenkívül a gazdasejtben történő replikáció szabályozására szolgáló génszekvenciákat is beépíthetünk a vektorba, amint az ismert a szakterületen.
Ellenanyag tisztítása
Anti-duális-integrin ellenanyagot jól ismert eljárások alkalmazásával nyerhetünk vissza és tisztíthatunk rekombináns sejttenyészetekből, nem korlátozó példaként protein-A tisztítással, ammónium-szulfátos vagy etanolos kicsapással, savas extrakcióval, anion- vagy
-30kationcserélő kromatográfiával, foszfocellulóz kromatográfiával, hidrofób kölcsönhatási kromatográfiával, affinitási kromatográfiával, hidroxilapatit kromatográfiával és lektin kromatográfiával. Nagyteljesítményű folyadékkromatográfiát („HPLC”) is alkalmazhatunk a tisztításra [lásd például Colligan, „Current Protocols in Immunology”, vagy „Current Protocols in Protein Science”, kiad.: John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001), például az 1., 4., 6., 8., 9., 10. fejezet, amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi],
A találmány szerinti ellenanyagok lehetnek természetes úton tisztított termékek, kémiai szintézis eljárások termékei, és rekombináns módszerekkel eukarióta gazdából, többek között például élesztő, magasabbrendű növényi, rovar és emlős sejtekből előállított termékek. A rekombináns tenyésztési előállítási eljárásban alkalmazott gazdától függően a találmány szerinti ellenanyag lehet glikozilált vagy lehet glikozilálatlan, ahol a glikozilált előnyös. Ilyen eljárásokat leírtak sok standard laboratóriumi kézikönyvben, mint például Sambrook, mint fent, 17.37-17.42. szakaszok; Ausubel, mint fent, 10., 12., 13., 16., 18. és 20. szakaszok, Colligan, „Protein Science”, mint fent, 12-14. szakaszok, amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.
Anti-duális-integrin ellenanyagok
A találmány szerinti izolált ellenanyagok a leírásban feltárt ellenanyag aminosavszekvenciát tartalmaznak, amelyet bármilyen alkalmas polinukleotid kódol, vagy bármilyen izolált vagy előállított ellenanyagot. Előnyösen a humán ellenanyag vagy antigén-kötő fragmens humán duális integrint köt, és ezáltal részlegesen vagy lényegében semlegesíti a fehérje legalább egy biológiai aktivitását. Ellenanyag vagy annak meghatározott részlete vagy variánsa, amely részlegesen vagy előnyösen lényegében semlegesíti legalább egy duális integrin fehérje vagy fragmens legalább egy aktivitását, kötheti a fehérjét vagy fragmenst, és ezáltal gátolhatja a duális integrinnek az duális-integrin-receptorhoz való kötődésén vagy más duális integrintől függő vagy azáltal közvetített mechanizmuson keresztül történő aktivitását. A leírás szerinti értelemben „semlegesítő ellenanyag” alatt olyan ellenanyagot értünk, amely képes gátolni egy duális-integrin-függő aktivitást körülbelül 20-120%-kal, előnyösen legalább körülbelül 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 0,94, 96, 97, 98, 99, 100%-kal vagy jobban, a vizsgálati eljárástól függően. Egy anti-duális-integrin ellenanyag képességét duális-integrin-függő aktivitás gátlására előnyösen legalább egy alkalmas duálisintegrin-fehérje vagy -receptor vizsgálati eljárással állapítjuk meg, amint azt a leírásban feltárjuk és/vagy ismert a szakterületen. Találmány szerinti humán ellenanyag bármilyen osztályba (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, stb.) vagy izotípusba tartozhat, és tartalmazhat kappa
-31 vagy lambda könnyüláncot. Egy megvalósítási mód szerint a humán ellenanyag IgG nehézláncot vagy meghatározott fragmenst tartalmaz, például az IgGl, IgG2, IgG3 vagy IgG4 izotípusok legalább egyikét. Ilyen típusú ellenanyagokat transzgenikus egerek vagy más transzgenikus nem humán emlősök alkalmazásával állíthatunk elő, amelyek legalább egy humán könnyűlánc [például IgG, IgA és IgM (például γί, γ2, γ3, γ4)] transzgént tartalmaznak, amint azt a leírásban feltárjuk és/vagy ismert a szakterületen. Egy másik megvalósítási mód szerint az anti-humán-duális-integrin ellenanyag IgGl nehézláncot és IgGl könnyűláncot tartalmaz.
Legalább egy találmány szerinti ellenanyag kötődik legalább egy meghatározott epitóphoz, amely specifikus legalább egy duális integrin fehérjére, alegységre, fragmensre, részletre vagy azok bármilyen kombinációjára. A legalább egy epitóp legalább egy ellenanyag-kötő régiót tartalmazhat, amely a fehérje legalább egy olyan részletét tartalmazza, amely epitóp előnyösen a fehérje legalább egy extracelluláris, oldható, hidrofil, külső vagy citoplazmatikus részletét tartalmazza. A legalább egy meghatározott epitóp a 9., 16. vagy 17. azonosítószámú szekvencia összefüggő aminosavainak teljes meghatározott részletének legalább egy 1-3 aminosav hosszúságú legalább egy aminosav-szekvenciájának bármilyen kombinációját tartalmazhatja.
Általában a találmány szerinti humán ellenanyag vagy antigén-kötő fragmens olyan antigén-kötő régiót tartalmazhat, amely legalább egy humán komplementaritást meghatározó régiót (CDR1, CDR2 vagy CDR3), vagy legalább egy nehézlánc variábilis régió variánsát és legalább egy humán komplementaritást meghatározó régiót (CDR1, CDR2 vagy CDR3), vagy legalább egy könnyűlánc variábilis régió variánsát tartalmazhatja. Nem korlátozó példaként az ellenanyag vagy antigén-kötő részlet vagy variáns tartalmazhat legalább egy 3. azonosítószámú szekvencia szerinti nehézlánc CDR3-at és/vagy 6. azonosítószámú szekvencia szerinti könnyűlánc CDR3-at. Egy előnyös megvalósítási mód szerint az ellenanyag vagy antigén-kötő fragmens tartalmazhat egy olyan antigén-kötő régiót, amely legalább egy, a megfelelő 1., 2. és/vagy 3. CDR (például 1., 2. és/vagy 3. azonosítószámú szekvencia) aminosav-szekvenciájával rendelkező nehézlánc CDR (azaz CDR1, CDR2 és/vagy CDR3) legalább egy részletét tartalmazza. Egy másik előnyös megvalósítási mód szerint az ellenanyag vagy antigén-kötő részlet vagy variáns tartalmazhat egy olyan antigénkötő régiót, amely legalább egy, a megfelelő 1., 2. és/vagy 3. CDR (például 4., 5. és/vagy 6. azonosítószámú szekvencia) aminosav-szekvenciájával rendelkező könnyűlánc CDR (azaz CDR1, CDR2 és/vagy CDR3) legalább egy részletét tartalmazza. Egy előnyös megvalósítási mód szerint az ellenanyag vagy antigén-kötő fragmens három nehézlánc CDR-jének és a
-32három könnyűlánc CDR-jének az aminosav-szekvenciája a leírásban feltárt GenO95, GenOlOl, CNTO95, C372A monoklonális ellenanyagok legalább egyikének a megfelelő CDR aminosav-szekvenciája. Ilyen ellenanyagokat előállíthatunk az ellenanyag különböző részleteinek (például CDR, vázrégió) kémiai összekapcsolásával, hagyományos módszerek alkalmazásával, az ellenanyagot kódoló (egy vagy több) nukleinsav-molekula előállításával és expresszáltatásával, rekombináns DNS technológia hagyományos módszereinek alkalmazásával, vagy bármely más alkalmas eljárás alkalmazásával.
Az anti-duális-integrin ellenanyag legalább egy, meghatározott aminosavszekvenciájú nehéz vagy könnyűlánc variábilis régiót tartalmazhat. Például egy előnyös megvalósítási mód szerint az anti-duális-integrin ellenanyag legalább egy nehézlánc variábilis régió — amelynek adott esetben a 7. azonosító számú szekvencia szerinti a szekvenciája — és/vagy legalább egy könnyülánc variábilis régió — amelynek adott esetben a 8. azonosítószámú szekvencia szerinti a szekvenciája — legalább egyikét tartalmazza. Humán duális integrinhez kötődő ellenanyagok, amelyek meghatározott nehéz és könnyűlánc variábilis régiót tartalmaznak, alkalmas eljárások alkalmazásával állíthatók elő, mint például fágprezentációval [Katsube, Y. és mtsai., Int. J. Mol. Med. 1, 863-868. old. (1998)] vagy transzgenikus állatokat alkalmazó eljárásokkal, amint az ismert a szakterületen és/vagy feltárjuk a leírásban. Például funkcionálisan átrendeződött humán immunglobulin nehézlánc transzgént, és funkcionális átrendeződésre képes humán immunglobulin könnyűlánc lókuszról származó DNS-t tartalmazó transzgént tartalmazó transzgenikus egeret immunizálhatunk humán duális integrinnel vagy annak fragmensével, hogy ellenanyagok termelését váltsuk ki. Kívánt esetben az ellenanyag-termelő sejteket izolálhatjuk és hibridómákat vagy más immortalizált ellenanyag-termelő sejteket állíthatunk elő, amint azt a leírásban feltárjuk és/vagy ismert a szakterületen. Más megoldásképpen az ellenanyagot, meghatározott részletet vagy variánst alkalmas gazdasejtben expresszáltathatjuk a kódoló nukleinsavnak vagy részletének alkalmazásával.
A találmány tárgyát képezik olyan ellenanyagok, antigén-kötő fragmensek, immunglobulin-láncok és CDR-ek is, amelyek a találmány szerint feltárt aminosavszekvenciával lényegében megegyező aminosav-szekvenciát tartalmaznak. Előnyösen az ilyen ellenanyagok vagy antigén-kötő fragmensek és ilyen láncokat vagy CDR-eket tartalmazó ellenanyagok magas affinitással képesek kötni a humán duális integrint (például körülbelül 109 M vagy kisebb Ko-vel). A találmány szerinti szekvenciákkal lényegében megegyező aminosav-szekvenciák közé tartoznak konzervatív aminosav-szubsztitúciókat, valamint aminosav-deléciókat és/vagy -inzerciókat tartalmazó szekvenciák. Konzervatív
-33 aminosav-szubsztitúció alatt egy első aminosavnak egy másodikkal történő helyettesítését értjük, amelynek a kémiai és/vagy fizikai tulajdonságai (például töltése, szerkezete, polaritása, hidrofobitása/hidrofilitása) hasonlóak az első aminosavéihoz. Konzervatív szubsztitúciók közé tartozik egy aminosav helyettesítése egy másikkal az alábbi csoportokon belül: lizin (K), 5 arginin (R) és hisztidin (H); aszparaginsav (D) és glutaminsav (E); aszparagin (N), glutamin (Q), szerin (S), treonin (T), tirozin (Y), K, R, H, D és E; alanin (A), valin (V), leucin (L), izoleucin (I), prolin (P), fenilalanin (F), triptofán (W), metionin (M), cisztein (C) és glicin (G); F, W és Y; C, S és T.
Aminosav kódok
A találmány szerinti anti-duális-integrin ellenanyagokat felépítő aminosavakat gyakran rövidítik. Az aminosavak neveit jelezhetjük az aminosavak egybetűs kódjaival, hárombetűs kódjaival, vagy három nukleotidot tartalmazó kodonnal történő megnevezésével, amint az közismert a szakterületen [lásd Alberts, B. és mtsai., „Molecular Biology of The Cell”, 3. kiadás, kiad.: Garland Publishing, Inc., New York, (1994)]:
Egybetűs kód Hárombetűs kód Név Hármas nukleotid kodon(ok)
A Alá Alanin GCA, GCC, GCG, GCU
C Cys Cisztein UGC, UGU
D Asp Aszparaginsav GAC, GAU
E Glu Glutaminsav GAA, GAG
F Phe Fenilanin uuc, uuu
G Gly Glicin GGA, GGC, GGG, GGU
H His Hisztidin CAC, CAU
I He Izoleucin AU A, AUC, AUU
K Lys Lizin AAA, AAG
L Leu Leucin UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU
M Met Metionin AUG
N Asn Aszparagin AAC, AAU
P Pro Prolin CCA, CCC, CCG, CCU
Q Gin Glutamin CAA, CAG
R Arg Arginin AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU
s Ser Szerin AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU
T Thr Treonin ACA, ACC, ACG, ACU
V Val Valin GUA, GUC, GUG, GUU
w Trp Triptofán UGG
Y Tyr Tirozin UAC, UAU
Találmány szerinti anti-duális-integrin ellenanyag tartalmazhat egy vagy több aminosav-szubsztitúciót, deléciót vagy addíciót, akár természetes mutáció, akár emberi 5 manipuláció eredményeképpen, amint a leírásban feltárjuk.
Természetesen azon aminosav-szubsztitúciók száma, amit a szakember végezne, sok tényezőtől függ, beleértve a fent leírtakat. Általánosságban, az aminosav-szubsztitúciók, inzerciók vagy deléciók száma bármely adott anti-duális-integrin ellenanyag esetében nem több, mint 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, mint 10 például 1-30, vagy bármely tartomány vagy érték azok között, amint a leírásban meghatározzuk.
-35Találmány szerinti anti-duális-integrin ellenanyag funkció szerint esszenciális aminosavait azonosíthatjuk a szakterületen ismert eljárások alkalmazásával, mint például helyspecifikus mutagenezissel vagy alanin-pásztázó mutagenezissel [például Ausubel, mint fent, 8., 15. fejezet; Cunningham és Wells, Science 244, 1081-1085. old. (1989)]. Az utóbbi 5 eljárás egyedi alanin mutációkat épít be a molekula minden egyes oldallánca helyett. A kapott mutáns molekulákat azután teszteljük biológiai aktivitásra, mint például nem korlátozó példaként legalább egy duális integrint semlegesítő aktivitásra. Az ellenanyag-kötés szempontjából kritikus helyeket azonosíthatjuk szerkezeti elemzéssel is, mint például kristályosítással, magmágneses rezonanciával vagy fotoaffinitási jelöléssel [Smith és mtsai., J.
Mól. Bioi. 224, 899-904. old. (1992) és de Vos és mtsai., Science 255, 306-312. old. (1992)].
Találmány szerinti anti-duális-integrin ellenanyag tartalmazhatja - de nem kizárólag az 1., 2., 3., 4., 5., 6. azonosítószámú szekvenciák legalább egyikének 5-től az összes összefüggő aminosavának számáig terjedő számú legalább egy részletét, szekvenciáját vagy kombinációját.
Anti-duális-integrin ellenanyag továbbá tartalmazhat adott esetben a 7. vagy 8.
azonosítószámú szekvenciák legalább egyikének összefüggő aminosavainak legalább 70100%-át tartalmazó polipeptidet.
Egy megvalósítási mód szerint immunglobulin lánc vagy részlete (például variábilis régió, CDR) aminosav-szekvenciája körülbelül 70-100%-ban (például 70, 71, 72, 73, 74, 75, 20 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99,
100%, vagy bármely tartomány vagy érték ezek között) azonos a 7. vagy 8. azonosítószámú szekvenciák legalább egyike megfelelő láncának aminosav-szekvenciájával. Például egy könnyűlánc variábilis régió aminosav-szekvenciáját összehasonlíthatjuk a 8. azonosítószámú szekvenciával, vagy egy nehézlánc CDR3 aminosav-szekvenciáját összehasonlíthatjuk a 7.
azonosítószámú szekvenciával. Előnyösen a 70-100% aminosav-azonosságot (azaz 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, vagy bármely tartományt vagy értéket ezek között) alkalmas számítógépi algoritmus alkalmazásával határozhatjuk meg, amint az ismert a szakterületen.
Szemléltető nehézlánc és könnyűlánc variábilis régió szekvenciákat mutatunk be a 7.
és 8. azonosítószámú szekvenciákon. A találmány szerinti ellenanyagok vagy azok 30 meghatározott variánsai tartalmazhatnak bármilyen számú összefüggő aminosav-oldalláncot egy találmány szerinti ellenanyagból, ahol ez a szám egy anti-duális-integrin ellenanyag összefüggő oldalláncai számának 10-100%-a közötti egész számok bármelyike. Adott esetben az összefüggő aminosavak ezen szubszekvenciája legalább körülbelül 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250
-36vagy több aminosav hosszúságú, vagy bármely tartomány vagy érték ezek között. Ezenkívül az ilyen szubszekvenciák száma lehet bármilyen egész szám az 1 és 20 között, mint például legalább 2, 3, 4 vagy 5.
Amint a szakember számára nyilvánvaló, a találmány tárgya legalább egy, találmány szerinti, biológiailag aktív ellenanyag. A biológiailag aktív ellenanyagoknak az aktivitása legalább 20%-a, 30%-a vagy 40%-a, és előnyösen legalább 50%-a, 60%-a vagy 70%-a, és legelőnyösebben legalább 80%-a, 90%-a vagy 95%-1000%-a a natív (nem szintetikus), endogén vagy rokon és ismert formának. Enzimatikus aktivitás és szubsztrát-specifítás mérésére és mennyiségi meghatározására szolgáló eljárások jól ismertek a szakember számára.
Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát humán ellenanyagok és antigén-kötő fragmensek képezik, amint azokat a leírásban feltárjuk, amelyek egy szerves molekularész kovalens kapcsolásával módosítva vannak. Az ilyen módosítások olyan ellenanyagot vagy antigén-kötő fragmenst eredményezhetnek, amelynek javítottak a farmakokinetikai paraméterei (például megnövekedett in vivo szérum-féléletidő). A szerves molekularész lehet lineáris vagy elágazó hidrofil polimer-csoport, zsírsav-csoport vagy zsírsav-észter-csoport. Előnyös megvalósítási módok szerint a hidrofil polimer-csoportnak a molekulatömege körülbelül 800 és körülbelül 120000 Dalton között lehet, és az polialkánglikol [például polietilén-glikol (PEG), polipropilén-glikol (PPG)], szénhidrát polimer, aminosav polimer vagy polivinil-pirrolidon lehet, és a zsírsav vagy zsírsav-észter csoport körülbelül 8 és körülbelül 40 közötti számú szénatomot tartalmazhat.
A találmány szerinti módosított ellenanyagok és antigén-kötő fragmensek tartalmazhatnak egy vagy több szerves molekularészt, amely kovalensen kötődik az ellenanyaghoz, akár közvetlenül, akár közvetetten. A találmány szerinti ellenanyaghoz vagy antigén-kötő fragmenshez kötött minden egyes szerves molekularész egymástól függetlenül lehet hidrofil polimer-csoport, zsírsav-csoport vagy zsírsav-észter-csoport. A leírás szerinti értelemben a „zsírsav” kifejezés alatt monokarboxil-savakat és dikarboxil-savakat értünk. A leírás szerinti értelemben „hidrofil polimer-csoport” kifejezés alatt olyan szerves polimert értünk, amely jobban oldódik vízben, mint oktánban. Például a polilizin jobban oldódik vízben, mint oktánban. Ily módon polilizin kovalens kapcsolásával módosított ellenanyag a találmány tárgykörébe tartozik. A találmány szerinti ellenanyagok módosítására alkalmas hidrofil polimerek lehetnek lineárisak vagy elágazóak, mint például polialkán-glikolok [például PEG, monometoxi-polietilén-glikol (mPEG), PPG és hasonlók], szénhidrátok (például dextrán, cellulóz, oligoszacharidok, poliszacharidok és hasonlók), hidrofil
- 37 aminosavak polimerjei (például polilizin, poliarginin, poliaszpartát és hasonlók), polialkánoxidok (például polietilén-oxid, poliprolilén-oxid és hasonlók) és polivinil-pirrolidon. Előnyösen a találmány szerinti ellenanyagot módosító hidrofil polimer molekulatömege körülbelül 800 és körülbelül 150000 Dalton között van különálló molekuláris entitásként. Például PEG5000 és PEG20000 alkalmazható, ahol az alsó index a polimer Daltonban mért átlagos molekulatömege. A hidrofil polimer-csoport szubsztituálva lehet körülbelül 1-6 alkil-, zsírsav- vagy zsírsav-észter-csoporttal. Zsírsav- vagy zsírsav-észter-csoporttal szubsztituált hidrofil polimereket megfelelő eljárások alkalmazásával állíthatunk elő. Például amincsoportot tartalmazó polimert kapcsolhatunk a zsírsav vagy zsírsav-észter karboxilcsoportjához, és zsírsav vagy zsírsav-észter aktivált (például N,N-karbonil-diimidazollal aktivált) karboxilját kapcsolhatjuk a polimer hidroxil-csoportjához.
Találmány szerinti ellenanyagok módosítására alkalmas zsírsavak és zsírsav-észterek lehetnek telítettek, vagy tartalmazhatnak egy vagy több telítetlen kötést. Találmány szerinti ellenanyagok módosítására alkalmas zsírsavak például az alábbiak: n-dodekanoát (C12, laurát), n-tetradekanoát (C14, mirisztát), n-oktadekanoát (Cis, sztearát), n-eikozanoát (C20, arachidát) n-dokozanoát (C22, behenát), n-triakontanoát (C30), n-tetrakontanoát (C40), cisz-A9oktadekanoát (Cis, oleát), összes cisz-A5,8,ll,14-eikozatetraenoát (620, arachidonát), oktándionsav, tetradekándionsav, oktadekándionsav, dokozándionsav, és hasonlók. Alkalmas zsírsav-észterek közé tartoznak dikarboxilsavak olyan monoészterei, amelyek lineáris vagy elágazó, kisebb szénatomszámú alkil-csoportot tartalmaznak. A kisebb szénatomszámú alkilcsoport tartalmazhat körülbelül 1-12, előnyösen körülbelül 1-6 szénatomot.
A módosított humán ellenanyagokat és antigén-kötő fragmenseket alkalmas eljárások alkalmazásával állíthatjuk elő, mint például egy vagy több módosító reagenssel történő reagáltatással. A leírás szerinti értelemben „módosító ágens” kifejezés alatt alkalmas szerves csoportot (például hidrofil polimert, zsírsavat, zsírsav-észter) értünk, amely aktiváló csoportot tartalmaz. Az „aktiváló csoport” olyan kémiai molekularész vagy funkciós csoport, amely — megfelelő körülmények között — képes reagálni egy második kémiai csoporttal, és ezáltal kovalens kötést kialakítani a módosító ágens és a második kémiai csoport között. Például amin-reaktív aktiváló csoportok közé tartoznak elektrofil csoportok, mint például a tozilát, mezilát, halo (kloro, bromo, fluoro, jodo), N-hidroxiszukcinimidil-észterek (NHS) és hasonlók. Tiolokkal reagáló aktiváló csoportok közé tartozik például a maleimid, jodoacetil, akriloil, piridil-diszulfidok, 5-tiol-2-nitrobenzoesav-tiol (TNB-tiol), és hasonlók. Aldehid funkciós csoportot kapcsolhatunk amint vagy hidrazidot tartalmazó molekulákhoz, és azidcsoport reagáltatható trivalens foszfor-csoporttal, foszforamidát vagy foszforimid kötéseket
- 38 kialakítva. Megfelelő eljárások aktiváló csoportok molekulákba történő beépítésére ismertek a szakterületen [lásd például Hermanson, G. T., „Bioconjugate Techniques.”, kiad.: Academic Press: San Diego, CA (1996)]. Aktiváló csoport köthető közvetlenül a szerves csoporthoz (például hidrofil polimerhez, zsírsavhoz vagy zsírsav-észterhez), vagy kapcsolómolekulán keresztül, például divalens Ci-Ci2 csoporton keresztül, amelyben egy vagy több szénatom helyettesíthető heteroatommal, mint például oxigénnel, nitrogénnel vagy kénnel. Megfelelő kapcsolómolekulák közé tartozik például a tetraetilén-glikol, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- és -CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-. Kapcsolómolekulát tartalmazó módosító ágenseket előállíthatunk például mono-Boc-alkildiamin (például mono-Bocetiléndiamin, mono-Boc-diaminohexán) zsírsavval történő reagáltatásával l-etil-3-(3dimetilaminopropil)-karbodiimid (EDC) jelenlétében, amid-kötést kialakítva a szabad amin és a zsírsav karboxilja között. A Boc védőcsoportot eltávolíthatjuk a termékről trifluorecetsavval (TFA), szabaddá téve a primer amint, amely kapcsolható egy másik karboxilhoz, amint feltártuk, vagy reagáltatható maleinsav-anhidriddel, és a kapott terméket ciklizálhatjuk, a zsírsav aktivált maleimido-származékát előállítva (lásd például Thompson és mtsai., WO 92/16221. számú nemzetközi közzétételi irat, amelynek kitanítása teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi],
A találmány szerinti módosított ellenanyagokat előállíthatjuk humán ellenanyagnak vagy antigén-kötő fragmensnek módosító ágenssel történő reagáltatásával. Például a szerves molekularészeket köthetjük az ellenanyaghoz nem specifikus módon, amin-reaktív módosító ágens alkalmazásával, például PEG NHS-észterével. Módosított humán ellenanyagokat vagy antigén-kötő fragmenseket előállíthatunk ellenanyag vagy antigén-kötő fragmens diszulfidkötéseinek (például láncon belüli diszulfid-kötéseinek) redukálásával. A redukált ellenanyagot vagy antigén-kötő fragmenst azután reagáltathatjuk tiol-reaktív módosító ágenssel, találmány szerinti módosított ellenanyagot előállítva. Találmány szerinti ellenanyag specifikus helyeihez kötött szerves molekularészt tartalmazó módosított humán ellenanyagokat és antigén-kötő fragmenseket előállíthatunk megfelelő eljárások alkalmazásával, mint például reverz proteolízissel [Fisch és mtsai., Bioconjugate Chem. 3, 147-153. old. (1992); Werlen és mtsai., Bioconjugate Chem. 5, 411-417. old. (1994); Kumaran és mtsai., Protein Sci. 6, 2233-2241. old. (1997); Itoh és mtsai., Bioorg. Chem. 24, 59-68. old. (1996); Capellas és mtsai., Biotechnoi. Bioeng. 56, 456-463. old. (1997)] és a Hermanson, G. T. által leírt eljárásokkal [„Bioconjugate Techniques.”, kiad.: Academic Press: San Diego, CA(1996)].
Anti-duális-integrin ellenanyag-készítmények elleni anti-idiotípus ellenanyagok
-39Monoklonális és kiméra anti-duális-integrin ellenanyagok mellett a találmány tárgyát képezi ilyen találmány szerinti ellenanyagokra specifikus anti-idiotípus ellenanyag. Egy antiidiotípus ellenanyag olyan ellenanyag, amely általában egy másik ellenanyag antigén-kötő régiójával kapcsolatos egyedi determinánsokat ismer fel. Az anti-idiotípust forrásként az ellenanyaggal vagy annak CDR-t tartalmazó régiójával azonos fajba tartozó és genetikai típusú állat (például egértörzs) immunizálásával állíthatjuk elő. Az immunizált állat felismeri és válaszol az immunnizáló ellenanyag idiotipikus determinánsaira, és anti-idiotípus ellenanyagot termel. Az anti-idiotípus ellenanyag alkalmazható „immunogénként” is egy másik állatban történő immunválasz indukálására, úgynevezett anti-anti-idiotípus ellenanyagot termelve.
Anti-duális-integrin ellenanyag-készítmények
A találmány tárgyát képezi legalább egy anti-duális-integrin ellenanyag készítmény is, amely legalább egy, legalább kettő, legalább három, legalább négy, legalább öt, legalább hat vagy több találmány szerinti anti-duális-integrin ellenanyagot tartalmaz, amint azt a leírásban feltárjuk és/vagy ismert a szakterületen, és amelyek természetben nem előforduló készítményben, keverékben vagy formában vannak. Az ilyen készítmények természetben nem előforduló készítmények, amelyek az 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. vagy 8. azonosítószámú szekvencia vagy annak meghatározott fragmensei, doménjai vagy variánsai összefüggő aminosavai 70-100%-a bármelyike szerinti anti-duális-integrin ellenanyag aminosavszekvencia legalább egy vagy kettő, teljes hosszúságú, C- és/vagy N-terminális deléciós variánsát, doménját, fragmensét vagy meghatározott variánsát tartalmazzák. Előnyös antiduális-integrin ellenanyag készítmények tartalmaznak legalább egy vagy kettő teljes hosszúságú CDR-t vagy LBR-t, fragmenst, domént vagy variánst, amelyek az 1., 2., 3., 4., 5. vagy 6. azonosító számú szekvencia, annak meghatározott fragmensei, doménjai vagy variánsai összefüggő aminosavai 70-100%-a bármelyike szerinti anti-duális-integrin ellenanyag aminosav-szekvencia részletet tartalmaznak. További előnyös készítmények az 1., 2., 3., 4., 5. vagy 6. azonosítószámú szekvencia vagy annak meghatározott fragmensei, doménjai vagy variánsai 70-100%-a legalább egyikének 40-99%-át tartalmazzák. Az ilyen százalékokat folyékony vagy szilárd oldatok, keverékek, szuszpenziók, emulziók vagy kolloidok tömege, térfogata, koncentrációja, molaritása vagy molalitása alapján számítjuk, amint az ismert a szakterületen vagy a leírásban feltárjuk.
Találmány szerinti ellenanyag készítmények továbbá tartalmazhatják legalább egy olyan készítmény vagy gyógyászati készítmény alkalmas és hatásos mennyiségét, amely legalább egy anti-duális-integrin ellenanyagot tartalmaz ilyen modulálást, kezelést vagy
-40terápiát igénylő sejt, szövet, szerv, állat vagy páciens számára, és adott esetben továbbá tartalmaz legalább egyet az alábbiak közül: duális integrin antagonista (például nem korlátozó példaként duális integrin ellenanyag vagy fragmens, oldható duális-integrin-receptor vagy fragmens, azok fúziós fehérjéje vagy kismolekulás duális integrin antagonista), antireumatikum (például metotrexát, auranofin, aurotioglükóz, azatioprin, etanercept, aranynátrium-tiomalát, hidroxikloroquin-szulfát, leflunomid, szulfaszalzin), izomrelaxáns, narkotikum, nem szteroid antiinflammatorikus drog (NSAID), fájdalomcsillapító, érzéstelenítő, nyugtató, helyi érzéstelenítő, neuromuszkuláris gátlószer, mikrobaellenes szer (például aminoglikozid, gombaellenes szer, parazitaellenes szer, vírusellenes szer, karbapenem, cefalosporin, flurorquinolon, makrolid, penicillin, szulfonamid, tetraciklin, egyéb mikrobaellenes szer), pikkelysömör elleni szer, kortikoszteroid, anabolikus szteroid, diabétesszel kapcsolatos ágens, ásványi anyag, tápanyag, pajzsmirigy ágens, vitamin, kalciummal kapcsolatos hormon, hasmenés elleni szer, köhögés elleni szer, hányás elleni szer, fekély elleni szer, hashajtó, antikoaguláns, eritropoietin (például epoetin-alfa), filgrasztim (például G-CSF, Neupogen), szargramosztim (GM-CSF, Leukin), immunizáló szer, immunglobulin, immunszuppresszáns (például basiliximab, ciklosporin, daclizumab), növekedési hormon, hormonhelyettesítő drog, ösztrogén-receptor modulátor, pupillatágító szer, cikloplegiás szer, alkiláló ágens, antimetabolit, mitótikus inhibitor, radioterápiás szer, antidepresszáns, antimániás ágens, antipszichotikus szer, anxiolitikum, hipnotikum, szimpatomimetikum, stimuláns, donepezil, takrin, asztmagyógyszer, béta agonista, inhalált szteroid, leukotrién inhibitor, metilxantin, kromolin, epinefrin vagy analógja, domáz-alfa (Pulmozyme), citokin vagy citokin antagonista vagy ellenanyag. Ilyen citokinek nem korlátozó példaként lehetnek IL-1 és IL-23 között bármelyik, IL-6, daganatellenes ellenanyagok, kemoterápiás ágensek vagy sugárterápiák. A megfelelő dózisok jól ismertek a szakterületen [lásd például „Pharmacotherapy Handbook”, 2. kiadás, szerk.: Wells, kiad.' Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); „PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition”, kiad.: Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000), amely referenciák mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi].
