HUP0001729A2 - Transzgenikus növények - Google Patents
Transzgenikus növényekInfo
- Publication number
- HUP0001729A2 HUP0001729A2 HU0001729A HUP0001729A HUP0001729A2 HU P0001729 A2 HUP0001729 A2 HU P0001729A2 HU 0001729 A HU0001729 A HU 0001729A HU P0001729 A HUP0001729 A HU P0001729A HU P0001729 A2 HUP0001729 A2 HU P0001729A2
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- plant
- dna
- sequence
- plants
- seq
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
- C12N9/1092—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
- C12N15/8275—Glyphosate
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
A találmány tárgyát transzgenikűs cűkőrrépanövények képezik, amelyek acp4/epsps enzimaktivitás expressziója következtében elviselik ahektárőnként 4-18 liter Rőűndűp-rel való kezelést. A növényeket aspecifikűs integrációs pőntők alapján lehet jellemezni. A találmánytárgyát képezik tővábbá az említett növényekből nyert magők, valamintaz említett növények szapőrítására szőlgáló eljárásők. ŕ
Description
KÖZZÉTÉTELI ' ' PÉLDÁNY SBC.&K
Nemzetközi
Szabadalmi Iroda
H-1062 Budapest, Andrássy út 113.
68.369/SZE Telefon: 34-24-950, Fax: 34-24-323
Transzgenikus növények
A jelen találmány tárgyát olyan transzgenikus cukorrépa növények képezik, amik elviselik a herbicid kezelést, glifozátot alkalmazva aktív adalékanyagként.
A cukorrépa-földeken a gazdálkodó számára nagy problémát jelentenek a gyomnövények. Versengenek a terménnyel, ezáltal csökkentik a termést. Ma nincs egyetlen olyan herbicid sem, amely képes hatékonyan gátolni az összes gyomnövényt, anélkül hogy károsítaná a cukorrépát magát [Miller és mtsai: J. Sugar Beet Res. 26, 3-4 (1989)]. A gyakorlatban a gazdálkodók herbicidek keverékeit használják, amik viszont a termény növekedését is gátolják. Az elmúlt időszakban azonban számos gyomnövény rezisztenciát fejlesztett ki az említett herbicidekkel szemben, és ezeknek a száma folyamatosan nő [Schweitzer és mtsai: J. of Sugar Beet Research 28, 1-23 (1991)], ami súlyosbítja a gyomnövények által okozott problémát a cukorrépa-földeken.
A Roundup® egy széles spektrumú, a környezetvédelmi szempontok miatt előnyben részesített herbicid, ami gátolja mind a növények, mind a termények növekedését. A jelen találmány összefüggésében egy liter Roundup® herbicid oldat aktív adalékanyagként 360 g (a.i.) glifozátot (ez az N-foszfonometil-glicin közönséges neve) tartalmaz, amit a levélzet felvesz. A húszéves használat során eddig még nem találtak olyan gyomnövényt, ami glifozát rezisztenciát fejlesztett ki [Holt és mtsai: Annu. Rev. Plant it - 2 - ·. :···.··.:
·· ··· ····« 4 • · · · · · ·
Physiol. (1993)]; emellett a cukorrépában sem fejlődött ki természetes glifozát rezisztencia. Azonban a Roundup® megjelenés előtti alkalmazása hatékonyabb gyomnövény gátlásnak túnik a cukorrépa-földeken mint a cukorrépa termesztésében gyakran használt herbicid kombinációk, amik phenmediphant, metamitront és ethofumesate-ot tartalmaznak [Madsen és mtsai: Weed Res. 35, 105-111(1995)].
A glifozát gátolja az aromás aminosavak bioszintézisét, azáltal, hogy irreverzibilisen kötődik az 5-enolpiruvilshikimát-3-foszfát szintázhoz (epsps). A kloroplaszton belül ez az enzim katalizálja a shikimát-3-foszfát és a foszfoenolpiruvát reakcióját, amiből 5enolpiruvilshikimát-3-foszfát és foszfát keletkezik. Közvetlenül egy héttel a herbicid alkalmazása után, látható hatások figyelhetők meg, ide tartozik a hervadás, a sárgulás, amit követ a teljes barnulás, a növényi szövetek tönkremenetele, majd a gyökerek szétesése.
Ahhoz, hogy a terményfajokra átvigyük a glifozát rezisztenciát, arra koncentráltunk, hogy a glifozát rezisztencia fokozására képes epsps gént bevigyük a növényekbe. A növények mellett a baktériumok és a gombák is eredendően expresszálják az epsps enzim aktivitást. Az Agrobactedum sp. CP4-böl származó cp4/epsps-ről kiderült, hogy toleranciát biztosít a glifozáttal szemben [Barry és mtsai: “Inhibitors of Amino Acid Biosynthesis: Strategies for Imparting Glyphosate Tolerance to Crop Plants”, in: Biosynthesis and Molecular Regulation of Amino Acids in Plants, 139-145. oldal; szerk.: Singh és munkatársai; American Society of Plant Physiologists (1992)]. A cp4/ epsps génnek szójababba és olaj repcébe való bevitele megnövelte a toleranciát a herbicid levélzetre való alkalmazása során, szántóföldi körülmények között [Delannay és mtsai: Crop Sci. 35, 1461-1467 (1995); Padgette és mtsai: Crop Sci. 35, 1451-1461 (1995)].
Az Achromobacter sp. LBAA törzsből izolált glifozát-oxidáz reduktáz (gox) enzim [Barry és mtsai: “Inhibitors of Amino Acid Biosynthesis: Strategies for Imparting Glyphosate Tolerance to Crop Plants”, in: Biosynthesis and Molecular Regulation of Amino Acids in Plants, 139-145. oldal; szerk.: Singh és munkatársai; American Society of Plant Physiologists (1992)] a glifozátot aminometil foszfonsavra bontja le, ami nem toxikus a növényre. A cp4/epsps és glifozát oxidáz (gox) gének kombinációját sikeresen alkalmazták transzgenikus búza előállítására [Zhou és mtsai: Plant Cell Rep. 15, 159-163 (1995)], ami elviseli a glifozátot.
A jelen találmány tárgya olyan cukorrépa növények előállítása, amik olyan dózisban viselik el a glifozátot, ami elég ahhoz, hogy optimális herbicid aktivitást kapjunk. Az ilyen növények tovább javíthatók, ha kiváló cukorrépa vonalakkal visszakeresztezzük őket, amivel optimalizálni lehet az agronómiái tulajdonságokat, azaz például a termést, a kórokozó-rezisztenciát, stb.
A cukorrépát Agrobacterium tumefaciens által közvetített transzformációval lehet transzformálni [Fry és mtsai: Third International congress of plant mol. biol., Tuscon, Arizona, USA; D'Halluin és mtsai: Bio/Technology 10, 309-314 (1992); Konwar: J. Plant Biochem. & Biotech. 3, 37-41 (1994)]. Az Agrobacterium által közvetített transzformáció gyakran azt eredményezi, hogy egynél több T-DNS kópia integrálódik a növény genomjába. Az in- 4 - · ···· ·· · • · ·· ·· · tegrálandó gént előnyösen úgy juttatjuk be a T-DNS-be, hogy a TDNS jobb széléhez közel integrálódjon, ami a bal széllel ellentétben majdnem mindig transzferálódik a növénybe.
A jelen találmány szerinti növények elviselik a kezelést, amit hektáronként több mint körülbelül 3x6 liter Roundup® herbiciddel végzünk (körülbelül 18 liter per hektár). A jó gyomirtó hatás eléréséhez szükséges teljes standard dózis körülbelül 4-6 liter per hektár között változik, a gyomosodás mértékétől függően. Ezeknél a koncentrációknál a herbicid kezelésnek nincs kimutatható hatása a növény életképességére és a levelek klorózisára. A találmány szerinti növények által mutatott toleranciát a transzgenikusan expresszált cp4/epsps aktivitás okozza. A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módját 1997. október 24-én helyeztük letétbe a National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited-nél (23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Skócia, Nagy-Britannia), 97087006/2 letéti számon.
Tehát a jelen találmány tárgyát olyan cukorrépa növény képezi, beleértve az utódait is, ami cp4/epsps enzimaktivitást expresszál. Pontosabban, a találmány tárgyát egy olyan cukorrépa növény képezi, beleértve a növény utódait is, ami elviseli a körülbelül 4-18 liter per hektár Roundup-pal való kezelést.
A jelen találmány szerinti növényeket rutinszerű, Agrobacterium által közvetített transzformációval lehet előállítani, olyan transzformációs vektorral, ami a T-DNS határoló szekvenciái között az 5. számú szekvenciavázlaton bemutatott, cp4/epsps-t kódoló DNS darabot tartalmaz.
- 5 - : ;··· : • · ··· ····· • · · · · · ·
Meglepő módon, a jelen találmány oltalmi körén belül kiderült, hogy egy transzformációs esemény (RRMax), aminél a T-DNS bal- és jobboldali határoló szekvenciái nincsenek meg a transzgenikus genomban, és a transzformáló vektor DNS jelentős részének delécióját eredményezi, miközben megtartja a cp4/epsps-t kódoló DNS-t, kiváló glifozát toleranciát biztosít. Pontosabban, egy DNSdarabot, amit az 1. számú szekvenciavázlattal lehet leírni, a genomnak egy erősen ismétlődő régiójába integrálódva találtunk meg, ami ezzel egyidöben helyettesíti az említett ismétlődő genomiális szekvenciát. A genomiális DNS, ami a transzgén szekvencia azon részének közvetlen szomszédságában található, ami a használt transzformációs vektorban a T-DNS jobboldali határoló szekvenciájához kapcsolódik, a 2. számú szekvenciavázlaton bemutatott szekvenciával rendelkezik. Az integrált transzgenikus DNS másik végének közvetlen szomszédságában levő genomiális DNS szekvenciáját a 3. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be. Az újonnan képződött genomiális DNS elrendeződés teljes DNS szekvenciáját a 4. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be.
Ennek megfelelően, a jelen találmány tárgyát olyan cukorrépa növény képezi, beleértve a növények utódait is, amikben az 1. számú szekvenciavázlaton bemutatott DNS a növény genomjának részét képezi, és az említett nukleotid szekvencia előnyösen a növény genomjának erősen ismétlődő szakaszait helyettesíti.
Egy olyan cukorrépa növényt, valamint azok utódait részesítjük előnyben, amiben a genomnak az említett nukleotid szekvenciához közvetlenül kapcsolódó részeit a 2. és 3. számú szekvenciával lehet leírni.
- 6 - ::***.**.:
• ·· · ·♦ ·
Előnyben részesítünk továbbá egy olyan cukorrépa növényt, beleértve az utódait is, amiben a 4. számú szekvenciavázlaton bemutatott DNS szekvencia a növény genomjának részét képezi.
A transzgenikus magvakba és növényekbe génsebészeti módszerekkel bevitt herbicid toleranciát szexuális szaporodással vagy vegetatív növekedéssel lehet továbbadni, ily módon az utódnövényekben fenn lehet tartani és szaporítani lehet. Általánosságban a fenntartás és szaporítás során azokat az ismert mezőgazdasági módszereket alkalmazzuk, amiket specifikus célok, azaz például talajmüvelés, magvetés vagy betakarítás elérése céljából fejlesztettek ki. Mivel a növekedő termény érzékeny a rovarok és fertőzések által okozott támadásokra és károsodásokra, intézkedéseket tesznek, hogy gátolják a növényi betegségeket, a rovarokat, a fonalférgeket és más káros körülményeket, hogy növeljék a termést. Ezek közé tartoznak mechanikai műveletek, azaz például a talaj felszántása, vagy a fertőzött növények eltávolítása, valamint a mezőgazdasági vegyszerek, azaz például a fungicidek, gametocidek, nematocidek, növekedés-szabályozók, érést gyorsító ágensek és rovarirtó szerek alkalmazása.
A találmány szerinti transzgenikus növények és magvak herbicid toleranciáját tovább használhatjuk a növénynemesítésben, aminek az a célja, hogy javított tulajdonságú növényt fejlesszünk ki, azaz például javuljon a kártevők, herbicidek vagy stressz elleni toleranciája, javuljon a tápértéke, nőjön a termése, vagy javuljon a struktúrája, ami a megdőlésből vagy összetörésből származó veszteséget csökkenti. A különböző nemesítési lépéseket jól definiált emberi beavatkozások jellemzik, azaz például a keresztezendő
- 7 - : :··· .··.:
• · ··· ····· • · · · ·· · vonalak megválasztása, a szülővonalak beporzásának irányítása, vagy a megfelelő utódnövények kiválogatása. A kívánt tulajdonságoktól függően más és más nemesítési lépéseket kell alkalmazni. A megfelelő technikák jól ismertek a szakterületen, ide tartozik, anélkül hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a hibridizáció, a beltenyésztés, a visszakeresztezés, a többvonalas keresztezés, a variáns keverés, az interspecifikus hibridizáció, az aneuploid technikák, stb. így a találmány szerinti transzgenikus magvak és növények használhatók a javított növényi vonalak nemesítésére, ami például fokozza a hagyományos módszerek, azaz például a herbicid vagy peszticid kezelés hatékonyságát, vagy lehetővé teszi a szétosztást az említett módszerekkel, a módosított genetikai tulajdonságaik alapján. Egy másik változat szerint javított stressztűrő képességű új termények kaphatók, amik, az optimalizált genetikai “berendezésük” révén jobb minőségű betakarított termést eredményeznek, amik nem voltak képesek elviselni az összehasonlítható káros fejlődési körülményeket.
A vetőmagtermelés során a csirázási minőség és a magvak egyöntetűsége lényeges termék-jellemzők, míg a gazdálkodók által begyűjtött és eladott magvak csirázási minősége és egyöntetűsége nem lényeges. Mivel nehezen lehet egy terményt egy másik terménytől és gyommagvaktól mentesen tartani, hogy a magvak által terjesztett betegségeket megakadályozzuk, a vetőmagtermelök, akik a tiszta vetőmag termelésére, kondicionálására és marketingjére specializálódtak, meglehetősen kiterjedt és jól definiált vetőmagtermelési gyakorlatot fejlesztettek ki. Tehát a gazdálkodók számára általános gyakorlat, hogy igazolt minőségű vetőmagokat vá- 8 - : :··· .··. : .
• ·· · »· * súrolnak, amik eleget tesznek specifikus minőségi követelményeknek, ahelyett hogy a saját termésükből fogjanak vetőmagot. A vetőmagént használandó szaporító anyagot általában vedőborítást biztosító anyaggal kezelik, ami herbicideket, rovarirtószereket, fungicideket, baktericideket, nematicideket, molluszkicideket vagy ezek keverékét tartalmazza. A megszokott módon használt védöboritások közé tartozik például a captan, a carboxin, a thiram (TMRD<RI), a methalaxyl (Apron(R>) és a pirimiphos-metil (Actellic<R)). Ha szükséges, akkor ezeket a vegyületeket együtt formulázzák további hordozóanyagokkal, felületaktív anyagokkal vagy megszokott módon az alkalmazást elősegítő adjuvánsokat alkalmaznak a kiszerelés során, hogy védelmet biztosítsanak a bakteriális, gomba vagy állati kártevőkkel szemben. A védőborítást úgy használhatjuk, hogy a szaporító anyagot egy folyékony készítménnyel impregnáljuk, vagy kombinált nedves vagy száraz készítménnyel borítjuk be. Az alkalmazás más módszerei is lehetségesek, mint például a rügyekre vagy a termésre irányított kezelés.
A jelen találmány tárgyát képezik továbbá az új mezőgazdasági módszerek, azaz például az előzőkben ismertetett módszerek, amiket az jellemez, hogy a jelen találmány szerinti transzgenikus növényeket, transzgenikus növényi anyagokat vagy transzgenikus magvakat alkalmaznak.
Egy másik megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgyát a transzgenikus növényből kapott transzgenikus növényi sejt, szövet, szerv, mag vagy növényi rész képezi. A találmány tárgyát képezik továbbá a növények transzgenikus leszármazottjai, vala
- 9 - : :··· .·*. :
···· · · · · 0· 1 • · · · ·· · mint a leszármazottakból kapott transzgenikus növényi sejtek, szövetek, szervek, magvak és növényi részek.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy kereskedelmi csomag, ami cp4/epsps expressziójára képes Roundup(R) toleráns cukorrépa magokat tartalmaz, a magok felhasználására vonatkozó címke utasításokkal együtt. A jelen találmány szerint előnyben részesítünk egy kereskedelmi csomagot, ami egy transzgenikus növény magvait tartalmazza, amely növény a genomjába stabilan integrálva tartalmaz egy DNS darabot, aminek a nukleotid szekvenciáját az 1. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be.
Az alkalmazott transzformációs módszert az alábbiakban foglalhatjuk össze:
(a) in vitro szaporított cukorrépa szikleveleket Agrobacterium tumefaciens alkalmazásával egy olyan vektorral transzformálunk, ami egy cp4/epsps-t kódoló DNS darabot tartalmaz, azaz aminek a szekvenciáját az 5. számú szekvenciavázlaton ismertetjük;
(b) a hajtásokat glifozát jelenlétében regeneráljuk;
(c) a hajtásokat üvegházi talajba visszük át;
(d) a fiatal növényeket glifozáttal kezeljük;
(e) vizuálisan értékeljük a növények életerejét és a levelek klorózisát;
(f) teljesen normális növényeket válogatunk ki, amiknek normális az életerejük, és a leveleiket nem érinti a glifozát kezelés; és (g) a kiválasztott növényeket hagyományos nemesítés! technikákkal szaporítjuk.
- 10 Pontosabban, hajtásokat regenerálunk körülbelül 0,1-10 mmol/1, előnyösen körülbelül 1 mmol/1 glifozát jelenlétében, a kiválasztás után 8-12 héttel. Mindegyik transzgenikus hajtást tovább szaporítjuk tíz példányban, amiket adott esetben polimeráz láncreakcióval (PCR) meg lehet vizsgálni, hogy tartalmazzák-e a cp4/epsps transzgént, mielőtt üvegházba visszük át meggyökereztetni. Az üvegházban a megvilágítási körülmények a következők: 16 óra megvilágítás és 8 óra sötét, a hőmérséklet 22 ± 2 °C. A három-négy leveles állapotban a növénykéket Roundup(R> vizes oldatával permetezzük, 0,1-20 liter, előnyösen 1 liter per hektár dózisban. A növények életképességének és a növények klorózisának sérülését vizuálisan értékeljük, O-tól (elpusztult növény) 9-ig (teljesen érintetlen növény) terjedő skálán, minden növényt 2 héttel a glifozát alkalmazása után értékelve. A 0 és 3 közötti skála értékek az érzékeny növényekre jellemzőek. A 3 és 7 közötti skála értékek a tolerancia alacsony vagy közepes szintjére utalnak, a 8 és 9 közötti skála értékek a tolerancia jó szintjére utalnak. Pontosabban a skála értékek értelme az alábbi:
... Érintetlen növény, azonos a kezeletlen kontrollal
... Csak nagyon kis nekrózis a levelek hegyén, a levelek te- rületének kevesebb mint 5%-a érintett és sárga színű
... Nagyon kis nekrózis a levelek hegyén, amik kezdenek pöndörödni; a levelek területének kevesebb mint 5%-a érintett és sárga színű
6,5,4 ... Növekvő nekrózis és levél pöndörödés; a levelek kisebbek mint a normálisak
- 11 - · ··** ·**♦ · *·
3,2 ... Nincs, vagy nagyon korlátozott levélnövekedés; mindegyik levél pöndörödik és nekrózis által érintett
... A növény nem növekedik; a növénynek maximum 5%-a marad zöld
... Elpusztult növény
Ahhoz, hogy a szabadföldi kísérletekből adatokat gyüjtsünk, a normális életképességü és a glifozát kezelés által nem érintett növényeket (9-es skála érték) hagyományos technikákkal tovább szaporítjuk vagy nemesítjük.
A transzformációt előnyösen egy Ti vektorral hajtjuk végre, ami az 5. számú szekvenciavázlaton bemutatott szekvenciával rendelkező DNS darabot tartalmaz, ami a cp4/epsps és a gox géneket tartalmazza, amikről mind a kettőről leírták, hogy bizonyos növényfajokban toleranciát biztosítanak a glifozáttal szemben, valamint tartalmazza a β-glükuronidázt kódoló uidA riporter gént. A javított 35S promotert [Odell és mtsai: Nature 313, 810-812 (1985)] az uidA génhez kapcsoljuk, a görvélyfü mozaikvírus (FMV) promotert [Gouwda és mtsai: Journal of Cell. Biochem. Suppl. 13D, 301 (1989)] a cp4/epsps és a gox génekhez kapcsoljuk. A cp4/epsps és a gox gének elé (upstream) egy tranzit pepiidet [Gasser és mtsai: Journal of Biological Chemistry 263, 4280-4289 (1988)] szúrunk be, amivel azt érjük el, hogy mindkét fehérjét a kloroplasztba irányítjuk.
Az egyik transzformációs eseményről, amit a jelen találmány szerint generáltunk, meglepő módon kiderült, hogy olyan növényeket generálnak, amiket még 3x6 liter (körülbelül 18 liter) per
- 12 hektár dózisú Roundup® herbicid sem érint. A molekuláris elemzés az alábbiakat derítette ki:
• a transzgenikus DNS-ből egyetlen példány integrálódott egyetlen pontban;
• az integrált DNS cp4/epsps-t kódol, és csonkított vektor DNS-nek felel meg;
• az integrált DNS egy genomiális DNS darabot helyettesit, szekvenciáját az 1. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be;
• az integrálódott DNS közvetlen szomszédságában levő genomiális DNS-t a 2. számú szekvenciavázlaton és a 3. számú szekvenciavázlaton bemutatott szekvenciák jellemzik, ami a 4. számú szekvenciavázlaton bemutatott új genomiális szekvencia-elrendezést eredményez;
• a cp4/epsps és az uidA gének érintetlenek, míg a gox gén csonkítva van;
• más vektor-szekvenciák nincsenek jelen a transzgenikus növényekben.
Most, hogy ez az információ rendelkezésre áll, a találmány szerinti transzformációs események egyikéből származó növényeket polimeráz láncreakcióval könnyen megkülönböztethetjük más cukorrépa növényektől. Megfelelő primer pár kombinációk lehetővé teszik, hogy specifikusan azonosítsuk azokat a DNS szekvenciákat, amik csak azokban a növényekben vannak jelen, amik közvetve vagy közvetlenül azonos transzformációs eseményekből származnak. Az ilyen transzformációs események semmi esetre sem korlátozódnak azokra, amiket az Agrobacterium által közvetí
- 13 tett transzformációval kapunk, hanem származhatnak például biolisztikus transzformációs eseményekből is.
A jelen találmány tárgyát tehát egy olyan cukorrépa növény képezi, beleértve a növény utódait is, amit az jellemez, hogy a genomiális DNS-ének, mint templátnak PCR amplifikálásával az alábbi fragmenseket kapjuk:
egy 739 bázispár méretű DNS fragmens, ha a B és a szekvenciákkal jellemzett oligonukleotid primereket használjuk; vagy egy 834 bázispár méretű DNS fragmens, ha a D és e szekvenciákkal jellemzett oligonukleotid primereket használjuk; vagy egy 1057 bázispár méretű DNS fragmens, ha az A és b szekvenciákkal jellemzett oligonukleotid primereket használjuk; vagy egy 1224 bázispár méretű DNS fragmens, ha a C és f szekvenciákkal jellemzett oligonukleotid primereket használjuk.
PÉLDÁK
Az alábbi példákban tovább ismertetjük a találmány végrehajtása során használt anyagokat és módszereket, valamint a kapott eredményeket. Csak illusztráció céljából adjuk meg őket, bemutatásukat nem tekinthetjük a szabadalmi igénypontok korlátozásának.
1. Példa
Cukorrépa transzformáció
Az A1012 genotipusú cukorrépát egy olyan vektorral transzformáljuk, ami egy cp4/epsps és egy gox gént tartalmaz, amely gének glifozát toleranciát biztosítanak, valamint tartalmazza az nptll
- 14 gént, ami kanamicin rezisztenciát biztosít, valamint tartalmazza az uidA riporter gént, ami β-glükuronidázt (GUS) kódol. Az nptll és az uidA gén funkcionálisan kapcsolódik a javított 35S promoterhez [Odell és mtsai: Nature 318, 810-812 (1985)], míg a cp4/epsps és a gox gének a görvélyfú mozaik virus (FMV) promoter [Gouwda és mtsai: J. Cell. Biochem. Suppl. 13D, 301 (1989)] szabályozása alatt állnak. Emellett a cp4/epsps és a gox gének egy tranzit pepiidhez kapcsolódnak [Gasser és mtsai: Journal of Biological Chemistry 263, 4280-4289 (1988)], ami az 5' pozícióban van elhelyezve, és a peptideket a kloroplasztba irányítják. A cp4/epsps és az uidA az E9 3' terminátor szekvenciát használják, míg a gox és az nptll a megfelelő NOS 3' szekvenciát használják.
In vitro szaporított cukorrépát {Beta vulgaris. L) transzformálunk Agrobacterium tumefaciens alkalmazásával. A növényeket Fry és munkatársai, valamint Konwar és munkatársai leírásának megfelelően regeneráljuk [Fry és mtsai: “Genotype-independent transformation of sugarbeet using Agrobacterium tumefaciens”, Third international congress of plant mol. biol.; Tuscon, Arizona, USA (1991); Konwar és mtsai: J. Plant Biochem 8s Biotech. 3, 3741 (1994)], 1 mmol/1 koncentrációjú glifozátot használva szelekciós ágensként. Ahhoz, hogy az Agrobacterium tumefaciens-t elimináljuk, a szikleveleket háromszor inkubáljuk 500 mg/liter cefotaximot tartalmazó MS táptalajban (60 perc, 45-50/perc fordulatszám). A regenerált hajtásokat az 1 mmol/1 glifozáton és 500 mg/liter cefotaximon 8-12 hétig való szelekció után elemezzük, beleértve a friss táptalajra való átoltást minden harmadik héten. Mindegyik transzgenikus hajtást további mikroszaporításnak vet
- 15 jük alá, tíz példányban, vizsgáljuk a transzgén jelenlétét, majd üvegházba visszük át gyökereztetni.
Polimeráz láncreakciót használunk a cp4/epsps gén jelenlétének igazoláséira. A regenerált in vitro hajtások növényi anyagából 20 mg-ot viszünk egy Eppendorf csőbe. Az össz-DNS-t Tai és munkatársai leírása alapján extraháljuk [Tai és mtsai: Plant Molecular Biology Rep. 8, 297-303 (1990)]. A minimális módosítások közé tartozik 500 μΐ 100 mmol/1 TRIS-HC1 (pH=8,0), ami 50 mmol/1 Na-EDTA-t, 1,25% SDS-t (tömeg/térfogat), 0,38% Na-biszulfitot (tömeg/térfogat) tartalmaz, valamint 200 μg/ml proteináz K hozzáadása, majd 65 °C-on két óra hosszat végzett inkubálás. A fel nem oldódott levélanyagot kiszedjük, majd az össz-DNS-t kicsapjuk és 2 óra hosszat -20 °C-on lefagyasztjuk. Polimeráz láncreakció végzünk a Perkin-Elmer Gene-Amp POR kit (Perkin-Elmer Corp.) mellé adott instrukcióknak megfelelően, egy módosított 10X reakcióelegyet használva, aminek az összetétele: 100 mmol/1 TRIS-HC1 (pH=8,3), 500 mmol/1 kálium-klórid, 30 mol/1 MgCl2, 1,0% Nonidet P-40 (tömeg/térfogat), 0,4 μΜ krezolvörös 24% szacharózban (tömeg/térfogat), valamint a Taq Start ellenanyag (Clontech). A cp4/ epsps szekvenciák amplifikálására az alábbi primereket használjuk [Shah és mtsai: Science 233, 478-481 (1986)]: 5'-CAC CGG TCT TTT GGA AGG TGA AG-3' (6. számú szekvencia) és
5'-ACC GAG ACC CAT AAC GAG GAA GC-3'(7. számú szekvencia). Egy genomiális belső kontroll szekvencia amplifikálására (surA, surB) az alábbi primereket használjuk:
- 16 5-AAA CAG TCC CGT GCA TCC CCA AC-3‘ (8. számú szekvencia) és
-GAC GCT CTC CTT GAT TCT GTC CC-3'(9. számú szekvencia).
Az eltérő bináris plazmidok között nem figyelhető meg különbség a transzformáció hatékonyságában.
A mikroszaporított hajtásokat üvegházi talajba visszük át. Az üvegházban a megvilágítási körülmények az alábbiak: 200 pmol/l nr2 mp1 (Osram Power Star HQI-Z, 400 W), 16 órás megvilágítás, 8 óra sötét, és 22 ±2 °C hőmérséklet. A 260 független transzformánsból származó, három-négy leveles állapotban levő növénykéket Roundup®-rel kezeljük. Egy kalibrált permetezőt használunk a herbicid vizes oldatának alkalmazásához, 1 liter per hektár (360 g.a.i./l) dózisban. A glifozát alkalmazása után két héttel az egyes növényeken kiértékeljük a fitotoxikus sérüléseket, egy O-tól (teljes levél nekrózis) 9-ig (nincs látható hatás) terjedő skálán. 75 független transzformánsnál 0 és 6 érték közé eső fitotoxikus hatás figyelhető meg. A többi 185 (71%) transzformáns értéke 7 vagy több, ami azt jelenti, hogy minimális vagy nem látható hatást mutatnak a herbiciddel való kezelés után. Ezeket tovább keresztezzük nemtranszgenikus cukorrépákkal, az FI utódok előállítása céljából, hogy a szabadföldi vizsgálatokban kiértékeljük.
A szabadföldi vizsgálatokat azzal a céllal végezzük, hogy szántóföldi körülmények között értékeljük ki a különböző transzformációs eseményeket. Az elrendezés az alábbi: három sor, mindegyik sor 9 méter hosszú, és a sorok között 0,5 méter távolság van. Az egyes pontokba egy-egy transzformánst ültetünk be. A sziklevél állapotú növény kiindulási Roundup® kezelése után (1
- 17 liter per hektár, 360 g a.i./l), amivel a nem-transzgenikus szegregáló növényeket elimináljuk, a sorokat kézzel egyeljük, hogy végül olyan állapotot hozzunk létre, amikor 20 centiméterenként csak egy növény van. Minden elrendezést három részre osztunk, amiket egymástól függetlenül kezelünk. Az egyik részt a hagyományos herbiciddel kezeljük (0,1 kg metamitron a.i.a./hektár, 0,2 kg phenmediphan a.i./hektár és 0.1 kg ethofumesate a.i./hektár). A másik részt kétszer kezeljük 2 liter/hektár (1440 g a.i./liter) Roundup®-pal, a harmadikat kétszer négy liter (2880 g a.i./liter) Roundup®-pal. A növényeket kétleveles és négyleveles állapotukban kezeljük. Az utolsó alkalmazás után két héttel kiértékeljük a növényeken a herbicid kezelés következtében megjelenő fitotoxikus hatásokat. A teljes érzékenységtől a teljes toleranciáig minden tünet megfigyelhető. Különbség figyelhető meg az üvegházi és a szabadföldi értékek között. Ez valószínűleg az üvegházi és a szabadföldi vizsgálatok közötti környezeti különbségeknek tulajdonítható, azaz például ide értve az UVB sugárzás hiányát az üveg alatt. Nincsenek morfológiai vagy fiziológiai eltérések a különböző dózisú Roundup®-pal kezelt növények között, a hagyományos herbicid keverékkel végzett kezeléssel összehasonlítva. Két transzformáns nagyon erős toleranciát mutat a Roundup®-ra, miután hektáronként kétszer két liter és kétszer négy liter Roundup®-pal kezeltük.
A Roundup®-pal végzett permetezés után a toleranciát úgy határozzuk meg, hogy a növény életképességét (Tr.vig) és a levél klorózist (Tr.chl) értékeljük. A különböző fokozatok értelme az alábbi:
- 18 9 ... Érintetlen növény, azonos a kezeletlen kontrollal
... Csak nagyon kis nekrózis a levelek hegyén, a levelek területének kevesebb mint 5%-a érintett és sárga színű
... Nagyon kis nekrózis a levelek hegyén, amik kezdenek pöndörödni; a levelek területének kevesebb mint 5%-a érintett és sárga színű
6,5,4 ... Növekvő nekrózis és levél pöndörödés; a levelek kisebbek mint a normálisak
3,2 ... Nincs, vagy nagyon korlátozott levélnövekedés; mindegyik levél pöndörödik és nekrózis által érintett
... A növény nem növekedik; a növénynek maximum 5%-a marad zöld
... Elpusztult növény
22, különböző transzformációs eseményből származó növényt (1-22-es sorszámú) és 1 nem-transzgenikus kontrollt (23-as sorszám) permetezünk 1+4+4 liter Roundup®-pal hektáronként (Összesen 9 liter/hektár). A vizuálisan értékelhető sérülési értékszámokat az alábbi táblázatban adjuk meg.
| Sorszám | Életképesség! érték | Klorózis érték |
| 1 | 9 | 9 |
| 2 | 6 | 7 |
| 3 | 2 | 3 |
| 4 | 5 | 7 |
| 5 | 9 | 8 |
| 6 | 3 | 3 |
| 7 | 7 | 7 |
(RRMax)
| 8 | 7 | 8 |
| 9 | 4 | 6 |
| 10 | 5 | 6 |
| 11 | 5 | 5 |
| 12 | 4 | 5 |
| 13 | 9 | 9 |
| 14 | 3 | 5 |
| 15 | 4 | 4 |
| 16 | 2 | 3 |
| 17 | 1 | 1 |
| Sorszám | Életképesség! érték | Klorózis érték |
| 18 | 2 | 2 |
| 19 | 6 | 8 |
| 20 | 7 | 5 |
| 21 | 4 | 5 |
| 22 | 5 | 7 |
| 23 | 0 | 0 |
(nem-transzgenikus kontroll)
2. Példa
Az integrálódott transzgenikus DNS kópiaszáma
A legmagasabb glifozát toleranciával (RRMax) rendelkező transzformáns genomjába integrálódott transzgenikus DNS kópiaszámát a használt transzformációs vektor jobb és bal kar szekvenciáján túl terjedő restrikciós fragmensek Southern biot elemzésével határozzuk meg.
-20 Az RRMax, és egy azonos genetikai hátterű nem-transzgenikus növény genomiális DNS-ét 250 mg liofilezett cukorrépa levélből izoláljuk, Saghai-Maroof és munkatársai közleménye alapján [Saghai-Maroof és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 81, 8014-8018 (1984)]. A használt transzformációs vektor DNS-e szolgál pozitív kontrollként. 15 gg DNS-t emésztünk 120 egység restrikciós enzimmel 4 óra hosszat 37 °C-on, 400 μΐ össztérfogatban. Az emésztett DNS-t kicsapjuk és újra oldjuk 50 μΐ össztérfogatban. Az emésztett DNS-t, a pozitív plazmid kontrollt és a molekulasúly marker standardot (Lambda EcoRI és Hindii! restrikciós enzimekkel emésztve) egy 0,8%-os agaróz gélen választjuk szét. A DNS-t etídiumbromiddal tesszük láthatóvá, majd a gélt egy vonalzóval együtt lefényképezzük. A DNS-t azután egy Hybond N+ membránra visszük át, majd egy próbához hibridizáljuk, Ausubel és munkatársai (szerk.) szerint [Current Protocols in Molecular Biology, szerk.: Ausubel és mtsai, Greene Publishing és Wiley Interscience: New York (1987)].
