DE69838750T2

DE69838750T2 - Zeitverzögerte gelzusammensetzungen mit verlängerter wirkstoffverabreichung

Info

Publication number: DE69838750T2
Application number: DE69838750T
Authority: DE
Inventors: Merrill Seymour Thousand Oaks GOLDENBERG; Alice C. Thousand Oaks BEEKMAN; Jian Hua Thousand Oaks GU
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1997-05-16
Filing date: 1998-05-18
Publication date: 2008-10-30
Anticipated expiration: 2018-05-19
Also published as: NO995591L; BG64860B1; YU58599A; BR9809117A; SK154399A3; NO995591D0; EP0981374B1; WO1998051348A2; CA2289196A1; CZ299180B6; EP0981374A2; IL132814A0; DE69838750D1; BG103914A; WO1998051348A3; PL336887A1; KR20010012374A; CA2289196C; EA199901013A1; PL199565B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft nachhaltig wirkende Formulierungen, die zeitverzögerte Alginatgele verwenden, und Verfahren dafür.
HINTERGRUND
Mit den Fortschritten auf dem Gebiet der Gen- und Zelltechnologie hat die Verfügbarkeit von rekombinanten Proteinen Fortschritte bei der Verwendung von Proteinen als Medikamente für therapeutische Anwendungen hervorgebracht. Viele Erkrankungen oder Zustände, die mit pharmazeutischen Proteinen behandelt werden, erfordern anhaltende Proteintiter, um das wirksamste therapeutische Ergebnis zu erreichen. Wie jedoch bei den meisten Proteinbasierten Pharmazeutika erfordert die im Allgemeinen kurze biologische Halbwertszeit eine häufige Verabreichung. Diese wiederholten Injektionen werden in verschiedenen Intervallen gegeben, was zu wechselnden Medikationstitern mit einer erheblichen körperlichen und monetären Belastung der Patienten führt. Da viele Zustände besser auf kontrollierte Titer eines Pharmazeutikums ansprechen, besteht ein Bedarf für die gesteuerte Freisetzung eines Medikamentes, um längere Zeitspannen mit konsistenter Freisetzung bereitzustellen. Derartige nachhaltig wirkende Medikamente würden den Patienten nicht nur verbesserte prophylaktische, therapeutische oder diagnostische Wirkungen bescheren, sondern auch eine Verringerung der Häufigkeit der Injektionen sowie der Gesamtkosten.
Derzeitige Bemühungen, Medikationstiter in Menschen oder Tieren zwischen Dosen aufrecht zu erhalten, haben die Verwendung von biologisch abbaubaren Polymeren als Matrizen umfasst, um die Medikamentenfreisetzung zu steuern. Beispielsweise offenbart das britische Patent Nr. 1,388,580 die Verwendung von Hydrogelen für die Langzeitfreisetzung von Insulin. Das US-Patent Nr. 4,789,550 offenbart die Verwendung von Polylysin-beschichteten Alginat-Mikrokapseln zur Abgabe von Protein durch Verkapseln von lebenden Zellen. Versuche für eine Langzeitfreisetzung haben auch anionische oder kationische Polymerzusammensetzungen für die Verkapselung von Zellen verwendet, die von ionischen Polymeren mit entgegengesetzter Ladung umgeben sind, wobei die Zellen in der Lage sind, biologisch aktive Zusammensetzungen herzustellen. US-Patent Nr. 4,744,933 . In ähnlicher Weise sind Mehrfachbeschichtungen aus anionischen oder kationischen quervernetzenden Polymeren als Mittel zum Erhalten einer gesteuerten Freisetzung offenbart worden. US-Patente Nr. 4,690,682 und 4,789,516 . Zusätzlich offenbarten weitere Bemühungen die Verwendung von Alginaten alleine, oder Alginaten, die mit anderen biologisch abbaubaren Polymeren beschichtet sind, für die gesteuerte Freisetzung von Polypeptidzusammensetzungen oder Kationenpräzipitaten davon. PCT WO 96/00081 , PCT WO 95/29664 und PCT WO 96/03116 .
Diese Bemühungen haben jedoch unzureichende Mittel bereitgestellt, um eine nachhaltig wirkende Abgabe von erwünschten Pharmazeutika auf Proteinbasis zu erhalten. Es ist allgemein bekannt, dass die Verwendung bestimmter biologisch abbaubarer Polymere, z. B. Polylactid-co-Glycolid, unter in-vivo-Bedingungen, hohe initiale Spitzen an Medikamentenfreisetzung aufweist. Johnson, O. et al., Nature Med., 2/7: 795 (1996). Weiterhin ist allgemein bekannt, dass Proteine, die mit derzeitigen nachhaltig wirkenden Präparatformen verwendet werden, eine Denaturierung und den Verlust ihrer Bioaktivität nach Exposition gegenüber Verkapselungsmitteln erfahren können. Derartige Präparate verwenden organische Lösungsmittel, die nachteilige Wirkungen auf das ausgewählte Protein aufweisen können. Schließlich, wie unten diskutiert, hat die Verwendung von Alginat alleine nicht die erwünschte gesteuerte Proteinfreisetzung erbracht, die für wirksame therapeutische Ergebnisse erforderlich ist.
Im Allgemeinen sind Alginate gut bekannte, natürlich auftretende, anionische Polysaccharide, die aus 1,4-verbundenem β-D-Mannuronsäure und α-L-Glucuronsäure bestehen. Smidsrod, O. et al., Trends in Biotechnology, 8: 71-78 (1990); Aslani, P. et al., J. Microencapsulation, 13/5: 601-614 (1996). Alginate variieren typischerweise von 70% Marmuronsäure und 30% Glucuronsäure, zu 30% Mannuronsäure und 70% Glucuronsäure. Smidsrod, a.a.O. Alginsäure ist wasserunlöslich, wohingegen Salze, die mit monovalenten Ionen, wie beispielsweise Natrium, Kalium und Ammonium, ausgebildet sind, wasserlöslich sind. McDowell, R.H., „Properties of Alginates" (London, Alginate Industries Ltd., 4. Ausgabe 1977). Es ist bekannt, dass polyvalente Kationen mit Alginaten reagieren, um spontan auszubilden.
Alginate haben eine große Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten, wie beispielsweise als Lebensmittelzusätze, Klebemittel, pharmazeutische Tabletten, Matrizen für neues Zellwachstum und Wundverbände. Alginate sind auch für Proteintrenntechniken empfohlen worden. Beispielsweise schloss Gray, C.J. et al., in Biotechnology and Bioengineering, 31: 607-612 (1988) Insulin in Zink/Kalzium-Alginatgelen für die Trennung von Insulin von anderen Serumproteinen ein.
Alginatmatrizen sind auch gut für Wirkstoffabgabesysteme beschrieben, siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 4,695,463 , das ein Alginat-basiertes Kaugummiabgabesystem und pharmazeutische Präparate offenbart. Alginatkügelchen sind für die gesteuerte Freisetzung verschiedener Proteine verwendet worden, wie beispielsweise: Tumornekrosefaktor-Rezeptor in kationischen Alginatkügelchen, die mit Polykationen beschichtet sind, Wee, S.F., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 21: 730-31 (1994); transformierender Wachstumsfaktor, der in Alginatkügelchen verkapselt ist, Puolakkainen, P.A. et al., Gastroenterology, 107: 1319-1326 (1994); angiogene Faktoren, die in Kalzium-Alginat-Kügelchen eingeschlossen sind, Downs, E.C. et al., J. of Cellular Physiology, 152: 422-429 (1992); Albumin, das in Chitosan-Alginat-Mikrokapseln eingeschlossen ist, Polk, A. et al., J. Pharmaceutical Sciences, 83/2: 178-185 (1994) oder Chitosan-Kalzium-Alginat-Kügelchen, die mit Polymeren beschichtet sind, Okhamafe, A. O. et al., J. Microencapsulation, 13/5: 497-508 (1996); Hämoglobin, das mit Chitosan-Kalzium-Alginat-Kügelchen verkapselt ist, Huguet, M.L. et al., J. Applied Polymer Science, 51: 1427-1432 (1994), Huguet, M.L. et al., Process Biochemistry, 31: 745-751 (1996); und Interleukin-2, das in Alginat-Chitosan-Mikrosphären verkapselt ist, Liu, L.S. et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater, 22: 542-543 (1995).
Systeme, die Alginat-Gelkügelchen oder Alginat/Kalzium-Gelkügelchen verwenden, um Proteine einzuschließen, fehlt es an einer nachhaltigen Wirkung infolge der schnellen Freisetzung des Proteins aus den Alginatkügelchen. Liu, L. et al., J. Control. Rel., 43: 65-74 (1997). Um eine derartige schnelle Freisetzung zu vermeiden, versuchen eine Anzahl der obigen Systeme polykationische Polymerbeschichtungen (z. B. Polylysin, Chitosan) zu verwenden, um die Freisetzung der Protein-Alginat-Kügelchen zu verzögern. Siehe z. B. Wheatley, M.A. et al., J. Applied Polymer Science, 43: 2123-2135 (1991); Wee, S.F. et al., a.a.O.; Liu, L.S. et al., a.a.O.; Wee, S.F. et al., Controlled Release Society, 22: 566-567 (1995) und Lim, et al., a.a.O.
Polykationen, wie beispielsweise Polylysin, sind positiv geladene Polyelektrolyte, die mit den negativ geladenen Alginatmolekülen Wechselwirken, um Polyelektrolytkomplexe auszubilden, die als Diffusionsbarrieren auf der Oberfläche der Kügelchen wirken. Die folgenden Probleme können bei der Verwendung von Polykationen auftreten: (1) derartige Formulierungen können infolge der Polykationen zytotoxisch sein (Huguet, M.L. et al., a.a.O.; Zimmermann, Ulrich, Electrophoresis, 13: 269 (1992); Bergmann, P. et al., Clinical Science, 67: 35 (1984)); (2) Polykationen neigen zu Oxidation; (3) Kügelchen mit polykationischen Beschichtungen neigen dazu, erodierbar zu sein und sich im Körper anzusammeln; (4) derartige Formulierungen werden durch arbeitsintensive Beschichtungsverfahren hergestellt, die Mehrfachbeschichtungen des Polykations Polylysin umfassen (Padol, et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater, 2: 216 (1986)) und (5) ionische Wechselwirkungen zwischen dem Protein und den Polykationen können zu einem Verlust an Proteinaktivität oder Proteinstabilität führen.