Az ilyen rákellenes vagy fertőzésellenes szerek tartalmazhatnak toxin molekulákat is, amelyek kapcsolódnak, kötve vannak, együtt vannak kiszerelve vagy együtt vannak beadva legalább egy, találmány szerinti ellenanyaggal. A toxin adott esetben hathat úgy, hogy szelektíven elpusztítja a patológiás sejtet vagy szövetet. A patológiás sejt lehet ráksejt vagy egyéb sejt. Ilyen toxin lehet nem korlátozó példaként tisztított vagy rekombináns toxin vagy toxin-fragmens, amely toxin — például ricin, diftériatoxin, venomtoxin vagy bakteriális
-41 toxin — legalább egy funkcionális citotoxikus doménját tartalmazza. A toxin kifejezés magában foglal mind endotoxinokat, mind exotoxinokat, amelyeket bármely természetben előforduló, mutáns vagy rekombináns baktérium vagy vírus termel, és amelyek bármilyen patológiás állapotot okozhatnak emberekben és egyéb emlősökben, mint például toxin sokkot, ami halált is eredményezhet. Ilyen toxinok nem korlátozó példái enterotoxigén E. coli hőlabilis enterotoxin (LT), hőstabil enterotoxin (ST), Shigella citotoxin, Aeromonas enterotoxinok, toxikus sokk szindróma toxin-1 (TSST-1), Staphylococcus enterotoxin A (SEA), B (SEB) vagy C (SEC), Streptococcus enterotoxinok és hasonlók. Ilyen baktériumok nem korlátozó példái enterotoxigén E. coli (ETEC), enterohemorrágiás E. coli fajok törzsei (például a 0157Ή7 szerotípus törzsei), Staphylococcus fajok (például Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes}, Shigella fajok (például Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii és Shigella sonnet), Salmonella fajok (például Salmonella typhi, Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), Clostridium fajok (például Clostridium perfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum), Camphlobacter fajok (például Camphlobacter jejuni, Camphlobacter fetus), Heliobacter fajok (például Heliobacter pylori), Aeromonas fajok (például Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, Vibrios fajok például Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), Klebsiella fajok, Pseudomonas aeruginosa és sztreptokokkuszok [lásd például „INTERNAL MEDICINE”, 3. kiadás, szerk.: Stein, 1-13. old., kiad.: Little, Brown and Co., Boston, (1990); „Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control”, 2. kiadás, szerk.: Evans és mtsai., 239-254. old., kiad.: Plenum Medical Book Co., New York (1991); Mandell és mtsai., „Principles and Practice of Infectious Diseases”, 3. kiadás, kiad.: Churchill Livingstone, New York (1990); „The Merck Manual”, 16. kiadás, szerk.: Berkow és mtsai., kiad.: Merck and Co., Rahway, N.J. (1992); Wood és mtsai, FEMS Microbiology Immunology 76, 121-134.old. (1991); Marrack és mtsai., Science 248, 705-711. old. (1990), amely referenciák teljes tartalma hivatkozás útján a kitanítás részét képezi].
Találmány szerinti anti-duális-integrin ellenanyag vegyületek, készítmények és kombinációk továbbá tartalmazhatnak legalább egy megfelelő kiegészítő anyagot, mint például nem korlátozó példaként oldószert, kötőszert, stabilizálószert, puffereket, sókat, lipofil oldószereket, tartósítószereket, adjuvánsokat és hasonlókat. Gyógyászatilag elfogadható kiegészítő anyagok az előnyösek. Ilyen steril oldatok, és előállításukra szolgáló eljárások nem korlátozó példái jól ismertek a szakterületen, mint például nem korlátozó példaként „Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 18. kiadás, szerk.: Gennaro, kiad.: Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Rutinszerűen választhatunk ki olyan gyógyászatilag
-42elfogadható hordozókat, amelyek alkalmasak az anti-duális-integrin ellenanyag, fragmens vagy variáns készítmény beadásának módja, oldhatósága és/vagy stabilitása szerint, amint az jól ismert a szakterületen vagy feltárjuk a leírásban.
A találmány szerinti készítményben hasznos gyógyászati kötőanyagok és adalékanyagok nem korlátozó példái közé tartoznak fehérjék, peptidek, aminosavak, lipidek és szénhidrátok (például cukrok, köztük monoszacharidok, di-, tri-, tetra- és oligoszacharidok; derivatizált cukrok, mint például alditolok, aldonsavak, észterifikált cukrok és hasonlók; és poliszacharidok vagy cukorpolimerek), amelyek egyedül vagy kombinációban lehetnek jelen, 1-99,99% mennyiségben egyedül vagy kombinációban tömeg vagy térfogat szerint. Szemléltető fehérje kötőanyagok lehetnek a szérumalbuminok, mint például humán szérumalbumin (HSA), rekombináns humán albumin (rHA), zselatin, kazein és hasonlók. Reprezentatív aminosav/ellenanyag komponensek — amelyek pufferként is működhetnek — lehetnek alanin, glicin, arginin, bétáin, hisztidin, glutaminsav, aszparaginsav, cisztein, lizin, leucin, izoleucin, valin, metionin, fenilalanin, aszpartám és hasonlók. Egy előnyös aminosav a glicin.
A találmány szerint megfelelően alkalmazható szénhidrát kötőanyagok például a monoszacharidok, mint például fruktóz, maltóz, galaktóz, glükóz, D-mannóz, szorbóz és hasonlók; diszacharidok, mint például laktóz, szukróz, trehalóz, cellobióz és hasonlók; poliszacharidok, mint például raffinóz, melezitóz, maltodextrinek, dextránok, keményítők és hasonlók; és alditolok, mint például mannitol, xilitol, maltitol, laktitol, xilitol szorbitol (glucitol), mioinozitol és hasonlók. A találmány szerint alkalmazható előnyös szénhidrát kötőanyagok a mannitol, trehalóz és raffinóz.
Anti-duális-integrin ellenanyag-készítmények tartalmazhatnak puffért vagy pH-állító ágenseket is; tipikusan a puffer szerves savból vagy bázisból készített só. Reprezentatív pufferek közé tartoznak szerves savak sói, mint például citromsav, aszkorbinsav, glukonsav, szénsav, borkősav, borostyánkősav, ecetsav vagy ftálsav sói, Tris, trometamin-hidroklorid vagy foszfát pufferek. A találmány szerinti készítményekben történő alkalmazásra előnyös pufferek szerves savak sói, mint például citrát.
Ezenfelül a találmány szerinti anti-duális-integrin ellenanyag-készítmények tartalmazhatnak polimer kötőanyagokat/adalékanyagokat, mint például polivinilpirrolidonokat, „ficoll”-okat (polimer cukor), dextránokat (például ciklodextrineket, mint például 2-hidroxipropil-3-ciklodextrint), polietilén-glikolokat, ízesítőszereket, mikrobaellenes szereket, édesítőszereket, antioxidánsokat, antisztatikus ágenseket, felületaktív anyagokat (például poliszorbátokat, mint például „TWEEN 20”-at és „TWEEN 80”-at), lipideket
-43 (például foszfolipideket, zsírsavakat), szteroidokat (például koleszterint) és komplexképző ágenseket (például EDTA-t).
Ezek és további, találmány szerinti anti-duális-integrin ellenanyag, részlet vagy variáns készítményekben történő alkalmazásra megfelelő, ismert gyógyászati kötőszerek és/vagy adalékanyagok ismertek a szakterületen, például amint a „Remington: The Science & Practice of Pharmacy” [19. kiadás szerk: Williams & Williams (1995)] és a „Physician's Desk Reference” [52. kiadás, kiad.: Medical Economics, Montvale, NJ (1998)] felsorolja, amely referenciák teljes tartalma hivatkozás útján a kitanítás részét képezi. Előnyös hordozó vagy kötőszer anyagok szénhidrátok (például szacharidok és alditolok) és pufferek (például citrát) vagy polimer ágensek.
Kiszerelések
Amint fent megjegyeztük, a találmány tárgyát stabil készítmények képezik, amelyek előnyösen foszfát-puffer sóoldattal vagy egy kiválasztott sóval, valamint tartósított oldatok és kiszerelések, amelyek tartósítószert valamint többszörös felhasználású tartósított kiszereléseket tartalmaznak, amelyek alkalmasak gyógyászati vagy állatgyógyászati alkalmazásra, és amelyek legalább egy anti-duális-integrin ellenanyagot tartalmaznak gyógyászatilag elfogadható kiszerelésben. Tartósított kiszerelések legalább egy ismert tartó sító szert tartalmaznak, vagy adott esetben legalább egyet az alábbiak közül: fenol, mkrezol, p-krezol, o-krezol, klorokrezol, benzilalkohol, fenil-higany-nitrit, fenoxietanol, formaldehid, klorobutanol, magnézium-klorid (például hexahidrát), alkilparabén (metil, etil, propil, butil és hasonlók), benzalkónium-klorid, benzetónium-klorid, nátrium-dehidroacetát vagy timerozál, vagy azok keveréke vizes oldószerben. Bármilyen megfelelő koncentrációt vagy keveréket alkalmazhatunk, amint az ismert a szakterületen, mint például 0,001-5%, vagy bármilyen tartomány vagy érték ezek között, mint például nem korlátozó példaként 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 0,1, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, vagy bármilyen tartomány vagy érték ezek között. Nem korlátozó példa lehet: tartósítószer nélkül, 0,1-2% m-krezol (például 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,1-3% benzil-alkohol (például 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%), 0,001-0,5% timerozál (például 0,005, 0,01%), 0,001-2,0% fenol (például 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,0005-1,0% alkilparabén(ek) (például 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 3,0, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%), és hasonlók.
- 44Amint fent megjegyeztük, a találmány tárgyát képezi gyártott termék, amely csomagolóanyagot és legalább egy fiolát tartalmaz, amely fiola legalább egy anti-duálisintegrin ellenanyagot tartalmaz az előírt pufferekkel és/vagy tartósítószerekkel, adott esetben vizes oldószerben, és a csomagolóanyag olyan címkét tartalmaz, amely jelzi azt, hogy az oldat tárolható 1, 2, 3, 4, 5 ,6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 órán keresztül vagy tovább. A találmány tárgyát képezi továbbá gyártott termék, amely csomagolóanyagot, egy első, legalább egy liofilizált anti-duális-integrin ellenanyagot tartalmazó fiolát, és egy második, előírt puffer vagy tartósítószer vizes oldatát tartalmazó fiolát tartalmaz, és a csomagolóanyag olyan címkét tartalmaz, amely utasítja a pácienst arra, hogy oldja fel a legalább egy anti-duális-integrin ellenanyagot a vizes oldószerben olyan oldatot előállítva, amely 24 órán keresztül vagy tovább tárolható.
A találmány szerint alkalmazott legalább egy anti-duális-integrin ellenanyagot rekombináns úton állíthatjuk elő, beleértve emlős sejtekből vagy transzgénikus készítményekből, vagy tisztíthatjuk más biológia forrásokból, amint azt a leírásban feltárjuk vagy ismert a szakterületen.
A találmány szerinti termékben található legalább egy anti-duális-integrin ellenanyag koncentráció-tartománya olyan mennyiségeket tartalmaz, hogy egy nedves/száraz rendszerben a feloldást követően az körülbelül 1,0 pg/ml és körülbelül 1000 mg/ml között van, habár alacsonyabb és magasabb koncentrációk is működőképesek, és a tervezett bejuttató eszköztől függenek, például oldat kiszerelések különbözhetnek transzdermális, pulmonáris, nyálkahártyái vagy ozmotikus pumpa vagy mikropumpa eljárások esetében.
Előnyösen a vizes oldószer adott esetben továbbá tartalmaz gyógyászatilag elfogadható tartósító szert is. Előnyös tartósító szerek közé tartoznak az m-krezol, p-krezol, okrezol, klorokrezol, benzil-alkohol, alkilparabén (metil, etil, propil, butil és hasonlók), benzalkónium-klorid, benzetónium-klorid, nátrium-dehidroacetát vagy timerozál, vagy ezek keverékei. A kiszerelésben alkalmazott tartósítószer koncentrációja olyan, hogy elegendő legyen mikrobaellenes hatás kifejtéséhez. Az ilyen koncentráció függ a kiválasztott tartósító szertől, és szakember számára könnyedén meghatározható.
Más kötőanyagok, például izotóniás ágensek, pufferek, antioxidánsok, tartósítószert segítő anyagok adhatók adott esetben és előnyösen az oldószerhez. Izotóniás ágenst, mint például glicerint általánosan alkalmaznak ismert koncentrációkban. Előnyösen fiziológiailag tolerált puffer is adhatunk javított pH-szabályozás biztosítására. A kiszerelések széles pHtartományt felölelhetnek, mint például körülbelül pH 4 és körülbelül pH 10 között, és előnyös tartomány a körülbelül pH 5 és körülbelül pH 9 közötti, és legelőnyösebb tartomány a
-45 körülbelül 6,0 és körülbelül 8,0 közötti. Előnyösen a találmány szerinti kiszerelések pH-ja körülbelül 6,8 és körülbelül 7,8 közötti. Előnyös pufferek közé tartoznak a foszfát-pufferek, legelőnyösebben nátrium-foszfát, különösen előnyösen a foszfát-pufferelt sóoldat (PBS).
Más adalékanyagok, mint például gyógyászatilag elfogadható szolubilizáló szerek, mint például Tween 20 [polioxietilén (20) szorbitán monolaurát], Tween 40 [polioxietilén (20) szorbitán monopalmitát], Tween 80 [polioxietilén (20) szorbitán monooleát], Pluronic F68 (polioxietilén polioxipropilén blokk-kopolimerek) és PEG (polietilén-glikol) vagy nem ionos felületaktív anyagok, mint például poliszorbát 20 vagy 80 vagy poloxamer 184 vagy 188, Pluronic® poliolok, egyéb blokk-kopolimerek és komplexképzők, mint például EDTA és EGTA adhatók adott esetben hozzá a kiszerelésekhez vagy kompozíciókhoz az aggregáció csökkentésére. Ezek az adalékanyagok különösen hasznosak, ha pumpás vagy műanyag tartályt alkalmazunk a kiszerelés beadására. A gyógyászatilag elfogadható felületaktív anyag jelenléte csökkenti a fehérje aggregációra való hajlamát.
A találmány szerinti kiszereléseket olyan eljárással állíthatjuk elő, amely során legalább egy anti-duális-integrin ellenanyagot összekeverünk vizes oldószerben az alábbi tartósító szerek bármelyikével: fenol, m-krezol, p-krezol, o-krezol, klorokrezol, benzil-alkohol, alkilparabén (metil, etil, propil, butil és hasonlók), benzalkónium-klorid, benzetónium-klorid, nátrium-dehidroacetát vagy timerozál vagy ezek keverékei. A legalább egy anti-duálisintegrin ellenanyag és tartósítószer vizes oldószerben történő összekeverését hagyományos feloldási és keverési módszerekkel hajtjuk végre. Alkalmas kiszerelések előállításához például legalább egy anti-duális-integrin ellenanyag puffereit oldatban lemért mennyiségét kombináljuk puffereit oldatban lévő kívánt tartó sító szerrel olyan mennyiségben, hogy az megfelelő legyen a fehérje és a tartósítószer kívánt koncentrációjának a biztosítására. Ezen eljárás variációi nyilvánvalóak az átlagos képességű szakember számára. Például a komponensek hozzáadásának a sorrendje, további adalékanyagok alkalmazása, a hőmérséklet és a pH, amelyen a kiszerelést előállítjuk, mind olyan tényezők, amelyek optimalizálhatok a koncentráció és az alkalmazott beadási mód függvényében.
A találmány szerinti kiszereléseket áttetsző oldatként biztosíthatjuk a páciensek számára, vagy dupla fiolaként, amelyek egyike legalább egy liofilizált anti-duális-integrin ellenanyagot tartalmaz, amelyet feloldandó egy második fiolában, amely vizet, tartósítószert és/vagy kötőanyagokat tartalmaz, előnyösen foszfát-puffért és/vagy sóoldatot vagy kiválasztott sót vizes oldószerben. Akár az egyetlen oldószeres fiola, akár a feloldást igénylő dupla fiola újrafelhasználható több alkalommal, és elegendő lehet a páciens kezelésének több
-46ciklusára, és ily módon kényelmesebb kezelési rendet tehet lehetővé, mint a jelenleg rendelkezésre állók.
A találmány szerinti gyártott termékek azonnalitól 24 órán belül vagy később történő beadásra alkalmazhatók. Ennek megfelelően a találmány szerinti gyártott termékek szignifikáns előnyöket biztosítanak a páciens számára. A találmány szerinti kiszereléseket adott esetben biztonságosan tárolhatjuk körülbelül 2 és körülbelül 40 °C között, és megtartják a fehérje biológiai aktivitását hosszú időn keresztül, ily módon lehetővé tesznek egy olyan címkét a csomagon, amely azt jelzi, hogy az oldat tárolható és/vagy felhasználható 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 vagy 96 órán keresztül vagy tovább. Ha tartósított oldószert alkalmazunk, az ilyen címke 1-12 hónapos, fél éves, másfél éves és/vagy két éves felhasználást tartalmazhat.
A legalább egy találmány szerinti anti-duális-integrin ellenanyag oldatait olyan eljárással állíthatjuk elő, amely során legalább egy ellenanyagot elkeverünk vizes oldószerben. Az elkeverést hagyományos feloldási és keverési módszerek alkalmazásával hajtjuk végre. Alkalmas oldószer előállításához például legalább egy ellenanyag mért mennyiségű vizes vagy pufferes oldatát kombináljuk olyan mennyiségben, amely megfelelő a fehérje és adott esetben tartósítószer vagy puffer kívánt koncentrációjának biztosítására. Ezen eljárás variációi nyilvánvalóak az átlagos képességű szakember számára. Például a komponensek hozzáadásának a sorrendje, további adalékanyagok alkalmazása, a hőmérséklet és a pH, amelyen a kiszerelést előállítjuk, mind olyan tényezők, amelyek optimalizálhatok a koncentráció és az alkalmazott beadási mód függvényében.
A találmány szerinti termékeket áttetsző oldatként biztosíthatjuk a páciensek számára, vagy dupla fiolaként, amelyek egyike legalább egy liofilizált anti-duális-integrin ellenanyagot tartalmaz, amely feloldandó egy második fiolában, amely vizes oldószert tartalmaz. Akár az egyetlen oldószeres fiola, akár a feloldást igénylő dupla fiola újrafelhasználható több alkalommal, és elegendő lehet a páciens kezelésének több ciklusára, és ily módon kényelmesebb kezelési rendet tesz lehetővé, mint a jelenleg rendelkezésre állók.
A találmány szerinti termékeket közvetve biztosíthatjuk a páciensek számára gyógyszertárak, klinikák vagy egyéb ilyen intézetek és intézmények útján, áttetsző oldatként vagy dupla fiolaként, amelyek egyike legalább egy liofilizált anti-duális-integrin ellenanyagot tartalmaz, amely feloldandó egy második fiolában, amely vizes oldószert tartalmaz. Ebben az esetben az áttetsző oldat akár egy liter vagy több is lehet, nagyobb készletet biztosítva, amelyből a legalább egy ellenanyag kisebb részleteit ki lehet venni egy vagy több alkalommal, kisebb fiolákba áttéve, és a gyógyszertár vagy klinika biztosítja azokat a vásárlói és/vagy páciensei számára.
-47Ezek az egyszeres fiolákat tartalmazó ismert eszközök közé tartoznak az oldat bejuttatására szolgáló toll-injektoros eszközök, mint például BD Pen, BD Autojedor®, Humaject®, NovoPen®, B-D®Pen, AutoPen® és OptiPen®, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, Biojector®, iject®, J-tip Needle-Free Injedor®, Intrajed®, Medi-Ject®, amelyket például az alábbi cégek készítenek és fejlesztettek ki: Becton Dickensen (Franklin, Lakes, NJ, www.bectondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Switzerland, www.disetronic.com); Bioject (Portland, Oregon, www.bioject.com); National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, UK, www.weston-medical.com), Medi-Ject Corp. (Minneapolis, MN, www.mediject.com). Dupla fiolás rendszert tartalmazó ismert eszközök a liofilizált drog kazettában történő feloldására, és az oldat bejuttatására szolgáló toll-injektor rendszerek, mint például a HumatroPen®.
A találmány szerinti termékek csomagolóanyagot tartalmaznak. A csomagolóanyag — a hatóságok által megkövetelt információk mellett - ismerteti azokat a körülményeket, amelyek között a termék alkalmazható. A találmány szerinti csomagolóanyag utasításokat biztosít a páciens számára a legalább egy anti-duális-integrin ellenanyag feloldására a vizes oldószerben oldat kialakítása végett, és az oldat alkalmazására 2-24 órás vagy hosszabb időtartamon belül a kétfiolás, nedves/száraz termék esetén. Az egyfiolás, oldat termék esetében a címke jelzi, hogy az ilyen oldat 2-24 órán keresztül vagy tovább is felhasználható. A találmány szerinti termékek alkalmazhatók humán gyógyászati alkalmazásra.
A találmány szerinti kiszereléseket legalább egy anti-duális-integrin ellenanyag és kiválasztott puffer, előnyösen sóoldatot vagy kiválasztott sót tartalmazó foszfát-puffer összekeverését tartalmazó eljárással lehet előállítani. A legalább egy ellenanyag és puffer vizes oldószerben történő összekeverését hagyományos feloldási és keverési módszerekkel hajtjuk végre. Alkalmas kiszerelések előállításához például a legalább egy ellenanyag vizes vagy pufferes lemért mennyiségét kombináljuk a kívánt pufferelő ágenssel olyan mennyiségben, hogy az megfelelő legyen a fehérje és a puffer kívánt koncentrációjának a biztosítására. Ezen eljárás variációi nyilvánvalóak az átlagos képességű szakember számára. Például a komponensek hozzáadásának a sorrendje, további adalékanyagok alkalmazása, a hőmérséklet és a pH, amelyen a kiszerelést előállítjuk, mind olyan tényezők, amelyek optimalizálhatok a koncentráció és az alkalmazott beadási mód függvényében.
A találmány szerinti stabil vagy tartósított kiszereléseket áttetsző oldatokként biztosíthatjuk a páciensek számára, vagy dupla fiolaként, amelyek egyike legalább egy liofilizált anti-duális-integrin ellenanyagot tartalmaz, amelyet feloldandó egy második fiolában, amely tartósítószert vagy puffért és kötőanyagokat tartalmaz vizes oldószerben.
-48Akár az egyetlen oldószeres fiola, akár a feloldást igénylő dupla fiola újra felhasználható több alkalommal, és elegendő lehet a páciens kezelésének több ciklusára, és ily módon kényelmesebb kezelési rendet tesz lehetővé, mint a jelenleg rendelkezésre állók.
A legalább egy, találmány szerinti stabil vagy tartósított kiszerelésekben vagy oldatokban lévő anti-duális-integrin ellenanyagot a találmány szerint beadhatjuk a páciensnek számos különféle beadási eljárás alkalmazásával, mint például SC vagy IM injekcióval; transzdermális, pulmonáris, transzmukózális, implantátum, ozmotikus pumpa, kazetta, mikropumpa, vagy egyéb, szakember számára ismert módon, amint az ismert a szakterületen. Terápiás alkalmazások
A találmány tárgyát képezi eljárás is legalább egy duális integrinnel kapcsolatos betegség modulálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben, amint az ismert a szakterületen vagy feltárjuk a leírásban, legalább egy találmány szerinti anti-duális-integrin ellenanyag alkalmazásával.
A találmány tárgyát képezi eljárás is legalább egy duális integrinnel kapcsolatos betegség modulálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben, amelynek nem korlátozó példája az alábbiak közül legalább egy: elhízás, immunológiai betegség, szív- és érrendszeri betegség, fertőző betegség, rosszindulatú betegség vagy idegrendszeri betegség.
A találmány tárgyát képezi eljárás is legalább egy immunológiai betegség modulálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben, amelynek nem korlátozó példája az alábbiak közül legalább egy: reumatoid artritisz, fiatalkori reumatoid artritisz, szisztémás kialakulású fiatalkori reumatoid artritisz, sömörös artritisz, összenövéses csigolyagyulladás, gyomorfekély, szeronegatív izületi betegségek, oszteoartritisz, gyulladásos bélbetegség, fekélyes bélgyulladás, szisztémás lupusz eritematozus, anti-foszfolipid szindróma, szivárványhártya gyulladás/uveitisz/szemideg gyulladás, idiopátiás pulmonáris fibrózis, szisztémás érgyulladás/Wegener-féle granulomatózis, szarkoidózis, heregyulladás/vazektómiát megfordító eljárások, allergiás/atópiás betegségek, asztma, allergiás orrnyálkahártya gyulladás, ekcéma, allergiás érintéses bőrgyulladás, allergiás kötőhártya gyulladás, hiperszensitivitásos tüdőgyulladás, transzplantálás, szervátültetési kilökődés, „graft-versus-host” betegség, szisztémás gyulladásos szindróma, szepszis szindróma, gram-pozitív szepszis, gram-negatív szepszis, tenyésztésre negatív szepszis, gombás szepszis, neutropéniás láz, uroszepszis, meningokokcémia, trauma/vérzés, égések, ionizáló sugárzás hatása, heveny hasnyálmirigy gyulladás, felnőttkori légzőszervi disztressz szindróma, reumatoid artritisz, alkohol-indukált
-49hepatitisz, krónikus gyulladásos betegségek, szarkoidózis, Crohn-féle betegség, sarlósejtes vérszegénység, diabétesz, nefrózis, atopiás betegségek, hiperszenzitivitási reakciók, allergiás orrnyálkahártya gyulladás, szénanátha, állandó orrnyálkahártya gyulladás, kötöhártya gyulladás, méhnyálkahártya gyulladás, asztma, csalánkiütés, szisztémás anafilaxis, bőrgyulladás, vészes vérszegénység, hemolitikus betegség, trombocitopénia, szöveti vagy szervi graft kilökődése, vese transzplantátum kilökődése, szív transzplantátum kilökődése, máj transzplantátum kilökődése, hasnyálmirigy transzplantátum kilökődése, tüdő transzplantátum kilökődése, csontvelő transzplantátum (BMT) kilökődése, bőr allograft kilökődése, porc transzplantátum kilökődése, csont graft kilökődése, vékonybél transzplantátum kilökődése, magzati csecsemőmirigy inplantátum kilökődése, mellékpajzsmirigy transzplantátum kilökődése, szöveti vagy szervi xenograft kilökődés, allograft kilökődése, anti-receptor hiperszenzitivitási reakciók, Graves-betegség, Raynoudféle betegség, B típusú inzulin-rezisztens diabétesz, asztma, miaszténia grávisz, ellenanyagközvetített citotoxicitás, III. típusú hiperszenzitivitási reakciók, szisztémás lupusz eritematózus, POEMS szindróma (polineuropátia, organomegália, endokrinopátia, monoklonális gammopátia és bőrelváltozási szindróma), polineuropátia, organomegália, endokrinopátia, monoklonális gammopátia, bőrelváltozási szindróma, anti-foszfolipid szindróma, pemfigusz, szkleroderma, kevert kötőszöveti betegség, idiopátiás Addison-féle betegség, diabétesz mellitusz, krónikus aktív hepatitisz, elsődleges epezsugorodás, vitiligo, érgyulladás, poszt-MI cardiotómiás szindróma, IV. típusú hiperszenzitivitás, érintéses bőrgyulladás, hiperszenzitivitásos tüdőgyulladás, allograft kilökődése, intracelluláris organizmusok miatti granulómák, gyógyszerérzékenység, metabolikus/idiopátiás, Wilson-féle betegség, hemakromatózis, alfa-l-antitripszin hiány, diabetikus retinopátia, Hashimoto-féle pajzsmirigy gyulladás, oszteoporózis, hipotalamikus-hipofizis-adrenális tengely értékelése, elsődleges epezsugorodás, pajzsmirigy gyulladás, enkefalomielitisz, cachexia, cisztás fibrózis, csecsemőkori krónikus tüdőbetegség, krónikus obstruktív tüdőbetegség (COPD), örökletes hematofagocitikus limfohisztiocitózis, bőrgyógyászati betegségek, pikkelysömör, hajhullás, nefrózisos szindróma, vesegyulladás, glomeruláris vesegyulladás, heveny veseelégtelenség, hemodialízis, urémia, toxicitás, rángógörcs, okt3 terápia, anti-CD3 terápia, citokin terápia, kemoterápia, radioterápia (például nem korlátozó példaként toaszténia, anémia, cachexia és hasonlók), krónikus szalicilát mérgezés, és hasonlók [lásd például „Merck Manual”, 12-17. kiadások, kiad.: Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), „Pharmacotherapy Handbook”, szerk.: Wells és mtsai., 2. kiadás, kiad.: Appleton and Lange,
- 50Stamford, Conn. (1998,2000), amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi],
A találmány tárgyát képezi eljárás is legalább egy szív- és érrendszeri betegség modulálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben, amelynek nem korlátozó példája az alábbiak közül legalább egy: szívbénulás szindróma, szívinfarktus, szívszélhüdés, szélütés, isémiás szélütés, vérzés, arterioszklerózis, ateroszklerózis, resztenózis, diabetikus aterioszklerózisos betegség, magas vérnyomás, artériás magas vérnyomás, renovaszkuláris magas vérnyomás, szívkihagyás, sokk, szív- és érrendszeri szifilisz, szívelégtelenség, cor pulmonale, elsődleges tüdői magas vérnyomás, szív aritmia, átriális ektópiás szívverés, átriális szívdobogás, átriális fibrilláció (állandó vagy rohamokban fellépő), perfuzió utáni szindróma, kardiopulmonáris bypass gyulladásos reakció, kaotikus vagy többközpontú átriális tachikardia, szabályos szűk QRS tachikardia, specifikus aritmia, ventrikuláris fibrilláció, His-köteg aritmia, atrioventrikuláris blokk, kötegelágazás blokk, miokardiális isémiás rendellenességek, koszorúér betegség, angina pektorisz, szívinfarktus, kardiomiopátia, kitágult vértolulásos kardiomiopátia, korlátozott kardiomiopátia, billentyűi szívbetegségek, endokarditisz, perikardiális betegség, szívdaganatok, aorai és perifériás aneurizmus, aortametszés, aorta gyulladása, abdominális aorta és ágainak elzáródása, perifériás érrendszeri rendellenességek, artériaelzáródásos rendellenességek, perifériás aterioszklerózisos betegség, tromboangitisz obliteransz, funkcionális perifériás artériás rendellenességek, Raynaud-féle jelenség és betegség, akrocianózis, eritromelalgia, vénás betegségek, vénás trombózis, viszértágulás, arteriovenózus fisztula, limfödema, lipödema, nem stabil angina, reperfóziós sérülés, pumpa utáni szindróma, isémiás reperfuziós sérülés és hasonlók. Ilyen eljárás adott esetben tartalmazhatja legalább egy anti-duális-integrin ellenanyagot tartalmazó készítmény vagy gyógyászati készítmény hatásos mennyiségének a beadását egy sejtbe, szövetbe, szervbe, állatba vagy páciensbe, amelynek szüksége van ilyen modulálásra, kezelésre vagy terápiára.