A cp4/epsps génszekvencia 975-1766 bázispárjaival (5. számú szekvencia) és a gox génszekvencia 7108-7535 bázispárjaival (5. számú szekvencia) komplementer próbákat polimeráz láncreakcióval (PCR) preparáljuk, ahol a transzformáló vektor szolgál a reakció templát DNS-eként. A cp4/epsps próbát használjuk a jobboldali kart határoló inszert számának meghatározásához. A gox próbát használjuk a bal kar régiót határoló inszertek számának meghatározásához. A PCR termékeket a Geneclean IIíR> Kit-tel tisztítjuk (BIO 101, La Jolla, CA). A próba 32P-vel való jelölését a
Megaprime™ DNS jelölő rendszerrel hajtjuk végre (Amersham International, Little Chalfont, Nagy-Britannia).
A kópiaszám meghatározását a jobboldali kart határoló genomiális DNS elemzésével végezzük. A genomiális DNS-t Ncol restrikciós enzimmel emésztjük, ami belevág a plazmid eredetű szekvenciákba a 35S promoter és az uidA gén közé, és a cukorrépa genomjába. A membránt a cp4/epsps gén belső PCR fragmenséből származó próbával vizsgáljuk meg. A cp4/epsps próba Ncol restrikciós enzimmel végzett emésztése után az RRMax-ban egyetlen, 4,7 kilobázis méretű csíkot lehet kimutatni. Ez azt igazolja, hogy egyetlen kópia DNS került egyetlen lókuszba.
A kópiaszám meghatározását elvégezhetjük a bal kar régiót határoló genomiális DNS elemzésével. A genomiális DNS-t HindlII restrikciós enzimmel emésztjük, ami belevág a plazmid eredetű szekvenciákba az uidA gén E9 3' terminátora és a gox gén FMV promotere közé, valamint a cukorrépa genomjába. A HindlII restrikciós enzimmel való emésztés és a gox próbával való hibridizálás után egyetlen, körülbelül 2,0 kilobázis méretű csíkot lehet kimutatni az RRMax transzformánsnál. Mivel a várt minimális fragmens-méret > 4,4 kilobázis, az eredmények azt mutatják, hogy a plazmid DNS csonkul a növény genomiális DNS-ébe való bevitel során. Mindezek ellenére az eredmények megerősítik, hogy az átvitt DNS-nek csak egyetlen kópiája integrálódik egyetlen lókuszban.
3. Példa
Az RRMax integrációs hely szekvenciájának elemzése
Genomiális RRMax DNS-t izolálunk 250 mg liofilezett cukorrépa levélből, Saghai-Maroof és munkatársai leírása alapján [Saghai-Maroof és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 81, 8014-8018 (1984)]. Egy XFIXII fágkönyvtárat készítünk, ami 9-23 kilobázis méretű inszerteket tartalmaz egy Xhol klónozó helyen (Stratagene), majd cp4/epsps és gox próbákkal vizsgáljuk meg, hogy kiszűrjük azokat a feltételezett kiónokat, amik lefedik az integrációs eseményt. Összesen 25 olyan fágot lehetett kimutatni, amik hibridizálódnak a cp4/epsps vagy a gox próbához. Két klónról derült ki, hogy hibridizálódik a cp4/epsps és a gox próbához is. Az egyiket megtisztítjuk (Fritsch és munkatársai, 1987), majd tovább elemezzük Southern biot elemzéssel és polimeráz láncreakcióval. Tartalmaz egy 15-16 kilobázis méretű genomiális DNS inszertet, ami tartalmazza a transzgenikus DNS-t és a határoló cukorrépa szekvenciákat. Az említett határoló szekvenciákat polimeráz láncreakcióval amplifikáljuk, az FMV promoterre vagy a gox génszekvenciára illeszkedő prímért használva, egy olyan primerrel kombinálva, ami a XFIXII klónozó kazettához illeszkedik (a részletes szekvenciát az alábbi, 1. táblázatban mutatjuk be). Az integrálódott DNS/cukorrépa kapcsolódási régiókat Sanger féle didezoxi láncterminációs módszerrel szekvenáljuk, az Applied Biosystems Model 373A, Version 2.1.1. berendezést használva. A szekvenáláshoz használt primereket a 2. táblázatban mutatjuk be.
1. Táblázat
A határoló régiók amplifíkálására használt primerek
| Primer | Szekvencia |
| #3 | 5-CAAGAAGGTTGGTATCGCTG-3' (10. számú szekvencia) |
| #7 | 5'-TCTTTTGTGGTCGTCACTGCGTT-3' (11. számú szekvencia) |
| #8 | 5' - GCG AGCTCTAATACG ACCTC ACT AT- 3' (12. számú szekvencia) |
| #9 | 5'-CGCGAGCTCAATTAACCCTCACT-3' (13. számú szekvencia) |
2. Táblázat
Szekvenáló primerek
| Primer | Szekvencia | Leírás |
| SÍ | 5'-TCTGTACCCTGACCTTGTTG-3' (14. számú szekvencia) | a határoló jobboldali régió szekvenálására |
| S3 | 5'-CGTGGATACCACATCGTGAT-3' (15. számú szekvencia) | a határoló baloldali régió szekvenálására |
| S4 | 5' - ACCTTGGCTTGAAGTACTC-3' (16. számú szekvencia) | a határoló baloldali régió szekvenálására |
A szekvencia elemzéséből kiderült, hogy az RRMax genomjába integrálódott transzgenikus DNS nukleotid szekvenciája az 1. számú szekvenciavázlaton látható szekvenciával azonos. Az integrációs pont a jobboldali határoló szekvencia és az FMV promoter
-24 között található, és a gox startkodon után (downstream) 897 bázispárral ér véget. A csonkított gox gén transzlációs stopkodonjait a kapcsolódási hely után (downstream) 130 és 235 bázispárral találhatók. Egy HindlII hasítási helyet azonosítottunk 210 bázispárral a gox startkodon után (downstream), és egy transzkripciós terminációs szignált (AATAAA) 650 bázispárral a gox startkodon után. A 2. számú szekvenciavázlaton bemutatjuk a transzgenikus DNS jobboldali határoló régiójához közvetlenül kapcsolódó genomiális DNS DNS szekvenciáját, a 3. számú szekvenciavázlaton bemutatjuk a transzgenikus DNS baloldali határoló régiójához közvetlenül kapcsolódó genomiális DNS DNS szekvenciáját.
4. Példa
Az RRMax-ba integrálódott transzgenikus DNS jellemzése
Ahhoz, hogy tovább jellemezzük a jobboldali határoló régiót, az RRMax genomiális DNS-ét és a transzformáló vektor DNS-ét emésztjük BamHI, vagy HindlII vagy Bell vagy EcoRI restrikciós enzimmel. Southern biot elemzésben a hasított DNS-t a 2. példában ismertetett cp4/epsps PCR fragmenssel vizsgáljuk át. A használt restrikciós enzimtől függetlenül, a különböző restrikciós enzimekkel végzett emésztéssel egyetlen fragmenst lehet kimutatni a Southern biot elemzés során. A kimutatott fragmensek méretét a 3. táblázatban mutatjuk be. Az adatok azt igazolják, hogy a DNSnek egyetlen kópiája ment át a növénybe, és a DNS-nek a cukorrépa növénybe való átvitele a cp4/epsps gén teljes átvitelét eredményezi. Az eredmények összhangban vannak a 2. példában végzett
-25 kópiaszám meghatározással, és a 3. példában végzett nukleotid szekvencia elemzéssel.
3. Táblázat
A Southern biot fragmensek mérete
| Enzim | RRMax | transzformáló vektor |
| BamHI | >10 kilobázis | 9,7 kilobázis |
| HindlII | 2.4 kilobázis | 2,4 kilobázis |
| Bell | 3,2 kilobázis | 2,9 kilobázis |
| EcoRI | 1,8 kilobázis | 1,8 kilobázis |
Ahhoz, hogy tovább jellemezzük az integrálódott transzgenikus DNS-t, az RRMax-ból származó genomiális DNS-t Ncol, BamHI vagy HindlII restrikciós enzimmel emésztjük. Kontrollként a transzformáló vektor DNS-ét ugyanazzal a restrikciós enzimmel emésztjük. A biottot egy polimeráz láncreakcióval amplifikált DNSsel vizsgáljuk át, ami az 5. számú szekvenciavázlaton látható uidA gén 3796-4837-es bázispárjait fedi le. A kimutatott fragmensek méretét a 4. táblázatban mutatjuk be. A használt restrikciós enzimektől függetlenül, a különböző restrikciós enzimekkel végzett emésztéssel egyetlen jelet kapunk az autoradiográfiás filmen, ami azt igazolja, hogy a DNS inszertnek ugyanolyan jellemzői vannak mint a használt transzformáló vektor belső DNS-ének.
4. Táblázat
A Southern blot fragmens mérete
| Enzim | Transzformáló vektor | RRMax |
| Ncol | 3,4 kilobázis | 3,4 kilobázis |
| BamHI | 3,2 kilobázis | 3,2 kilobázis |
| HindlII | 3,2 kilobázis | 3,2 kilobázis |
Ahhoz, hogy tovább jellemezzük a baloldali határoló régiót, az RRMax genomiális DNS-ét és a transzformáló vektor DNS-ét Ncol, BamHI, HindlII vagy EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük. A Southern biot elemzés során a hasított DNS-t a 2. példában ismertetett gox polimeráz láncreakció fragmenssel vizsgáljuk át. A kimutatott fragmensek méretét az 5. táblázatban mutatjuk be. A használt restrikciós enzimtől függetlenül, a különböző restrikciós enzimekkel végzett emésztéssel egyetlen fragmenst kaptunk az autoradiográfiás filmen. Akármelyik, az Ncol, BamHI vagy EcoRI restrikciós enzimmel végzett emésztéstől azt vártuk, hogy azonosítani lehet egy ismert méretű belső fragmenst. Azonban ezek közül a restrikciós enzimek közül egyik sem ad ilyen, várt méretű restrikciós enzimet. Ez azt mutatja, hogy az Ncol, BamHI és EcoRI rezisztens hasítási helyek nincsenek meg a transzgenikus növényben. Az eredmények összhangban vannak a szekvenálással kapott eredményekkel, amikből az derült ki, hogy a gox gén csak részben integrálódik a növénybe. A HindlII restrikciós enzimmel végzett emésztés egy körülbelül 2 kilobázis méretű fragmenst eredményez, ami tovább erősíti a szekvenálási adatokat, amik sze-η rint egy HindlII hasítási hely található a genomban a gox gén után (downstream). Az eredmények azt is mutatják, hogy a transzgenikus DNS-ből egyetlen kópia ment át a növénybe. Ezek jól korrelálnak a 2. példában végzett kópiaszám meghatározás és a 3. példában végzett nukleotid szekvencia elemzés primer eredményeivel. Egyetlen kópia integrálódik a növény genomjába, míg a gox gén részlegesen deletálódik.
5. Táblázat
Southern blot fragmens méretek
| Enzim | transzformáló vektor | T9100152 |
| Ncol | 2,5 kilobázis | 3,0 kilobázis |
| BamHI | 2,9 kilobázis | >10 kilobázis |
| HindlII | 9,5 kilobázis | 2,0 kilobázis |
| EcoRI | 1,6 kilobázis | 3,6 kilobázis |
5. Példa
Más vektor-szekvenciáik hiánya
Ahhoz, hogy igazoljuk az oriV, ori-322, aad és nptll szekvenciák hiányát a transzformációs eseményekben, RRMax Southern biot elemzést végezhetünk, az oriV, ori-322, aad és nptll részt lefedő restrikciós enzim/próba kombinációval.
A transzformációs vektor DNS-t Nspl restrikciós enzimmel emésztjük, ami 17 ponton vág bele a plazmidba. Az elemzés céljára az oriV-t, valamint az ori-322-t és az aad-t tartalmazó Nspl fragmenst megtisztítjuk, majd a Southern biot elemzés céljára fel használjuk. Egy PCR-rel amplifikált fragmenst, aminek a nukleotid szekvenciáját a 26. számú szekvenciavázlaton adjuk meg, arra használunk, hogy az nptll szekvenciákat átvizsgáljuk vele. Mindegyik fragmenst GenecleanII(Rl Kit-tel tisztítjuk (BI 101, La Jolla, CA). A 32P izotóppal végzett jelölést a Megaprime™ DNS jelölő rendszerrel végezzük el (Amersham International, Little Chalfont, Nagy-Britannia).
Az RRMax genomiális DNS-ét BamHI restrikciós enzimmel emésztjük, ami három helyen hasít bele a vektor DNS-ébe, az 5. számú szekvencia 2321-es, 5544-es és 8413-es pozíciójában. A megfelelő Southern biot transzfer membránt az oriV-t tartalmazó próbával hibridizáltatva nem tudtunk jelet kimutatni. Ebből azt a következtetést kellett levonnunk, hogy az oriV nincs jelen az RRMax-ban.
Ha a megfelelő Southern biot transzfer membránt az ori-322t és aad-t tartalmazó próbával hibridizáljuk, akkor nem tudunk jelet kimutatni. Ebből azt a következtetést kellett levonnunk, hogy az ori-322 és az aad szekvenciák nincsenek meg az RRMax-ban.
Ha a megfelelő Southern biot transzfer membránt az nptll-t tartalmazó próbával hibridizáljuk, akkor nem tudunk jelet kimutatni. Ebből azt a következtetést kellett levonnunk, hogy a gén nincs meg az RRMax-ban.
6. Példa
Az RRMax vonal stabilitása
A genomiális DNS-t Bell restrikciós enzimmel emésztjük, és Southern biot elemzést végzünk a cp4/epsps génnel mint próbá a » · ♦ β *
-^9- · « ··* »·* » » · » * ~*J»· · * »k* ** * val, amint azt a 2. példában ismertetjük. Ebben az elemzésben a 2. és 3. generációból négy növényt, a 4. generációból pedig öt növényt használunk. Emellett negatív kontrollként 3 nem-transzgenikus növényt használunk. A primer transzformációs esemény elemzése egyetlen 3,2 kilobázis méretű fragmenst eredményez. Az utódgenerációk Southern biot elemzésével szintén csak egyetlen, 3,2 kilobázis méretű fragmenst lehet kimutatni. Ha a bevitt DNS generációról generációra stabilan öröklődik, akkor ugyanazt a 3,2 kilobázis méretű fragmenst várjuk az összes növényben.
A genomiális DNS-t Bell restrikciós enzimmel emésztjük, és Southern biot elemzést végzünk a gox génnel mint próbával, amint azt a 2. példában ismertetjük. A primer transzformációs esemény elemzése egyetlen 2,0 kilobázis méretű fragmenst eredményez. Az utódgenerációk Southern biot elemzésével szintén csak egyetlen, 2,0 kilobázis méretű fragmenst lehet kimutatni, ami a tulajdonság stabil öröklődését mutatja.
7. Példa
Az RRMax PCR jellemzése
Az RRMax.ból a 2. példában leírt módon genomiális DNS-t készítünk. Körülbelül 0,5 μg DNS-t használunk templát DNS-ként egy polimeráz láncreakcióban, a 6. táblázatban ismertetett szekvenciákkal jellemzett primer szekvenciák specifikus kombinációit alkalmazva. Az említett specifikus kombinációkat és az amplifikált fragmens méretét a 7. táblázatban adjuk meg. A primerpár kombinációktól függően 55 °C és 65 °C közötti illeszkedési hőmérsékletet használunk mind a 30-35 amplifikációs ciklusban.
6. Táblázat
Primer szekvenciák
| Primer | Szekvencia | Leírás |
| A | 5' -TCAACCTAC AGCTGATTTGGACC-3' (17. számú szekvencia) | közel a jobboldali kapcsolódáshoz |
| B | 5-GGACCGGAACGACAAT- CTGATC-3' (18. számú szekvencia) | közel a jobboldali kapcsolódáshoz |
| C | 5 -CCTAGGGAAGTCCAAATCAGCCG-3' (19. számú szekvencia) | közel a baloldali kapcsolódáshoz |
| D | 5-TTTGGACCGGAACTTT- CCAGAAG-3' (20. számú szekvencia) | közel a baloldali kapcsolódáshoz |
| a | 5'-CTAACTTGCGCCATCG- GAGAAAC-3' (21. számú szekvencia) | a cp4/epsps génen belül |
| b | 5' - G ACTTGTC ACCTGG AATACGGAC-3' (22. számú szekvencia) | a cp4/epsps génen belül |
| c | 5'-ATTCTTGAGCTCATCA- AGCAGCC-3' (23. számú szekvencia) | a cp4/epsps génen belül |
| e | 5'-AAGGTTGGTATCGCTG- GAGCTG-3' (24. számú szekvencia) | a gox génen belül |
| f | 5'-TCTCCACAATGGCTTC- CTCTATG-3' (25. számú szekvencia) | a gox génen belül |
7. Táblázat
Specifikus primer-kombinációk
| Kombináció | Az amplifikált fragmens mérete |
| A+a | 757 bp |
| A+b | 1057 bp |
| A+c | 2352 bp |
| B+a | 739 bp (27. számú szekvencia) |
| B+b | 1039 bp |
| B+c | 2334 bp |
| C+e | 888 bp |
| C+f | 1224 bp |
| D+e | 834 bp |
| D+f | 1178 bp |
Az alábbiakban ismertetjük a leírásban említett szekvenciák listáját.
-32 A SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:
(i) BENYÚJTÓ:
(A) NÉV: Novartis AG (B) UTCA: Schwarzwaldallee 215 (C) VÁROS: Basel (E) ORSZÁG: Svájc (F) IRÁNYÍTÓSZÁM: 4058 (G) TELEFON: +41 61 324 11 11 (H) TELEFAX: +41 61 322 75 32 (ii) A TALÁLMÁNY Transzgenikus növények
CÍME:
(iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 27 (iv) SZÁMÍTÓGÉPES FORMA:
(A) A HORDOZÓ TÍPUSA: FLOPPY LEMEZ (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM PC KOMPATIBILIS (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAM: PATENTIN RELEASE #1.0, VERSION #1.25 (EPO)
1. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 8012 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: kétszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: NEM (iii ) Antiszensz: NEM (xi) A szekvencia leírása: 1. számú szekvencia
AACGACAATC TGATCCCCAT CAAGCTTGAG CTCAGGATTT AGCAGCATTC CAGATTGGGT 60 TCAATCAACA AGGTACGAGC CATATCACTT TATTCAAATT GGTATCGCCA AAACCAAGAA 120 GGAACTCCCA TCCTCAAAGG TTTGTAAGGA AGAATTCTCA GTCCAAAGCC TCAACAAGGT 180 CAGGGTACAG AGTCTCCAAA CCATTAGCCA AAAGCTACAG GAGATCAATG AAGAATCTTC 240 AATCAAAGTA AACTACTGTT CCAGCACAGT CATCATGGTC AGTAAGTTCT AGAAAAAGAC 300 ATCCACCGAA GACTTAAAGT TAGTGGGCAT CTTTGAAAGT AATCTTGTCA ACATCGAGCA 360 GCTGGCTTGT GGGGACCAGA CAAAAAAGGA ATGGTGCAGA ATTGTTAGGC GCACCTACCA 420 AAAGCATCTC TGCCTTTATT GCAAAGATAA AGCAGATTCC TCTAGTATAA GTGGGGAACA 480 AAATAACGTG GAAAAGAGCT GTCCTGACAG CCCACTCACT AATGCGTATG ACGAACGCAG 540 TGACGACCAC AAAAGAATTC CCTCTATATA AGAAGGCATT CATTCCCATT TGAAGGATCA 600 TCAGATACTG AACCAATCCT TCTAGAAGAT CTAAGATTAT CGATAAGCTT GATGTAATTG 660 GAGGAAGATC AAAATTTTCA ATCCCCATTC TTCGATTGCT TCAATTGAAG TTTCTCCGAT 720 GGCGCAAGGT AGCAGAATCT GCAATGGTGT GCAGAACCCA TCTCTTATCT CCAATCTCTC 780 GAAATCCAGT CAACGCAAAT CTCCCTTATC GGTTTCTCTG AAGACGCAGC AGCATCCACG 840 AGCTTATCCG ATTTCGTCGT CGTGGGGATT GAAGAAGAGT GGGATGACGT TAATTGGCTC 900 TGAGCTTCGT CCTCTTAAGG TCATGTCTTC TGTTTCCACG GCGTGCATGC TTCACGGTGC 960 AAGCAGCCGT CCAGCAACTG CTCGTAAGTC CTCTGGTCTT TCTGGAACCG TCCGTATTCC 1020 AGGTGACAAG TCTATCTCCC ACAGGTCCTT CATGTTTGGA GGTCTCGCTA GCGGTGAAAC 1080 TCGTATCACC CGTCTTTTGG AAGGTGAAGA TGTTATCAAC ACTGGTAAGG CTATGCAAGC 1140 TATGGGTGCC AGAATCCGTA AGGAAGGTGA TACTTGGATC ATTGATGGTG TTGGTAACGG 1200 TGGACTCCTT GCTCCTGAGG CTCCTCTCGA TTTCGGTAAC GCTGCAACTG GTTGCCGTTT 1260
GACTATGGGT CTTGTTGGTG TTTACGATTT CGATAGCACT TTCATTGGTG ACGCTTCTCT 1320 CACTAAGCGT CCAATGGGTC GTGTGTTGAA CCCACTTCGC GAAATGGGTG TGCAGGTGAA 1380 GTCTGAAGAC GGTGATCGTC TTCCAGTTAC CTTGCGTGGA CCAAAGACTC CAACGCCAAT 1440 CACCTACAGG GTACCTATGG CTTCCGCTCA AGTGAAGTCC GCTGTTCTGC TTGCTGGTCT 1500 CAACACCCCA GGTATCACCA CTGTTATCGA GCCAATCATG ACTCGTGACC ACACTGAAAA 1560 GATGCTTCAA GGTTTTGGTG CTAACCTTAC CGTTGAGACT GATGCTGACG GTGTGCGTAC 1620 CATCCGTCTT GAAGGTCGTG TGAAGCTCAC CGGTCAAGTG ATTGATGTTC CAGGTGATCC 1680 ATCCTCTACT GCTTTCCCAT TGGTTGCTGC CTTGCTTGTT CTAGGTTCCG ACGTCACCAT 1740 CCTTAACGTT TTGATGACCC CAACCCGTAC TGGTCTCATC TTGACTCTGC AGGAAATGGG 1800 TGCCGACATC GAAGTGATCA ACCCACGTCT TGCTGGTGGA GAAGACGTGG CTGACTTGCG 1860 TGTTCGTTCT TCTACTTTGA AGGGTGTTAC TGTTCCAGAA GACCGTGCTC CTTCTATGAT 1920 CGACGAGTAT CCAATTCTCG CTGTTGCAGC TGCATTCGCT GAAGGTGCTA CCGTTATGAA 1980 CGGTTTGGAA GAACTCCGTG TAAAGGAAAG CGACCGTCTT TCTGCTGTCG CAAACGGTCG 2040 CAAGCTCAAC GGTGTTGATT GCGATGAAGG TGAGACTTCT CTCGTCGTGC GTGGTCGTCC 2100
- 34 TGACGGTAAG GGTCTCGGTA ACGCTTCTGG AGCAGCTGTC GCTACCCACC TCGATCACCG 2160 TATCGCTATG AGCTTCCTCG TTCTGGGTCT CGTTTCTGAA AACCCTGTTA CTGTTCATGA 2220 TGCTACTATG ATCGCTACTA GCTTCCCAGA GTTCATGGAT TTGATGGCTG GTCTTGGAGC 2290 TAAGATCGAA CTCTCCGACA CTAAGGCTGC TTGATGAGCT CAAGAATTCG AGCTCGGTAC 2340 CGGATCCTCT AGCTAGAGCT TTCGTTCGTA TCATCGGTTT CGACAACGTT CGTCAAGTTC 2400 AATGCATCAG TTTCATTGCG CACACACCAG AATCCTACTG AGTTCGAGTA TTATGGCATT 2460 GGGAAAACTG TTTTTCTTGT ACCATTTGTT GTGCTTGTAA TTTACTGTGT TTTTTATTCG 2520 GTTTTCGCTA TCGAACTGTG AAATGGAAAT GGATGGAGAA GAGTTAATGA ATGATATGGT 2580 CCTTTTGTTC ATTCTCAAAT TAATATTATT TGTTTTTTCT CTTATTTGTT GTGTGTTGAA 2640 TTTGAAATTA TAAGAGATAT GCAAACATTT TGTTTTGAGT AAAAATGTGT CAAATCGTGG 2700 CCTCTAATGA CCGAAGTTAA TATGAGGAGT AAAACACTTG TAGTTGTACC ATTATGCTTA 2760 TTCACTAGGC AACAAATATA TTTTCAGACC TAGAAAAGCT GCAAATGTTA CTGAATACAA 2820 GTATGTCCTG TTGTGTTTTA GACATTTATG AACTTTCCTT TATGTAATTT TCCAGAATCC 2880 TTGTCAGATT CTAATCATTG CTTTATAATT ATAGTTATAC TCATGGATTT GTAGTTGAGT 2940 ATGAAAATAT TTTTTAATGC ATTTTATGAC TTGCCAATTG ATTGACAACA TGCATCAATA 3000 GACCTGCAGC CACTCGAAGC GGCCGCGTTC AAGCTTCTGC AGGTCCGATG TGAGACTTTT 3060 CAACAAAGGG TAATATCCGG AAACCTCCTC GGATTCCGTT GCCCAGCTAT CTGTCACTTT 3120 ATTGTGAAGA TAGTGGAAAA GGAAGGTGGC TCCTACAAAT GCCATCATTG CGATAAAGGA 3180 AAGGGCATCG TTGAAGATGC CTCTGCCGAC AGTGGTCCCA AAGATGGACC CCCACCCACG 3240 AGGAGCATCG TGGAAAAAGA AGACGTTCCA ACCACGTCTT CAAAGCAAGT GGATTGATGT 3300 GATGG'TCCGA TGTGAGACTT TTCAACAAAG GGTAATATCC GGAAACCTCC TCGGATTCCA 3360 TTGCCCAGCT ATCTGTCACT TTATTGTGAA GATAGTGGAA AAGGAAGGTG GCTCCTACAA 3420 ATGCCATCAT TGCGATAAAG GAAAGGCCAT CGTTGAAGAT GCCTCTGCCG ACAGTGGTCC 3480 CAAAGATGGA CCCCCACCCA CGAGGAGCAT CGTGGAAAAA GAAGACGTTC CAACCACGTC 3540 TTCAAAGCAA GTCGATTGAT GTGATATCTC CACTGACGTA AGGGATGACG CACAATCCCA 3600 CTATCCTTCG CAAGACCCTT CCTCTATATA AGGAAGTTCA TTCATTTTGG AGAGGACACG 3660 CTGACAAGCT GACTCTAGCA GATCTCCATG GTCCGTCCTG TAGAAACCCC AACCCGTGAA 3720 ATCAAAAAAC TCGACGGCCT GTGGGCATTC AGTCTGGATC GCGAAAACTG TGGAATTGAT 3780 CAGCGTTGGT GGGAAAGCGC GTTACAAGAA AGCCGGGCAA TTGCTGTGCC AGGCAGTTTT 3840 AACGATCAGT TCGCCGATGC AGATATTCGT AATTATGCGG GCAACGTCTG GTATCAGCGC 3900 GAAGTCTTTA TACCGAAAGG TTGGGCAGGC CAGCGTATCG TGCTGCGGTT CGATGCGGTC 3960 ACTCATTACG GCAAAGTGTG GGTCCATAAT CAGGAAGTGA TGGAGCATCA GGGCGGCTAT 4020 ACGCCATTTG AAGCCGATGT CACGCCGTAT GTTATTGCCG GGAAAAGTGT ACGTATCACC 4080 GTTTGTGTGA ACAACGAACT GAACTGGCAG ACTATCCCGC CGGGAATGGT GATTACCGAC 4140 GAAAACGGCA AGAAAAAGCA GTCCCACTTC CATGATTTCT TTAACTATGC CGGAATCCAC 4200 CGCAGCGTAA TGCTCTACAC CACGCCGAAC ACCTGGGTGG ACGATATCAC CGTGGTGACG 4260 CATGTCCGGC AAGACTGTAA CCACGCGTCT GTTGACTGGC AGGTGGTGGC CAATGGTGAT 4320 GTCAGCCTTG AACTGCGTGA TGCGGATCAA CAGGTGGTTG CAACTGGACA AGGCACTAGC 4380 GGGACTTTGC AAGTGGTGAA TCCGCACCTC TGGCAACCGG GTGAAGGTTA TCTCTATGAA 4440 CTGTGCGTCA CAGCCAAAAG CCAGACAGAG TGTGATATCT ACCCGCTTCG CGTCGGCATC 4500 CGGTCAGTGG CAGTGAAGGG CGAACAGTTC CTGATTAACC ACAAACCGTT CTACTTTACT 4560 GGCTTTGGTC GTCATGAAGA TGCGGACTTA CGTGGCAAAG GATTCGATAA CGTGCTGATG 4620 GTGCACGACC ACGCATTAAT GGACTGGATT GGGGCCAACT CCTACCGTAC CTCGCATTAC 4680
-35 CCTTACGCTG AAGAGATGCT CGACTGGGCA GATGAACATG GCATCGTGGT GATTGATGAA 4740 ACTGCTGCTG TCGGCTTTAA CCTCTCTTTA GGCATTGGTT TCGAAGCGGG CAACAAGCCG 4800 AAAGAACTGT ACAGCGAAGA GGCAGTCAAC GGGGAAACTC AGCAAGCGCA CTTACAGGCG 4860 ATTAAAGAGC TGATAGCGCG TGACAAAAAC CACCCAAGCG TGGTGATGTG GAGTATTGCC 4920 AACGAACCGG ATACCCGTCC TGAACGGGAA TATTTCGGCA TTTCGCCACT GGCGGAAGCA 4980 ACGCGTAAAC TCGACCCGAC GCGTCCGATC ACCTGCCTCA ATGTTATGTT CTGCGACGCT 5040 CACACCGATA CCATCAGCGA TCTCTTTGAT GTGCTGTGCC TGAACCGTTA TTACGGATGG 5100 TATGTCCAAA GCGGCGATTT GGAAACGGCA GAGAAGGTAC TGGAAAAAGA ACTTCTGGCC 5160 TGGCAGGAGA AACTGCATCA GCCGATTATC ATCACCGAAT ACGGCGTGGA TACGTTAGCC 5220 GGGCTGCACT CAATGTACAC CGACATGTGG AGTGAAGAGT ATCAGTGTGC ATGGCTGGAT 5280 ATGTATCACC GCGTCTTTGA TCGCGTCAGC GCCGTCGTCG GTGAACAGGT ATGGAATTTC 5340 GCCGATTTTG CGACCTCGCA AGGCATATTG CGCGTTGGCG GTAACAAGAA AGGGATCTTC 5400 ACTCGCGACC GCAAACCGAA GTCGGCGGCT TTTCTGCTGC AAAAACGCTG GACTGGCATG 5460 AACTTCGGTG AAAAACCGCA GCAGGGAGGC AAACAATGAA TCAACAACTC TCCTGGCGCA 5520 CCATCGTCGG CTACAGCCTC GGTGGGGAAT TCGAGCTCGC CCGGGGATCC TCTAGCTAGA 5580 GCTTTCGTTC GTATCATCGG TTTCGACAAC GTTCGTCAAG TTCAATGCAT CAGTTTCATT 5640 GCGCACACAC CAGAATCCTA CTGAGTTCGA GTATTATGGC ATTGGGAAAA CTGTTTTTCT 5700 TGTACCATTT GTTGTGCTTG TAATTTACTG TGTTTTTTAT TCGGTTTTCG CTATCGAACT 5760 GTGAAATGGA AATGGATGGA GAAGAGTTAA TGAATGATAT GGTCCTTTTG TTCATTCTCA 5820 AATTAATATT ATTTGTTTTT TCTCTTATTT GTTGTGTGTT GAATTTGAAA TTATAAGAGA 5880 TATGCAAACA TTTGTTTTTG AGTAAAAATG TGTCAAATCG TGGCCTCTAA TGACCGAAGT 5940 TAATATGAGG AGTAAAACAC TTGTAGTTGT ACCATTATGC TTATTCACTA GGCAACAAAT 6000 ATATTTTCAG ACCTAGAAAA GCTGCAAATG TTACTGAATA CAAGTATGTC CTCTTGTGTT 6060 TTAGACATTT ATGAACTTTC CTTTATGTAA TTTCCCAGAA TCCTTGTCAG ATTCTAATCA 6120 TTGCTTTATA ATTATAGTTA TACTCATGGA TTTGTAGTTG AGTATGAAAA TATTTTTTAA 6180 TGCATTTTAT GACTTGCCAA TTGATTGACA ACATGCATCA ATCGACCTGC AGCCCAAGCT 6240 TGAGCTCAGG ATTTAGCAGC ATTCCAGATT GGGTTCAATC AACAAGGTAC GAGCCATATC 6300 ACTTTATTCA AATTGGTACT GCCAAAACCA AGAAAGAACT CCCATCCTCA AAGGTTTGTA 6360 AGGAAGAATT CTCAGTCCAA AGCCTCAACA AGGTCAGGGT ACAGAGTCTC CAAACCATTA 6420 GCCAAAAGCT ACAGGAGATC AATGAAGAAT CTTCAATCAA AGTAAACTAC TGTTCCAGCA 6480 CATGCATCAT GGTCAGTAAG TTTCAGAAAA AGACATCCAC CGAAGACTTA AAGTTAGTGG 6540 GCATCTTTGA AAGTAATCTT GTCAACATCG AGCAGCTGGC TTGTGGGGAC CAGACAAAAA 6600 AGGAATGGTG CAGAATTGTT AGGCGCACCT ACCAAAAGCA TCTTTGCCTT TATTGCAAAG 6660 ATAAAGCAGA TTCCTCTAGT ACAAGTGGGG AACAAAATAA CGTGGAAAAG AGCTGTCCTG 6720 ACAGCCCACT CACTAATGCG TATGACGAAC GCAGTGACGA CCACAAAAGA ATTCCCTCTA 6780 TATAAGAAGG CATTCATTCC CATTTGAAGG ATCATCAGAT ACTGAACCAA TCCTTCTAGT 6840 AGATCTCCAC AATGGCTTCC TCTATGCTCT CTTCCGCTAC TATGGTTGCC TCTCCGGCTC 6900 AGGCCACTAT GGTCGCTCCT TTCAACGGAC TTAAGTCCTC CGCTGCCTTC CCAGCCACCC 6960 GCAAGGCTAA CAACGACATT ACTTCCATCA CAAGCAACGG CGGAAGAGTT AACTGCATGC 7020 AGGTGTGGCC TCCGATTGGA AAGAAGAAGT TTGAGACTCT CTCTTACCTT CCTGACCTTA 7080 CCGATTCCGG TGGTCGCGTC AACTGCATGC AGGCCATGGC TGAGAACCAC AAGAAGGTTG 7140 GTATCGCTGG AGCTGGAATC GTTGGTGTTT GCACTGCTTT GATGCTTCAA CGTCGTGGAT 7200 TCAAGGTTAC CTTGATTGAT CCAAACCCAC CAGGTGAAGG TGCTTCTTTC GGTAACGCTG 7260
-36 GTTGCTTCAA CGGTTCCTCC GTTGTTCCAA TGTCCATGCC AGGAAACTTG ACTAGCGTTC CAAAGTGGCT TCTTGACCCA ATGGGTCCAT TGTCCATCCG TTTCAGCTAC TTTCCAACCA TCATGCCTTG GTTGATTCGT TTCTTGCTTG CTGGAAGACC AAACAAGGTG AAGGAGCAAG CTAAGGCACT CCGTAACCTC ATCAAGTCCA CTGTGCCTTT GATCAAGTCC TTGGCTGAGG AGGCTGATGC TAGCCACCTT ATCCGTCACG AAGGTCACCT TACCGTGTAC CGTGGAGAAG CAGACTTCGC CAAGGACCGT GGAGGTTGGG AACTTCGTCG TCTCAACGGT GTTCGTACTC AAATCCTCAG CGCTGATGCA TTGCGTGATT TCGATCCTAA CTTGTCTCAC GCCTTTACCA AGGG/AATCCT TATCGAAGAG AACGGTCACA CCATCAACCC ACAAGGTCTC GTGACTCTCT TGTTTCGTCG TTTCATCGCT AACGGTCCAG AGTTCGTGTC TGCTCGTGTT ATCGGATTCG AGACTGAAGG TCGTGCTCTC AAGGGTATCA CCACCACCAA CGGTGTTCTT GCTGTTGATG CAGCTGTTGT TGCAGCTGGT GCACACTCCA AGTCTCTTGC TAACTCCCTT GGTGATGACA TCCCATTGGA TACCGAACGT GGATACCACA TCGTGATCGC CAACCCAGAA GCTGCTCCAC GTATTCCAAC TACCGATGCT TCTGGAAAGT TO
2. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 89 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: kétszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: NEM (iii) Antiszensz: NEM (xi) A szekvencia leírása: 2. számú szekvencia
GGATTGTGTT TGGGTTTTGT CTGTGTGTTT AATGTGTTTA AGGGATGAAT TAGAATGCTC TTAATCAACC TACAGCTGAT TTGGACCGG
7320
7380
7440
7500
7560
7620
7680
7740
7800
8 60
7920
98 0
12
3. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 697 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: kétszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii ) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 3. számú szekvencia
CGGTCCAAAT TTGTTTACAT TGTGTCCAAA TTTCGGCTGA TTTGGACTTC CCTAGCTATG 60
CCAACTAAGC TAATAAAAAA CATGAAACAA CAATTACAAA CTGTCGAGCA CACCTTCTAC 120
AAACTAGCTT AGATTTCTAT TGGAAGTTAC AAAACAGTAA AACTACCAAT AGGATACTAA 180
ATTAAACATA TTAAACTATT ACTCCTCAAA AGCTTGTACA ATTTGCAGAA GAAATGATGG 240
TTGCCCAAAA GCTTCAAAGG GAACCTGCTG GGAAGCCTGC TGGGACGCTG GGGATGCTGG 300
CAGCAGCATA CCTTGGCTTG AAGTACTCTT CTCTCATTGG TTTTGCTTCC CTTGCCCATG 360
TGGTCTTCAT ATGGCCTCAT TACTTCCCAA GGGCTTCAAA TCAGTAGGTG GTGGCAACCA 420
AAAGCATCAA AAACATCTCC TAAAACTAGC TTATACAACC GGATTACATG AGCTTATACT 480
AGCTTAACTC TTAAAGCATG ATTAACATAA TGATGTTTAA GGTGTCATTA AGTATTACTA 540
ATCTTGCTTA AGTAGAGATT AACATAGGAT TAGCCTAATC AAGTTGCTTA AGTAAGGTTT 600
TAGAATAAAC CGAGCTAGTT AGGCTTAAGT AGAGATTAAC ATAGGATTAG CCTAATCAAG 660
TTGCTTAAGT AAGGTTTTAG AATAAACCGA GCTAGTT 697
4. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 8798 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: kétszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 4. számú szekvencia
GGATTGTGTT TGGGTTTTGT CTGTGTGTTT AATGTGTTTA AGGGATGAAT TAGAATGCTC60
TTAATCAACC TACAGCTGAT TTGGACCGGA ACGACAATCT GATCCCCATC AAGCTTGAGC120
TCAGGATTTA GCAGCATTCC AGATTGGGTT CAATCAACAA GGTACGAGCC ATATCACTTT180
ATTCAAATTG GTATCGCCAA AACCAAGAAG GAACTCCCAT CCTCAAAGGT TTGTAAGGAA240
GAATTCTCAG TCCAAAGCCT CAACAAGGTC AGGGTACAGA GTCTCCAAAC CATTAGCCAA300
AAGCTACAGG AGATCAATGA AGAATCTTCA ATCAAAGTAA ACTACTGTTC CAGCACATGC360
ATCATGGTCA GTAAGTTTCA GAAAAAGACA TCCACCGAAG ACTTAAAGTT AGTGGGCATC420
TTTGAAAGTA ATCTTGTCAA CATCGAGCAG CTGGCTTGTG GGGACCAGAC AAAAAAGGAA480
TGGTGCAGAA TTGTTAGGCG CACCTACCAA AAGCATCTTT GCCTTTATTG CAAAGATAAA540
GCAGATTCCT CTAGTACAAG TGGGGAACAA AATAACGTGG AAAAGAGCTG TCCTGACAGC600
CCACTCACTA ATGCGTATGA CGAACGCAGT GACGACCACA AAAGAATTCC CTCTATATAA660
GAAGGCATTC ATTCCCATTT GAAGGATCAT CAGATACTGA ACCAATCCTT CTAGAAGATC720
TAAGCTTATC GATAAGCTTG ATGTAATTGG AGGAAGATCA AAATTTTCAA TCCCCATTCT780
TCGATTGCTT CAATTGAAGT TTCTCCGATG GCGCAAGTTA GCAGAATCTG CAATGGTGTG840
CAGAACCCAT CTCTTATCTC CAATCTCTCG AAATCCAGTC AACGCAAATC TCCCTTATCG900
GTTTCTCTGA AGACGCAGCA GCATCCACGA GCTTATCCGA TTTCGTCGTC GTGGGGATTG960
AAGAAGAGTG GGATGACGTT AATTGGCTCT GAGCTTCGTC CTCTTAAGGT CATGTCTTCT1020
GTTTCCACGG CGTGCATGCT TCACGGTGCA AGCAGCCGTC CAGCAACTGC TCGTAAGTCC1080
TCTGGTCTTT CTGGAACCGT CCGTATTCCA GGTGACAAGT CTATCTCCCA CAGGTCCTTC1140
ATGTTTGGAG GTCTCGCTAG CGGTGAAACT CGTATCACCG GTCTTTTGGA AGGTGAAGAT1200
GTTATCAACA CTGGTAAGGC TATGCAAGCT ATGGGTGCCA GAATCCGTAA GGAAGGTGAT1260
ACTTGGATCA TTGATGGTGT TGGTAACGGT GGACTCCTTG CTCCTGAGGC TCCTCTCGAT1320
TTCGGTAACG CTGCAACTGG TTGCCGTTTG ACTATGGGTC TTGTTGGTGT TTACGATTTC1380
GATAGCACTT TCATTGGTGA CGCTTCTCTC ACTAAGCGTC CAATGGGTCG TGTGTTGAAC1440
CCACTTCGCG AAATGGGTGT GCAGGTGAAG TCTGAAGACG GTGATCGTCT TCCAGTTCAA1500
TTGCGTGGAC CAAAGACTCC AACGCCAATC ACCTACAGGG TACCTCTGGC TTCCGCTCAA1560
GTGAAGTCCG CTGTTCTGCT TGCTGGTCTC AACACCCCAG GTATCACCAC TGTTATCGAG1620
CCAATCATGA CTCGTGACCA CACTGAAAAG ATGCTTCAAG GTTTTGGTGC TAACCTTACC1680
GTTGAGACTG ATGCTGACGG TGTGCGTACC ATCCGTCTTG AAGGTCGTGG TAAGCTCACC1740
GGTCAAGTGA TTGATGTTCC AGGTGATCCA TCCTCTACTG CTTTCCCATT GGTTGCTGCC1800
TTGCTTGTTC CAGGTTCCGA CGTCACCATC CTTAACGTTT TGATGAACCC AACCCGTACT1860
GGTCTCATCT TGACTCTGCA GGAAATGGGT GCCGACATCG AAGTGATCAA CCCACGTCTT1920
GCTGGTGGAG AAGACGTGGC TGACTTGCGT GTTCGTTCTT CTACTTTGAA GGGTGTTACT1980
GTTCCAGAAG ACCGTGCTCC TTCTATGATC GACGAGTATC CAATTCTCGC TGTTGCAGCT2040
GCATTCGCTG AAGGTGCTAC CGTTATGAAC GGTTTGGAAG AACTCCGTGT TAAGGAAAGC2100
-39 GACCGTCTTT CTGCTGTCGC AAACGGTCTC AAGCTCAACG GTGTTGATTG CGATGAAGGT2160
GAGACTTCTC TCGTCGTGCG TGGTCGTCCT GACGGTAAGG GTCTCGGTAA CGCTTCTGGA2220
GCAGCTGTCG CTACCCACCT CGATCACCGT ATCGCTATGA GCTTCCTCGT TATGGGTCTC2280
GTTTCTGAAA ACCCTGTTAC TGTTGATGAT GCTACTATGA TCGCTACTAG CTTCCCAGAG2340
TTCATGGATT TGATGGCTGG TCTTGGAGCT AAGATCGAAC TCTCCGACAC TAAGGCTGCT2400
TGATGAGCTC AAGAATTCGA GCTCGGTACC GGATCCTCTA GCTAGAGCTT TCGTTCGTAT2460
CATCGGTTTC GACAACGTTC GTCAAGTTCA ATGCATCAGT TTCATTGCGC ACACACCAGA2520
ATCCTACTGA GTTCGAGTAT TATGGCATTG GGAAAACTGT TTTTCTTGTA CCATTTGTTG2580
TGCTTGTAAT TTACTGTGTT TTTTATTCGG TTTTCGCTAT CGAACTGTGA AATGGAAATG2640
GATGGAGAAG AGTTAATGAA TGATATGGTC CTTTTGTTCA TTCTCAAATT AATATTATTT2700
GTTTTTTCTC TTATTTGTTG TGTGTTGAAT TTGAAATTAT AAGAGATATG CAAACATTTT2760
GTTTTGAGTA AAAATGTGTC AAATCGTGGC CTCTAATGAC CGAAGTTAAT ATGAGGAGTA2820
AAACACTTGT AGTTGTACCA TTATGCTTAT TCACTAGGCA ACAAATATAT TTTCAGACCT2880
AGAAAAGCTG CAAATGTTAC TGAATACAAG TATGTCCTCT TGTGTTTTAG ACATTTATGA2940
ACTTTCCTTT ATGTAATTTT CCAGAATCCT TGTCAGATTC TAATCATTGC TTTATAATTA3000
TAGTTATACT CATGGATTTG TAGTTGAGTA TGAAAATATT TTTTAATGCA TTTTATGACT3060
TGCCAATTGA TTGACAACAT GCATCAATCG ACCTGCAGCC ACTCGAAGCG GCCGCGTTCA3120
AGCTTCTGCA GGTCCGATGT GAGACTTTTC AACAAAGGGT AATATCCGGA AACCTCCTCG3180
GATTCCATTG CCCAGCTATC TGTCACTTTA TTGTGAAGAT AGTGGAAAAG GAAGGTGGCT3240
CCTACAAATG CCATCATTGC GATAAAGGAA AGGCCATCGT TGAAGATGCC TCTGCCGACA3300
GTGGTCCCAA AGATGGACCC CCACCCACGA GGAGCATCGT GGAAAAAGAA GACGTTCCAA3360
CCACGTCTTC AAAGCAAGTG GATTGATGTG ATGGTCCGAT GTGAGACTTT TCAACAAAGG3420
GTAATATCCG GAAACCTCCT CGGATTCCAT TGCCCAGCTA TCTGTCACTT TATTGTGAAG3480
ATAGTGGAAA AGGAAGGTGG CTCCTACAAA TGCCATCATT GCGATAAAGG AAAGGCCATC3540
GTTGAAGATG CCTCTGCCGA CAGTGGTCCC AAAGATGGAC CCCCACCCAC GAGGAGCATC3600
GTGGAAAAAG AAGACGTTCC AACCACGTCT TCAAAGCAAG TGGATTGATG TGATATCTCC3660
ACTGACGTAA GGGATGACGC ACAATCCCAC TATCCTTCGC AAGACCCTTC CTCTATATAA3720
GGAAGTTCAT TTCATTTGGA GAGGACACGC TGACAAGCTG ACTCTAGCAG ATCTCCATGG3780
TCCGTCCTGT AGAAACCCCA ACCCGTGAAA TCAAAAAACT CGACGGCCTG TGGGCATTCA3840
GTCTGGATCG CGAAAACTGT GGAATTGATC AGCGTTGGTG GGAAAGCGCG TTACAAGAAA3900
GCCGGGCAAT TGCTGTGCCA GGCAGTTTTA ACGATCAGTT CGCCGATGCA GATATTCGTA3960
ATTATGCGGG CAACGTCTGG TATCAGCGCG AAGTCTTTAT ACCGAAAGGT TGGGCAGGCC4020
AGCGTATCGT GCTGCGTTTC GATGCGGTCA CTCATTACGG CAAAGTGTGG GTCAATAATC4080
AGGAAGTGAT GGAGCATCAG GGCGGCTATA CGCCATTTGA AGCCGATGTC ACGCCGTATG4140
TTATTGCCGG GAAAAGTGTA CGTATCACCG TTTGTGTGAA CAACGAACTG AACTGGCAGA4200
CTATCCCGCC GGGAATGGTG ATTACCGACG AAAACGGCAA GAAAAAGCAG TCTTACTTCC4260
ATGATTTCTT TAACTATGCC GGAATCCATC GCAGCGTAAT GCTCTACACC ACGCCGAACA4320
CCTGGGTGGA CGATATCACC GTGGTGACGC ATGTCGCGCA AGACTGTAAC CACGCGTCTG4380
TTGACTGGCA GGTGGTGGCC AATGGTGATG TCAGCGTTGA ACTGCGTGAT GCGGATCAAC4440
AGGTGGTTGC AACTGGACAA GGCACTAGCG GGACTTTGCA AGTGGTGAAT CCGCACCTCT4500
GGCAACCGGG TGAAGGTTAT CTCTATGAAC TGTGCGTCAC AGCCAAAAGC CAGACAGAGT4560
GTGATATCTA CCCGCTTCGC GTCGGCATCC GGTCAGTGGC AGTGAAGGGC GAACAGTTCC4620
TGATTAACCA CAAACCGTTC TACTTTACTG GCTTTGGTCG TCATGAAGAT GCGGACTTAC4680
-40 GTGGCAAAGG ATTCGATAAC GTGCTGATGG TGCACGACCA AGCATTAATG GACTGGATTG 4740 GGGCCAACTC CTACCGTACC TCGCATTACC CTTACGCTGA AGAGATGCTC GACTGGGCAG 4800 ATGAACATGG CATCGTGGTG ATTGATGAAA CTGCTGCTGT CGGCTTTAAC CTCTCTTTAG 4860 GCATTGGTTT CGAAGCGGGC AACAAGCCGA AAGAACTGTA CAGCGAAGAG GCAGTCAACG 4920 GGGAAACTCA GCAAGCGCAC TTACAGGCGA TTAAAGAGCT GATAGCGCGT GACAAAAACC 4980 ACCCAAGCGT GGTGATGTGG AGTATTGCCA ACGAACCGGA TACCCGTCCT GCACGGGAAT 5040 ATTTCGGCAT TTCGCCACTG GCGGAAGCAA CGCGTAAACT CGACCCGACG CGTCCGATCA 5100 CCTGCGTCAA TGTAATGTTC TGCGACGCTC ACACCGATAC CATCAGCGAT CTCTTTGATG 5160 TGCTGTGCCT GAACCGTTAT TACGGATGGT ATGTCCAAAG CGGCGATTTG GAAACGGCAG 5220 AGAAGGTACT GGAAAAAGAA CTTCTGGCCT GGCAGGAGAA ACTGCATCAG CCGATTATCA 5280 TCACCGAATA CGGCGTGGAT ACGTTAGCCG GGCTGCACTC AATGTACACC GACATGTGGA 5340 GTGAAGAGTA TCAGTGTGCA TGGCTGGATA TGTATCACCG CGTCTTTGAT CGCGTCAGCG 5400 CCGTCGTCGG TGAACAGGTA TGGAATTTCG CCGATTTTGC GACCTCGCAA GGCATATTGC 5460 GCGTTGGCGG TAACAAGAAA GGGATCTTCA CTCGCGACCG CAAACCGAAG TCGGCGGCTT 5520 TTCTGCTGCA AAAACGCTGG ACTGGCATGA ACTTCGGTGA AAAACCGCAG CAGGGAGGCA 5580 AACAATGAAT CAACAACTCT CCTGGCGCAC CATCGTCGGC TACAGCCTCG GTGGGGAATT 5640 CGAGCTCGCC CGGGGATCCT CTAGCTAGAG CTTTCGTTCG TATCATCGGT TTCGACAACG 5700 TTCGTCAAGT TCAATGCATC AGTTTCATTG CGCACACACC AGAATCCTAC TGAGTTCGAG 5760 TATTATGGCA TTGGGAAAAC TGTTTTTCTT GTACCATTTG TTGTGCTTGT AATTTACTGT 5820 GTTTTTTATT CGGTTTTCGC TATCGAACTG TGAAATGGAA ATGGATGGAG AAGAGTTAAT 5880 GAATGATATG GTCCTTTTGT TCATTCTCAA ATTAATATTA TTTGTTTTTT CTCTTATTTG 5940 TTGTGTGTTG AATTTGAAAT TATAAGAGAT ATGCAAACAT TTTGTTTTGA GTAAAAATGT 6000 GTCAAATCGT GGCCTCTAAT GACCGAAGTT AATATGAGGA GTAAAACACT TGTAGTTGTA 6060 CCATTATGCT TATTCACTAG GCAACAAATA TATTTTCAGA CCTAGAAAAG CTGCAAATGT 6120 TACTGAATAC AAGTATGTCC TCTTGTGTTT TAGACATTTA TGAACTTTCC TTTATGTAAT 6180 TTTCCAGAAT CCTTGTCAGA TTCTAATCAT TGCTTTATAA TTATAGTTAT ACTCATGGAT 6240 TTGTAGTTGA GTATGAAAAT ATTTTTTAAT GCATTTTATG ACTTGCCAAT TGATTGACAA 6300 CATGCATCAA TCGACCTGCA GCCCAAGCTT GAGCTCAGGA TTTAGCAGCA TTCCAGATTG 6360 GGTTCAATCA ACAAGGTACG AGCCATATCA CTTTATTCAA ATTGGTATCG CCAAAACCAA 6420 GAAGGAACTC CCATCCTCAA AGGTTTGTAA GGAAGAATTC TCAGTCCAAA GCCTCAACAA 6480 GGTCAGGGTA CAGAGTCTCC AAACCATTAG CCAAAAGCTA CAGGAGATCA ATGAAGAATC 6540 TTCAATCAAA GTAAACTACT GTTCCAGCAC ATGCATCATG GTCAGTAAGT TTCAGAAAAA 6600 GACATCCACC GAAGACTTAA AGTTAGTGGG CATCTTTGAA AGTAATCTTG TCAACATCGA 6660 GCAGCTGGCT TGTGGGGACC AGACAAAAAA GGAATGGTGC AGAATTGTTA GGCGCACCTA 6720 CCAAAAGCAT CTTTGCCTTT ATTGCAAAGA TAAAGCAGAT TCCTCTAGTA CAAGTGGGGA 6780 ACAAAATAAC GTGGAAAAGA GCTGTCCTGA CAGCCCACTC ACTAATGCGT ATGACGAACG 6840 CAGTGACGAC CACAAAAGAA TTCCCTCTAT ATAAGAAGGC ATTCATTCCC ATTTGAAGGA 6900 TCATCAGATA CTGAACCAAT. CCTTCTAGAA GATCTCCACA ATGGCTTCCT CTATGCTCTC 6960 TTCCGCTACT ATGGTTGCCT CTCCGGCTCA GGCCACTATG GTCGCTCCTT TCAACGGACT 7020 TAAGTCCTCC GCTGCCTTCC CAGCCACCCG CAAGGCTAAC AACGACATTA CTTCCATCAC 7080 AAGCAACGGC GGAAGAGTTA ACTGCATGCA GGTGTGGCCT CCGATTGGAA AGAAGAAGTT 7140 TGAGACTCTC TCTTACCTTC CTGACCTTAC CGATTCCGGT GGTCGCGTCA ACTGCATGCA 7200 GGCCATGGCT GAGAACCACA AGAAGGTTGG ATACGCTGGA GCTGGAATCG TTGGTGTTTG 7260
CACTGCTTTG ATGCTTCAAC GTCGTGGATT CAAGGTTACC TTGATTGATC CAAACCCACC 7320 AGGTGAAGGT GCTTCTTTCG GTAACGCTGG TTGCTTCAAC GGTTCCTCCG TTGTTCCAAT 7380 GTCCATGCCA GGAAACTTGA CTAGCGTTCC AAAGTGGCTT CTTGACCCAA TGGGTCCATT 7440 GTCCATCCGT TTCAGCTACT TTCCAACCAT CATGCCTTGG TTGATTCGTT TCTTGCTTGC 7500 TGGAAGACCA AACAAGGTGA AGGAGCAAGC TAAGGCACTC CGTAACCTCA TCAAGTCCAC 7560 TGTGCCTTTG ATCAAGTCCT TGGCTGAGGA GGCTGATGCT AGCCACCTTA TCCGTCACGA 7620 AGGTCACCTT ACCGTGTACC GTGGAGAAGC AGACTTCGCC AAGGACCGTG GAGGTTGGGA 7680 ACTTCGTCGT CTCAACGGTG TTCGTACTCA AATCCTCAGC GCTGATGCAT TGCGTGATTT 7740 CGATCCTAAC TTGTCTCACG CCTTTACCAA GGGAATCCTT ATCGAAGAGA ACGGTCACAC 7800 CATCAACCCA CAAGGTCTCG TGACTCTCTT GTTTCGTCGT TTCATCGCTA ACGGTGGAGA 7860 GTTCGTGTCT GCTCGTGTTA TCGGATTCGA GACTGAAGGT CGTGCTCTCA AGGGTATCAC 7920 CACCACCAAC GGTGTTCTTG CTGTTGATGC AGCTGTTGTT GCAGCTGGTG CACACTGGAA 7980 GTCTCTTGCT AACTCCCTTG GTGATGACAT CCCATTGGAT ACCGAACGTG GATACCACAT 8040 CGTGATCGCC AACCCAGAAG CTGCTCCACG TATTCCAACT ACCGATGCTT CTGGAAAGTT 8100 CCGGTCCAAA TTTGTTTACA TTGTGTCCAA ATTTCGGCTG ATTTGGACTT CCCTAGCTAT 8160 GCCAACTAAG CTAATAAAAA ACATGAAACA ACAATTACAA ACTGTCGAGC ACACCTTCTA 8220 CAAACTAGCT TAGATTTCTA TTGGAAGTTA CAAAACAGTA AAACTACCAA TAGGATACTA 8280 AATTAAACAT ATTAAACTAT TACTCCTCAA AAGCTTGTAC AATTTGCAGA AGAAATGATG 8340 GTTGCCCAAA AGCTTCAAAG GGAACCTGCT GGGAAGCCTG CTGGGACGCT GGGGATGCTG 8400 GCAGCAGCAT ACCTTGGCTT GAAGTACTCT TCTCTCATTG GTTTTGCTTC CCTTGCCCAT 8460 GTGGTCTTCA TATGGCCTCA TTACTTCCCA AGGGCTTCAA ATCAGTAGGT GGTGGCAACC 8520 AAAAGCATCA AAAACATCTC CTAAAACTAG ATTATACAAC AGGATTACAT GAGCTTATAC 8580 TAGCTTAACT CTTAAAGCAT GATTAACATA ATGATGTTTA AGGTGTCATT AAGTATTACT 8640 AATCTTGCTT AAGTAGAGAT TAACATAGGA TTAGCCTAAT CAAGTTGCTT AAGTAAGGTT 8700 TTAGAATAAA CCGAGCTAGT TAGGCTTAAG TAGAGATTAA CATAGGATTA GCCTAATCAA 8760 GTTGCTTAAG TAAGGTTTTA GAATAAACCG AGCTAGTT 8798
5. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 8418 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: kétszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem
-42 (iii) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 5. számú szekvencia
AAGCTTGAGC TCAGGATTTA GCAGCATTCC AGATTGGGTT CAATCAACAA GGTACGAGCC 60 ATATCACTTT ATTCAAATTG GTATCGCCAA AACCAAGAAG GAACTCCCAT CCTCAAAGGT 120 TTGTAAGGAA GAATTCTCAG TCCAAAGCCT CAACAAGGTC AGGGTACAGA GTCTCCAAAC 180 CATTAGCCAA AAGCTACAGG AGATCAATGA AGAATCTTCA ATCAAAGTAA ACTACTGTTC 240 CAGCACATGC ATCATGGTCA GTAAGTTTCA GAAAAAGACA TCCACCGAAG ACTTAAAGTT 300 AGTGGGCATG TTTGAAAGTA ATCTTGTCAA CATCGAGCAG CTGGCTTGTG GGGACCAGAC 360 AAAAAAGGAA TGGTGCAGAA TTGTTAGGCG CACCTACCAA AAGCATCTTT GCCTTTATTG 420 CAAAGATAAA GCAGATTCCT CTAGTACAAG TGGGGAACAA AATAACGTGG AAAAGAGCTG 480 TCCTGACAGC CCACTCACTA ATGCGTATGA CGAACGCAGT GACGACCACA AAAGAATTCC 540 CTCTATATAA GAAGGCATTC ATTCCCATTT GAAGGATCAT CAGATACTGA ACCAATCCTT 600 CTAGAAGATC TAAGCTTATC GATAAGCTTG ATGTAATTGG AGGAAGATCA AAATTTTCAA 660 TCCCCATTCT TCGATTGCTT CAATTGAAGT TTCTCCGATG GCGCAAGTTA GCAGAATCTG 720 CAATGGTGTG CAGAACCCAT CTCTTATCTC CAATCTCTCG AAATCCAGTC AACGCAAATC 780 TCCCTTATCG GTTTCTCTGA AGACGCAGCA GCATCCACGA GCTTATCCGA TTTCGTCGTC 840 GTGGGGATTG AAGAAGAGTG GGATGACGTT AATTGGCTCT GAGCTTCGTC CTCTTAAGGT 900 CATGTCTTCT GTTTCCACGG CGTGCATGCT TCACGGTGCA ACGAGCCGTC CAGCAACTGC 960 TCGTAAGTCC TCTGGTCTTT CTGGAACCGT CCGTATTCCA GGTGACAAGT CTATCTCCCA 1020 CAGGTCCTTC ATGTTTGGAG GTCTCGCTAG CGGTGAAACT CGTATCACCG GTCTTTTGGA 1080 AGGTGAAGAT GTTATCAACA CTGGTAAGGC TATGCAAGCT ATGGGTGCCA GAATCCGTAA 1140 GGAAGGTGAT ACTTGGATCA TTGATGGTGT TGGTAACGGT GGACTCCTTG CTCCTGAGGC 1200 TCCTCTCGAT TTCGGTAACG CTGCAACTGG TTGCCGTTTG ACTATGGGTC TTGTTGGTGT 1260 TTACGATTTC GATAGCACTT TCATTGGTGA CGCTTCTCTC ACTAAGCGTC CAATGGGTCG 1320 TGTGTTGAAC CCACTTCGCG AAATGGGTGT GCAGGTGAAG TGTGAAGACG GTGATCGTCT 1380 TCCAGTTACC TTGCGTGGAC CAAAGACTCC AACGCCAATC ACCTACAGGG TACCTATGGC 1440 TTCCGCTCAA GTGAAGTCGG CTGTTCTGCT TGCTGGTCTC AACACCCCAG GTATCACCAC 1500 TGTTATCGAG CCAATCATGA CTCGTGACCA CACTGAAAAG ATGCTTCAAG GTTTTGGTGC 1560 TAACCTTACC GTTGAGACTG ATGCTGACGG TGTGCGTACC ATCCGTCTTG AAGGTCGTGG 1620 TAAGCTCACC GGTCAAGTGA TTGATGTTCC AGGTGATCCA TCCTCTACTG CTTTCCCATT 1680 GGTTGCTGCC TTGCTTGTTC CAGGTTCCGA CGTCACCATC CTTAACGTTT TGATGAACCC 1740 AACCCGTACT GGTCTCATCT TGACTCTGCA GGAAATGGGT GCCGACATCG AAGCGATCAA 1800 CCCACGTCTT GCTGGTGGAG AAGACGTGGC TGACTTGCGT GTTCGTTCTT CTACTTTGAA 1860 GGGTGTTACT GTTCCAGAAG ACCGCGCTCC TTCTATGATC GACGAGTATC CAATTCTCGC 1920 TGTTGCAGCT GCATTCGCTG AAGGTGCTAC CGTTATGAAC GGTTTGGAAG AACTCCGTGT 1980 TAAGGAAAGC GACCGTCTTT CTGCTGTCGC AAACGGTCTC AAGCTCAACG GCGTTGATTG 2040 CGATGAAGGT GAGACTTCTC TCGTCGTGCG TGGTCGTCCT GACGGTAAGG GTCTCGGTAA 2100 CGCTTCTGGA GCAGCTGTCG CTACCCACCT CGATCACCGT ATCGCTATGA GCTTCCTCGT 2160 TATGGGTCTC GTTTCTGAAA ACCCTGTTAC TGTTGATGAT GCTACTATGA TCGCTACTAG 2220 CTTCCCAGAG TTCATGGATT TGATGGCTGG TCTTGGAGCT AAGATCGAAC TCTCCGACAC 2280 TAAGGCTGCT TGCTGCGCTC AAGAATTCGA GCTCGGTACC GGATCCTCTA GCTAGAGCTT 2340
-43 TCGTTCGTAT CATCGGTTTC GACAACGTTC GTCAAGTTCA ATGCATCAGT TTCATTGCGC ACACACCAGA ATCCTACTGA GTTCGAGTAT TATGGCATTG GGAAAACTGT TTTTCTTGTA CCATTTGTTG TGCTTGTAAT TTACTGTGTT TTTTATTCGG TTTTCGCTAT CGAACTGTGA AATGGAAATG GATGGAGAAG AGTTAATGAA TGATATGGTC CTTTTGTTCA TTCTCAAATT AATATTATTT GTTTTTTCTC TTATTTGTTG TGTGTTGAAT TTGAAATTAT AAGAGATATG CAAACATTTT GTTTTGAGTA AAAATGTGTC AAATCGTGGC CTCTAATGAC CGAAGTTAAT ATGAGGAGTA AAACACTTGT AGTTGTACCA TTATGCTTAT TCACTAGGCA ACAAATATAT TTTCAGACCT AGAAAAGCTG CAAATGTTAC TGAATACAAG TATGTCCTCT TGTGTTTTAG ACATTTATGA ACTTTCCTTT ATGTAATTTT CCAGAATCCT TGTCAGATTC TAATCATTGC TTTATAATTA TAGTTATACT CATGGATTTG TAGTTGAGTA TGAAAATATT TTTTAATGCA TTTTATGACT TGCCAATTGA TTGACAACAT GCATCAATCG ACCTGCAGCC ACTCGAAGCG GCCGCGTTCA AGCTTCTGCA GGTCCGATGT GAGACTTTTG AACAAAGGGT AATATCCGGA AACCTCCTCG GATTCCATTG CCCAGCTATC TGTCACTTTA TTGTGAAGAT AGTGGAAAAG GAAGGTGGCT CCTACAAATG CCATCATTGC GATAAAGGAA AGGCCATCGT TGAAGATGCC TCTGCCGACA GTGGTCCCAA AGATGGACCC CCACCCACGA GGAGCATCGT GGAAAAAGAA GACGTTCCAA CCACGTCTTC AAAGCAAGTG GATTGATGTG ATGGTCCGAT GTGAGACTTT TCAACAAAGG GTAATATCCG GAAACCTCCT CGGATTCCAT TGCCCAGCTA TCTGTCACTT TATTGTGAAG ATAGTGGAAA AGGAAGGTGG CTCCTACAAA TGCCATCATT GCGATAAAGG AAAGGCCATC GTTGAAGATG CCTCTGCCGA CAGTGGTCCC AAAGATGGAC CCCCACCCAC GAGGAGCATC GTGGAAAAAG AAGACGTTCC AACCACGTCT TCAAAGCAAG TGGATTGATG TGATATCTCC ACTGACGTAA GGGATGACGC ACAATCCCAC TATCCTTCGC AAGACCCTTC CTCTATATAA GGAAGTTCAT TTCATTTGGA GAGGACACGC TGACAAGCTG ACTCTAGCAG ATCTCCATGG TCCGTCCTGT AGAAACCCCA ACCCGTGAAA TCAAAAAACT CGACGGCCTG TGGGCATTCA GTCTGGATCG CGAAAACTGT GGAATTGATC AGCGTTGGTG GGAAAGCGCG TTACAAGAAA GCCGGGCAAT TGCTGTGCCA GGCAGTTTTA ACGATCAGTT CGCCGATGCA GATATTCGTA ATTATGCGGG CAACGTCTGG TATCAGCGCG AAGTCTTTAT ACCGAAAGGT TGGGCAGGCC AGCGTATCGT GCTGCGTTTC GATGCGGTCA CTCATTACGG CAAAGTGTGG GTCAATAATC AGGAAGTGAT GGAGCATCAG GGCGGCTATA CGCCATTTGA AGCCGATGTC ACGCCGTATG TTATTGCCGG GAAAAGTGTA CGTATCACCG TTTGTGTGAA CAACGAACTG AACTGGCAGA CTATCCCGCC GGGAATGGTG ATTACCGACG AAAACGGCAA GAAAAAGCAG TCTTACTTCC ATGATTTCTT TAACTATGCC GGAATCCATC GCAGCGTAAT GCTCTACACC ACGCCGAACA CCTGGGTGGA CGATATCACC GTGGTGACGC ATGTCGCGCA AGACTGTAAC CACGCGTCTG TTGACTGGCA GGTGGTGGCC AATGGTGATG TCAGCGTTGA ACTGCGTGAT GCGGATCAAC AGGTGGTTGC AACTGGACAA GGCACTAGCG GGACTTTGCA AGTGGTGAAT CCGCACCTCT GGCAACCGGG TGAAGGTTAT CTCTATGAAC TGTGCGTCAC AGCCAAAAGC CAGACAGAGT GTGATATCTA CCCGCTTCGC GTCGGCATCC GGTCAGTGGC AGTGAAGGGC GAACAGTTCC TGATTAACCA CAAACCGTTC TACTTTACTG GCTTTGGTCG TCATGAAGAT GCGGACTTAC GTGGCAAAGG ATTCGATAAC GTGCTGATGG TGCACGACCA CGCATTAATG GACTGGATTG GGGCCAACTC CTACCGTACC TCGCATTACC CTTACGCTGA AGAGATGCTC GACTGGGCAG ATGAACATGG CATCGTGGTG ATTGATGAAA CTGCTGCTGT CGGCTTTAAC CTCTCTTTAG GCATTGGTTT CGAAGCGGGC AACAAGCCGA AAGAACTGTA CAGCGAAGAG GCAGTCAACG GGGAAACTCA GCAAGCGCAC TTACAGGCGA TTAAAGAGCT GATAGCGCGT GACAAAAACC ACCCAAGCGT GGTGATGTGG AGTATTGCCA ACGAACCGGA TACCCGTCCT
2400 2460 2520 2580 1640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 30 60 3120 318 0 324 0 3300 3 360 3420 34 8 0 35 4 0 3600 3660 3720 37 8 0 38 4 0 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260' 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920
-44 GCACGGGAAT ATTTCGGCAT TTCGCCACTG GCGGAAGCAA CGCGTAAACT CGACCCGACG 4980 CGTCCGATCA CCTGCGTCAA TGTAATGTTC TGCGACGCTC ACACCGATAC CATCAGCGAT 5040 CTCTTTGATG TGCTGTGCCT GAACCGTTAT TACGGATGGT ATGTCCAAAG CGGCGATTTG 5100 GAAACGGCAG AGAAGGTACT GGAAAAAGAA CTTCTGGCCT GGCAGGAGAA ACTGCATCAG 5160 CCGATTATCA TCACCGAATA CGGCGTGGAT ACGTTAGCCG GGCTGCACTC AATGTACACC 5220 GACATGTGGA GTGAAGAGTA TCAGTGTGCA TGGCTGGATA TGTATCACCG CGTCTTTGAT 5280 CGCGTCAGCG CCGTCGTCGG TGAACAGGTA TGGAATTTCG CCGATTTTGC GACCTCGCAA 5340 GGCATATTGC GCGTTGGCGG TAACAAGAAA GGGATCTTCA CTCGCGACCG CAAACCGAAG 5400 TCGGCGGCTT TTCTGCTGCA AAAACGCTGG ACTGGCATGA ACTTCGGTGA AAAACCGCAG 5460 CAGGGAGGCA AACAATGAAT CAACAACTCT CCTGGCGCAC CATCGTCGGC TACAGCCTCG 5520 GTGGGGAATT CGAGCTCGCC CGGGGATCCT CTAGCTAGAG CTTTCGTTCG TATCATCGGT 5580 TTCGACAACG TTCGTCAAGT TCAATGCATC AGTTTCATTG CGCACACACC AGAATCCTAC 5640 TGAGTTCGAG TATTATGGCA TTGGGAAAAC TGTTTTTCTT GTACCATTTG TTGTGCTTGT 5700 AATTTACTGT GTTTTTTATT CGGTTTTCGC TATCGAACTG TGAAATGGAA ATGGATGGAG 5760 AAGAGTTAAT GAATGATATG GTCCTTTTGT TCATTCTCAA ATTAATATTA TTTGTTTTTT 5820 CTCTTATTTG TTGTGTGTTG AATTTGAAAT TATAAGAGAT ATGCAAACAT TTTGTTTTGA 5880 GTAAAAATGT GTCAAATCGT GGCCTCTAAT GACCGAAGTT AATATGAGGA GTAAAACACT 5940 TGTAGTTGTA CCATTATGCT TATTCACTAG GCAACAAATA TATTTTCAGA CCTAGAAAAG 6000 CTGCAAATGT TACTGAATAC AAGTATGTCC TGTTGTGTTT TAŰACATTTA TGAACTTTCC 6060 TTTATGTAAT TTTCCAGAAT CCTTGTCAGA TTCTAATCAT TGCTTTATAA TTATAGTTAT 6120 ACTCATGGAT TTGTAGTTGA GTATGAAAAT ATTTTTTAAT GCATTTTATG ACTTGCCAAT 6180 TGATTGACAA CATGCATCAA TCGACCTGCA GCCCAAGCTT GAGCTCAGGA TTTAGCAGCA 6240 TTCCAGATTG GGTTCAATCA ACAAGGTACG AGCCATATCA CTTTATTCAA ATTGGTATCG 6300 CCAAAACCAA GAAGGAACTC CCATCCTCAA AGGTTTGTAA GGAAGAATTC TCAGTCCAAA 6360 GCCTCAACAA GGTCAGGGTA CAGAGTCTCC AAACCATTAG CCAAAAGCTA CAGGAGATCA 6420 ATGAAGAATC TTCAATCAAA GTAAACTACT GTTCCAGCAC ATGCATCATG GTCAGTAAGT 6480 TTCAGAAAAA GACATCCACC GAAGACTTAA AGTTAGTGGG CATCTTTGAA AGTAATCTTG 6540 TCAACATCGA GCAGCTGGCT TGTGGGGACC AGACAAAAAA GGAATGGTGC AGAATTGTTA 6600 GGCGCACCTA CCAAAAGCAT CTTTGCCTTT ATTGCAAAGA TAAAGCAGAT TCCTCTAGTA 6660 CAAGTGGGGA ACAAAATAAC GTGGAAAAGA GCTGTCCTGA CAGCCCACTG ACTAATGCGT 6720 ATGACGAACG CAGTGACGAC CACAAAAGAA TTCCCTCTAT ATAAGAAGGC ATTCATTCCC 6780 ATTTGAAGGA TCATCAGATA CTGAACCAAT CCTTCTAGAA GATCTCCACA ATGGCTTCCT 6840 CTATGCTCTC TTCCGCTACT ATGGTTGCCT CTCCGGCTCA GGCCACTATG GTCGCTCCTT 6900 TCAACGGACT TAAGTCCTCC GCTGCCTTCC CAGCCACCCG CAAGGCTAAC CCAGACATTA 6960 CTTCCATCAC AAGCAACGGA GGAAGAGTTA ACTGCATGCA GGTGTGGCCT CCGATTGGAA 7020 AGAAGAAGTT TGAGACTCTC TCTTACCTTC CTGACCTTAC CGATTCCGGT GGTCGCGTCA 7080 ACTGCATGCA GGCCATGGCT GAGAACCACA AGAAGGTTGG TATCGCTGGA GCTGGAATCG 7140 TTGGTGTTTG CACTGCTTTG ATGCTTCAAC GTCGTGGATT CAAGGTTACC TTGATTGATC 7200 CAAACCCACC AGGTGAAGGT GCTTCTTTCG GTAACGCTGG TTGCTTCAAC GGTTCCTCCG 7260 TTGTTCCAAT GTCCATGCCA GGAAACTTGA CTAGCGTTCC AAAGTGGCTT CTTGACCCAA 7320 TGGGTCCATT GTCCATCCGT TTCAGCTACT TTCCAACCAT.CATGCCTTGG TTGATTCGTT 7380 TCTTGCTTGC TGGAAGACCA AACAAGGTGA AGGAGCAAGC TAAGGCACTC CGTAACCTCA 7440 TCAAGTCCAC TGTGCCTTTG ATCAAGTCCT TGGCTGAGGA GGCTGATGCT AGCCACCTTA 7500
-45 TCCGTCACGA AGGTCACCTT ACCGTGTACC GTGGAGAAGC AGACTTCGCC AAGGACCGTG 7560 GAGGTTGGGA ACTTCGTCGT CTCAACGGTG TTCGTACTCA AATCCTCAGC GCTGATGCAT 7620 TGCGTGATTT CGATCCTAAC TTGTCTCACG CCTTTACCAA GGGAATCCTT ATCGAAGAGA 7680 ACGGTCACAC CATCAACCCA CAAGGTCTCG TGACTCTCTT GTTTCGTCGT TTCATCGCTA 7740 ACGGTGGAGA GTTCGTGTCT GCTCGTGTTA TCGGATTCGA GACTGAAGGT CGTGCTCTCA 7800 AGGGTATCAC CACCACCAAC GGTGTTCTTG CTGTTGATGC AGCTGTTGTT GCAGCTGGTG 7860 CACACTCCAA GTCTCTTGCT AACTCCCTTG GTGATGACAT CCCATTGGAT ACCGAACGTG 7920 GATACCACAT CGTGATCGCC AACCCAGAAG CTGCTCCACG TATTCCAACT ACCGATGCTT 7980 CTGGAAAGTT CATCGCTACT CCTATGGAGA TGGGTCTTCG TGTTGCTGGA ACCGTTGAGT 8040 TCGCTGGTCT CACTGCTGCT CCTAACTGGA AGCGTGCTCA CGTTCTCTAC ACTCACGCTC 8100 GTAAGTTGCT TCCAGCTCTC GCTCCTGCCA GTTCTGAAGA ACGTTACTCC AAGTGGATGG 8160 GTTTCCGTCC AAGCATCCCA GATTCCCTTC CAGTGATTGG TCGTGCTACC CGTACTCCAG 8220 ACGTTATCTA AGCTTTCGGT CACGGTCACC TCGGTATGAC TGGTGCTCCA ATGACCGCAA 8280 CCCTCGTTTC TGAGCTCCTC GCAGGTGAGA AGACCTCTAT CGACATCTCT CCATTCGCAC 8340 CAAACCGTTT CGGTATTGGT AAGTCCAAGC AAACTGGTCC TGCATCCTAA GTGGGAATTC 8400 GAGCTCGGTA CCGGATCC 8/18
6. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii ) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 6. számú szekvencia:
CACCGGTCTT TTGGAAGGTG AAG
7. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNA (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii ) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 7. számú szekvencia
AACGAGACCC ATAACGAGGA AGC 23
8. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szélitípus: egyszédú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii ) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 8. számú szekvencia
AAACAGTCCC GTGCATCCCC AAC
9. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii ) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 9. számú szekvencia
GACGCTCTCC TTGATTCTGT CCC 23
10. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii ) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 10. számú szekvencia
CAAGAAGGTT GGTATCGCTG
11. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 11. számú szekvencia
TCTTTTGTGG TCGTCACTGC GTT 23
12. számú szekvencíavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 24 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii ) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 12. számú szekvencia
GCGAGCTCTA ATACGACTCA CTAT
13. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egy szálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 13. számú szekvencia
CGCGAGCTCA ATTAACCCTC ACT 23
14, számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egy szálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii ) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 14. számú szekvencia
TCTGTACCCT GACCTTGTTG
15. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii ) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 15. számú szekvencia
CGTGGATACC ACATCGTGAT 20
16. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 19 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii ) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 16. számú szekvencia
ACCTTGGCTT GAAGTACTC
17. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál típus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa:DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 17. számú szekvencia
TCAACCTACA GCTGATTTGG ACC
18. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 22 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii ) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 18. számú szekvencia
GGACCGGAAC GACAATCTGA TC
19. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 22 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii ) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 19. számú szekvencia
CTAGGGAAGT CCAAATCAGC CG
20. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii ) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 20. számú szekvencia
TTTGGACCGG AACTTTCCAG AAG
21. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltipus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii ) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 21. számú szekvencia
CTAACTTGCG CCATCGGAGA AAC
22. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS ( genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii ) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 22. számú szekvencia
GACTTGTCAC CTGGAATACG GAC
23. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii ) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 23. számú szekvencia
ATTCTTGAGC TCATCAAGCA GCC 23
24. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 22 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii ) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 24. számú szekvencia
AAGGTTGGTA TCGCTGGAGC TG
25. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii ) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 25. számú szekvencia
TCTCCACAAT GGCTTCCTCT ATG
26. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 671 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: kétszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii ) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 26. számú szekvencia
CAAGATGGAT TGCACGCAGG TTCTCCGGCC GCTTGGGTGG AGAGGCTATT CGGCTATGAC 60
TGGGCACAAC AGACAATCGG CTGCTCTGAT GCCGCCGTGT TCCGGCTGTC AGCGCAGGGG 120
-56 CGCCCGGTTC TTTTTGTCAA GACCGACCTG TCCGGTGCCC TGAATGAACT GCAGGACGAG180
GCAGCGCGGC TATCGTGGCT GGCCACGACG GGCGTTCCTT GCGCAGCTGT GCTCGACGTT240
GTCACTGAAG CGGGAAGGGA CTGGCTGCTA TTGGGCGAAG TGCCGGGGCA GGATCTCCTG300
TCATCTCACC TTGCTCCTGC CGAGAAAGTC TCCATCATGG CTGATGCAAT GCGGCGGCTG360
CATACGCTTG ATCCGGCTAC CTGCCCATTC GACCACCAAG CGAAACATCG CATCGAGCGA420
GCACGTACTC GGATGGAAGC CGGTCTTGTC GATCAGGATG ATCTGGACGA AGAGCATCAG480
GGGCTCGCGC CAGCCGAACT GTTCGCCAGG CTCAAGGCGC GCATGCCCGA CGGCGAGGAT540
CTCGTCGTGA CCCATGGCGA TGCCTGCTTG CCGAATATCA TGGTGGAAAA TGGCCGCTTT600
TCTGGATTCA TCGACTGTGG CCGGCTGGGT GTGGCGGACC GCTATCAGGA CATAGCGTTG660
GCTACCCGTG A
27. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 739 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: kétszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 27. számú szekvencia
GGACCGGAAC GACAATCTGA TCCCCATCAA GCTTGAGCTC AGGATTTAGC AGCATTCCAG 60
ATTGGGTTCA ATCAACAAGG TACGAGCCAT ATCACTTTAT TCAAATTGGT ATCGCCAAAA 120
CCAAGAAGGA ACTCCCATCC TCAAAGGTTT GTAAGGAAGA ATTCTCAGTC CAAAGCCTCA 180
ACAAGGTCAG GGTACAGAGT CTCCAAACCA TTAGCCAAAA GCTACAGGAG ATCAATGAAG 240
AATCTTCAAT CAAAGTAAAC TACTGTTCCA GCACATGCAT CATGGTCAGT AAGTTTCAGA 300
AAAAGACATC CACCGAAGAC TTAAAGTTAG TGGGCATCTT TGAAAGTAAT CTTGTCAACA 360
TCGAGCAGCT GGCTTGTGGG GACCAGACAA AAAAGGAATG GTGCAGAATT GTTAGGCGCA 420
CCTACCAAAA GCATCTTTGC CTTTATTGCA AAGATAAAGC AGATTCCTCT AGTACAAGTG 480
GGGAACAAAA TAACGTGGAA AAGAGCTGTC CTGACAGCCC ACTCACTAAT GCGTATGACG 540
AACGCAGTGA CGACCACAAA AGAATTCCCT ATATATAAGA AGGCATTCAT TCCCATTTGA 600
AGGATCATCA GATACTGAAC CAATCCTTCT AGAAGATCTA AGCTTATCGA TAAGCTTGAT 660
GTAATTGGAG GAAGATCAAA ATTTTCAATC CCCATTCTTC GATTGCTTCA ATTGAAGTTT 720
CTCCGATGGC GCAAGTTAG 739
Claims (15)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Cukorrépa növény, beleértve az utódait is, ami cp4/ epsps enzimaktivitást expresszál.
- 2. Az 1. igénypont szerinti növény, amiben a 27. számú szekvenciával leírható DNS a növény genomjának részét képezi.
- 3. Az 1. igénypont szerinti növény, aminek a genomiális DNS-ét templátként használó PCR amplifikálás egy 834 bázispár méretű DNS fragmens amplifikálását eredményezi, ha a 20. és a 24. számú szekvenciával jellemezhető oligonukleotid primerpárokat használjuk.
- 4. Az 1. igénypont szerinti növény, aminek a genomiális DNS-ét templátként használó PCR amplifikálás egy 1057 bázispár méretű DNS fragmens amplifikálását eredményezi, ha a 17. és a 22. számú szekvenciával jellemezhető oligonukleotid primerpárokat használjuk.
- 5. Az 1. igénypont szerinti növény, aminek a genomiális DNS-ét templátként használó PCR amplifikálás egy 1224 bázispár méretű DNS fragmens amplifikálását eredményezi, ha a 19. és a 25. számú szekvenciával jellemezhető oligonukleotid primerpárokat használjuk.
- 6. Az 1. igénypont szerinti növény, amiben az 1. számú szekvenciával leírható DNS a növény genomjának részét képezi.
- 7. A 6. igénypont szerinti növény, amiben az említett nukleotid szekvencia erősen ismétlődő DNS szekvenciákat helyettesít.
- 8. A 6. igénypont szerinti növény, amiben a genomnak az említett nukleotid szekvenciához közvetlenül kapcsolódó részeit a 2. és 3. számú szekvenciavázlat írja le.
- 9. A 7. igénypont szerinti növény, aholis a 4. számú szekvenciával jellemezhető DNS a növény genomjának részét képezi.
- 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti növény magjai.
- 11. A 6. igénypont szerinti növény magja, amit NCIMB 97087006/2 számon helyeztünk letétbe.