Zusätzlich zu den obigen Systemen existieren auch Abgabesysteme, die nach Injektion gelieren, oder organisch oder thixotrop basiert sind. Gelierte Depots, die nach Injektion im Körper gelieren, können die Freisetzung von eingeschlossenen Wirkstoffen nachhaltig aufrechterhalten. Dies würde die Temperatur-induzierte Gelierung von Poloxameren (z. B. Pluronics^®, US-Patent Nr. 2,741,573 ) umfassen. Diese sind flüssig bei kalten Temperaturen, gelieren aber bei erhöhten Temperaturen, wie beispielsweise Körpertemperaturen. Dies Systeme sind schwierig zu steuern infolge der Variationen der Umgebungstemperaturbedingungen und Variationen in anatomischen Temperaturen, insbesondere, wenn subkutane Injektionen verwendet werden.
Was organisch basierte Gelierungssysteme anbelangt, so sind derartige Systeme nicht für fragile Proteinwirkstoffe geeignet, die in Gegenwart von organischen Lösungsmitteln oder nicht-physiologischen Bedingungen destabilisiert werden. Thixotrope Gele aus Aluminiumstearat in Ölen sind ebenfalls verwendet worden, um die Aktivität von Penicillin zu verlängern. Buckwalter et al., J. Am. Pharm Assoc., 137: 472 (1948); Thompson, R.E., American Journal Clinical Nutrition, 7: 311 (1959); Thompson, Robert E., Sustained Release of Parenteral Drugs, Bulletin of Parenteral Drug Assoc., 14: 6-17, (1960); Chen, Y., Journal of Parenteral Science & Tech., 35: 106 (1981). JP 01 005460 A offenbart gelierenden Gellan- Gummi, der ein Alkalimetallsalz und eine saure Substanz verwendet. Proteine neigen dazu, in Gegenwart von dieser Art von Öl enthaltenden Systemen zu destabilisieren.
Nachhaltig wirkende Wirkstoffabgabesysteme, die einen gesteuerten Zeitverlauf für die Gelierung im Körper aufweisen, sind allgemein ein in der Technik nicht bekannt. Diese Art von verzögerten Gelsystemen sind jedoch bekannt im Zusammenhang mit Pflanzengewebekultur, Immobilisierung von Zellen, Mikrosphärenbildung, Insektizidfreisetzung und der Lebensmittelindustrie. Beispielsweise sind Alginate mit unlöslichen Kalziumkomplexen und δ-Gluconolacton als Protonendonor für die Freisetzung von Kalziumionen in die Lösung für die Gelierung verwendet worden. Siehe Draget et al., Appl Microbiol. Biotechnol, 31: 79-83 (1989). In ähnlicher Weise sind ähnliche Systeme für Alginatkügelchenbildung durch Emulgieren/interne Gelierung verwendet worden. Alginatmikrosphären wurden hergestellt unter Verwendung von Alginat, das in Pflanzenöl dispergiert war und die Gelbildung durch Verringerung des pHs initiiert, um Kalzium aus dem unlöslichen. Komplex freizusetzen. Siehe Poncelet, D. et al, Appl. Microbiol. Biotechnol, 43: 644-650 (1995). Alginatsysteme sind auch verwendet worden, um Zellen zu immobilisieren. Burke, C. offenbart in Methods of Enzymology, 135: 175-189 (1987), dass Dikalziumphosphat und δ-Gluconolacton mit Alginaten für verzögerte Gelierung von Zellen verwendet werden können. Das US-Patent Nr. 4,053,627 offenbart die Verwendung von Alginatgelscheiben, um die Freisetzung eines Insektizids in einer wässrigen Umgebung zu steuern. Diese zuvor erwähnten Verwendungen sind nicht für gelierte Depots im Körper für die Langzeitfreisetzung von biologisch aktiven Agenzien, insbesondere Proteinen, konzipiert.
Entsprechend besteht ein Bedarf, zeitverzögerte pharmazeutische Gelformulierungen zu entwickeln, die ein besseres Mittel für die Langzeitfreisetzung für klinische Anwendungen erreichen. Viele rekombinante oder natürliche Proteine könnten von einer konstanten langfristigen Freisetzung vermittels zeitverzögerter Gelformulierungen profitieren und dadurch wirksamere klinische Ergebnisse erzielen.
Die vorliegende Erfindung liefert derartige Vorteile. Pharmazeutische zeitverzögerte Gelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, einen Schutz von Proteinen, verringerten Abbau und langsames Auflösen mit erhöhter Proteinstabilität und -leistungsfähigkeit bereitzustellen. Ebenso liefern pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ein einfaches, schnelles und kostengünstiges Mittel für die gesteuerte Freisetzung von rekombinanten Proteinen für wirksame prophylaktische, therapeutische oder diagnostische Ergebnisse.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft nachhaltig wirkende Formulierungen unter Verwendung von zeitverzögerten Alginatgelen und Verfahren dafür. Insbesondere umfasst die Bildung der nachhaltig wirkenden zeitverzögerten Gele thixotrope Alginatgele mit einem biologisch aktiven Agens. Dieser Ansatz liefert einen Vorteil bei der Herstellung einer wirksamen und hohen Beladung mit biologisch aktiven Agenzien innerhalb des zeitverzögerten Alginatgels für nachhaltig wirkende Abgabe, während Proteinschutz, verringerter Abbau, erhöhte Stabilität und Leistungsfähigkeit des abzugebenden Agens erreicht wird. Weiterhin liefert die zeitlich gesteuerte Gelierung eine stärkere Kontrolle über die Gelierungseigenschaften und dessen Verabreichung.
Entsprechend liefert ein Aspekt der vorliegenden Erfindung eine zeitverzögerte nachhaltig wirkende Gelzusammensetzung, die ein hydrophiles Polymer; ein biologisch aktives Agens und wenigstens ein gebundenes polyvalentes Metallion umfasst. Die Gelierungsgeschwindigkeit wird gesteuert durch den Titer an freiem Kalzium, d. h. ungebundenem polyvalenten Metallion. Das biologisch aktive Agens kann in einer komplexierten Form vorliegen. Die Bildung von komplexierten Molekülen und ein jegliches damit im Zusammenhang stehende Komplexierungsmittel sind den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Zusätzlich kann die obige Zusammensetzung weiter polyvalentes Metallion enthalten, welches eine Mischung aus gebundenen und ungebundenen polyvalenten Metallionen ist. Infolge der zeitgesteuerten Natur dieser zeitverzögerten Gele können diese Mischungen in den Körper eingebracht werden, wo sie nach der Injektion gelieren können. Zusätzlich können infolge der thixotropen Natur der Zusammensetzung im Gelzustand diese Mischungen im Gelzustand injiziert werden, bspw. durch Druck aus der Spitze, woraufhin sie sich im Körper erneut in ein Gel umwandeln können.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung liefert eine zeitverzögerte nachhaltig wirkende Gelzusammensetzung, die ein hydrophiles Polymer; ein biologisch aktives Agens; wenigstens ein ungebundenes polyvalentes Metallion und weiter wenigstens einen Protonendonor umfasst, der in der Lage ist, das gebundene polyvalente Metallion freizusetzen. Die Freisetzung des Protons von dem Protonendonor setzt das Kation von dem gebundenen polyvalenten Metallion frei.
Ein weiterer Aspekt liefert Verfahren, um die zeitverzögerten nachhaltig wirkenden Gelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung herzustellen. Ein Verfahren umfasst die Schritte, ein biologisch aktives Agens und ein hydrophiles Polymer mit einem Lösungsmittel zu mischen, um eine erste Mischung auszubilden, und Mischen der ersten Mischung mit wenigstens einem gebundenen polyvalenten Metallion, um eine zweite Mischung auszubilden. Ein alternatives Verfahren umfasst die Schritte, ein biologisch aktives Agens und ein hydrophiles Polymer mit einem Lösungsmittel zu mischen, um eine erste Mischung auszubilden; Mischen der ersten Mischung mit wenigstens einem gebundenen polyvalenten Metallion, um eine zweite Mischung auszubilden; und Mischen wenigstens eines Protonen-Donors mit der zweiten Mischung, der in der Lage ist, das gebundene polyvalente Metallion freizusetzen. Das gebundene polyvalente Metallion und der Protonendonor können auch zusammen zu der ersten Mischung hinzugegeben werden, oder es kann der Protonendonor zu der ersten Mischung vor dem gebundenen polyvalenten Metallion hinzugegeben werden. Zusätzlich wird auch ein Schritt zum Isolieren der zeitverzögerten nachhaltig wirkenden Gelzusammensetzung ins Auge gefasst werden.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff gebundenes polyvalentes Metallion ein polyvalentes Metallion in einer Salz- oder Chelatform oder einem Ionenkomplex. Gebundenes polyvalentes Metallion kann eine Mischung von gebundenem und ungebundenem polyvalenten Metallion umfassen. Dies würde wie oben festgehalten die Freisetzung des gebundenen zu ungebundenem polyvalenten Metallion einschließen. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff Protonendonor, der in der Lage ist, gebundenes polyvalentes Metallion freizusetzen, starke Säuren, schwache Säuren oder Materialien, die in der Lage sind, eine Säure zu erzeugen, beispielsweise Lactone oder Ester (durch wässrige Hydrolyse), oder eine schwach lösliche Säure oder sich langsam auflösende Säure, wie beispielsweise Adipinsäure.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff Lösungsmittel wässrige oder nicht wässrige Lösungsmittel, die in der Lage sind, die biologisch aktiven Agenzien, hydrophilen Polymere, polyvalenten Metallionen, Protonendonoren oder Komplexierungsmittel der Wahl zu dispergieren oder aufzulösen. Derartige Lösungsmittel sind den Fachleuten auf dem Gebiet sehr wohl bekannt. Eine Zugabe, um die erste Mischung und die zweite Mischung auszubilden, kann durch Verfahren erfolgen, die den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Hineinschütten und Schütteln, tröpfchenweise Zugabe, Dispersion, Sprühen oder Mischen unter Verwendung von einem Sprühstrahl, Luftstrahl, Atomisieren und elektrischen Feldern. Der Begriff Dispersion zur Zwecken dieser Erfindung kann eine flüssige, feste oder gasförmige Dispersion bezeichnen. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff Isolieren das Verfahren zum Isolieren der zeitverzögerten nachhaltig wirkenden Gelzusammensetzung der vorliegenden Erfindung. Derartige Isolierungs- und Reinigungsverfahren sind in der Technik gut bekannt.
In einem noch weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine zeitverzögerte nachhaltig wirkende Gelzusammensetzung bereit, die durch die obigen Verfahren hergestellt ist. Weitere Aspekte umfassen zeitverzögerte pharmazeutische Gelformulierungen der obigen Zusammensetzungen in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Adjuvans. Zusätzlich kann die zeitverzögerte Gelzusammensetzung in einer Spritze enthalten sein.
In einem noch weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren bereit zur Behandlung von Indikationen mit zeitverzögerten nachhaltig wirkenden Gelzusammensetzungen, die erwünschte biologisch aktive Agenzien enthalten.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Zusammensetzungen
Die Zusammensetzung verwendet Alginate und Derivate davon, die von verschiedenen kommerziellen, natürlichen oder synthetischen Quellen, die in der Technik gut bekannt sind, erhalten werden können.
In ähnlicher Weise können gebundene polyvalente Metallionen aus verschiedenen kommerziellen, natürlichen oder synthetischen Quellen erhalten werden, die in der Technik gut bekannt sind. Gebundene oder maskierte polyvalente Metallionen im Umfang der vorliegenden Erfindung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Mangan, Strontium, Eisen, Magnesium, Kalzium, Barium, Kupfer, Aluminium oder Zink. Metallionen können aus löslichen Salzen eines Komplexbildners, Phosphaten, Tartraten, Sulfaten, Carbonaten, Hydroxiden oder Fettsäureanionen davon, wie beispielsweise Oleaten, erhalten werden. Ein Fachmann wird verschiedene andere gebundene polyvalente Metallionen/Komplexe zu schätzen wissen, die im Umfang der Erfindung enthalten sind. Gebundene polyvalente Metallionen können eine Mischung aus gebundenen und nicht gebundenen polyvalenten Metallionen umfassen.
Protonendonoren, wie hierin verwendet, bezeichnet ein Material, das Säuren erzeugen kann. Protonendonoren sind in der Lage, ein gebundenes oder maskiertes polyvalentes Metallion freizusetzen. Protonendonoren sind in der Technik gut bekannt und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Lactone, wie beispielsweise Gluconolactone, Ester, Puffer und andere sich langsam auflösende Säuren. Wie hierin verwendet, bezeichnet sich langsam auflösende Säuren Säuren, wie beispielsweise feste Säuren, die eine niedrige Lösungsmittellöslichkeit aufweisen. Zusätzlich umfassen sich langsam auflösende Säuren Vorrichtungen oder beschichtete Materialien, die langsam Säuren freisetzen. Gut bekannte Säuren in der Technik umfassen Essig-, Adipin-, Zitronen-, Fumar-, Glucon-, Milch-, Apfel-, Phosphor- und Weinsäure. Ein Fachmann wird verschiedene andere Protonendonoren zu schätzen wissen, die im Umfang der Erfindung enthalten sind.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff Puffer oder Pufferlösung die Verwendung von anorganischen oder organischen Säuren oder Basen oder eine Kombination davon, um eine Pufferlösung herzustellen, wie in der Technik bekannt. Diese umfassen auch amphotere Materialien oder Aminosäuren. Anorganische Säuren im Umfang der vorliegenden Erfindung umfassen Halogenwasserstoff (z. B. Salzsäure), Phosphor-, Salpeter- oder Schwefelsäure. Andere anorganische Säuren würden den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sein und werden hierin ins Auge gefasst. Organische Säuren im Umfang der Erfindung umfassen aliphatische Carbonsäuren und aromatische Säuren, wie beispielsweise Ameisen-, Carbon-, Essig-, Propion-, Butter-, Valerian-, Capron-, Acryl-, Malon-, Sukzin-, Glutar-, Adipin-, Malein-, Fumar-, Glycin- oder Phenolsulfonsäure. Andere organische Säuren würden den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sein. Organische Basen umfassen TRIS^®, Pyridin, PIPES^® und HEPES^®. Aminosäurepuffer umfassen Glycin und Glycin/Phosphorsäuremischungen.
Wie hierin verwendet, bezeichnet biologisch aktives Agens rekombinante oder natürlich vorkommende Proteine, gleich ob menschlich oder tierisch, die für die prophylaktische, therapeutische oder diagnostische Anwendung nützlich sind, ebenso wie Nicht-Protein basierte Agenzien, wie beispielsweise kleine Moleküle, Oligonukleotide und anorganische oder organische Agenzien. Das biologisch aktive Agens kann natürlich, synthetisch, semisynthetisch oder Derivate davon sein. Zusätzlich können die biologisch aktiven Agenzien der vorliegenden Erfindung präzipitierbar sein. Eine große Bandbreite an biologisch aktiven Agenzien werden ins Auge gefasst. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Hormone, Zytokine, hämatopoetische Faktoren, Wachstumsfaktoren, Faktoren gegen Fettleibigkeit, trophe Faktoren, anti-entzündliche Faktoren und Enzyme (siehe auch US-Patent Nr. 4,695,463 für zusätzliche Beispiele nützlicher biologisch aktiver Agenzien). Ein Fachmann auf dem Gebiet wird leicht in der Lage sein, ein erwünschtes biologisch aktives Agens an die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung anzupassen.
Derartige Proteine würden umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Interferone (siehe US-Patente 5,372,808 , 5,541,293 , 4,897,471 und 4,695,623 , hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, einschließlich Zeichnungen), Interleukine (siehe US-Patent Nr. 5,075,222 , hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, einschließlich Zeichnungen), Erythropoietine (siehe US-Patente Nrn. 4,703,008 , 5,441,868 , 5,618,698 , 5,547,933 und 5,621,080 , hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, einschließlich Zeichnungen), Granulozytenkoloniestimulierende Faktoren (siehe US-Patente Nrn. 4,810,643 , 4,999,291 , 5,581,476 , 5,582,823 und PCT-Veröffentlichung Nr. 94/17185, hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, einschließlich Zeichnungen), Stammzellfaktor (PCT-Veröffentlichungen 91/05795, 92/17505 und 95/17206, hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, einschließlich Zeichnungen) und das OB-Protein (siehe PCT-Veröffentlichungen 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 und 97/06816, hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, einschließlich Zeichnungen). Zusätzlich können biologisch aktive Agenzien auch umfassen, sind aber nicht beschränkt auf mit Mitteln gegen Fettleibigkeit im Zusammengang stehende Mittel, Insulin, Gastrin, Prolactin, adrenocorticotropes Hormon (ACTH), Schilddrüsen-stimulierendes Hormon (TSH), leuteinisierendes Hormon (LH), Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), menschliches Choriongonadotropin (HCG), Motilin, Interferone (alpha, beta, gamma), Interleukine (IL-1 bis IL-12), Tumornekrosefaktor (TNF), Tumornekrosefaktor-bindendes Protein (TNF-bp), aus dem Gehirn gewonnener neurotropher Faktor (BDNF), von Glial abgeleiteter neutrotropher Faktor (GDNF), neurotropher Faktor 3 (NT3), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), neurotropher Wachstumsfaktor (NGF), Knochenwachstumsfaktoren, wie beispielsweise Osteoprotegerin (OPG), Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren (IGFs), Makrophagenkoloniestimulierender Faktor (M-CSF), Granulozyten-Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), von Megakaryozyten gewonnener Wachstumsfaktor (MGDF), Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF), Thrombopoietin, von Plättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (PGDF), Kolonie-stimulierende Wachstumsfaktoren (CSFs), knochenmorphogenetisches Protein (BMP), Superoxiddismutase (SOD), Gewebeplasminogenaktivator (TPA), Urokinase, Streptokinase und Kallikrein. Der Begriff Proteine, wie hierin verwendet, umfasst Peptide, Polypeptide, Konsensmoleküle, Analoga, Derivate oder Kombinationen davon.
Derivate von biologisch aktiven Verbindungen können die Befestigung von einem oder mehreren chemischen Teilen an den Proteinteil umfassen. Man hat gefunden, dass die chemische Modifikation von biologisch aktiven Agenzien unter bestimmten Umständen zusätzliche Vorteile mit sich bringt, wie beispielsweise Erhöhen der Stabilität und der Kreislaufzeit des therapeutischen Proteins und Verringern der Immunogenität. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird in der Lage sein, erwünschte chemische Modifikationen auszuwählen auf der Grundlage der erwünschten Dosierung, Kreislaufzeit, Resistenz gegenüber Proteolyse, therapeutischen Verwendungen und anderen Überlegungen. Derivate, wie beispielsweise Polyethylenglycol und Fc-Fusionsproteine sind wünschenswert.
Komplexe
Das biologisch aktive Agens kann in komplexierten Formen vorliegen. Dies würde präzipitierte Formen, strukturierte Formen und Assoziationen mit anderen Molekülen einschließen. Diese komplexierten Formen des Agens können die Diffusionsgeschwindigkeit des Agens aus dem Gel verringern und somit die Agensfreisetzung nachhaltig aufrechterhalten. Diese komplexierten Formen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf biologisch aktive Agenzien, die mit Antikörpern, Substraten, Rezeptoren, Lipiden, Polymeren und Fällungsmittel komplexiert sind.
Beispielsweise können die biologisch aktiven Agenzien, das Analog oder die Derivate komplexiert einer Bindungszusammensetzung zugegeben werden. Derartige Bindungszusammensetzungen können, zusätzlich zu den obigen Vorteilen, auch die Wirkung haben, die Kreislaufzeit des Agens, Analogs oder Derivates zu verlängern, oder die Aktivität des biologisch aktiven Agens zu verstärken. Derartige Zusammensetzungen können ein Protein (oder, synonym, Peptid), Derivat, Analog oder Kombination oder Nicht-Protein-Agens sein.
Zu Zwecken der Veranschaulichung ist ein bindendes Protein für das OB-Protein der OB-Proteinrezeptor oder ein Teil davon, wie beispielsweise ein löslicher Teil davon. Andere bindende Proteine können ermittelt werden, indem das OB-Protein oder das Protein der Wahl, in Serum untersucht wird, oder empirisch auf die Anwesenheit von Binden hin gescreent werden. Ein derartiges Binden wird typischerweise nicht die Fähigkeit des OB-Proteins oder Analogs oder Derivats, an endogenen OB-Proteinrezeptor zu binden, und/oder die Signaltransduktion beeinträchtigen. Zusätzlich zum OB-Protein werden bindende Komplexe auch auf andere therapeutische Proteine der vorliegenden Erfindung ebenso anwendbar sein. Die Fachleute auf dem Gebiet werden in der Lage sein, geeignete bindende Proteine zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung zu ermitteln.
In ähnlicher Weise können Fällungsmittel, die verwendet werden, um das biologisch aktive Agens zu fällen, aus verschiedenen kommerziellen, natürlichen oder synthetischen Quellen erhalten werden, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Fällungsmittel umfassen, sind aber nicht beschränkt auf polyvalente Metallionen oder ihre Salze, wie beispielsweise Acetate, Citrate, Chloride, Carbonate, Hydroxide, Oxalate, Tartrate oder Hydroxide davon, Säuren oder wasserlösliche Polymere. Insbesondere können die Metallionen Aluminium, Barium, Kalzium, Eisen, Mangan, Magnesium, Strontium und Zink umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt. Bevorzugterweise ist das Metallion Zink oder die Salze davon, wie beispielsweise Acetatchloridsalze. Wasserlösliche kleine Moleküle und Salze können ebenfalls verwendet werden, wie beispielsweise Ammoniumsulfat, Aceton, Ethanol und Glycerol.
Was die wasserlöslichen Polymere anbelangt, umfassen diese, sind aber nicht beschränkt auf Polyethylenglycol, Ethylenglycol/Propylenglycol-Copolymere, Hydroxyethylcellulose, Amylose, Carboxylmethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrolidon, Poly-1, 3-Dioxolan, Poly-1,3,6-Trioxan, Ethylen/Maleinsäureanhydrid-Copolymere, Polyaminosäuren, Dextran, Poly(n-Vinylpyrolidon)polyethylenglycol, Propylenglycolhomopolymere, Polypropylenoxid/Ethylenoxid-Copolymere, polyoxyethylierte Polyole, Polyvinylalkoholsukzinat, Glycerin, Ethylenoxide, Propylenoxide, Poloxamere, alkoxylierte Copolymere, wasserlösliche Polyanionen, Derivate oder Kombinationen davon. Das wasserlösliche Polymer kann ein jegliches Molekulargewicht aufweisen und kann geradkettig oder verzweigtkettig sein. Beispielsweise beträgt das bevorzugte Molekulargewicht von Polyethylenglycol zwischen etwa 700 Da und etwa 100 kDa für ein leichtes Handhaben und Wirksamkeit bei der Präzipitation.
Andere Größen und Arten von Fällungsmitteln können verwendet werden, abhängig von dem erwünschten therapeutischen Profil (z. B. der Dauer der erwünschten nachhaltigen Freisetzung, den Wirkungen auf biologische Aktivität, sofern vorhanden, die Leichtigkeit der Handhabung, das Ausmaß oder das Fehlen von Antigenität und anderen bekannten Wirkungen eines erwünschten Fällungsmittels gegenüber einem therapeutischen Protein oder Analog). Ein Fachmann auf dem Gebiet wird andere Fällungsmittel zu schätzen wissen, die im Umfang der Erfindung enthalten sind.
Zusätzlich können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auch zusätzliche Bindemittel umfassen, die erforderlich sind, um das biologisch aktive Agens und/oder das hydrophile Polymer zu stabilisieren. Diese können in dem Puffer enthalten sein und können Konservierungsmittel enthalten, sind aber nicht darauf beschränkt.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die nachhaltig wirkenden pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können durch orale (z. B. flüssige Präparate, die die Gelierung im Magen oder Darm erlauben) und nicht-orale Präparate (z. B. intramuskuläre, subkutane, transdermale, viscerale, IV-(intravenöse), IP-(intraperitoneale), intraartikuläre, Plazieren im Ohr, ICV-(intrazerebroventrikuläre), IP-(intraperitoneale), intraarterielle, intrathekale, intrakapsuläre, intraorbitale, injizierbare, pulmonale, nasale, rektale und Uterin-transmukosale Präparate) verabreicht werden. Im Allgemeinen sind von der Erfindung umfasst zeitverzögerte nachhaltig wirkende pharmazeutische Gelzusammensetzungen, die wirksame Mengen eines Proteins oder Derivatproduktes mit den nachhaltig wirkenden Zusammensetzungen der Erfindung zusammen mit pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Löslichkeitsvermittlern, Emulgatoren, Adjuvanzien und/oder Trägern umfassen, die für die Verabreichung benötigt werden. (Siehe PCT 97/01331, hiermit durch Bezugnahme aufgenommen). Die optimale pharmazeutische Formulierung für ein erwünschtes biologisch aktives Agens wird durch die Fachleute auf dem Gebiet bestimmt werden in Abhängigkeit von dem Verabreichungsweg und der erwünschten Dosis.
Beispielhafte pharmazeutische Zusammensetzungen sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., 18. Ausg., Esston, PA, S. 1435-1712 (1990)) beschrieben.
Infolge der thixotropen Natur der zeitverzögerten Gelformulierung können Spritzen für die subkutane Verabreichung verwendet werden. Die Zusammensetzung kann in einer Spritze für die spätere Injektion geliert sind. Diese Gelierung kann vorgenommen werden in einer zeitverzögerten Art und Weise. Das Timing wird gesteuert durch die überlegte Einstellung der Menge des gelierenden Agens und des Protonendonors, sofern verwendet, ebenso wie der Partikelgröße des polyvalenten Metallions und der Temperatur der Mischung. Ein derartiges Präparat würde für das spätere erneute Gelieren im Körper nach der Injektion verwendet werden. Der Begriff thixotrop, wie hierin verwendet, bezeichnet die Viskosität der Gelmischung, die sich unter Druck verringert, z. B. durch den Spritzenkolben, wobei die Mischung an diesem Punkt fließen kann, z. B. durch die Spritzennadel, und sich dann ein Gel an der Injektionsstelle erneut ausbilden kann.
Das Konzept der zeitverzögerten Gelierung kann auch angewandt werden, um eine Spritze zu füllen, wobei eine nachhaltig wirkende Gelzusammensetzung in eine Spritze eingefüllt wird und zu einer vorher bestimmten Zeit in der Spritze geliert, d. h. von einigen wenigen Minuten bis vielen Stunden nach dem Abfüllen. Dies vermeidet das Problem des Befüllens einer Spritze mit Material, das bereits geliert ist. Diese vorgefüllten Spritzen können für die spätere Injektion in Patienten gelagert werden.
Bestandteile, die für die Verabreichung erforderlich sein können, umfassen Verdünnungsmittel oder Puffer mit verschiedenen pH und ionischer Stärke (z. B. Tris-HCl, Acetat); Zusätze, wie beispielsweise oberflächenaktive Agenzien und Löslichkeitsverbesserer (z. B. Tween 80, HCO-60, Polysorbat 80), Lipide, Liposomen, Antioxidanzien (z. B. Ascorbinsäure, Glutathion, Natriummetabisulfit), zusätzliche Polysaccharide (z. B. Carboxymethylcellulose, Natriumalginat, Natriumhyaluronat, Protaminsulfat, Polyethylenglycol), Konservierungsstoffe (z. B. Thimersol, Benzylalkohol, Methylparaben, Propylparaben) und Aufbausubstanzen (z. B. Lactose, Mannitol); Einbau des Materials mit partikulären Präparaten polymerer Verbindungen, wie beispielsweise Polymilch-/Polyglycolsäure-Polymere oder -Copolymere etc., oder kombiniert mit Liposomen. Hyaluronsäure kann auch als eine Verabreichungsverbindung verwendet werden und dies kann die Wirkung haben, dass der nachhaltige Verbleib im Kreislauf sogar noch gefördert wird. Zusätzlich können nachhaltig wirkende Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auch mit Ölen (z. B. Sesamöl, Maisöl, Pflanzenöl) oder einer Mischung davon mit einem Phospholipid (z. B. Lecitin) oder Triglyzeriden mit mittleren Fettsäureketten (z. B. Miglyol 812) dispergiert sein, um eine ölige Suspension bereitzustellen. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch mit Dispersionsmitteln, wie beispielsweise wasserlöslichen Polysacchariden (z. B. Mannitol, Lactose, Glucose, Stärken), Hyaluronsäure, Glycin, Fibrin, Kollagen und anorganischen Salzen (z. B. Natriumchlorid) dispergiert sein.
Zusätzlich wird für die Verwendung bei der Verabreichung der nachhaltig wirkenden Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auch die Verwendung von mechanischen Vorrichtungen ins Auge gefasst, die für die pulmonale Abgabe von therapeutischen Produkten konzipiert sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Zerstäuber, Inhalatoren für abgemessene Dosen und Pulverinhalatoren, die alle den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind.
Die Verabreichungsverbindungen können den physikalischen Zustand, die Stabilität, die Geschwindigkeit der in-vivo-Freisetzung und der in-vivo-Clearance der vorliegenden Proteine und Derivate beeinflussen. Ein Fachmann wird anerkennen, dass geeignete Verabreichungsverbindungen und/oder die geeigneten mechanischen Vorrichtungen zu verwenden sind, abhängig von der therapeutischen Verwendung, dem Verabreichungsweg, der erwünschten Dosierung, Kreislaufzeit, Widerstand gegen Proteolyse, Proteinstabilität und andere Überlegungen.
Anwendungsverfahren
Therapie. Therapeutische Verwendungen hängen von dem verwendeten biologisch aktiven Agens ab. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird leicht in der Lage sein, ein erwünschtes biologisch aktives Agens an die vorliegende Erfindung für seine beabsichtigten therapeutischen Verwendungen anzupassen. Therapeutische Verwendungen für derartige Agenzien sind detaillierter in den folgenden Publikationen angegeben, die hiermit einschließlich Zeichnungen durch Bezugnahme aufgenommen sind. Therapeutische Verwendungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die Verwendungen von Proteinen wie Interferonen (siehe US-Patente 5,372,808 , 5,541,293 , 4,897,471 und 4,695,623 , hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, einschließlich Zeichnungen), Interleukinen (siehe US-Patent 5,075,222 , hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, einschließlich Zeichnungen), Erythropoietinen (siehe US-Patente 4,703,008 , 5,441,868 , 5,618,698 , 5,547,933 und 5,621,080 , hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, einschließlich Zeichnungen), Granulozyten-Kolonie-stimulierende Faktoren (siehe US-Patente 4,999,291 , 5,581,476 , 5,582,823 , 4,810,643 und PCT-Veröffentlichung 94/17185, hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, einschließlich Zeichnungen), Stammzellfaktor (PCT-Veröffentlichungen 91/05795, 92/17505 und 95/17206, hierin durch Bezugnahme aufgenommen, einschließlich Zeichnungen) und dem OB-Protein (siehe PCT-Veröffentlichungen 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 und 97/06818, hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, einschließlich Zeichnungen).
Zusätzlich umfassen therapeutische Verwendungen der vorliegenden Erfindung Verwendungen von biologisch aktiven Agenzien, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Produkte, die verwandt sind zu Mitteln gegen Fettleibigkeit, Insulin, Gastrin, Prolactin, adrenocorticotropes Hormon (ACTH), Schilddrüsen-stimulierendes Hormon (TSH), luteinisierendes Hormon (LH), Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), menschliches Choriongonadotropin (HCG), Motilin, Interferone (alpha, beta, gamma), Interleukine (IL-1 bis IL-12), Tumornekrosefaktor (TNF), Tumornekrosefaktor-bindendes Protein (TNF-bp), aus dem Gehirn gewonnener neurotropher Faktor (BDNF), von Glial abgeleiteter neutrotropher Faktor (GDNF), neurotropher Faktor 3 (NT3), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), neurotropher Wachstumsfaktor (NGF), Knochenwachstumsfaktoren, wie beispielsweise Osteoprotegerin (OPG), Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren (IGFs), Makrophagen-Koloniestimulierender Faktor (M-CSF), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), von Megakaryozyten gewonnener Wachstumsfaktor (MGDF), Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF), Thrombopoietin, von Plättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (PGDF), Kolonie-stimulierende Wachstumsfaktoren (CSFs), knochenmorphogenetisches Protein (BMP), Superoxiddismutase (SOD), Gewebeplasminogenaktivator (TPA), Urokinase, Streptokinase und Kallikrein. Der Begriff Proteine, wie hierin verwendet, umfasst Peptide, Polypeptide, Konsensmoleküle, Analoga, Derivate oder Kombinationen davon. Zusätzlich können die vorliegenden Zusammensetzungen auch für die Herstellungen von einem oder mehreren Medikamenten zur Behandlung oder Verbesserung der Zustände verwendet, für deren Behandlung das biologisch aktive Agens vorgesehen ist.
Kombinationstherapien. Die vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren können in Verbindung mit anderen Therapien verwendet werden, wie beispielsweise geänderte Ernährung und Leibesübungen. Andere Medikamente, wie jene, die nützlich sind für die Behandlung von Diabetes (z. B. Insulin und möglicherweise Amylin), Cholesterin und Blutdruck-senkende Medikamente (wie beispielsweise jene, die Blutlipidtiter verringern und andere kardiovaskuläre Medikamente), Aktivität-erhöhende Medikamente (z. B. Amphetamine), Diuretika (für Flüssigkeitseliminierung) und Appetitzügler. Eine derartige Verabreichung kann gleichzeitig erfolgen oder in seriatim. Zusätzlich kann das vorliegende Verfahren zusammen mit chirurgischen Eingriffen verwendet werden, wie beispielsweise kosmetischer Chirurgie, die darauf abstellt, das Gesamterscheinungsbild eines Körpers zu ändern (z. B. durch Fettabsaugung oder Laserchirurgie, die darauf abstellt, Körpermasse zu verringern, oder Implantatchirurgie, die darauf abstellt, das Aussehen von Körpermasse zu verbessern). Die gesundheitlichen Vorteile von Herzchirurgie, wie beispielsweise Bypass-Chirurgie oder anderen chirurgischen Eingriffen, die darauf abstellen, einen nachteiligen Zustand zu milder, der durch die Blockade von Blutgefäßen durch Fettablagerungen bedingt ist, wie beispielsweise arterielles Plaque, können mit der gleichzeitigen Verwendung der vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren erhöht werden. Verfahren, um Gallensteine zu beseitigen, wie beispielsweise Ultraschall- oder Laserverfahren, können ebenfalls entweder vor, während oder nach der Anwendung der vorliegenden therapeutischen Verfahren verwendet werden. Weiterhin können die vorliegenden Verfahren verwendet werden zusätzlich zu chirurgischen Eingriffen oder Therapien für gebrochene Knochen, beschädigte Muskeln oder anderen Therapien, die verbessert würden durch eine Erhöhung der fettfreien Gewebemasse.
Dosierungen
Ein Fachmann wird in der Lage sein, bestimmte wirksame Dosierungen sicherzustellen durch Verabreichen und Beobachten der erwünschten therapeutischen Wirkung. Die Dosierung von nachhaltig wirkenden Zusammensetzungen ist die Menge, die erforderlich ist, um die wirksame Konzentration des biologisch aktiven Agens in vivo für eine gegebene Zeitspanne zu erreichen. Die Dosierung und die bevorzugte Verabreichungshäufigkeit der nachhaltig wirkenden Präparate variiert mit der Art des biologisch aktiven Agens, der erwünschten Dauer der Freisetzung, der Zielerkrankung, der erwünschten Verabreichungshäufigkeit, der Tierart und anderen Faktoren. Bevorzugterweise wird die Formulierung der Moleküle so sein, dass zwischen 0,10 μg/kg/Tag und 100 mg/kg/Tag die erwünschte therapeutische Wirkung ergeben wird.
Die wirksame Dosierung kann bestimmt werden, indem diagnostische Mittel über die Zeit verwendet werden. Beispielhaft liefert die vorliegende Erfindung die Dosierungen für OB-Protein. Beispielsweise kann ein Diagnostikum zum Messen der Menge an OB-Protein im Blut (oder Plasma oder Serum) zuerst verwendet werden, um endogene Titer von OB-Protein zu bestimmen. Ein derartiges Werkzeug kann in der Form eines Antikörpertests vorliegen, wie beispielsweise einem Antikörper-Sandwich-Test. Die Menge an endogenem OB-Protein wird initial bestimmt und eine Basislinie festgelegt. Die therapeutischen Dosierungen werden bestimmt als die Quantifizierung von endogenem und exogenem OB-Protein (das heißt Protein, Analog oder Derivat, das im Körper gefunden wird, entweder selbst produziert oder verabreicht), und wird fortgesetzt über den Verlauf der Therapie. Beispielsweise kann eine vergleichsweise hohe Dosierung initial erforderlich sein, bis ein therapeutischer Nutzen zu sehen ist, und dann können niedrigere Dosierungen verwendet werden, um die therapeutischen Vorteile beizubehalten.
Materialien und Verfahren
Materialien. Alginate in der Form von Alginatsalz können aus Quellen erhalten oder durch Verfahren, die in der Technik gut bekannt sind, hergestellt werden. Leptin, GCSF und Konsensus-Interferon sind von Amgen Inc. Andere Chemikalien stammen von in der Technik gut bekannten Quellen.
Zeitverzögerte Gelpräparate – Einführung. Das zeitverzögerte Gel wird hergestellt durch Kombinieren einer Mischung aus biologisch aktivem Agens und anionischem Polymer (z. B. Alginat) mit einem polyvalenten Kationsalz (z. B. CaCO3) und einem Protonendonor (z. B. angesäuerter Puffer oder eine Quelle für langsam freisetzende oder auflösende Säure, wie beispielsweise δ-Gluconolacton), sofern verwendet. In allen Fallen kann das anionische Polymer, Protein und ein jegliches Fällungsmittel/Bindemittel als eine Mischung hergestellt werden. Die Gelierung wird initiiert durch das Zugeben des polyvalenten Kationsalzes und der Protonenquelle, sofern verwendet, zu dieser Mischung. Die Zugabe von Proton, polyvalentem Metallion zu der Mischung aus Polymer und biologisch aktivem Agens kann gleichzeitig oder getrennt erfolgen, wobei entweder der Protonendonor oder das polyvalente Metallion zuerst zugegeben wird. Für Puffer-induzierte Gelierung kann das polyvalente Kationsalz und die Protonenquelle als eine wässrige Suspension deutlich vor dem Zeitpunkt der Gelierung gemischt werden. Nachdem die Gelierung begonnen hat, werden Spritzen befüllt, bevor die Gelierung erfolgt (typischerweise 5 bis 10 Minuten). Injektionen können für in-situ-Gelierung vorgenommen werden, bevor das Material geliert oder nachdem das Material geliert.
Protein-Alginat-Mischung. Eine Mischung aus Lösungsmittel und Fällungsmitteln/Bindemitteln (z. B. Zinksalze, Puffer etc.) wird hergestellt. In schneller Abfolge werden eine Lösung des Proteins (z. B. Leptin in 10 mM Tris HCl, pH 8) und steriles Alginat (z. B. autoklavierte 10%-Lösung) schnell gemischt. Wo das biologisch aktive Agens als eine feine Suspension hergestellt ist (z. B. wird Zink-Leptin typischerweise bei 10–15 mg/ml gebildet), kann es wünschenswert sein, die Suspension zu konzentrieren.
Kalziumsalz. Das Kalziumsalz kann hergestellt werden als eine Art autoklavierte Suspension aus feinem Pulver in Wasser (z. B. 9,1% CaCO₃ in Wasser).
Protonenquelle. Für Puffer-induzierte Gele kann die Kalziumsalzsuspension mit Puffer, wie beispielsweise 1 M Tris HCl, pH 7,0 oder 0,5 M PIPES, pH 6,7, kombiniert werden.
Für sich langsam auflösende oder langsam freisetzende Säurequellen (δ-Gluconolacton) wird ein gegebenes Pulvergewicht in Wasser bei einer ausgewählten Zeit kurz vor Verwendung gelöst (z. B: eine Minute vor dem Mischen). Eine vorgewogene Mischung aus trockenen, sterilen Pulvern der Säurequelle und des Kalziumsalzes kann ebenfalls verwendet werden, um das Verfahren zu vereinfachen.
Lösungsmittel. Das Lösungsmittel kann wässrig, nicht-wässrig oder Mischungen davon sein. Beispiele für nicht-wässrige Lösungsmittel sind Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Glycerin, Polyethylenglycole, Pluronics^® und dergleichen.
Gelierung. Die Gelierung der Polymer-Wirkstoff-Mischung kann initiiert werden durch Hinzugeben von Kalziumsalz. Die Temperatur der Mischung und die Menge und Partikelgröße des Salzes kann verwendet werden, um die Geschwindigkeit der Gelierung zu steuern. Wenn zusätzlich ein Protonendonor verwendet wird, kann die Gelierung der Mischung initiiert werden durch Hinzufügen von entweder 1) Kalziumsalz und angesäuerter Puffersuspension (getrennt oder zusammen), 2) Kalziumsalzsuspension, gefolgt von einer frischen Lösung/Suspension einer langsam freisetzenden Protonenquelle oder umgekehrt, oder 3) Pulvern von Kalziumsalz und Protonenquelle zusammen oder getrennt. Nach Hinzugeben des Kalziumsalzes können andere Fällungsmittel/Bindemittel (z. B. Zinksalze, Puffer etc.) zu der Mischung hinzugegeben werden. Nach gründlichem und schnellem Mischen kann die Gelmischung in eine Spritze aufgezogen werden, bevor sie geliert.
Gelbeladung. Im Allgemeinen ist Proteinbeladung bekannt. Unbekannte Gelbeladungen können wie folgt bestimmt werden.