A találmány tárgyát képezi eljárás is legalább egy fertőző betegség modulálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben, amelynek nem korlátozó példája az alábbiak közül legalább egy: heveny vagy krónikus bakteriális fertőzés, heveny vagy krónikus parazitikus vagy fertőző folyamatok, köztük bakteriális, virális és gombás fertőzések, HIV-fertőzés/HIV-neuropátia, meningitisz, hepatitisz (A, B vagy C, vagy hasonlók), szeptikus artritisz, peritonitisz, tüdőgyulladás, gégefőgyulladás, E. coli 0157:h7, hemolitikus uremiás szindróma/trombolitikus trombocitopéna purpura, malária, dengue hemorrágiás láz, leismaniázis, lepra, toxikus sokk szindróma, sztreptokokkuszos
- 51 izomgyulladás, gázos üszkösödés, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium intracellulare, Pneumocystis carinii tüdőgyulladás, medencei gyulladásos betegség, heregyulladás/mellékheregyulladás, Legionella, Lyme betegség, influenza A, Epstein-Barr vírus, virális hemafagocitótikus szindróma, virális enkefalitisz/aszeptikus meningitisz, és hasonlók.
A találmány tárgyát képezi eljárás is legalább egy rosszindulatú betegség modulálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben, amelynek nem korlátozó példája az alábbiak közül legalább egy: leukémia, heveny leukémia, heveny limfoblasztikus leukémia (ALL), B-sejtes, T-sejtes vagy FAB ALL, heveny mieloid leukémia (AML), krónikus mielocitikus leukémia (CML), krónikus limfocitikus leukémia (CLL), szőrsejt leukémia, mielodiplasztikus szindróma (MDS), limfóma, Hodgkin-betegség, rosszindulatú limfóma, nem-hodgkin-limfóma, Burkitt-limfóma, töbsszörös mielóma, Kaposiszarkóma, kolorektális karcinóma, pankreatikus karcinóma, nazofaringeális karcinóma, rosszindulatú hisztiocitózis, paraneoplasztikus szindróma/rosszindulatú elváltozás hiperkalcémiája, szilárd daganatok, adenokarcinómák, szarkómák, rosszindulatú melanoma, hemangioma, áttétes betegség, rákkal kapcsolatos csontfelszívódás, rákkal kapcsolatos csontfájdalom, és hasonlók.
A találmány tárgyát képezi eljárás is legalább egy idegrendszeri betegség modulálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben, amelynek nem korlátozó példája az alábbiak közül legalább egy: neurodegeneratív betegségek, szklerózis multiplex, migrénes fejfájás, AIDS demencia komplex, demielinációs betegségek, mint például szklerózis multiplex és heveny transzverz mielitisz; extrapiramidális és cerebelláris rendellenességek, mint például a kortikospinális rendszer sérülései; a bazális ganglionok rendellenességei vagy cerebelláris rendellenességek; hiperkinetikus mozgási rendellenességek, mint például Huntington-féle vitustánc és öregkori vitustánc; gyógyszerindukált mozgási rendellenességek, mint például a CNS dopamin-receptorokat gátló gyógyszerekkel indukáltak; hipokinetikus mozgási rendellenességek, mint például Parkinsonkór; progresszív szupranukleáris bénulás; a cerebellum szerkezeti sérülései; spinocerebelláris degenerációk, mint például spinális ataxia, Friedreich-féle ataxia, cerebelláris kortikális degenerációk, több rendszert érintő degenerációk (Mencel, Dejerihe-Thomas, Shi-Drager és Machado-Joseph); szisztémás rendellenességek (Refsum-féle betegség, abétalipoprotémia, ataxia, telangiektázia és mitokondriális több rendszert érintő rendellenességek); demielinációs mag rendellenességek, mint például szklerózis multiplex, heveny transzverz mielitisz; és a motoros egységek rendellenességei, mint például neurogén muszkuláris atrófiák (anterior
-52szarvsejtek degenerációja, mint például amiotrofikus laterális szklerózis, gyermekkori spinális muszkuláris atrófia és fiatalkori spinális muszkuláris atrófía); Alzheimer-kór; középkorban fellépő Down szindróma; diffúz Lewy-féle testbetegség; öregkori Lewy-féle elmebaj; Wemicke-Korsakoff szindróma; krónikus alkoholizmus; Creutzfeldt-Jakob betegség; szubakut szklerózisos panenkefalitisz, Hallerrorden-Spatz betegség és dementia pugilistica, és hasonlók. Ilyen eljárás adott esetben tartalmazhatja legalább egy duális integrin ellenanyagot vagy meghatározott részletet vagy variánst tartalmazó készítmény vagy gyógyászati készítmény hatásos mennyiségének a beadását egy sejtbe, szövetbe, szervbe, állatba vagy páciensbe, amelynek szüksége van ilyen modulálásra, kezelésre vagy terápiára [lásd például Merck Manual”, 16. kiadás, kiad.: Merck & Company, Rahway, NJ (1992)].
Bármilyen találmány szerinti eljárás tartalmazhatja legalább egy anti-duális-integrin ellenanyagot tartalmazó készítmény vagy gyógyászati készítmény hatásos mennyiségének a beadását egy sejtbe, szövetbe, szervbe, állatba vagy páciensbe, amelynek szüksége van ilyen modulálásra, kezelésre vagy terápiára. Ilyen eljárás adott esetben továbbá tartalmazhat ilyen immunológiai betegségek kezelésére szolgáló együttes beadást vagy kombinált terápiát, amely esetben a legalább egy anti-duális-integrin ellenanyag, annak meghatározott részlete vagy variánsa beadását előtt, azzal egy időben és/vagy azután legalább egyet beadunk az alábbiak közül: duális integrin antagonista (például nem korlátozó példaként duális integrin ellenanyag vagy fragmens, oldható duális-integrin-receptor vagy fragmens, azok fúziós fehérjéje vagy kismolekulás duális integrin antagonista), antireumatikum (például metotrexát, auranofm, aurotioglükóz, azatioprin, etanercept, arany-nátrium-tiomalát, hidroxikloroquinszulfát, leflunomid, szulfaszalzin), izomrelaxáns, narkotikum, nem szteroid antiinflammatorikus drog (NSAID), fájdalomcsillapító, érzéstelenítő, nyugtató, helyi érzéstelenítő, neuromuszkuláris gátlószer, mikrobaellenes szer (például aminoglikozid, gombaellenes szer, parazitaellenes szer, vírusellenes szer, karbapenem, cefalosporin, flurorquinolon, makrolid, penicillin, szulfonamid, tetraciklin, egyéb mikrobaellenes szer), pikkelysömör elleni szer, kortikoszteroid, anabolikus szteroid, diabétesszel kapcsolatos ágens, ásványi anyag, tápanyag, pajzsmirigy ágens, vitamin, kalciummal kapcsolatos hormon, hasmenés elleni szer, köhögés elleni szer, hányás elleni szer, fekély elleni szer, hashajtó, antikoaguláns, eritropoietin (például epoetin-alfa), fílgrasztim (például G-CSF, Neupogen), szargramosztim (GM-CSF, Leukin), immunizáló szer, immunglobulin, immunszuppresszáns (például basiliximab, ciklosporin, daclizumab), növekedési hormon, hormonhelyettesítő drog, ösztrogén-receptor modulátor, pupillatágító szer, cikloplegiás szer, alkiláló ágens, antimetabolit, mitótikus inhibitor, radioterápiás szer, antidepresszáns, antimániás ágens,
- 53 antipszichotikus szer, anxiolitikum, hipnotikum, szimpatomimetikum, stimuláns, donepezil, takrin, asztmagyógyszer, béta agonista, inhalált szteroid, leukotrién inhibitor, metilxantin, kromolin, epinefrin vagy analógja, dornáz-alfa (Pulmozyme), citokin vagy citokin antagonista. A megfelelő dózisok jól ismertek a szakterületen [lásd például „Pharmacotherapy Handbook”, 2. kiadás, szerk.: Wells, kiad.: Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); „PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition”, kiad.: Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000), amely referenciák mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi].
Találmány szerinti készítményekben, kombinációs terápiákban, együttes beadásban, eszközökben és/vagy eljárásokban alkalmazható TNF-antagonisták (amelyek továbbá tartalmaznak legalább egy találmány szerinti ellenanyagot, annak meghatározott részletét vagy variánsát) nem korlátozó példái közé tartoznak anti-TNF ellenanyagok, azok antigénkötő fragmensei, és olyan receptor-molekulák, amelyek specifikusan kötődnek TNF-hez; olyan vegyületek, amelyek megelőzik és/vagy gátolják TNF szintézisét, TNF felszabadulását vagy annak hatását célsejteken, mint például thalidomide, tenidap, foszfodiészteráz inhibitorok (például pentoxifylline vagy rolipram), A2b-adenozin-receptor agonisták és A2badenozin-receptor enhancerek; olyan vegyületek, amelyek megelőzik és/vagy gátolják a TNFreceptor jeltovábbítását, mint például a mitogén-aktivált protein -(MAP)- kináz inhibitorok; olyan vegyületek, amelyek blokkolják és/vagy gátolják a membrán-TNF hasítását, mint például metalloproteináz inhibitorok; olyan vegyületek, amelyek blokkolják és/vagy gátolják a TNF aktivitását, mint például angiotenzin-konvertáló-enzim -(ACE)- inhibitorok (például captopril); és olyan vegyületek, amelyek blokkolják és/vagy gátolják a TNF termelését és/vagy szintézisét, mint például MAP-kináz inhibitorok.
A leírás szerinti értelemben „tumornekrózis-faktor ellenanyag”, „TNF ellenanyag”, „TNF-α ellenanyag” vagy fragmens és hasonló csökkenti, blokkolja, gátolja, megszünteti vagy zavarja a TNF-α aktivitását in vitro, in situ és/vagy előnyösen in vivo. Például megfelelő találmány szerinti TNF humán ellenanyagok kötődhetnek TNF-a-hoz, és lehetnek anti-TNF ellenanyagok, azok antigén-kötő fragmensei, és azok meghatározott mutánsai vagy doménjai, amelyek specifikusan kötődnek a TNF-a-hoz. Megfelelő TNF ellenanyag vagy fragmens csökkentheti, blokkolhatja, megszüntetheti, zavarhatja, megelőzheti és/vagy gátolhatja TNF RNS-, DNS- vagy fehérjeszintézisét, TNF felszabadulását, TNF-receptor jeltovábbítását, membrán-TNF hasítását, TNF aktivitását, TNF termelését és/vagy szintézisét.
A cA2 kiméra ellenanyag tartalmazza az A2 jelű, magas affinitású semlegesítő egér anti-humán-TNF-α IgGl ellenanyag antigén-kötő variábilis régióját, és a humán IgGl kappa
- 54immunglobulin állandó régióját. A humán IgGl Fc-régió javítja az ellenanyagok allogeneikus effektor funkcióit, növeli a keringési féléletidejüket és csökkenti az immunogenitásukat. A cA2 kiméra ellenanyag aviditása és epitóp-specifitása az A2 egér ellenanyag variábilis régiójától származik. Egy előnyös megvalósítási mód szerint az A2 egér ellenanyag variábilis régióját kódoló nukleinsav előnyös forrása az A2 hibridóma sejtvonal.
A kiméra A2 ellenanyag (cA2) dózisfüggő módon semlegesíti mind a természetes eredetű, mind a rekombináns humán TNF-α citotoxikus hatásait. A cA2 kiméra ellenanyag és rekombináns humán TNF-α kötési vizsgálataiból a cA2 kiméra ellenanyag affínitási állandója l,O4xlO10 M'1 értékűnek adódott. Monoklonális ellenanyag specifításának és affinitásának meghatározására szolgáló előnyös kompetitív inhibiciós eljárások megtalálhatók az alábbi irodalmi helyeken: Harlow és mtsai., „Antibodies: A Laboratory Manual”, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, (1988); „Current Protocols in Immunology”, szerk.: Colligan és mtsai., kiad.: Greene Publishing Assoc, and Wiley Interscience, New York (1992-2000); Kozbor és mtsai., Immunol. Today, 4, 72-79. old. (1983); „Current Protocols in Molecular Biology”, szerk.: Ausubel és mtsai., kiad.: Wiley Interscience, New York (1987-2000); és Muller, Meth. Enzymol. 92, 589-601. old. (1983), amely referenciák teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint az A2 egér monoklonális ellenanyagot a C134A jelű sejtvonal termeli. A cA2 kiméra ellenanyagot a C168A jelű sejtvonal termeli.
A találmány szerint alkalmazható monoklonális anti-TNF ellenanyagok további példáit feltárják a szakirodalomban [lásd például a 5 231 024. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot; Moller A. és mtsai., Cytokine 2, 162-169. old. (1990) 07/943 852. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (benyújtva 1992. szeptember 11-én); Rathjen és mtsai., WO 91/02078. számú nemzetközi közzétételi irat (közzétéve 1991. február 21-én) ; Rubin és mtsai., 0 218 868, számú európai közzétételi irat (közzétéve 1987. április 22-én); Yone és mtsai., 0 288 088. számú európai közzétételi irat (közzétéve 1988. október 26-án); Liang és mtsai., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137, 847854. old. (1986); Meager és mtsai., Hybridoma 6, 305-311. old. (1987); Fendly és mtsai., Hybridoma 6, 359-369. old. (1987); Bringman és mtsai., Hybridoma 6, 489-507. old. (1987); és Hirai és mtsai., J. Immunol. Meth. 96, 57-62. old. (1987), amely referenciák teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik],
TNF-receptor molekulák
A találmány szerint alkalmazható előnyös TNF-receptor molekulák azok, amelyek magas affinitással kötődnek a TNF-a-hoz [lásd például Feldmann és mtsai., WO 92/07076,
- 55 számú nemzetközi közzétételi irat (közzétéve 1992. április 30-án); Schall és mtsai., Cell 61, 361-370. old. (1990); és Loetscher és mtsai., Cell 61, 351-359. old. (1990), amely referenciák teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik], és adott esetben alacsony immunogenitásúak. Közelebbről az 55 kDa (p55 TNF-R) és a 75 kDa (p75 TNF-R) sejtfelszíni TNF-receptorok alkalmazhatók a találmány szerint. Ezeknek a receptoroknak a csonkolt formái, amelyek a receptorok extracelluláris doménjait (ECD) vagy azok funkcionális részleteit tartalmazzák [lásd például Corcoran és mtsai., Eur. J. Biochem. 223, 831-840. old. (1994)], szintén alkalmazhatók a találmány szerint. A TNF-receptorok ECD-t tartalmazó csonkolt formáit detektálták vizeletben és szérumban, mint 30 kDa és 40 kDa TNF-α inhibitorikus kötőfehérjéket [Engelmann H. és mtsai., J. Bioi. Chem. 265, 1531-1536. old. (1990)]. Multimer TNF-receptor molekulák és TNF-immunreceptor fúziós molekulák és azok származékai és fragmensei vagy részletei további példái a találmány szerinti eljárásokban és készítményekben alkalmazható TNF-receptor molekuláknak. A találmány szerint alkalmazható TNF-receptor molekulákat az jellemzi, hogy képesek páciensek hosszú időn keresztül történő kezelésére, a tünetek jó és kiváló enyhítésével és alacsony toxicitással. Az alacsony immunogenitás és/vagy magas affinitás, valamint más meg nem határozott tulajdonságok hozzájárulhatnak az elért terápiás eredményekhez.
A találmány szerint alkalmazható TNF-receptor multimer molekulák tartalmazzák két vagy több TNF-receptor ECD-jének az egészét vagy funkcionális részletét egy vagy több polipeptid kapcsolómolekulával vagy nem peptid kapcsolómolekulával, mint például polietilén-glikollal (PEG) összekötve. A multimer molekulák továbbá tartalmazhatják szekretált fehérje szignálpeptidjét, hogy az irányítsa a multimer molekula expresszióját. Ezeket a multimer molekulákat és az előállításukra szolgáló eljárásokat a 08/437 533. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben tárták fel (benyújtva 1995. május 9én), amelynek a tartalma teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.
A találmány szerinti eljárásokban és készítményekben alkalmazható TNFimmunreceptor fúziós molekulák egy vagy több immunglobulin molekula legalább egy részletét, és egy vagy több TNF-receptor egészét vagy funkcionális részletét tartalmazzák. Ezeket az immunreceptor fúziós molekulákat monomerekként, vagy hetero- vagy homomultimerekként állíthatjuk össze. Az immunreceptor fúziós molekulák lehetnek monovalensek vagy multivalensek is. Ilyen TNF-immunreceptor fúziós molekula egy példája a TNF-receptor/IgG fúziós fehérje. TNF-immunreceptor fúziós molekulákat és azok előállítására szolgáló eljárásokat feltártak a szakirodalomban [Lesslauer és mtsai., Eur. J. Immunoi. 21, 2883-2886. old. (1991); Ashkenazi és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,
-5610535-10539. old. (1991); Peppel és mtsai., J. Exp. Med. 174, 1483-1489. old. (1991); Kolls és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 215-219.old. (1994); Butler és mtsai., Cytokine 6, 616-623. old. (1994); Baker és mtsai., Eur. J. Immunol. 24, 2040-2048.old. (1994); Beutler és mtsai., 5 447 851. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; és 08/442 133. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (benyújtva 1995. május 16-án), amely referenciák teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik]. Eljárások immunreceptor fúziós molekulák előállítására megtalálhatók az alábbi irodalmi helyeken is: Capon és mtsai., 5 116 964. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; Capon és mtsai., 5 225 538. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; és Capon és mtsai., Nature 33, 525-531. old. (1989), amely referenciák teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik.
TNF-receptor molekula funkcionális ekvivalense, származéka vagy régiója alatt a TNF-receptor molekula olyan részletét, vagy a TNF-receptor molekulát kódoló TNF-receptor molekula szekvencia olyan részletét értjük, amely elegendő méretű és szekvenciájú ahhoz, hogy funkcionálisan hasonlítson találmány szerint alkalmazható TNF-receptor molekulákhoz (például magas affinitással köti a TNF-a-t és alacsony az immunogenitása). TNF-receptor molekula funkcionális ekvivalense lehet módosított TNF-receptor molekula is, amely funkcionálisan hasonlít találmány szerint alkalmazható TNF-receptor molekulákra (például magas affinitással köti a TNF-a-t és alacsony az immunogenitása). Például TNF-receptor molekula funkcionális ekvivalense tartalmazhat „SILENT” kodont vagy egy vagy több aminosav-szubsztitúciót, deléciót vagy addíciót (például egy savas aminosav szubsztitúcióját egy másik savas aminosavval; vagy azonos vagy különböző hidrofób aminosavat kódoló kodon szubsztitúcióját hidrofób aminosavat kódoló másik kodonnal) [lásd Ausubel és mtsai., „Current Protocols in Molecular Biology”, kiad.: Greene Publishing Assoc, and WileyInterscience, New York (1987-2000)].
Citokin lehet bármilyen ismert citokin (lásd például www.CopewithCytokines.com). Citokin antagonisták nem korlátozó példái közé tartozik bármilyen ellenanyag, fragmens vagy mimetikum, bármilyen oldható receptor, fragmens vagy mimetikum, bármilyen kismolekulás antagonista, vagy ezek bármilyen kombinációja.
Terápiás kezelések. Bármilyen találmány szerinti eljárás lehet duális-integrinközvetített rendellenesség kezelésére szolgáló eljárás, amely tartalmazza legalább egy antiduális-integrin ellenanyagot tartalmazó készítmény vagy gyógyászati készítmény hatásos mennyiségének a beadását egy sejtbe, szövetbe, szervbe, állatba vagy páciensbe, amelynek szüksége van ilyen modulálásra, kezelésre vagy terápiára. Ilyen eljárás adott esetben továbbá
- 57 tartalmazhat ilyen immunológiai betegségek kezelésére szolgáló együttes beadást vagy kombinált terápiát, amely esetben a legalább egy anti-duális-integrin ellenanyag, annak meghatározott részlete vagy variánsa beadása előtt, azzal egy időben és/vagy azután legalább egyet beadunk az alábbiak közül: duális integrin antagonista (például nem korlátozó példaként duális integrin ellenanyag vagy fragmens, oldható duális-integrin-receptor vagy fragmens, azok fúziós fehérjéje vagy kismolekulás duális integrin antagonista), antireumatikum (például metotrexát, auranofm, aurotioglükóz, azatioprin, etanercept, aranynátrium-tiomalát, hidroxikloroquin-szulfát, leflunomid, szulfaszalzin), izomrelaxáns, narkotikum, nem szteroid antiinflammatorikus drog (NSAID), fájdalomcsillapító, érzéstelenítő, nyugtató, helyi érzéstelenítő, neuromuszkuláris gátlószer, mikrobaellenes szer (például aminoglikozid, gombaellenes szer, parazitaellenes szer, vírusellenes szer, karbapenem, cefalosporin, flurorquinolon, makrolid, penicillin, szulfonamid, tetraciklin, egyéb mikrobaellenes szer), pikkelysömör elleni szer, kortikoszteroid, anabolikus szteroid, diabétesszel kapcsolatos ágens, ásványi anyag, tápanyag, pajzsmirigy ágens, vitamin, kalciummal kapcsolatos hormon, hasmenés elleni szer, köhögés elleni szer, hányás elleni szer, fekély elleni szer, hashajtó, antikoaguláns, eritropoietin (például epoetin-alfa), filgrasztim (például G-CSF, Neupogen), szargramosztim (GM-CSF, Leukin), immunizáló szer, immunglobulin, immunszuppresszáns (például basiliximab, ciklosporin, daclizumab), növekedési hormon, hormonhelyettesítő drog, ösztrogén-receptor modulátor, pupillatágító szer, cikloplegiás szer, alkiláló ágens, antimetabolit, mitótikus inhibitor, radioterápiás szer, antidepresszáns, antimániás ágens, antipszichotikus szer, anxiolitikum, hipnotikum, szimpatomimetikum, stimuláns, donepezil, takrin, asztmagyógyszer, béta agonista, inhalált szteroid, leukotrién inhibitor, metilxantin, kromolin, epinefrin vagy analógja, domáz-alfa (Pulmozyme), citokin vagy citokin antagonista.
Tipikusan patológiás állapot kezelését legalább egy anti-duális-integrin ellenanyagkészítmény hatásos mennyiségének vagy dózisának beadásával végezzük, amelynek az összmennyisége átlagosan legalább körülbelül 0,01 és 500 mg közötti tartományba esik legalább egy anti-duális-integrin ellenanyagra vonatkoztatva a páciens kg-jaira dózisonként, és előnyösen legalább körülbelül 0,1 és 100 mg ellenanyag/kg közötti egyszeri vagy többszöri beadásonként, a készítményben található specifikus aktivitástól függően. Más megoldásképpen a hatásos szérumkoncentráció 0,1-5000 pg/ml szérumkoncentráció lehet egyszeri vagy többszöri beadásonként. A megfelelő dózisok ismertek a gyakorló orvos számára, és — természetesen — függhetnek az adott betegség állapotától, a beadott készítmény specifikus aktivitásától és a kezelés alatt álló pácienstől. Bizonyos esetekben a
- 58kívánt terápiás mennyiség eléréséhez szükséges lehet ismételt beadást alkalmazni, azaz egy monitorozott vagy mért dózis ismételt egyedi beadásaira van szükség, amikor az egyedi beadásokat addig ismételjük, amíg a kívánt napi dózist vagy hatást el nem érjük.
Előnyös dózisok adott esetben tartalmazhatnak 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 0 9
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,
29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53,
54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79,
80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 és/vagy 100-500 mg/kg-ot beadásonként, vagy bármilyen tartományt vagy értéket ezek között, vagy 0,1, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5, 2,9, 3,0, 3,5, 3,9, 4,0, 4,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 20, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14,0, 14,5, 15, 0,15, 15,9, 16, 16,5, 16,9, 17, 17,5, 17,9, 18, 18,5, 18,9, 19, 19,5, 19,9, 20, 20,5, 20,9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 és/vagy 5000 gg/ml szérumkoncentráció elérését egyszeri vagy többszöri beadásonként, vagy bármilyen tartományt vagy értéket ezek között.
Más megoldásképpen a beadott dózis változhat ismert tényezők függvényében, mint például az adott ágens farmakodinamikai jellegzetességei, a beadásának módja és útja; a befogadó kora, egészségi állapota és tömege; a tünetek természete és mértéke, az egyidejű kezelések típusa, a kezelés gyakorisága, és a kívánt hatás. Általában a hatóanyag dózisa körülbelül 0,1-100 mg/testtömeg-kg lehet. Rendszerint 0,1-50, és előnyösen 0,1-10 mg/kg/beadás vagy fenntartott felszabadulású forma hatásos a kívánt eredmények elérésére.
Nem korlátozó példaként emberek vagy állatok kezelését biztosíthatjuk legalább egy, találmány szerinti ellenanyag egyszeri vagy periodikus dózisával 0,1-100 mg/kg között, mint például 0,5, 0,0, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 vagy 100 mg/kg naponta legalább az 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7., 8., 9., 10., 11., 12., 13., 14., 15., 16., 17., 18., 19., 20., 21.,
22. , 23., 24., 25., 26., 27., 28., 29., 30., 31., 32., 33., 34., 35., 36., 37., 38., 39. vagy 40. nap legalább egyikén, vagy más megoldásképpen vagy ezenfelül az 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7., 8., 9., 10., 11., 12., 13., 14., 15., 16., 17., 18., 19., 20., 21., 22., 23., 24., 25., 26., 27., 28., 29., 30.,
31. , 32., 33., 34., 35., 36., 37., 38., 39., 40., 41., 42., 43., 44., 45., 46., 47., 48., 49., 50., 51.
vagy 52. hét legalább egyikén, vagy más megoldásképpen vagy ezenfelül az 1., 2., 3., 4., 5., 6., ., 7., 8., 9., 10., 11., 12., 13., 14., 15., 16., 17., 18., 19. vagy 20. év legalább egyikében, vagy ezek bármilyen kombinációjában, egyszeri, infúziós vagy ismételt dózis alkalmazásával.
- 59A belsőleg történő beadásra alkalmas adagolási alak (készítmény) általában körülbelül 0,1 mg és körülbelül 500 mg közötti mennyiségű hatóanyagot tartalmaz egységenként vagy tartályonként. Ezekben a gyógyászati készítményekben a hatóanyag rendszerint körülbelül 0,5-99,999 tömeg% mennyiségben lehet jelen a készítmény össztömege alapján.
Parenterális beadás esetében az ellenanyagot oldat, szuszpenzió, emulzió vagy liofilizált por formájában szerelhetjük ki, együtt vagy külön gyógyászatilag elfogadható parenterális hordozóeszköztől. Ilyen hordozóeszközök példái a víz, sóoldat, Ringer-oldat, dextróz oldat és 1-10% humán szérumalbumin. Liposzómákat és nemvizes hordozóeszközöket, mint például rögzített olajokat is alkalmazhatunk. A hordozóeszköz vagy liofilizált por tartalmazhat olyan adalékanyagokat, amelyek fenntartják az izotóniásságot (például nátrium-klorid, mannitol) és a kémiai stabilitást (például pufferek és tartósítószerek). A kiszereléseket ismert vagy megfelelő módszerekkel sterilizáljuk.
Megfelelő gyógyászati hordozókat ír le a Remington's Pharmaceutical Sciences” című könyv (A. Osol), amely a szakterületen alkalmazott szokásos kézikönyv.
Alternatív beadási módok
A találmány szerint sok ismert és kifejlesztett módot alkalmazhatunk legalább egy találmány szerinti anti-duális-integrin ellenanyag gyógyászatilag hatásos mennyiségeinek a beadására. Míg pulmonáris beadást alkalmazunk a következő leírásban, a beadás más módjait is alkalmazhatjuk megfelelő eredménnyel a találmány szerint. Találmány szerinti duális integrin ellenanyagokat bejuttathatunk hordozóban oldatként, emulzióként, kolloidként vagy szuszpenzióként, vagy száraz porként, bármilyen, inhalációs vagy más módon történő beadásra alkalmas különféle eszközök és eljárások alkalmazásával, amint azt feltárjuk a leírásban vagy ismert a szakterületen.
Parenterális kiszerelések és beadás
Parenterális beadásra szolgáló kiszerelések közönséges kötőanyagot, mint például steril vizet vagy sóoldatot, polialkán-glikolokat, mint például polietilén-glikolt, növényi eredetű olajokat, hidrogénezett naftaléneket és hasonlókat tartalmazhatnak. Injektálásra szolgáló vizes vagy olajos szuszpenziókat megfelelő emulgeálószer vagy nedvesítőszer és szuszpendáló ágens alkalmazásával állíthatunk elő ismert eljárások szerint. Injektálásra szolgáló ágensek lehetnek nem toxikus, nem orálisan beadható hígító ágensek, mint például vizes oldat vagy steril injektálható oldat vagy szuszpenzió egy oldószerben. Alkalmazható hordozóeszközként vagy oldószerként víz, Ringer-oldat, izotóniás sóoldat, stb. engedélyezett; szokványos oldószerként vagy szuszpendáló oldószerként steril nem illékony olajat alkalmazhatunk. Ezekre a célokra bármilyen típusú nem illékony olajat és zsírsavat
-60alkalmazhatunk, beleértve természetes vagy szintetikus vagy szemiszintetikus zsírolajokat vagy zsírsavakat, természetes vagy szintetikus vagy szemiszintetikus mono- vagy di- vagy triglicerideket. A parenterális beadás ismert a szakterületen, és magában foglalja nem korlátozó példaként az injekciók hagyományos formáit, gáznyomásos tűmentes injekciós eszközt, amint azt az 5 851 198. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat feltárja, és lézer perforátor eszközt, amint az 5 839 446. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat feltárja, amelyek teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik.
Alternatív bejuttatás
A találmány tárgyát képezi továbbá legalább egy anti-duális-integrin ellenanyag beadása parenterális, szubkután, intramuszkuláris, intravénás, intrartikuláris, intrabronchiális, intraabdominális, intrakapszuláris, intrakartilagiális, intrakavitális, intraceliális, intracelebelláris, intracerebroventrikuláris, intrakolikus, intracervikális, intragasztrikus intrahepatikus, intramiokardiális, intraoszteális, intrapelvikus, intraperikardiális, intraperitoneális, intrapleurális, intraprosztatikus, intrapulmonáris, intrarektális, intrarenális, intraretinális, intraspinális, intraszinoviális, intratoracikus, intrauterin, intravezikális, bólusz vaginális, rektális, bukkális, szublingvális, intranazális vagy transzdermális úton. Legalább egy anti-duális-integrin ellenanyag készítményt előállíthatunk parenterális (szubkután, intramuszkuláris vagy intravénás) beadásra, vagy bármilyen egyéb beadásra, előnyösen folyékony oldatok vagy szuszpenziók formájában; vaginális vagy rektális beadásra, előnyösen félszilárd formában, mint például nem korlátozó példaként krém vagy kúp formájában· bukkális vagy szublingvális beadásra, mint például nem korlátozó példaként tabletták vagy kapszulák formájában; vagy intranazális beadásra, mint például nem korlátozó példaként porok, orrcseppek vagy aeroszolok vagy bizonyos ágensek formájában; vagy transzdermális beadásra, mint például nem korlátozó példaként gél, kenőcs, lemosó, szuszpenzió vagy tapasz bejuttatási rendszer formájában, kémiai enhancerekkel, mint például dimetil-szulfoxiddal, hogy módosítsuk a bőr szerkezetét vagy hogy növeljük a drog koncentrációját a transzdermális tapaszban [Junginger és mtsai., „Drug Permeation Enhancement”, szerk.: Hsieh, D.S., 59-90. old., kiad.: Marcel Dekker, Inc. New York (1994), amely teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi], vagy oxidálószerekkel, amelyek lehetővé teszik fehérjéket és peptideket tartalmazó kiszerelések bőrre történő bejuttatását (WO 98/53847. számú nemzetközi közzétételi irat), vagy elektromos mezők alkalmazását, hogy tranziens transzport-útvonalat hozzunk létre, mint például elektroporációval, vagy hogy növeljük a feltöltött drogok mobilitását a bőrön keresztül, mint például iontoforézissel, vagy
- 61 ultrahang alkalmazását, mint például szonoforézissel (4 309 989. és 4 767 402 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok) (a fenti publikációk és szabadalmak teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik).
