CZ20004111A3 - Biologicky odbouratelné alginátové gely s prodlouženým uvolňováním - Google Patents

Abstract

Předkládané řešení se týká přípravků s prodlouženým uvolňováním, které používají biologicky odbouratelné alginátové zpožděné gely nebo částice a způsoby jejich výroby.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká přípravků s prodlouženým uvolňováním, které používají biologicky odbouratelné perly z alginátového gelu a/nebo zpožděné gely, a způsobů jejich výroby.

Dosavadní stav techniky

Dostupnost rekombinantních proteinů díky pokrokům v technologiích genetického a buněčného inženýrství rozvinula používání proteinů jako léčiv pro terapeutické aplikace. Mnoho nemocí nebo chorob léčených farmaceutickými proteiny vyžaduje pro dosažení nej účinnějšího terapeutického výsledku trvalé hladiny proteinu. Ale u většiny proteinových léčiv je díky obecně krátkému biologickému poločasu nutné časté podávání. Tyto opakované injekce jsou podávány v různých intervalech, což má za následek kolísání hladin léčiva při významné tělesné i finanční zátěži pacientů. Protože mnoho chorob lépe odpovídá na řízené hladiny léčiva, je potřebné řízené uvolňování léčiva pro zajištění delšího období trvalého uvolňování. Taková léčiva s prodlouženým uvolňováním by pacientovi zajistila nejen zesílený profylaktický, terapeutický nebo diagnostický účinek, ale také snížení častého opakování injekcí, jakož i celkových nákladů na léčení.

Současné pokusy o udržení léčivých hladin mezi dávkami u lidí nebo zvířat zahrnují použití biologicky odbouratelných polymerů jako matrice pro řízení uvolňování léčiva. Například patent Velké Británie č. 1 388 580 popisuje použití hydrogelů pro přetrvávající uvolňování inzulínu. Patent Spojených Států • · ·· · · Λ ·· • · · · ···· ···

č. 4 789 550 popisuje použiti alginátových mikrotobolek potažených polylysinem pro podáváni proteinu opouzdřenim živých buněk. Pokusy s prodlouženým uvolňováním také používaly aniontové nebo kationtové polymerové přípravky obklopené iontovými polymery opačného náboje pro opouzdření buněk schopných produkovat biologicky aktivní přípravky, viz patent Spojených Států č. 4 744 933. Podobně byly také popsány mnohonásobné povlaky aniontových nebo kationtových zesítěných polymerů jako prostředků pro dosaženi řízeného uvolňování, viz patent Spojených Států č. 4 690 682 a 4 789 516. Kromě toho další pokusy popisuji použiti samotných alginátů nebo aiginátů potažených dalšími biologicky odbouratelnými polymery pro řízené uvolňování polypeptidových přípravků nebo jejích kationtových precipitátů, viz dokumenty PCT WO 96/00081, PCT WO 95/29664 a PCT WO 96/03116.

Tyto pokusy ale poskytly nedostatečné prostředky pro to, aby bylo dosaženo podávání s prodlouženým uvolňováním požadovaných proteinových léčiv. Je obecně známo, že použití určitých biologicky odbouratelných polymerů, např. koglykolidu polylaktidu, v podmínkách in vivo projevuje vysoký počáteční pulz v uvolňování léčiva (Johnson, 0. et al., Nátuře Med., 2(7): 795, 1996). Kromě toho je všeobecně známo, že proteiny použité se současnými formami přípravků s prodlouženým uvolňováním mohou prodělat denaturaci a ztratit svou biologickou aktivitu při expozici opouzdřovacim činidlům. Tyto přípravné postupy používají organická rozpouštědla, která mohou mít škodlivé účinky na vybraný protein. Konečně, jak je pojednáno níže, použití samotného alginátů nezajistilo požadované řízené uvolňování proteinu nezbytné pro účinné terapeutické výsledky.

Obecně jsou algináty dobře známé, přirozeně se vyskytující aniontové polysacharidy složené z 1,4-navázané β-D-mannuronové kyseliny a α-L-guluronové kyseliny (Smidsrod, 0. et al., « · · · • ·

kolísají od 70 kyseliny ke 30 kyseliny % guluronové % guluronové je ve vodě

Trends in Biotechnoi,, 8, 71-78, 1990, Aslani, P. et al., J,

Microencapsulatíon, 13(5), 601-614, 1996). Typicky algináty mannuronové kyseliny a 30 mannuronové kyseliny a 70 (Smidsrod, výše). Álginová kyselina nerozpustná, zatímco soli tvořené s monovalentními ionty, jako je sodík, draslík a amonium, jsou ve vodě rozpustné (McDowell, R.H., „Properties of Alginates, Londýn, Alginate Industries Ltd., 4. vydání, 1977). Je známo, že polyvalentní kationty reagují s algináty a spontánně tvoři gely.

Algináty mají celou řadu aplikací, jako například potravinářská aditiva, lepidla, farmaceutické tablety a obvazy ran. Algináty byly také doporučené pro proteinové separační techniky. Například Cray, C.J. et al,, (Biotechnology and Bioengineering, 31, 607-612, 1988) zachytávali inzulín na zinkové,/vápníkové algínátové gely pro oddělení inzulínu od jiných sérových proteinů.

Bylo také dobře prokázáno, že algínátové. matrice jsou dobré jako systémy pro podáváni léků, víz například patent Spojených Států c. 4 695 463, který popisuje žvýkací gumu s alginátovým základem jako systém pro podáváni léčiv a pro farmaceutické přípravky. Algínátové perly byly použity pro řízené uvolňováni různých proteinů jako jsou: receptor nádorového nekrotického faktoru v kationtových alginátových perlách potažených polykationty (Wee, S.t'., Proceed, Intern, Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 21, 730-31, 1994), transformující růstový faktor opouzdřený v alginátových perlách (Puolakkainen, P.A. et al,, Gastroenterology, 107, 1319-1326, 1994), angiogenní faktory zachycené ve vápníkových alginátových perlách (Downs, L.C. et al·., J. of Cellular Physiology, 152, 422-429, 1992), albumin zachycený v chitosanových alginátových mikrotobolkách (Polk, A. et al.,

J. Pharmaceutical Sciences, 83(2), 178-185, 1994), chitosanové vápníkové alginátové perly potažené polymery (Okhamafe, Ά.Ο. et al., J. Microencapsul., 13(5), 497-508, 1996), hemo.globulin opouzdřený chitosanovými vápníkovými alginátovými perlami (Huguet, M.L. et al., J. Applied Polymer Science, 51, 14271432, 1994, Huguet, M.L. et al., Process Biochemistry, 31, 746-751, 1996) a interleukin-2 chitosanových mikrosférách (Liu, opouzdřený v alginátových L.S., et al., Proceed.

zpomalilo

Wheatley,

Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 22, 542-543,

1995) .

Systémy používající perly z alginátového gelu nebo perly alginátového/vápníkového gelu pro zachycení proteinů trpí nedostatkem jakéhokoliv prodlouženého či přetrvávajícího uvolňování díky rychlému uvolňování proteinu z alginátových perel (Liu, L. et al., J. Control. Rel., 43, 65-74, 1997). Aby se zabránilo takovému rychlému uvolňování, velký počet výše uvedených systémů zkoušel použít polykationtové polymerové povlaky (např. polylysín, chitosan), aby se uvolňování proteinu z alginátových perel (viz např

M.A. et al., J. Applied Polymer Science, 43, 2123-2135, 1991), Wee, S.F. et al., výše, Liu, L.S. et al., výše, Wee, S.F. et al., Controlled Release Society, 22, 566-567, 1995 a Lim et al., výše.

Polykationty, jako je polylysin, jsou pozitivně nabité polyelektrolyty, které interagují s negativně nabitými alginátovými molekulami za vzniku polyeiektrolytových komplexů, které působí jako difúzni bariéry na povrchu perel. Při použití polykationtů mohou nastat problémy v tom, že: 1) takové přípravky mohou být díky polykationtům cytotoxícké (Huguet, M.L. et al., výše, Zimmermann, Ulrich, Electrophoresis, 13, 269, 1992, Bergmann, P. et al., Clinical Science, 67, 35, 1984), 2) polykationty jsou náchylné k oxidaci, 3) perly s polykationtovým povlakem mají tendenci k tomu, že jsou nerozrušitelné a v těle přibývají, 4) tyto • ·

Ο -

přípravky jsou vytvářené pomocí pracných potahovacích postupů, které zahrnují mnohonásobné potahování polykationtovým polylysinem (Padol, et al ., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 2, 216, 1986) a 5) iontové interakce mezi proteinem a polykationty mohou mít za následek ztrátu proteinové aktivity nebo způsobí nestabilitu proteinu.

Francesco et al. (Patent Spojených Států c. 5 336 668, a odkazy zde uvedené) popisují úplné a parciální estery kyseliny alginové, tvořené různými postupy a mající zajímavé farmaceutické kvality. Je popsáno, jak mohou být estery kyseliny alginové použity jako biologicky odbouratelné plastové materiály pro zdravotně-chirurgické použití, jako aditiva pro celou řadu polymerových materiálů nebo mohou být použity při přípravě různých léčiv. Možné použití esterů kyseliny alginové v přípravcích s prodlouženým uvolňováním není pojednáno, ani nejsou popsány esteralginátové hydrogely.

Nightlinger et al. (Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 22, 738-739, 1995) popisují mikrosféry esterifikované hyaluronové kyseliny (HA) mající schopnost řízeného uvolňováni. Odkazy se obecně obrací na různé rychlosti degradace derivátů HA a popisuji, jak se ester „rozlomí, aby uvolnil skupiny alkoholu a HA. Není zde žádná diskuse týkající se toho, jak nebo zdali se samotná HA kostra rozloží na polymerové jednotky o nižší molekulové hmotnosti.

Aby byl použitelný systém pro podávání léků s prodlouženým uvolňováním založený na polysacharidech, musí být polysacharid biologicky odbouratelný na netoxické produkty. Bylo zjištěno, že určité systémy algínátového gelu, i když jsou účinné pro zajištění prodlouženého uvolňování léčiva, mají za následek „hrboiek (nebo uzlík) v místě injekce způsobený velmi pomalým rozpadem gelu. V terapeutickém uspořádání zahrnujícím nízké dávky léku a řídké injekce by to nemusel být hlavní problém. Ale v léčebném uspořádání zahrnujícím vysoké dávky léčiva

• · a účinnější přípravky klinické aplikace. Trvalé přinos přinést četným a tudíž zajistí a častější injekce může být tento výsledek odrazující. Musí být vyvinuty prostředky pro zvýšení rychlosti rozpadu alginátového gelu v místě injekce.