Spitzenverfahren. Etwa 0,1–0,2 ml (genaues Gewicht wird aufgenommen) an Gel wird in ein Eppendorf-Röhrchen gegossen, dann in 1 ml 0,1 M Natriumcitrat gelöst. Die Mischung wird bei Raumtemperatur unter vorsichtigem Schütteln inkubiert, bis das Gel zerfällt (im Allgemeinen 2 Stunden bis über Nacht). Nachdem die sich ergebende Suspension bei 8 K Upm für 2 Min. zentrifugiert wurde (Eppendorf, 5415 C), wird die Absorbanz des Überstandes bei 280 nm aufgenommen. Jegliche verbleibende Feststoffe werden in 1 ml 7 M Harnstoff gelöst; die Absorbanz dieser Lösung wird aufgezeichnet. Aus diesen Absorbanzen können die Milligramm pro Gramm Gel berechnet werden.
Kumulatives Verfahren. Dieses Verfahren wird zusammen mit den in-vitro-Freisetzungsstudien verwendet. Die Menge an aus dem Gel freigesetztem Protein, einschließlich der Spitze am Ende der Studie, wird aufsummiert. Für Details siehe den Abschnitt betreffend in-vitro-Freisetzungsstudien.
In-vitro-Freisetzungsstudien. Das Gel wird entweder in einem Eppendorf-Röhrchen („gegossene” Proben) oder in der Spritze ausgebildet, dann in ein Eppendorf-Röhrchen extrudiert („extrudierte” Proben). Im Allgemeinen werden etwa 0,1–0,2 ml Gel gegossen oder extrudiert (die genaue Menge wird gewogen). Die Freisetzung wird gestartet durch Hinzugeben von Puffer (10 mM Tris HCl, pH 8 für Leptin, pH 7,4 für GCSF) zu einem jeden Röhrchen und Plazieren desselben in einem Inkubatorschüttler (New Brunswick Scientific) bei 37°C und 100–200 Upm. Bei ausgewählten Zeitintervallen wird die Probe aus dem Inkubator entfernt. Wenn das Gel intakt ist, wird der Überstand entfernt und zentrifugiert (Eppendorf, 8000 Upm, 2 Min) und der Überstand gesammelt. Jegliche Feststoffe werden in 1 ml frischem Tris-Puffer suspendiert und zu dem ursprünglichen Freisetzungsröhrchen zurückgegeben für eine Wiederaufnahme der Freisetzung. Wenn das Gel umfänglich zerstört ist, werden die Röhrcheninhalte zentrifugiert, der Überstand gesammelt und die Feststoffe erneut in 1 ml Puffer zur Wiederaufnahme der Freisetzung aufgenommen. Die Überstands„Zeitpunkte" können ein weiteres Zentrifugieren erforderlich machen (8000–13.000 Upm, 8 Minuten), um sie für ein UV-Abrastern zu klären. Die Menge an freigesetztem Protein wird bestimmt aus der Absorbanz des Überstandes. Nachdem die letzte Freisetzungsprobe genommen ist, wird die in dem Kügelchen verbliebene Menge durch das Spitzen-Verfahren (oben) bestimmt. Der freigesetzte Prozentsatz zu einem bestimmten Zeitpunkt wird bestimmt aus dem kumulativ freigesetzten Protein, ausgedrückt als ein Bruchteil von entweder der ursprünglichen Proteinbeladung im Gel (bekannt aus dem Gewicht des Gels und wie es formuliert ist), oder dem finalen, freigesetzten Gesamtprotein (einschließlich der finalen Citrat-Harnstoff-Spitze).
In-vivo-Studien.
Gewichtsverlust bei der Maus. Sechs bis acht Wochen alte weibliche Mäuse, Typ C57/BLC, werden von Charles River und Taconic Inc. erhalten. Sie wiegen typischerweise 20 Gramm. Eine jede Dosisgruppe besteht aus fünf Mäusen. Injektionen erfolgen subkutan.
Ratten-PK-Sudie. Männliche Ratten werden in dieser Studie verwendet und sie wiegen typischerweise 250–300 Gramm. Die Injektionen werden in ähnlicher Weise vorgenommen wie in den Experimenten zum Gewichtsverlust bei Mäusen beschrieben. Blut wird durch Sammeln mittels Katheter zu verschiedenen Zeitintervallen nach Injektion gesammelt und die Proben auf Leptin durch einen ELISA-Test analysiert.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele werden angeboten, um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen, sollen aber nicht als den Schutzumfang beschränkend verstanden werden. Zusätzlich wird mit Blick auf die obige Offenbarung oder die folgenden Beispiele der Fachmann in der Lage sein, die erforderlichen Änderungen an den Offenbarungen für eine Produktion in Großmaßstab vorzunehmen.
Beispiel 1
Dieses in-vivo-Beispiel zeigt, dass Leptin in einem Puffer-induzierten zeitverzögerten Gel aktiv ist und verglichen mit einer Lösung von Leptin eine Langzeitwirkung zeigt. Dieses Beispiel veranschaulicht auch ein System, das nach Injektion in das Tier geliert. Eine sterile Kalziumcarbonatlösung wurde hergestellt aus gesiebten Feststoffen mit einer Partikelgröße von weniger als 75 Mikrometer. Eine Vormischung davon mit Tris pH 7 wurde zu Leptin in Alginat (in 10 mM Tris pH 8) hinzugegeben, so dass die Endkonzentrationen der Bestandteile wie folgt waren: 2% Alginat (steril filtriert), 10 mg/ml Leptin, 7 mM Tris pH 8, 150 mM Tris pH 7 und 24 mM CaCO3 (unter der Annahme einer vollständigen Auflösung). Eine derartige Mischung gelierte innerhalb von acht bis neun Minuten. Wenn Leptin weggelassen wurde, war die Gelierungszeit geringfügig länger (10–12 Minuten). Dies erlaubte Zeit, um die Spritzen zu beladen.
Die zeitverzögerte Gelformulierung wurde (während sie noch ungeliert war) in eine Gruppe von Mäusen an wechselnden Tagen mit 100 mg/kg/Tag injiziert (2 Tage mit einem Wert von 50 mg/kg). Einer zweiten Gruppe wurde Leptinlösung (in Tris-Puffer mit 10 mg/ml) täglich mit 50 mg/kg verabreicht und eine dritte Gruppe erhielt die Leptinlösung an wechselnden Tagen mit 100 mg/kg. Die Mäuse wurden täglich gewogen und die Gewichtsveränderung als Prozent des Anfangsgewichtes der Mäuse ausgedrückt.
Das Schema mit einer Dosierung an wechselnden Tagen mit dem zeitverzögerten Gel ergab nahezu den gleichen Gewichtsverlust wie täglich injizierte Leptinlösung (8–9%). Im Gegensatz dazu zeigte die Leptinlösung, die an wechselnden Tagen verabreicht wurde, einen geringeren Gewichtsverlust (6%) mit kürzerer Dauer. Diese letztere Gruppe kehrte auf ihr Basisliniengewicht am Tag 8 zurück, wohingegen die anderen Gruppen ihr ursprüngliches Gewicht am Tag 10–11 wiedergewannen.
Beispiel 2
Dieses Beispiel zeigt, dass die Produktion eines Puffer-induzierten zeitverzögerten Kalziumalginatgels die in-vitro-Langzeitfreisetzung verglichen mit nicht gelierten Formulierungen verlängern kann. Eine Kalziumcarbonatsuspension wurde als eine 100 mg/ml Suspension von sehr feinem Pulver hergestellt. Eine Vormischung davon mit pH 6,7 PIPES-Puffer wurde zu einer Zink-Leptin-Suspension in Alginat (Tris-gepuffert bei pH 8) hinzugegeben, die aus einer konzentrierten Leptin-Lösung erzeugt wurde (83 mg/ml in Tris pH 8 zu dem Zeitpunkt, als Zink hinzugegeben wurde). Ein ml einer derartigen Mischung wurde in einen 10 ml Becher gegossen. Die Endkonzentrationen aller Bestandteile war wie folgt: 2% Alginat (aus autoklavierter 10%-Lösung von Keltone LVCR), 15 mM Tris pH 8, 50 mg/ml Leptin, 1 mM ZnCl2, 10 mM CaCO3 (unter der Annahme einer vollständigen Auflösung) und 93 mM PIPES pH 6,7. Bei Abwesenheit von Leptin gelierte eine derartige Mischung in 7 Minuten. Nach Über-Nacht-Gelierung wurden 0,2-g-Stücke des Gels gewogen und in Szintillationsröhrchen für die Freisetzung auf den 37°C-Schüttler gegeben. Die Freisetzung wurde verglichen mit der Freisetzung aus der gleichen Formulierung ohne Kalzium und PIPES (kein Kalziumalginatgel). Wenn die Zink-Leptin-Alginat-verdickte Formulierung (nicht geliert) freigesetzt wurde, betrug der 5-Stunden-Zeitpunkt 75% und es wurde eine graduelle Freisetzung auf 90% über die folgenden ~3 Tage beobachtet. Das Zinkleptin in dem zeitverzögerten Kalziumalginatgel wies jedoch eine viel nachhaltigere Freisetzung auf - -35% bei 5 Stunden, 60% bei einem Tag, dann eine graduellere Freisetzung auf 70% bei 5 Tagen.
Beispiel 3
Dieses Beispiel zeigt, dass δ-Gluconolacton-induziertes Gel, das Leptin als ein feines Zinkpräparat enthält, die Freisetzung von Leptin nachhaltig unterhält. Leptin (~14 mg/ml in Tris pH 8) wurde zu einer pH 6,7 PIPES-Lösung gegeben und eine ZnCl2-Lösung wurde unmittelbar eingemischt, schnell gefolgt von Alginatlösung (autoklaviert, 10%), so dass die Endkonzentration der Bestandteile 1,1 mM ZnCl2, 2,2% Alginat, 10 mM Tris (pH 8) und 22 mM PIPES (pH 6,7) betrug. Diese Mischung wurde durch Zentrifugieren konzentriert, bis die Leptinkonzentration 46 mg/ml betrug. Die Gelmischung wird dann hergestellt durch Einrühren von CaCO3-Suspension (feines Pulver), schnell gefolgt von δ-Gluconolacton-Lösung. Die Endkonzentrationen der Bestandteile betrugen 2% Alginat, 20 mM PIPES, 9 mM Tris, 1 mM ZnCl2, 16 mM (unter der Annahme einer vollständigen Lösung) CaCO3 und 79 mM δ-Gluconolacton. Die Mischung wurde vor dem Gelieren in Spritzen aufgezogen und das Gelieren erfolgte in den Spritzen nach 10 Minuten. Nach Über-Nacht-Lagerung (3 Stunden bei Raumtemperatur und dann bei 4°C) wurden die Gele in Mäuse injiziert. Der Gewichtsverlust wurde verglichen mit der Pufferkontrolle überwacht.