Pulmonáris/nazális beadás
Pulmonáris beadás esetén előnyösen legalább egy anti-duális-integrin ellenanyag készítményt bejuttatunk olyan méretű részecskékben, amelyek hatásosak a tüdő vagy a szinuszok alsó légutainak elérésére. A találmány szerint legalább egy anti-duális-integrin ellenanyagot bejuttathatunk a szakterületen terápiás ágens inhalációval történő bejuttatására ismert bármilyen inhalációs vagy nazális eszköz alkalmazásával. Aeroszolizált kiszereléseknek a páciens szinuszüregeibe vagy alveolusaiba történő bejuttatására képes ilyen eszközök közé tartoznak mért dózisú inhalátorok, nebulizátorok, szárazpor generátorok permetezők és hasonlók. Ellenanyagok pulmonáris vagy nazális beadását irányító más alkalmas eszközök szintén ismertek a szakterületen. Minden ilyen eszköz az ellenanyagnak aeroszolban történő eloszlatásával történő beadásra alkalmas kiszerelést alkalmaz. Ilyen aeroszolok vagy oldatokat (mind vizes, mind nem vizes), vagy szilárd részecskéket tartalmazhatnak. Mért dózisú inhalátorok, mint például a Ventolin® mért dózisú inhalátor tipikusan hajtógázt alkalmaznak, és meghajtást igényelnek a belégzés során (lásd például a WO 94/16970., WO 98/35888. számú nemzetközi közzétételi iratokat). A száraz poros inhalátorok, mint a Turbuhaler® (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), Spiros™ inhalátor (Dura), az Inhale Therapeutics által forgalmazott eszközök és a Spinhaler® poros inhalátor (Fisons), kevert pornak lélegzettel való meghajtását alkalmazzák [4 668 218. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (Astra), EP 237 507. számú európai szabadalmi irat (Astra), WO 97/25086. számú nemzetközi közzétételi irat (Glaxo), WO 94/08552. számú nemzetközi közzétételi irat (Dura), 5 458 135. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (Inhale), WO 94/06498, számú nemzetközi közzétételi irat (Fisons), amelyek teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik], Nebulizátorok, mint az AERx™Aradigm, az Ultravent® nebulizátor (Mallinckrodt) és az Acorn II® nebulizátor (Marquest Medical Products) (5 404 871. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat, Aradigm, WO 97/22376. számú nemzetközi közzétételi irat, amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi) aeroszolokat hoznak létre folyadékokból, míg a mért dózisú inhalátorok, száraz poros inhalátorok, stb. kis részecskeméretű aeroszolokat hoznak létre. A kereskedelmi forgalomban kapható inhalációs eszközök ezen specifikus példáit csak a találmány gyakorlatba vételére alkalmas specifikus eszközök reprezentációjának szánjuk, és nem a találmány oltalmi körét korlátozónak.
- 62Előnyösen a legalább egy anti-duális-integrin ellenanyagot tartalmazó készítményt száraz poros inhalátorral vagy permetezővel juttatjuk be. A találmány szerinti legalább egy ellenanyag beadására szolgáló inhalációs eszköznek számos kívánatos tulajdonsága van. Például az inhalációs eszköz általi bejuttatás előnyösen megbízható, reprodukálható és pontos. Az inhalációs eszköz adott esetben kis száraz részecskéket juttathat be, például kisebb, mint körülbelül 10 pm, előnyösen körülbelül 1-5 pm, a jó lélegezhetőség érdekében.
Duális integrin ellenanyag készítmények beadása sprayként
Duális integrin ellenanyag-készítmény fehérjét tartalmazó sprayt előállíthatunk legalább egy anti-duális-integrin ellenanyagot tartalmazó szuszpenzió vagy oldat fuvókán keresztül nyomás alatt történő átpréselésével. A fúvóka méretét és konfigurációját, az alkalmazott nyomást és a folyadék adagolási sebességét úgy választhatjuk meg, hogy a kívánt kimenetet és részecskeméretet kapjuk. Elekrtosprayt állíthatunk elő például kapillárison vagy fúvókán keresztüli áramlattal kapcsolatban lévő elektromos mezővel. Előnyösen a porlasztóval bejuttatott, legalább egy anti-duális-integrin ellenanyag készítmény részecskéinek a részecskemérete kisebb, mint körülbelül 10 pm, előnyösen a körülbelül 1 pm és körülbelül 5 pm közötti tartományban van, és legelőnyösebben körülbelül 2 pm és körülbelül 3 pm közötti.
A porlasztóval történő alkalmazásra megfelelő legalább egy anti-duális-integrin ellenanyag-készítmény fehérje kiszerelései vizes oldatban lévő ellenanyag-készítmény fehérjét tartalmaznak az oldat ml-eiként vagy g-jaiként a legalább egy anti-duális-integrin ellenanyag készítmény körülbelül 0,1 mg és körülbelül 100 mg közötti koncentrációjában, vagy bármilyen tartomány vagy érték ezek között, például nem korlátozó példaként 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 vagy 100 mg/ml vagy mg/g koncentrációban. A kiszerelés tartalmazhat ágenseket, mint például kötőszert, puffért, izotóniás ágenst, tartósítószert felületaktív anyagot és — előnyösen — cinket. A kiszerelés tartalmazhat az ellenanyag-készítmény fehérje stabilizálására szolgáló kötőszert vagy ágenst is, mint például puffért, redukálószert, fehérjét vagy szénhidrátot. Ellenanyag-készítmények kiszerelésében alkalmazható fehérjék közé tartozik az albumin, protamin vagy hasonlók. Ellenanyag-készítmény fehérjék kiszerelésében alkalmazható tipikus szénhidrátok közé tartozik a szukróz, mannitol, laktóz, trehalóz, glükóz vagy hasonlók. Az ellenanyagkészítmény fehérjekiszerelés tartalmazhat felületaktív anyagot is, amely csökkentheti vagy megelőzheti az ellenanyag-készítmény fehérje felszíni aggregációját, amelyet az oldatnak az aeroszol létrehozása során bekövetkező atomizációja okoz. Különféle hagyományos • 1 ·· >·♦» • · * ~ ® - 63 felületaktív anyagokat alkalmazhatunk, mint például polioxietilén-zsírsav-észtereket és -alkoholokat, és polioxietilén-szorbitol-zsírsav-észtereket. A mennyiségük általában a 0,001 és 14 tömeg% közötti tartományba eshet. Különösen előnyös felületaktív anyag a találmány szerinti alkalmazásra a polioxietilén-monooleát, poliszorbát 80, poliszorbát 20 vagy hasonlók. Fehérje, mint például duális integrin ellenanyagok vagy azok meghatározott részletei vagy variánsai kiszerelésének a szakterületén ismert további ágensek is alkalmazhatók a kiszerelésben.
Duális integrin ellenanyag-készítmények beadása nebulizátorral
Ellenanyag-készítmény fehérjét beadhatunk nebulizátorral, mint például sugárhajtású nebulizátorral vagy ultrahangos nebulizátorral. Tipikusan egy sugárhajtású nebulizátorban kompresszált-levegő-forrást alkalmazunk nyíláson keresztül kilépő nagysebességű levegősugár létrehozására. Ahogyan a gáz kitágul a fúvóka után, alacsony nyomású régió jön létre, ami ellenanyag-készítmény fehérje oldatát átszívja a folyadéktartályhoz kapcsolódó kapilláriscsövön. A kapilláriscsőből kilépő folyadékáram instabil szálakká és cseppekké nyíródik szét, aeroszolt hozva létre. Különféle konfigurációkat, áramlási sebességeket és terelőtípusokat alkalmazhatunk egy adott sugárhajtású nebulizátor kívánt teljesítményi jellemzőinek eléréséhez. Ultrahangos nebulizátorban magas frekvenciájú elektromos energiát alkalmazunk mechanikus rezgési energia létrehozására, tipikusan piezoelektromos transzduktor alkalmazásával. Ezt az energiát visszük át az ellenanyag-készítmény fehérjekiszerelésre akár közvetlenül, akár kapcsolófolyadékon keresztül, az ellenanyagkészítmény fehérjét tartalmazó aeroszolt hozva létre. Előnyösen a nebulizátorral bejuttatott ellenanyag-készítmény fehérje részecskéinek a részecskemérete kisebb, mint körülbelül 10 pm, előnyösen a körülbelül 1 pm és körülbelül 5 pm közötti tartományban van, és legelőnyösebben körülbelül 2 pm és körülbelül 3 pm közötti.
A nebulizátorral - akár sugárhajtású, akár ultrahangos — történő alkalmazásra megfelelő legalább egy anti-duális-integrin ellenanyag kiszerelései tipikusan az oldat miéiként a legalább egy anti-duális-integrin ellenanyag-készítmény fehérjét tartalmaznak körülbelül 0,1 mg és körülbelül 100 mg közötti koncentrációban. A kiszerelés tartalmazhat ágenseket, mint például kötőszert, puffért, izotóniás ágenst, tartósítószert felületaktív anyagot és — előnyösen — cinket. A kiszerelés tartalmazhat a legalább egy anti-duális-integrin ellenanyag-készítmény fehérje stabilizálására szolgáló kötőszert vagy ágenst is, mint például puffért, redukálószert, fehérjét vagy szénhidrátot. A legalább egy anti-duális-integrin ellenanyag-készítmény kiszerelésében alkalmazható fehérjék közé tartozik az albumin, protamin vagy hasonlók. A legalább egy anti-duális-integrin ellenanyag-kiszerelésében
-64alkalmazható tipikus szénhidrátok közé tartozik a szukróz, mannitol, laktóz, trehalóz, glükóz vagy hasonlók. A legalább egy anti-duális-integrin ellenanyag-kiszerelés tartalmazhat felületaktív anyagot is, amely csökkentheti vagy megelőzheti a legalább egy anti-duálisintegrin ellenanyag felszíni aggregációját, amelyet az oldatnak az aeroszol létrehozása során bekövetkező atomizációja okoz. Különféle hagyományos felületaktív anyagokat alkalmazhatunk, mint például polioxietilén-zsírsav-észtereket és -alkoholokat, és polioxietilénszorbitol-zsírsav-észtereket. A mennyiségük általában a 0,001 és 4 tömeg% közötti tartományba eshet. Különösen előnyös felületaktív anyag a találmány szerinti alkalmazásra a polioxietilén-monooleát, poliszorbát 80, poliszorbát 20 vagy hasonlók. Fehérje, mint például ellenanyag fehérje kiszerelésének a szakterületén ismert további ágensek is alkalmazhatók a kiszerelésben.
Duális integrin ellenanyag-készítmények beadása mért dózisú inhalátorral
Mért dózisú inhalátorban (MDI) hajtógáz, legalább egy anti-duális-integrin ellenanyag, és bármilyen kötőszer vagy egyéb adalékanyag található fémdobozban, cseppfolyósított kompresszált gázt tartalmazó keverékként. A mérőszelep beindítása a keveréket aeroszolként szabadítja fel, amely előnyösen kisebb, mint körülbelül 10 pm, előnyösen a körülbelül 1 pm és körülbelül 5 pm közötti tartományban van, és legelőnyösebben körülbelül 2 pm és körülbelül 3 pm közötti méretű részecskéket tartalmaz. A kívánt aeroszol részecskeméretet előállíthatjuk szakember számára ismert különféle módokon — mint például „jet-milling”, spray-szárítás, kritikus ponti kondenzáció vagy hasonlók — előállított ellenanyag-készítmény fehérjekiszerelés alkalmazásával. Előnyös mért dózisú inhalátorok közé tartoznak a 3M és Glaxo által gyártottak, amelyekben hidrofluorokarbon hajtógázt alkalmaznak.
A legalább egy anti-duális-integrin ellenanyag mért dózisú inhalátor eszközzel történő alkalmazására szolgáló kiszerelései általában finom eloszlású port tartalmazhatnak, amely legalább egy anti-duális-integrin ellenanyagot tartalmaz szuszpenzióként nem vizes közegben, például felszuszpendálva a hajtógázban felületaktív anyag segítségével. A hajtógáz lehet bármilyen erre a célra hagyományosan alkalmazott anyag, mint például klorofluorokarbon, hidroklorofluorokarbon, hidrofluorokarbon vagy szénhidrogén, beleértve triklorofluorometánt, diklorodifluorometánt, diklorotetrafluoroetanolt és 1,1,1,2-tetrafluoroetánt, HFA134a-t (hidrofluroalkán-134a), HFA-227-et (hidrofluroalkán-227), vagy hasonlókat. Előnyösen a hajtógáz hidrofluorokarbon. A felületaktív anyagot úgy választhatjuk meg, hogy stabilizálja a hajtógáz-szuszpenzióban a legalább egy anti-duális-integrin ellenanyagot, védje a hatóanyagot a kémiai degradációval szemben, és hasonlók. Alkalmas felületaktív anyagok
- 65 - ” * közé tartozik a szorbitán-trioleát, szójalecitin, olajsav vagy hasonlók. Bizonyos esetekben oldat aeroszolok előnyösek, oldószerként például etanol alkalmazásával. Fehérje, mint például ellenanyag-fehérje kiszerelésének a szakterületén ismert további ágensek is alkalmazhatók a kiszerelésben.
Átlagos képességű szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti eljárásokat megvalósíthatjuk legalább egy anti-duális-integrin ellenanyagnak a leírásban nem feltárt eszközzel történő pulmonáris beadásával is.
Orális kiszerelések és beadás
Orális beadásra szolgáló kiszerelések olyan adjuvánsok (például rezorcinolok és nemionos felületaktív anyagok, mint például polioxietilén-oleil-éter és n-hexadecil-polietilénéter) együttes beadásán alapulnak, amelyek mesterségesen növelik a bélrendszer falának a permeabilitását, valamint olyan enziminhibitorok [például hasnyálmirigy tripszin inhibitorok, diizopropil-fluorofoszfát (DFP) és trazilol] együttes beadásán alapulnak, amelyek gátolják az enzimatikus degradációt. Orális beadásra szolgáló szilárd adagolási forma hatóanyagkomponensét összekeverhetjük legalább egy adalékanyaggal, mint például szukrózzal, laktózzal, cellulózzal, mannitollal, trehalózzal, raffinózzal, maltitollal, dextránnal, keményítőkkel, agarral, arginátokkal, kitinekkel, kitozánokkal, pektinekkel, tragakant gumival, gumiarábikummal, zselatinnal, kollagénnel, kazeinnel, albuminnal, szintetikus vagy szemiszintetikus polimerekkel és gliceridekkel. Ezek az adagolási formák tartalmazhatnak más típusú adalékanyagokat is, például inaktív hígító ágenseket, kenőanyagokat, mint például magnézium-sztearátot, parabént, tartósító ágenseket, mint például szorbinsavat, aszkorbinsavat, alfa-tokoferolt, antioxidánst, mint például ciszteint, bomlasztószert, kötőanyagot, pufferelő ágenst, édesítőszert, ízesítőszert, illatosító szert, stb.
Tablettákat és pirulákat továbbalakíthatunk enterikus bevonatú készítményekké. Az orális beadásra szolgáló folyékony készítmények közé tartoznak a gyógyászati alkalmazásra engedélyezhető emulzió, szirup, elixir, szuszpenzió és oldat készítmények. Ezek a készítmények a szakterületen rendszeresen alkalmazott inaktív hígító ágenseket tartalmazhatnak, mint például vizet. Liposzómákat is leírtak drogszállító rendszerként inzulin és heparin esetében (4 239 754. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat). Újabban kevert aminosavak mesterséges polimerjeiből (proteinoid) készült mikrogömböket is alkalmaztak gyógyászati készítmények bejuttatására (4 925 673. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat). Ezenkívül az 5 879 681. és 5 871 753. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokban feltárt hordozóvegyületeket is alkalmazzák biológiailag aktív ágensek orális bejuttatására.
-66Mukózális kiszerelések és beadás
A nyálkahártyái felszíneken keresztül történő abszorpció esetében a legalább egy antiduális-integrin ellenanyag beadására szolgáló készítmények és eljárások tartalmazhatnak olyan emulziót, amely sok szubmikron részecskét, mukoadhezív makromolekulát, bioaktív pepiidet, és egy összefüggő vizes fázist tartalmaz, ami elősegíti a nyálkahártya-felszíneken keresztül történő abszorpciót, az emulzió részecskéinek mukoadhéziójának elérésével (5 514 670. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat). A találmány szerinti emulziók felvitelére alkalmas nyálkahártya-felszínek lehetnek szaruhártyai, kötőhártyai, bukkális, szublingvális, nazális, vaginális, pulmonáris, gyomorbeli, intesztinális és rektális beadási utak. Vaginális vagy rektális beadásra szolgáló kiszerelések, például kúpok tartalmazhatnak kötőszereket, például polialkán-glikolokat, vazelint, kakaóvajat és hasonlókat. Intranazális beadásra szolgáló kiszerelések lehetnek szilárdak, és kötőszert tartalmazhatnak, mint például laktózt, vagy lehetnek vizes vagy olajos orrcseppek. Bukkális beadás esetén a kötőszerek lehetnek cukrok, kalcium-sztearát, magnézium-sztearát, előre zselatinizált keményítő és hasonlók (5 849 695. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat).
Transzdermális kiszerelések és beadás
Transzdermális beadás esetében a legalább egy anti-duális-integrin ellenanyagot szállítóeszközbe, mint például liposzómába vagy polimer nanorészecskékbe, mikrorészecskébe, mikrokapszulába vagy mikrogömbökbe (amelyeket együttesen mikrorészecskéknek nevezünk, amennyiben másképp nem jelezzük) burkoljuk be. Számos alkalmas eszköz ismert, például szintetikus polimerekből, mint például polihidroxi-savakból, mint például poli-tejsavból, poliglikolsavból és azok kopolimerjeiből, poliortoészterekből, polianhidridekből és polifoszfazénekből, és természetes polimerekből, mint például kollagénből, poli-aminosavakból, albuminból és egyéb fehérjékből, alginátból és egyéb poliszacharidokból, és ezek kombinációiból készített mikrorészecskék (5 814 599. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat).
Tartós beadás és kiszerelések
Bizonyos esetekben kívánatos lehet a találmány szerinti vegyületeket hosszan tartó időszakon keresztül beadni az alanynak, például egy beadásból egy hét és egy év közötti időtartam alatt. Különféle lassú felszabadulású, depó és implantátum formákat alkalmazhatunk. Például egy adagolási forma tartalmazhatja a vegyület gyógyászatilag elfogadható nem toxikus sóját, amelynek alacsony az oldhatósága a testfolyadékokban, például (a) savaddíciós só polibázisos savval, mint például foszforsavval, kénsavval, citromsavval,
- 67 borkősawal, csersavval, pamoinsavval, algasavval, poliglutaminsavval, naftalén-mono- vagy diszulfonsavval, poligalakturonsavval és hasonlókkal; (b) polivalens fémkation sója, mint például cink, kalcium, bizmut, bárium, magnézium, alumínium, réz, kobalt, nikkel, kadmium és hasonlók, vagy szerves kation sója, például Ν,Ν’-dibenzil-etiléndiamin vagy etiléndiamin; vagy (c) (a) és (b) kombinációi, mint például cink csersav sója. Ezenkívül a találmány szerinti vegyületeket — vagy előnyösen — egy előbb ismertetett viszonylag oldhatatlan sót kiszerelhetünk gélben, például alumínium-monosztearát gélben, például injektálásra alkalmas szezámolajjal. Különösen előnyös sók a cink sók, cink csersav sók, pamoát sók és hasonlók. Az injektálásra szolgáló lassú felszabadulású depó kiszerelések egy másik típusa a vegyületet vagy sót diszpergálva tartalmazná lassan degradálódó, nem toxikus, nem antigénhatású polimerben, mint például polilakát/poliglikolát polimerben, például ahogyan a 3 773 919. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat feltárja. A vegyületeket vagy — előnyösen — a feltárt viszonylag oldhatatlan sókat szilasztikus koleszterin pelletben is kiszerelhetjük, különösen állati alkalmazásra. További lassú felszabadulású, depó vagy implantátum kiszerelések, például gáz vagy folyadék liposzómák ismertek a szakirodalomban [5 770 222. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat és „Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems”, szerk.: J. R. Robinson, kiad.: Marcel Dekker, Inc., N. Y. (1978)].
A találmány általános ismertetését követően az könnyebben is érthető lesz a következő példákra való hivatkozással, amelyeket a szemléltetés érdekében mutatunk be, és nem tekintjük azokat korlátozónak.
1. példa: Duális integrin ellenanyag klónozása és expresszáltatása emlős sejtekben
Egy tipikus emlős expressziós vektor legalább egy promoter elemet tartalmaz, amely irányítja az mRNS-nek, az ellenanyag kódoló szekvenciájának és a transzkripció terminációjához és a transzkriptum poliadenilációjához szükséges szignálok transzkripciójának az iniciációját. További elemek közé tartoznak enhancerek, Kozák-szekvenciák, és RNSsplicing-re szolgáló donor és akceptor helyekkel szegélyezett közbenső szekvenciák. Nagyon hatékony transzkripciót érhetünk el az SV40-ből származó korai és késői promóterekkel, a retrovírusok, például RSV, HTLVI, HIVI hosszú terminális ismétlődéseivel (LTR) és a citomegalovírus (CMV) korai promóterével. Azonban sejtbeli elemeket is alkalmazhatunk (például a humán aktin-promótert). Megfelelő expressziós vektorok a találmány gyakorlatba vételéhez például olyan vektorok, mint a pIRESlneo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN vagy pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, CA), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-) vagy
- 68 pcDNA3.1/Hygro (+/-) (Invitrogen), PSVL és PMSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) és pBC12MI (ATCC 67109). Az alkalmazható emlős gazdasejtek közé tartoznak a humán Hela 293, H9 és Jurkat sejtek, egér NIH3T3 és C127 sejtek, Cos 1, Cos 7 és CV 1, fúrj QC1-3 sejtek, egér L sejtek és kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtek.
Más megoldásképpen a gént stabil sejtvonalakban is expresszáltathatjuk, amelyek tartalmazzák a gént a kromoszómába integrálódva. Együttes transzfektálás szelektálható markerrel — mint például dhfr, gpt, neomicin vagy higromicin — lehetővé teszi a transzfektált sejtek azonosítását és izolálását.
A transzfektált géneket amplifikálhatjuk is, hogy a kódolt ellenanyag nagy mennyiségét expresszáltassuk. A DHFR (dihidrofolát-reduktáz) marker alkalmazható olyan sejtvonalak kifejlesztésére, amelyek a jelentőséggel bíró gén több száz vagy több ezer példányát hordozzák. Egy másik alkalmazható szelekciós marker a glutamin-szintáz (GS) enzim [Murphy és mtsai., Biochem. J. 227, 277-279. old. (1991); Bebbington és mtsai., Bio/Technology 10, 169-175. old. (1992)]. Ezeknek a markereknek az alkalmazásával az emlőssejteket szelektív tápközegben tenyésztjük, és legmagasabb rezisztenciájú sejteket szelektáljuk ki. Ezek a sejtvonalak az amplifikált gént a kromoszómába integrálódva tartalmazzák. Kínai hörcsög petefészek (CHO) és NSO sejteket gyakran alkalmaznak ellenanyagok termeltetésére.
A pCl és pC4 expressziós vektorok a Rous Sarcoma Virus erős promóterét (LTR) tartalmazzák [Cullen és mtsai., Molec. Cell. Bioi. 5, 438-447. old. (1985)] és a CMVenhancer egy fragmensét [Boshart és mtsai., Cell 41, 521-530. old. (1985)]. Többszörös klónozó helyek, például a BamHI, Xbal és Asp718 helyeket tartalmazók elősegítik a jelentőséggel bíró gén klónozását. A vektorok ezenfelül tartalmazzák a patkány preproinzulin génjének a 3’ intronját, poliadenilációs és terminációs szignálját.
Klónozás és expresszáltatás CHO sejtekben
A pC4 vektort alkalmazzuk duális integrin ellenanyag expresszáltatására. A pC4 plazmid a pSV2-dhfr (ATCC elérési szám: 37146) származéka. A plazmid tartalmazza az egér DHFR génjét az SV40 korai promóterének a szabályozása alatt. Kínai hörcsög petefészek sejtek, vagy más, dihidrofolát aktivitás nélküli sejtek, amelyek transzfektálva vannak ezekkel a plazmidokkal, szelektálhatok a sejteknek metotrexát kemoterápiás szerrel kiegészített szelektív tápközegen (például alfa mínusz MEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD) történő tenyésztésével. A DHFR gének amplifikációját metotrexátra (MTX) rezisztens sejtekben részletesen dokumentálták [lásd például F. W. Alt és mtsai., J. Bioi. Chem. 253,
-691357-1370. old. (1978); J. L. Hamlin és C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097, 107-143. old. (1990); és M. J. Page és M. A. Sydenham, Biotechnology 9, 64-68. old. (1991)]. Növekvő koncentrációjú MTX-en tenyésztett sejtekben rezisztencia alakul a drogra a célenzim, a DHFR túltermelése mellett, a DHFR gén amplifikációja eredményeképpen. Ha egy másik gén is kapcsolódik a DHFR génhez, akkor általában az is együtt amplifikálódik és túltermelődik. Ismert a szakterületen, hogy ez a megközelítési mód alkalmazható az amplifikált gén(ek) több mint 1000 példányát hordozó sejtvonalak kifejlesztésére. Azt követően — amikor a metotrexátot elvonjuk — olyan sejtvonalakat kapunk, amelyek tartalmazzák az amplifikált gént a gazdasejt egy vagy több kromoszómájába integrálódva.
A pC4 plazmid a jelentőséggel bíró gén expresszáltatásához tartalmazza a Rous Sarcoma Vírus hosszú terminális ismétlődésének (LTR) az erős promóterét [Cullen és mtsai., Molec. Cell. Bioi. 5, 438-447. old. (1985)], és egy izolált fragmenst a humán citomegalovírus (CMV) azonnali korai génjének az enhanceréből Boshart és mtsai., Cell 41, 521-530, old. (1985)]. A promótertől leolvasással megegyező irányban BamHI, Xbal és Asp718 restrikciós enzim helyek találhatók, amelyek lehetővé teszik a gének integrálását. Ezek mögött a klónozó helyek mögött a plazmid a patkány preproinzulin génjének a 3’ intronját és poliadenilációs helyét tartalmazza. Más nagyon hatékony promótereket is alkalmazhatunk az expresszáltatásra, mint például a humán β-aktin promótert, az SV40 korai vagy késői promóterét, vagy a hosszú terminális ismétlődéseket más retrovírusokból, például HIV-ből és HTLVI-ből. A Clontech Tet-Off és Tet-On génexpressziós rendszerei és hasonló expressziós rendszerek is alkalmazhatók duális integrin szabályozott expresszáltatására emlős sejtekben [M. Gossen ésH. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-5551. old. (1992)]. Az mRNS poliadenilálására más szignálokat, például a humán növekedési hormon génből vagy globin génekből származókat is alkalmazhatunk. A jelentőséggel bíró gént a kromoszómákba integrálódva hordozó stabil sejtvonalakat kiszelektálhatunk szelektálható markerrel, mint például gpt-vel, G418-cal vagy higromicinnel történő együtt transzfektálást követően. Előnyös kezdetben egynél több szelektálható markert alkalmazni, például G418-at és metotrexátot.
A pC4 plazmidot restrikciós enzimekkel emésztjük, és azután defoszforiláljuk borjú intesztinális foszfatázzal a szakterületen ismert eljárások alkalmazásával. A vektort azután 1%-os agarózgélből izoláljuk.
A duális integrin ellenanyag teljes szekvenciáját kódoló DNS-szekvenciát alkalmazzuk ismert eljárási lépések szerint, amelyek sorrendben megfelelnek egy találmány szerinti duális integrin ellenanyag HC és LC variábilis régiójának. Megfelelő humán állandó
- 70 - --.
régiókat (azaz HC és LC régiókat) kódoló izolált nukleinsavakat is alkalmazunk ebben a konstrukcióban.
A variábilis és állandó régiót kódoló izolált DNS-t és a defoszforilált vektort azután T4 DNS-ligázzal összeligáljuk. Azután E. coli HB 101 vagy XL-1 Blue sejteket transzformálunk, és olyan baktériumokat azonosítunk például restrikciós enzimes elemzés alkalmazásával, amelyek tartalmazzák a fragmenst a pC4 plazmidba inzertálva.
Aktív DHFR gént nem tartalmazó kínai hörcsög petefészek (CHO) sejteket alkalmazunk a transzfektáláshoz. A pC4 expressziós plazmid 5 pg-ját együtt transzfektáljuk 0,5 pg pSV2-neo plazmiddal lipofektin alkalmazásával. A pSV2neo plazmid egy domináns szelektálható markert tartalmaz, a Tn5 neo génjét, amely antibiotikumok egy csoportjára, köztük a G418-ra való rezisztenciát okoz. A sejteket 1 pg/ml G418-cal kiegészített alfa mínusz MÉM tápközegre oltjuk le. Két nap múlva a sejteket tripszinizáljuk, és leoltjuk hibridóma klónozó lemezekre (Greiner, Germany) 10, 25 vagy 50 ng/ml metotrexáttal és 1 pg/ml G418-cal kiegészített alfa mínusz MÉM tápközegben. Körülbelül 10-14 nap elteltével egyedi kiónokat tripszinizálunk, és azután leoltjuk azokat 6-mérőhelyes csészékre vagy 10 ml-es edényekbe metotrexát különböző koncentrációinak (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM) az alkalmazásával. A metotrexát legmagasabb koncentrációján növekvő kiónokat azután átvisszük új 6-mérőhelyes lemezekre, amelyek metotrexát még magasabb koncentrációját (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM) tartalmazzák. Ugyanezt az eljárást ismételjük addig, amíg olyan kiónokat állítunk elő, amelyek növekednek 100-200 mM koncentráción. Elemezzük a kívánt gén expresszióját, például SDS-PAGE és Western-blot vagy fordított fázisú HPLC elemzéssel.
2. példa: Teljesen humán duális integrin ellenanyag nem korlátozó példájának előállítására és jellemzésére szolgáló eljárás
Összefoglalás
A nehézlánc és könnyülánc humán variábilis és állandó régió ellenanyag-transzgénjeit tartalmazó (CBA/J x C57/BL6/J) F2 hibrid egereket immunizáltunk humán placentális ανβ3mal [Taylor és mtsai., Inti. Immunoi. 6, 579-591. old. (1993); Lonberg és mtsai., Nature 368, 856-859. old. (1994); Neuberger, M., Nature Biotech. 14, 826, old. (1996); Fishwild és mtsai., Nature Biotechnology 14, 845-851. old. (1996)]. Egy fúzió 2 teljesen humán, ανβ3-νβΙ reagáló IgGlK monoklonális ellenanyagot eredményezett, amelyeket GenO.95-nek és GenO. 101-nek neveztünk. A teljesen humán anti-avp3 ellenanyagokat tovább jellemeztük, és mindkettőről azt találtuk, hogy reagálnak az ανβ3 és ανβ5 heterodimerekkel, azt sugallva, hogy a mindkét
- 71 molekulában megtalálható alfa-láncra specifikusak. Egy monoklonális ellenanyag, a GenO.95, amit CNTO95 néven is ismerünk, gátolja mind az ανβ3, mind az ανβ5 kötődését vitronektinhez sejtalapú vizsgálati eljárásokban.
Rövidítések
BSA - marhaszérum-albumin
CO2 - szén-dioxid
DMSO - dimetil-szulfoxid
EIA - enzimes immunológiai vizsgálati eljárás
FBS - magzati marhaszérum
H2O2 - hidrogén-peroxid
HC - nehézlánc
HRP - tormaperoxidáz lg - immunglobulin
IP - intraperitoneális
IV - intravénás
Mab - monoklonális ellenanyag
OD - optikai denzitás
OPD - o-feniléndiamin dihidroklorid
PEG - polietilén-glikol
PSA - penicillin, sztreptomicin, amfotericin
RT - szobahőmérséklet
SQ - szubkután
TBS - Tris-pufferelt sóoldat v/v - térfogat/térfogat w/v - tömeg/térfogat
Bevezetés
Humán nehézlánc és könnyülánc immunglobulin géneket tartalmazó transzgenikus egereket alkalmaztunk αν-integrinekre specifikus teljesen humán monoklonális ellenanyagok előállítására. Ezeket az új ellenanyagokat terápiásán alkalmazhatjuk az angiogenezis folyamat gátlására az αν-integrineknek a megfelelő ECM ligandumjaikhoz való kötődésének blokkolásával, további eszközt biztosítva különféle rákok kezelésében.