Stále tedy trvá potřeba vyvinout farmaceutické formulace, které vytvoří univerzálnější s prodlouženým uvolňováním pro dlouhodobé uvolňováni může rekombinantním nebo přirozeným proteinům, účinnější klinické výsledky.

Předkládaný vynález poskytuje takové postupy. Farmaceutické přípravky používající biologicky odbourateiné částice alginátového gelu nebo gely podle předkládaného vynálezu jsou schopné zajistit zvýšenou biologickou dostupnost, ochranu proteinů, sníženou degradaci a pomalé uvolňování při zvýšené proteinové stabilitě a účinnosti. Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu také poskytují jednoduchý, rychlý a nenákladný způsob řízeného uvolňování rekombinantního proteinu pro účinné profýlaktické, terapeutické nebo diagnostické výsledky.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález vychází ze studií používajících nemodifikované alginátové (skupina aniontových polysacharidů) hydrogely pro prodloužené uvolňování proteinů. Tyto nemodifikované alginátové hydrogely obsahující protein (viz současně projednávané přihlášky Spojených Států 08/857 913 a 08/912 902) jsou tvořeny tak, aby prodlužovaly dobu uvolňování, přičemž látky mohou být naplněny do stříkačky a ponechány do tvorby pozdějšího gelu v téže stříkačce, neboť bylo zjištěno, že tyto gely je možné injikovat. Po jediné subkutánní injekci je na modelech hlodavců po mnoho dnů pozorován a prokázán setrvalý výskyt proteinu, ale v místě

injekce zůstává po dlouhé časové období hmatatelný hrbolek nebo uzlík s malými změnami ve velikosti. Tento uzlík se skládá ?. alginátového hydrogelu naplněného vodou a jeho velikost je funkcí objemu gelu, který je injikován, v místě injekce také zůstávají gelové perly.

Předkládaný vynález se tedy týká nové skupiny biologicky kompatibilních polysacháridových hydrogeiů, např. esteralginátových hydrogeiů, pro prodloužené uvolňování terapeutických proteinů. Neočekávaně esteralginátové hyd.rogely, kromě toho, že sdílejí vlastnosti nemodifikovaných algínátů, co a prodlouženého se týče uvolňování, uzlík, což gelovatění, injikovatelností v místě injekce nezanechávají znamená, že esteralginátové hydrogely jsou biologicky odbouratelné nebo rozložitelné a jsou postupně resorbovány do okolních tkání s malou reakcí v místě injekce.

Přípravky podle předkládaného vynálezu obsahují estery kyseliny alginové nebo jejich deriváty iontově zesítěné v hydrogelovou (vodu zadržující) matrici obsahující terapeutické agens, jako například protein.

Předkládaný vynález se dále týká způsobu produkce biologicky odbouratelných přípravků s prodlouženým uvolňováním.

Předkládaný vynález se dále týká použití esteralginátových materiálů v tekutých směsích pro časově oddálené gelovatění v těle.

Předkládaný vynález se dále týká přípravků, kde esteralginátové hydrogely jsou ve formě perel nebo mikrosfér pro prodloužené uvolňování aktivních agens, výhodně terapeutických proteinů.

V jednom provedeni předkládaného vynálezu poskytuji esteralginátové hydrogely přípravky pro aplikaci na cílová místa v těle pacienta. Tyto přípravky jsou použitelné; pro prevenci nebo inhibicí tvorby tkáňových adhezí po • Φ φφ

Φ· φ

chirurgických výkonech a traumatech, jako doplněk tkáni, zejména pro doplněni měkkých a tvrdých tkání, k vyplněni omezeného prostoru resorbovatelným materiálem, jako skelet pro růst tkáně a jako krytí ran.

V dalším provedeni poskytují esteralginátové hydrogely zařízeni pro implantaci'do organismu obsahující aktivní agens, přičemž agens může být buď navázáno nebo nenavázáno na alginátový polymer.

V dalším provedení přípravky s esteralginátovýmí hydrogely podle předkládaného vynálezu poskytuji způsob zlepšení biologické dostupností aktivního agens v přípravku.

Konečně přípravky s esteralginátovýmí hydrogely podle předkládaného vynálezu dále poskytují způsob dosažení v podstatě konstantní hladiny v krvi pacienta přetrvávající po určité období.

Přípravky

Hydrofilní polymery včetně alginátů a jejich derivátů mohou být získány z různých komerčních, přirozených nebo syntetických zdrojů v oboru dobře známých. Termín „hydrofilní polymer se užívá v tomto popisu tak, že se vztahuje k polymerům ve vodě rozpustných nebo polymerům majících tendenci k absorpci vody. Odborníkovi jsou hydrofilní polymery dobře známy. Hydrofilní polymery bez omezení zahrnují polyaníonty, včetně aniontových polysacharidů, jako například alginát, karboxymetylamylózu, soli polyakrylové kyseliny, soli polymetakrylové kyseliny, kopolymer anhydridu etylenmaleinové kyseliny (poloviční ester), karboxymetylcelulózu, dextransulfát, heparin, karboxymetyidextran, karboxycelulózu,

2,3-dikarboxycelulózu, trikarboxycelulózu, karboxylovanou arabskou gumu, karboxylovaný karagenan, pektin, karboxypektin, karboxylovanou tragantovou gumu, karboxylovanou xantanovou

• 9

9 gumu, pentosanpolysulfát

karboxyiovaný škrob karboxymetylchitin/chitosan, curdlan, inositolhexasulřat, b-cyklodextrinsulfát, kyselinu hyaluronovou, chondroitin-6sulfát, dermatansulfát, heparinsulfát, karboxymetylškrob, karagenan, polygalakturonát, karboxylovanou guarovou gumu, polyfosfát, polyaldehydokarbonovou kyselinu, poly-l-hydroxy-1sulřonát-propen-2, kopoiystyrenmaleínovou kyselinu, agarózu, mezoglykan, . sulfopropyiované polyvinyiaikohoiy, celulózosulfát, protaminsulfát, fosfoguarovou gumu, polyglutamovou kyselinu, polyasparagovou kyselinu, polyaminokyseliny, jejich deriváty nebo kombinace. Odborník zná další různé hydrofilní polymery, které se týkají oblasti předkládaného vynálezu.

Podobně mohou být získány vázané polyvalentní kovové ionty z různých komerčních, přirozených nebo syntetických zdrojů v oboru dobře známých. Kovové ionty mohou konkrétně, ale bez omezení, zahrnovat hliník, baryum, vápník, železo, mangan, hořčík, stroncium a zinek. Výhodně jsou kovové ionty vápník a zinek nebo jejich soli, jako acetát zinečnatý, acetát vápenatý nebo chloridy. Mohou být také použity malé molekuly a soli rozpustné ve vodě, jako například síran amonný, aceton, etanol a glycerol.

Alkoholy alifatické řady pro použití jako esterifikační složky karboxylových skupin alginové kyseliny podle předkládaného vynálezu jsou například takové, které obsahují maximálně 34 uhlíkových atomů, mohou být saturované nebo nesaturované, a mohou být eventuálně také substituovány dalšími volnými nebo funkčně modifikovanými skupinami, jako jsou aminoskupiny, hydroxyskupiny, aldehydové skupiny, ketoskupiny, merkaptoskupiny, karboxylové skupiny, a nebo skupiny odvozené z těchto skupin, jako hydroxykarbylové skupiny nebo dihydrokarbylaminové skupiny (termín „hydrokarbyl může dále znamenat nejen monovalentní radikály • · ·· »·····*· uhlovodíků např. typu C_nH2_n-_lř ale také bivalentní nebo trivalentní radikály, jako například „alkyleny-C_nH₂ nebo „alkylideny = C_nH_2n), éterové nebo esterové skupiny, acetalové nebo ketalové skupiny, thioéterové nebo thioesterové skupiny a esterifikované karboxyskupiny nebo karbamidové skupiny či karbamidové skupiny substituované jednou nebo dvěma hydroxyskupinami, nitrilovými skupinami nebo halogeny.

Ve výše uvedených skupinách obsahujících hydrokarbylové radikály, jsou tyto radikály výhodně nižší alifatické radikály, jako například heteroatomy, jako kyslík, dusík a síra. Přednost se dává alkoholům substituovaným jednou nebo dvěma z výše uvedených funkčních skupin.

Alkoholy z výše uvedené skupiny výhodně používané za podmínek podle předkládaného vynálezu jsou alkoholy s maximálně 12 a obzvláště s maximálně 6 uhlíkovými atomy, ve radikály skupinách, kterých hydrokarbylové aminoskupinách, éterových uvedených skupinách, ve výše esterových thioéterových skupinách, thioesterových skupinách, acetalových skupinách, ketalových skupiny s maximálně skupinách představujících alkylové 4 uhlíkovými atomy, a také v esterifikovaných karboxyskupinách nebo substituovaných karbamidových skupinách hydroxykarbylových skupin jsou alkylové skupiny, se stejným počtem uhlíkových atomů, a ve kterých aminoskupiny nebo karbamidové skupiny mohou být alkylenaminoskupiny nebo alkyienkarbamidové skupiny s maximálně 8 uhlíkovými atomy. Z těchto alkoholů jsou na prvém miste uvedeny saturované a nesubstituované alkoholy, jako jsou metyl, etyl, propyl, isopropylalkoholy, n-butyi alkohol, isobutyl, terč.-butylaikoholy, amyl-, pentyl-,.

oktyl-, nonyl-, a dodecylalkoholy, a především s lineárním řetězcem, jako n-oktyl- nebo n-dodecylalkoholy. Ze substituovaných alkoholů této skupiny by mely být uvedeny bivalentní alkoholy, jako etylenglykol, hexyl-, alkoholy kyselina kyselina • tt tttt tt · · · · · • tttt* tt tttttttt • · · · tttttttt tttttttt tttt tttt • tttt · • tt tt · tttt • · » · tttttttt tt • tt · · • tttt tttt tt·· glykolová, citrónová, propylenglykol nebo butylenglykol, trivalentní alkoholy jako glycerin, aldehydaikoholy jako tartronalkohol, karboxyalkohoiy jako kyselina mléčná, například kyselina alfa-oxypropionová, kyselina jablečná, kyselina vinná, aminoalkoholy, jako aminoetanol, aminopropanol, n-aminobutanol a jejich dimetylové a dietylové deriváty aminové skupiny, cholin, pyrrolidinyletanol, piperidinyletanol, piperazinyletanol a odpovídající deriváty n-propyl nebo n-butylalkoholů, monothioetylenglykol nebo jeho alkylové deriváty, například etylderívát merkaptoskupiny.