- 12. Eljárás az 1. igénypont szerinti transzgenikus cukorrépa növény előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket alkalmazzuk:(a) in vitro nőtt cukorrépa szikleveleket transzformálunk Agrobacteriumokkal, amik egy cp4/epsps-t kódoló DNS darabot tartalmazó vektort hordoznak;(b) hajtásokat regenerálunk glifozát jelenlétében;(c) a hajtásokat talajba ültetjük üvegházban;(d) a növénykéket glifozáttal kezeljük;(e) 0 és 9 között vizuálisan kiértékeljük a növények életképességét és a levelek klorózisát;(g) olyan növényeket szelektálunk, amiknek az életképesség! és levél-klorózis értéke 9; és (h) a kiválasztott növényeket hagyományos nemesítés! technikákkal szaporítjuk.
- 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a cp4/epsps fehérjét kódoló vektor egy olyan vektor, ami az 5. számú nukleotid szekvenciával rendelkező DNS darabot tartal mazza.
- 14. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a regenerált hajtásokat PCR-rel elemezzük, hogy tartalmazzák-e a cp4/epsps-t kódoló DNS-t.
- 15. Glifozát-toleráns cukorrépa növény, beleértve az utódait is, amit egy olyan génnek Agrobacterium által közvetített transzformációjával kapunk meg, ami lehetővé teszi cp4/epsps expresszióját növényekben, és amely növényből a T-DNS-nek mind a jobboldali, mind a baloldali határoló szekvenciái hiányoznak.A meghatalmazott ifj. Szentpéteri A<szabadalmi ügyvivő
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11200397P | 1997-10-31 | 1997-10-31 | |
| PCT/EP1998/006859 WO1999023232A1 (en) | 1997-10-31 | 1998-10-29 | Glyphosate resistant transgenic plants |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0001729A2 true HUP0001729A2 (hu) | 2000-09-28 |
| HUP0001729A3 HUP0001729A3 (en) | 2002-04-29 |
Family
ID=22341613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0001729A HUP0001729A3 (en) | 1997-10-31 | 1998-10-29 | Glyphosate resistant transgenic plants |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6204436B1 (hu) |
| EP (1) | EP0950109A1 (hu) |
| JP (1) | JP2001503280A (hu) |
| CN (1) | CN1148453C (hu) |
| AU (1) | AU1558099A (hu) |
| CA (1) | CA2279258A1 (hu) |
| CZ (1) | CZ300208B6 (hu) |
| DE (1) | DE19881833B4 (hu) |
| DK (1) | DK199900916A (hu) |
| FI (1) | FI991221A7 (hu) |
| GB (1) | GB2337263A (hu) |
| HU (1) | HUP0001729A3 (hu) |
| PL (1) | PL197872B1 (hu) |
| RU (1) | RU2224024C2 (hu) |
| SE (1) | SE520353C2 (hu) |
| SK (1) | SK88599A3 (hu) |
| TR (1) | TR199901515T1 (hu) |
| UA (1) | UA85364C2 (hu) |
| WO (1) | WO1999023232A1 (hu) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5633435A (en) | 1990-08-31 | 1997-05-27 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases |
| GB2337263A (en) * | 1997-10-31 | 1999-11-17 | Novartis Ag | Glyphosate resistant transgenic plants |
| US6489542B1 (en) | 1998-11-04 | 2002-12-03 | Monsanto Technology Llc | Methods for transforming plants to express Cry2Ab δ-endotoxins targeted to the plastids |
| PE20010635A1 (es) * | 1999-10-08 | 2001-08-15 | Smithkline Beecham Corp | Inhibidores de fab i utiles para el tratamiento de infecciones bacterianas |
| AU2575701A (en) * | 1999-12-07 | 2001-06-18 | Monsanto Company | Sugarbeet regeneration and transformation |
| CA2641218C (en) | 1999-12-16 | 2014-02-25 | Monsanto Technology Llc | Hybrid promoter for use in plants |
| US7105718B2 (en) | 2000-03-31 | 2006-09-12 | The Regents Of The University Of Colorado | Compositions and methods for regulating metabolism in plants |
| EP1366070A2 (en) | 2000-10-25 | 2003-12-03 | Monsanto Technology LLC | Cotton event pv-ghgt07(1445) and compositions and methods for detection thereof |
| US7306909B2 (en) * | 2000-10-30 | 2007-12-11 | Monsanto Technology Llc | Canola event pv-bngt04(rt73) and compositions and methods for detection thereof |
| US7241567B2 (en) | 2000-11-30 | 2007-07-10 | Ses Europe N.V./S.A. | T227-1 flanking sequence |
| BR0208388A (pt) * | 2001-03-27 | 2004-06-15 | Syngenta Seeds Inc | Usos de hìbridos de milho branco |
| AU2002367773A1 (en) * | 2001-04-06 | 2003-11-03 | Affinium Pharmaceuticals, Inc. | Fab i inhibitors |
| EG26529A (en) | 2001-06-11 | 2014-01-27 | مونسانتو تكنولوجى ل ل سى | Prefixes for detection of DNA molecule in cotton plant MON15985 which gives resistance to damage caused by insect of squamous lepidoptera |
| CA2851035C (en) * | 2002-07-18 | 2018-05-29 | Stanislaw Flasinski | Methods for using artificial polynucleotides and compositions thereof to reduce transgene silencing |
| AU2003298937A1 (en) * | 2002-12-06 | 2004-06-30 | Affinium Pharmaceuticals, Inc. | Heterocyclic compounds, methods of making them and their use in therapy |
| ATE553202T1 (de) * | 2003-01-31 | 2012-04-15 | Monsanto Technology Llc | Glyphosat-tolerante luzernepflanzen und verfahren zu deren detektion |
| US7381861B2 (en) * | 2003-02-12 | 2008-06-03 | Monsanto Technology Llc | Cotton event MON 88913 and compositions and methods for detection thereof |
| PT1597373E (pt) * | 2003-02-20 | 2012-09-27 | Kws Saat Ag | Beterraba açucareira tolerante a glifosato |
| US7335816B2 (en) * | 2003-02-28 | 2008-02-26 | Kws Saat Ag | Glyphosate tolerant sugar beet |
| JP4880448B2 (ja) * | 2003-03-17 | 2012-02-22 | アフィナム ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド | 複数の抗生物質を含む組成物、及びそれを用いる方法 |
| RS54170B1 (en) | 2003-12-15 | 2015-12-31 | Monsanto Technology, Llc | MON88017 MAIZE PLANT AND COMPOSITIONS AND DETECTION PROCEDURES |
| DK1828167T3 (da) * | 2004-06-04 | 2014-10-20 | Debiopharm Int Sa | Acrylamidderivater som antibiotiske midler |
| WO2006012080A2 (en) * | 2004-06-24 | 2006-02-02 | Monsanto Technology Llc | Microbial glyphosate resistant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases |
| DE102004057291C5 (de) * | 2004-11-26 | 2010-08-26 | Südzucker AG Mannheim/Ochsenfurt | Lagerungsinduzierte Promotoren |
| AP2693A (en) * | 2005-05-27 | 2013-07-16 | Monsanto Technology Llc | Soybean event MON89788 and methods for detection thereof |
| US20090156578A1 (en) * | 2005-12-05 | 2009-06-18 | PAULS Henry | 3-Heterocyclylacrylamide Compounds as Fab I Inhibitors and Antibacterial Agents |
| US7906709B2 (en) * | 2006-01-23 | 2011-03-15 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Methods for breeding glyphosate resistant plants and compositions thereof |
| CA2647270A1 (en) * | 2006-03-27 | 2007-10-04 | Monsanto Technology Llc | Methods of producing and using cold temperature tolerant plants, seeds, and crops |
| SG171612A1 (en) | 2006-05-26 | 2011-06-29 | Monsanto Technology Llc | Corn plant and seed corresponding to transgenic event mon89034 and methods for detection and use thereof |
| EP2054422B1 (en) | 2006-07-20 | 2017-06-14 | Debiopharm International SA | Acrylamide derivatives as fab i inhibitors |
| EP3255045A1 (en) | 2007-02-16 | 2017-12-13 | Debiopharm International SA | Salts, prodrugs and polymorphs of fab i inhibitors |
| WO2010135324A1 (en) | 2009-05-18 | 2010-11-25 | Monsanto Technology Llc | Use of glyphosate for disease suppression and yield enhancement in soybean |
| SI2861608T1 (sl) | 2012-06-19 | 2019-08-30 | Debiopharm International Sa | Derivati predzdravila (E)-N-metil-N-((3-metilbenzofuran-2-IL)metil)- 3-(7-okso-5,6,7,8-tetrahidro-1 ,8-nafthiridin-3-il)akrilamid |
| CN103695446B (zh) * | 2013-01-31 | 2016-08-03 | 北京未名凯拓作物设计中心有限公司 | 一种来源于恶臭假单胞菌的epsp合酶基因及其应用 |
| CA3014541A1 (en) | 2016-02-26 | 2017-08-31 | Debiopharm International S.A. | Medicament for treatment of diabetic foot infections |
| DE102016015741A1 (de) | 2016-04-12 | 2017-11-30 | Kws Saat Se | Kernkodierte männliche Sterilität durch Mutation in Cytochrom P450 Oxidase |
| DE102016106656A1 (de) | 2016-04-12 | 2017-10-12 | Kws Saat Se | Kernkodierte männliche Sterilität durch Mutation in Cytochrom P450 Oxidase |
| CN107164514A (zh) * | 2017-06-22 | 2017-09-15 | 中华人民共和国黄埔出入境检验检疫局 | 转基因甜菜gtsb77品系特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒 |
| EP3628738A1 (en) * | 2018-09-25 | 2020-04-01 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Method for controlling weed beets and other weeds |
| EP3628160A1 (en) | 2018-09-25 | 2020-04-01 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Use of glyphosate herbicide for controlling unwanted vegetation in beta vulgaris growing areas |
| CN111118055A (zh) * | 2020-01-03 | 2020-05-08 | 鲁东大学 | 高糖品种甜菜转基因体系的建立方法 |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4535060A (en) | 1983-01-05 | 1985-08-13 | Calgene, Inc. | Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use |
| US5094945A (en) | 1983-01-05 | 1992-03-10 | Calgene, Inc. | Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase, production and use |
| NZ217113A (en) | 1985-08-07 | 1988-06-30 | Monsanto Co | Production of eucaryotic plants which are glyphosate resistant, vectors (transformation and expression), chimeric gene and plant cells |
| US4940835A (en) | 1985-10-29 | 1990-07-10 | Monsanto Company | Glyphosate-resistant plants |
| US4971908A (en) | 1987-05-26 | 1990-11-20 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase |
| US5312910A (en) | 1987-05-26 | 1994-05-17 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase |
| US5145783A (en) | 1987-05-26 | 1992-09-08 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-endolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase |
| US7705215B1 (en) | 1990-04-17 | 2010-04-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| US5550318A (en) | 1990-04-17 | 1996-08-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| US5484956A (en) | 1990-01-22 | 1996-01-16 | Dekalb Genetics Corporation | Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin |
| CA2074355C (en) | 1990-01-22 | 2008-10-28 | Ronald C. Lundquist | Method of producing fertile transgenic corn plants |
| EP0536330B1 (en) | 1990-06-25 | 2002-02-27 | Monsanto Technology LLC | Glyphosate tolerant plants |
| US5633435A (en) * | 1990-08-31 | 1997-05-27 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases |
| FR2673643B1 (fr) | 1991-03-05 | 1993-05-21 | Rhone Poulenc Agrochimie | Peptide de transit pour l'insertion d'un gene etranger dans un gene vegetal et plantes transformees en utilisant ce peptide. |
| US5631152A (en) | 1994-10-26 | 1997-05-20 | Monsanto Company | Rapid and efficient regeneration of transgenic plants |
| DE69713496T2 (de) * | 1996-03-29 | 2003-02-13 | Monsanto Europe Sa | Neue verwendung von n-(phosphonomethyl)-glycin und derivaten davon |
| US5859348A (en) | 1996-07-17 | 1999-01-12 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Imidazolinone and sulfonyl urea herbicide resistant sugar beet plants |
| US6376754B1 (en) | 1997-03-07 | 2002-04-23 | Asgrow Seed Company | Plants having resistance to multiple herbicides and its use |
| ES2289776T3 (es) | 1997-04-03 | 2008-02-01 | Dekalb Genetics Corporation | Utilizacion de lineas de maiz resistentes al glifosato. |
| GB2337263A (en) * | 1997-10-31 | 1999-11-17 | Novartis Ag | Glyphosate resistant transgenic plants |
-
1998
- 1998-10-29 GB GB9915068A patent/GB2337263A/en not_active Withdrawn
- 1998-10-29 CA CA002279258A patent/CA2279258A1/en not_active Abandoned
- 1998-10-29 PL PL334135A patent/PL197872B1/pl unknown
- 1998-10-29 TR TR1999/01515T patent/TR199901515T1/xx unknown
- 1998-10-29 AU AU15580/99A patent/AU1558099A/en not_active Abandoned
- 1998-10-29 SK SK885-99A patent/SK88599A3/sk unknown
- 1998-10-29 DE DE19881833T patent/DE19881833B4/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-29 RU RU99116249/13A patent/RU2224024C2/ru active
- 1998-10-29 US US09/182,117 patent/US6204436B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-29 WO PCT/EP1998/006859 patent/WO1999023232A1/en not_active Application Discontinuation
- 1998-10-29 FI FI991221A patent/FI991221A7/fi not_active Application Discontinuation
- 1998-10-29 JP JP52534299A patent/JP2001503280A/ja active Pending
- 1998-10-29 CZ CZ0235199A patent/CZ300208B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-10-29 HU HU0001729A patent/HUP0001729A3/hu unknown
- 1998-10-29 EP EP98959811A patent/EP0950109A1/en not_active Withdrawn
- 1998-10-29 UA UA99063655A patent/UA85364C2/uk unknown
- 1998-10-29 CN CNB988016362A patent/CN1148453C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-06-10 SE SE9902189A patent/SE520353C2/sv not_active IP Right Cessation
- 1999-06-28 DK DK199900916A patent/DK199900916A/da not_active Application Discontinuation
- 1999-11-04 US US09/434,039 patent/US6531649B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ300208B6 (cs) | 2009-03-18 |
| DK199900916A (da) | 1999-06-28 |
| CZ235199A3 (cs) | 1999-09-15 |
| WO1999023232A1 (en) | 1999-05-14 |
| EP0950109A1 (en) | 1999-10-20 |
| US6204436B1 (en) | 2001-03-20 |
| US6531649B1 (en) | 2003-03-11 |
| GB2337263A8 (en) | 2000-02-24 |
| JP2001503280A (ja) | 2001-03-13 |
| SE9902189L (sv) | 1999-08-19 |
| GB9915068D0 (en) | 1999-08-25 |
| FI991221L (fi) | 1999-05-28 |
| DE19881833B4 (de) | 2007-05-10 |
| SE9902189D0 (sv) | 1999-06-10 |
| TR199901515T1 (xx) | 2000-11-21 |
| GB2337263A (en) | 1999-11-17 |
| SE520353C2 (sv) | 2003-07-01 |
| FI991221A7 (fi) | 1999-08-31 |
| HUP0001729A3 (en) | 2002-04-29 |
| PL197872B1 (pl) | 2008-05-30 |
| WO1999023232B1 (en) | 1999-07-15 |
| CN1242803A (zh) | 2000-01-26 |
| CA2279258A1 (en) | 1999-05-14 |
| UA85364C2 (uk) | 2009-01-26 |
| FI991221A0 (fi) | 1999-05-28 |
| SK88599A3 (en) | 2000-03-13 |
| RU2224024C2 (ru) | 2004-02-20 |
| HK1025360A1 (en) | 2000-11-10 |
| CN1148453C (zh) | 2004-05-05 |
| AU1558099A (en) | 1999-05-24 |
| DE19881833T1 (de) | 2000-02-10 |
| PL334135A1 (en) | 2000-02-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6204436B1 (en) | Transgenic plants | |
| US11492630B2 (en) | Methods and hybrids for targeted nucleic acid editing in plants using CRISPR/Cas systems | |
| Mannerlöf et al. | Transgenic sugar beet tolerant to glyphosate | |
| EP0731632B1 (en) | Agrobacterium tumefaciens transformation of musa species | |
| CN107129993B (zh) | 一种修饰的抗草甘膦基因及抗草甘膦水稻的培育方法 | |
| US12275944B2 (en) | Compositions and methods for genome editing in planta | |
| US6750378B2 (en) | Maize H3C4 promoter combined with the first intron of rice actin, chimeric gene comprising it and transformed plant | |
| CN113151314B (zh) | 一种植物ACCase突变型基因及其应用 | |
| US12077764B2 (en) | Delivery of developmental regulators to plants for the induction of meristematic tissue with genetic alterations | |
| US20190017067A1 (en) | Glyphosate tolerant plants having modified 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene regulation | |
| Konagaya et al. | Application of the acetolactate synthase gene as a cisgenic selectable marker for Agrobacterium-mediated transformation in Chinese cabbage (Brassica rapa ssp. pekinensis) | |
| CN110881367A (zh) | 一种玉米事件t抗-4及其使用方法 | |
| Fitzmaurice et al. | Epigenetic modification of plants with systemic RNA viruses | |
| US20240327852A1 (en) | Methods of transformation | |
| WO2023031885A1 (en) | Methods and compositions for ppo herbicide tolerance | |
| KR20220149325A (ko) | 제초제 저항성 식물 및 이의 제조 방법 | |
| WO2023129099A1 (en) | Developing orobanche (orobanche spp., phelipanche spp.) resistance in tomato (solanum lycopersicum), using gene editing technology (crispr) | |
| WO2021260632A1 (en) | Plant cell treatments to improve plant transformation | |
| Evans | The use of microorganisms in plant breeding | |
| MXPA99000639A (en) | Chemical gene for various genes of herbicide tolerance, cell vegetable plants tolerantesa various herbici |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FD9A | Lapse of provisional protection due to non-payment of fees |