-72Anyagok és eljárások
Állatok
Humán immunglobulinokat igen, de egér IgM-et vagy IgK-t nem expresszáló transzgénikus egereket fejlesztettek ki a GenPharm International cégnél. Ezek a transzgénikus egerek V(D)J kapcsoláson, nehézlánc osztályváltozásán és szomatikus mutációkon keresztülmenő humán szekvenciájú transzgéneket tartalmaznak, humán szekvenciájú immunglobulinok készletét hozva létre [Taylor és mtsai., International Immunology 6, 579591. old. (1993)]. A könnyülánc transzgén részben élesztő mesterséges kromoszómáról származik, amely tartalmazza a csíravonalbeli humán VK-régiónak majdnem a felét. A számos VH gén mellett a nehézlánc (HC) transzgén mind humán μ, mind humán γΐ [Lonberg és mtsai., Nature 368, 856-859. old. (1994)] és/vagy γ3 állandó régiókat kódolhat. A HC012 genotípusos leszármazási vonalból származó egeret alkalmaztunk az immunizációs és fúziós eljárásban ezen monoklonális ellenanyagok előállítására.
Humán ανβ3 tisztítása avp3-t expresszáló humán placentát (húsdarálóval feltárva) vagy M21 humán melanoma sejteket extraháltunk 20 mM Tris pH 7,5, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, 100 mM oktiltioglukozid (OTG, Pierce), 0,05% nátrium-azid és 1 mM fenilmetilszulfonil-fluorid (Sigma) puffért tartalmazó sóoldattal. A keveréket 1 órán keresztül kevertettük szobahőmérsékleten, és centrifugál ássál feltisztítottuk 10000 g-n. A placentáris extraktum felülúszóját affmitási oszlopra vittük fel, amely Sepharose-hoz (Pharmacia) kötött 10E5 monoklonális ellenanyagot tartalmazott, hogy eltávolítsuk a GPIIb/IIIa-t, és az átfolyó frakciót felvittük Sepharose-hoz (Pharmacia) kötött c7E3 monoklonális ellenanyag Fab-t tartalmazó affmitási oszlopra az ανβ3 megkötése végett. A c7E3 oszlopot 1 mM CaCl2-t, 1 mM MnCl2-t és 0,1% OTG-t tartalmazó PBS-sel mostuk, majd 0,1 M nátrium-acetát, pH 4,5, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2 és 0,1% OTG, pH 3,0 pufferrel. Az oszlopot 0,1 M glicin, 2% ecetsav, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2 és 0,1% OTG pufferrel eluáltuk. A tisztított ανβ3-ί tartalmazó eluátumot 2 M Tris, pH 8,5 puffer alkalmazásával semlegesítettük. A készítmények tisztaságát SDS-PAGE elemzéssel és ELISA-val jellemeztük, hogy kizárjuk a GPIIb/IIIa szennyeződés jelenlétét [Wayner és mtsai., J. Cell Bioi. 113, 919-929, old. (1991)]. Immunizációk
Egy, a GenPharm cégtől beszerzett, 15-17 hetes, műtéti úton ivartalanított hím egeret immunizáltunk IP (200 μΐ), és két helyen SQ (100 μΐ helyenként) összesen 20 μg placentáris ανβ3-νε1 (V. frakció, JG21197), amelyet azonos térfogatú komplett Freund-féle adjuvánsban emulgeáltunk (0. nap). Az egeret két héttel később azonos módon immunizáltuk ανβ3-νε1,
- 73 amelyet azonos térfogatú inkomplett Freund-féle adjuvánsban emulgeáltunk. Három további, 10 pg IP/10 pg SQ injekciót adtunk inkomplett Freund-féle adjuvánsban a 28., 42. és 56. napon. Az egeret a 42. és 56. napon véreztettük retro-orbitális szúrással, véralvadás elleni szer nélkül. Egy órán keresztül hagytuk a vért megalvadni szobahőmérsékleten, és a szérumot összegyűjtöttük és titráltuk szilárdfázisú ανβ3 EIA vizsgálati eljárás alkalmazásával. A GenO jelű fúziót akkor hajtottuk végre, amikor az injekciók már nem okozták a titer növekedését. Ekkor az ανβ3 elleni 1:1280 specifikus humán IgG titerű egérnek egy utolsó IV megerősítő injekciót adtunk, 10 pg ανβ3-νε1 100 pl fiziológiás sóoldatban hígítva. Három nappal később az egeret eutanizáltuk a nyak kitekerésével, a lépet aszeptikusán eltávolítottuk, és 10 ml hideg foszfát-pufferelt sóoldatba (PBS) tettük, amely 100 U/ml penicillint, 100 pg/ml sztreptomicint és 0,25 pg/ml amfotericin B-t (PSA) tartalmazott. A lépsejteket sterilen begyűjtöttük a lépnek PSA-PBS-sel történő perfúziójával. A sejteket egyszer megmostuk hideg PSA-PBS-sel, megszámoltuk tripánkék festékkizárás alkalmazásával, és újra felszuszpendáltuk 25 mM Hepes-t tartalmazó RPMI 1640 tápközegben.
Sejtvonalak
A nem szekretáló SP2/0 egér mielóma fúziós partner 1993. szeptember 1-én érkezett be a Cell Biology Services (CBS) csoporthoz. A sejtvonalat felszaporítottuk (módosított) aMEM tápközegben (JRH Biosciences), amely ki volt egészítve 10% (v/v) FBS-sel (Cell Culture Labs), 1 mM nátrium-piruváttal, 0,1 mM NEAA-val, 2 mM L-glutaminnal (mindegyik JRH Biosciences), és fagyasztva tartósítottuk 95% FBS-ben és 5% DMSO-ban (Sigma), majd gőzfázisú folyékony nitrogén fagyasztóban tároltuk a CBS-nél. A sejtbank steril volt (Quality Control Centocor, Malvern), és mentes mikoplazmától (Bionique Laboratories). A sejteket log-fázisú tenyészetben tartottuk a fúzióig. PBS-sel mostuk azokat, megszámoltuk, és meghatároztuk az életképességüket (>95%) tripánkék festékkizárás alkalmazásával a fúziót megelőzően.
Az M21, ανββΉΐ és ανβ5-0ί expresszáló humán mealnóma sejtvonalat felszaporítottuk és fagyasztva tartósítottuk. A 10-fiolás kutatási sejtbank a Cell Biology Services csoporthoz érkezett, és folyékony nitrogénen tároltuk. A sejtbank steril volt, és mentes mikoplazmától (Bionique Laboratories). Az ανβ3 integrint expresszáló MDAMB435L2 humán emlőkarcinóma sejtvonal Dr. Janet Price (MD Anderson, Houston TX) ajándéka volt. A sejtvonalat fagyasztva tartósítottuk a Cell Biology Services csoportnál. A sejtbank steril volt, és mentes mikoplazmától (Bionique Laboratories). Az M21 és MDAMB435L2 sejteket felolvasztottuk, megfelelő tápközegben tenyésztettük, és log-fázisban tartottuk több napon
- 74keresztül a biológiai vizsgálati eljárásokban történő alkalmazást megelőzően, vagy hagytuk a konfluencia elérését, ανβ3 fehérje tisztításában történő alkalmazásra (M2I cells).
Sejtfúzió
A fúziót 1:1 arányban lévő egér mielóma sejtek (SP2/0) és életképes lépsejtek alkalmazásával hajtottuk végre. Röviden, lépsejteket és mielóma sejteket együtt csapadékba vittünk. A csapadékot azután lassan újra felszuszpendáltuk — 30 másodperc alatt — 1 ml 50% (w/v) PEG/PBS oldatban (a PEG molekulatömege 3000, Sigma) 37 °C-on. A fúziót 1 ml Dulbecco-féle PBS (RJH) 1 percen keresztül történő lassú hozzáadásával állítottuk le (37 °Con). További 19 ml PBS-t adtunk hozzá a következő 90 másodperc leforgása alatt. A füzionáltatott sejteket lecentrifugáltuk 5 percen keresztül 750 rpm-en. A sejteket azután újra felszuszpendáltuk HAT tápközegben [MÉM tápközeg, amely 20% magzati borjúszérumot (JRH), 1 mM nátrium-piruvátot, 2 mM L-glutamint, 0,1 mM nem-esszenciális aminosavakat, 10 pg/ml gentamicint, 2,5% Origen culturing supplement-ei (Fisher), 50 μΜ 2merkaptoetanolt, 100 μΜ hipoxantint, 0,4 μΜ aminopterint és 16 μΜ timidint tartalmaz], és azután szélesztettük azokat 200 μΐ/mérőhely mennyiségben 13 darab 96-mérőhelyes, lapos fenekű szövettenyésztő mikrotiterlemezre. A lemezeket azután 7-10 napra párásított 37 °C-os inkubátorba helyeztük, amely 5% CO2-t és 95% levegőt tartalmazott.
Humán IgG anti-avjL ellenanyagok detektálása egér szérumban
Szilárdfázisú EIA-t alkalmaztunk az egérszérumok humán αvβ3-ra specifikus humán IgG ellenanyagokra történő szkrínelésére. Röviden, lemezeket vontunk be 1 pg/ml koncentrációjú αvβ3-mal éjszakán keresztül PBS-ben. Miután mostuk 0,02% (v/v) Tween 20at tartalmazó 0,15 M sóoldattal, a mérőhelyeket blokkoltuk 1% (w/v) BSA-t, Ca++-t és Mg+-t tartalmazó HBSS-ben, 200 μΐ/mérőhely mennyiségben, 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. A lemezeket azonnal felhasználtuk, vagy lefagyasztottuk -20 °C-on későbbi alkalmazásra. Egérszérumokat inkubáltunk 2-szeres sorozathígításban a αvβ3-mal bevont lemezeken, 50 μΐ/mérőhely mennyiségben szobahőmérsékleten 1 órán keresztül. A lemezeket mostuk, és azután próbáztuk 50 μΐ/mérőhely HRP-vel jelölt, Fc-specifikus kecske anti-humán-IgG-vel (Accurate), 1:30000-szeres hígításban 1% BSA-PBS-ben, 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. A lemezeket megint mostuk, és 100 μΐ/mérőhely citrát-foszfát szubsztrát-oldatot (0,1 M citromsav és 0,1 M nátrium-foszfát, 0,01% H202 és 1 mg/ml OPD) adtunk hozzájuk 15 percre szobahőmérsékleten. Leállító oldatot (4 N kénsav) adtunk a mérőhelyre 25 μΐ/mérőhely mennyiségben, és leolvastuk az OD-t 490 nm-en automatikus spektrofotométer alkalmazásával.
- 75 Teljesen humán immunglobulinok detektálása hibridóma felülúszókban
Mivel a GenPharm egér képes mind egér, mind humán immunglobulin láncok létrehozására, a teljesen humán immunglobulinokat szekretáló pozitív növekedésű hibridómákat két különálló EIA rendszer alkalmazásával detektáltuk. Mikrotiterlemezeket vontunk be a fenti leírás szerint, és hígítatlan hibridóma felülúszókat inkubáltunk a lemezeken 1 órán keresztül 37 °C-on. A lemezeket mostuk, és próbáztuk vagy HRP-vel jelzett kecske antihumán-kappa (Southern Biotech) ellenanyaggal, l:10000-szeresre hígítva 1% BSA-HBSSben, vagy HRP-vel jelzett kecske anti-humán-IgG-Fc-specifikus ellenanyaggal, 1:30000szeresre hígítva 1% BSA-HBSS-ben, 1 órán keresztül 37 °C-on. A lemezeket azután szubsztrát oldattal inkubáltuk, amint fent leírtuk.
Izotipizálás
Az ellenanyagok izotípusának meghatározását EIA alkalmazásával hajtottuk végre, az egérszérumok specifikus titereinek szkrínelésére alkalmazotthoz hasonló formátumban. 96mérőhelyes mikrotiterlemezeket (r^-mal vontunk be, amint fent leírtuk, és 2 pg/ml koncentrációjú tisztított ellenanyagot inkubáltunk a lemezen 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. A lemezt mostuk, és próbáztuk HRP-vel jelölt kecske anti-humán-IgGi-gyel (Binding Site), vagy HRP-vel jelzett kecske anti-humán-IgG3-mal (Zymed), 1 órán keresztül szobahőmérsékleten 1:4000-szeresre hígítva 1% BSA-HBSS-ben. A lemezt ismét mostuk, és szubsztrát oldattal inkubáltuk, amint fent leírtuk.
Humán monoklonális ellenanyagok kötődésének jellemzése EIA-val
Az ellenanyagok kötődési jellegzetességeit ανβ3 befogási EIA-val állapítottuk meg. Linbro mikrotiterlemezeket ανββ-πΐΗΐ vontunk be 1 pg/ml koncentrációban TBS-ben 2 mM kalcium jelenlétében, éjszakán keresztül 4 °C-on. A lemezeket mostuk, és blokkoltuk TBS/l%BSA/kalcium pufferrel legalább egy órán keresztül szobahőmérsékleten. Tisztított ellenanyagokat inkubáltunk felező hígításban 2 pg/ml kiindulási koncentrációtól kezdve. A lemezeket mostuk, és konjugált ellenanyagot (HRP-vel jelzett kecske anti-humán-IgG-Fc 1:30000 hígításban) adtunk a mérőhelyekhez, és inkubáltuk a lemezeken 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. A lemezeket mostuk és OPD szubsztrátot adtunk a mérőhelyekre. A lemezeket automatikus mikrotiterlemez-spektrofotométerrel olvastuk le.
GenO95 M21 sejtekhez történő kötődésével való kompetíció különféle kereskedelmi forgalomban kapható anti-integrin monoklonális ellenanyagokkal
M21 sejteket tripszinizáltunk tenyésztöedényékből, mostuk azokat és újra felszuszpendáltuk HBSS/kalcium pufferben 2 x 106 sejt/ml sűrűségre. A GenO95-öt előre megjelöltük FITC-cel jelzett kecske anti-humán-Fc-vel (Jackson), 30 percen keresztül szoba
-76hőmérsékleten. A GenO95 10X hígított koncentrációit (200 pg/ml vagy 20 pg/ml) inkubáltuk FITC-cel jelzett kecske anti-humán-IgG-vel 250 pg/ml koncentrációban. 100 μΐ M21 sejtet (2 x 104 sejt) inkubáltuk 12 pl 10X hígított GenO95 ellenanyaggal magas (20 pg/ml végkoncentráció) és alacsony (2 pg/ml végkoncentráció) koncentrációban ± 12 pl-t az alábbi egér ellenanyagokból: m7E3 IgG, anti-avp3 (LM609 jelű klón, Chemicon), anti-avp5 (P1F6 jelű klón), anti-p3 (Chemicon, AMAC) vagy anti-αν (VNR139 jelű klón, Gibco) 20 pg/ml koncentrációban 45 percen keresztül 37 °C-on. Eltávolítottunk egy alikvotot az egyes csövekből kétszínű elemzéshez, és a maradékot rögzítettük 1% paraformaldehiddel és áramlási citometriával elemeztük. A kétszínű elemzéshez egy alikvotot (50 pl) inkubáltunk PE-vel jelzett kecske anti-egér-IgG-vel 30 percen keresztül szobahőmérsékleten, hogy megjelöljük az egér anti-avp3, anti-avPs, anti-p3 vagy anti-av ellenanyagokat a kétszínű elemzéshez. Az összes csövet 1% paraformaldehiddel rögzítettük.
M21 sejteknek vagy MDAMB435L2 sejteknek vitronektinnel bevont mikrotiterlemezekhez való ανβ3 vagy «\β5 függő adhéziójának gátlása avp3/«vPs-re specifikus monoklonális ellenanyagokkal
Linbro mikrotiterlemezeket vontunk be 1 órán keresztül szobahőmérsékleten 50 μΐ/mérőhely vitronektinnel (Collaborative, Becton Dickinson) 5 pg/ml koncentrációban 2 mM kalciumot tartalmazó TBS-ben. A lemezeket HBSS/kalcium pufferrel mostuk, és blokkoltuk 2 mM kalciumot és 1% BSA-t tartalmazó TBS-sel 30 percen keresztül szobahőmérsékleten. M21 sejteket tripszinizáltunk, egyszer mostunk FCS-t tartalmazó tápközeggel, és újra felszuszpendáltuk azokat kalcium nélküli HBSS pufferben. Minden mosást 10 percig tartó centrifugálással végeztünk 1000 rpm-en Sorvall asztali centrifugában. A sejtek fluoreszcens jelöléséhez kalceint (Molecular Probes) (5 mg/ml DMSO-ban) adtunk a sejtekhez 100 pg/ml végkoncentrációban 50 ml-es kúpos csőben (fóliába csomagolva). A sejteket 10-15 percen keresztül inkubáltuk 37 °C-on. A kalceinnel jelzett sejteket egyszer megmostuk HBSS-sel, és újra felszuszpendáltuk azokat 0,1% BSA-val és 1 mM MgC^-vel kiegészített HBSS-ben. Az ellenanyagokat megtitráltuk (14-szeres hígítási sorozat) HBSS/0,1% BSA/2 mM kalcium pufferben 10X végkoncentrációban. Sejteket (300 pl, 7,5 x 106/ml) előinkubáltunk titrált ellenanyagokkal (37 pl, 10X oldat) ± anti-avPs (P1F6) aszcitesszel (Chemicon) [37 pl, 1:600 (10X)], 15 percen keresztül 37 °C-on. A sejt-ellenanyag keveréket hozzáadtuk a vitronektinnel bevont lemezekhez 100 pl/mérőhely mennyiségben három párhuzamosban (megközelítőleg 6 x 105 sejt/mérőhely). A lemezeket 45 percen keresztül inkubáltuk 37 °Con. A nem kötődött sejteket kétszeri mosással távolítottuk le HBSS/kalcium pufferrel (150 pl
- 77 /mérőhely). 100 μΐ HBSS/kalcium puffért adtunk az egyes mérőhelyekhez, és a mikrotiterlemezt leolvastuk Fluoroskan mikrotiterlemez-leolvasóval 485-538 nm-en.
Egy másik vizsgálatban MDAMB435L2 humán emlőkarcinóma sejteket gyűjtöttünk be verzénnel, és újra felszuszpendáltuk azokat szérummentes tápközegben 500000 sejt/ml sűrűségben, és GenO95 különböző koncentrációival inkubáltuk azokat. 10 perces inkubálás után a daganatsejt-szuszpenziót (100 μΐ) vitronektinnel (10 μg/ml) bevont Linbro mikrotiterlemezekhez adtuk, és 37 °C-on inkubáltuk. 1 óra elteltével a mikrotiterlemezeket háromszor mostuk szérummentes tápközeggel (200 μΐ/mosás), és MTT-alapú Cell Titer AQ festéket (Promega) adtunk az egyes mérőhelyekhez. A sejtadhézió mértékét ELISA mikrotiterlemez-leolvasóval határoztuk meg, ahol az OD490 egyenesen arányos a sejtek adhéziójával. BSA-val bevont mérőhelyekhez való sejtadhézió szolgált negatív kontrollként. Az anti-humán-avP3/avPs monoklonális ellenanyag ligandumjaihoz való kötődése Cafiiggésének meghatározása
CNTO95 és C372 avPs-hoz és avPs-höz való kötődése kation-függésének meghatározására folyadékfázisú EIA-t alkalmaztunk. EIA mikrotiterlemezeket (Corning) CNTO95, C372, c7E3 vagy LM609 IgG monoklonális ellenanyagokkal vontunk be 10 pg/ml koncentrációban, karbonát bevonópufferben éjszakán keresztül 4 °C-on. A lemezeket HBSSben hígított 1% BSA-val blokkoltuk 2 mM Ca2+ jelenlétében vagy hiányában, legalább egy órán keresztül 37 °C-on. ανβ3 (lot JG52599) vagy ανβ5 (Chemicon) 10 pg/ml-től kezdődő felező hígításait előinkubáltuk 50 mM EDTA-val (Sigma) 1% BSA/HBSS pufferben Ca++ nélkül, vagy 1% BSA/HBSS pufferben Ca++ jelenlétében, 30 percen keresztül 37 °C-on. A keverékeket azután hozzáadtuk a lemezekhez, és 30 percen keresztül inkubáltuk 37 °C-on. A lemezeket azután megmostuk, és nem kompetitív monoklonális ellenanyagokat adtunk a lemezekre az alábbiak szerint: a CNTO95-tel, C372-vel és c7E3-mal bevont lemezekhez az ανβ3 kötésének detektálására LM609 monoklonális ellenanyagot adtunk 20 pg/ml koncentrációban 1% BSA/HBSS-ben Ca++ nélkül’ az LM609-cel bevont lemezekhez az ανβ3 kötésének detektálására CNTO95 monoklonális ellenanyagot adtunk 20 pg/ml koncentrációban 1% BSA/HBSS-ben Ca++ nélkül; a CNTO95-tel, C372-vel és c7E3-maI bevont lemezekhez az ανβί kötésének detektálására VNR139 monoklonális ellenanyagot (Gibco) adtunk 10 μg/ml koncentrációban 1% BSA/HBSS-ben Ca++ nélkül, és ezeket 30 percen keresztül inkubáltuk 37 °C-on. A lemezeket ismét mostuk, és próbáztuk vagy HRP-vel jelzett kecske anti-egér-IgG-Fc-vel vagy HRP-vel jelzett kecske anti-humán-IgG-Fc-vel megfelelő pufferben, és 30 percen keresztül inkubáltuk 37 °C-on. A lemezeket azután mostuk, OPD szubsztrátot adtunk a mérőhelyekhez, és mértük az OD490-et, amint korábban leírtuk.
- 78 Eredmények és diszkusszió
Teljesen humán anti-humán-avPs-integrin monoklonális ellenanyagok létrehozása
Egy — GenO-nak nevezett — fúziót végeztünk ανβ3 fehérjével immunizált GenPharm egérből. Ebből a fúzióból 129 pozitív növekedésű hibridet szkríneltünk. Két hibridóma sejtvonalat azonosítottunk, amelyek teljesen humán, humán αvβ3-mal reagáló IgG ellenanyagokat szekretáltak. Ezen két sejtvonal — a GenO95.9.12 és GenO. 101.17.22 __ mindegyike humán IgGlK izotípusú immunglobulint szekretált, és mindkettőt kétszer szubklónoztuk korlátozó hígítással, stabil (>90% homogén) sejtvonalakat előállítva.. A GenO.95.9.12 a #CNTO95 C-kódot kapta, és a GenO. 101,17.22 a &C372A C-kódot kapta. A sejtvonalak mindegyikét lefagyasztottuk 12-fíolás, folyékony nitrogénben tárolt kutatási sejtbankokban.
Humán monoklonális ellenanyagok kötődésének jellemzése EIA-val
ELISA elemzés bizonyította, hogy a két hibridómából tisztított ellenanyag — CNTO 95 és C372A - koncentráció-fuggő módon kötp az o^3-at. Az 1. ábrán az ellenanyagoknak a relatív kötési hatékonyságát mutatjuk be. 50%-os kötődést értünk el sorrendben 0,07 és 0,7 pg/ml koncentrációnál a C372A és CNTO 95 esetében. Ugyanebben a vizsgálati eljárásban a c7E3 IgG 50%-os kötődést mutatott 0,07 pg/ml koncentrációnál.
GenO95 M21 sejtekhez történő kötődésével való kompetíció kereskedelmi forgalomban kapható anti-integrin monoklonális ellenanyagokkal
Egyszínű elemzéssel az egér anti-op^, anti-c^s, anti-β3 vagy anti-av ellenanyagok egyike sem versengett a CNTO95-tel M21 sejtek kötéséért (1. táblázat). Ez a kísérlet azt is demonstrálja, hogy a CNTO95 dózisfüggő módon kötődik M21 sejtekhez. Kétszínű kísérletben demonstráltuk, hogy az egér anti-c^3, anti-c^5, anti^3 vagy anti αν ellenanyagok képesek kötődni M21 sejtekhez (adatokat nem közlünk).
- 791. Táblázat: GenO95 M21 sejtekhez történő kötődésével való kompetíció különféle egér antiintegrin monoklonális ellenanyagokkal
Versengő ellenanyag FITC-cel jelzett kecske anti-humán-Fc-vel jelzett GenO95
2 pg/ml 20 pg/ml
MCF % pozitív MCF % pozitív
negatív (nincs GenO95) 2,69 2,69
pozitív (sóoldat) 4,33 100% 14,33 100%
m7E3 IgG 5,73 132% 14,72 103%
LM609 (anti-avPs) 4,78 110% 13,34 93%
anti- β3 (Chemicon) 5,42 125% 13,10 91%
&ηΐΐ-β3 (AMAC) 4,61 106% 13,10 91%
P1F6 (anti-αvβ3) 4,87 112% 14,46 101%
VNR139 (anti-αν) 4,61 106% 14,86 104%
MCF = médián csatorna-fluoreszcencia
M21 sejteknek vagy MDAMB435L2 sejteknek vitronektinnel bevont mikrotiterlemezekhez való ανβ3 vagy ανβ5 függő adhéziójának gátlása ο^/ανβδ-τε specifikus monoklonális ellenanyagokkal
Az M21 sejtek ανββ-ίόΐ és ανβ5-ίο1 függő módon tapadnak vitronektinnel bevont mikrotiterlemezekhez. Tehát szükség van mind az ανβ3, mind az ανβ5 blokkolására, hogy teljesen gátoljuk az M21 sejtek adhézióját a vitronektinnel bevont lemezekhez. A C372A nem gátolta M21 sejtek adhézióját a P1F6 jelű, anti-αvβ5 aszcitesz jelenlétében vagy hiányában (2. ábra). A GenO95 (CNTO95) teljesen gátolta az M21 sejtek adhézióját vitronektinnel bevont lemezekhez anti-αvβ5 (P1F6) aszcitesszel vagy anélkül, jelezve, hogy az ellenanyag blokkolja mind az avp3-at, mind az ανβί-οΐ. A vizsgálati eljárás paramétereinek kontrolljaként ReoPro-t (c7E3 Fab) alkalmaztunk, amely blokkolja az c^3-at (a GPIIb/IIIa mellett). A ReoPro egymagában csak részlegesen gátolta az M21 sejtek adhézióját, a ReoPro anti-αvβ5 (P1F6) aszcitesz jelenlétében teljesen gátolta az adhéziót, ami az demonstrálja, hogy az M21 sejtek mind az ανβ3-, mind az αvβ5-integrinen keresztül kötődnek a vitronektinhez. Az adatokat normalizáltuk az antagonista hiányában ± anti-a\^5 (P1F6) aszcitesz hiányában mutatott maximális M21-kötés százalékára. A P1F6 nélküli antagonista-titrálás esetében az adatokat antagonista vagy P1F6 hiányában való maximális M21-kötésre normalizáltuk. A P1F6 jelenlétében való antagonista-titrálás esetében az adatokat antagonista hiányában, de P1F6
- 80jelenlétében való maximális M21-kötésre normalizáltuk. Az adatokat százalékos maximális kötés (ellenanyag nélkül) ábrázoltuk, és nemlineáris regressziót végeztünk GraphPad Prism alkalmazásával.
A GenO95 monoklonális ellenanyag képes volt teljesen gátolni MDAMB435L2 sejtek adhézióját is vitronektinhez 1,5 pg/ml minimális koncentráció mellett (3. ábra). Ezek az adatok, az M21 sejtek adhéziójának gátlását mutató adatokkal együtt bizonyítják a GenO95 képességét az ανβ3- és/vagy avPs-receptor vitronektinnel való kölcsönhatásának funkcionális gátlására.
Az anti-humán-avPs/avPs monoklonális ellenanyag ligandumjaihoz való kötődése Cafiiggésének meghatározása
Ismert, hogy kalcium kation jelenlétére van szükség ahhoz, hogy a c7E3 monoklonális ellenanyag kötődjön az ανβ3-1ιοζ, és nem szükséges, hogy az LM609 monoklonális ellenanyag kötődjön az avp3-hoz, amint azt sorrendben bemutatjuk a 4c. és 4d. ábrákon. Ezt a kísérletet annak megállapítására hajtottuk végre, hogy van-e kalcium-függés a CNTO95 vagy C372 ανβ3- vagy αvβ5-integrinekhez való kötési kinetikájában. EDTA feleslegben adott koncentrációját alkalmaztuk a vizsgálati eljárásban, hogy komplexáljuk az integrin heterodimerek kötőzsebében jelenlévő kalciumot , és ezáltal meghatározzuk a kötődést a kation hiányában. Azt találtuk, hogy a CNTO95 és C372 ανβ3-1ιοζ való kötődése nem függ a kalcium jelenlététtől (4a. és 4b. ábra). Ugyanez igaz a CNTO95 αvβ5-höz való kötődésére, de azonban ez nem igaz a C372 ανβί-höz való kötődésére (4e. és 4f. ábra), minthogy a kötődés látszólag növekszik Ca jelenlétében.
Konklúzió
A GenO fúziót humán aA^3-mal immunizált, humán variábilis és állandó régió ellenanyag-transzgéneket tartalmazó hibrid egérből származó lépsejtekkel hajtottuk végre. Két teljesen humán, op^3-mal reagáló, IgGlK izotípusú monoklonális ellenanyagot hoztunk létre. Ezeket a monoklonális ellenanyagokat tovább jellemeztük, és azt találtuk, hogy kötődnek mind az ανβ3-, mind az αvβ5-integrinhez. A két monoklonális ellenanyag kötődéséről demonstráltuk, hogy független a kalciumtól az ανβ3 esetében, és csak a C372 kötődése kalciumfüggö az ανβί esetében. Ezenkívül az egyik monoklonális ellenanyag, a GenO95 (CNTO95) képes teljesen gátolni az ανβ3 és ανβί kötődését vitronektin ligandumhoz sejtalapú vizsgálati eljárásokban. Ez a monoklonális ellenanyag hasznosnak bizonyulhat antiangiogenezis és egyéb, rákkal kapcsolatos alkalmazásokban.
- 81 Hivatkozások
1. Taylor és mtsai., International Immunology 6, 579-591. old. (1993).
2. Lonberg és mtsai., Nature 368, 856-859. old. (1994).
3. Neuberger M., Nature Biotechnology 14, 826. old. (1996).
4. Fishwild és mtsai., Nature Biotechnology 14, 845-851. old. (1996).
5. Gastl és mtsai., Oncology 54, 177-184. old. (1997).
6. Eliceiri és mtsai., J. Clin. Invest. 103, 1227-1230. old. (1999).
7. Friedlander és mtsai., Science 270, 1500-1502. old. (1995).
8. Wayner és mtsai., I. Ceil Biol. 113, 919-929. old. (1991).
3. példa: Duális integrin ellenanyagok kötési affinitása
Bevezetés
A GenO.95 — vagy más néven CNTO95 - egy humán monoklonális ellenanyag, amelyet (CBA/J x C57/BL6/J, GenPharm International) F2 hibrid egereknek humán placentából tisztított ανβ3 integrinnel történő immunizálásával állítottunk elő. Az ellenanyag humán variábilis és IgGl kappa állandó régiókból tevődik össze, és azt találtuk, hogy reagál mind avp3-mal, mind avp5-tel, azt sugallva, hogy specifikus a két integrin molekula közös alfa láncára.
Célkitűzés
Ezen vizsgálat célja a GenO.95 kötési affinitásának jellemzése ανβ3 és ανβ5 tisztított integrinekhez, és béta integrineket expresszáló sejtvonalakhoz. További jellemzés végett a kötési értékeket összehasonlítjuk GenO95 és ReoPro között.