Eine Menge von Leptin für fünf Tage wurde mit 50 mg/kg/Tag injiziert, d. h. ein 250 mg/kg Bolus in dem Gel, und verglichen mit dem gleichen Bolus freien Leptins in Lösung. Der Bolus aus freiem Leptin zeigte nur ein bescheidenes Gewichtsverlustmaximum von 4,4–4,8% bei 2 bis 3 Tagen und Gewichtszunahme begann wieder am Tag 5. Im Gegensatz dazu lieferte an den Tagen 2 bis 4 das Zinkleptin in dem Gel einen Gewichtsverlust von 9%. Am Tag 5 betrug der Gewichtsverlust für das Gel noch 5% und blieb oberhalb der Basislinie (beibehaltener Gewichtsverlust), als das Experiment am Tag 7 endete.
Beispiel 4
Dieses Beispiel zeigt, dass, wenn die Proteinkonzentration der Alginat-Leptin-Zink-Mischung ausreichend hoch ist, die Mischung ein Gel bei Abwesenheit von Kalzium ausbildet, welches eine nachhaltig wirkende Freisetzung zeigt. Leptin (~14 mg/ml in Tris pH 8) wurde zu einer Pufferlösung hinzugegeben und eine ZnCl2-Lösung wurde unmittelbar eingemischt, schnell gefolgt von Alginatlösung (autoklaviert, 10%), so dass die Endkonzentrationen der Bestandteile 1,1 mM ZnCl2, entweder 1,1 oder 2,2% Alginat, 10 mM Tris (pH 8) und 22 mM PIPES pH 6,7 (sofern vorhanden) betrug. Diese Mischung wurde durch Zentrifugieren konzentriert, bis die erwünschte Konzentration an Leptinfeststoffen ereicht wurde. Die ~50 mg/ml-Formulierung wies PIPES und 2,2% Alginat auf. Die ~100 mg/ml-Formulierung wies kein PIPES und 1,1% Alginat auf.
Die Endkonzentrationen der Bestandteile für das 50 mg/ml-Kalziumgel von Beispiel 3 betrugen 2% Alginat, 20 mM PIPES, 9 mM Tris, 1 mM ZnCl2, 16 mM (unter der Annahme der vollständigen Auflösung) CaCO3 und 79 mM δ-Gluconolacton. Für das 100 mg/ml Kalziumgel war die Formulierung ähnlich mit der Ausnahme, dass die Endkonzentrationen der Bestandteile 1% Alginat, 13 mM CaCO3 und 67 mM δ-Gluconolacton betrugen, wobei PIPES weggelassen war.
Für die Gele mit Kalzium wurden die Mischungen vor dem Gelieren in Spritzen aufgezogen und das Gelieren erfolgte in den Spritzen nach 10 Minuten. Wo kein Kalzium in dem Gel enthalten war, wurde die Zn-Leptin-Alginat-Mischung in Spritzen aufgezogen und zu gelieren erlaubt. Es schien, dass die 50 mg/ml-Formulierung ohne Kalzium nicht gelierte. Nach Über- Nacht-Lagerung (3 Stunden bei Raumtemperatur und dann bei 4 °C) wurden die Gele in Mäuse injiziert. Gewichtsverlust wurde verglichen mit der Pufferkontrolle überwacht.
Eine Menge von Leptin entsprechend fünf Tagen wurde mit 50 mg/kg/Tag, d. h. einem 250 mg/kg Bolus im Gel injiziert. Die Kalziumgele von Beispiel 3 ergaben einen Gewichtsverlust von 9% innerhalb von 2–4 Tagen; am Tag fünf betrug der Gewichtsverlust für das Gel noch 5% und er blieb oberhalb der Basislinie (beibehaltener Gewichtsverlust), als das Experiment am Tag 7 endete. Im Vergleich produzierte die 50 mg/ml-Formulierung ohne Kalzium einen Gewichtsverlust von 3% über die Tage 2 bis 4, jedoch fiel der Gewichtsverlust auf Null am Tag 5. Im Gegensatz dazu war die 100 mg/ml-Leptinformulierung ohne Kalzium wenigstens genauso aktiv wie die 100 mg/ml-Leptinformulierung mit Kalzium. Der Spitzengewichtsverlust für das Kalzium-freie 100 mg/ml Gel betrug 9% am Tag 4, der Spitzengewichtsverlust für das 100 mg/ml-Kalziumgel betrug 6%, ebenfalls am Tag 4. Beide Formulierungen begannen mit Gewichtszunahme am Tag 9.
Beispiel 5
Dieses Beispiel zeigt, dass die nachhaltig wirkende in-vitro-Freisetzung von Leptin aus einem zeitverzögerten Alginatgel bereitgestellt werden kann, ohne dass zuerst ein Leptin-Zink-Feinpräzipitat hergestellt wird. Leptin (100 mg/ml; 10 mM Tris HCl, pH 8,8; pH eingestellt von 8,0 auf 8,8 mit 1 M NaOH) und 6% Alginat (10 mM Tris HCl, pH 8,6) wurden in einem Eisbad abgekühlt. Leptin (0,5 ml) wurde zu dem 6% Alginat (0,18 ml) hinzugegeben und die Mischung auf einem Eisbad für 10–15 Minuten gerührt; der End-pH betrug 8,6–8,8. Zu dieser Mischung wurde eine Suspension von 1 M CaCO3 (16 mcl) hinzugegeben und die sich ergebende Suspension gut gerührt. Zu dieser Suspension wurde unter Rühren tropfenweise eine Lösung von 0,1 M ZnCl2 (100 mcl) hinzugegeben; Wasser wurde dann hinzugegeben, um das Volumen auf 1 ml aufzufüllen. Die Suspensionsmischung wurde vollständig gemischt und auf einem Eisbad für 10–20 Minuten gehalten. Dann wurde eine Lösung von 1,68 M δ-Gluconolacton (56 mcl) gründlich in diese Mischung eingerührt. Eine Menge von 0,1 ml der Endmischung (50 mg/ml Leptin, 1% Alginat) wurde auf die Innenseite eines Eppendorf-Röhrchens gegossen und über Nacht bei 4°C stehen gelassen.
Nach Über-Nacht-Lagerung wurde eine In-vitro-Freisetzung in 10 mM Histidin, pH 7,4, durchgeführt. Das gegossene Gel wies einen kleine Spitze und eine ziemlich konstante Leptinfreisetzung auf, wobei 50% in 6 Tagen freigesetzt wurden.
Beispiel 6
Dieses Beispiel zeigt, dass ein δ-Gluconolacton-induziertes Gel, das Leptin als ein feines Zinkpräzipitat enthält, eine nachhaltiger wirkende Freisetzung von Leptin produziert als die gleiche Zinksuspension in Alginat, das nicht geliert ist. Das Gel mit dem Zink-Leptin wurde wie in Beispiel 3 hergestellt. Eine nicht gelierte Zink-Leptin-Suspension in Alginat wurde in der gleichen Weise hergestellt mit der Ausnahme, dass das CaCO₃ und δ-Gluconolacton weggelassen wurden. Die Mäuse wurden mit Bolusinjektionen von 250 mg/kg dosiert und das Gewichtsverlustexperiment wurde wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. Die nicht gelierte Suspension produzierte lediglich einen Gewichtsverlust von 3% an den Tagen 2–4, wohingegen die gelierte Suspension etwa 9% Gewichtsverlust während der gleichen Zeitspanne erbrachte. Der Gewichtsverlust für die nicht gelierte Suspension kehrte am Tag 5 auf die Basislinie zurück, wohingegen Gewichtsverlust für die gelierte Suspension oberhalb der Basislinie am Tag sieben verblieb, als das Experiment endete.
Beispiel 7
Dieses Beispiel zeigt Freisetzungskinetiken nullter Ordnung in einer pharmakokinetischen/pharmakodynamischen Studie in männlichen Ratten, was sowohl eine nachhaltig wirkende Freisetzung als auch eine gleichzeitige nachhaltige Wirkung von Leptin (d. h. Gewichtsverlust) zeigt, die durch die in Beispiel 3 beschriebene Gelzusammensetzung bedingt wurden. Die Leptinkonzentration betrug 47 mg/ml und war prägeliert in der Spritze, wie in Beispiel 3 beschrieben. Man verabreichte den Ratten eine Bolusdosis von 0 mg/kg (Kontrolle), 50 mg/kg und 250 mg/kg, dann wurden Bluttiter und Gewichtsverlust für sechs Tage überwacht. Leptin-Zink-Präzipitat ohne das Gel wurde ebenfalls Ratten mit einer Dosis von 100 mg/kg injiziert.
Die Gruppe mit hoch dosiertem Leptingel wies einen gleichmäßigen Bluttiter von ~2000 ng/ml während der Periode auf, wohingegen das Leptingel mit niedrigerer Dosis einen Titer von ~1/5 dieses Titers für vier Tage aufwies. Im Gegensatz dazu zeigte die Gruppe mit Leptin ohne das Gel einen Bluttiter von 2300 ng/ml, der ein Maximum bei 12 Stunden erreichte und dann um einen Faktor von 100 über die gleiche Zeitspanne abnahm. Das Gewicht der Ratten (gegenüber der Vehikelkontrolle) nahm für die Gruppe mit Gel mit hoch dosiertem Leptin gleichmäßig über diese Zeitspanne ab. Das Gewicht der Gruppe mit Leptingel mit niedrigerer Dosis folgte dem gleichen Verlauf für fast 5 Tage; ab diesem Zeitpunkt nahm der Leptinblutspiegel der Gruppe mit niedrigerer Dosis ab.
Die Bioverfügbarkeit des Leptin-Wirkstoffes wurde bewertet durch Vergleich von Dosisnormalisierten Flächen unter der Kurve der Leptingelformulierung, der Formulierung von Leptin ohne Gel und intravenös verabreichtem Leptin. Die Bioverfügbarkeit der Leptingelformulierung betrug 80% verglichen mit einer Bioverfügbarkeit von 63% des Leptins ohne Gelformulierung.