Z vyšších saturovaných alifatických alkoholů zasluhujících si speciální zmínky jsou to například , acetylalkohol a myristylalkohol, ale pro účely předkládaného vynálezu jsou obzvláště důležité vyšší nesaturované alkoholy s jednou nebo dvěma dvojitými vazbami, jako jsou zejména ty, které jsou obsažené v mnoha esenciálních olejích a které mají afinitu k terpenům, jako je citronelloi, geraniol, nerol, nerolidoí, farnesoi, fytoi.

Z nižších nesaturovaných alkoholů by měla být pozornost věnována propargylalkoholu.

Alifatické alkoholy, které by měly být uvedeny především, jsou alkoholy s pouze jedním benzenovým zbytkem a alifatickým řetězcem s maximálně 4 uhlíkovými atomy, ve kterých také benzenový zbytek může být substituován 1 až 3 metylovými skupinami nebo hydroxyskupínámi nebo atomy halogenů, zejména chlórem, brómem nebo jódem a ve kterých může být alifatický řetězec substituován jednou nebo více funkčními skupinami vybranými ze skupiny zahrnující volné aminoskupiny nebo mononebo dimetylové skupiny nebo pyrrolidínové či piperidinové skupiny. Z těchto alkoholů jsou výhodné zejména benzylalkohol a fenetylalkohol. Alkoholy cykloalifatické nebo alifatické cykloalifatické řady mohou pocházet od mono nebo poíycyklických uhlovodíků a mohou mít maximálně 34 uhlíkových

• Φ • <

·· · • · • · • ΦΦΦ »··· atomů. Z alkoholů pocházejících z cyklických jednokruhových uhlovodíků si speciální zmínky zasluhují ty s maximálně 12 uhlíkovými atomy, s kruhy obsahujícími výhodně 5 až 7 uhlíkových atomů, eventuálně substituované například jednou až třemi nižšími alkylovými skupinami, jako jsou metylové skupiny, etylové skupiny, propyiové nebo ísopropylové skupiny. Specifické alkoholy z této skupiny jsou cyklohexanoi, cyklonexandíol, 1,2,3-cykiohexantrioi a 1,3,5-cyklohexantriol (fiorogiucitoi) , ínositoi, alkoholy odvozené od p-menthanu, jako karvomentoi, mentol, alfa a gama-terpineoi, 1-terpíneol alkoholy známé jako „terpíneol, 1,4- a 1,8-terpin. Alkoholy odvozené z uhlovodíků s kondenzovanými kruhy jsou například ty z thujanové, pinanové a kamfanové skupiny, zejména thujanoi, sabinolpinolnydrát, D a L-borneol a D a L-ísoborneol.

Patří sem také alkoholy pocházející z esterifikační reakce sloučenin obsahujících epoxyskupiny s algináty (viz např. patent Spojených Států č. 2 463 824 a patent Spojených Států č. 2 426 125).

Úplnou a částečnou esterovou skupinu obsahující poiyanionty podle předkládaného vynálezu jsou obecně kyselé polysacharidy, kde glykosidový kyslík je připojen v pozici beta ke karbonylovému uhlíku esteru. Bez vazby na nějaký specifický mechanismus toto uspořádání skupin umožňuje rozpad polymerového řetězce prostřednictvím beta-eiiminačního mechanismu, který může nastat za fyziologických podmínek.

Estery alginové kyseliny podle předkládaného vynálezu jsou složeny ze zbytků kyseliny mannuronové (m-COOH nebo m-COO anion) a zbytků kyseliny guluronové (g-COOH nebo g-COO anion) spojených dohromady glykosidickými éterovými kyslíkovými vazbami podle následujícího obecného vzorce 1:

- (M) nl- (M') n2 - (G) n3- (G ’) n4- (Ά) n5• · · · · · · • · · kde:

M je zbytek kyseliny mannuronové, m-COOH nebo m-COO anion,

M^ř je zbytek esteru kyseliny mannuronové, m-COORi,

G je zbytek kyseliny guiuronové, g-COOH nebo g-COO anion,

G' je zbytek esteru kyseliny guiuronové, g-COOR2,

A představuje jednotky řetězce non-g nebo non-m, jako jsou sacharidy, produkty oxidace sacharidů, nebo alifatické, aromatické, aralifatické, alaromatické, cykloalifatické radikály, které mohou být substituovány a přerušeny heteroatomy připojenými v řetězci nebo na koncích řetězce, nl, n2, n3, n4 a n5 jsou celá čísla představující průměrný relativní počet inkorporovaných jednotek,

Rl a R2 jsou nezávisle alifatické, aromatické, araiifatické, alaromatické, cykloalifatické radikály, které mohou být substituovány a přerušeny heteroatomy, a deriváty (např. kde hydroxyskupiny jsou acetylovány a reagují s isokyanatany) a jejich farmaceuticky přijatelné soli.

V esterech podle předkládaného vynálezu je žádoucí, aby Rl = R2 = alifatický nebo alaromatický radikál a dále, aby 100(n2+n4)/(nl+n2+n3+n4) byl od 1 do 99 % (mol.), výhodně 5 až 50 % (mol.), výhodněji 6 až 30 % (mol.), ještě výhodněji 6 až 15 % (mol.) a nej výhodněji 7 až 12 % (mol.) a 100n5/(nl+n2+n3+n4+n5) je výhodně méně než 10 % (mol.).

V parciálních esterech podle vynálezu mohou být neesterifikované karboxyskupiny udržovány volné nebo mohou být přeměněny na soli. Báze pro tvorbu těchto solí jsou vybírány podle konečného použití produktu. Anorganické soli mohou být tvořeny z alkalických kovů, jako je draslík a zejména sodík a amoníum, nebo mohou pocházet z kovů alkalických zemin, jako je vápník nebo hořčík nebo hliník.

Obzvláštního významu jsou soli s organickými bázemi, zejména bazické azosloučeniny, a tudíž alifatické, araiifatické, cykloalifatické nebo heterocyklické aminy. Tyto « a • ·

amonné soli mohou pocházet z terapeuticky přijatelných aminů nebo netoxických, ale terapeuticky neaktivních aminů nebo z aminů s terapeutickým účinkem. Co se týče prvního typu, výhodné jsou alifatické aminy, například mono-, di- a trialkyiaminy s alkylovými skupinami s maximálně 8 uhlíkovými atomy nebo arylalkylaminy se stejným počtem uhlíkových atomů v alifatické části a kde aryl znamená benzenovou skupinu eventuálně substituovanou 1 až 3 metylovými' skupinami nebo atomy halogenů nebo hydroxyskupinamí.. Biologicky neaktivní báze pro tvorbu solí mohou také být cyklické, jako monocykiické alkyienamíny s cykly o 4 až 6 uhlíkových atomech, eventuálně přerušené v cyklu heteroatomy vybranými ze skupiny tvořené dusíkem, kyslíkem a sírou, jako piperazin nebo morfolin, nebo mohou být substituovány, například aminoskupinou nebo hydroxyskupinou, jako je aminoetanoi, etyiendiamoi, etyiendiamin, efedrin nebo cholin.

Stupeň a typ esterifikace může být řízen syntetickými metodami v oboru známými. Výhodně jsou alginátové estery připraveny ošetřením kvartérnícn amonných solí kyseliny algínové obvyklými alkyiačními činidly v aprotickém organickém rozpouštědle jako například dimetylsulřoxidu. Výsledné estery jsou výhodně estery monovalentních alkoholů jako například nižších alkylových, jako etyl nebo aralkyl, jako benzyl nebo jejich směsi. Mohou se také tvořit estery reakcí kyseliny aiginové se sloučeninami obsahujícími oxiran nebo epoxyskupinu, jako například etylen nebo propylenoxid.

Je také možné tvořit kvarterní amonné soli parciálních esterů, například soli tetraalkylamonia s výše uvedeným počtem uhlíkových atomů a výhodně solí tohoto typu, ve kterých čtvrtá alkylová skupina má 1 až 4 uhlíkové atomy, například metylová skupina.

Stupeň esterifikace (vyjádřen v % (mol.)) kyseliny aiginové se vztahuje k požadované rychlostí rozpadu gelu ib v tkáni pacienta. Tato rychlost rozpadu gelu je obecně ve vztahu, k požadované rychlosti uvolňováni aktivního agens z gelu, což je po dobu 5 let nebo méně, obvykle 2 dny až 270 dnů, obvykleji 2 dny až 180 dnů, obvykleji 2 dny až 90 dnů. Stupeň esterífíkace (Ďfi) je od 1 do 99 % (mol.), výhodně od 5 do 50 % (mol.), výhodněji od 6 do 30 % (mol.), ještě výhodněji od 6 do 15 % (mol.) a nejvýhodněji od 7 do 12 % (mol.).

Termín pufr nebo pufrovaci roztok, používaný v popisu, se týká použití anorganických nebo organických kyselin nebo jejich kombinace pro přípravu pufrovacího roztoku, jak je v oboru známo. Anorganické kyseliny v rozsahu předkládaného vynálezu zahrnují halid vodiku (např. kyselinu chlorovodíkovou), kyselinu fosforovou, kyselinu dusičnou nebo kyselinu sírovou. Další anorganické kyseliny jsou odborníkovi dobře známy a jsou zde brány do úvahy. Organické kyseliny v rozsahu vynálezu zahrnuji alifatické karboxylové kyseliny a aromatické kyseliny jako například kyselinu mravenčí, kyselinu uhličitou, kyselinu octovou, kyselinu propionovou, kyselinu máseinou, kyselinu valerovou, kyselinu kapronovou, kyselinu akrylovou, kyselinu maionovou, kyselinu jantarovou, kyselinu giutarovou, kyselinu adipovou, kyselinu maieinovou, kyselinu fumarovou, gíycin nebo kyselinu fenoisuifonovou. Daiši organické kyseliny jsou odborníkovi dobře známy.