Rövidítések
Ka, egyensúlyi disszociációs állandó, M-ban kifejezve
Bmax, kötőhelyek maximális száma
Anyagok és eljárások
Sejtvonalak
A375S2 humán melanoma sejtvonalat — amely ανβ3 és ανβ? integrineket expresszál — Dulbelcco-féle minimál tápközegen (DMEM) tenyésztettünk, amely 10% magzati marhaszérumot (FBS, Cell Culture Labs), 1 mM nátrium-piruvátot, 0,1 mM nem-esszenciális aminosavakat és 2 mM L-glutamint (mindegyik JRH Biosciences) tartalmazott.
HT29 humán kolónkarcinóma sejtvonalat — amely ανβ5-οΐ és minimális mennyiségű M3-at expresszál (NB 4546, 207. old.) — DMEM tápközegben tenyésztettünk, amely 10%
- 82FBS-t, 1 mM nátrium-piruvátot, 0,1 mM nem-esszenciális aminosavakat és 2 mM Lglutamint tartalmazott.
M21 humán melanoma sejteket — ανβ3- és o^s-integrint expresszálnak, és amelyeket Dr. J. Jakubowski-tól kaptunk (Eli Lilly, Inc.) — RPMI tápközegben (JRH Biosciences) tenyésztettünk, amely 10% FBS-t, 1 mM nátrium-piruvátot, 0,1 mM nem-esszenciális aminosavakat és 2 mM L-glutamint tartalmazott.
Integrinek
A JG22499 lotba tartozó αvβ3-at a Centocor-nál tisztítottuk humán placentából. Egy másik ανβ3 lotot (oktil kiszerelés, lot 19100991) a Chemicon cégtől vásároltunk meg. Az ανβί-öt (Triton kiszerelés, lot 20030055, lot 1910990, és oktil kiszerelés, lot 19060747) a Chemicon cégtől vásároltuk meg.
Ellenanyagok
A GenO95-öt sejttenyészetek felülúszójából tisztítottuk Protein-A kromatográfíával.
A ReoPro-t a Centocor, Inc. gyártotta, az LM609 jelű egér anti-humán-o^3 ellenanyagot (1976ZK, lot 20020559 és lot 1910329) és a P1F6 egér anti-humán-αvβ5 ellenanyagot (1961 P-K, lot 17110560) a Chemicon cégtől vásároltuk meg.
Radioaktív jelölés
Az ellenanyagokat 125I Na-val (Amersham, IL) jelöltük, lodobeads (Pierce Chemicals, IL) alkalmazásával, 1-2 pCi/pg specifikus aktivitásra. Az ellenanyag-koncentrációt (mg/ml) a 280 nm-en mért abszorpciónak (OD/ml) 1,4-el történő elosztásával határoztuk meg. A jódozott ellenanyag specifikus aktivitását az ellenanyag hígításával és egy alikvot számlálásával határoztuk meg Topcounter (Packard) gammaszámlálóban.
cpm/térfogat (ml) x hígítás faktor
Specifikus aktivitás (cpm/pg) = ---------------------------------------------— koncentráció (pg/ml, OD280 méréssel meghatározva)
Integrin-bevonatú mikrotiterlemezes kötési vizsgálati eljárás ανβ3 vagy ανβ5 integrint 1 pg/ml koncentrációra hígítottunk Tris-pufferelt sóoldatban (TBS, 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,5), amely 2 mM kalcium-kloridot tartalmazott(TBS/Ca), és 50 μΐ/mérőhely mennyiségben bevontuk vele 96-mérőhelyes polisztirol Linbro mikrotiterlemezek (Flow/ICN) mérőhelyeit, éjszakán keresztül 4 °C-on. A lemezeket mostuk TBS/Ca pufferrel, és blokkoltuk 1 % szarvasmarha-szérumalbuminnal (BSA) TBS/Ca pufferben, 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. 50 μΐ hígított ellenanyagot
- 83 adtunk három párhuzamosban a bevont mérőhelyhez, és 2 órán keresztül inkubáltuk 37 °C-on. TBS-Tween pufferrel (TBS + 0,1% Tween 20) történő háromszori mosás után peroxidázzal konjugált kecske anti-humán-IgG-F(ab’)2 ellenanyagot (H+L, Jackson, lot 16869) adtunk a mérőhelyekhez, 1:40000 hígításban 1% BSA-TBS pufferben, és 1 órán keresztül inkubáltuk szobahőmérsékleten. A lemezeket háromszor mostuk, és előhívtuk o-feniléndiamin dihidroklorid szubsztrát-oldattal (OPD, Sigma), amely 0,1 M citromsavat, 0,2 M nátriumfoszfátot, 0,01% H202-t és 1 mg/ml OPD-t tartalmazott. A szín kialakulását 15 perc szobahőmérsékleten történő inkubálás után leállítottuk 0,3 N H2SO4-gyel, és a lemezeket leolvastuk 490 nm-en Molecular Dynamics mikrotiterlemez-leolvasóval.
A kötési görbéket GraphPad PRISM szoftverrel (version 3, GraphPad Software) állítottuk elő. Az eredményeket a maximális kötődés telítési értékének százalékában fejeztük ki. A Kd egyensúlyi disszociációs állandó M-ban kifejezett értékét az adatok nemlineáris regressziós illesztéséből határoztuk meg a PRISM szoftver alkalmazásával.
Sejtkötési vizsgálati eljárás
Radioaktívan jelzett, 2% szarvasmarha-szérumalbuminban (JRH Biosciences) hígított ellenanyag 50 pl-ét adtuk három párhuzamosban 96-mérőhelyes szövettenyésztő mikrotiterlemezeken (Packard) tenyésztett konfluens sejtekhez. A sejteket 1,5 órán keresztül inkubáltuk 37 °C-on; óvatosan megmostuk három alkalommal Hanks-féle puffereit sóoldattal, amely kalciumot és magnéziumot tartalmazott (HBSS++, JRH Biosciences), majd leszívtuk a puffért. 100 pl Mycosinct 20-M. (Packard) adtunk minden egyes mérőhelyhez, és meghatároztuk a sejtekhez kötődött radioaktivitás mennyiségét TopCounter készülékben (Packard).
A nemspecifikus kötődés meghatározására a kísérleteket hasonló hígításokkal hajtottuk végre jelzetlen ellenanyag 100-szoros feleslege jelenlétében.
Az egyes mérőhelyekre szélesztett sejtek számának meghatározására több mérőhelyből eltávolítottuk a sejteket tripszinnel, összeöntöttük, és mikroszkóp alatt megszámoltuk. A receptorok sejtenként! számát az alábbiak szerint számítottuk:
specifikus kötött cpm x 6,023 x 1023 molekula/mol
Receptorok száma/sejt = —---------—--------------------specifikus aktivitás(cpm/g) x molekulatömeg (g/mol) x sejt szám
A kötőhelyek sejtenként! maximális számát (Bmax), és a Kd-t az adatok nemlineáris regressziójából határoztuk meg a PRISM szoftver alkalmazásával.
/7-: ΠΩ 7
-84- ” ’’ ' ’
Eredmények és diszkusszió
A kötési affinitási értékek meghatározását GenO.95 (és ReoPro) tisztított ανβ3 és ανβ? integrinek különböző koncentrációihoz és sejtfelszíni receptorokhoz való kötődésének egyensúlyban történő mérésével hajtottuk végre. A telítési kötési görbék rektanguláris hiperbolák voltak, egyetlen receptorkötöhelyre utalva a GenO.95 és ReoPro esetében (5. és 6. ábra; Motulsky, H., 1999). Ezen telítési kötési adatok elemzését (amit néha Scatchard kísérleteknek neveznek) egyhelyes hiperbolikus nemlineáris regressziós illesztéssel hajtottuk végre a PRISM szoftverrel, kiszámítva az affinitást (Kd) és a receptorok számát (Bmax) (Motulsky, H., 1999).
A GenO.95, ReoPro és tisztított integrinek több lotját is alkalmaztuk a kötési affinitási értékek pontos meghatározásának biztosítására. A GenO.95 telítési kötési görbéje c^3-mal bevont mikrotiterlemezen (5A. ábra) és a ReoPro kötési görbéje αvβ3-mal bevont lemezen (5B. ábra) hat különálló kísérlet átlagát és szórását reprezentálja. Az ανβ3 Triton kiszerelésével kapott eredményekről azt találtuk, hogy reprodukálhatóbbak, mint az oktil kiszereléssel kapottak. Az αvβ3-mal bevont lemezeken a GenO.95 átlagos Kd-je 2,1 ± 1,33 x 10'10 M volt; és a ReoPro Kd-je 2,5 ± 1,46 χ 10’10 M volt.
A GenO.95 telítési kötési görbéjét ανβδ-ίβΐ bevont mikrotiterlemezen (6A. ábra) és a ReoPro kötési görbéjét ανβ5-ίε1 bevont lemezen (6B. ábra) hat különálló kísérlet átlagaként és szórásaként mutatjuk be. Az oktil kiszereléssel kapott eredmények konzisztensebbek voltak, mint a Triton kiszereléssel kapottak. A GenO95 átlagos Kd-je ανβ5-όη 2,5 ± 1,04 χ 10'11 M volt. A ReoPro nem mutatott kötődést és dózis-választ ανβί-ΐεΐ bevont lemezeken.
A tisztított integrinek kötési affinitási értékeit összehasonlítottuk különféle sejtvonalakon expresszált receptorokéval. A 7A-7C. ábrákon 125I-vel jelzett GenO.95 kötődését mutatjuk be A375S2 sejtekhez, amelyek ανβ3-Βΐ és ανβ5-0ί expresszálnak (7A. ábra). Az átlagos affinitási értékek A375S2 sejteken az alábbiak voltak: Kd = 5,2 ± 2,04 χ 10’9 M; és 120000 ± 37000 receptor/sejt. A HT29 sejtek avPs-öt expresszálnak. A 125I-vel jelzett GenO.95 kötési affinitási értékei HT29 sejtekhez az alábbiak voltak: Kd = 1,3 ± 3,76 χ 10'9 M; és 81 000 ± 24 000 receptor/sejt (7B. ábra). Az M21 sejtek ανβ3 és ανβ5 integrineket expresszálnak. 125I-vel jelzett GenO.95 kötődése M21 sejtekhez az alábbi volt: Kd = 8,5 ± 3,03 χ 10’9 M; és 200 000 ± 80 000 receptor/sejt (7C. ábra).
Hasonló kötési vizsgálatokat végeztünk 125I-vel jelzett ReoPro alkalmazásával különféle sejtvonalakon. A 8A-8C. ábrákon 125I-vel jelzett ReoPro kötődést mutatjuk be A375S2 sejtekhez, és a kapott átlagos értékek az alábbiak voltak: Kd = 22 ± 3,7 χ ΙΟ’9 M; és
370000 ± 190000 receptor/sejt (8A. ábra). HT29 sejteken a 125I-vel jelzett ReoPro minimális kötődést mutatott (8B. ábra). A 125I-vel jelzett ReoPro kötődése M21 sejtekhez az alábbi volt: Ka = 10 ± 2,00 x 10‘9 M és 660000 ± 120000 receptor/sejt (8C. ábra). A 125I-vel jelzett ReoPro kötési értékei M21 sejteken összhangban állnak a korábban publikált értékekkel (Tam és mtsai., 1998).
A kötési eredmények összefoglalását a 2. és 3. táblázatban mutatjuk be.
2. Táblázat. GenO.95 és ReoPro tisztított integrinekhez való affinitásának összefoglalása
ανβ3 bevonatos lemez (n = 6) ανβ5 bevonatos lemez (n = 6)
Kd (M) Kd(M)
GenO.95 2,1 ± 1,33 X 10'w 2,5 ± 1,04 X 10'11
ReoPro 2.5 ± 1,46 x 1O'1U elhanyagolható
3. Táblázat. GenO.95 és ReoPro sejtekhez való affinitásának összefoglalása
A375S2 sejtek A375S2 sejtek HT-29 sejtek HT-29 sejtek M21 sejtek M21 sejtek
Kd(M) receptor/sejt Kd(M) receptor/sejt Kd(M) receptor/sejt
GenO.95 5,2 ± 2,04 x 10’9 (n=5) 120000 ± 37000 (n=7) 1,3 ±0,38 x 10‘9 (n=5) 81,000 ±24000 (n=7) 8,5 ± 3,03 x 10'9 (n=4) 200000 ± 80000 (n=8)
ReoPro 22 ± 3,7 x 10'9 370000 ± 190000 (n=6) elhanyagolható (n=4) elhanyagolható (n=4) 10 ± 2,00 x 10'9 (n=3) 660000 ± 120000 (n=7)
Αηίί-ανβ3 LM609 nd 300000 (n=2) nd nd nd nd
Anti-avfs P1F6 nd 70000 ± 50000 (n=4) nd 73000 (n=D nd 44000 (n=2)
Számos megfigyelés volt figyelemre méltó a kötés jellemzésekor. A GenO.95 affinitási értékei (Ka) ctvps-höz alacsonyabbak voltak, mint avPs-hoz. Az alacsonyabb Kd 15 értékek magasabb affinitást jeleznek; ily módon a GenO.95 kötődésnek affinitása a tisztított ανβ5 integrinhez körülbelül 8-szor magasabb volt, mint a tisztított ανβ3 integrinhez. Azonban amikor mindkét integrin-receptor jelen van ugyanazon a sejten, a teljes affinitási érték jobban megközelíti a nagyobb mennyiségben jelen lévő integrinnek megfelelő értéket. Ily módon az A375S2 és M21 sejteken, amelyeken több ανβ3 van, mint ανβ5, a GenO.95 kötődésének az
-86affinitása ezekhez a sejtekhez hasonló volt az ανβ3 affinitásához, ~7 x ΙΟ’9 M. Ezzel ellentétben HT-29 sejteken, amelyek ανβ5-όί expresszálnak, a GenO.95 affinitása kissé magasabb volt, 1 x ΙΟ’9 M. A megközelítőleg kétszeres eltérés a sejtenként! receptorszámban a GenO.95 és ReoPro kötésben megmagyarázható az ellenanyag-valencia különbségével. A 5 GenO.95 (IgG) bivalens, és valószínűleg két szomszédos receptorhoz kötődik, míg a ReoPro (Fab) monovalens, és csak egy receptorhoz képes kötődni (BRD930001).
Hivatkozások
Fraker, D.J., Speck, J.C., „Protein and ceil membrane iodination with a sparingly 10 soluble chloramide l,3,4,5-tetrachloro-3a-diphenyl-glycoluril.”, Biochem. Biophys. Res.
Commun. 80, 849. old. (1978)
Motulsky H, „Analyzing Data with GraphPad Prism.”, kiad.: GraphPad Software, Inc. San Diego, CA (1999)
Tarn, S.H, Sassoli, P.M., R. Iordan, M.T. Nakada., Circulation (1999)
4. példa: Duális integrin ellenanyag hatása az angiogenezis modulálására
Összefoglalás
A GenO95 egy humán IgGlK monoklonális ellenanyag, amely felismeri az ανβ3 és ανβ5 integrineket. Ezek az integrinek részt vesznek az endotéliális sejtek adhéziójában, 20 migrációjában, túlélésében és proliferációjában, amelyek az angiogenezis szempontjából fontos folyamatok. Az endotéliális sejtek sarjadzása utánozza in vitro az angiogenezist, mivel szerepet játszik benne a sejtek adhéziója, migrációja, proliferációja és túlélése. Saijadzási vizsgálati eljárást alkalmaztunk annak meghatározására, hogy a GenO95 képes-e gátolni az ανβ3 és ανβ5 funkcióját. Ebben a példában azt mutatjuk be, hogy a GenO95 a 25 háromdimenziós fibrin mátrixban tenyésztett endotéliális sejtek sarjadzásának az inhibitora, ezáltal demonstráljuk azt, hogy ez az ellenanyag potenciálisan angiogenikus tulajdonságú.
Bevezetés lelenleg figyelemre méltó bizonyíték van arra, hogy a progresszív daganatnövekedés az angiogenezistől, új vérerek kialakulásától függ. Ezek a vérerek ellátják a daganatokat 30 tápanyagokkal és oxigénnel, eltávolítják a salakanyagokat, és a daganatsejtek távoli helyekre történő metasztázisának vezetékeként működnek (1). Friss vizsgálatok tovább definiálták az integrinek különböző szerepeit az angiogenezis folyamatában. Az integrinek heterodimer transzmembrán fehérjék, amelyek fontos szerepet játszanak a sejtek adhéziójának, migrációjának, túlélésének és proliferációjának közvetítésében (2). Az ανβ3 integrin
- 87expressziója minimális nyugvó vagy normális vérerekben, de szignifikánsan serkentett angiogenikus vaszkuláris sejtekben (1-3). A közeli rokonságban álló, de eltérő avPs-ről is kimutatták, hogy közvetít az angiogenezis folyamatában. Az ανβ3 ellen termeltetett ellenanyag blokkolta a bázikus fibroblaszt növekedési hormon (bFGF) által indukált angiogenezist, míg az ανβ5-Γ6 specifikus ellenanyag gátolta a vaszkuláris endotéliális növekedési faktor (VEGF) által indukált angiogenezist (1-5).
Az angiogenezist utánozhatjuk in vitro endotéliális sarjadzási vizsgálati eljárással. Ez a rendszer magában foglalja endotéliális sejtek migrációját és proliferációját. A GenO95 olyan humán monoklonális ellenanyag, amely felismeri az ανβ3 és ανβ5 integrineket, és ezek az integrinek szabályozzák az endotéliális sejtek migrációját és proliferációját. Tehát meghatároztuk, hogy a GenO95 képes-e meggátolni az endotéliális sejtek sarjadzását. Ebben a példában olyan kísérleteket írunk le, amelyek azt demonstrálják, hogy a GenO95 gátolja fibrin-mátrixban növekvő humán endotéliális sejtek sarjadzását.
Anyagok
A humán bázikus fibroblaszt növekedési hormont (bFGF) és a humán 165-ös vaszkuláris endotéliális növekedési hormont (VEGF165) az R&D Systems cégtől (Minneapolis, MN) szereztük be. MAB1976Z-t (LM609), amely egy ανβ3 integrin elleni monoklonális ellenanyag, és a MAB1961-et (P1F6), amely egy ανβ5 elleni monoklonális ellenanyag, a Chemicon cégtől (Temecula, CA) vásároltuk meg. A ReoPro és GenO95 ellenanyagokat a Centocor „Clinical Pharmacology and Antibody Technology Department” részlegétől szereztük be. A humán fibrinogént (plazminogén-mentes, >95% megalvadó fehérje) és a szarvasmarha bőréből származó zselatint a Sigma cégtől (Saint Louis, MI) vásároltuk meg.
Sejtvonalak
HUVEC humán köldökzsinórvéna endotéliális sejteket a Clonetics cégtől (Walkersville, MA) vásároltunk. A Huvec sejteket endothelial basal media (EBM) kit (Clonetics) alkalmazásával tenyésztettünk, amely 10% FBS-t, hosszú R-inzulin-szerű növekedési faktor- 1-et, aszkorbinsavat, hidrokortizont, humán epidermális növekedési faktort, humán vaszkuláris endotéliális növekedési faktort, hFGF-b-t, gentamicin-szulfátot és amfotericin-B-t tartalmazott. A sejteket 37 °C-on és 5% CO2-ben inkubáltuk, és a tápközeget 2-3 naponta cseréltük. Csak a 3-8. passzálást alkalmaztuk a kísérletekben.
Fibrin mikrohordozón alapuló sarjadzási vizsgálati eljárás
Nehls és Drenckhahn (6) eljárásainak módosított változatát alkalmaztuk kapilláriskialakulás mérésére háromdimenziós fibrinalapú mátrixban. Zselatinnal bevont cytodex-3
- 88mikrohordozókat (MC, Sigma) készítettünk a szállító javaslatai szerint. Frissen autoklávozott MC-ket felszuszpendáltunk EBM-2 + 20% FBS tápközegben, és endotéliális sejteket adtunk hozzájuk 40 sejt/MC végkoncentrációban. Hagytuk a sejteket kapcsolódni az MC-khez, 4 órán keresztül inkubálva 37 °C-on. Azután az MC-ket nagy térfogatú tápközegben felszuszpendáltuk, és 2-4 napon keresztül tenyésztettük 37 °C-on 5% CO2 atmoszférában. Alkalmanként megráztuk az MC-ket, hogy megelőzzük a sejtekkel bevont gyöngyök aggregációját. Az MC-ket fibringélbe ágyaztuk be, amelyet az alábbiak szerint állítottunk elő: humán fíbrinogént (2 mg/ml) feloldottunk normál, bFGHF-t vagy szérumot tartalmazó EBM-2 tápközegben. Ez az oldat tartalmazott különféle ellenanyagokat is. A fibrinbe ágyazott sejtek általi túlzott fibrinolízis megakadályozására aprotinint adtunk a fíbrinogén oldathoz és a tenyésztő tápközeghez 200 U/ml koncentrációban. Sejtekkel bevont mikrohordozót adtunk a fíbrinogén oldathoz 100-200 MC/ml sűrűségben (50-100 gyöngy/mérőhely — 48-mérőhelyes lemezen), és alvadást indukáltunk trombin hozzáadásával (0,5 U/ml). Miután az alvadás teljes volt, 0,5 ml oldatot (amely a fent leírt összes komponenst tartalmazta a fíbrinogén és a trombin kivételével) adtunk fíbrin-mátrixokhoz. A lemezeket 37 °C-on és 5% CO2-ben inkubáltuk 1-3 napon keresztül. 1-3 nap elteltével a géleket rögzítettük PBS-ben feloldott 3% paraformaldehiddel, és meghatároztuk az MC-gyöngyök átmérőjét (150 pm) meghaladó hosszúságú kapilláris-sarjak számát.
Eredmények és diszkusszió
A HUVEC sejtek kapilláris-szerű sarjakat képesek kialakítani fíbringélben (9. ábra). Az endotéliális sejtek kifelé migrálnak a zselatinnal bevont gyöngyöktől, és hosszú filopódiumokat fejlesztenek ki. A hosszú sarjak több, üreget alkotó sejtből állnak. Ez a folyamat hasonlít az in vivo mikrokapilláris-kialakulásra, mivel magában foglalja endotéliális sejtek migrációját, invázióját és proliferációját. A sarjképződés mennyiségi meghatározása feltárta, hogy a GenO95 gátolta az endotéliális sejtek sarjképződését bFGF vagy teljes tápközegben (10. ábra). Az LM609 és P1F6 kombinációja rutinszerűen hatékonyabban gátolta a sarjadzás, mint a GenO95 (11. ábra).
Konklúzió
Új vérerek kialakulása meglévő vérerekből az angiogenezis fémjele. Ezt a folyamatot utánozhatjuk in vitro az endotéliális sarjadzási vizsgálati eljárással. Ezek a sarjak olyan mikrokapillárisokat reprezentálnak, amelyek angiogenikus stimulusok, mint például bFGF vagy számos különböző, a szérumban jelen lévő stimulus hatására alakulnak ki. A GenO95 dózisfüggő módon gátolta a bFGF-fel vagy teljes tápközeggel stimulált endotéliális-sejtsarjadzást, azt sugallva, hogy ez az ellenanyag hatékonyan képes gátolni az ανβ3 és ανβ5
-89funkcióját. Az, hogy a GenO95 nem volt annyira hatékony, mint az LM609 és P1F6 kombinációja, nem ismert, de lehetséges, hogy a GenO95 alacsonyabb affinitással ismeri fel az avPs-at és ανβ5-όΐ, összehasonlítva az LM609-cel és PlF6-tal. Együtt ezek az adatok demonstrálják azt, hogy a GenO95 képes gátolni a mikrokapilláris-kialakulás komplex folyamatát in vitro.
Hivatkozások
1. Gastl G., Hermann T., Steurer M., Zmija J., Gunsilius E., Unger C. és Kraft A., „Angiogenesis as a Target for Tumor Treatment.”, Oncology 54, 177-184. old. (1997)
2. Eliceiri B.P. és Cheresh D.A., „The role of aV integrins during angiogenesis: insights into potential mechanisms of action and clinical development.”, The Journal of Clinical Investigation 103, 1227-1230. old. (1999)
3. Brooks P.C., Montgomery A.M., Rosenfeld M., Reisfeld R.A., „Integrin ανβ3 antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels.”, Cell 79, 1157-1164. old. (1994)
4. Enenstein J., Walweh N.S. és Kramer R.H., „Basic FGF and TGF-β differentially modulate integrin expression of human microvascular endothelial cells.”, Exp. Cell Res. 203, 499-503. old. (1992)
5. Friedlander M., Brooks P.C., Shaffer R.W., Kincaid C.M., Varner J.A. és Cheresh D.A., „Definition of two angiogenic pathways by distinct av integrins.”, Science 270, 15001502. old. (1995)
6. Nehls, V. és Drenckhahn, D., ”A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis.”, Microvascular Res. 50, 311-322. old. (1995)
5. példa: Duális integrin ellenanyag hatása endotéliális és daganatsejtek adhéziójára, migrációjára és inváziójára
Összefoglalás
A nehéz és könnyűlánc humán variábilis és állandó régiós ellenanyag-transzgénjeit tartalmazó (CBA/J x C57/BL/6J) F2 hibrid egereket (1-4) immunizáltunk humán placentáris αvβ3-mal. Egy fúzió teljesen humán, ανβ3-Γε specifikus IgGlK monoklonális ellenanyagot eredményezett, amelyet GenO95-nek neveztünk el. A teljesen humán ellenanyagról azt találtuk, hogy reagál az ανβ3 és avps integrinekkel (5). Ezek az integrinek részt vesznek az endotéliális és daganatsejtek adhéziójában, migrációjában és inváziójában. Tehát jellemeztük
- 90a GenO95 hatását az integrinek által közvetített sejtmozgékonyságra. A GenO95 gátolja humán köldökzsinórvéna endotéliális (HUVEC) és humán melanoma sejtek kötődését vitronektinhez, denaturált kollagénhez, fibrinogénhez és fibrinhez, de nem blokkolja a sejtek adhézióját fibronektinhez és Les típusú kollagénhez. A GenO95 gátolja a bázikus fibroblaszt növekedési faktorral és alacsony mennyiségű szérummal stimulált endotéliális sejtek migrációját is. A GenO95 gátolja daganatsejt invázióját, fibringélen keresztül. Összefoglalva, a GenO95 fünkcionálisan blokkolja az αvβ3-at és ανβί-öt különféle sejtalapú vizsgálati eljárásokban in vitro.
Rövidítések
BSA - marhaszérum-albumin
CO2 - szén-dioxid
DMSO - dimetil-szulfoxid
FBS - magzati marhaszérum lg - immunglobulin
Mab - monoklonális ellenanyag
OD - optikai denzitás
RT - szobahőmérséklet
HUVEC - humán köldökzsinórvéna endotéliális sejtek bFGF - szarvasmarha bázikus fibroblaszt növekedési faktor
Bevezetés
Jelenleg figyelemre méltó bizonyíték van arra, hogy a progresszív daganatnövekedés függ az angiogenezistől. Ezeknek a vérereknek a kialakulása ellátja a daganatokat tápanyagokkal és oxigénnel, eltávolítja a salakanyagokat, és a daganatsejtek távoli helyekre történő elterjedésének vezetékeként működik. Számos vizsgálat definiálta az integrinek szerepét az angiogenezis folyamatában. Az integrinek heterodimer transzmembrán fehérjék, amelyek kulcsszerepet játszanak a sejteknek az extracelluláris mátrixhoz (ECM) való adhéziójában, és közvetítik a sejtek túlélését, proliferációját és migrációját (6). Az angiogenezis folyamata során az ανβ3 és ανβ5 serkentett az aktivált endotéliális sejtek felszínén, ami pedig segíti ezeket a sejteket a migrációban és proliferációban (6). Az ανβ3 ellen termeltetett ellenanyag blokkolja a fibroblaszt növekedési hormon (bFGF) által indukált angiogenezist, míg az ανβ5-Γε specifikus ellenanyag gátolja a vaszkuláris endotéliális növekedési faktor (VEGF) által indukált angiogenezist (6,7). Az angiogenezis szabályozása mellett az ανβ3 és ανβ5 szabályozza a daganatsejtek adhézióját, migrációját és invázióját,
-91 amely folyamatok szükségesek a daganatsejt metasztázisához. Korábbi vizsgálatok azt mutatták, hogy a GenO95 kötődik a tisztított ανβ3 és ανβ5 integrinekhez, és ezért meghatároztuk, hogy képes-e ez az ellenanyag funkcionálisan gátolni az endotéliális és daganatsejtek ανβ3 és ανβδ által közvetített adhézióját, migrációját és invázióját.
Anyagok és eljárások
Anyagok
A szarvasmarha fíbroblaszt növekedési hormont (bFGF) és a humán 165-ös vaszkuláris endotéliális növekedési hormont (VEGF165) az R&D Systems cégtől 10 (Minneapolis, MN) szereztük be. MAB1976Z-t (LM609), amely egy ανβ3 integrin elleni monoklonális ellenanyag, és a MAB1961-et (P1F6), amely egy ανβ5 elleni monoklonális ellenanyag, a Chemicon cégtől (Temecula, CA) vásároltuk meg. A ReoPro (lot: 94A04ZE) és GenO95 (lot: JG100899) ellenanyagokat a Centocor-tól szereztük be. A BIOCOAT sejttenyésztő betéteket (pórusméret: 8 pm) a Becton Dickinson cégtől (Bedford, MA) 15 vásároltuk. A VybrantTM cell adhesion assay kit-et (V-13181) a Molecular Probes cégtől (Eugene, OR) vásároltuk. A humán plazminogén-mentes fibrinogént (VWF/Fn depletált) az Enzyme Research Labs cégtől (South Bend, IN) vásároltuk. A szarvasmarha bőreredetű zselatint a Sigma cégtől (Saint Louis, MO) vásároltuk. A humán vitronektint a Promega cégtől (Madison, WI) vásároltuk, és az Les típusú kollagént a GIBCO BRL cégtől 20 (Gaithersburg, MD) vásároltuk.
Sejtvonalak
Humán köldökzsinórvéna endotéliális sejteket (HUVEC) vásároltunk a Clonetics cégtől (Walkersville, MA), és tenyésztettük azokat EBM medium kit (Clonetics) alkalmazásával, amely 10% FBS-t, hosszú R-inzulin-szerű növekedési faktor-1-et, 25 aszkorbinsavat, hidrokortizont, humán epidermális növekedési faktort, humán vaszkuláris endotéliális növekedési faktort, gentamicin-szulfátot és amfotericin-B-t tartalmazott. A sejteket 37 °C-on és 5% CO2-ben tenyésztettük, és a tápközeget 2-3 naponta cseréltük. A sejteket akkor passzáltuk, amikor elérték a 80%-os konfluenciát. A 3-8. passzálást alkalmaztuk a kísérletekben.
Az ανβ3 és ανβ5 integrineket expresszáló A375S.2 humán melanoma sejtvonalat a „Centocor Cell Bank”-tói kaptuk, amikor a sejtvonalakat mikoplazma és bakteriális szennyeződésektől mentesnek ítélték. A sejteket 10% FBS-sel, 2 mM L-glutaminnal, 1 mM nátrium-piruváttal és 0,1 mM nem-esszenciális aminosavakkal kiegészített DMEM tápközegben tenyésztettük.