Beispiel 8
Dieses Beispiel zeigt die nachhaltige in-vitro-Freisetzung von G-CSF aus zeitverzögerten Gelvehikeln. Sowohl „gegossene" als auch „extrudierte" Materialien sind beispielhaft dargestellt. G-CSF in Wasser mit pH 3,4 wurde mit konzentriertem Alginat (10%) gemischt, um eine trübe, viskose Suspension auszubilden. Diese Mischung wurde mit CaCO₃ und δ-Gluconolacton mit 16 mM bzw. 79 mM geliert. Vor der Gelierung wurden Aliquots des Materials entweder in Röhrchen gegossen oder in Spritzen aufgezogen. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Gele bei 4°C (über Nacht) gelagert. Vor der Durchführung der Freisetzungsstudie wurde das Gel in den Spritzen in Röhrchen extrudiert und für 20 Minuten auszuhärten erlaubt. Freisetzungspuffer wurde dann hinzugegeben. Das extrudierte Gel wies eine G-CSF-Freisetzung über eine Zeitspanne von drei Tagen auf, d. h. 11% bei 1 Stunde, 35 % bei einem Tag, 75% bei zwei Tagen und ~90% bei drei Tagen. Das gegossene Gel setzte 22% nach 1 Stunde, 80% nach 1 Tag und 94% nach zwei Tagen frei.
Beispiel 9
Dieses Beispiel zeigt eine in vitro nachhaltig wirkende Freisetzung von Leptin aus einem zeitverzögerten Alginatgel, das aus Kalziumsalz (CaSO₄) ohne das Hinzufügen eines Protonendonors hergestellt ist. Nicht gepuffertes Leptin bei pH 8 wurde verwendet, um eine Zink-Leptin-Suspension in 2% Alginat auszubilden. Die Endkonzentration von ZnCl₂ und Leptin betrug 1 mM bzw. 55 mg/ml. Ein feines Pulver aus CaSO₄ wurde mit der Zink-Leptin-Alginat-Suspension gemischt, so dass die Endmischung 10 mM bezüglich CaSO₄ war. Aliquots des Materials wurden auf die Wände von Eppendorf-Röhrchen gegossen. Die Mischung gelierte in 4–5 Minuten.
Nach Lagerung über Nacht bei Raumtemperatur wurde eine Freisetzungsstudie durchgeführt. Die Proteinfreisetzung aus dem Gel zeigte eine niedrige Spitze (≤ 5%) bei 1 Stunde. Nach einem Tag waren 11% des Leptins freigesetzt. Die Leptinfreisetzung erfolgte graduell, 1,1% pro Tag, für die nächsten sieben Tage.
Beispiel 10
Dieses Beispiel zeigt eine nachhaltig wirkende in-vitro-Freisetzung von Leptin aus einem zeitverzögerten Alginatgel, das aus einem Kalziumsalz in einem nicht wässrigen Lösungsmittel ohne die Zugabe eines Protonendonors hergestellt ist. Ein lyophilisiertes Leptinpulver wird in 2% Alginat in trockenem Dimethylsulfoxid suspendiert. Ein feines Pulver von Kalziumoleat wird mit der Alginat-Leptin-Suspension gemischt, so dass die Endmischung 10 mM bezüglich Kalzium ist. Aliquots des Materials werden auf die Wände der Teströhrchen gegossen. Die Mischung geliert über die Zeit.
Nach Lagerung über Nacht bei Raumtemperatur wird eine Freisetzungsstudie durchgeführt. Die Proteinfreisetzung aus dem Gel erfolgt graduell und nachhaltig über die nächsten 7 Tage.
Beispiel 11
Dieses Beispiel zeigt eine in vivo nachhaltig wirkende Freisetzung von Leptin aus einem Alginatgel, das aus einem Kalziumsalz hergestellt ist, wie in Beispiel 10 beschrieben. Eine Gewichtsverluststudie in Mäusen wird durchgeführt nach einer einzelnen Injektion dieses Leptin-enthaltenden Gels mit 250 mg/kg. Der Gewichtsverlust wird über mehrere Tage gemessen.
Beispiel 12
Dieses Beispiel zeigt eine in vitro nachhaltig wirkende Freisetzung von G-CSF aus einem zeitverzögerten Alginatgel, das aus einem Kalziumsalz in einem nicht wässrigen Lösungsmittel hergestellt ist ohne das Hinzugeben eines Protonendonors. Ein lyophilisiertes Pulver von G-CSF wird in 2% Alginat in trockenem Dimethylsulfoxid suspendiert. Ein feines Pulver von Kalziumoleat wird mit der Alginat-G-CSF-Suspension gemischt, so dass die letztendliche Mischung 10 mM bezüglich Kalzium ist. Aliquots des Materials werden auf die Wände der Teströhrchen gegossen. Die Mischung geliert über die Zeit.
Nach Lagerung über Nacht bei Raumtemperatur wird eine Freisetzungsstudie durchgeführt. Die Proteinfreisetzung ist graduell und nachhaltig.
Beispiel 13
Dieses Beispiel zeigt eine in vitro nachhaltig wirkende Freisetzung von Konsensus-Interferon, wie in US-Patent 4,695,623 , a.a.O., offenbart, aus zeitverzögerten Alginatgelen. Wasser, ZnCl₂, Tris-Puffer und Konsensus-Interferon (in 10 mM Tris, pH 7,5) wurden mit Alginatlösung gemischt, dann mit CaCO₃ und δ-Gluconolacton gemischt, so dass die Endkonzentration der Bestandteile 1 mg/ml Konsensus-Interferon, 10 mM ZnCl₂, 1% Alginat, 20 mM Tris, 10 mM CaCO₃ und 40 mM δ-Gluconolacton betrug. Die Mischung wurde auf ein Eppendorf-Röhrchen gegossen (0,4 ml pro Röhrchen), bei Raumtemperatur geliert und über Nacht bei 4 °C gelagert. Nach Lagerung über Nacht wurde eine in-vitro-Freisetzung durchgeführt in 10 mM Histidin-Puffer, pH 7,4. Das gegossene Gel wies eine kleine initiale Spitze auf – die prozentuale Freisetzung betrug 3% nach 1 Stunde, 14% nach einem Tag. Nach 4 Tagen waren 70% freigesetzt. Nach 5–6 Tagen verringerte sich die Freisetzung auf < 5% pro Tag.
Beispiel 14
Dieses Beispiel zeigt, dass zeitverzögerte Alginatgele verwendet werden können für die nachhaltig wirkende Freisetzung von Konsensus-Interferon. Ein zeitverzögertes Alginatgel mit Konsensus-Interferon wurde gemäß Beispiel 13 hergestellt mit der Ausnahme, dass die Endkonzentrationen wie folgt waren: 0,2 mg/ml Konsensus-Interferon, 10 mM ZnCl₂, 2% Alginat, 20 mM Tris, 10 mM CaCO₃ und 40 mM δ-Gluconolacton. Eine weitere Formulierung wurde mit der gleichen Zusammensetzung hergestellt mit der Ausnahme, dass die Endkonzentration von Konsensus-Interferon 1 mg/ml betrug. Die Mischungen wurden in Spritzen aufgezogen und gelierten nach 2 Stunden. Die 0,2 mg/ml-Formulierung wurde mit 1 mg/kg und die 1 mg/ml-Formulierung mit 1 mg/kg- und 5 mg/kg-Dosen subkutan in männliche Syrische Hamster injiziert. Blut wurde durch Herzpunktierung gesammelt und auf Konsensus-Interferon getestet, um eine nachhaltig wirkende Freisetzung des Wirkstoffes zu beobachten.

Claims

Pharmazeutische Formulierung einer nachhaltig wirkenden Gelzusammensetzung umfassend: a) Alginat; b) ein biologisch aktives Agens; und c) wenigstens ein gebundenes polyvalentes Metallion, wobei sich das Gel zeitverzögert ausbildet, in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, wobei die nachhaltig wirkende Zusammensetzung weiter umfasst: d) wenigstens einen Protonendonor, der in der Lage ist, vermittels Hydrolyse, geringer Löslichkeit oder langsamen Auflösen eine Säure zu erzeugen, wobei das gebundene polyvalente Metallion freigesetzt wird.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 2, wobei der Protonendonor ausgewählt ist aus Puffern, Ester, schwach löslichen Säuren, langsam in Lösung gehenden Säuren oder Laktonen.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 3, wobei der Protonendonor Gluconolakton ist.
Pharmazeutische Formulierung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das gebundene polyvalente Metallion eine Mischung aus gebundenem und nicht gebundenem polyvalenten Metallion ist.
Pharmazeutische Formulierung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiter umfassend Bindemittel zum Stabilisieren des biologisch aktiven Agens oder Alginats.
Pharmazeutische Formulierung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das gebundene polyvalente Metallion ein Salz ist, das ausgewählt ist aus Phosphaten, Tartraten, Sulfaten, Carbonaten, Hydroxiden oder Fettsäureanionen davon.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 7, wobei das Metallion ausgewählt ist aus Mangan, Strontium, Eisen, Magnesium, Kalzium, Barium, Kupfer, Aluminium oder Zink.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 8, wobei das Metallion Kalzium ist.
Pharmazeutische Formulierung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Alginat wenigstens 30% Glucuronsäure enthält.
Pharmazeutische Formulierung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biologisch aktive Agens ein Protein umfasst.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 11, wobei das Protein ausgewählt ist aus hämatopoetischen Faktoren, koloniestimulierenden Faktoren, Faktoren gegen Fettleibigkeit, Wachstumsfaktoren und anti-entzündlichen Faktoren.
Pharmazeutische Formulierung nach den Ansprüchen 11 oder 12, wobei das Protein ausgewählt ist aus Leptin, G-CSF, SCF, BDNF, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-1ra, IL2, TNF-bp, MGDF, OPG, Interferonen, Erythropoietin, KGF, Insulin und Analogen oder Derivaten davon.
Pharmazeutische Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das biologisch aktive Agens ein komplexiertes biologisch aktives Agens ist.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 14, wobei das komplexierte biologisch aktive Agens ein präzipitiertes Protein ist.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 15, wobei das präzipitierte Protein ein Zink-Leptin-Präzipitat ist.
Pharmazeutische Formulierung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Formulierung sich in einer Spritze befindet.
Verwendung einer nachhaltig wirkenden Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 16 in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel oder Adjuvans für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Indikation.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Indikation eine Störung ist, die ausgewählt ist aus Übergewicht, Diabetes, hohe Blutlipidtiter, Arteriosklerose, Arterioskleroseherd, die Verringerung oder Verhinderung von Gallensteinbildung, ungenügende fettfreie Gewebemasse, ungenügende Empfindlichkeit gegenüber Insulin, und Schlaganfall.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Indikation eine Störung ist, die ausgewählt ist aus Mangel an hämatopoetischen Zellen, Infektion und Neutropenie.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Indikation Entzündung ist.