Termín biologicky aktivní agens, používaný v tomto popisu, se týká rekombinantních nebo přirozeně se vyskytujících proteinů, lidských nebo zvířecích, použitelných pro profylaktické, terapeutické nebo diagnostické aplikace, jakož i agens nevycházejících z proteinů, jako jsou malé molekuly. Biologicky aktivní agens mohou být přirozená, syntetická, polosyntetická agens nebo jejich deriváty. Biologicky aktivní agens podle předkládaného vynálezu musí jít precipitovat. Je uvažováno o celé řadě biologicky aktivních agens. To bez omezení zahrnuje hormony, cytokiny, hemopoetické faktory, růstové faktory,. faktory působící proti obezitě, trofícké faktory, protizánětlívé faktory a enzymy (viz také patent Spojených Států Č. 4 695 463 pro další příklady použitelných biologicky aktivních agens). Odborník je snadno schopný adaptovat požadované biologicky aktivní agens do přípravku podle předkládaného vynálezu.

Tyto proteiny bez omezení zahrnuji interferony (viz patenty Spojených Států Č. 5 372 808, 5 541 293, 4 897 471 a 4 695 623, tímto zahrnuty formou odkazu včetně obrázků) , interleukiny (viz patent Spojených Států č. 5 075 222, tímto zahrnut formou odkazu včetně obrázků), erytropoetiny (víz patenty Spojených Států č. 4 703 008, 5 441 868, 5 618 698, 5 547 933 a 5 621 080, tímto zahrnuty formou odkazu včetně obrázků), granulocytové kolonie stimulující faktor (víz patenty Spojených Států č. 4 810 643, 4 999 291, 5 581 476, 5 582 823 a PCT publikace Č. 94/17185, tímto zahrnuty formou odkazu včetně obrázků), faktor kmenové buňky (PCT publikace č. 91/05795, 92/17505 a 95/17206, tímto zahrnuty formou odkazu včetně obrázků) a protein OB (víz PCT publikace č. 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 a 97/06816, tímto zahrnuty formou odkazu včetně obrázků). Kromě toho, biologicky aktivní agens mohou také bez omezení zahrnovat produkty působící proti obezitě, inzulín, gastrin, prolaktin, adrenokortíkotropní hormon (ACTH), hormon stimulující štítnou žlázu (TSH), luteinizační hormon (LH), hormon stimulující folikuly (FSH), lidský choriogonadotropin (HCG), motilin, interferony (alfa, beta, gama), interleukiny (IL-1 až IL-12), nádorový nekrotický faktor (TNF), protein vázající nádorový nekrotický faktor (TNF-bp), neurotrofický mozkový faktor (BDNF), gliový neurotrofický faktor (GDNF), neurotrofický faktor 3 (NT3), fibroblastové růstové faktory (FGF), neurotrofícký růstový faktor (NGF), kostní růstové faktory jako osteoprotegeríny (OPG), růstové faktory podobné inzulínu (IGF), faktor stimulující makroťágovou kolonii (M-CSF), faktor stimulující kolonie makrofágů a granulocytů (GM-CSF), megakeratinocytový růstový faktor (MGDFj, trombopoetin, destičkový růstový faktor (PGDF), růstové faktory stimulující kolonie (CSF), kostní morfogenetický protein (BMP), superoxid-aismutáza (SOD), tkáňový aktivátor plazminogenu (TPA), urokínáza, streptokináza a kalikrein. Termín proteiny, jak se zde používá, zahrnuje peptidy, polypeptidy, konsenzní molekuly, analogy, deriváty nebo jejich kombinace.

Deriváty biologicky aktivních agens mohou zahrnovat připojení jedné nebo více chemických skupin ke skupině proteinu. Bylo nalezeno, že chemické modifikace biologicky aktivních agens poskytnou za určitých podmínek další výhody, jako například zvýšeni stability a doby cirkulace terapeutického proteinu a sníženou imunogenicnost. Odborník bude schopný vybrat požadovanou chemickou modifikaci na základě požadovaného dávkování, době cirkulace, rezistence k proteolýze, terapeutického použití a dalších zřetelích.

Termín biologická odbouratelnost (biodegradabilita) v tomto popisu se týká rozpadu molekuly s vyšší molekulovou hmotností konkrétního polymeru na menší počet jednotek v řetězci, tj. rozpad na jednotky o nižší molekulové hmotnosti. Termín biologicky odbourateiný gei se vztahuje k rozptýlení gelu v prostředí, ve kterém byi použit, přičemž rozptýlení je podmíněné rozpadem molekul základních polymerů s vyšší molekulovou hmotností, což má za následek méně jednotek v polymerovém řetězci.

Komplexy

Proteiny, analogy nebo deriváty mohou být podávány v komplexu s vazebným přípravkem. Tento vazebný přípravek může mít vliv na prodloužení doby cirkulace proteinu, analogu nebo derivátu nebo zvýšení aktivity biologicky aktivního agens. Takový přípravek může být protein (nebo synonymne peptid), derivát, analog nebo jejich kombinace. Například vazebný protein pro protein ÓB je receptor proteinu ÓB nebo jeho část, jako například jeho rozpustná část. Další vazebné proteiny mohou být zjištěny vyšetřením proteinu OB nebo proteinu dle výběru v séru nebo mohou být empiricky testovány na přítomnost vazby. Taková vazba typicky neínterferuje se schopností proteinu OB nebo analogu či derivátu vázat se na endogenní receptor proteinu OB a/nebo uskutečnit signální transdukci. Kromě proteinu OB budou vazebné komplexy také použitelné stejně tak pro další terapeutické proteiny podle předkládaného vynálezu. Odborníci jsou schopni zjistit vhodné vazebné proteiny pro použití podle předkládaného vynálezu.

Podobně precipitační činidla použitá pro precípitaci biologicky aktivního agens mohou být získána z různých komerčních, přirozených nebo syntetických, zdrojů, které jsou v oboru dobře známy. Precipitační činidla bez omezení zahrnují polyvaientní kovové ionty nebo jejich solí, jako acetáty, citráty, chloridy, uhličitany, hydroxidy, oxaláty, tartréty nebo jejich hydroxidy, kyseliny nebo ve vodě rozpustné polymery. Konkrétně kovové ionty mohou bez omezení zahrnovat hliník, baryum, vápník, železo, mangan, hořčík, stroncium a zinek. Výhodně kovový ion je zinek nebo jeho soli, jako acetátchlorid. Mohou být také použity ve vodě rozpustné malé molekuly a soli, jako například síran amonný, aceton, etanol a glycerol.

• · • · ·

Co se týče ve vodě rozpustných polymerů, tyto bez omezení zahrnuji polyetylenglykol, kopolymery etylenglykol/propylenglykolu, karboxymetylcelulózu, dextran, polyvinylalkohol, polyvinylpyrolidon, poly-1,3-dioxolan, poly1,3,6-trioxan, kopolymery anhydridu etylenmaleinové kyseliny, polyaminokyseliny, dextran, póly(n-vinylpyrolidon) polyetylenglykol, homopolymery propylenglykolu, kopolymery polypropylenoxid/etylenoxídu, polyoxyetylované polyoly, polyvinylalkoholsukcínát, glycerin, etylenoxidy, propylenoxídy, poloxamery, alkoxylované kopolymery, ve vodě rozpustné polyaníonty, deriváty nebo jejich kombinace. Ve vodě rozpustný polymer může mít jakoukoliv molekulovou hmotnost a může být rozvětvený nebo nerozvětvený. Například výhodné molekulová hmotnost polyetylenglykolu je mezí přibližně 700 kD a přibližně 100 kD pro snadnou manipulaci a účinnost precipitace.

V závislosti na požadovaném terapeutickém profilu mohou být použity jiné velikostí a typy precipitačních činidel (např. požadované trvání prodlouženého uvolňování, účinek, biologická aktivita, snadnost manipulace, stupeň antígeničností nebo její nedostatek a další známé účinky požadovaného precipitačního činidla na terapeutický protein nebo analog). Odborník si uvědomuje další precipitační činidla, která jsou v rozsahu vynálezu.

Navíc přípravky podle předkládaného vynálezu mohou také zahrnovat dodatečné excipienty nezbytné pro stabilizaci biologicky aktivního agens a/nebo hydrofilního polymeru. Ty mohou být obsaženy v pufru a mohou bez omezení zahrnovat konzervační činidla.

• ·

Farmaceutické přípravky

Farmaceutické přípravky s prodlouženým uvolňováním podle předkládaného vynálezu mohou být podávány perorálně (např. tobolky jako například tvrdé tobolky a měkké tobolky, pevné přípravky jako například granule, tablety, pilulky, pastilky oplatky s práškem, pelety, prášek tekuté přípravky jako například pro parenterální podávání (např.

intramuskulární, subkutánní, transdermální, viscerální, i.v.

(intravenózní), i.p. (intraperitoneálni), intraarteriální, intrathekální, intrakapsulární, intraorbitální, injikovatelné, plicní, nazální, rektální a přípravky pro vstřebávání děložní sliznici).

nebo zdravotní bonbóny, a lyofilizované formy, suspenze) a přípravky

Obecně vynález zahrnuje farmaceutické přípravky s prodlouženým uvolňováním obsahující účinné množství proteinu nebo odvozených produktů, s přípravky pro prodloužené uvolňování podle vynálezu dohromady s farmaceuticky přijatelnými ředidly, konzervačními činidly, rozpouštědly, emulgátory, adjuvans a/nebo nosící potřebnými pro podávání. Viz PCT 97/01331 zahrnutou formou odkazu. Optimální farmaceutická formulace pro požadované biologicky aktivní agens bude odborníkem určena v závislosti na způsobů podávání a požadovaném dávkování. Příklady farmaceutických přípravků jsou popsány v publikaci Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publíshíng Co., 18. vyd., Easton, PA, 1435-1712, 1990).

Diky tixotropní povaze formulace zpožděného gelu mohou být použity injekční stříkačky pro subkutánní podávání. Přípravek může být gelovaten ve stříkačce pro pozdější injekci. Toto gelovatení se může provádět opožděným, t j. časově oddáleným způsobem. Časování je řízeno rozumným nastavením množství gelatínačního činidla a protonového donoru ve směsi, je-li nutné. Takový přípravek bude použit pro pozdější opětné gelovatění v organismu po injekci. Termín tixotropní, jak se zde používá, se týká viskozity gelové směsí, která se snižuje pod tlakem, např. pístem injekční stříkačky, čímž směs může protékat, např. jehlou stříkačky, a pak znovu vytvořit gel v místě injekce.

Koncepce opožděného gelovatění může být také aplikována na plnění stříkačky, kdy je přípravek gelu s prodlouženým uvolňováním naplněn do stříkačky a předvolený čas ve stříkačce geiovatí, např. několik minut až mnoho hodin po naplnění. Tím se zabrání problému plnění injekční stříkačky látkou, která jíž zgelovatěla. Tyto předem naplněné stříkačky mohou být uskladněny pro pozdější injekce pacientům.

Složky, které mohou být potřebné pro podávání zahrnují ředidla s různým obsahem pufru (např. Tris-HCl, acetát), pH a iontové síly, aditiva, jako například surfaktanty a rozpouštědla antioxidanty metabisulfít

HCO-60, polysorbát 80), askorbová, glutathion, (např. sodný, a nosičové inkorporace sloučeniny (napr. Tween 80, (např. kyselina sodný), další polysacharidy karboxymetyiceiulóza, alginát sodný, hyaluronát protaminsulfát, polyetylenglykol), konzervační činidla (např. Thimersol, benzylalkonol, metylparaben, propylparaben) látky či plnidla (např. laktóza, manit), látky do partikulárního přípravku polymerové jako napříkiad polymery nebo kopolymery polymléčné/polyglykolové kyseliny atd. nebo kombinované s lípozomy. Jako složka pro podáváni může být také použita kyselina hyaluronová a ta může ještě dále podporovat prodloužené setrvávání agens v oběhu. Kromě toho přípravky s prodlouženým uvolňováním podle předkládaného vynálezu mohou být také dispergovány s oleji (např. sezamový olej, kukuřičný olej, rostlinný olej) nebo jejich směsí s fosfolipidy (např. lecitin) čí triglyceridy mastných kyselin se středně dlouhým řetězcem (např. Miglyoi 812) za vzniku olejové suspenze.

··

Přípravky podle předkládaného vynálezu mohu být také dispergovány s dispergačními činidly, jako například ve vodě rozpustné polysacharidy (např. manit, laktóza, glukóza, škroby), kyselina hyaluronová, glycin, fibrin, kolagen a anorganické soli (např. chlorid sodný).

Kromě toho je také předpokládáno použití mechanických zařízení pro podávání přípravků s prodlouženým uvolňováním podle předkládaného vynálezu navržených pro plicní podávání terapeutických produktů, včetně, ale bez omezení, nebulizérů, inhalátorů odměřujících dávku a práškových inhalátorů, které jsou odborníkovi všechny známy.

Složky přípravku potřebné pro podávání mohou mít vliv na fyzikální a rychlost stav, stabilitu, rychlost uvolňování in vivo in vivo clearance předkládaných proteinů a derivátů. Odborníkovi jsou známy příslušné složky přípravku potřebné pro podávání a/nebo příslušná mechanická zařízení pro použití v závislostí na terapeutickém použití, způsobu podávání, požadovaném dávkování, době cirkulace, rezistencí k proteolýze, proteinové stabilitě a dalších důvodech.

Způsoby použití

Terapeutické použití

Terapeutické použití závisí na použitém biologicky aktivním agens. Odborník snadno upraví požadované biologicky aktivní agens podle předkládaného vynálezu pro jeho zamýšlené terapeutické použití. Terapeutické použití pro tyto agens je dále detailněji uvedeno v následujících publikacích, tímto zahrnutých formou odkazu včetně obrázků. Terapeutická použití zahrnují, ale bez omezení, použití proteinů jako (viz patenty Spojených Států č. 5 372 808, 5 541 293, 4 897 471 a 4 695 623, tímto zahrnuty formou odkazu včetně obrázků), interleukiny (víz patent Spojených Států č. 5 075 222, tímto • · • ·

zahrnut formou odkazu včetně obrázků), erytropoetiny (viz patenty Spojených Států č. 4 703 008, 5 441 868, 5 618 698, 5 547 933 a 5 621 080, tímto zahrnuty formou odkazu včetně obrázků), granulocytové kolonie stimulující faktor (viz patenty Spojených Států č. 4 999 291, 5 581 476, 5 582 823,

810 643 a PCT publikace Č. 94/17185, tímto zahrnuty formou odkazu .včetně obrázků), faktor kmenové buňky (PCT publikace č. 91/05795, 92/17505 a 95/17206, tímto zahrnuty formou odkazu včetně obrázků) a protein OB (víz PCT publikace č. 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 a 97/06816, tímto zahrnuty formou odkazu včetně obrázků).

Kromě toho, terapeutická použití podle předkládaného vynálezu zahrnuji použití biologicky aktivních agens jako jsou bez omezení produkty působící proti obezitě, inzulín, gastrin, prolaktin, adrenokortikotropní hormon (ACTHj, hormon stimulující štítnou žlázu (TSH), luteinizační hormon (LH), hormon stimulující folikuiy (FSH), lidský choríogonadotropin (HCG), motilin, ínterferony (alfa, beta, gama), interleukíny (IL-1 až 11-12), nádorový nekrotický faktor ÍTNF), protein vázající nádorový nekrotický faktor (TNF-bp), neurotrofícký mozkový faktor (BDNF), gliový neurotrofický faktor (GDNF), neurotrofický faktor 3 (NT3), fibroblastové růstové faktory (FGF), neurotrofický růstový faktor (NGF), kostní růstové faktory jako osteoprotegeriny (OPG), růstové faktory podobné inzulínu (IGF), faktor stimulující makrofágovou kolonií (M-CSF), faktor stimulující kolonie makrofágů a granulocytů (GM-CSF), megakeratinocytový růstový faktor (MGDF), trombopoetin, destičkový růstový faktor (PGDF), růstové faktory stimulující kolonie (CSF), kostní morfogenetický protein (BMP), superoxid-dismutáza(SOD), tkáňový aktivátor plazminogenu (TPA), urokináza, streptokináza a kalikrein. Termín proteiny, jak se zde používá, zahrnuje peptidy, polypeptidy, konsenzní molekuly, analogy, deriváty nebo jejích

ΦΦ Φ· φ · · φ

Φ··· φφφφ kombinace. Kromě toho mohou být přípravky podle vynálezu také použity pro výrobu jednoho nebo více léčiv pro léčení nebo zmírnění chorobného stavu, který je biologicky aktivní agens určeno léčit.

Příkladem terapeutického použití může být také dosažení oxygenace krve a snížení resorpce kosti nebo snížení osteoporózy bez úbytku hmotnosti.

Kombinované terapie

Přípravky podle vynálezu mohou s jinou léčbou, jako je změněná dieta jako jsou léky použitelné pro léčení být použity ve spojení a cvičení. Další léčiva, diabetů (např. inzulín, a eventuálně amylin), cholesterol a léky snižující krevní tlak (jako například léky, které snižuji hladiny krevních lipidů nebo jiné kardiovaskulární léky), léky zvyšující aktivitu (např. amfetaminy), diuretika (pro vylučování tekutin) a potlačovatele chuti. Jejích podáváni může být současné nebo mohou být podávány jeden po druhém. Kromě toho předkládaný způsob může být použit ve spojení s chirurgickými výkony, jako například kosmetickými chirurgickými výkony zaměřenými na změnu celkového vzhledu těla (např. líposukce nebo laserové chirurgické výkony zaměřené na redukci tělesné hmoty nebo implantacní chirurgické výkony zaměřené na zvětšeni tělesné hmoty). Zdravotní přinos kardiologických chirurgických výkonů, jako například bypassů nebo jiných chirurgických výkonů zaměřených na zmírněni škodlivého stavu způsobeného blokádou krevních cév tukovými depozity, jako jsou například arteriální plaky, může být zesílen současným použitím předkládaných přípravků a způsobů. Mohou být také použity způsoby pro odstranění žlučových kamenů, jako například ultrazvukovými nebo laserovými metodami, a to buď před, v průběhu nebo po kúře předkládaným terapeutickým způsobem. Mimoto mohou být předkládané způsoby použity jako doplněk chirurgických výkonů φφ φφ φφ < » φ » · · φ φφφ • · φ · φ • φ · · φφφφ φφφφ φφ φ φφφ φφ · φφφ > φφφ φφφφ φ φ φφφ •ΦΦ φφ φφφ nebo léčby zlomených kosti, poškozených svalů nebo další léčby, která může být zlepšena zesílením chabé tkáňové hmoty.

Dávkování

Odborník je schopen určit účinné dávkování prostřednictvím podávání léku a pozorováním požadovaného terapeutického účinku. Dávka přípravku s prodlouženým uvolňováním je množství nezbytné pro dosažení účinné koncentrace biologicky aktivního agens in vivo po dané časové období. Dávky a výhodná frekvence podáváni přípravku s prodlouženým uvolňováním kolísá podle typu biologicky aktivního agens, požadované doby uvolňování, cílové nemocí, požadované frekvenci podávání léku, předmětného živočišného druhu a dalších faktorech. Výhodně formulace molekuly bude taková, aby dávka přibližně mezi 0,10 pg/kg/den až 100 mg/kg/den poskytla požadovaný terapeutický účinek.

Účinné dávkování může být určeno s použitím diagnostických pomůcek v průběhu času. Jako přiklad poskytuje předkládaný vynález dávkování proteinu OB. Například diagnostika pro měření množství proteinu OB v krví (nebo plazmě či séru) může být nejdříve použita pro určení endogenních hladin proteinu OB. Takový diagnostický nástroj může být ve formě protilátkového testu, jako například protilátkový „sendvičový test. Nejdříve je kvantifikováno množství endogenního proteinu OB a je stanovena výchozí hodnota. Jsou určovány terapeutické dávky, zatímco kvantifikace endogenního a exogenního proteinu OB (tj. proteinu, analogu nebo derivátu nalezeného v těle, buď vytvořeného organismem nebo podaného) trvá v průběhu terapie. Například může být zpočátku potřebná relativně vysoká dávka, dokud není pozorován terapeutický přínos, a pak jsou použity nižší dávky pro udržení terapeutického přínosu.

Příklady provedení vynálezu

Materiál a metody

Materiál

Aíginát ve formě alginátu sodného může být nalezen ze zdrojů v oboru dobře známých. Protein OB a GCSF jsou od firmy Amgen lne., dalši chemikálie jsou ze zdrojů v oboru známých.

Příprava částíc/perel algínátového hydrogelu

Příprava částic a perel alginátového hydrogelu, s proteiny a bez proteinů, je detailně popsána v současně projednávané přihlášce Spojených Států 08/842 756, tímto zahrnuté formou odkazu.

Příprava opožděného gelu

Příprava opožděných algínátových hydrogelů, s proteiny a bez proteinů, je detailně popsána v současně projednávaných přihláškách Spojených Států 08/857 913 a 08/912 902, tímto zahrnutých formou odkazu.

Následující příklady jsou uvedeny pro úplnější vysvětlení a ilustraci vynálezu, ale nejsou zamýšleny jako omezující jeho rozsah. Kromě toho, s ohledem na výše uvedený popis nebo níže uvedené příklady, odborník je schopen učinit nezbytné změny popisů pro účely produkce ve velkém měřítku.

Příklad 1

Tento přiklad popisuje přípravu esteralginátů použitých v předkládaném vynálezu.

* · ·

• tt tt tt

Příprava A: tetrabutylammonium (TBA) alginát

Pryskyřice sulfonové kyseliny (Bio-rad, AG MP-50) je konvertována na formu tetrabutylammonia (TBA) ošetřením s tetrabutylammoniumhydroxidem (Aldrich) s použitím periodického postupu při teplotě místnosti. K roztoku 10 g sodné soli kyseliny alginové v 800 ml destilované vody je přidáno 60 ml sulfonové pryskyřice (Bio-rad, AG MP-50) ve formě tetrabutylammonné soli. Směs je míchána 0,5 hodiny pří teplotě místnosti. Pryskyřice je odstraněna filtrací a promyta destilovanou vodou. TBA alginát ve filtrátu je izolován lyofilizaci (výtěžek 16,8 g) a potvrzen ¹H NMR.

Příprava B: parciální etylester kyseliny alginové, stupeň esterifikace (DE) = 30 % (mol.).

g (14,4 mmol jednotek TBA) TBA alginátu je rozpuštěno v 500 ml dimetylsulfoxifu (DMSO) při teplotě místnosti. Pak je přidáno 673 mg jodoetanu (4,3 mmol, Aldrich). Směs je 15 hodin míchána ve 30 °C, a pak ochlazena na teplotu místnosti.

K tomuto roztoku je pomalu přidáván roztok 2 g NaCl ve 20 ml vody, aby bylo TBA úplné konvertováno na sodnou sůl. Po míchání 15 až 30 minut je roztok pomalu vléván do 1500 ml etylacetátu. Precipitát je sebrán filtrací a třikrát promyt acetonem/vodou (8:1 objem/objem) a třikrát acetonem, a poté je usušen ve vakuu. Sloučenina je opět rozpuštěna v -100 ml destilované vody a pH je upraveno na ~6,5 pomocí 0,2% NaHCO₃ v 0 °C. Roztok je pak dialyzován (limit MW 8000) přes noc proti destilované vodě ve 4 °C, a pak lyofilizován. Výtěžek parciálního esteru je 2,8 g a stupeň esterifikace je 30 ± 1 % (¹H NMR, jako vnitřní standard maleimid).

ti 9 9 9 «<*

9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9999 9999 99 999 99

Příprava C: úplný a parciální etylester kyseliny alginové, DE = 100 %, 50 %, 20 %, 10 % a 5 %.

Příprava těchto sloučenin je podobná přípravě popsané v přípravě B kromě toho, že množství přidaného jodoetanu je upraveno tak, aby bylo dosaženo požadovaného stupně esterifikace.

Příprava Ď: parciální propyl-, hexyl-, oktyl- a dodecylestery kyseliny alginové.

Přípravy jsou podobné postupům popsaným v přípravách B a C výše, ale jodoetan je substituován 1-jodopropanem, 1-jodohexanem, 1-jodooktanem nebo 1-jodočodekanem, co se každého týče.

Příprava E: parciální benzylester kyseliny alginové, DE = 30 %.

2,5 g Ί'ΒΑ alginátu (5,99 mmol jednotek TBA) je rozpuštěno v -200 ml DMlSO při teplotě místností. Je přidáno 307 mg benzylbromidu (1,8 mmol, Aldrich) a 30 mg TBA jodidu (Aldrich) . Směs je 15 hodin míchána ve 30 °C, a pak ochlazena na teplotu místnosti. K tomuto roztoku je pomalu přidáván roztok 0,6 g NaCl v 10 ml vody, aby bylo TBA úplně konvertováno na sodnou sůl. Po míchání 15 až 30 minut je roztok pomalu vléván do 500 ml etylacetátu. Precipitát je sebrán filtrací a třikrát promyt acetonem/vodou (8:1 objem/objem) a třikrát acetonem, a poté je usušen ve vakuu. Sloučenina je opět rozpuštěna v ~60 ml destilované vody a pH je upraveno na ~6,5 pomocí 0,2% NaHCO₃ v 0 °C, a pak je sloučenina dialyzována (limit MW 8000) přes noc proti destilované vodě ve 4 °C. Výtěžek parciálního esteru je 1,3 g a stupeň esterifikace je 30 ± 1 % ÚH NMR, jako vnitřní standard maleimid).

• · · • 9 ·

Příprava F: úplný a parciální benzylester kyseliny alginové s odlišným DE.

Příprava těchto sloučenin je podobná přípravě popsané v přípravě E kromě toho, že množství přidaného benzylbromidu a TBA jodidu je upraveno tak, aby byl dosažen požadovaný stupeň esterifikace.

Příklad 2

Následující příklad ukazuje přípravu etylesteralginátového (DE - 15 % (mol.) a 10 % (mol.)) gelu obsahujícího proteinové léčivo (leptin) a ín vitro prodloužené uvolňování proteinu z tohoto gelu.

100 mg/ml leptinu (lOmM Tris HCl, pH 8,8, pH upraveno z 8,0 na 8,8 s 1M NaOH) a 6% etylesteralginát (15 % (mol.), lOmM Tris HCl, pH 8,6) jsou chlazeny v ledové lázni. 0,5 ml leptinu je přidáno k 0,18 ml 6% etylesteralginátu a směs je míchána v ledové lázní 10 až 15 minut, konečné pH je 8,6 až 8,8. K této směsí je přidáno 16 μΐ suspenze 1M CaCO₃ a výsledná suspenze je dobře promíchána. K této suspenzi je po kapkách přidáván za míchání 100 μΐ roztoku 0,lM ŽnCL₂, pak je přidána voda na doplnění obejmu na 1 ml. Směs je kompletně promíchána a držena v ledové lázni 10 až 20 minut. Pak je do této směsi důkladně zamícháno 56 μΐ roztoku 1,68M δ-glukonolaktonu (Aldrích). Konečná směs (50 mg/ml leptin, 1% etylesteralginát, 0,1 mi) je nalita do vnitřku eppendorřovy zkumavky a ponechána přes noc ve 4 °C gelovatět. Po nočním uskladnění bylo provedeno in vitro uvolnění v lOmM histidinovém pufru, pH 7,4. Litý gel s 15 % (mol.) stupněm esterifikace projevuje minimální počáteční pulzní uvolněni a zcela konstantní uvolňování leptinu vykazující 60% uvolnění během šestí dnů.

♦ · 0 · 4 4 · • 000 · · * 0 000 0 0 0 0 0 0 0 a a 000 · e

00000000 00 0 0 íí 0» 0

Litý gel s 10 % (mol.) stupněm esteriiikace projevuje minimální počáteční pulzní uvolnění a zcela konstantní uvolňování leptínu vykazující 55% uvolněni během šestí dnů.

Přiklad 3

Tento příklad = 15 % (mol.) a léčivo (leptin) a

UKazuje pripravu nexylesteralginatoveho (DI3 10 % (mol.)) gelu obsahujícího proteinové rn vitro prodloužena uvolňovaní proteinu z tohoto gelu.

Tento příklad je prováděn podoionym zpusoioem jaký je v přikladu z kromě užiti etylesteralginatu.

Hexylesteralginátový gel s 15 % (mol.) a 10 % stupni esterífíkace projevuje minimální počáteční popsán (mol.) pulzní uvolnění a projevuje prodloužené uvolňování vykazující 50% uvolnění během šesti dnů.

Příklad 4

Následující přiklad ukazuje přípravu etylesteralginátového (DE = 15 % (mol.)) gelu obsahujícího proteinové léčivo (Znleptin) a in vitro prodloužené uvolňování proteinu z tohoto gelu.

K 0,75 ml roztoku 4% (hmotnost/objem) etylesteraiginátu (15 % (mol.)) je přidáno 7,5 μΐ 1M Tris HCI, pH 8,0, 33 μΐ 0,5M PIPES, pH 6,8 a 8,5 μΐ 0,lM ZnCÍ2· Směs je dobře promíchána. K tomuto roztoku je přidáno 675 μΐ Zn-leptinové suspenze (100 mg/ml) a směs je důkladně míchána. Do této směsi je důkladně zamícháno 24 μί suspenze 1M CaCO3 a 70 μί roztoku 1,68M δ-glukonolaktonu. 0,1 ml konečné směsi je nalita do vnitřku eppendorfovy zkumavky a ponechána přes noc ve gelovatět. Po nočním uskladnění bylo provedeno in °C v i tro uvolnění v lOmM histidinovém pufru, pn

7,4.

S 13 etylesterdlginátový gel projevuje malé počáteční pulzní uvolnění a prodloužené uvolňování leptinu vykazující 65% uvolnění během čtyř dnů.

(mol.) stupněm esterifíkace

Příklad 5

Následující přiklad ukazuje přípravu etylesteralginátového (DE = 30 % (mol.)) gelu obsahujícího proteinové léčivo (GCSF) a in vitro prodloužené uvolňování proteinu z tohoto gelu.

K 0,5 ml roztoku 2,39% etylesteralginátu (30 % (mol.)) je přidáno 100 μΐ 0,lM acetátového pufru (pfi 4,5), 104 μΐ GCSF (48,2 mg/ml, HCI pH 3) a 24 6 ml destilované vody. Směs je dobře promíchána. Do této směsi je důkladně zamícháno 10 μΐ suspenze 1M Cah'PO₄ a 40 μΐ roztoku 1,68M δ-glukonolaktonu. 0,2 ml konečné směsi jsou nality do vnitřku eppendorfovy zkumavky a ponechány přes noc ve 4 “C gelovatět. Po nočním uskladnění gelu bylo provedeno in vitro uvolnění v lOrnM Tris pufru, pH 7,5. Litý ety lesteralg inátový gel s 30 % (mol.) stupněm esterifíkace projevuje méně než 5% počáteční pulzní uvolnění a prodloužené uvolňování leptinu vykazující 20% uvolnění během jednoho dne a 40% uvolněni během 2 dnů.

Příklad 6

Následující příklad ukazuje přípravu etylesteralginátového (DE = 30 % (mol.)) gelu obsahujícího proteinové léčivo (GCSF) a in vitro prodloužené uvolňování proteinu z tohoto gelu.

* I • · • 9

9 9 9 9999

Λ· ·

Tento příklad je prováděn podobným způsobem, jaký je popsaný v příkladu 5, kromě toho, že etylester je nahrazen benzylesteralginátem. Esteralginát gelovatí během doby nočního uložení. Benzylesteralginátový gel s 30% stupněm esterifikace projevuje méně než 5% počáteční pulzni uvolnění a prodloužené uvolňování leptinu vykazující 40% uvolnění během jednoho dne a 80% uvolněni během 2 dnů.

Příklad 7

Tento přiklad ukazuje přípravu perel z etylesteralginátu.

Gelové perly jsou připraveny přidáváním roztoku 2% esteralginátu po kapkách do roztoku lOOmM chloridu vápenatého (destilovaná voda nebo pufr 1M Trls HCI, pH 7,0). Vytvořené perly jsou promyty destilovanou vodou nebo pufrem. Perly jsou připraveny s použitím buď 30% nebo 50% stupně esterifikace.

Příklad 8

Tento příklad ukazuje přípravu esteraiginátových perel obsahujících leptín.

Perly jsou připraveny přidáváním roztoku 25 mg/ml leptinu ve 2% etylesteralginátu(Tris HCI, pH 8,7) po kapkách do roztoku lOOmM chloridu vápenatého a 25mM chloridu zinečnatého. Perly jsou připraveny s použitím 30% stupně esterifikace. Perly vykazuji prodloužené uvolňování leptinu in vitro.

«« « *» • * « · · 9 • · 4 » 4 4 • · 4 9 ·

999 99

Příklad 9

Tento příklad ukazuje rozpad (nebo degradaci) molekul esteralgínátů s vysokou molekulovou hmotností v pufrech s neutrálním fyziologickým pH.

1% roztok esteralgínátů je rozpuštěn buď ve fosfátovém pufru (0,'lM fosfát sodný, pH 6,8) nebo v O,1M Tris pufru (pH 7,0) a inkubován ve 37 °C. Rozpad molekulové hmotnosti je určován měřením snižování viskozity roztoku (Brookfield, 25 °C) ve vybraných časových intervalech. Bylo nalezeno, že nemodifikovaný alginát sodný je relativně stabilní, poněvadž jeho viskozita se snížila pouze o 5 % během 8 dnů (fosfátový pufr), ale u etyl- a benzylesterů kyseliny algínové (DE = 30%) viskozita poklesla o 35 % během 8 dnů ve stejném pufru. Stupeň degradace esterů kyseliny algínové je také závislý na stupni esterifikace, např. u etylesteru nižšího stupně esterifikace (DE = 15%) viskozita poklesla o 25 % během 8 dnů. Tudíž rozpad molekulové hmotnosti má přímý vztah ke stupni esterifikace.

Příklad 10

Tento příklad ukazuje in vivo degradaci (nebo postupný úbytek) esteralginátových hydrogelů bez proteinu a hydrogelů obsahujících protein.

Esteralginátové gely jsou připraveny podobným způsobem jaký je popsaný v příkladu 3, ale konečná směs je nabrána do stříkačky a ponechána gelovatět ve stříkačce ve 4 °C přes noc. Pak je injikováno 100 μΐ gelu subkutánně do zadní části krku myší (Charles River, samice.staré 12 týdnů, BDF1, 20 g, 5 myší ve skupině) a místo je periodicky chirurgicky vyšetřováno na různých Členech skupiny.

Při použití etyl- a benzylesteralginátové materiály s DE = 30 % ukazují výsledky studie s jedním místem injekce, že esteralginátový hydrogel vymizí během 2 týdnů. Při použití etylesteralginátového gelu s ĎE = 15 % se gely vyskytují ještě

30. a 61. den, ale mají menší etylesteralginátového gelu s DE = 5 30. a 61. den, s malým zmenšením nesubstituovaného alginátů sodného beze změny po 61. dnu.

velikost. Při použití % se gely vyskytují ještě velikosti. Při použití přetrvává gel relativně

Rychlost úbytku esteralginátových gelů s proteinem nebo bez proteinu je stejná.

Příklad li

Tento příklad poskytuje data o ztrátě a farmakokinetická data pro esteralginátové obsahující leptin u laboratorního potkana.

hmotnosti hydrogely

Esteralginátové gely jsou připraveny podobným způsobem jaký je popsaný v přikladu 4, ale konečná směs je nabrána do stříkačky a ponechána gelovatět ve stříkačce ve 4 °C přes noc. Potkanům je podána dávka jako bolus 0 mg/kg (kontroly) a 100 mg/kg, pak jsou sedm dnů sledovány krevní hladiny a úbytek hmotnosti.

Výsledky ukázaly: esteralginát s DE = 5 % (mol.) projevoval rovnoměrnou krevní hladinu -2000 ng/ml po 3 dny, pak hladina klesla na 2 - 3 ng/ml po další 3-4 dny, esteralginát s DE = 15 % (mol.) projevoval rovnoměrnou krevní

hladinu	-2000 ng/ml po 2	dny, pak hladina klesla	na 2 - 3
ng/ml v	5 dnech, esteralgi	.nát s DE = 30 % (mol.)	projevoval
rovnoměrnou krevní hladinu	-2000 ng/ml 1 den, která	se snížila
na 2 - :	3 ng/ml ve 4 dnech,	krevní hladina suspenze	Zn-leptínu
vrcholil	a za 12 hodin, a	pak se snížila na 1-2	ng/ml v 6

«··· · · ·· dnech. U všech zvířat se projevila ztráta hmotnosti ukazující, že Zn-leptin je aktivní. Výsledky také ukázaly, že inkorporace Zn-leptínu do etylesteralginátových gelů (DE = 5 % (mol.) a 15 % (mol.)) téměř zdvojnásobila (faktor 1,8 - 1,9) oblast pod křivkou (AUC) Zn-leptinu, což svědčí pro zdvojení biologické dostupnosti, a použití etylesteralginátového gelu (DE = 30 % (mol.)) ukázalo stejnou biologickou dostupnost Zn-leptinu, na základě AUC.

Claims (30)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Přípravek s prodlouženým uvolňováním se zpožděným gelem vyznačující se tím, že obsahuje:

   a) hydrofilní polymer,

   b) biologicky aktivní agens, a

   c) alespoň jeden navázaný polyvalentní kovový ion, přičemž gel je biologicky odbouratelný.
2. 2. Přípravek s prodlouženým uvolňováním podie nároku 1 vyznačující se tím, že navázaný polyvalentní kovový ion je směs' navázaného a nenavázaného polyvalentního kovového iontu.
3. 3. Přípravek s prodlouženým uvolňováním se zpožděným gelem podle nároku lvyznačující se tím, že dále obsahuje excipienty pro stabilizaci biologicky aktivního agens nebo hydrofilního polymeru.
4. 4. Přípravek podle nároku 1 vyznačující se tím, že navázaný polyvalentní kovový ion je sůl vybraná ze skupiny obsahující acetáty, fosfáty, laktáty, tartráty, citráty, chloridy, uhličitany nebo jejich hydroxidy.
5. 5. Přípravek podle nároku 4 vyznačující se t í m, že kovový ion je vybraný ze skupiny obsahující mangan, stroncium, železo, hořčík, vápník, baryum, měď, hliník nebo zinek.
6. 6. Přípravek podle nároku 5 vyznačuj ící tím, že kovový ion je vápník.

   • ·
7. 7. Přípravek podle nároku 1 vyznačujíc! s tím, že dárce protonu je z kyselého zdroje.
8. 8. Přípravek podle nároku 7 vyznačujíc! s t 1 rn, že kyselý zdroj je vybrán ze skupiny obsahující pufry estery, pomalu se rozpouštějící kyseliny nebo laktony.
9. 9. Přípravek podle nároku 1 vyznačující s t i rn, že hydrofilní polymer je polyanion.
10. 10. Přípravek podle nároku 1 vyznačující s t i m, že hydrofilní polymer je polysacharid.

    11. Přípravek podle nároku 10 vyzná č u j - Lei s t i rn, že polysacharid je kyselý polysacharid. 12. Přípravek podle nároku 11 vyzná č u 3 - Lei s t i rn, že polysacharid je alginát • 13. Přípravek podle nároku 12 vyzná č u j - Lei s

    t i rn, že alginát obsahuje alespoň 30 % guluronové kyseliny.
11. 14. Přípravek podle nároku 12 vyznačující s tím, že alginát tvoří alespoň 0,05 % (hmotnostních).
12. 15. Přípravek podle nároku 1 vyznačující s t i rn, že biologicky aktivní agens obsahuje protein přípravek prokazuje zlepšenou biologickou dostupnost.
13. 16. Přípravek podle nároku 15 vyznačující s tím, že obsah proteinu je alespoň 0,001 mg/ml.

    Φ Φ φ · · · φ * · · • φφ φ φ φφφ φ φφφ φ φφφφ φφφ φ Φφφφ φφφφ φ φφ φφφ φφφ φφφφ φφφφ ·» φφφ ·Φ φφφ
14. 17. Přípravek podle nároku 15 vyznačující se tím, že protein je vybrán ze skupiny obsahující hemopoetické faktory, faktory stimulujici kolonie, faktory působící proti obezitě, růstové faktory, trofícké faktory a protizánětlivé faktory.
15. 18. Přípravek podle nároku 15 vyznačující se tím, že protein je vybrán ze skupiny obsahující leptin, GCSP, SCF, BDNF, GDNF, N'i'3, GM-CSF, IL-lra, 1L2, TNF-bp, MGDF, OPG, interferony, erytrpoetin, KGF, inzulín a jejich analogy nebo deriváty.
16. 19. Přípravek podle nároku 1 vyznačující se tím, že biologicky aktivní agens je komplexované biologicky aktivní agens.
17. 20. Přípravek podle nároku 19 vyznačující se tím, že komplexované biologicky aktivní agens je precipitovaný protein.
18. 21. Přípravek podle nároku 20 vyznačující se tím, že precipitovaný protein je precipitát zinek-leptinu.
19. 22. Způsob výroby přípravku se zpožděným gelem s prodlouženým uvolňováním, přičemž gel je biologicky odbouratelný, vyznačující se tím, že způsob zahrnuje kroky:

    a) smíchání biologicky aktivního agens a hydrofilního polymeru v rozpouštědle za vzniku první směsi,

    b) přimíšení alespoň jednoho navázaného polyvalentního kovového iontu k první směsi za vzniku druhé směsi.

    • · · · ♦ · ·* • · · · · «v *· » ·*
20. 23. Způsob podle nároku 22 vyznačující se tím, že dále obsahuje krok c) přimíšení k druhé směsi alespoň jednoho čonoru protonů schopného uvolnění navázaného polyvalentního kovového iontu.
21. 24. Způsob podle nároku 22 vyznačující se tím, že první směs je koncentrována před přimíšením donoru protonů nebo navázaného polyvalentního kovového iontu.
22. 25. Způsob podle nároku 22 vyznačující se tím, že navázaný polyvalentní kovový ion je sůl vybraná ze skupiny obsahující acetáty, fosfáty, laktáty, tartráty, citráty, chloridy, uhličitany nebo jejich hydroxidy.
23. 26. Způsob podle nároku 22 vyznačujíc! se tím, že uvedený způsob zajišťuje v podstatě konstantní krevní hladinu biologicky aktivního agens po časové období u pacienta.
24. 27. Přípravek podle nároku 24 vyznačující se tím, že kovový ion je vybraný ze skupiny obsahující mangan, stroncium, železo, hořčík, vápník, baryum, měď, hliník nebo zinek.
25. 28. Přípravek podle nároku 26 vyznačující se t 1 m, že kovový ion je vápník.
26. 29. Přípravek podle nároku 23 vyznačující se tím, že dárce protonu je z kyselého zdroje.
27. 30. Přípravek podle nároku 28 vyznačuj ící se t í m, že pomalu se rozpouštějící kyselina je vybrána ze •· ·· 9 9 9 99

    9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

    9 9 9 9 9 9 9 9 9

    9 9 9 9 9 9 9

    9999 9999 99 999 99 skupiny obsahující pufry, estery, pomalu se rozpouštějící kyseliny nebo iaktony.
28. 31. Přípravek podle nároku 29 vyznačující se t í m, že kyselý zdroj je δ-glukonolakton.
29. 32. Přípravek podle nároku 22 vyznačující se t í rn, že hydrofilní polymer je polyanion.
30. 33. Přípravek podle nároku 22 vyznačující se t í rn, že hydrofilní polymer je polysacharid.

    34. Přípravek podle nároku 32 vyznačuj t í rn, že polysacharid je kyselý polysacharid. i c í se 35. Přípravek podle nároku 33 vyznačuj í o i se t í m, že polysacharid je alginát. 36. Přípravek podle nároku 34 vyznačuj í c í se t í rn, že alginát obsahuje alespoň 30 % guiuronové kyseliny. 37. Přípravek podle nároku 34 vyznačuj i c 1 se t í rn, že alginát tvoří alespoň 0,05 % (hmotnostních ) · 38. Přípravek podle nároku 22 vyznačuj i c 1 se t 1 rn, že biologicky aktivní agens obsahuje protein. 39. Přípravek podle nároku 37 vyznačuj i 0 i se

    tím, že obsah proteinu je alespoň 0,001 mg/ml.

    40. Přípravek podle nároku 37 vyznačující se t í m, že protein je vybrán ze skupiny obsahující hemopoetické faktory, faktory stimulující kolonie, faktory působící proti obezitě, růstové faktory, trofické faktory a protizánětlivé faktory.

    41. Přípravek podle nároku 37 vyznačující se t i rn, ze protein je vybrán ze skupiny obsahující leptin, G-CSF, SCF, BDNF, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-lra, IL2, TNF-bp, MGDF, OPG, interferony, ěrytrpoetin, KGF, inzulín a jejich analogy nebo deriváty.

    42 . Přípravek podle nároku 22 v y z n a č u j i c i s e t i rn, že biologicky aktivní agens je kornplexované biologicky aktivní agens. 4 3 . Přípravek podle nároku 41 v y z n a č u j i c i s e t i rn, že kornplexované biologicky aktivní agens je

    precipitovaný protein.

    44. Přípravek podle nároku 42 vyznačující se t i m, ze precipitovaný protein je precipitát zinek-leptinu.

    45. Způsob podle nároku 22 vyznačující se t í rn, že dále obsahuje krok izolace přípravku s prodlouženým uvolňováním.

    46. Přípravek s prodlouženými uvolňováním vyznačující se ti m, že byl vyroben způsobem podle nároků 22 nebo 44.

    47. Farmaceutický přípravek vyznačující se t i rn, že obsahuje přípravek s prodlouženým uvolňováním podle nároků 1, 2, 3 nebo 45 ve farmaceuticky přijatelném nosiči, ředidle nebo adjuvans.

    Farmaceutický přípravek podle nároku čující se tím, že přípravek je v injekční

    Způsob indikované léčby vyznačující se se léčí přípravkem s prodlouženým uvolňováním podle 2, 3 nebo 45 ve farmaceuticky přijatelném nosiči.

    48.

    vyzná stříkačce

    49.

    t í rn, že nároků 1, ředidle nebo adjuvans.

    50. Způsob léčby chorobného stavu vybraného ze skupiny obsahující nadměrnou hmotnost, diabetes, vysokou hladinu krevních lipidů, arteriální _ sklerózu, arteríální pláty, redukci nebo prevencí tvorby žlučových kamenů, nedostatečnou chabou tkáňovou hmotu, nedostatečnou citlivost na inzulín, a mozkovou mrtvici, vyznačující se tím, že používá přípravek s prodlouženým uvolňováním podle nároků 1, 2, 3 nebo 45 ve farmaceuticky přijatelném nosiči, ředidle nebo adjuvans, přičemž biologicky aktivní agens je ieptin, jeho analog nebo derivát.

    51. Způsob léčby chorobného stavu vybraného ze skupiny obsahující deficit hemopoetických buněk, infekci a neutropenii vyznačující se tím, že používá přípravek s prodlouženým uvolňováním podle nároků 1, 2, 3 nebo 45 ve farmaceuticky přijatelném nosiči, ředidle nebo adjuvans, přičemž biologicky aktivní agens je G-CSF, jeho analog nebo derivát.

    52. Způsob léčby zánětu vyznačující se tím, že používá přípravek s prodlouženým uvolňováním podle nároků i, 2, 3 nebo 45 ve farmaceuticky přijatelném nosiči, ředidle nebo adjuvans, přičemž biologicky aktivní agens je IL-lra, jeho analog nebo derivát.

    ·· ·· *« « ·« • · · · · · ·· tf · · • 9 9 9 9 9 9 9 9 9

    9 9 9 9 9 9 9 9

    999 9999 99 999 99 999

    53. Přípravek s prodlouženým uvolňováním vyznačující se tím, že obsahuje:

    a) hydrofilní polymer,

    b) biologicky aktivní agens, a

    c) alespoň jedno precipitační činidlo, přičemž biologicky aktivní agens je společně precipitováno s hydrofilním polymerem, přičemž přípravek je ve formě gelové částice a částice je biologicky odbouratelná.

    54. Přípravek podle nároku 52 vyznačující se tím, že precipitační činidlo je vybráno ze skupiny obsahující polyvalentní kovový ionty nebo soli, acetáty, citráty, chloridy, uhličitany nebo jejich hydroxidy.

    55. Přípravek podle nároku 53 vyznačující se t í m, že kovový ion je vybraný ze skupiny obsahující mangan, stroncium, železo, hořčík, vápník, baryum, měď, hliník nebo zinek.

    56. Přípravek podle nároku 52 vyznačující se tím, že precipitační činidlo je vybráno ze skupiny obsahující zinek, vápník nebo jejich kombinaci.

    57. Přípravek podle nároku 52 vyznačující se tím, že hydrofilní polymer je polysacharid.

    58. Přípravek podle nároku 56 vyznačující se tím, že polysacharid je alginát.

    59. Způsob výroby přípravku s prodlouženým uvolňováním vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

    ·· ··

    4 4 4

    a) rozpuštění biologicky aktivního agens a hydrofilního polymeru v rozpouštědle za vzniku první směsi,

    b) rozpuštění alespoň jednoho precipitačního činidla v rozpouštědle za vzniku druhé směsi,

    c) společná precipitace biologicky aktivního agens s hydrofilním polymerem za vzniku společně precipltované gelové částice, přičemž částice je biologicky odbouratelná.

    60. Způsob podle nároku 58 vyznačující se t i m, že dále obsahuje krok izolace společně precipltované částice.

    61. Přípravek vyznačuj ící podle nároku 59.

    prodlouženým uvolňováním tím, je vyrobený způsobem

    62. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, podle nároku 52 že přípravek je ve farmaceuticky přijatelném nosiči, ředidle nebo adjuvans.

    63. Způsob indikované léčby vyznačující se tím, že se léčí přípravkem s prodlouženým uvolňováním podle nároků 52 ve farmaceuticky přijatelném nosiči, ředidle nebo adjuvans.