- 92A HT29 humán kolónkarcinóma sejteket a Centocor „Cell Biology Service Department”-től kaptuk, ahol a sejtvonalakat mikoplazma és bakteriális szennyeződésektől mentesnek ítélték. A sejteket 10% FBS-sel, 2 mM L-glutaminnal, 1 mM nátrium-piruváttal és 0,1 mM nem-esszenciális aminosavakkal kiegészített DMEM tápközegben tenyésztettük. Áramlási citometria
A felszíni integrinek detektálásához a sejteket begyűjtöttük, leöblítettük, felszuszpendáltuk kiegészítetlen RPMI tápközegben, és 60 percen keresztül folyamatosan inkubáltuk jégen anti-integrin monoklonális ellenanyaggal (10 μg/ml), és FITC-cel jelzett anti-egér ellenanyaggal (1:100), vagy FITC-cel jelzett anti-integrin ellenanyaggal (10 μg/ml). Az elsődleges ellenanyag hiánya vagy az elsődleges ellenanyag helyettesítése izotípus szerint illeszkedő ellenanyaggal szolgált negatív kontrollként. A sejteket azonnal elemeztük FACS Scan //áramlási citométerrel (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
Adhéziós vizsgálati eljárás
Mikrotiterlemezeket (Linbro-Titertek, ICN Biomedicals, Inc.) vontunk be éjszakán keresztül 4 °C-on vitronektinnel (1 μg/ml), zselatinnal (0,1%), fibrinogénnel (100 pg/ml), I-es típusú kollagénnel (10 μg/ml) vagy fíbronektinnel (10 gg/ml). Közvetlenül a felhasználás előtt a lemezeket leöblítettük PBS-sel, és blokkoltuk 1 órán keresztül 1% BSA/PBS pufferrel (pH 7,4). Fibrinnel bevont mikrotiterlemez-mérőhelyeket állítottunk elő fibrinogén trombinnal (1 U/ml) történő kezelésével. Tapadó sejteket (HUVEC, HT29 és A375S.2) jelöltünk Calcein AM fluoreszcens festékkel (Molecular Probes, Eugene, OR) a gyártó utasításai szerint, begyűjtöttük azokat, kétszer mostuk és felszuszpendáltuk 0,1% BSA-t tartalmazó DMEM tápközegben. Miután a sejtsűrűséget beállítottuk 5x 105/ml értékre, a sejteket ellenanyagok különböző koncentrációival inkubáltuk 15 percen keresztül 37 °C-on. A sejt-ellenanyag keveréket hozzáadtuk a mérőhelyekhez (100 μΐ/mérőhely) és 1 órán keresztül inkubáltuk 37 °C-on. A lemezeket leöblítettük kétszer PBS-sel, hogy eltávolítsuk a nem kötődött sejteket, és mértük az adhéziót mikrotiterlemez-leolvasóval (Fluoroskari) 485-538 nm-en. BSA-val bevont mérőhelyekhez való sejtadhézió szolgált negatív kontrollként. Izotípus szerint illeszkedő ellenanyagokat alkalmaztunk negatív kontrollként.
Kemotaktikus migrációs vizsgálati eljárás
Sejtmigrációs vizsgálati eljárást hajtottunk végre 24-Transwell kamrában polisztirol membránnal (6,5 mm átmérőjű, 10 pm vastagságú és 8 um pórusméretű). Konfluencia elérése előtti 24 órás sejttenyészeteket (HUVEC vagy A375S.2) begyűjtöttünk tripszin-EDTA-val, kétszer megmostunk, és újra felszuszpendáltunk 0,1% BSA-t tartalmazó megfelelő szérummentes tápközegben. Sejteket (100000/500 μΐ) adtunk a felső kamrába ellenanyagok
- 93 jelenlétében vagy hiányában. A kemotaktikus sejtmigráció elősegítésére 750 pl, 0,1% BSA-t és vitronektint (2 pg/ml), vagy szérumot (2% HUVEC esetében és 10% A375S2 sejtek esetében) tartalmazó tápközeget adtunk az alsó kamrákba, és a lemezt szövettenyésztő inkubátorba raktuk. A migrációt leállítottuk 4-8 óra elteltével, a felső kamrában lévő 5 sejteknek vattacsomóval történő eltávolításával, azután a szűrőket rögzítettük 3% paraformaldehiddel, és megfestettük kristály ibolyával. A sejtmigráció mértékét fénymikroszkópiával határoztuk meg, és a képeket a Phase 3 képanalizáló szoftverrel (Glen Mills, PA) elemeztük. A szoftver a festett sejtek által elfoglalt területet elemzi a szűrő alsó oldalán, és ez egyenesen arányos a sejtmigráció mértékével.
Haptotaktikus migrációs vizsgálati eljárás
Sejtmigrációs vizsgálati eljárást hajtottunk végre a Transwell kamrákban a fent leírtak szerint, kisebb módosításokkal. Röviden, a membrán alsó oldalát vitronektinnel (2 pg/ml) vontuk be 60 percen keresztül szobahőmérsékleten, és azután blokkoltuk 1% BSA/PBS pufferrel szobahőmérsékleten 60 percen keresztül. Azt követően a membránokat megmostuk 15 PBS-sel, és levegőn megszárítottuk. 0,1% BSA-t és bFGF-t (20 ng/ml) tartalmazó szérummentes tápközeget (750 pl) adtunk az alsó kamrákba. Konfluencia elérés előtti 24 órás sejttenyészeteket begyűjtöttünk tripszin-EDTA-val, kétszer megmostunk, és újra felszuszpendáltunk szérummentes tápközegben Sejteket (100000/500 pl) adtunk a felső kamrákba ellenanyagok jelenlétében vagy hiányában. A kamrákat szövettenyésztő 20 inkubátorba raktuk, és hagytuk a migrációt 6 órán keresztül folyni. A migráció mértékét a fent leírt módon határoztuk meg.
Inváziós vizsgálati eljárás
Fibrinogént (plazminogén-mentes, 100 pl, 10 mg/ml) és 100 pl 1 U/ml koncentrációjú trombint összekevertünk, és azonnal 24-mérőhelyes transwell mikrotiterlemezek (6,5 mm 25 átmérőjű, 10 pm vastagságú és 8 pm pórusméretű, Costar) felső kamrájába adtuk. A lemezeket 30 percen keresztül inkubáltuk 37 °C-on, fibringél keletkezése végett. Konfluens daganatsejteket (A375S.2) tripszinizáltunk, lecentrifugáltunk, újra felszuszpendáltunk 0,1% BSA-val és 10 pg/ml plazminogénnel (Enzyme Research Labs, South Bend, IN) és ellenanyagok különböző koncentrációival kiegészített alaptápközegben, majd 15 percen 30 keresztül inkubáltuk szobahőmérsékleten. Sejteket (100000/500 pl) adtunk a felső kamrába ellenanyagok jelenlétében vagy hiányában. Az inváziós kamra alsó rekeszét feltöltöttük 0,75 ml, kemoattraktánsként szolgáló 10% FBS-DMEM tápközeggel, és a lemezt áttettük szövettenyésztő inkubátorba. 24 óra elteltével az inváziót leállítottuk a felső kamrában lévő sejteknek vattacsomóval történő eltávolításával, azután a szűrőket rögzítettük 3%
- 94paraformaldehiddel, és megfestettük kristályibolyával. A sejtmigráció mértékét a Phase 3 képanalizáló szoftver alkalmazásával elemeztük a felt leírt módon.
Eredmények és diszkusszió
A GenO95 gátolja az ανβ3 és ανβδ általközvetített sejtmigrációt.
Mivel a GenO95 kötődik az ανβ3 és ανβ5 integrinekhez, meghatároztuk, hogy a daganatsejtek (A375S.2 és HT29) és endotéliális sejtek expresszálják-e ezeket az integrineket. Áramlási citometria azt mutatta, hogy az A375S.2 és HUVEC sejtek mind ανβ3, mind ανβί integrint is expresszálnak, de a HT29 sejtek csak ανβ? integrint expresszálnak, de avPa-at nem (12A-12I. ábrák).
A HT29 sejtek (12A., 12B. és 12C. ábrák) ανβ5-όΐ expresszálnak a felszínükön, de αvβ3-at nem. A HUVEC (12D., 12E. és 12F. ábrák) és A375S.2 (12G, 12H. és 121. ábrák) sejtek ανβ5 és ανβ3 integrineket expresszálnak a felszínükön. A daganatsejteket és endotéliális sejteket immunfluoreszcenciával festettük, és áramlási citometriával elemeztük. A baloldalon látható hisztogram a háttér-fluoreszcenciát reprezentálja, izotípus szerint illeszkedő ellenanyag jelenlétében. A jobboldalon látható hisztogram a pozitív festődést mutatja. A, D, G: LM609 (ανβ3 elleni monoklonális ellenanyag, 10 μg/ml); B, E, H: P1F6 (ανβ5 elleni monoklonális ellenanyag, 10 μg/ml); és C, F, I: GenO95 (10 μg/ml).
Részletesen meghatároztuk a GenO95 hatását HUVEC, A375S.2 és HT 29 sejteknek különböző mátrixfehérjékhez történő adhéziójára. A GenO95 teljesen gátolta a HUVEC és A375S.2 sejtek adhézióját vitronektinnel, és részlegesen gátolta fibrinogénnel, zselatinnal és fibrinnel bevont mikrotiterlemezekhez, jelezve, hogy az ellenanyag képes gátolni az ανβ3-ί és az ανβ5-όί (2. és 3. ábra, 1. és 2. táblázat).
A GenO95 teljesen gátolta HT-29 sejtek adhézióját vitronektinnel bevont mikrotiterlemezekhez, jelezve, hogy az ellenanyag gátolja ax ανβ5-οί (4. ábra). A GenO95 teljesen gátolta HUVEC és A375S.2 sejtek adhézióját vitronektinnel bevont mikrotiterlemezekhez, jelezve, hogy az ellenanyag gátolja az ανβ3-ΐ és az a^5-öt (2. és 3. ábra). Az adatokat százalékos maximális kötésként (ellenanyag nélkül) ábrázoltuk, és nemlineáris regressziót végeztünk GraphPadPrism alkalmazásával.
HUVEC sejteknek mátrixfehérjékkel bevont mikrotiterlemezekhez történő adhéziója
Az adhéziós vizsgálati eljárást az eljárásoknál leírt módon hajtottuk végre. A lemezt fluorométerben olvastuk le 485-538 nm-en. BSA-val bevont mérőhelyekhez való sejtadhézió szolgált negatív kontrollként. A 13. ábrán a sejtadhézió különböző koncentrációjú ellenanyag jelenlétében mért értékét ábrázoltuk sejtadhéziónak ellenanyag hiányában mért értékének
-95százalékaként, amit 100%-nak tekintettük. Minden adatpont három meghatározás átlaga (± szórás).
Humán melanoma sejteknek mátrixfehérjékkel bevont mikrotiterlemezekhez történő adhéziója
Az adhéziós vizsgálati eljárást az eljárásoknál leírt módon hajtottuk végre. BSA-val bevont mérőhelyekhez való sejtadhézió szolgált negatív kontrollként. A 14. ábrán a sejtadhézió különböző koncentrációjú ellenanyag jelenlétében mért értékét ábrázoltuk sejtadhéziónak ellenanyag hiányában mért értékének százalékaként, amit 100%-nak tekintettük. Minden adatpont három meghatározás átlaga (± szórás).
4. Táblázat. HUVEC sejtek adhéziója vitronektinhez, zselatinhoz, fibrinogénhez, fíbrinhez, fibronektinhez és I-es típusú kollagénhez. A sejtadhézió különböző koncentrációjú ellenanyag jelenlétében mért értékét ábrázoltuk sejtadhéziónak ellenanyag hiányában mért értékének százalékaként, amit 100%-nak tekintettünk. Minden adatpont három meghatározás 15 átlaga (± szórás). Az alkalmazott ellenanyag-koncentráció 10 pg/ml.
Adhézió (%) ± SD
Vitronektin Zselatin Fibrinogén Fibrin Fibronektin I-es típusú kollagén
Human IgG 96,3 ±11,4 109,0 ± 8,8 108,0 ±6,3 99,7 ± 4,5 96,8 ± 4,7 99,3 ±4,1
LM609 26,3 ±3,7 36,5 ±4,7 14,3 ±2,5 48,1 ± 1,5 102,8 ±7,2 108,8 ± 12,7
P1F6 39,8 + 5,9 94,4 ± 15,1 94,5 ± 4,2 96,7 ± 4,5 103,2 + 3,8 115,7 ± 8,1
LM609-P1F6 3,7 ± 0,4 32,2 + 5,2 10,7± 1,1 30,7 + 8,9 99,6 ±4,7 116,2 + 4,1
GenO95 3,3 ±0,6 54,8 ± 4,0 34,5 ± 1,7 45,1+2,4 101,6 ±6,1 97,7 ±3, 9
ReoPro 54,9 ± 0,9 2,5 ± 2,3 8,7 ±2,9 35,8 ±3,0 96,3 ± 2,8 99,6 ± 6,0
5. Táblázat. A375S.2 sejtek adhéziója vitronektinhez, zselatinhoz, fibrinogénhez, fíbrinhez, fibronektinhez és I-es típusú kollagénhez. A sejtadhézió különböző koncentrációjú 20 ellenanyag jelenlétében mért értékét ábrázoltuk sejtadhéziónak ellenanyag hiányában mért értékének százalékaként, amit 100%-nak tekintettünk. Minden adatpont három meghatározás átlaga (± szórás). Az alkalmazott ellenanyag-koncentráció 10 pg/ml.
Adhézió (%) ± SD
Vitronektin Zselatin Fibrinogén Fibrin Fibronektin I-es típusú kollagén
Human IgG 104,0 ± 5,3 94,6 ± 12,4 102,5 ±5,9 99,5 ±4,0 100,0 ± 5,5 99,1 ±3,3
LM609 42,1 ±6,1 25,2 ±7,1 14,0 ± 1,8 50,0 ± 1,9 104,0 ± 8,1 100,0 ± 1,5
P1F6 28,5 ±3,8 87,4 ± 7,8 99,4 ±3,6 92,9 ±4,7 101,0 ±5,7 101,0 ± 7,3
LM609-P1F6 0,9 ±0,3 1,1 ± 1,5 10,3 ±2,6 47,6 ±3,2 109,0 ±4,1 102,0 ±4,6
GenO95 1,4 ±0,4 23,2 ± 7,2 11,4 ±2,8 43,3 ±3,5 103,0 ±4,5 104,0 ± 5,9
ReoPro 38,1 ±0,7 6,0 ± 1,0 6,5 ±2,1 12,9 ±3,8 104,0 ± 5,6 93,1 ±3,1
HT29 humán kolónkarcinóma sejtek adhéziója vitronektinhez
Az adhéziós vizsgálati eljárást az eljárásoknál leírt módon hajtottuk végre. BSA-val bevont mérőhelyekhez való sejtadhézió szolgált negatív kontrollként. A 15. ábrán ábrázolt adatokat a maximális kötődés (ellenanyag nélkül) százalékában ábrázoltuk, és három párhuzamosban végzett meghatározások átlagai (± szórás).
A GenO95 gátolja humán melanoma és endotéliális sejtek migrációját
Az ανβ3 és ανβ5 integrinek részt vesznek a sejtmigrációban, és ezért meghatároztuk, hogy a GenO95 képe-e gátolni a vitronektin által stimulált sejtmigrációt. A vitronektin által stimulált sejtmigrációban részt vesz az ανβ3 és ανβ5· A GenO95 dózisfuggő módon gátolta az endotéliális sejtek migrációját, amikor vitronektint alkalmaztunk kemoattraktánsként (5. és 6. ábrák). Érdekes, hogy a GenO95 gátolta HUVEC és A375S.2 sejtek szérum felé történő migrációját is (7. és 8. ábrák). Ezek a felismerések potenciálisan fontosak lehetnek az angiogenikus daganatterápiában, mivel azt sugallják, hogy a GenO95 célpontjai, az ανβ3 és ανβδ központi jelentőségű receptorok, amelyek a szérumban jelenlévő különféle migrációs faktorok által aktiválódnak.
HUVEC migrációja 3 pg/ml vitronektin irányába
A vizsgálati eljárást az eljárásoknál leírt módon hajtottuk végre, és a sejteket 6 órán keresztül hagytuk migrálni. A mikrofotográfiák reprezentatív látótér (lOx objektív lencse) képek a sejtmigrációról, 16A. ábra, ellenanyag nélkül, 16B. ábra, GenO95 (5 pg/ml), 16C. ábra, GenO95 (40 pg/ml). A 16D. ábra a sejtmigráció grafikus ábrázolása GenO95 különböző koncentrációinak jelenlétében. Az adatokat normalizáltuk a kontroll (ellenanyag nélkül) százalékára, amit 100%-nak tekintettünk, és mindegyik pont 3 transwell szűrő átlaga (± szórás).
- 97 HUVEC sejtek migrációja 2 pg/ml vitronektin irányába ανβ3 és ανβ5 elleni ellenanyagok jelenlétében. A vizsgálati eljárást az eljárásoknál leírt módon hajtottuk végre, és a sejteket 6 órán keresztül hagytuk migrálni. Az LM609 és P1F6 monoklonális ellenanyagok sorrendben az ανβ3 és ανβ5 ellen irányulnak. A 17. ábrán bemutatott adatokat normalizáltuk a kontroll (ellenanyag nélkül) százalékára, amit 100%-nak tekintettünk, és mindegyik oszlop 3 transwell szűrő átlaga (± szórás). BSA, egér IgG és humán IgG szolgált negatív kontrollként. LM609-P1F6 mindkét ellenanyag kombinációját jelenti. Az ellenanyagokat és a BSA-t 10 pg/ml koncentrációban alkalmaztuk.
HUVECS migrációja 2% FBS irányába
A migrációs vizsgálati eljárást 4 órán keresztül hagytuk folyni, és az adatokat az eljárásoknál leírt módon gyűjtöttük. A 18A. ábrán az LM609, P1F6, LM609+P1F6 kombináció és izotípus szerint illeszkedő kontroll ellenanyagok (humán és egér) jelenlétében mért sejtmigrációt mutatjuk be. Az ellenanyagokat és a fehérjéket 10 pg/ml koncentrációban alkalmaztuk. A 18B. ábrán a sejtmigráció grafikus ábrázolását mutatjuk be ReoPro és GenO95 jelenlétében. A mikrofotográfíák reprezentatív látótér (lOx objektív lencse) képek a sejtmigrációról, 18C. ábra, ellenanyag nélkül, 18D. ábra GenO95 (5 pg/ml) és 18E. ábra GenO95 (20 pg/ml). Az adatokat normalizáltuk a kontroll (ellenanyag nélkül) százalékára, amit 100%-nak tekintettünk, és mindegyik pont 3 transwell szűrő átlaga (± szórás)
A375S.2 sejtek migrációja 10% FBS irányába
A migrációs vizsgálati eljárást 4 órán keresztül hagytuk folyni, és az adatokat az eljárásoknál leírt módon gyűjtöttük. Az ellenanyagokat 10 pg/ml koncentrációban alkalmaztuk. A 19A. ábrán a sejtmigráció grafikus ábrázolását mutatjuk be GenO95 különböző koncentrációinak jelenlétében. A 19B. ábrán az LM609, P1F6, LM609+P1F6 kombináció és izotípus szerint illeszkedő kontroll ellenanyagok (humán és egér) jelenlétében mért sejtmigrációt mutatjuk be. Az adatokat normalizáltuk a kontroll százalékára, amit 100%nak tekintettünk, és mindegyik pont 3 transwell szűrő átlaga (± szórás). A mikrofotográfíák reprezentatív látótér (lOx objektív lencse) képek a sejtmigrációról, 19C. ábra, ellenanyag nélkül, 19D. ábra, GenO95 (5 pg/ml) és 19E. ábra, GenO95 (20 pg/ml).
A fent bemutatott eredmények azt mutatják, hogy a GenO95 gátolja a daganatsejtek és endotéliális sejtek migrációját vitronektin és szérum irányába. Ezt követően meghatároztuk, hogy ez az ellenanyag képes-e gátolni a bFGF által stimulált sejtmigrációt. Amint a 9. ábrán bemutatjuk, a bFGF stimulálta HUVEC sejtek migrációját vitronektin irányába, és a GenO95 szignifikánsan blokkolta ezt a stimulált sejtmigrációt.
- 98 HUVEC sejtek migrációja vitronektin irányába bFGF jelenlétében
A migrációs kamrák szűrőinek alsó oldalát 2 μg/ml vitronektinnel vontuk be, és a vizsgálati eljárást az eljárásoknál leírt módon hajtottuk végre. A sejtek migrációját 6 órán keresztül hagytuk folyni. A 20A.-20E. ábrákon minden egyes adatpont 3 transwell szűrő átlaga (± szórás). 20A. ábra, bFGF; 20B. ábra, GenO95 (5 pg/ml); 20C. ábra, GenO95 (40 pg/ml); 20D. ábra, bFGF nélkül. A 20E. ábrán sejtmigráció gátlását mutatjuk be grafikusan különböző ellenanyagok jelenlétében.
A GenO95 blokkolja humán melanoma sejtek invázióját
A fent bemutatott eredmények azt jelzik, hogy a GenO95 képes gátolni sejtek adhézióját és migrációját. Tehát azt a kérdést tettük fel, hogy ez az ellenanyag képes-e blokkolni daganatsejtek invázióját, egy többlépéses folyamatot, amely magában foglalja sejtek adhézióját, a mátrix lebomlását és sejtek migrációját a lebomlott mátrixon keresztül. Fibrint választottunk a daganatsejt mátrixának, mivel a GenO95 képes volt gátolni daganatsejtek adhézióját fibrinhez (3. ábra). Amint a 10. ábrán bemutatjuk, az A375S.2 sejtek invázióját gátolhattuk LM609 ellenanyaggal, jelezve legalább az ανβ3 szerepét ebben a folyamatban A GenO95 dózisfüggő módon gátolta a daganatsejtek invázióját fíbrinen keresztül. Irreleváns, vérlemezke GPIIb/IIIa elleni IgG A elleni monoklonális ellenanyag (10E5) szolgált negatív kontrollként. Összességében ezek az adatok azt sugallják, hogy a GenO95 hatásosan képes gátolni humán melanoma sejtek invázióját.
A375S.2 sejtek inváziója fibringélen (5 mg/ml) keresztül
Az inváziós vizsgálati eljárást 24 órán keresztül hagytuk folyni, és az adatokat az eljárásoknál leírt módon gyűjtöttük. A mikrofotográfíák reprezentatív látótér (4x objektív lencse) képek a sejtmigrációról, 21 A. ábra, ellenanyagok nélkül, 21B. ábra, GenO95 (10 μg/ml), 21C. és 21D. ábra, GenO95, 10E5 F(ab’)2, LM609, P1F6, LM-P1F6 (LM609+P1F6), humán és egér IgG (Η-IgG és Μ-IgG) jelenlétében. A 21D. ábrán mindegyik ellenanyag és fehérje koncentrációja 10 μg/ml. Az adatokat normalizáltuk a kontroll (ellenanyag nélkül) százalékára, amit 100%-nak tekintettünk, és mindegyik pont 3 transwell szűrő átlaga (± szórás).
Konklúzió
A sejtek adhéziója, migrációja és inváziója integrineket, mint például ανβ3 és ανβ> integrineket igényel. A GenO95 képes funkcionálisan blokkolni az ανβ3 és ανβ5 integrineket, amelyeket endotéliális és daganatsejtek expresszálnak. A GenO95 képes volt gátolni bFGFfel vagy szérummal stimulált sejtek migrációját és invázióját. Ezek az eredmények azt
- 99sugallják, hogy a GenO95 hatásos inhibitora az daganatsejtek és endotéliális sejtek által expresszált ανβ3 ts ανβί integrineknek.
Hivatkozások
1. Taylor, L. D., C. E. Carmack, D. Huszar, K. M. Higgins, R. Mashayekh, G. Sequar,
S. R. Schramm, C-C. Kuo, S. L. O’Donnell, R. M. Kay, C. S. Woodhouse és N. Lonberg, „Human immunoglobulin transgenes undergo rearrangement, somatic mutation and class switching in mice that lack endogenous IgM”, International Immunology 6, 579-591. old.(1993)
2. Lonberg, N., L. D. Taylor, F. A. Harding, M. Trounstine, K. M. Higgins, S. R.
Schramm, C-C. Kuo. R. Mashayekh, K. Wymore, J. G. McCabe, D. Munoz-O’Regan, S. L. O’Donnell, E. S. G. Lapachet. T. Bengoechea, D. M. Fishwild, C. E. Carmack, R. M. Kay és D. Huszar, „Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications.”, Nature 368, 856-859. old. (1994)
3. Neuberger, M., „Generating high-avidity human Mabs in mice.”, Nature
Biotechnology 14, 826. old. (1996)
4. Fishwild, D. M., S. L. O’Donnell, T. Bengoechea, D. V. Hudson, F. Harding, S. L. Bernhard, D. Jones, R. M. Kay. K. M. Higgins, S. R. Schramm és N. Lonberg, „High-avidity human IgG monoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice.”, Nature 20 Biotechnology 14, 845-851. old. (1996)
5. Gastl, G., T. Hermann, M. Steurer, J. Zmija, E. Gunsilius, C. Unger és A. Kraft, „Angiogenesis as a Target for Tumor Treatment.”, Oncology 54, 177-184. old. (1997)
6. Eliceiri B. P. és D. A. Cheresh, „The role of aV integrins during angiogenesis: insights into potential mechanisms of action and clinical development.”, The Journal of 25 Clinical Investigation 103, 1227-1230. old. (1999)
7. Friedlander Μ., P. C. Brooks, R. W. Shaffer, C. M. Kincaid, J. A. Varner és D. A. Cheresh, „Definition of two angiogenic pathways by distinct av integrins.”, Science 270, 1500-1502. old. (1995)
Nyilvánvaló, hogy a találmányt másképpen is gyakorlatba lehet venni, mint ahogyan azt részletesen feltártuk a fenti leírásban és példákban.
A találmány számos módosítása és variációja lehetséges a fenti kitanítás fényében, és ezek a csatolt igénypontok oltalmi körébe esnek.

Claims (26)

- 100Szabadalmi igénypontok
1. Legalább egy izolált emlős anti-duális-integrin ellenanyag, amely legalább egy, 7. vagy 8. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó variábilis régiót tartalmaz.
5
2. Izolált nukleinsav, amely legalább egy, 7. vagy 8. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó variábilis régióval rendelkező legalább egy izolált emlős anti-duális-integrin ellenanyagot kódol.
3. Prokarióta vagy eukarióta gazdasejt, amely 2. igénypont szerinti izolált nukleinsavat tartalmaz.
10
4. Készítmény, amely legalább egy, 7. vagy 8. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó variábilis régióval rendelkező legalább egy izolált emlős anti-duális-integrin ellenanyagot és legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy oldószert tartalmaz.
5. Eljárás duális integrinnel kapcsolatos állapot diagnosztizálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben vagy állatban, azzal jellemezve, hogy legalább egy, 7. vagy 8.
6. Legalább egy izolált emlős anti-duális-integrin ellenanyag, amely vagy (i) az 1., 2. és 3. azonosítószámú szekvencia szerinti nehézlánc komplementaritást meghatározó régió 20 (CDR) aminosav-szekvenciák mindegyikét, vagy (ii) a 4., 5. és 6. azonosítószámú szekvencia szerinti könnyűlánc CDR aminosav-szekvenciák mindegyikét tartalmazza
7· Izolált nukleinsav, amely vagy (i) az 1., 2. és 3. azonosítószámú szekvencia szerinti nehézlánc CDR aminosav-szekvenciák mindegyikét, vagy (ii) a 4., 5. és 6. azonosítószámú szekvencia szerinti könnyűlánc CDR aminosav-szekvenciák mindegyikét tartalmazó legalább 25 egy izolált emlős anti-duális-integrin ellenanyagot kódol.
8. Prokarióta vagy eukarióta gazdasejt, amely 7. igénypont szerinti izolált nukleinsavat tartalmaz.
9. Készítmény, amely vagy (i) az 1., 2. és 3. azonosítószámú szekvencia szerinti nehézlánc CDR aminosav-szekvenciák mindegyikét, vagy (ii) a 4., 5. és 6. azonosítószámú 30 szekvencia szerinti könnyűlánc CDR aminosav-szekvenciák mindegyikét tartalmazó legalább egy izolált emlős anti-duális-integrin ellenanyagot és legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy oldószert tartalmaz.
10. Eljárás duális integrinnel kapcsolatos állapot diagnosztizálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben vagy állatban, azzal jellemezve, hogy vagy (i) az 1., 2. és 3.
- 101 azonosítószámú szekvencia szerinti nehézlánc CDR aminosav-szekvenciák mindegyikét, vagy (ii) a 4., 5. és 6. azonosítószámú szekvencia szerinti könnyűlánc CDR aminosav-szekvenciák mindegyikét tartalmazó legalább egy izolált emlős anti-duális-integrin ellenanyag hatásos mennyiségét tartalmazó készítményt érintkezésbe hozunk a sejttel, szövettel, szervvel vagy 5 állattal, vagy azt beadjuk annak.
11. Legalább egy izolált emlős anti-duális-integrin ellenanyag, amely az L, 2., 3., 4., 5. vagy 6. azonosító számú szekvenciák legalább egyike szerinti aminosav-szekvenciával rendelkező legalább egy nehézlánc vagy könnyűlánc CDR-t tartalmaz.
12. Izolált nukleinsav, amely az L, 2., 3., 4., 5. vagy 6. azonosítószámú szekvenciák 10 legalább egyike szerinti aminosav-szekvenciával rendelkező legalább egy nehézlánc vagy könnyűlánc CDR-rel rendelkező legalább egy izolált emlős anti-duális-integrin ellenanyagot kódol.
13. Prokarióta vagy eukarióta gazdasejt, amely 12. igénypont szerinti izolált nukleinsavat tartalmaz.
15
14. Készítmény, amely az L, 2., 3., 4., 5. vagy 6. azonosítószámú szekvenciák legalább egyike szerinti aminosav-szekvenciával rendelkező legalább egy nehézlánc vagy könnyűlánc CDR-rel rendelkező legalább egy izolált emlős anti-duális-integrin ellenanyagot és legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy oldószert tartalmaz.
15. Eljárás duális integrinnel kapcsolatos állapot diagnosztizálására vagy kezelésére 20 sejtben, szövetben, szervben vagy állatban, azzal jellemezve, hogy az L, 2., 3., 4., 5. vagy 6. azonosítószámú szekvenciák legalább egyike szerinti aminosav-szekvenciával rendelkező legalább egy nehézlánc vagy könnyűlánc CDR-rel rendelkező legalább egy izolált emlős antiduális-integrin ellenanyag hatásos mennyiségét tartalmazó készítményt érintkezésbe hozunk a sejttel, szövettel, szervvel vagy állattal, vagy azt beadjuk annak.
25
15 azonosítószámú szekvenciát tartalmazó variábilis régióval rendelkező legalább egy izolált emlős anti-duális-integrin ellenanyag hatásos mennyiségét tartalmazó készítményt érintkezésbe hozunk a sejttel, szövettel vagy állattal, vagy azt beadjuk annak.
16. Legalább egy izolált emlős anti-duális-integrin ellenanyag, amely duális integrin fehérjének ugyanazon régiójához kötődik, mint az L, 2., 3., 4., 5. vagy 6. azonosítószámú szekvenciák legalább egyike szerinti aminosav-szekvenciával rendelkező legalább egy nehézlánc vagy könnyűlánc CDR-t tartalmazó ellenanyag.
17. Izolált nukleinsav, amely duális integrin fehérjének az L, 2., 3., 4., 5. vagy 6.
30 azonosítószámú szekvenciák legalább egyike szerinti aminosav-szekvenciával rendelkező legalább egy nehézlánc vagy könnyűlánc CDR-t tartalmazó ellenanyaggal megegyező régiójához kötődő legalább egy izolált emlős anti-duális-integrin ellenanyagot kódol.
18. Prokarióta vagy eukarióta gazdasejt, amely 17. igénypont szerinti izolált nukleinsavat tartalmaz.
- 102-
19. Készítmény, amely duális integrin fehérjének az 1., 2., 3., 4., 5. vagy 6. azonosítószámú szekvenciák legalább egyike szerinti aminosav-szekvenciával rendelkező legalább egy nehézlánc vagy könnyűlánc CDR-rel rendelkező ellenanyagéval megegyező régiójához kötődő legalább egy izolált emlős anti-duális-integrin ellenanyagot és legalább egy 5 gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy oldószert tartalmaz.
