HUP0003393A2 - Hosszan tartó felszabadulású, késleltetett gélek - Google Patents

Abstract

A jelen találmány alginát késleltetett géleket használó, hosszan tartófelszabadulású készítményekkel és az ezekkel kapcsolatos módszerekkelkapcsolatos. A hosszan tartó felszabadulású, késleltetettgélkészítmény tartalmaz a) egy hidrofil polimert, b) egy biológiailagaktív anyagot és c) legalább egy kötött polivalens fémiont. Ó

Description

69.144/SZE

S.B.G. & K.

Nemzetközi Szabadalmi Iroda H-1062 Budapest, Andrássy út 113. Telefon: 34-24-950, Fax: 34-24-323

KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY

HOSSZAN TARTÓ FELSZABADULÁSÚ, KÉSLELTETETT GÉLEK

A TALÁLMÁNY TERÜLETE

A jelen találmány alginát késeltetett géleket használó, hosszan tartó felszabadulású formulákkal és az ezekkel kapcsolatos módszerekkel kapcsolatos.

A TALÁLMÁNY HÁTTERE

A gén- és sejtsebészeti technológiák fejlődésével a rekombináns proteinek elérhetősége előrelépést jelentett a proteinek terápiás alkalmazásokhoz való gyógyszerekként történő felhasználásában. Számos, gyógyszerészeti proteinekkel kezelt betegség vagy betegségi állapot, hosszantartó protein szinteket tesz szükségessé ahhoz, hogy a leghatékonyabb terápiás eredményt biztosíthassa. Azonban, ahogy a legtöbb protein gyógyszerek esetében, az általában rövid biológiai felezési idő folyamatos alkalmazást tesz szükségessé. Ezeket az ismételt injekciókat különböző időpontokban adjuk, ami változó gyógyszer szinteket eredményez, szignifikáns fizikai és pénzügyi korlátozást jelent a beteg szempontjából. Miután számos betegségi állapot jobban reagál a szabályozott szintű gyógyszerekre, szükség van szabályozott felszabadulású gyógyszerészeti készítményekre a hosszabb ideig tartó, állandó felszabadulás biztosításához. A hosszan tartó felszabadulású gyógyszerek nem csupán fokozott profilaktikus, terápiás vagy diagnosztikai hatást biztosítanak a betegnek, de csökkentik az injekciók gyakoriságát valamint a teljes költséget.

A dózisok között a gyógyszer szintek emberekben vagy állatokban való fenntartására tett jelenlegi erőfeszítések magukba foglalják a biológiailag lebontható polimerek használatát, melyek mátrixokként szabályozzák a gyógyszer felszabadulását. Például az 1.388.580 GB Szabadalom hidrogélek használatát írja le a hosszan tartó felszabadulású inzulinhoz. A 4.789.550 számú US szabadalmi alkalmazás a polilizinnel borított alginát mikrokapszulákat írja le, melyek bekapszulázott élő sejtek révén biztosítja a proteint. A hosszan tartó felszabadulású gyógyszerek előállítására tett erőfeszítések során anionos vagy kationos polimerek készítményeket is hasznosítunk, melyeket az ellentétes töltésű ionos polimerekkel veszünk körül a biológiailag aktív készítmény előállítására képes sejtek bekapszulázásához. 4.744.933 számú US szabadalmi alkalmazás. Hasonlóképpen, többszörös borítású anionos vagy kationos kereszt kötődő polimerek is leírásra kerültek már, olyan eszközökként, melyekkel szabályozott felszabadulást lehetett elérni. 4.690.682 és 4.798.516 számú US szabadalmi alkalmazások. Ezenkívül, további kísérletekben alginátok magukban történő használatát is leírták vagy más biológiailag lebontható polimerekkel burkolt alginátok használatát, a polipeptid készítmények vagy ezek kationos csapadékának szabályozott felszabadulásához. PCT WO 96/00081, PCT WO 95/29664 és PCT WO 96/03116.

Ezek a kísérletek azonban nem kielégítő eszközöket biztosítottak a kívánt protein gyógyszerek hosszan tartó felszabadulásának biztosításához. Általában ismert, hogy bizonyos biológiailag lebontható polimerek, mint például a polilaktid ko-glikolid, in vivo körülmények között magas kezdeti gyógyszer kiszabadulással jellemezhető. Johnson, O. et al., Nature Med., 2/7:795 (1996). Ezenkívül, általánosságban ismert, hogy a jelenlegi hosszan tartó felszabadulású készítményekkel használt proteinek denaturálódhatnak és elveszíthetik bioaktivitásukat, ha a bekapszulázó anyaggal érintkeznek. Az ilyen készítményekben szerves oldószereket használnak, melyek káros hatással lehetnek a kiválasztott proteinre. Végül, ahogy azt a későbbiekben tárgyaljuk, az alginát egyedüli használata nem biztosította a hatékony terápiás eredményekhez szükséges kívánt szabályozott protein felszabadulást.

Általában, az alginátok jól ismert, természetesen előforduló, anionos poliszacharidok, melyek 1,4-kötésü-p-D-mannuronsavból és a-Lglükuronsavból állnak. Smidsrod, 0., et al., Trends in Biotechnology, 8: 71-78 (1990); Aslani, P., et al., J. Microencapsulation 13/5:601-614 (1996). Az alginátok tipikusan a következőket tartalmazzák: 70 % mannuronsav és 30 % glükuronsav - 30 % mannuronsav és 70 % glükuronsav. Smidsrod supra. Az alginátsav vízben oldhatatlan, míg a monovalens ionokkal, például nátriummal, káliummal és ammóniummal képzett sói vizoldhatóak. McDowell, R.H., Properties of Alginates” (London Alginate Industries Ltd., 4th edition, 1977). A polivalens ionokról ismert, hogy reakcióba lépnek az alginátokkal és spontán módon géleket képeznek.

Az alginátokat széles körben alkalmazzák élelmiszer adalékokként, adhéziós anyagokként, gyógyszerészeti tablettákként, új sejt növekedési templátokként és seb kötszerként. Az alginátokat javasolják protein szeparációs technikákhoz is. Például, Grey, C.J. et al., in Biotechnology and Bioengineering, 31:607-612 (1988) a cink/kalcium alginát gélekbe zárt inzulin az inzulin más szérum proteinektől való szeparálására.

Az alginát mátrixok jól dokumentált gyógyszer szállító rendszerek, lásd például 4.695.463 számú US szabadalmi alkalmazást, melyben az alginát alapú rágógumi bejuttatás! rendszer és gyógyszerészeti

Y készítmény került leírásra. Alginát gyöngyöket használtak a különböző proteinek szabályozott felszabadulásához, ilyen proteinek például a tumor nekrózis faktor receptor a polikationokkal borított kation-alginát gyöngyökben. Wee, S.F. Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 21:730-31 (1994); a transzformáló növekedési faktor, melyet alginát gyöngyökbe kapszuláztak, Puolakkainen, P.A. et al., Gastorentoerology, 107:1319-1326 (1994); angiogen faktorok, melyeket kalcium-alginát gyöngyökbe zártak, Downs, E.C. et al., J. of Cellular Physiology, 152:422-429 (1992); albumin, melyet kitozán-alginát mikrokapszulákba helyeztek, Polk, A. et al., J. Pharmaceutical Sciences, 83/2:178-185 (1994), vagy polimerekkel borított kitozán-kalcium alginát gyöngyökbe, Okhamafe, A.O. et al., J. Microencapsulation, 13/5:497-508 (1996); hemoglobulin, melyet kitozán-kalcium alginát gyöngyökbe kapszuláztak, Huguet, M.L. et al., J. Applied Polymer Science, 51:14271432 L994), Huguet, M.L. Process Biochemistry, 31:745-751 (1996); és interleukin-2, melyet alginát-kitozán mikroszférákba kapszuláztak, Liu, L.S. et al., Proced. Intern. Symp. Contrail. Rel. Biact. Mater., 22:542-543 (1995).

A protein bekapszulázására alginát gél gyöngyöket vagy alginát/kálcium gél gyöngyöket használó rendszerek nem rendelkeznek semmilyen hosszantartó felszabadulási hatással a protein alginát gyöngyökből való gyors kiszabadulásának köszönhetően. Liu, L. et al., J. Control. Rel. 43:65-74 (1997). Az ilyen gyors kiszabadulás elkerüléséhez a fenti rendszerekből számosban megkísérelték a polikationos polimer burkolás alkalmazását (például polilizin, kitozán) a protein alginát gyöngyök kiszabadulásának késleltetése céljából. Lásd például Wheatley, M.A. et al., J. Applied Polymer Science, 43:2123-2135 (1991); Wee, S.F. et al., supra, Liu, L.S. et al., supra; Wee, S.F. et al., Controlled Release Society, 22:566-567 (1995) és Lim et al., supra.

A polikationok, mint a polilizin pozitív töltésű polielektrolitok, melyek kölcsönhatásba lépnek a negatív töltésű alginát molekulákkal és polielektrolit komplexeket képeznek, melyek diffúziós korlátként működnek a gyöngy felszínén. A polikationok használatával kapcsolatban problémák merülhetnek fel:

(1) az ilyen készítmények citotoxikusak lehetnek a polikationok miatt (Huguet, M.L. et al., supra; Zimmermann, Ulrich, Electrophoresis, 13:269 (1992); Bergmann, P. et al., Clinical Science, 67:35 (1984));

(2) a polikationok hajlamosak az oxidációra;

(3) a polikation borítású gyöngyök úgy tűnnek nem mállaszthatók szét és nem épülnek fel a testben;

(4) az ilyen készítmények munkaigényes burkolási eljárásokkal állíthatók elő, melyek magukba foglalják a polikationos polilizin többszörös burkolását (Padol, et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater, 2:216 (1986) és (5) a protein és a polikationok közötti ionos kölcsönhatások a protein aktivitás csökkenését eredményezhetik és protein instabilitást okozhatnak.

A fenti rendszereken túl, léteznek olyan bejuttatás! rendszerek is, melyek az injektálás után képeznek gélt, vagy melyek szerves alapúak és/vagy tioxotróp alapúak. A gél raktárak, melyek az injektálás után képeznek gélt a testben biztosíthatják a gélbe zárt gyógyszerek hosszantartó felszabadulását. Ezek közé tartoznak a poloxamerek hőmérséklet által indukált gélképzödése (például Pluronics, 2.741.573 számú US szabadalmi alkalmazás). Alacsony hőmérsékleten ezek folyadékok, de a megemelt hőmérsékleten, mint a testhőmérséklet gélt képeznek. Ezeket a rendszereket nehezen lehet szabályozni a környezeti hőmérséklet körülmények változásai valamint az anatómiai hőmérsékletek változásai következtében, ha subcután injekciókat alkalmazunk.

A szerves alapú gélképző rendszerek esetében az ilyen rendszerek nem megfelelőek a törékeny protein gyógyszerekhez, melyek szerves oldószerek vagy nem fiziológiás körülmények között destabilizálódnak. Az olajban levő alumínium sztearát tixotróf géljeit is felhasználták a penicillin aktivitásának meghosszabbítására. Buckwaiter, et. al., J. Am. Pharm. Assoc. 137:472 (1948); Thompson, R.E., American Journal Clinical Nutrition, 7:311 (1959); Thompson, Robert, E., Sustained Release of Parenteral Drugs, Bulletin of Parenteral Drug Assoc., 14:6-17 (1960); Chen, Y., Journal of Parenteral Science & Tech., 35:106 (1981). A proteinek hajlamosak destabilizálódni az ilyen típusú olajokat tartalmazó rendszerek jelenlétében.

A hosszan tartó felszabadulású gyógyszer szállító rendszerek, melybe beletartozik a szabályozott idejű testben történő gélképzési eltolódás nem általánosan ismertek a tudomány e területén. Ezek a típusú késleltetett gél rendszerek, azonban ismertek a növényi szövettenyésztéssel, a sejtek immobilizálásával, a mikroszféra képzéssel, az inszekticid felszabadulással és az élelmiszeriparral kapcsolatban. Például, alginátokat használtak oldhatatlan kalcium komplexekkel és 5glükonolaktonnal kapcsolatban proton donorként a kalcium ionok oldatba való felszabadítása céljából a gélképzéshez. Lásd, Draget et al., Appl. Microbiol. Biotechnoi. 31:79-83 (1989).. Hasonlóképpen, hasonló rendszereket használtak az alginát gyöngy emulgeálással/belsö gélképzéssel történő létrehozásához. Az alginát mikroszférákat úgy állították elő, hogy alginátot diszpergáltak növényi olajban és a gélképzödést a pH csökkentésével indukálták, a kalcium oldhatatlan komplexből való felszabadítása céljából. Lásd, Poncelet, D., et al., Appl. Microbiol. Biotechnoi., 43:644-650 (1995). Alginát rendszereket sejtek immobilizálására is használtak. Burke, C. a Methods in Enzymology, 135: 175-189 (1987) azt írta le, hogy a dikalcium foszfát és a δ-glükonolakton felhasználható az alginátokkal a sejtek késeltetett gélképzéséhez. A 4.053.627 számú US szabadalmi alkalmazás az alginát gél korongok használatát írja le egy inszekticid vizes közegben való felszabadulásának szabályozására. Ezeket a korábban említett alkalmazásokat nem a biológiailag aktív anyagok, különösen proteinek testben levő gél raktárakhoz való hosszan tartó felszabadulása céljából tervezték.

Ennek megfelelően szükség van késeltetett gél gyógyszerészeti készítmények kifejlesztésére, melyek a hosszan tartó felszabadulás jobb eszközei lehetnek a klinikai gyakorlatban. Számos rekombináns vagy természetes protein előnyt élvezhet az állandó, hosszú időtartamú felszabadulásból késleltetett gél készítményeken keresztül és ily módon sokkal hatékonyabb klinikai eredményeket biztosítana.

A jelen találmány ilyen előnyöket biztosít. A jelen találmány késleltetett gél gyógyszerészeti készítményei képesek protein védelmet, csökkent lebontást és a megnövelt protein stabilitás és potencia révén lassú oldódást biztosítani. A jelen találmány gyógyszerészeti készítményei egyszerű, gyors és olcsó eszközt biztosítanak a rekombináns protein felszabaduláshoz a hatékony profilaktikus, terápiás vagy diagnosztikai eredményekhez.

A jelen találmány összefoglalása

A jelen találmány hosszan tartó felszabadulású készítményekkel kapcsolatos, melyekben alginát késleltetett géleket használunk, valamint kapcsolatos ezek használatával. Részletesebben, a hosszan tartó felszabadulású késleltetett gélek képzése magába foglalja a tixotróf alginát géleket és egy biológiailag aktív anyagot. Ez a megközelítés azzal az előnnyel jár, hogy hatékony és nagy dózisú biológiailag aktív anyag helyezhető az alginát késleltetett gélbe a hosszan tartó gyógyszer biztosítás céljából, mialatt a protein védelme, a bejuttatandó anyag csökkent lebontása és megnövekedett stabilitása érhető el. Ezenkívül, az időzített gélképződés erősebb szabályozást eredményez a gélképzö tulajdonságok és ezek alkalmazása fölött.

Ennek megfelelően, a jelen találmány egyik aspektusa egy hosszan tartó felszabadulású késleltetett gél készítményt biztosít, mely egy hidrofil polimert; egy biológiailag aktív anyagot és legalább egy kötött polivalens fémiont tartalmaz. A gélképződés sebességét a szabad kalcium szint szabályozza, azaz a nem kötött polivalens fémion. A biológiailag aktív anyag komplex formájában is lehet. A komplex molekula létrehozása és a kapcsolatos komplexképzö anyagok jól ismertek a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára. Ezenkívül, a fenti készítmény tartalmazhat még olyan polivalens fémiont, mely kötött és nem kötött polivalens fémionok keveréke. Ezen késleltetett gélek idő szabályozott természetéből adódóan ezek a keverékek a testben olyan helyre juttathatók be, ahol az injektálás után gélt tudnak létrehozni. Ezenkívül, a készítmény gél állapotban mutatkozó tixotróf természetének köszönhetően, ezek a keverékek gél állapotban is injektálhatok, például az injekciós tűből való ki nyomással, ahol ezután a testben újra gélt képezhetnek.

A jelen találmány egy másik aspektusa egy hosszan tartó felszabadulású késleltetett gél készítményt biztosít, mely hidrofil polimert; egy biológiailag aktív anyagot; legalább egy kötött polivalens fémiont tartalmaz, továbbá tartalmazhat legalább egy proton donort, mely képes felszabadítani a kötött polivalens fémiont. A proton proton donorról való felszabadulása felszabadítja a kötött polivalens fémionból a kationt.

Egy másik aspektus olyan módszereket biztosít, melyek révén a jelen találmány hosszan tartó felszabadulású késleltetett gél készítményei állíthatók elő. Az egyik módszer a következő lépésekből áll: a biológiailag aktív anyagot és egy hidrofil polimert összekeverünk egy oldószerrel, hogy egy első keveréket hozzunk létre, majd az első keveréket legalább egy kötött polivalens fémionnal keverjük össze, hogy egy második keveréket hozzunk létre. Egy alternatív módszer a következő lépésekből áll: egy biológiailag aktív anyagot és egy hidrofil polimert egy oldószerrel keverünk össze, hogy létrehozzuk az első keveréket; az első keveréket összekeverjük legalább egy kötött polivalens fémionnal, hogy létrehozzuk a második keveréket; és a második keverékkel, legalább egy proton donort keverünk össze, mely képes a kötött polivalens fémiont felszabadítani. A kötött polivalens fémion és a proton donor együtt is hozzáadható az első keverékhez vagy a proton donor hozzáadható az első keverékhez a kötött polivalens fémion hozzáadása előtt. Ezenkívül, egyik lépésként figyelembe vesszük a hosszan tartó felszabadulású késleltetett gél készítmény izolálását.

A találmány szerinti használatban a kötött polivalens fémion olyan polivalens fémionra utal, mely só, kelát vagy ion komplex formájában található. A kötött polivalens fémion magába foglalhatja a kötött és nem kötött polivalens fémionok keverékét. Ez magába foglalná, ahogy korábban említettük, a kötött - nem kötött polivalens fémion felszabadulását. A találmány szerinti használatban a kötött polivalens fémion felszabadítására képes proton donor kifejezés erős savakat, gyenge savakat vagy olyan anyagokat jelent, melyek savakat képesek létrehozni, például laktonokat vagy észtereket (vizes hidrolízis révén), vagy melyek gyengén oldódó savat vagy lassan oldódó savat jelentenek, például adipinsavat.

A találmány szerinti használatban az oldószer vizes, nem vizes alapú oldószereket jelent, melyek képesek diszpergálni vagy feloldani a kiválasztott biológiailag aktív anyagokat, hidrofil polimereket, polivalens fémionokat, proton donorokat vagy komplex képző anyagokat. Az ilyen oldószerek jól ismertek a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára. Az első keverékhez és a második keverékhez való hozzáadás elvégezhető a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára jól ismert módszerekkel, ideértve az ezekre való korlátozás nélkül a keverést, a cseppenkénti hozzáadást, a diszpergálást, a sprayvel történő hozzáadást vagy a spray fecskendős, levegő fecskendős, atomizáló és elektromos mezejű keveréseket. A találmány szerinti használatban a diszpergálás folyadék, szilárd vagy gáz diszpergálást jelenthet. A találmány szerinti használatban az izolálás olyan izolálási folyamatra utal, melyben a jelen találmány hosszan tartó felszabadulású késleltetett gél készítményét izoláljuk. Az ilyen izolálási és tisztítási eljárások jól ismertek a tudomány e területén.

A jelen találmány egy megint más aspektusában hosszan tartó felszabaduláséi késleltetett gél készítményt biztosítunk, melyet a fenti módszerekkel állítunk elő. A további aspektusok magukba foglalják a fenti készítmények késleltetett gél gyógyszerészeti formuláit egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóban, vagy hatásjavítóban. Ezenkívül, a késleltetett gél készítmény lehet injekciós tűben is. Egy megint más aspektusban a jelen találmány módszert biztosít indikációk kezelésére a kívánt biológiailag aktív anyagot tartalmazó hosszan tartó felszabadulású késleltetett gél készítménnyel.

A jelen találmány részletes leírása

Készítmények

Az alginátokat és ezek származékait magába foglaló hidrofil polimerek különböző kereskedelmi, természetes vagy szintetikus forrásokból szerezhetők be, melyek jól ismertek a tudomány e területén. A találmány szerinti használatban a hidrofil polimer kifejezés vízoldható polimerekre, vagy olyan polimerekre utal, melyek a víz abszorbeálásra affinitást mutatnak. A hidrofil polimereket a tudomány e területén átlagosan képzett szakemberek jól ismerik. Ezek közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül a polianionok, ideértve az anionos poliszacharidokat, mint például az alginát, a gellán, a karboximetil amilóz, a poliakrilsavas sók, a polimetarilsavas sók, az etilén maleinsav anhidrid kopolimer (félig észter), a karboximetilcellulóz, a dextrán-szulfát, a heparin, a karboximetil-dextrán a karboximetil cellulóz, a 2,3dikarboxicellulóz, a trikarboxicellulóz, a karboxi-gumiarábikum, a karboxicarrageenán, a karboxi-pektin, a karboxi-tragakant gumi, a karboxi-xantán gumi, a pentozán-poliszulfát, a karboxi-keményítő, a karboximetilkitin/kitozán, a curdlán, az inozitol-hexaszulfát, a β-ciklodextrin-szulfát, a hialuronsav, a kondroitin-6-szulfát, a dermatán-szulfát, a heparin-szulfát, a kabroximetil-keményítö, a carrageenan, a poligalakturonát, a karboxiguar gumi, a polifoszfát, a polialdehido-karbonsav, a poli-1-hidroxi-1 szulfonát-propén-2, a kopolisztirén, a maleinsav, az agaróz, a mezoglükán, a szulfópropilált polivinil alkoholok, a cellulóz-szulfát, a protamin-szulfát, a foszfo-guar gumi, a poliglutaminsav, a poliaszparaginsav, a poliaminsavak, ezek származékai vagy kombinációi. A tudomány e területén átlagosan képzett szakember ismer más különböző hidrofil polimereket is, melyek a jelen találmány körébe esnek.

Hasonlóképpen, a kötött polivalens fémionok különböző kereskedelmi, természetes vagy szintetikus forrásokból is beszerezhetők, melyek jól ismertek a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára. A kötött vagy sequestered polivalens fémionok a jelen találmány körén belül esnek de nem korlátozódnak a mangánra, a stronciumra, vasra, magnéziumra, kalciumra, báriumra, rézre, alumíniumra vagy a cinkre. A fémionok kinyerhetők komplexképzö anyagok, acetátok, foszfátok, laktátok, tartarátok, citrátok, szulfátok, kloridok, karbonátok, hidroxidok vagy zsírsav anionok, például oleátok oldható sóiból. A tudomány e területén átlagosan képzett szakember ismer más kötött polivalens fémionokat/komplexeket, melyek a jelen találmány körébe tartoznak. A kötött polivalens fémionok magukba foglalhatnak kötött és nem kötött polivalens fémion keverékeket.

A találmány szerinti használatban a proton donor kifejezés olyan anyagra utal, mely savakat képes létrehozni. A proton donorok képesek felszabadítani a kötött vagy sequestered polivalens fémiont. A proton donorok jól ismertek a tudomány e területén és az ezekre való korlátozás nélkül magukba foglalják a iaktonokat, mint például a glükolaktonokat, az észtereket, a puffereket és más lassan oldódó savakat. A találmány szerinti használatban a lassan oldódó savak olyan savakra vonatkoznak, mint a szilárd savak, melyek alacsony oldódási tulajdonságúak. Ezenkívül a lassan oldódó savak magukba foglalnak olyan eszközöket vagy burkoló anyagokat, melyek lassan szabadítják fel a savakat. A jelen találmány körébe tartozó jól ismert savak közé tartoznak az ecetsav, az adipinsav, a citromsav, a fumársav, a glükonsav, a tejsav, az almasav, a foszforsav és a borkősav. A tudomány e területén átlagosan képzett szakember ismer más olyan proton donorokat, melyek a jelen találmány körébe tartoznak.

A találmány szerinti használatban a puffer vagy puffer oldat szervetlen vagy szerves savak vagy bázisok vagy ezek kombinációinak használatára vonatkozik, melyekkel a tudomány e területén ismert puffért állítanak elő. Ezek közé tartoznak az amfoterikus anyagok vagy az aminosavak. A jelen találmány körébe tartozó szervetlen savak a hidrogén halid (például a sósav), a foszforsav, a salétromsav vagy a kénsav. Más szervetlen savak ismertek lennének a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára és ezeket is figyelembe vesszük. A jelen találmány körébe tartozó szerves savak az alipatikus karboxilsavak és az aromás savak, mint a hangyasav, a szénsav, az ecetsav, a propionsav, a vajsav, a valeriánsav, a kapronsav, a carilsav, a malonsav, a borostyánkősav, a glutársav, az adipinsav, a maleinsav, a fumársav, a glicin vagy fenol szinfonsav. Más szerves savak is. jól ismertek lennének a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára. A szerves bázisok közé tartoznak a TRIS, a piridin, a PIPES, és a HEPES. Az aminosav pufferek közé tartoznak a glicin és glicin/foszforsav keverékek.

A találmány szerinti használatban a biológiailag aktív anyagok rekombináns vagy természetesen előforduló proteinekre - humán vagy állati - vonatkozik, melyek felhasználhatók profilaktikus, terápiás vagy diagnosztikai alkalmazásokban, valamint nem-protein alapú anyagokra, mint például kis molekulákra, oligonukleotidokra és szervetlen vagy szerves anyagokra. A biológiailag aktív anyag lehet természetes, szintetikus, szemi-szintetikus anyag vagy lehet ezek származéka. Ezenkívül, a jelen találmány biológiailag aktív anyagai lehetnek kicsapatható anyagok. A biológiailag aktív anyagok széles skáláját figyelembe vesszük. Ezek közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül a hormonok, a citokinek, a hematopoietikus faktorok, a növekedési faktorok, az elhízás elleni faktorok, a trófikus faktorok, a gyulladás elleni faktorok, és az enzimek (lásd még a 4.695.463 számú US szabadalmi alkalmazást a használható biológiailag aktív anyagok további példáihoz). A tudomány e területén átlagosan képzett szakember képes lesz a kívánt biológiailag aktív anyag jelen találmányban szereplő készítményhez való adaptálására.

Az ilyen proteinek közé tartoznának, az ezekre való korlátozás nélkül, az interferonok (lásd 5.372.808, 5.541.293, 4.897.471 és 4.695.623 számú US szabadalmi alkalmazásokat, melyek a hivatkozás révén részét képezik a találmánynak, a csatolt rajzokkal együtt), az interleukinek (lásd az 5.075.222 számú US szabadalmi alkalmazást, mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak, a csatolt rajzokkal együtt), az eritropoietinek (lásd a 4.703.008, 5.441.868, 5.618.698, 5.547.933 és 5.621.080 számú US szabadalmi alkalmazásokat, melyek a hivatkozás révén részét képezik a találmánynak, a csatolt rajzokkal együtt), a granulocita-telep stimuláló faktorok (lásd 4.810.643, 4.999.291, 5.581.476, 5.582.823, számú US szabadalmi alkalmazások és 94/17185 számú PCT alkalmazás, melyek a hivatkozás révén részét képezik a találmánynak, a csatolt rajzokkal együtt), a törzs sejt faktor (91/05795, 92/17505, és 95/17206 számú PCT alkalmazásokat, melyek a hivatkozás révén részét képezik a találmánynak a csatolt rajzokkal együtt), és az OB protein (lásd 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010, és 97/06816 számú PCT alkalmazások, melyek a hivatkozás révén részét képezik a találmánynak a csatolt ábrákkal együtt). Ezenkívül, a biológiailag aktív anyagok magukba foglalhatják az ezekre való korlátozás nélkül az antiobesity (elhízás) rokon termékeket, az inzulint, a gasztrint, a prolaktint, az adrenokortiko-trophormont (ACTH), a tiroid stimuláló hormont (TSH), a luteinizáló hormont (LH), a follikulus stimuláló hormont (FSH), a humán korion gonadotropint (GCH), a motilint, az interferonokat (alfa, beta, gamma), az interleukineket (11-1 - IL-12), a tumor nekrózisos faktort (TNF), ··)% a tumor nekrózisos faktor-kötő proteint (TNF-bp), az agyi eredetű neurotróf faktort (BDNF), a glia eredetű neurotróf faktort (GDNF), a neurotóf faktor 3 (NTF 3) a fibroblaszt növekedési faktorok (FGF), a neurotróf növekedési faktor (NGF), a csont növekedési faktorok, mint például az oszteoprotegerin (OPG), az inzulin-szerű növekedési faktorok (IGF-ek), a makrofág telep stimuláló faktor (M-CSF) a granulocita makrofág telep stimuláló faktor (GM-CSF), a megakariocita eredetű növekedési faktor (MGDF), a keratinocita növekedési faktor (KGF), a trombopoietin, a vérlemezke eredetű növekedési faktor (PGDF), a telep stimuláló növekedési faktorok (CSF-ek), a csont morfogenetikus protein (BMP), a szuperoxid diszmutáz (SOD), a szövet plazminogén aktivátor (TPA), az urokináz, a sztreptokináz és kallikrein. A protein kifejezés a találmány szerinti használatban magába foglalja a peptideket, a polipeptideket, a konszenzus molekulákat, analógokat, származékokat vagy ezen molekulák kombinációit.

A biológiailag aktív anyagok származékai magukba foglalhatják egy vagy több kémiai egység protein egységhez való hozzá kapcsolását. Azt találták, hogy a biológiailag aktív anyagok kémiai módosítása további előnyt jelenthet bizonyos körülmények között, például megnöveli a terápiás protein stabilitását, keringési idejét és csökkenti az immunogenicitást. A tudomány e területén átlagosan képzett szakember képes lesz a kívánt kémiai módosítást kiválasztani a kívánt dózis, keringési idő, proteolízisnek való ellenállás, terápiás használat és más szempontok alapján, kívánatosak az olyan származékok, mint a polietilén glikol és az Fc fúziós proteinek.

Komplexek

A biológiailag aktív anyag lehet komplex formában is. Ez magába foglalja a kicsapatott formákat, a strukturált formákat és á más molekulákkal való formákat. Az anyag ezen komplex formái csökkenthetik ·* » *·* V az anyag gélből történő kidiffundálási sebességét és így fenntartják az anyag kiszabadulását. Ezek a komplex formák magukba foglalják az ezekre való korlátozás nélkül az antitestekhez, szubsztrátokhoz, receptorokhoz, lipidekhez, polimerekhez és kicsapató anyagokhoz kapcsolódó biológiailag aktív anyagokat.

Például, a biológiailag aktív anyagok, analógok, vagy származékok alkalmazhatók egy kötődő készítménnyel komplexet képzett formában. Az ilyen kötődő készítmény a fenti előnyökön túl olyan hatással is rendelkezhet, hogy meghosszabbítja az anyag, analógja vagy származéka keringési idejét, vagy fokozza a biológiailag aktív anyag aktivitását. Az ilyen készítmény lehet egy protein (vagy szinonimként pepiid), egy származék, analóg vagy ezek kombinációja, vagy lehet egy nem-proteines anyag.

Illusztrációként, az OB proteinhez való kötő protein az OB protein receptor vagy ennek egy része, mint például ennek egy oldható része. Más kötő proteinek úgy határozhatók meg, hogy vizsgáljuk az OB proteint, vagy más kiválasztott proteint a szérumban, vagy kísérletileg szkrínelünk a kötődés meglétére. Az ilyen kötődés tipikusan nem befolyásolja az OB protein vagy analóg vagy származék azon képességét, hogy kötődjön az endogén OB protein receptorhoz és/vagy hatással legyen a jel transzdukcióra. Az OB proteinen kívül a kötő komplexek alkalmazhatók a jelen találmány más terápiás proteinjeivel is. A tudomány e területén átlagosan képzett szakemberek képesek lesznek meghatározni a megfelelő kötödö proteint a jelen találmányban való alkalmazáshoz.

Hasonlóképpen, a biológiailag aktív anyag kicsapatására használt kicsapató anyagok is beszerezhetők a kereskedelemből, természetes vagy szintetikus forrásokból, melyek jól ismertek a tudomány e területén. A kicsapató anyagok közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül a polivalens fémionok, vagy ezek sói, például az acetátok, cifrátok, kloridok, karbonátok, hidroxidok, oxalátok, tartarátok vagy ezek hidroxidjai, savak %> Á vagy vízoldható polimerek. Részletesen, a fémionok közé tartozhatnak az ezekre való korlátozás nélkül az alumínium, a bárium, a kalcium, a vas, a mangán, a magnézium, a stroncium és a cink ion. Előnyösen a fémion cink, vagy ennek sói, mint például az acetát-klorid sók. A vízoldható kis molekulák és sók szintén felhasználhatók, mint például az ammonium szulfát, az aceton, az etanol és a glicerol.

A vízoldható polimerekről szólva, ezek közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül a polietilén glikol, az etilén glikol/propilén glikol kopolimerek, a hidroxi-etil-cellulóz, az amilóz, a karboximetilcellulóz, a dextrán, a polivinil alkohol, a polivinil pirrolidon, a poli-1,3-dioxolán, a poli1,3,6-trioxán, az etilén/maleinsav anhidrid kopolimerek, a poliaminosavak, a dextrán, a poli (n-vinil pirrolidon) polietilén glikol, propilén glikol homopolimerek, a polipropilén oxid/etilén-oxid kopolimerek, a poli-oxietilált poliolok, a polivinil alkohol szukcinát, a glicerin, az etilén-oxidok, a propilén-oxidok, poloxamerek, alkoxilált kopolimerek, a vízoldható polianionok, ezek származékai vagy kombinációi. A vízoldható polimer bármilyen molekulatömegű lehet és lehet elágazó láncú vagy elágazás nélküli. Például, a polietilén glikol előnyben részesített molekula tömege körülbelül 700 Da és körülbelül 100 kDa közötti a könnyebb kezelés és a kicsapatás hatékonysága miatt.

Más méretű és típusú kicsapató anyagok is alkalmazhatók a kívánt terápiás profiltól függően (például ha a hosszan tartó felszabadulás a kívánatos, a hatások - ha van ilyen a biológiai aktivitásra - a kezelés egyszerűsége, az antigenicitás mértéke vagy hiánya és a kívánt kicsapató anyag más kívánt hatásai egy terápiás proteinre vagy analógra). A tudomány e területén átlagosan képzett szakember ismer más kicsapató anyagokat is, melyek a jelen találmány körébe tartoznak.

Ezenkívül, a jelen találmány készítménye magába foglalhat extra kötőanyagot a biológiailag aktív anyag és/vagy hidrofil polimer stabilizálása céljából. Ezek lehetnek a pufferben és tartalmazhatnak az ezekre való korlátozás nélkül tartósítóanyagokat is.

Gyógyszerészeti készítmények

A jelen találmány hosszan tartó felszabadulási) gyógyszerészeti készítményei adhatók orálisan (azaz folyadék készítményként, mely lehetővé teszi a gyomorban vagy bélben való gélképződést) és nem orális készítmények (például intramusculáris, subcután, transdermális, viscerális, IV (intravénás), IP (intraperitoneális), intraarticuláris, fülbe helyezett, ICV (intracerebraventriculáris), IP (intraperitoneális), intraarteriális, intracheális, intrakapszuláris, intraorbitális, injektálható, pulmonáris, nazális, rectális, és méh-transmucozális készítmények). Általában a jelen találmány olyan készítményeket foglal magába, melyek hosszan tartó felszabadulási) késleltetett gél gyógyszerészeti készítmények, melyek a protein vagy egy származék termék hatékony mennyiségét tartalmazzák a jelen találmány hosszan tartó felszabadulási) készítményével gyógyszerészetileg elfogadható hígítókkal, tartósítószerekkel, oldószerekkel, emulgeáló szerekkel, hatásjavítókkal és/vagy az alkalmazáshoz szükséges hordozókkal együtt. (Lásd 97/01331 PCT alkalmazás, mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak). Az optimális gyógyszerészeti készítményt egy kívánt biológiailag aktív anyag esetében a tudomány e területén átlagosan képzett szakember határozza meg az alkalmazás módjától, és a kívánt dózistól függően. Példaként szolgáló gyógyszerészeti készítmények kerültek leírásra a Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., 18th Ed., Easton, PA, pp. 1435-1712 (1990)).

A késleltetett gél képződés tixotróf tulajdonságának köszönhetően az injekciókat subcután is alkalmazhatjuk. A készítmény géllé alakulhat az injekciós tűben egy későbbi alkalmazáshoz. Ez a gélképződés megvalósítható időben késleltetett módon is. Az időzítést a gélképző anyag és ha használunk, a proton donor mennyiségének, valamint a polivalens fémion részecske méretének, és a keverék hőmérsékletének gondos beállításával lehet szabályozni. Az ilyen készítmény injekciózás után a későbbi, testben megvalósuló újra-gél állapotúvá váláshoz használható. A találmány szerinti használatban a tixotróf kifejezés a gél keverék viszkozitására utal, mely nyomás hatására csökken, például az injekciós tűből való kinyomás hatására, amikor a keverék folyhat, majd újra gélt hoz létre az injektálás helyén.

A késleltetett gélképződés koncepciója felhasználható az injekciós tű feltöltésére, amikor a hosszan tartó felszabadulású gél készítményt az injekciós tűbe helyezzük és egy előre megállapított időben gélt képez az injekciós tűben, például a töltés után néhány perccel vagy több órával. Ez elkerüli az injekciós tű már gél állapotú anyaggal való töltésével kapcsolatos problémát. Ezek az előre megtöltött injekciós tűk raktározhatok a betegeknek való későbbi beadáshoz.

Az alkalmazáshoz szükséges alkotórészek közé tartozhatnak a hígítószerek, vagy a különböző pH és ion erősségű pufferek (például a Tris-HCI, az acetát); az adalékanyagok, mint például a felületaktív anyagok és az oldódást elősegítő szerek (például a Tween 80, HCO-60, Poliszorbát 80), lipidek, liposzómák, antioxidánsok (például aszkorbinsav, glutation, nátrium-metabiszulfit), további poliszacharidok (például karboximetilcellulóz, nátrium-alginát, nátrium-hialuronát, protamin-szulfát, polietilén glikol), tartósítószerek (például Thimersol, benzil-alkohol, metilparabén, propio-parabén) és térfogatnövelö szerek (például laktóz, mannitol); az anyag polimer vegyületek szemcsés készítményeit tartalmazzák, például politejsav/poliglikolsav polimereket vagy kopolimereket stb, vagy liposzómákkal keverjük ezeket össze. A hialuronsav is használható alkalmazási komponensként és ez járhat olyan hatással, hogy tovább növeli a keringésben való meghosszabított időt. Ezenkívül, a jelen találmány hosszan tartó felszabadulású készítményei olajokban is diszpergálhatók (például szezám olajban, kukorica olajban, növényi olajban) vagy ezek foszfolipiddel való keverékében (például lecitin) vagy közepes láncú zsírsav trigliceridekben (például Mygliol 812), az olajos szuszpenzió létrehozása céljából. A jelen találmány készítményei diszpergálhatók diszpergáló szerekkel, mint például vízoldható poliszacharidokkal (például mannitollal, laktózzal, glükózzal, keményítővel), hialuronsavval, glikokollal, fibrinnel, kollagénnel, és szervetlen sókkal (például nátrium-kloriddal).

Ezenkívül, a jelen találmány hosszan tartó felszabadulású készítményeinek alkalmazásában való használat magába foglalja a terápiás készítmény pulmonáris bejuttatáshoz tervezett mechanikai készülékeket is, ideértve az ezekre való korlátozás nélkül a porlasztókészüléket, a mért dózisú inhalálókat és a por inhalálókat, melyek mindegyike ismert a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára.

Az alkalmazási alkotórészek hatással lehetnek a jelen proteinek és származékok fizikai állapotára, stabilitására, in vivo felszabadulási sebességére és az in vivo kiürülésre. A tudomány e területén átlagosan képzett szakember ismeri a terápiás használattól, az alkalmazás módjától, a kívánt dózistól, keringési időtől, a proteolízisnek való ellenállástól, a protein stabilitástól és más szempontoktól függő megfelelő alkalmazandó alkotórészeket és/vagy megfelelő mechanikai eszközöket.

Alkalmazási módszerek

Terápiás alkalmazás: A terápiás alkalmazások a használt biológiailag aktív anyagtól függnek. A tudomány e területén átlagosan képzett szakember könnyen adaptálja a jelen találmányhoz való kívánt biológiailag aktív anyagot annak célzott terápiás használatához. Az ilyen anyagok terápiás alkalmazása részletesebben az alábbi publikációkban került leírásra, melyek a hivatkozás révén részét képezik a találmánynak, a csatolt rajzokat is beleértve. A terápiás alkalmazások magukba foglalják az ezekre való korlátozás nélkül a protein-szerű interferonok használatát (lásd 5.372.808, 5.541.293, 4.897.471, és 4.695.623 számú US szabadalmi alkalmazásokat, melyek a hivatkozás révén részét képezik a találmánynak, a csatolt rajzokkal együtt), az interleukinek használatát (lásd az 5.075.222 számú US szabadalmi alkalmazást, mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak a csatolt rajzokkal együtt), az eritropoietinek használatát (lásd a 4.703.008, 5.441.868, 5.618.698, 5.547.933, és a 5.621.080 számú US szabadalmi alkalmazásokat, melyek a hivatkozás révén részét képezik a találmánynak), a granulocita-telep stimuláló faktorok használatát (lásd a 4.999.291, 5.581.476, 5.582.823, 4.810.643, számú US szabadalmi alkalmazásokat és a 94/17185 számú PCT alkalmazást, melyek a hivatkozás révén részét képezik a találmánynak a csatolt rajzokat is beleértve), a törzs sejt faktor használatát (91/05795, 92/17505 és 95/17206 számú PCT alkalmazások, melyek a hivatkozás révén részét képezik a találmánynak, a csatolt rajzokat is beleértve), és az OB protein használatát (lásd a 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 és a 97/06816 számú PCT alkalmazások, melyek a hivatkozás révén részét képezik a találmánynak, a csatolt ábrákkal együtt).

Ezenkívül a jelen találmány terápiás alkalmazásai magukba foglalják biológiailag aktív anyagként az ezekre való korlátozás nélkül az anti-obesity (elhízás elleni) rokon termékek, az inzulin, a gasztrin, a prolaktin, az adrenokrtiko-trophormon (ACTH), a tiroid stimuláló hormon (TSH), a luteinizáló hormon (LH), a follikulus stimuláló hormon (FSH), a humán korion gonadotropin (HCG), a motilin, az interferonok, (alfa, beta, gamma), az interleukinek (IL-1 - IL-12), a tumor nekrózisos faktor (TNF), a tumor nekrózisos faktor-kötő protein (TNF-bp), az agyi eredetű neurotróf faktor (BDNF), a glia eredetű neurotróf faktor (GDNF), a neurotróf faktor 3 (NT3), a fibroblaszt növekedési faktorok (FGF), a neurotróf növekedési faktor (NGF), a csont növekedési faktorok, mint például az oszteoprotegerin (OPG), az inzulin-szerű növekedési faktorok (IGF-ek), a makrofág telep stimuláló faktor (M-CSF) a granulocita makrofág telep stimuláló faktor (GM-CSF), a megakariocita eredetű növekedési faktor (MGDF), a keratinocita növekedési faktor (KGF), a trombopoietin, a vérlemezke eredetű növekedési faktor (PGDF), a telep stimuláló növekedési faktorok (CSF-ek), a csont morfogenetikus protein (BMP), a szuperoxid diszmutáz (SOD), a szövet plazminogén aktivátor (TPA), az urokináz, a sztreptokináz és kallikrein használatát. A protein kifejezés a találmány szerinti használatban magába foglalja a peptideket, a polipeptideket, a konszenzus molekulákat, analógokat, származékokat vagy ezen molekulák kombinációit. Ezenkívül, a jelen készítmények felhasználhatók olyan állapotok kezelésére vagy javítására szolgáló egy vagy több gyógyszer előállítására, melyekhez a biológiailag aktív anyagot szándékozunk használni.

Kombinációs terápiák: A jelen készítmények és módszerek más terápiákkal együtt is felhasználhatók, például megváltozott étrenddel és testgyakorlatokkal. Más gyógyszerek, például a diabetes kezelésére használt gyógyszerek (például inzulin és talán az amilin), a koleszterin és a vérnyomás csökkentő gyógyszerek (például amelyek csökkentik a vér lipid szinteket vagy más cardiovasculáris gyógyszerek), aktivitás fokozó szerek (például az amfetaminok), a vízhajtószerek (a folyadék eltávolításra) és az étvágycsökkentő szerek. Az ilyen gyógyszerek alkalmazása történhet azonos időben vagy in seriatim, Ezenkívül, a jelen módszerek alkalmazhatók sebészeti eljárásokkal együtt is, mint például kozmetikai sebészeti eljárásokkal együtt, melyekben a test teljes megjelenését akarják megváltoztatni (például a testsúly csökkentésére irányuló zsírleszívás, vagy lézer sebészet, vagy a beültetést használó sebészeti eljárások esetén, amikor a test tömeg megjelenést akarják növelni). A szívsebészeti eljárások - mint például a bypass sebészet, vagy más az érfalak zsír lerakódásokból eredő eltömődése által okozott káros állapotok megszüntetésére irányuló sebészeti beavatkozások egészségügyi haszna növelhető a jelen készítmények és módszerek együttes alkalmazásával. Az epekövek eltávolítására szolgáló módszerek, mint például az ultrahangos vagy lézeres módszerek szintén végezhetők a jelen terápiás módszerek alkalmazása előtt vagy után. Ezenkívül, a jelen módszerek használhatók a törött csontok, sérült izmok sebészeti eljárásainak, vagy más terápiák kiegészítőiként, melyet a sovány szövet tömegének növekedése javítana.

Dózisok

A tudomány e területén átlagosan képzett szakember képes lesz meghatározni a hatékony dózisokat az alkalmazás és a kívánt terápiás hatás megfigyelése alapján. A hosszan tartó felszabadulású készítmény dózisa az a mennyiség, mely ahhoz szükséges, hogy a biológiailag aktív anyag hatékony koncentrációját érjük el in vivo egy adott időtartamra. A hosszan tartó felszabadulású készítmények dózisa és az előnyben részesített alkalmazás gyakorisága a biológiailag aktív anyag típusától, a felszabadulás tervezett időtartamától, a megcélzott betegségtől, az alkalmazás tervezett gyakoriságától, a célzott állat fajától és más tényezőktől függ. Előnyösen, a molekula formázása olyan, hogy körülbelül 0,01 ng/kg/nap és 100 mg/kg/nap közötti dózis eredményezi a kívánt terápiás hatást.

A hatékony dózisok meghatározhatók diagnosztikai eszközökkel is. Példa kedvéért, a jelen találmány az OB protein dózisait mutatja be. Például, a vérben (vagy plazmában vagy szérumban) levő OB protein mennyiségének mérésére szolgáló diagnosztika először az OB protein endogén szintjeinek időbeni meghatározásához használható. Az ilyen diagnosztikai eszköz lehet egy antitest vizsgálati formában, mint például az antitest szendvics vizsgálat. Az endogén OB protein mennyiségét először meghatározzuk és megállapítjuk az alapértéket. A terápiás dózist úgy határozzuk meg, hogy folyamatosan mérjük az endogén és az exogén OB protein (azaz a testben talált - akár maga által termelt, akár adagolt - protein) az analóg vagy a származék mennyiségét a terápia teljes időtartama alatt. Például, kezdetben esetleg egy viszonylag nagy dózisra lehet szükség, egészen addig, míg a terápiás eredmény meglátszik, azután csökkent dózisok kerülnek felhasználásra a terápiás előnyök fenntartásához.

Anyagok és módszerek

Anyagok: Az alginát, só formájában levő alginát forrásokból szerezhető be, vagy a tudomány e területén ismert módszerekkel állítható elő. A leptin, a GCSF és a konszenzus interferon az Amgen Inc.-tői származik. A többi vegyszer a tudomány e területén ismert forrásokból származik.

Késleltetett gél készítmény indukció: A késleltetett gélt úgy állítjuk elő, hogy egy biológiailag aktív anyag és egy anionos polimer (például alginát) keveréket vegyítjük egy polivalens kation sóval (például CaCO3) és egy proton donorral (például savanyított pufferrel vagy lassan felszabaduló vagy oldódó sav forrással, mint például a δglukonolaktonnal) ha használunk ilyet. Minden esetben az anionos polimer, protein és bármilyen kicsapató anyag/kötőanyag is használható keverékként. A gélképzödést a polivalens kation só és proton donor (ha használunk ilyet) keverékhez való hozzáadásával indítjuk el. A proton, polivalens fémion polimer biológiailag aktív anyag keverékhez való hozzáadása történhet azonos időben, vagy egymástól függetlenül, úgy, hogy először a proton donort vagy először a polivalens fémiont adjuk hozzá. A puffer által indukált gélképződéshez a polivalens kation só és a proton forrás vizes szuszpenzióként összekeverhető jóval a gélképződés időpontja előtt. Ha a gélképződés megindult, az injekciókat megtöltjük a gélképzés bekövetkezte előtt (tipikusan 5-10 perccel korábban). Az injekciók beadhatók az anyag gélképzése előtt in situ gélképződéshez, vagy az anyag gélképződése után.

Protein-aíqinát keverék: Oldószer és kicsapató/kötőanyag (például cink sók, pufferek, stb) keverékét elkészítjük. Gyors egymásutánban egy ·: ”· .· »·· *^;· *·· protein oldatot (például 10 mM Tris HCI-ben (pH 8) levő leptin) és steril alginátot (például autoklávozott 10 %-os oldat) gyorsan összekeverünk. Amikor a biológiailag aktív anyagot finom szuszpenzióként készítjük el, (például cink-leptin, tipikusan 10-15 mg/ml koncentrációban készítjük), előnyös lehet a szuszpenzió koncentrálása.

Kalcium só: A kalcium só elkészíthető finom por és víz autoklávozott szuszpenziójában (például 9,1 % CaCO₃ vízben).

Proton forrás: A puffer-indukálta gélek esetében a kalcium só szuszpenzió kombinálható a pufferrel, például 1 M Tris HCI-dal, pH 7,0 vagy 0,5 M PIPES-sel, pH 6,7.

A lassan oldódó vagy lassan felszabaduló sav forrás (5glükonolakton) esetében egy adott tömegű port oldunk fel vízben egy meghatározott időpontban röviddel a használat előtt (például egy perccel az összekeverés előtt). Az előre lemért sav forrás száraz, steril porainak és a kalcium sónak a keveréke szintén felhasználható a folyamat egyszerűsítéséhez.

Oldószer: Az oldószer lehet vizes, nem-vizes oldószer vagy ezek keveréke. A nem-vizes oldószerekre példák a dimetil-szulfoxid, a dimetilformamid, a glicerol, a polietilén glikolok, a Pluronics® és így tovább.

Gélképződés: A polimer-gyógyszer keverék gélképzése kalcium só hozzáadásával indítható be. A keverék hőmérséklete, a só mennyisége és részecske mérete használható a gélképzödés sebességének szabályozására. Ha ezen kívül még proton donort is használunk a keverék gélképződése beindítható

1) kalcium só és savasitott puffer szuszpenzió (együttes, vagy külön-külön történő) hozzáadásával,

2) kalcium só szuszpenzió, majd egy lassan felszabaduló proton forrás friss oldatának/szuszpenziójának hozzáadásával vagy fordítva történő hozzáadásával, vagy

3) kalcium só és proton forrás porított formában történő együttes, vagy külön-külön történő hozzáadásával.

A kalcium só hozzáadása után más kicsapató anyagok/kötöanyagok (például cink sók, pufferek, stb.) is hozzáadhatok a keverékhez. Az alapos és gyors összekeverés után a gél keverék felszívható egy injekciós tűbe a gélképződés előtt.

Gél töltés: Általában a protein töltés ismert folyamat. Az ismeretlen gél töltés az alábbiak szerint határozható meg.

Burst módszer: Körülbelül 0,1 - 0,2 ml (pontos súlyt veszünk) gélt teszünk egy Eppendorf csőbe, majd 1 ml 0,1 M nátrium citrátban feloldjuk. A keveréket szobahőmérsékleten inkubáljuk óvatos rázatás mellett, míg a gél szétmállik (általában 2 óra - egy éjszaka). Ezután a kapott szuszpenziót 8K rpm értéken 2 percen keresztül centrifugáljuk (Eppendorf, 5415 C), és a felülúszó abszorbanciáját 280 nm hullámhosszon felvesszük. Bármilyen maradvány szilárd anyagot feloldunk 1 ml 7M karbamidban, ezen oldat abszorbanciáját feljegyezzük. Ezen abszorbancia értékekből a protein gél grammonként! mg mennyiségeit kiszámíthatjuk.

Kumulatív módszer: Ezt a módszert az in vitro felszabadulási vizsgálatokkal kapcsolatban végezzük el. A gélből felszabaduló protein mennyiségét, ideértve a vizsgálat végén történő robbanásszerű kiszabadulást összesítjük. A részletekhez lásd az In vitro felszabadulási vizsgálat részt.

In vitro felszabadulási vizsgálatok: A gélt vagy egy Eppendorf csőben hozzuk létre (kent minta) vagy az injekciós tűben, majd ezután nyomjuk az Eppendorf csőbe (kinyomott minta). Általában körülbelül 0,1 - 0,2 ml gélt kenünk vagy nyomunk a csőbe (a pontos tömeget mérjük). A felszabadulás a puffer (10 mM Tris HCI, pH 8 a leptin, pH 7,4 a GCSF esetén) csövekhez való hozzáadásával indul meg, ezután a csöveket inkubátor rázógépbe helyezzük (New Brunswick Scientific) 37 °C hőmérsékletre 100 - 200 rpm fordulatszámon. Kiválasztott időtartamoknál a mintát kivesszük az inkubátorból. Ha a gél érintetlen a felülúszót eltávolítjuk és centrifugáljuk (Eppendorf, 8000 rpm, 2 perc) és a felülúszót összegyűjtjük. A szilárd anyagot 1 ml friss Tris pufferben szuszpendáljuk és visszahelyezzük az eredeti felszabadulási csőbe a felszabadulás újrakezdéséhez. Ha a gél jelentősen összetöredezett, a cső tartalmát centrifugáljuk, a felülúszót összegyűjtjük és a szilárd anyagokat 1 ml pufferben reszuszpendáljuk a felszabadulás újrakezdéséhez. A különböző időpontokban gyűjtött felülúszók esetében további centrifugálásra lehet szükség (8000 - 13000 rpm, 8 perc) az UV szkenneléshez szükséges feltisztításhoz. A felszabadult protein mennyiségét a felülúszó abszorbanciájából határozzuk meg. Az utolsó felszabadulási minta levétele után a gyöngyökben maradt mennyiséget a fenti Burst módszerrel határozzuk meg. Az egy adott időben felszabadult százalékot a kumulatív protein felszabadulásból határozzuk meg, melyet vagy a gélbe eredetileg betöltött protein frakciójaként fejezünk ki (a gél súlyából és formulázásából ismerjük) vagy a végső teljes protein felszabadulásból (ideértve a végső citrát-karbamidos kiszabadulást).

In vivo vizsgálatok

Egér testtömeg vesztés: hat - nyolc hetes öreg nőstény egereket (C57/BLC) szerzünk a Charles River and Taconic Inc.-töl. Ezek az állatok tipikusan 20 grammosak. Minden egyes dózis csoportban öt egér van. Az injekciókat subcután adjuk.

Patkány PK vizsgálat: Ebben a vizsgálatban hím patkányokat használunk, testtömegük tipikusan 250-300 g. Az injekciókat az egér testtömeg veszteségi kísérletekben leírtakhoz hasonló módon adjuk. A vért katéterrel gyűjtjük különböző időpontokban az injekció beadása után és a mintákat leptinre vizsgáljuk ELISA módszerrel.

PÉLDÁK

A következő példákat a jelen találmány teljesebb illusztrálása céljából adjuk meg és semmilyen mértékben nem szándékoztuk velük korlátozni a találmány körét. Ezenkívül, a korábbi leírást vagy az alábbiakban szereplő példákat tekintve a tudomány e területén átlagosan képzett szakember képes lesz a leírás szükséges változtatásait megtenni a nagyüzemi előállításhoz.

1. példa

Ez az in vivo példa azt mutatja, hogy a leptin egy puffer-indukálta késleltetett gélben aktív és hosszan tartó felszabadulást mutat a leptin oldattal való összehasonlításban. Ez a példa egy olyan rendszert is bemutat, mely az állatba való beinjektálás után képez gélt. Steril kalciumkarbonát szuszpenziót készítünk szűrt szilárd anyagokból, melyek részecske mérete 75 mikronnál kisebb. A Tris (pH 7) pufferrel való előzetes keveréket alginátban levő leptinhez adjuk (10 mM Trisben pH 8), oly módon, hogy az alkotórészek végső koncentrációi: 2 % alginát (sterilre szűrt), 10 mg/ml leptin, 7 mM Tris pH 8, 150 mM Tris pH 7, és 24 mM CaCO3 (tökéletes feloldódást feltételezve). Egy ilyen keverék 8 - 9 perc alatt képez gélt. Amikor a leptint kihagyjuk, a gélképzödési idő kicsivel hosszabb (10-12 perc). Ez lehetővé teszi, hogy megtöltsük az injekciós tűket.

A késleltetett gél készítményt az egerek egyik csoportjába injektáljuk (még gélképzés előtt) minden második napon 100 mg/kg/nap dózisban (2 napon 50 mg/kg dózisban). Egy második csoportot leptin oldattal (Trisben 10 mg/ml koncentrációban) injektálunk naponta 50 mg/kg dózisban és egy harmadik csoport leptin oldatot kap úgy, hogy másnaponként 100 mg/kg dózist kap. Az egereket naponta mérjük és a testsúly változást az egerek kiindulási tömegének százalékában fejezzük ki.

A váltakozó napi dózis terv a késleltetett géllel megközelítően ugyanazt a testsúlycsökkenést eredményezte, mint a naponta injektált leptin oldat (8 - 9%). Ezzel szemben a másnaponként alkalmazott leptin oldat kisebb tömeg csökkenést eredményez (6 %) rövidebb idő alatt. Ez utóbbi csoport a 8. napra visszatért az alapértékhez, míg a többi csoport megtartotta eredeti testsúlyát a 10 -11. napig.

2. példa

Ez a példa azt mutatja, hogy egy puffer-indukálta kalcium alginát késleltetett gél létrehozása meghosszabbíthatja az in vitro hosszan tartó felszabadulást a nem géllé alakuló készítményekhez képest. A nagyon apró por alakú kalcium-karbonát szuszpenziót 100 mg/ml koncentrációban készítjük el. Ezt a pH 6,7 értékű PIPES pufferes elökeveréket alginátban levő cink leptin szuszpenzióhoz (Tris pH 8) adjuk, melyet koncentrált leptin oldatból (83 mg/ml Trisben pH 8 akkor, amikor a cinket hozzáadjuk) készítünk. Egy ilyen keverék 1 ml mennyiségét 10 ml főzőpohárba tesszük. Az összes alkotórész végső koncentrációja a következő: 2 % alginát (Keltone LVCR 10 % oldatából autoklávozzuk), 15 mM Tris pH 8, 50 mg/ml leptin, 1 mM ZnCI2, 10 mM CaCO3 (teljes oldódást feltételezve) és 93 mM PIPES pH 6,7. Leptin hiányában az ilyen keverék 7 percen belül géllé alakul. Egy éjszakán át tartó gélképzés után 0,2 g géldarabokat megmérünk és szcincillációs fiolákba helyezünk a felszabaduláshoz 37 °C hőmérsékletű rázógépbe. Ezt a felszabadulást a kalcium és PIPES nélküli (nincs kalcium alginát gél) ugyanilyen készítményből történő felszabaduláshoz hasonlítjuk. Amikor a cink leptin alginát megsűrűsödött készítmény (nem géleződött) felszabadul, az 5 órás időpontban 75 % és további 90 %-ig emelkedő felszabadulást detektáltunk a következő 3 napban. Azonban a kalcium alginát késleltetett gélben a cink leptin sokkal nagyobb hosszan tartó felszabadulást mutatott: 35 % 5 órakor, 60 % egy nap után majd enyhébb 70%-ig tartó emelkedést az 5. napig.

3. példa

Ez a példa azt mutatja, hogy a finom eloszlású cink csapadékként leptint tartalmazó δ-glükonolakton indukálta gél fenntartja a leptin felszabadulását. Leptint adunk (körülbelül 14 mg/ml Trisben pH 8) egy pH 6,7-es PIPES oldathoz és ZnCI2 oldatot keverünk bele azonnal, ezután gyorsan alginát oldatot (10%-os, autoklávozott) adunk hozzá így az alkotórészek végső koncentrációja a következő: 1,1 mM ZnCI2, 2,2 % alginát, 10 mM Tris (pH8) és 22 mM PIPES (pH 6,7). Ezt a keveréket centrifugálással koncentráljuk, míg a leptin szint 46 mg/ml értéket ér el. Ezután létrehozzuk a gél keveréket CaCO3 szuszpenzió (finom porként történő) belekeverésével, melyet a δ-glükonolakton gyors hozzáadása követ. Az alkotórészek végső koncentrációja a következő: 2 % alginát, 20 mM PIPES, 9 mM Tris, 1 mM ZnCI2, 16 mM (teljes feloldódást feltételezve) CaCO3 és 79 mM δ-glükonolakton. A keveréket felszívjuk injekciós tűkbe a gélképzödés előtt és a gélképződés az injekciós tűkben következik be 10 perc elteltével. Az egy éjszakán át tartó tárolás (3 óra szobahőmérsékleten, majd 4 °C hőmérsékleten) után a géleket egerekbe injektáljuk. A testsúlycsökkenést a pufferrel injekciózott kontrolhoz viszonyítva követjük nyomon.

Öt napon keresztül leptint injektálunk 50 mg/kg/nap dózisban, azaz egy 250 mg/kg-os adag van a gélben és ezt hasonlítjuk a szabad leptines, ugyanilyen dózisú oldathoz. A szabad leptin adag csak mérsékelt testtömeg csökkenést mutatott 4,4 - 4,8 % 2 - 3 nap alatt és az egerek az ötödik napon újra gyarapodni kezdtek. Ezzel szemben a 2 - 4. napon a gélben levő cink leptin 9 %-os testsúlycsökkenést eredményezett. Az 5. napon a súlyveszteség még mindig 5%-os és az alapérték felett maradt (fenntartott súlyveszteség), amikor a kísérlet a 7. napon véget ért.

4. példa

Ez a példa azt mutatja, hogy amennyiben az alginát-leptin-cink keverék protein koncentrációja elegendően magas, a keverék gélt hoz létre kalcium hiányában is és a gél hosszan tartó felszabadulást mutat. Leptint (körülbelül 14 mg/ml Trisben pH 8) adunk egy puffer oldathoz és rögtön ezután ZnCI2 oldatot keverünk bele, ezután gyorsan alginát oldatot (10 %-os, autoklávozott) keverünk hozzá oly módon, hogy az alkotórészek végső koncentrációja a következő: 1,1 mM ZnCI2, vagy 1,1 vagy 2,2 % alginát, 10 mM Tris (pH 8) és 22 mM PIPES pH 6,7 (ha jelen van). Ezt a keveréket centrifugálással koncentráljuk amíg a leptines szilárd anyagok kívánt koncentrációját elérjük. A körülbelül 50 mg/ml koncentrációjú készítményben PIPES és 2,2 % alginát található. A körülbelül 100 mg/ml koncentrációjú készítményben nincs PIPES és az alginát 1,1 %-ban van jelen.

A komponensek végső koncentrációja a 3. példa 50 mg/ml kalcium géljéhez 2 % alginát, 20 mM PIPES, 9 mM Tris, 1 mM ZnCI2, 16 mM (teljes feloldódást feltételezve) CaCO3 és 79 mM δ-glükonolakton. A 100 mg/ml-es kalcium gél esetében a készítmény hasonló, azzal az eltéréssel, hogy az alkotórészek végső koncentrációja 1% alginát, a PIPES-t kihagytuk, 13 mM CaCO3 és 67 mM δ-glükonolakton.

A kalciumot tartalmazó gélek esetében a keverékeket felszívjuk az injekciós tűkbe a gélképződés előtt és a gélképzödés az injekciós tűben következik be 10 perc elteltével. Amikor a gélben nincs kalcium, a Znleptin-alginát keveréket felszívjuk az injekciós tűbe és hagyjuk, hogy létrejöjjön a gél. Úgy tűnt, hogy a kalcium nélküli 50 mg/ml koncentrációjú készítmény nem képez gélt. Egy éjszakás tárolás után (3 óra szobahőmérsékleten, majd 4 °C hőmérsékleten) a gélek az egerekbe injektáljuk. A testsúly vesztést a puffereit kontrollokhoz viszonyítva követjük nyomon.

Az öt napos leptin adagolásnál 50 mg/ml/kg leptint injektáltunk, azaz a gélben levő 250 mg/kg-os adagot. A 3. példa kalcium géljei 9 %-os testsúly csökkenést eredményeznek 2 - 4 nap alatt; az ötödik napon a súlycsökkenés még mindig 5 %-os és az alapérték felett marad (fenntartott súlycsökkenés), amikor a kísérletet a 7. napon befejeztük. Ezzel szemben, a kalcium nélküli 50 mg/ml-es készítmény 3 %-os súlycsökkenést okoz a 2 - 4. napokon, azonban a súlycsökkenés nullára zuhan az 5. napon. Ezzel szemben a 100 mg/ml leptin készítmény kalcium nélkül legalább ugyanolyan aktív mint a 100 mg/ml leptin készítmény kalciummal. A legnagyobb súlycsökkenés a nem kalciumos esetben, 100 mg/ml gélnél 9 %-os a 4. napon, ugyanez a kalciumos esetben 100 mg/ml gélnél 6%-os szintén a 4. napon. Mind a két készítmény után elkezdődik a súlygyarapodás a 9. napon.

5. példa

Ez a példa azt mutatja, hogy egy alginát késleltetett gélből a leptin in vitro hosszan tartó felszabadulása előidézhető úgy is, hogy először nem készítünk leptin-cink finom csapadékot. Leptint (100 mg/ml; 10 mM Tris HCI, pH 8,8; a pH értéket 8,0-ról 8,8-ra 1 M NaOH-val állítjuk) és 6 % alginátot (10 mM tris HCI, pH 8,6) jégfürdőben lehűtünk. A 6 %-os 0,18 ml mennyiségű algináthoz 0,5 ml leptint adunk és a keveréket jégfürdön kevertetjük 10-15 percig; a végső pH 8,6 - 8,8. Ehhez a keverékhez hozzáadjuk 1 M CaCO3 (16 mcl) szuszpenzióját és a kapott szuszpenziót jól összekeverjük. Ehhez a keverékhez cseppenként hozzáadunk keverés mellett 0,1 M ZnCI2 (100 mcl) oldatot; ezután vizet adunk hozzá, hogy a készítmény térfogata 1 ml legyen. A szuszpenzió keveréket teljesen összekeverjük és 10-20 percig jégfürdön tartjuk. 0,68 M δ-glükonolakton (56 mcl) oldatát alapos keverés mellett hozzáadjuk ehhez a keverékhez. A végső keverék 0,1 ml mennyiségét (50 mg/ml leptin, 1 % alginát) egy Eppendorf cső belsejébe tesszük és egy éjszakán át ott hagyjuk 4 °C hőmérsékleten.

Az egy éjszakán át tartó keverés után egy in vitro felszabadulási kísérletet hajtunk végre 10 mM hisztidinben pH 7,4. A betett gél kis robbanásszerű kiszabadulást mutat és meglehetősen állandó leptin kiszabadulást mutat, hat nap alatt 50 % szabadul fel.

6. példa

Ez a példa azt mutatja, hogy a finom cink csapadékként leptint tartalmazó δ-glükonolakton által indukált gél a leptin sokkal hosszabban tartó kiszabadulását eredményezi, mint ugyanaz az alginátban levő cink szuszpenzió, mely nem képez gélt. A cink leptint tartalmazó gélt a 3. példa szerint állítjuk elő. A géllé nem alakult, alginátban levő cink leptin szuszpenziót ugyanilyen módon állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy a CaCO3-ot és a δ-glükonolaktont kihagyjuk. Az egereket 250 mg/kg adagú dózissal injektáljuk és a súlycsökkenési kísérletet a 3. példában leírtak szerint végezzük el. A géllé nem alakult szuszpenzió csupán 3 %-os súlycsökkenést eredményez 2-4. nap alatt, míg a géllé alakult szuszpenzió körülbelül 9 %-os súlycsökkenést eredményez ugyanezen időszak alatt. A géllé nem alakult szuszpenzió súlycsökkenése visszatért az alapértékhez az 5. napon, míg a géllé alakult szuszpenzió súlycsökkenése alapérték fölött maradt a 7. napon is, amikor a kísérletet befejeztük.

7. példa

Ez a példa nulla-rendű felszabadulási kinetikát mutat a hím patkányok farmakokinetikai-farmakodinamikai vizsgálatában, ami bemutatja, a leptin hosszan tartó felszabadulású és az azonos időben történő felszabadulású hatását (azaz a súlycsökkenést), melyet a 3. példában leírt gél készítmény segítségével valósítottunk meg. A leptin koncentráció 47 mg/ml volt és az injekciós tűben már megtörtént a gélképződés, ahogy azt a 3. példában leírtuk. A patkányok 0 mg/kg (kontroll) adagú, 50 mg/kg és 250 mg/kg adagú dózist kaptak, majd hat napon keresztül nyomon követtük a vérszintet és súlycsökkenést. Gél nélküli leptin-cink csapadékot is injektáltuk a patkányokba 100 mg/kg dózisban.

A nagy dózisú leptines gél csoport állandó vérszintű, körülbelül 2000 ng/ml koncentrációt mutatott ez alatt az időszak alatt, míg az alacsonyabb dózisú leptin gél körülbelül 1/5 szintet mutatott a 4. napig. Ezzel szemben, a gél nélküli leptines csoportban a vér szint 2300 ng/ml, és ez a 12. órában csúcsosodott, majd század részére csökkent ugyanezen időszak alatt. A patkányok súlya (versus hordozó kontroll) állandóan csökkent ez alatt az időszak alatt a nagy dózisú leptines gél csoportban. Az alacsonyabb dózisú leptin gél csoportban a súly ugyanazt a folyamatot követte, közel 5 napig, ekkor az alacsonyabb dózisú csoport leptin vérszintje lecsökkent.

A leptines gyógyszer biológiai elérhetőségét úgy becsültük meg, hogy dózis-normalizáltuk a leptin-gél formula és a gél nélküli leptin formula és az intravénásán adott leptin görbék alatti területet és ezeket összehasonlítottuk. A leptin gél formula biológiai elérhetősége 80 %-os, míg a gél nélküli leptin biológiai elérhetősége 63 %-os.

8. példa

Ez a példa a G-CSF in vitro hosszan tartó felszabadulását mutatja késleltetett gél hordozóból. A kent és benyomott anyagokat is bemutatjuk a példában. 3,4-es pH értékű vízben levő G-CSF-et keverünk koncentrált algináttal (10 %), zavaros, viszkózusos szuszpenzió létrehozása céljából. Ezt a keveréket CaCO3-tal géllé alakítjuk és δglükonolaktont adunk hozzá sorrendben 16 mM és 79 mM koncentrációban. A gélképzödés előtt azonos mennyiségű anyagot helyezünk a kémcsőbe, vagy szívunk fel injekciós tűbe. Szobahőmérsékleten eltöltött egy óra után a géleket 4 °C hőmérsékleten tároljuk (egy éjszakán keresztül). A felszabadulási vizsgálat elvégzése előtt, az injekciós tűben levő gélt kinyomjuk a kémcsőbe és 20 percig állni hagyjuk. Ezután adjuk hozzá felszabadító puffért. A kinyomott gél GCSF felszabadulást mutat 3 napos időtartam alatt, azaz 1 óra után 11%, az 1 nap után 35 %, a második napon 75 % és körülbelül 90 % a harmadik napon. A bekent gélből 1 óra után 22 %, egy nap után 80 % és 2 nap után 94 % szabadult fel.

9. példa

Ez a példa a kalcium sóból, proton donor hozzáadása nélkül készült alginát késleltetett gélből történő leptin hosszan tartó felszabadulását mutatja. A nem puffereit leptint pH 8 értéken használjuk a cink-leptin szuszpenzió 2 % alginátban való létrehozásához. A ZnCI2 és a leptin végső koncentrációja sorrendben 1 mM és 35 mg/ml. CaSO4 finom porát keverjük a cink-leptin-alginát szuszpenzióval oly módon, hogy a végső keverékben a CaSO4 10 mM. A keverék azonos mennyiségeit az eppendorf csövek falára kenjük. A keverék 4-5 percen belül géllé alakul.

A szobahőmérsékleten való egy éjszakán át tartó tárolás után elvégezzük a felszabadulási kísérletet. A gélből a protein felszabadulás alacsony hirtelen történő kijutást 5 %) mutat egy óra után. Egy napos korban a leptin 11 %-a szabadul ki. A leptin kiszabadulás fokozatos, 1,1 % naponta a következő 7 napon.

10. példa

Ez a példa a kalcium sóból, proton donor hozzáadása nélkül, nem vizes oldószerben készült alginát késleltetett gélből történő leptin hosszan tartó fel szabadulását mutatja. A leptin liofilezett porát száraz metilszulfoxidban levő 2 % alginátban szuszpendáljuk. Kalcium-oleát finom porát keverjük az alginát-leptin szuszpenzióba oly módon, hogy a végső keverékben a kalcium 10 mM. Az anyag azonos mennyiséget a teszt csövek falaira öntjük. A keverék egy idő után géllé alakul.

A szobahőmérsékleten egy éjszakán át tartó tárolás után elvégezzük a felszabadulási vizsgálatot. A protein felszabadulása a gélből fokozatos és hosszan tartó a következő 7 nap alatt.

11. példa

Ez a példa a leptin in vivo hosszan tartó felszabadulását mutatja a kalcium sóból a 10. példa alapján leírtak szerint előállított alginát gélből. Az egerek súlycsökkenési vizsgálatát a leptint tartalmazó gél 250 mg/kg dózisban történő, egyszeri beinjekciózása után mérjük. Súlycsökkenést mértünk több napon keresztül.

12. példa

Ez a példa a kalcium sóból, proton donor hozzáadása nélkül, nem vizes oldószerben készült alginát késleltetett gélből történő G-CSF hosszan tartó felszabadulást mutatja be. A G-CSF liofilezett porát száraz dimetil-szulfoxidban levő 2 % alginátban szuszpendáljuk. Kalcium-oleát finom porát keverjük az alginát-G-CSF szuszpenzióval oly módon, hogy a végső keverékben a kalcium 10 mM. Az anyag azonos mennyiségeit a teszt kémcsövek falára öntjük. A keverék egy idő után géllé alakul.

A szobahőmérsékleten egy éjszakán át tartó tárolás után elvégezzük a felszabadulási vizsgálatot. A protein felszabadulása fokozatos és hosszan tartó.

13. példa

Ez a példa a konszenzus interferon in vitro hosszan tartó felszabadulását mutatja, ahogy az a 4.695.623 számú US szabadalmi alkalmazásban leírásra került, supra, az alginát késleltetett gélekből. Vizet, ZnCI2-ot, Tris puffért és konszenzus interferont (10 mM Trisben pH 7,5) keverünk össze alginát oldattal, majd CaCO3-at és δ-glükonolaktont keverünk hozzá oly módon, hogy az alkotórészek végső koncentrációja a következő: 1 mg/ml konszenzus interferon, 10 mM ZnCI2, 1 % alginát, 20 mM Tris, 10 mM CaCO3 és 40 mM δ-glükonolakton. A keveréket egy eppendorf csőre öntjük (0,4 ml csövenként), szobahőmérsékleten géllé alakul és egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten tároljuk. Az egy éjszakán át tartó tárolás után egy in vitro felszabadulási vizsgálatot hajtunk végre 10 mM hisztidin pufferben pH 7,4. Az öntött gél kicsi kezdeti kijutást - a százalékos kijutás 3 % 1 óra után, 14 % egy nap után - mutat. A 4. napra 70 % szabadul fel. Az 5 - 6. napon a kiszabadulási sebesség lelassul napi 5% alá.

14. példa

Ez a példa azt mutatja be, hogy az alginát késleltetett gélek felhasználhatók a konszenzus interferon hosszan tartó felszabadulásához. Egy alginát konszenzus interferon késleltetett gélt készítünk a 13. példa eljárásának megfelelően, azzal az eltéréssel, hogy a végső koncentrációk a következők: 0,2 mg/ml konszenzus interferon, 10 mM ZnCI2, 2 % alginát, 20 mM Tris, 10 mM CaCO3 és 40 mM δglükonolakton. Egy másik készítményt is előállítunk ugyanilyen összetételben, azzal az eltéréssel, hogy a konszenzus interferon végső koncentrációja 1 mg/ml. A keverékeket injekciós tűvel felszívjuk és két órán keresztül hagyjuk géllé alakulni. A 0,2 mg/ml-es készítményt subcután injektáljuk 1 mg/kg és az 1 mg/ml készítményt 1 mg/kg és 5 mg/kg dózisokban hím szíriai aranyhörcsögökbe. Vért gyűjtünk szív punktúrával és a mintát vizsgáljuk a konszenzus interferonra, ily módon figyeljük a gyógyszer hosszan tartó felszabadulását.

Claims (50)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Egy hosszan tartó felszabadulású, késleltetett gél készítmény azzal jellemezve, hogy

   a) egy hidrofil polimert;

   b) egy biológiailag aktív anyagot; és

   c) legalább egy kötött polivalens fémiont tartalmaz.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti hosszan tartó felszabadulású készítmény azzal jellemezve, hogy d) legalább egy proton donor a kötött polivalens fémiont felszabadítani képes.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti hosszan tartó felszabadulású készítmény azzal jellemezve, hogy a kötött polivalens fémion a kötött és nem kötött polivalens fémion keverékét jelenti.
4. 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti hosszan tartó felszabadulású készítmény azzal jellemezve, hogy a továbbiakban a biológiailag aktív anyag vagy a hidrofil polimer stabilizálására kötőanyagot is tartalmaz.
5. 5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti hosszan tartó felszabadulású készítmény azzal jellemezve, hogy a kötött polivalens fémion egy olyan só, melyet az acetátokat, foszfátokat, laktátokat, tartarátokat, citrátokat, kloridokat, szulfátokat, karbonátokat, hidroxidokat vagy ezek zsírsav anionjait magába foglaló csoportból szelektálunk.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a fémiont a mangánt, a stronciumot, a vasat, a magnéziumot, a kalciumot, báriumot, rezet, alumíniumot vagy a cinket magába foglaló csoportból szelektáljuk.
7. 7. A 6. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a fémion kalciumot jelent.
8. 8. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a hidrofil polimer polianioint jelent.
9. 9. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a hidrofil polimer poliszacharidot jelent.
10. 10. A 9. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a poliszacharid egy savas poliszacharidot jelent.
11. 11. A 10. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a poliszacharid alginátot jelent.
12. 12. A 11. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy az alginát legalább 30 % glükuronsavat tartalmaz.
13. 13. A 11. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy az alginát legalább 0,05 súly%-ban jelen van.
14. 14. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a biológiailag aktív anyag proteint tartalmaz.
15. 15. A 14. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a protein legalább 0,001 mg/ml mennyiségben jelen van.
16. 16. A 14. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a proteint a hematopoietikus faktorokat, a telep stimuláló faktorokat, az elhízás elleni faktorokat, növekedési faktorokat, trofikus faktorokat és gyulladásgátló faktorokat magába foglaló csoportból szelektáljuk.
17. 17. A 14. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a proteint a leptint, a G-CSF-et, SCF-et, BDNF-et, GDNF-et, NT3-at, GMCSF-et, IL-1ra-t, IR2-őt, TNF-bp-t, MGDF-et, OPG-t, interferonokat, eritropoietint, KGF-et, inzulint és ezek analógjait vagy származékait magába foglaló csoportból szelektáljuk.
18. 18. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a biológiailag aktív anyag egy komplexszé tett biológiailag aktív anyagot jelent.
19. 19. A 18. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a komplexszé tett biológiai anyag egy kicsapatott proteint jelent.
20. 20. A 19. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a kicsapatott protein egy cink leptin csapadékot jelent.
21. 21. A 2. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a proton donor savas forrásból származik.
22. 22. A 21. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a savas forrást a puffereket, az észtereket, a lassan oldódó savakat vagy laktonokat magába foglaló csoportból szelektáljuk.
23. 23. Eljárás a hosszantartó felszabadulású, késleltetett gél készítmény előállítására azzal jellemezve, hogy az eljárás a következő lépésekből áll:

    a) egy biológiailag aktív anyagot és egy hidrofil polimert oldószerben összekeverünk és így létrehozzuk az első keveréket; és

    b) az első keveréket legalább egy kötött polivalens fémionnal keverjük össze és így a második keveréket is létrehozzuk.
24. 24. A 23. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a továbbiakban tartalmazza a c) lépést is, melynek során a második keveréket a kötött polivalens fémion felszabadítására képes legalább egy proton donorral keverjük.
25. 25. A 23. vagy 24. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kötött polivalens fémion egy olyan só, melyet az acetátokat, foszfátokat, (aktátokat, citrátokat, szulfátokat, tartarátokat, kloridokat, karbonátokat, hidroxidokat vagy ezek zsírsav anionjait magába foglaló csoportból szelektáljuk.
26. 26. A 25. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fémiont a mangánt, a stronciumot, a vasat, a magnéziumot, a kalciumot, báriumot, rezet, alumíniumot vagy a cinket magába foglaló csoportból szelektáljuk.
27. 27. A 26. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fémion kalciumot jelent.
28. 28. A 23. vagy 24. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a hidrofil polimer polianiont jelent.
29. 29. A 23. vagy 24. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a hidrofil polimer poliszacharidot jelent.
30. 30. A 29. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a poliszacharid egy savas poliszacharidot jelent.
31. 31. A 30. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a poliszacharid alginátot jelent.
32. 32. A 31. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az alginát legalább 30 % glükuronsavat tartalmaz.
33. 33. A 31. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az alginát legalább 0,05 súly%-ban jelen van.
34. 34. A 23. vagy 24. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a biológiailag aktív anyag proteint tartalmaz.
35. 35. A 34. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a protein legalább 0,001 mg/ml mennyiségben jelen van.
36. 36. A 34. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a proteint a hematopoietikus faktorokat, a telep stimuláló faktorokat, az elhízás elleni faktorokat, növekedési faktorokat, trofikus faktorokat és gyulladásgátló faktorokat magába foglaló csoportból szelektáljuk.
37. 37. A 34. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a proteint a leptint, a G-CSF-et, SCF-et, BDNF-et, GDNF-et, NT3-at, GMCSF-et, IL-1ra-t, IL2-öt, TNF-bp-t, MGDF-et, OPG-t, interferonokat, eritropoietint, KGF-et és ezek analógjait vagy származékait magába foglaló csoportból szelektáljuk.
38. 38. A 23. vagy 24. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a biológiailag aktív anyag egy komplexszé tett biológiailag aktív anyagot jelent.
39. 39. A 38. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a komplexszé tett biológiai anyag egy kicsapatott proteint jelent.
40. 40. A 39. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a kicsapatott protein egy cink leptin csapadékot jelent.
41. 41. A 23. vagy 24. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy olyan lépést, melynek során a hosszantartó felszabadulású készítményt izoláljuk.
42. 42. A 24. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a proton donor savas forrásból származik.
43. 43. A 42. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a savas forrást a puffereket, az észtereket, a lassan oldódó savakat vagy laktonokat magába foglaló csoportból szelektáljuk.
44. 44. Egy hosszantartó felszabadulású készítmény azzal jellemezve, hogy a 23., 24. vagy a 41. igénypont szerinti módszer alapján előállítjuk.
45. 45. Egy gyógyszerészeti készítmény azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 2. igénypont szerinti hosszantartó felszabadulású készítményt egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóban, hígítóban vagy hatásjavítóban tartalmazza.
46. 46. A 45. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény azzal jellemezve, hogy a készítmény injekciós tűben van.
47. 47. Eljárás egy indikáció kezelésére azzal jellemezve, hogy az eljárás során a gyógyszerészetileg elfogadható hordozóban, hígítóban vagy hatásjavítóban levő, a 1. vagy 2. igénypont szerinti hosszantartó felszabadulású készítményt alkalmazzuk.
48. 48. Kezelési eljárás azzal jellemezve, hogy a túlsúlyt, diabetest, magas vér lipid szintet, artériás sclerosist, artériás plakkot, az epeköképzödés csökkentését vagy megelőzését, a nem kielégítő sovány szövet tömeget, a nem kielégítő inzulin szenzitivitást és a stroke-ot magába foglaló csoportból szelektált betegségeket egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóban, hígítóban vagy hatásjavítóban levő, az 1. vagy 2. igénypont szerinti hosszantartó felszabadulású készítménnyel kezeljük, melyben a biológiailag aktív anyagot a leptin, vagy ennek egy analógja vagy származéka jelenti.
49. 49. Kezelési eljárás azzal jellemezve, hogy a hematopoietikus sejt deficienciákat, fertőzéseket és neuropeniát magába foglaló csoportból szelektált betegségeket egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóban, hígítóban vagy hatásjavítóban levő, az 1. vagy 2. igénypont szerinti hosszantartó felszabadulású készítménnyel kezeljük, melyben a biológiailag aktív anyagot a G-CSF vagy ennek egy analógja vagy származéka jelenti.
50. 50. Kezelési eljárás azzal jellemezve, hogy a gyulladást egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóban, hígítóban vagy hatásjavítóban levő, az 1. vagy 2. igénypont szerinti hosszantartó felszabadulású készítménnyel kezeljük, melyben a biológiailag aktív anyagot az IL-1 vagy ennek egy analógja vagy származéka jelenti.

    A meghatalmazott ifit Szentpéteri Ádám ^! dll

    Telelőn 34-J4-95J, rnx. 34.^.