20. Eljárás duális integrinnel kapcsolatos állapot diagnosztizálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben vagy állatban, azzal jellemezve, hogy duális integrin fehérjének az 1., 2., 3., 4., 5. vagy 6. azonosítószámú szekvenciák legalább egyike szerinti aminosavszekvenciával rendelkező legalább egy nehézlánc vagy könnyűlánc CDR-rel rendelkező 10 ellenanyagéval megegyező régiójához kötődő legalább egy izolált emlős anti-duális-integrin ellenanyag hatásos mennyiségét tartalmazó készítményt érintkezésbe hozunk a sejttel, szövettel, szervvel vagy állattal, vagy azt beadjuk annak.
21. Legalább egy izolált emlős anti-duális-integrin ellenanyag, amely legalább egy humán CDR-t tartalmaz, és amely specifikusan kötődik a 9. azonosítószámú szekvencia 15 legalább egy 1-3 aminosavát tartalmazó epitóphoz.
22. Legalább egy izolált nukleinsav, amely a 9. azonosítószámú szekvencia legalább egy 1-3 aminosavát tartalmazó epitóphoz specifikusan kötődő és legalább egy humán CDR-t tartalmazó legalább egy emlős anti-duális-integrin ellenanyagot kódol.
23. Prokarióta vagy eukarióta gazdasejt, amely 22. igénypont szerinti izolált 20 nukleinsavat tartalmaz.
24. Készítmény, amely a 9. azonosítószámú szekvencia legalább egy 1-3 aminosavát tartalmazó epitóphoz specifikusan kötődő és legalább egy humán CDR-t tartalmazó legalább egy emlős anti-duális-integrin ellenanyagot és legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy oldószert tartalmaz.
25
25. Eljárás duális integrinnel kapcsolatos állapot diagnosztizálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben vagy állatban, azzal jellemezve, hogy a 9. azonosítószámú szekvencia legalább egy 1-3 aminosavát tartalmazó epitóphoz specifikusan kötődő és legalább egy humán CDR-t tartalmazó legalább egy emlős anti-duális-integrin ellenanyag hatásos mennyiségét tartalmazó készítményt érintkezésbe hozunk a sejttel, szövettel vagy állattal, 30 vagy azt beadjuk annak.
26. Bármely leírásban feltárt találmány.
Védjegy Iroda Kft.
Lengyel Zsolt %
Szabadalmi 1 5i elölt
HU0302128A 2000-08-07 2001-08-07 Anti-duális-integrin ellenanyagok, készítmények, eljárások és alkalmazások HU229418B1 (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22336300P 2000-08-07 2000-08-07
US09/920,267 US7288390B2 (en) 2000-08-07 2001-08-01 Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
PCT/US2001/024784 WO2002012501A2 (en) 2000-08-07 2001-08-07 Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0302128A2 true HUP0302128A2 (hu) 2003-09-29
HUP0302128A3 HUP0302128A3 (en) 2005-11-28
HU229418B1 HU229418B1 (hu) 2013-12-30

Family

ID=26917697

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0302128A HU229418B1 (hu) 2000-08-07 2001-08-07 Anti-duális-integrin ellenanyagok, készítmények, eljárások és alkalmazások

Country Status (23)

Country Link
US (1) US7288390B2 (hu)
EP (2) EP1309693B1 (hu)
JP (1) JP5014557B2 (hu)
KR (1) KR100832486B1 (hu)
CN (1) CN1468307B (hu)
AT (1) ATE470714T1 (hu)
AU (1) AU8316701A (hu)
BR (1) BR0113112A (hu)
CA (1) CA2418962C (hu)
DE (1) DE60142342D1 (hu)
DK (1) DK1309693T3 (hu)
EA (1) EA007617B1 (hu)
ES (1) ES2346041T3 (hu)
HR (1) HRP20030088B1 (hu)
HU (1) HU229418B1 (hu)
IL (1) IL154326A0 (hu)
MX (1) MXPA03001230A (hu)
NO (1) NO334999B1 (hu)
NZ (1) NZ524146A (hu)
PL (1) PL213030B1 (hu)
PT (1) PT1309693E (hu)
RS (1) RS51197B (hu)
WO (1) WO2002012501A2 (hu)

Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030059427A1 (en) * 2000-04-28 2003-03-27 Force Walker R. Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody
US7163681B2 (en) * 2000-08-07 2007-01-16 Centocor, Inc. Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
US8703126B2 (en) 2000-10-12 2014-04-22 Genentech, Inc. Reduced-viscosity concentrated protein formulations
CN101508734A (zh) 2001-04-27 2009-08-19 协和发酵麒麟株式会社 抗cd40单克隆抗体
US7829087B2 (en) * 2001-07-09 2010-11-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating cognitive impairment
JP4351043B2 (ja) * 2001-07-09 2009-10-28 エラン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド アミロイド毒性の阻害方法
MY154009A (en) 2002-03-13 2015-04-30 Biogen Idec Inc Anti-alpha v beta 6 antibodies
AR042145A1 (es) * 2002-11-27 2005-06-08 Dow Agrociences Llc Produccion de inmunoglobulinas en plantas con una fucocilacion reducida
AU2004210679A1 (en) 2003-02-10 2004-08-26 Elan Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin formulation and method of preparation thereof
WO2004076488A1 (en) * 2003-02-27 2004-09-10 Theravision Gmbh A molecule which binds cd80 and cd86
JP4869064B2 (ja) 2003-04-04 2012-02-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド 高濃度抗体及びタンパク質製剤
US9708410B2 (en) 2003-05-30 2017-07-18 Janssen Biotech, Inc. Anti-tissue factor antibodies and compositions
US7365154B2 (en) 2003-06-23 2008-04-29 Centocor, Inc. Peptides antagonistic to an anti-angiogenic antibody and uses therefor
JPWO2005068504A1 (ja) * 2004-01-19 2008-01-10 株式会社医学生物学研究所 炎症性サイトカイン抑制剤
AU2012216372B2 (en) * 2004-04-02 2015-01-22 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating and preventing disease associated with alphaVbeta5 integrin
HRP20130782T1 (en) * 2004-04-02 2013-09-30 The Regents Of The University Of California, Office Of Technology Transfer Methods and compositions for treating and preventing disease associated with alpha v beta 5 integrin
US20060008415A1 (en) * 2004-06-25 2006-01-12 Protein Design Labs, Inc. Stable liquid and lyophilized formulation of proteins
US20060035239A1 (en) * 2004-08-06 2006-02-16 Applera Corporation Method and compositions for treating diseases targeting CD51
WO2006062779A2 (en) * 2004-12-09 2006-06-15 Centocor, Inc. Anti-integrin immunoconjugates, methods and uses
CN104072614B (zh) 2005-07-08 2017-04-26 生物基因Ma公司 抗-αvβ6 抗体及其用途
US7927590B2 (en) 2006-07-10 2011-04-19 Biogen Idec Ma Inc. Compositions and methods for inhibiting growth of smad4-deficient cancers
US8911964B2 (en) 2006-09-13 2014-12-16 Abbvie Inc. Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody
RU2518289C2 (ru) 2006-09-13 2014-06-10 Эббви Инк, Способ получения антитела или его фрагмента с подпиткой (варианты)
WO2008141276A1 (en) * 2007-05-11 2008-11-20 Centocor, Inc. Anti-alpha-v immunoliposome composition, methods and uses
US20090163698A1 (en) * 2007-05-11 2009-06-25 John Joseph Grigsby Method for Preparing Antibody Conjugates
US20090175784A1 (en) * 2007-05-11 2009-07-09 Joshua Goldstein Anti-Alpha V Immunoliposome Composition, Methods, and Uses
BRPI0816014A8 (pt) 2007-10-01 2018-06-19 Bristol Myers Squibb Co anticorpo humano monoclonal isolado, composição, conjugado anticorpo-molécula parceiro, mólecula isolada de ácido nucléico, vetor de expressão, célula hospedeira, método para preparar um anticorpo anti-mesotelina, método de inibição do crescimento de uma célula tumoral expressando a mesotelina, método de tratamento do câncer em um indivíduo, anticorpo anti-mesotelina isolado, e método de inibir o crescimento de uma célula expressando a mesotelina
EP2244729B1 (en) 2008-01-18 2016-11-02 MedImmune, LLC Cysteine engineered antibodies for site-specific conjugation
WO2009154995A2 (en) * 2008-05-27 2009-12-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Interleukin 10 receptor (il-10r) antibodies and methods of use
EP2373689A1 (en) 2008-12-12 2011-10-12 MedImmune, LLC Crystals and structure of a human igg fc variant with enhanced fcrn binding
AR076640A1 (es) 2009-03-06 2011-06-29 Genentech Inc Formulacion con anticuerpo. metodo para estabilizar anticuerpo. articulo de manufactura
CN102421420A (zh) * 2009-05-13 2012-04-18 蛋白传输解决方案有限责任公司 用于跨膜递送的药物系统
BRPI1015234A2 (pt) 2009-06-22 2018-02-20 Medimmune Llc regiões fc projetadas para conjugação sítio específica.
JP5755647B2 (ja) 2009-07-24 2015-07-29 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア αｖβ５インテグリンに関連する疾患の処置および予防のための方法および組成物
RU2015102845A (ru) 2010-02-23 2015-06-10 Санофи АНТИТЕЛА К ИНТЕГРИНУ α2 И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
US8993844B1 (en) 2010-05-27 2015-03-31 University Of Wyoming Production of spider silk protein in corn
ES2757857T3 (es) 2010-09-27 2020-04-30 Janssen Biotech Inc Anticuerpos de unión a colágeno II humano
US8906649B2 (en) 2010-09-27 2014-12-09 Janssen Biotech, Inc. Antibodies binding human collagen II
WO2012143497A2 (de) 2011-04-21 2012-10-26 Bayer Intellectual Property Gmbh Neue binder-wirkstoff konjugate (adcs) und ihre verwendung
EP2702077A2 (en) 2011-04-27 2014-03-05 AbbVie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
CN104039826A (zh) 2011-10-31 2014-09-10 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗体制剂
US9150645B2 (en) 2012-04-20 2015-10-06 Abbvie, Inc. Cell culture methods to reduce acidic species
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
US9181572B2 (en) 2012-04-20 2015-11-10 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
US9249182B2 (en) 2012-05-24 2016-02-02 Abbvie, Inc. Purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
EP2888287A4 (en) * 2012-08-21 2016-04-20 Ortho Clinical Diagnostics Inc ANTIBODIES AGAINST PALIPERIDONE HAPTENES AND THEIR USE
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
AU2013309506A1 (en) 2012-09-02 2015-03-12 Abbvie Inc. Methods to control protein heterogeneity
WO2014143205A1 (en) 2013-03-12 2014-09-18 Abbvie Inc. Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same
US8921526B2 (en) 2013-03-14 2014-12-30 Abbvie, Inc. Mutated anti-TNFα antibodies and methods of their use
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
US9499614B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides
US10035859B2 (en) 2013-03-15 2018-07-31 Biogen Ma Inc. Anti-alpha V beta 6 antibodies and uses thereof
EP2970475A1 (en) * 2013-03-15 2016-01-20 Biogen MA Inc. Treatment and prevention of acute kidney injury using anti-alpha v beta 5 antibodies
US10035860B2 (en) 2013-03-15 2018-07-31 Biogen Ma Inc. Anti-alpha V beta 6 antibodies and uses thereof
WO2015051293A2 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Abbvie, Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US8946395B1 (en) 2013-10-18 2015-02-03 Abbvie Inc. Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US20150139988A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
WO2015096982A1 (de) 2013-12-23 2015-07-02 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Binder-konjugate (adcs) mit ksp-inhibitoren
CN107001469A (zh) * 2014-09-12 2017-08-01 比奥根Ma公司 人源化抗‑αvβ5抗体及其用途
EP3194972B1 (en) 2014-09-17 2021-04-14 Merck Patent GmbH A method of treating bone metastasis diseases, medicaments therefore, and a method of predicting the clinical outcome of treating bone metastasis diseases
SG11201702135PA (en) 2014-09-17 2017-04-27 Merck Patent Gmbh A method of treating solid cancers and/or metastases thereof, medicaments therefore, and a method of predicting the clinical outcome of treating solid cancers and/or metastases thereof
CA2990076A1 (en) 2015-06-22 2016-12-29 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates (adcs) and antibody prodrug conjugates (apdcs) with enzymatically cleavable groups
CN106745817B (zh) * 2015-07-26 2020-12-15 苏州果汁网信息科技有限公司 一种去除含镉污水污染物的方法
WO2017060322A2 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Ptefb-inhibitor-adc
EA201891093A1 (ru) 2015-11-03 2018-10-31 Янссен Байотек, Инк. Антитела, специфически связывающие pd-1, и их применение
CN109069570A (zh) * 2015-12-16 2018-12-21 默沙东公司 抗lag3抗体和抗原结合片段
EP3207937A1 (en) * 2016-02-17 2017-08-23 Royal College of Surgeons in Ireland A method of treating or preventing sepsis
AU2017236431A1 (en) 2016-03-24 2018-09-27 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups
EP3471776B1 (en) 2016-06-15 2022-05-04 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody-drug-conjugates with ksp inhibitors and anti-cd123-antibodies
CN106265480A (zh) * 2016-09-03 2017-01-04 山西纳安生物科技有限公司 纳米抗体阴道给药系统及制备方法和应用
IL291308B2 (en) 2016-12-21 2024-07-01 Bayer Pharma AG Drug-antibody conjugates with enzymatically cleavable groups
EP3558386A1 (de) 2016-12-21 2019-10-30 Bayer Aktiengesellschaft Prodrugs von cytotoxischen wirkstoffen mit enzymatisch spaltbaren gruppen
WO2018114804A1 (de) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Spezifische antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) mit ksp-inhibitoren
CA3162181A1 (en) 2019-11-21 2021-05-27 Unity Biotechnology Antibodies directed to tie-2 and methods of use

Family Cites Families (184)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4309989A (en) 1976-02-09 1982-01-12 The Curators Of The University Of Missouri Topical application of medication by ultrasound with coupling agent
FR2374910A1 (fr) 1976-10-23 1978-07-21 Choay Sa Preparation a base d'heparine, comprenant des liposomes, procede pour l'obtenir et medicaments contenant de telles preparations
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4656134A (en) 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US5149636A (en) 1982-03-15 1992-09-22 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for introducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8426467D0 (en) 1984-10-19 1984-11-28 Technology Licence Co Ltd Monoclonal antibodies
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
EP0590689B2 (fr) 1985-03-30 2006-08-16 KAUFFMAN, Stuart A. Procédé d'obtention d'ADN, ARN, peptides, polypeptides ou protéines, par une technique de recombinaison d'ADN
SE448277B (sv) 1985-04-12 1987-02-09 Draco Ab Indikeringsanordning vid en doseringsanordning for lekemedel
US4766067A (en) 1985-05-31 1988-08-23 President And Fellows Of Harvard College Gene amplification
US4870163A (en) 1985-08-29 1989-09-26 New York Blood Center, Inc. Preparation of pure human tumor necrosis factor and hybridomas producing monoclonal antibodies to human tumor necrosis factor
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5576195A (en) 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
SE453566B (sv) 1986-03-07 1988-02-15 Draco Ab Anordning vid pulverinhalatorer
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4767402A (en) 1986-07-08 1988-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transdermal drug delivery
AU610083B2 (en) 1986-08-18 1991-05-16 Clinical Technologies Associates, Inc. Delivery systems for pharmacological agents
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US4704692A (en) 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
DE3631229A1 (de) 1986-09-13 1988-03-24 Basf Ag Monoklonale antikoerper gegen humanen tumornekrosefaktor (tnf) und deren verwendung
IL83419A0 (en) 1986-09-15 1988-01-31 Westinghouse Electric Corp Antibodies reactive with chlorinated phenols,their preparation and their use
US4921794A (en) 1987-01-14 1990-05-01 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US4795699A (en) 1987-01-14 1989-01-03 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
EP0279582A3 (en) 1987-02-17 1989-10-18 Pharming B.V. Dna sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
EP0349578B2 (en) 1987-03-02 1998-10-28 Enzon Labs Inc. Organism carrying a Single Chain Antibody Domain at its surface.
JP2647427B2 (ja) 1987-04-24 1997-08-27 帝人株式会社 被検者の病態の判定のための検出方法、モノクロ−ナル抗体および検出キット
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
CA1341235C (en) 1987-07-24 2001-05-22 Randy R. Robinson Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US4939666A (en) 1987-09-02 1990-07-03 Genex Corporation Incremental macromolecule construction methods
DE68926882T2 (de) 1988-01-11 1997-02-13 Xoma Corp Plasmidvektor mit pectatlyase-signalsequenz
US6010902A (en) 1988-04-04 2000-01-04 Bristol-Meyers Squibb Company Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity
US4956288A (en) 1988-04-22 1990-09-11 Biogen, Inc. Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5142033A (en) 1988-09-23 1992-08-25 Hoffmann-La Roche Inc. Structure-independent DNA amplification by the polymerase chain reaction
US5091310A (en) 1988-09-23 1992-02-25 Cetus Corporation Structure-independent dna amplification by the polymerase chain reaction
US5066584A (en) 1988-09-23 1991-11-19 Cetus Corporation Methods for generating single stranded dna by the polymerase chain reaction
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US4994370A (en) 1989-01-03 1991-02-19 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services DNA amplification technique
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5266491A (en) 1989-03-14 1993-11-30 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. DNA fragment and expression plasmid containing the DNA fragment
DE3909708A1 (de) 1989-03-23 1990-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung bispezifischer antikoerper
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
AU652539B2 (en) 1989-05-16 1994-09-01 Medical Research Council Co-expression of heteromeric receptors
DE69029036T2 (de) 1989-06-29 1997-05-22 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
WO1991002078A1 (en) 1989-08-07 1991-02-21 Peptide Technology Ltd Tumour necrosis factor binding ligands
JP3127158B2 (ja) 1989-10-05 2001-01-22 オプテイン，インコーポレイティド 新規の遺伝子及びポリペチドの無細胞合成並びに単離
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5580575A (en) 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
ATE139258T1 (de) 1990-01-12 1996-06-15 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
TW212184B (hu) 1990-04-02 1993-09-01 Takeda Pharm Industry Co Ltd
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
ES2109945T3 (es) 1990-06-01 1998-02-01 Chiron Corp Composiciones y procedimientos para identificar moleculas biologicamente activas.
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
JPH06500011A (ja) 1990-06-29 1994-01-06 ラージ　スケール　バイオロジー　コーポレイション 形質転換された微生物によるメラニンの製造
US5580734A (en) 1990-07-13 1996-12-03 Transkaryotic Therapies, Inc. Method of producing a physical map contigous DNA sequences
EP0542810A1 (en) 1990-08-02 1993-05-26 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1994025585A1 (en) 1993-04-26 1994-11-10 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992005258A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 La Trobe University Gene encoding barley enzyme
GB9022648D0 (en) 1990-10-18 1990-11-28 Charing Cross Sunley Research Polypeptide and its use
WO1992008802A1 (en) 1990-10-29 1992-05-29 Cetus Oncology Corporation Bispecific antibodies, method of production, and uses thereof
CA2405246A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with alterred binding properties
US5582996A (en) 1990-12-04 1996-12-10 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
EP0572529A4 (en) 1991-02-21 1994-11-02 Gilead Sciences Inc SPECIFIC APTAMER OF BIOMOLECULES AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME.
US5404871A (en) 1991-03-05 1995-04-11 Aradigm Delivery of aerosol medications for inspiration
ATE240740T1 (de) 1991-03-15 2003-06-15 Amgen Inc Pegylation von polypeptiden
DE69233750D1 (de) 1991-04-10 2009-01-02 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer Rezeptoren mittels Phagemiden
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
DE69230613T2 (de) 1991-07-02 2000-12-28 Inhale Inc Verfahren und vorrichtung zum abgeben von medikamenten in aerosolform
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5968502A (en) 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
US5885793A (en) 1991-12-02 1999-03-23 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
JP4157160B2 (ja) 1991-12-13 2008-09-24 ゾーマ テクノロジー リミテッド 改変抗体可変領域の調製のための方法
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
DE4207475A1 (de) 1992-03-10 1993-09-16 Goldwell Ag Mittel zum blondieren von menschlichen haaren und verfahren zu dessen herstellung
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
CA2132091C (en) 1992-04-03 2008-09-16 Kyung J. Kim Antibodies to alphavbeta3 integrin
WO1994006498A1 (en) 1992-09-23 1994-03-31 Fisons Plc Inhalation device
WO1994008038A1 (en) 1992-10-02 1994-04-14 Trustees Of Dartmouth College Bispecific reagents for redirected targeting of low density lipoprotein
CZ282964B6 (cs) 1992-10-19 1997-11-12 Dura Pharmaceuticals, Inc. Inhalátor pro inhalování suchého prášku
US5643252A (en) 1992-10-28 1997-07-01 Venisect, Inc. Laser perforator
WO1994012520A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
AU675689B2 (en) 1992-12-01 1997-02-13 Merck & Co., Inc. Fibrinogen receptor antagonists
US5849695A (en) 1993-01-13 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Parathyroid hormone analogues useful for treatment of osteoporosis and disorders of calcium meatabolism in mammals
AU5883694A (en) 1993-01-19 1994-08-15 Glaxo Group Limited Device
PL310327A1 (en) 1993-02-12 1995-12-11 Univ Leland Stanford Junior Adjustable transcription of target genes and other biological processes
US5770428A (en) 1993-02-17 1998-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Chimeric retrovial expression vectors and particles containing a simple retroviral long terminal repeat, BLV or HIV coding regions and cis-acting regulatory sequences, and an RNA translational enhancer with internal ribsome entry site
EP0614989A1 (en) 1993-02-17 1994-09-14 MorphoSys AG A method for in vivo selection of ligand-binding proteins
US5514670A (en) 1993-08-13 1996-05-07 Pharmos Corporation Submicron emulsions for delivery of peptides
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
DE4337197C1 (de) 1993-10-30 1994-08-25 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur selektiven Herstellung von Hybridomazellinien, die monoklonale Antikörper mit hoher Zytotoxizität gegen humanes CD16-Antigen produzieren, sowie Herstellung bispezifischer monoklonaler Antikörper unter Verwendung derartiger monoklonaler Antikörper und des CD30-HRS-3-Antikörpers zur Therapie menschlicher Tumore
US5814599A (en) 1995-08-04 1998-09-29 Massachusetts Insitiute Of Technology Transdermal delivery of encapsulated drugs
SE9304060D0 (sv) 1993-12-06 1993-12-06 Bioinvent Int Ab Sätt att selektera specifika bakteriofager
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
AU692239B2 (en) 1994-03-07 1998-06-04 Medarex, Inc. Bispecific molecules having clinical utilities
US5753230A (en) 1994-03-18 1998-05-19 The Scripps Research Institute Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
US5763733A (en) 1994-10-13 1998-06-09 Enzon, Inc. Antigen-binding fusion proteins
PT719859E (pt) 1994-12-20 2003-11-28 Merck Patent Gmbh Anticorpo monoclonal anti-alfa v-integrina
US5549551A (en) 1994-12-22 1996-08-27 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Adjustable length balloon catheter
US5674483A (en) 1995-01-31 1997-10-07 National Jewish Medical And Research Center Treatment for diseases involving inflammation
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6037453A (en) 1995-03-15 2000-03-14 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
US5656730A (en) 1995-04-07 1997-08-12 Enzon, Inc. Stabilized monomeric protein compositions
EP1978033A3 (en) * 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
RU2214268C2 (ru) 1995-08-14 2003-10-20 Дзе Скриппс Рисерч Инститьют СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ, ПОЛЕЗНЫЕ ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ АНГИОГЕНЕЗА, ОПОСРЕДОВАННОГО αvβ5
US20030009404A2 (en) * 1995-10-12 2003-01-09 Mopex, Inc. Open end mutual fund securitization process
GB9526100D0 (en) 1995-12-20 1996-02-21 Intersurgical Ltd Nebulizer
AP9801285A0 (en) 1996-01-03 1998-09-30 Glaxo Group Ltd Inhalation device.
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
DE69710319T2 (de) 1996-03-29 2002-08-14 G.D. SEARLE & CO., CHICAGO Para-substituierte phenylpropansäure derivate als integrin-antagonisten
DE19624387C2 (de) 1996-06-19 1999-08-19 Hatz Motoren Kaltstartvorrichtung
DK0826695T3 (da) 1996-09-03 2002-04-15 Gsf Forschungszentrum Umwelt Tilintetgørelse af kontaminerende tumorceller i stamcelletransplantater med bispecifikke antistoffer
JP4044648B2 (ja) 1996-10-04 2008-02-06 日本エンバイロケミカルズ株式会社 洗剤またはその分解物の免疫学的分析用モノクローナル抗体およびその用途
AU5702298A (en) 1996-12-03 1998-06-29 Abgenix, Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and VK regions nd antibodies produced therefrom
US20010011125A1 (en) 1997-01-30 2001-08-02 William D. Huse Anti-alpha v beta 3 recombinant human antibodies, nucleic acids encoding same and methods of use
US5879681A (en) 1997-02-07 1999-03-09 Emisphere Technolgies Inc. Compounds and compositions for delivering active agents
US5921447A (en) 1997-02-13 1999-07-13 Glaxo Wellcome Inc. Flow-through metered aerosol dispensing apparatus and method of use thereof
PT973550E (pt) 1997-04-11 2003-01-31 Searle & Co Anticorpos antagonistas anti-integrina avb3
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
IL120943A (en) 1997-05-29 2004-03-28 Univ Ben Gurion A system for administering drugs through the skin
US6160099A (en) 1998-11-24 2000-12-12 Jonak; Zdenka Ludmila Anti-human αv β3 and αv β5 antibodies
US6521593B1 (en) 1999-02-01 2003-02-18 Childrens Hospital Los Angeles Methods for inhibiting brain tumor growth
WO2000064946A2 (en) 1999-04-28 2000-11-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting vegf
US6175824B1 (en) * 1999-07-14 2001-01-16 Chi Research, Inc. Method and apparatus for choosing a stock portfolio, based on patent indicators
US7184981B2 (en) * 1999-12-06 2007-02-27 X/Net Associates, Inc. Method and system for the creation of a class of loan securities
US6484152B1 (en) * 1999-12-29 2002-11-19 Optimumportfolio.Com, Llc Automated portfolio selection system
US6604113B1 (en) * 2000-04-14 2003-08-05 Qwest Communications International, Inc. Method and apparatus for providing account information
US20020059126A1 (en) * 2000-06-27 2002-05-16 John Ricciardi System and method for a selecting an investment item
US20030093353A1 (en) * 2000-07-05 2003-05-15 Marketocracy System and method for creating and maintaining investment portfolios
IL157153A0 (en) * 2001-02-06 2004-02-08 Strategic Capital Network Llc System for facilitating selection of investments
WO2002089033A1 (en) * 2001-04-30 2002-11-07 Philip Tan Meng Ngee A multi-dimensional method and system of simulating and managing an alliance investment portfolio
US20030036945A1 (en) * 2001-05-22 2003-02-20 Del Vecchio Joseph Nicholas System, method and computer program product for assessing the value of intellectual property
US20020178099A1 (en) * 2001-05-25 2002-11-28 Shayne Young Methods and systems for managing a portfolio of securities
US7509278B2 (en) * 2001-07-16 2009-03-24 Jones W Richard Long-term investing
US7512555B2 (en) * 2001-11-13 2009-03-31 Gregory M Finn Investment management tool
EP1585477A4 (en) * 2001-11-30 2007-06-27 Centocor Inc ANTI-TNF ANTIBODIES, COMPOSITIONS, METHODS AND USES
US7433839B2 (en) * 2002-03-20 2008-10-07 Bodurtha Stephen G Total return asset contracts and associated processing systems
US20040002892A1 (en) * 2002-03-20 2004-01-01 Martin Gluck Portal for global portfolio management system method & apparatus
US7599870B2 (en) * 2002-04-12 2009-10-06 Glo Software Llc System, method and framework for generating scenarios
US20040024673A1 (en) * 2002-07-31 2004-02-05 International Business Machines Corporation Method for optimizing the allocation of resources based on market and technology considerations
US7606756B2 (en) * 2002-08-02 2009-10-20 Jpmorgan Chase Bank, N.A. Synthetic funds having structured notes
US20040111350A1 (en) * 2002-08-14 2004-06-10 Water Street Advisers, Inc. Process to create market-sector investment portfolio performance indices
US7340425B2 (en) * 2002-10-29 2008-03-04 First Trust Portfolios, L.P. Method for generating a portfolio of stocks
US8121889B2 (en) * 2003-05-16 2012-02-21 International Business Machines Corporation Information technology portfolio management
US20050267835A1 (en) * 2003-12-31 2005-12-01 Scott Condron System and method for evaluating exposure across a group of investment portfolios by category
US20050251465A1 (en) * 2004-05-02 2005-11-10 Brown Daniel P System and method for structuring and operating an investment vehicle
US7739183B2 (en) * 2004-06-03 2010-06-15 Voudrie Jeffrey D Real-time client portfolio management system
US8442889B2 (en) * 2004-07-12 2013-05-14 Darrin B. Farrow Asset allocation based system for individual investor portfolio selection
US20060031149A1 (en) * 2004-08-04 2006-02-09 Lyons Timothy J Investment vehicle and methods and systems for implementing investment strategy
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件

Also Published As

Publication number Publication date
CN1468307A (zh) 2004-01-14
RS51197B (sr) 2010-12-31
HRP20030088B1 (hr) 2012-12-31
NZ524146A (en) 2005-11-25
YU9403A (sh) 2006-05-25
IL154326A0 (en) 2003-09-17
HRP20030088A2 (en) 2007-04-30
US7288390B2 (en) 2007-10-30
HU229418B1 (hu) 2013-12-30
JP2004510414A (ja) 2004-04-08
PT1309693E (pt) 2010-08-09
JP5014557B2 (ja) 2012-08-29
HUP0302128A3 (en) 2005-11-28
EP1309693A2 (en) 2003-05-14
EP2253646A1 (en) 2010-11-24
EA200300244A1 (ru) 2004-02-26
US20030040044A1 (en) 2003-02-27
EA007617B1 (ru) 2006-12-29
MXPA03001230A (es) 2004-01-29
DK1309693T3 (da) 2010-09-27
KR100832486B1 (ko) 2008-05-26
AU2001283167A2 (en) 2002-02-18
CA2418962C (en) 2012-02-21
AU2001283167A9 (en) 2002-02-18
CA2418962A1 (en) 2002-02-14
DE60142342D1 (de) 2010-07-22
WO2002012501A3 (en) 2003-01-03
ES2346041T3 (es) 2010-10-08
WO2002012501A2 (en) 2002-02-14
PL366211A1 (en) 2005-01-24
BR0113112A (pt) 2004-04-20
NO20030621D0 (no) 2003-02-07
PL213030B1 (pl) 2012-12-31
NO334999B1 (no) 2014-08-18
NO20030621L (no) 2003-04-01
CN1468307B (zh) 2010-04-28
AU8316701A (en) 2002-02-18
ATE470714T1 (de) 2010-06-15
KR20030022369A (ko) 2003-03-15
EP1309693B1 (en) 2010-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1309693B1 (en) Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
US7550142B2 (en) Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
US9828424B2 (en) Anti-TNF antibodies, compositions, methods and uses
US7166285B2 (en) Anti-IL-12 antibodies and compositions
HUP0302376A2 (hu) Anti-TNF ellenanyagok, készítmények, eljárások és alkalmazások
AU2007202670B2 (en) Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
AU2001283167B2 (en) Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
HK1151042A (en) Anti-dual integrin antibody and compositions and conjugates comprising said antibody
AU2001283167A1 (en) Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
ZA200301864B (en) Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses.
ZA200301867B (en) Anti-IL-12 antibodies, compositions, methods and uses.

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees