CZ235199A3 - Transgenní rostlina tolerantní k herbicidu glyfosatu a způsob přípravy takové rostliny - Google Patents
Transgenní rostlina tolerantní k herbicidu glyfosatu a způsob přípravy takové rostliny Download PDFInfo
- Publication number
- CZ235199A3 CZ235199A3 CZ992351A CZ235199A CZ235199A3 CZ 235199 A3 CZ235199 A3 CZ 235199A3 CZ 992351 A CZ992351 A CZ 992351A CZ 235199 A CZ235199 A CZ 235199A CZ 235199 A3 CZ235199 A3 CZ 235199A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- plant
- dna
- sequence
- plants
- seq
- Prior art date
Links
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 40
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 5
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 title description 29
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 title description 24
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 122
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 claims abstract description 37
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 119
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 47
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 36
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 32
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 claims description 30
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 claims description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 22
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 claims description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 9
- 208000006278 hypochromic anemia Diseases 0.000 claims description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 6
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 3
- 238000000844 transformation Methods 0.000 claims description 3
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 claims description 2
- 102000053632 repetitive DNA sequence Human genes 0.000 claims description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 12
- 230000010354 integration Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 27
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 27
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 27
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 27
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 101150094958 gox gene Proteins 0.000 description 13
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 8
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 101100437498 Escherichia coli (strain K12) uidA gene Proteins 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 101150101900 uidA gene Proteins 0.000 description 4
- 238000004383 yellowing Methods 0.000 description 4
- 241000543381 Cliftonia monophylla Species 0.000 description 3
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 3
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 230000000885 phytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000011241 protective layer Substances 0.000 description 3
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IRCMYGHHKLLGHV-UHFFFAOYSA-N 2-ethoxy-3,3-dimethyl-2,3-dihydro-1-benzofuran-5-yl methanesulfonate Chemical compound C1=C(OS(C)(=O)=O)C=C2C(C)(C)C(OCC)OC2=C1 IRCMYGHHKLLGHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 2
- 239000005512 Ethofumesate Substances 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000005579 Metamitron Substances 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 2
- GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N cefotaxime Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)/C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N 0.000 description 2
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 2
- 230000002015 leaf growth Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- VHCNQEUWZYOAEV-UHFFFAOYSA-N metamitron Chemical compound O=C1N(N)C(C)=NN=C1C1=CC=CC=C1 VHCNQEUWZYOAEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005645 nematicide Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- QHOQHJPRIBSPCY-UHFFFAOYSA-N pirimiphos-methyl Chemical group CCN(CC)C1=NC(C)=CC(OP(=S)(OC)OC)=N1 QHOQHJPRIBSPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- KUAZQDVKQLNFPE-UHFFFAOYSA-N thiram Chemical compound CN(C)C(=S)SSC(=S)N(C)C KUAZQDVKQLNFPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LDVVMCZRFWMZSG-OLQVQODUSA-N (3ar,7as)-2-(trichloromethylsulfanyl)-3a,4,7,7a-tetrahydroisoindole-1,3-dione Chemical compound C1C=CC[C@H]2C(=O)N(SC(Cl)(Cl)Cl)C(=O)[C@H]21 LDVVMCZRFWMZSG-OLQVQODUSA-N 0.000 description 1
- MGRVRXRGTBOSHW-UHFFFAOYSA-N (aminomethyl)phosphonic acid Chemical compound NCP(O)(O)=O MGRVRXRGTBOSHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000932047 Achromobacter sp. Species 0.000 description 1
- 241000589159 Agrobacterium sp. Species 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 235000021533 Beta vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 239000005745 Captan Substances 0.000 description 1
- 239000005746 Carboxin Substances 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 101100169274 Escherichia coli (strain K12) cydC gene Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101100420606 Geobacillus stearothermophilus sacB gene Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 239000005807 Metalaxyl Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 240000001140 Mimosa pudica Species 0.000 description 1
- 235000016462 Mimosa pudica Nutrition 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000005924 Pirimiphos-methyl Substances 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000005843 Thiram Substances 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- ZVQOOHYFBIDMTQ-UHFFFAOYSA-N [methyl(oxido){1-[6-(trifluoromethyl)pyridin-3-yl]ethyl}-lambda(6)-sulfanylidene]cyanamide Chemical compound N#CN=S(C)(=O)C(C)C1=CC=C(C(F)(F)F)N=C1 ZVQOOHYFBIDMTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003322 aneuploid effect Effects 0.000 description 1
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229940117949 captan Drugs 0.000 description 1
- GYSSRZJIHXQEHQ-UHFFFAOYSA-N carboxin Chemical compound S1CCOC(C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 GYSSRZJIHXQEHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- OBRMNDMBJQTZHV-UHFFFAOYSA-N cresol red Chemical compound C1=C(O)C(C)=CC(C2(C3=CC=CC=C3S(=O)(=O)O2)C=2C=C(C)C(O)=CC=2)=C1 OBRMNDMBJQTZHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000003090 exacerbative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 238000009399 inbreeding Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000009403 interspecific hybridization Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- ZQEIXNIJLIKNTD-UHFFFAOYSA-N methyl N-(2,6-dimethylphenyl)-N-(methoxyacetyl)alaninate Chemical compound COCC(=O)N(C(C)C(=O)OC)C1=C(C)C=CC=C1C ZQEIXNIJLIKNTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003750 molluscacide Substances 0.000 description 1
- 230000002013 molluscicidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical group OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000208 phytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 1
- QYOJSKGCWNAKGW-HCWXCVPCSA-N shikimate-3-phosphate Chemical compound O[C@H]1CC(C(O)=O)=C[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1O QYOJSKGCWNAKGW-HCWXCVPCSA-N 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960002447 thiram Drugs 0.000 description 1
- 238000003971 tillage Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000009417 vegetative reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000013466 vegetative reproduction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
- C12N9/1092—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
- C12N15/8275—Glyphosate
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
(57) Anotace:
Transgenní rostliny cukrové řepy, které díky tomu, že exprimují enzymovou aktivitu cp4/epsps, tolerují ošetření 4 až 18 1/ha herbicidu Roundup. Rostliny jsou charakteristické specifickým, integračním místem. Semena získaná z uvedených rostlin a způsob přípravy takových rostlin.
CZ 2351-99 A3
177 099/KB
Transgenní rostlina tolerantní k herbicidu glyfosatu a způsob přípravy takové rostliny
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká transgenních rostlin cukrové řepy, které jsou schopny tolerovat ošetření herbicidem, ve kterém je jako účinná látka glyfosat.
Dosavadní stav techniky
Plevele v poli cukrové řepy představují pro farmáře hlavní problém. Kompetice s plodinou vede ke snížení výnosu. V současnosti není žádný herbicid schopen účinně hubit všechny plevely, aniž by přitom neškodil také samotné plodině, tj. cukrové řepě (Miller et al., J. Sugar Beets Res. 26: 3-4, 1989.). V praxi užívají farmáři směs herbicidů, která ale také omezuje růst plodiny. Mezitím ovšem došlo ke vzniku rezistence k těmto herbicidům u mnoha druhů plevelů a jejich počet stále roste (Schweizer et al., J. Sugar Beets Res. 28: 1-23, 1991), což problém hubení plevelů v poli s cukrovou řepou dále zhoršuje.
Roundup® je herbicid se širokým rozsahem, výhodný z hlediska ochrany prostředí, který však inhibuje růst jak plevele, tak i plodiny. Z hlediska předkládaného vynálezu 1 1 roztoku herbicidu Roundup® obsahuje 360 g účinné složky, tj. glyfosatu (což je triviální název pro N-fosfonometylglycin), která je přijímána listy. Dosud se nevyvinul žádný plevel rezistentní ke glyfosatu i přes 20 let jeho užívání (Holt et al., Annu. Rev. Plant Physiol. 1993), ale také nebyla zjištěna žádná přirozená tolerance ke glyfosatu u cukrové řepy. Premergentní použití herbicidu Roundup® se zdá být na hubení plevele v poli cukrové řepy mnohem účinnější než při pěstování řepy často užívaná kombinace, obsahující phenmediphan, metamitron a ethofumesat (Madsen et al., Weeds Res. 35: 105-111, 1995).
Glyfosat inhibuje biosyntézu aromatických aminokyselin tím, že se ireverzibilně váže na 5-enolpyruvátšikimát-3fosfátsyntázu (epsps) . V chloroplastu tento enzym katalyzuje reakci, kdy se z šikimát-3-fosfátu a fosfoenolpyruvátu tvoří enolpyruvátšikimát-3-fosfát a fosfát. Přibližně asi týden po aplikaci herbicidu se projeví viditelný účinek, což znamená vadnutí, žloutnutí a následně úplné zhnědnutí, degradaci rostlinného pletiva a rozpad kořenů.
Aby kulturní rostliny získaly toleranci ke glyfosatu, výzkum se soustředil na přenesení genu epsps, schopného zvýšit toleranci ke glyfosatu, do rostlin. Kromě rostlin také bakterie a houby přirozeně exprimují enzymovou aktivitu epsps. Bylo zjištěno, že gen cp4/epsps z Agrobacterium sp. CP4 udílí toleranci ke glyfosatu (Barry et al., Inhibitors of Amino Acid Biosynthesis: Strategies for Imparting Glyphosate Tolerance to Crop Plants, in: Biosynthesis and Molecular Regulation of Amino Acids in Plants, Singh et al (eds), American Society of Plant Physiologists, pages 139145, 1992). Vnesení genu cp4/epsps do sóji a řepky olejky vedlo k toleranci k aplikaci herbicidu na list v polních podmínkách (Delannay et al., Crop Sci. 35: 1461-1467, 1995; Padgette et al., Crop Sci. 35: 1451-1461 , 1995).
Glyfosatoxidáza-reduktáza(gox) izolovaná z Achromobacter sp. kmen LBAA (Barry et al., viuz výše) degraduje glyfosat na kyselinu aminometylfosfonovou, což je sloučenina, která není toxická pro rostliny. Kombinace genů cp4/epsps • · · ·
a glyfosatoxidézy (gox) bylo úspěšně použito pro získání transgenní pšenice (Zhou et al., Plant Cell Rep. 15: 159-163, 1995) tolerantní ke glyfosatu.
Předmětem předkládaného vynálezu jsou tedy transgenní rostliny cukrové řepy, které jsou tolerantní ke glyfosatu v dávce, která je dostatečně vysoká, aby projevila optimální herbicidní účinnost. Takové rostliny mohou být dále zlepšeny zpětným křížením s výběrovými liniemi, aby se dosáhlo optimalizace agronomických vlastností jako je výnos, odolnost k patogenům apod.
Cukrová řepa může být transformována pomocí metody transformace zprostředkované Agrobacterium tumefaciens (Fry et al, Third International congress of plant mol. biol., Tuscon, Arizona, USA; D'Halluin et al, Bio/Technology 10: 309-314, 1992; Konwar, J. Plant Biochem & Biotech 3: 37-41, 1994). Transformace zprostředkovaná Agrobacterium tumefaciens vede často k tomu, že do rostlinného genomu je integrováno několik kopií T-DNA. Gen, který má být integrován, je výhodně vložen do T-DNA, takže je lokalizován v blízkosti pravé hranice T-DNA, která je, na rozdíl od levé hranice, téměř jistě vždy přenesena do rostliny.
Rostliny podle předkládaného vynálezu tolerují ošetření více než 3x6 litry herbicidu Roundup® na hektar (asi 18 1/ha). Celková standardní dávka, umožňující dobré výsledky v hubení plevelů, je 4 až 6 litrů na hektar, v závislosti na množství plevelu. V těchto koncentracích neprojevuje herbicid žádný vliv na životaschopnost rostlin a chlorózu listů. Tolerance, kterou vykazují rostliny podle předkládaného vynálezu, je udělována transgenně exprimovanou enzymovou aktivitou cp4/epsps. Výhodné provedení vynálezu bylo uloženo v Národní sbírce průmyslových a mořských bakterií (National Collections of Industrial and Marině Bacteria Limited, • ·
St Machar Drive, Aberdeen AB2 1 RY, Scotland UK) 24. října 1997 jako položka č. 97087006/2.
Předkládaný vynález se týká rostlin cukrové řepy, včetně jejich potomstva, které exprimují enzymovou aktivitu cp4/epsps. Konkrétně se předkládaný vynález týká rostlin cukrové řepy, včetně jejich potomstva, které tolerují ošetření 4 až 18 litry herbicidu Roundup® na hektar.
Rostliny podle předkládaného vynálezu je možné získat rutinní transformací zprostředkovanou Agrobacterium tumefaciens pomocí transformačního vektoru, který mezi pravou a levou hraniční sekvencí T-DNA obsahuje úsek DNA popsaný zde jako sekvence id. č. 5 kódující cp4/epsps.
Bylo překvapivě zjištěno v rámci předkládaného vynálezu, že transformace (RRMax) bez levé a pravé T-DNA hraniční sekvence v transgenním genomu vedoucí k deleci (odstranění) značné části DNA transformačního vektoru, přičemž však DNA kódující cp4/epsps zůstává, vede k vynikající toleranci ke glyfosatu. Zvláště úsek DNA, popsaný zde jako sekvence id. č. 1, byl nalezen integrovaný do vysoce repetítivního úseku genomu, a současně nahradil část DNA v této repetitivní (opakující se) genomové sekvenci.
Genomová DNA bezprostředně sousedící s částí transgenní sekvence, která je v použitém vektoru spojena s pravou T-DNA hraniční sekvencí, má sekvenci zde uvedenou jako sekvence id. č. 2. Genomová sekvence bezprostředně přilehlá k druhému konci integrované transgenní DNA má sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. 3. Úplná DNA sekvence nového uspořádání genomové DNA je zde uvedena jako sekvence id. 4.
Tudíž předkládaný vynález se týká rostlin cukrové řepy, včetně jejich potomstva, ve kterých část rostlinného genomu tvoří DNA charakterizovaná nukleotidovou sekvencí id. č. 1, • · • · ·· ·· přičemž uvedená nukleotidové sekvence výhodně nahrazuje vysoce repetítivní sekvenci DNA uvnitř rostlinného genomu.
Výhodná podle předkládaného vynálezu je rostlina cukrové řepy, včetně jejího potomstva, ve které části jejího genomu přímo spojené s uvedenou nukleotidovou sekvencí jsou charakterizovány jako sekvence id. č. 2 a sekvence id. č. 3.
Dalším výhodným řešením podle předkládaného vynálezu je rostlina cukrové řepy, včetně jejího potomstva, kde DNA charakterizovaná nukleotidovou sekvencí id. č. 4 tvoří část rostlinného genomu.
Tolerance k herbicidu vnesená do transgenních semen se přenáší při pohlavním nebo a rostlin zmíněných výše vegetativním rozmnožování a a udržovat ji v potomstvu.
je tedy možné Obecně řečeno, rozšiřovat udržování a rozmnožování užívá známé zemědělské techniky jako je obdělávání půdy, setí nebo sklízení. Vzhledem k tomu, že rostoucí plodina je náchylná k poškození způsobeném hmyzem nebo infekcemi, podnikají se opatření k zbránění chorobám a k hubení škodlivého hmyzu a nematod, a další opatření ke zlepšení výnosů. K nim patří i mechanická opatření jako orání půdy nebo odstraňování infikovaných rostlin, a také aplikace agrochemikálií jako jsou fungicidy, gametocidy, nematicidy, růstové regulátory, insekticidy a činidla urychlující zrání.
Transgenní rostliny a semena tolerantní k herbicidu podle předkládaného vynálezu se mohou dále využít ve šlechtění rostlin, s cílem zlepšit toleranci ke škodlivému hmyzu, herbicidů nebo stresu, zlepšení nutričních hodnot, zvýšení výnosu nebo zlepšení struktury, které by vedlo ke zmenšení ztrát v důsledku zničení při skladování a transportu. Jednotlivé kroky šlechtitelského procesu jsou charakterizovány dobře definovanými lidskými zásahy jako je výběr linií ke křížení, řízení opylení rodičovských linií • · ·· · ♦ · ·· ·· ··· ··· ······· · · ···· ·· ·· ·· ·· ·· nebo výběr potomstva. V závislosti na požadovaných vlastnostech se provádějí různá šlechtitelská opatření. Odpovídající techniky jsou v oboru dobře známy a neomezují se pouze na hybridizaci, inbreeding, zpětné křížení, víceliniové křížení, křížení variet, mezidruhovou hybridizaci, aneuploidní techniky apod. Takže transgenní semena a rostliny podle předkládaného vynálezu se mohou použít pro šlechtění zlepšených linií rostlin, které např. zvyšují účinnost konvenčních metod jako je ošetření herbicidy nebo pesticidy, nebo se díky svým modifikovaných genetickým vlastnostem obejdou bez těchto metod. Alternativně je možné získat nové plodiny se zlepšenou tolerancí ke stresu, které díky jejich optimalizované genetické výbavě poskytují produkty v lepší kvalitě než produkty rostlin, které nejsou schopné tolerovat srovnatelně nepříznivé vývojové podmínky.
V semenářství jsou kvalita klíčení a uniformita osiva nezbytnými charakteristikami produktu, zatímco kvalita klíčení a uniformita semen sklízených a prodávaných farmáři nejsou tak důležité. Jelikož je obtížné udržovat plodinu v čistém stavu bez příměsi semen jiné plodiny nebo plevelu, kontrolovat nemoci přenášené semeny, a produkovat osivo s dobrou kvalitou klíčení, značně obsáhlé a dobře definované techniky výroby osiva byly vyvinuty producenty osiva, kteří mají zkušenosti s pěstováním, udržováním a prodejem čistého osiva. Je běžnou praxí, že farmář kupuje certifikované osivo odpovídající kvalitativním standardům, místo aby používal osivo z vlastní úrody. Materiál používaný jako osivo je obvykle ošetřen ochrannou vrstvou obsahující herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy, nematicidy, moluscicidy nebo jejich různé směsi. Obvykle užívané ochranné vrstvy obsahují sloučeniny jako kaptan, karboxin, thiram (TMTD®) , metalaxyl (Apron®) a pirimifosmetyl (Actellic®) . Pokud je to • ·
potřeba, tyto sloučeniny tvoří prostředek společně s dalšími pomocnými látkami, nosiči, surfaktanty nebo adjuvans usnadňujícími aplikaci, což běžně užívá v oboru prostředků pro ochranu před poškozením bakteriálními, houbovými nebo živočišnými škůdci. Ochranná vrstva se může aplikovat impregnací osiva tekutým prostředkem nebo kombinovanou aplikací kapalného a suchého prostředku. Jiné způsoby aplikace lze také použít, např. přímé ošetření pupenů nebo plodů.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká nových zemědělských způsobů, jejichž příklady jsou uvedeny v předchozím textu, a které jsou charakterizovány použitím transgenních rostlin, transgenního rostlinného materiálu nebo transgenního osiva podle předkládaného vynálezu.
Předkládaný vynález se také týká transgenních rostlinných buněk, tkání, orgánů,semen nebo částí rostlin rostlin. Součástí rostlin včetně rostlinných buněk, pletiv, orgánů, semen a rostlinných částí získaných z potomstva.
Vynález se dále týká obchodního sáčku, který obsahuje semena cukrové řepy schopné exprimovat cp4/epsps tolerantní k herbicidu Roundup®, společně s instrukcemi k použití na obalu. Výhodným provedením podle předkládaného vynálezu je obchodní sáček obsahující semena transgenní rostliny, která obsahuje úsek DNA stabilně integrovaný do svého genomu, který má nukleotidovou sekvenci id. č. 1.
Použitý transformační postup lze shrnout do následujících kroků:
a) transformace děložních lístků in vitro pěstované cukrové řepy prostřednictvím Agrobacterium tumefaciens pomocí vynálezu je transgenních získaných z transgenních i transgenní potomstvo • · vektoru obsahujícího úsek DNA kódující cp4/epsps jak je popsán v sekvenci id. č. 5,
b) regenerace výhonků v přítomnosti glyfosatu,
c) přenos výhonků do půdy ve skleníku,
d) ošetření rostlinek glyfosatem,
e) vizuální hodnocení životaschopnosti rostlin a chlorózy listů,
f) selekce zcela normálních rostlin, u kterých ani životaschopnost ani listy nejsou ovlivněny ošetřením glyfosatem, a
g) množení selektovaných rostlin pomocí obvyklých šlechtitelských technik.
Konkrétně výhonky se regenerují v přítomnosti 0,1 až mM, výhodně 1 mM glyfosatu po 8 až 12 týdnech selekce. Každý transgenní výhonek je dále namnožen do 10 kopií, které lze případně analyzovat na přítomnost transgenu cp4/epsps pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) předtím, než se přenesou do skleníku pro zakořenění. Světelné podmínky ve skleníku byly 16 hodin světla a 8 hodin tmy s teplotou 22 + 2 °C. Ve stadiu 3 až 4 listů byly rostlinky postříkány vodným roztokem herbicidu Roundup® v dávce 0,1 až 20 litrů na hektar, výhodně v dávce 1 liter na hektar. Dva týdny po aplikaci glyfosatu bylo provedeno individuálně pro každou rostlinu vizuální hodnocení vitality a chlorózy, založené na stupnici od 0 (odumřelá rostlina) do 9 (zcela neovlivněná rostlina). Hodnocení 0 až 3 je typické pro citlivé rostliny, hodnocení 3 až 7 ukazuje nízkou až střední míru tolerance a hodnocení 8 až 9 znamená dobrou úroveň tolerance. Stupnice hodnocení má tento konkrétní význam:
... neovlivněná rostlina shodná s neošetřenou kontrolou 8 ... velmi malé nekrózy na špičkách listů, kdy méně než 5 % listové plochy je ovlivněno a žloutne • · • ·
... velmi malé nekrózy na špičkách listů, které se ale začínají kroutit, přičemž méně než 5 % listové plochy je ovlivněno a žloutne
6, 5, 4 ... zvětšující se nekrózy a kroucení listů, listy jsou menší než normální
3,2 ... buďto žádný nebo omezený růst listů, všechny listy jsou zkroucené a zasaženy nekrózou
... žádný růst rostliny, nejvýše 5% rostliny je ještě zelené 0 ... odumřelá rostlina
Pro získání údajů z polních experimentů byly normální rostliny s normální vitalitou a neovlivněné glyfosatem (hodnocení 9) množeny nebo dále pěstovány obvyklými způsoby. Transformace se výhodně prováděla pomocí Ti vektoru obsahujícího úsek DNA se sekvencí uvedenou zde jako sekvence id. č. 5 obsahující geny cp4/epsps a gox, o kterých je známo, že udělují toleranci ke glyfosatu určitým rostlinným druhům, a reportérový gen uidA kódující enzym β-glukuronidázu. Zesílený promotor 35S (Oděli et al., Nátuře 313: 810-812,
1985) byl připojen ke genu uidA, promotor viru mozaiky krtičníku (FMV) (Gouwda et al., J. Cell. Biochem. Suppl. 13D: 301, 1989) byl připojen ke genům cp4/epsps a gox. Před geny cp4/epsps a gox (upstream, tj. proti směru transkripce) byl vložen transitní peptid (Gasser et al., J. Biol. Chem. 263:4280-4289, 1988), aby se zajistilo zacílení obou proteinů do chloroplastu.
Jedna transformační událost podle předkládaného vynálezu vedla k překvapivému zjištění, že na rostliny nepůsobil Roundup® v dávkách až do 3 x 6 litrů na hektar (18 1/ha) . Molekulární analýza ukázala,že • je zde jedna kopie transgenu integrovaná do jediného lokusu s integrovanou DNA je 2 a sekvencí id. č. 3, • integrovaná DNA kóduje cp4/epsps a odpovídá zkrácené vektorové DNA • integrovaná DNA nahradila část genomové DNA a má sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 1 • genomová DNA přímo sousedící charakterizována sekvencí id. č a má nové uspořádání genomových sekvencí uvedené zde jako sekvence id. č.4 • geny cp4/epsps a uidA jsou intaktní zatímco gen gox je zkrácen • jiné vektorové sekvence nejsou v transgenní rostlině přítomny .
Nyní, když jsou tyto informace dostupné, je možné rostliny z jedné specifické transformační události podle předkládaného vynálezu odlišit od jiných rostlin cukrové řepy pomocí PCR. Vhodné kombinace párů oligonukleotidových primerů dovolují specificky identifikovat sekvence genomové DNA, které jsou přítomné v rostlinách pouze jako přímý či nepřímý důsledek shodných transformačních událostí. Takové transformační události nejsou omezeny na transformace provedené pomocí Agrobacterium tumefaciens, ale mohou to být i transformace biolistické (ostřelováním mikročásticemi).
Předkládaný vynález se dále týká rostlin cukrové řepy, včetně potomstva, u kterých amplifikace PCR na jejich
| genomové DNA jako templátu vede k | amplifikaci | |||
| DNA fragmentu velikosti 739 | bp, | pokud se | použij e | pár |
| oligonukleotidových primerů | se | sekvencemi | id. č. | B |
| a id. č. a, nebo | ||||
| - DNA fragmentu velikosti 834 | bp, | pokud se | použij e | pár |
| oligonukleotidových primerů | se | sekvencemi | id. č. | D |
a id. č. e, nebo • · • ·
| • · · | • | • · · · | • | |
| • · · · · · | • · | • · · · | • · | |
| 11 | ||||
| DNA fragmentu velikosti 1057 | bp, pokud | se | použije | pár |
| oligonukleotidových primerů | se sekvencemi | id. č. | A | |
| a id. č. b, nebo | ||||
| DNA fragmentu velikosti 1224 | bp, pokud | se | použije | pár |
| oligonukleotidových primerů | se sekvencemi | id. č. | C |
a id. č. f.
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady popisují materiály a metody použité při provádění vynálezu a dosažené výsledky. Slouží k ilustraci vynálezu a v žádném případě ho nijak neomezují.
Příklad 1
Transformace cukrové řepy
Cukrová řepa genotypu A1012 byla transformována vektorem obsahujícím geny cp4/epsps a gox schopnými udělit toleranci ke glyfosatu, gen nptll, který udílí rezistenci k antibiotiku kanamycinu a reportérový gen uidA kódující β-glukuronidázu (GUS) . Geny nptll a uidA jsou funkčně spojeny se zesíleným promotorem 35S (Oděli et al., Nátuře 313: 810-812, 1985), zatímco geny cp4/epsps a gox jsou řízeny promotorem viru mozaiky krtičníku (FMV) (Gouwda et al., J. Cell. Biochem. Suppl. 13D: 301, 1989). Kromě toho jsou geny cp4/epsps a gox spojeny s transitním peptidem (Gasser et al., J. Biol. Chem. 263: 4280-4289, 1988) umístěným na 5'-konci, aby byly oba proteiny směrovány do chlorplastu. cp4/epsps a uidA užívají terminátorovou 3'-sekvenci E9, zatímco gox a nptll užívají odpovídající 3'-sekvenci NOS.
Rostliny cukrové řepy (Beta vulgaris. L) pěstované in vitro byly transformovány prostřednictvím Agrobacterium • · · 0 tumefaciens. Rostliny byly regenerovány způsobem, který popsali Fry et al. (Genotype-independent transformation of sugarbeet using Agrobacterium tumefaciens, Third International congress of plant mol. biol., Tuscon, Arizona, USA., 1991) a Konwar (J. Plant Biochem & Biotech 3: 37-41 , 1994) za použití glyfosatu v koncentraci 1 mM jako selekčního činidla. Aby se odstranil Agrobacterium tumefaciens, byly děložní lístky třikrát po sobě inkubovány v MS médiu obsahujícím 500 mg/1 cefotaximu (60 minut při 45 až 50 ot./min). Regenerované výhonky byly analyzovány po 8 až 12 týdnech selekce na lmM glyfosatu a 500 mg/1 cefotaximu včetně pasážování do čerstvého média každý třetí týden. Každý transgenní výhonek byl rozdělen a dále pěstován (mikropropagace) do 10 kopií a analyzován na přítomnost transgenu a pak přenesen do skleníku pro zakořenění.
Polymerázová řetězová reakce (PCR) byla použita k ověření přítomnosti genu cp4/epsps. Dvacet mg rostlinného materiálu bylo odebráno z výhonků regenerovaných in vitro do mikrozkumavky eppedndorf. Celková DNA byla izolována v podstatě postupem, který popsali Tai et al., Plant Mol. Biol. Rep 8: 297303, 1990. Menší modifikací bylo přidání 500 μΐ lOOmM Tris-HCl pH 8.0 obsahujícího 50mM Na-EDTA, 1,25% (hmot./objem) SDS, 0,38% (hmot./objem) siřičitanu sodného a 200 mg/ml proteinázy K, a pak inkubace v 65°C po 2 hodiny. Nerozpuštěný materiál z listů byl odstraněn a celková DNA byla precipitována zmražením v -20 °C. PCR byla provedena podle návodu k soupravě Gene-Amp PCR kit (Perkin-Elmer Corp.) s tím, že byl použit modifikovaný reakční pufr (lOx) obsahující lOOmM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 30mM MgC12, 1,0% Nonidet P-40 (hmot./objem), 0.4μΜ kresolovou červeň ve 24% (hmot./objem) sacharóze a protilátku Taq Start (Taq Start Antibody, Clontech).
• · • · · · · · ·· ·· ··
Pro amplifikaci sekvencí cp4/epsps byly použity následující primery (Shah et al., Science 233: 478-481 ,
1986):
5'-CAC CGG TCT TTT GGA AGG TGA AG-3'(sekvence id. č. 6) a 5'-AAC GAG ACC CAT AAC GAG GAA GC-3'(sekvence id. č. 7) .
Pro amplifikaci sekvencí genomové vnitřní (surA, surBbyly použity následující primery:
5'-AAA CAG TCC CGT GCA TCC CCA AC-3' (sekvence id. č. 8) a 5'-GAC GCT CTC CTT GAT TCT GTC CC-3' (sekvence id. č. 9). Nebyl patrna žádná variabilita v transformační účinnosti při použití různých binárních plazmidů.
Výhonky získané mikropropagací byly přeneseny do půdy ve skleníku. Světelné podmínky ve skleníku byly 200 pmol m_z s’1 (Osram Power Star HQI-Z, 400W), 16 hodin světla a 8 hodin tmy s teplotou 22 ± 2°C. Ve stadiu 3 až 4 listů byly rostlinky pocházející z původních (transformant) ošetřeny kalibrovaný postřikovač (odumřelá Fytotoxický
260 transformovaných rostlin hebicidem Roundup®. Byl použit pro aplikaci vodného roztoku herbicidu v dávce 1 litr na hektar (1 1/ha při 360 g/1 účinné látky). Dva týdny po aplikaci glyfosatu bylo provedeno hodnocení fytotoxického účinku individuálně pro každou rostlinu vizuálně na základě stupnice od 0 rostlina) do 9 (zcela neovlivněná rostlina).
účinek u 75 různých transformant byl hodnocen skórem 0 až 6. Ostatních 185 transformant bylo hodnoceno skórem 7 a vyšším, což znamenalo, že tyto transformanty projevovaly malé nebo žádné známky účinku ošetření herbicidem. Tyto rostliny byly dále kříženy s normálními, tj. netransgenními rostlinami cukrové řepy pro získání Fl potomstva pro další vyhodnocování polních pokusů.
Polní pokusy se prováděly k vyhodnocení různých transformačních událostí v polních podmínkách. Každá parcelka • · ······· · · ···· · · ·· ·· ·· ·· měla tři řady, každou o délce 9 m, se vzdáleností mezi řadami 0,5 m. Na každé parcelce byla vysazena jedna tranformanta. Po počáteční aplikaci prostředku Roundup® v dávce 1 1/ha (360 g/1 účinné látky), ve stadiu děložních lístků, byly rostliny ručně jednoceny, aby se eliminovaly segregující netransgenní rostliny, a to tak, aby zůstala jedna rostlina na 20 cm. Každá parcelka byla rozdělena na 3 části, které byly ošetřovány nezávisle. Jedna parcelka byla ošetřena konvenčními herbicidy metamitron v dávce 0.1 kg účinné látky/ha, phenmediphan 0.2 kg účinné látky/ha a ethofumesate 0.1 kg účinné látky/ha. Další parcelka byla ošetřena prostředkem Roundup® 2x2 1/ha (1440 g/1 účinné látky) a třetí parcelka byla ošetřena prostředkem Roundup® 2x4 1/ha (2880 g/1 účinné látky). Rostliny byly ošetřovány ve stadiu 4 listů. Dva týdny po aplikaci herbicidu byly rostliny hodnoceny z hlediska fytotoxického účinku herbicidu. Zjištěny byly symptomy v rozsahu od úplné citlivosti až po úplnou toleranci. Byly zjištěny rozdíly mezi hodnocením ve skleníku a na poli. To bylo zřejmě způsobeno rozdílem ve vnějších podmínkách, mimo jiné i tím, že ve skleníku nebyl použit filtr pro UVB záření. Nebyly zjištěny žádné morfologické nebo fyziologické rozdíly mezi rostlinami z parcelek ošetřených různými dávkami prostředku Roundup® ve srovnání s ošetřením směsí konvenčních herbicidů. Dvě transformanty projevovaly vysokou toleranci k prostředku Roundup® po ošetření 2x2 1/ha a 2 x 4 1/ha.
Po postřiku herbicidem Roundup® byla tolerance vyhodnocena posuzováním vitality rostlin (Tr.vig) a chlorózy listů (Tr. chl) . Jednotlivé stupně ve škále hodnocení měly následující význam:
... neovlivněná rostlina shodná s neošetřenou kontrolou 8 ... velmi malé nekrózy na špičkách listů, kdy méně než 5 % • tititi tititi · · · · • titi · ti··· ti · · · titi····· ti · • tititi titi titi titi titi ·· listové plochy je ovlivněno a žloutne 7 ... velmi malé nekrózy na špičkách listů, které se ale začínají kroutit, přičemž méně než 5 % listové plochy je ovlivněno a žloutne
6, 5, 4 ... zvětšující se nekrózy a kroucení listů, listy jsou menší než normální
3,2 ... buďto žádný nebo omezený růst listů, všechny listy jsou zkroucené a zasaženy nekrózou
... žádný růst rostliny, nejvýše 5% rostliny je ještě zelené 0 ... odumřelá rostlina
Bylo hodnoceno 22 různých transformačních událostí (č. 1 až 22) a 1 netrasngenní kontrola (č. 3) po postřiku 1+4+4 1/ha Roundup® (celkem 9 1/ha). Výsledky vizuálního hodnocení poškození jsou uvedeny v následující tabulce.
| trans form. | hodnocení | hodnocení |
| událost č. | vitality | chlorózy |
| 1 | 9 | 9 |
| 2 | 6 | 7 |
| 3 | 2 | 3 |
| 4 | 5 | 7 |
| 5 | 9 | 8 |
| 6 | 3 | 3 |
| 7 | 7 | 7 |
| 8 | 7 | 8 |
| 9 | 4 | 6 |
| 10 | 5 | 6 |
| 11 | 5 | 5 |
| 12 | 4 | 5 |
| 13 | 9 | 9 |
| 14 | 3 | 5 |
| 15 | 4 | 4 |
| 16 | 2 | 3 |
| 17 | 1 | 1 |
| 18 | 2 | 2 |
| 19 | 6 | 8 |
| 20 | 7 | 5 |
| 21 | ** 4 | 5 |
| 22 | 5 | 7 |
| 23 | 0 | 0 |
(RRMax) (netransgen kontrola) • · · · ······· · · ···· ·· · · ·· · · ··
Příklad 2
Počet kopií integrované DNA
Počet kopií transgenní DNA integrované v genomu transformované rostliny (transformanty) s nejyšší tolerancí ke glyfosatu (RRMax) byl stanoven metodou Southernova přenosu na restrikčních fragmentech sahajících za levou a pravou hraniční sekvenci použitého transformačního vektoru.
Genomová DNA z RRMax a netransgenní kontrolní rostliny byla izolována z 250 mg zamraženého pletiva listu cukrové řepy postupem, který publikovali Saghai-Maroof et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81 :8014-8018, 1984. DNA transformačního vektoru sloužila jako pozitivní kontrola. 15 pg DNA bylo naštěpeno pomocí 120 jednotek restrikčního enzymu 4 hodiny při 37°C v celkovém reakčním objemu 400 pl. Naštěpená DNA byla precipitována a znovu rozpuštěna v 50 pl . Naštěpená DNA, pozitivní plazmidová kontrola a standard velikosti (lambda DNA naštěpená EcoRI and HindlII) byly separovány elektroforézou na 0.8% agarózovém gelu. DNA byla vizualizována pomocí etidiumbromidu a vyfotografována společně s měřítkem. Pak byla DNA přenesena na membránu Hybond N+ a hybridizována se sondou postupem, který popsali Ausubel et al. (eds.) in: Current protocols in molecular biology, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York, 1987.
Byly připraveny sondy zahrnující páry baží 975 až 1766 ze sekvence genu cp4/epsps (sekvence id. č. 5) a páry baží 7108 až 7535 sekvence genu gox (sekvence id. č. 5) pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR), kdy jako templátová DNA sloužil použitý transformační vektor. Sonda genu cp4/epsps byla užita pro stanovení počtu inzertů sousedících s pravou hraniční sekvencí. Sonda genu gox byla užita pro stanovení • · · · • · počtu inzertů sousedících s levou hraniční sekvencí. Produkty PCR byly purifikovány pomocí soupravy Geneclean II® Kit firmy BIO 101 (La Jolla, CA) . Značení sondy 32P bylo provedeno pomocí soupravy Megaprime™ DNA labelling systém firmy Amersham International (Little Chalfont, UK).
Stanovení počtu kopií se provádělo analýzou genomové DNA obklopující pravou hraniční oblast. Genomová DNA byla naštěpena restrikčním enzymem Ncol, který štěpí sekvence odvozené z plazmidu mezi promotorem 35S a genem uidA a uvnitř genomu cukrové řepy. Membrána pak byla testována se sondou, kterou byl vnitřní PCR fragment genu cp4/epsps.
Stanovení počtu kopií lze také provést analýzou genomové DNA sousedící s levou hraniční sekvencí. Genomová DNA se naštěpí restrikčním enzymem HindlII, který štěpí sekvence odvozené z plazmidu mezi 3'-terminátopem E9 genu uidA a promotorem FMV genu gox a uvnitř genomu cukrové řepy. Po naštěpení HindlII a hybridizací se sondou gox byl detekován jediný pás velikosti asi 2,0 kb u transformanty RRMax. Vzhledem k tomu, že velikost nejmenšího očekávaného fragmentu byla >4 kb, tento výsledek ukazuje na zkrácení plazmidové DNA během přenosu do genomové DNA rostliny. Nicméně výsledek potvrdil, že pouze jediná kopie přenesené DNA byla integrována do jediného lokusu.
Příklad 3
Analýza sekvence integračního místa RRMax
Genomová DNA z RRMax a netransgenní kontrolní rostliny byla izolována z 250 mg zamaraženého pletiva listu cukrové řepy postupem, který publikovali Saghai-Maroof (viz výše). Byla připravena knihovna fága λΠΧΙΙ (objednáno u firmy Stratagene) s inzerty velikosti 9 až 23 kb v klonovacím místě • ·
0 0 0 * 0
| 18 | »00 0· 0 0 0 0 0 · 0 0 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 | |
| Xhol a tato | knihovna byla podrobena | screeningu | se sondami |
| cp4/epsps a | gox pro vyhledání | předpokládaných klonů | |
| obsahuj ících | integrační místo. Bylo | detekováno | celkem 25 |
| fágů, které | hybridizovaly s geny cp4/epsps a | gox. Jeden |
z nich byl purifíkován (podle Fritsch et al., 1987) a dále testován Southernovým přenosem a PCR. Ukázalo se, že obsahuje inzert genomové DNA velikosti 15 až 16 kb včetně transgenní DNA a přilehlých sekvencí z genomu cukrové řepy. Uvedené přilehlé sekvence byly amplifikovány pomocí PCR s primery komplementárními k promotoru FMV nebo sekvenci genu gox v kombinaci s primery komplementárními k sekvenci klonovací kazety ÁFIXII (sekvence jsou podrobně uvedeny v následují tabulce 1). Úsek spojení integrované DNA a genomové DNA cukrové řepy byl sekvencován Sangerovou dideoxy-terminační metodou na přístroji Applied Biosystems, Model 373A, verze 2.1.1. Primery použité k sekvencování jsou uvedeny v následující tabulce 2.
Tabulka 1
Primery použité pro amplifikaci hraničních úseků
| Primer č. | Sekvence |
| 3 | 5'-CAAGAAGGTTGGTATCGCTG-3' (sekvence id. č. 10) |
| 7 | 5'-TCTTTTGTGGTCGTCACTGCGTT-3’ (sekvence id. č. 11) |
| 8 | 5'-GCGAGCTCTAATACGACTCACTAT-3’ (sekvence id. č. 12) |
| 9 | 5'-CGCGAGCTCAATTAACCCTCACT-3' ( sekvence id. č. 13) |
··«· · · · » · · · • ·· ····· ···· ·····«* > · «••a ·-» ·· ·· ** · ·
Tabulka 2
Primery pro sekvencování
| Primer | Sekvence | Popis |
| Sl | 5’-TCTGTACCCTGACCTTGTTG-3' (sekvence id. č. 14) | pro sekvencování úseku sousedícího s pravou hranicí |
| S3 | 5' -CGTGGATACCACATCGTGAT-3' (sekvence id. č. 15) | pro sekvencování úseku sousedícího s levou hranicí |
| S4 | 5'-ACCTTGGCTTGAAGTACTC-3' (sekvence id. č. 16) | pro sekvencování úseku sousedícího s levou hranicí |
Sekvenční analýza ukázala, že transgenní DNA integrovaná v genomu RRMax má sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 1. Počáteční místo integrace leží mezi sekvencí pravé hranice a promotorem FMV a končí 897 bp downstream (po směru transkripce) od startkodonu genu gox. Translační stopkodony pro zkrácený gen gox lze najít 130 a 235 bp downstream od míst aspojení. Místo HindlII bylo identifikováno 210 bp downstream a transkripční terminační signál (AATAAA) 650 bp downstream od startkodonu genu gox. Sekvence id. č. 2 popisuje sekvenci genomové DNA bezprostředně spojené s pravým hraničním úsekem transgenní DNA a sekvence id. č. 3 popisuje DNA sekvenci genomové DNA bezprostředně spojené s levým hraničním úsekem transgenní DNA.
·« ·· ·· ·· ·· ·· ···· 0·· · · · · • ·· · · ··· · · · · • · · Ί Λ · · · · ··· ··· ······· · · «·*· ·· ·· ·· ·» ··
Příklad 4
Charakterizace transgenní DNA integrované v RRMax
Pro další charakterizaci pravé hraniční oblasti byla genomová DNA z RRMax a DNA transformačního vektoru naštěpena některým z restrikčních enzymů BamHI, HindlII, Bell nebo EcoRI. Naštěpená DNA pak byla Southernovým přenosem testována pomocí sondy, kterou byl PCR fragment genu cp4/epsps popsaný v příkladu 2. Nezávisle na použitém restrikčním enzymu, štěpení vždy vedlo ke vzniku jediného fragmentu, jak ukázala Southernova analýza. Velikost detekovaných fragmentů je uvedena v tabulce 3. Data ukazují, že jediná kopie DNA byla přenesena do rostliny a že přenos DNA do rostliny cukrové řepy vedl k přenosu úplného genu cp4/epsps. tyto výsledky jsou v souladu s výsledky stanovení počtu kopií v příkladu 2 a s analýzou nukleotidové sekvence v příkladu 3.
Tabulka 3
Velikost fragmentů detekovaných Southernovým přenosem
| Enzym | RRMax | Transformační vektor |
| BamHI | >10 kb | 9,7 kb |
| HindlII | 2,4 kb | 2,4 kb |
| Bell | 3,2 kb | 2, 9 kb |
| EcoRI | 1, 8 kb | 1, 8 kb |
Pro další charakterizaci úseku integrované transgenní DNA byla genomová DNA z RRMax naštěpena restrikčními enzymy Ncol, BamHI a HindlII. Jako kontrola byl stejnými enzymy naštěpen transformační vektor. Southernův přenos byl testován sodnou,kterou byl PCR amplifikovaný fragment DNA zahrnující páry baží 3796 až 4837 genu uidA sekvence id. č. 5. Velikost • · detekovaných fragmentů je uvedena v tabulce 4. Nezávisle na použitém restrikčním enzymu, štěpení vždy vedlo ke vzniku jediného signálu na autoradiografickém filmu, což ukazuje, že inzert DNA má stejné vlastnosti jako vnitřní DNA použitého transformačního vektoru.
Tabulka 4
Velikost fragmentů detekovaných Southernovým přenosem
| Enzym | Transformační vektor | RRMax |
| Ncol | 3, 4 kb | 3,4 kb |
| BamHI | 3,2 kb | 3,2 kb |
| HindlII | 3,2 kb | 3,2 kb |
Pro další charakterizaci levého hraničního úseku byla genomová DNA z RRMax a DNA transformačního vektoru naštěpeny některým z restrikčních enzymů Ncol, BamHI, HindlII nebo EcoRI. Naštěpená DNA pak byla Southernovým přenosem testována pomocí sondy, kterou byl PCR fragment genu gox popsaný v příkladu 2. Velikost detekovaných fragmentů je uvedena v tabulce 5. Nezávisle na použitém restrikčním enzymu, štěpení vždy vedlo ke vzniku jediného fragmentu na autopradiografickém filmu. Podle očekávání štěpení enzymy Ncol, BamHI nebo EcoRI mělo vést ke vzniku vnitřních fragmentů známé velikosti. Avšak žádné štěpení jedním z těchto enzymů nevedlo ke vzniku očekávaného fragmentu známé velikosti. To ukazuje, že restrikční místa pro Ncol, BamHI a EcoRI v transgenní rostlině chybí. Výsledky jsou v souladu se sekvencováním, kdy se ukázalo, že pouze část genu gox se integrovala do rostliny. Štěpení enzymem HindlII vedlo ke vzniku fragmentu velikosti asi 2 kb, což dodatečně potvrdilo data ze sekvenční analýzy, že místo HindlII je lokalizováno » · • ·
• · • · · · · · · • ···· · ·· · • · · ·· ··· ··· • · · · * * ·· ·· ·· ·· downstream od genu gox uvnitř genomu. Výsledky také ukazují, že do rostliny byla přenesena jediná kopie DNA. To koreluje velmi dobře s primárními výsledky stanovení počtu kopií v příkladu 2 a se sekvencováním nukleotidové sekvence v příkladu 3. V rostlinném genomu je integrována jediná kopie, přičemž část genu gox je deletována (odstraněna).
Tabulka 5
Velikost fragmentů detekovaných Southernovým přenosem
| Enzym | Transformační vektor | T9100152 |
| Ncol | 2, 5 kb | 3, 0 kb |
| BamHI | 2,9 kb | >10 kb |
| HindlII | 9,5 kb | 2, 0 kb |
| EcoRI | 1, 6 kb | 3, 6 kb |
Příklad 5
Nepřítomnost dalších vektorových sekvencí
Pro ověření absence sekvencí oriV, ori-322, aad a nptll po transformační události byla RRMax analyzována pomocí restrikčních enzymů a sond, pokrývajících geny oriV, ori-322, aad a nptll.
DNA transformačního vektoru byla naštěpena enzymem NspI, který štěpí plazmid na 17 místech. Pro účely analýzy byly purifikovány fragmenty zahrnující úseky genů oriV, ori322, aad a použity pro Southernovu analýzu. Fragment amplifikovaný PCR se sekvencí uvedenou zde jako sekvence id. č. 26 byl použit jako sonda pro sekvenci nptll. Všechny fragmenty byly purifikovány pomocí soupravy Geneclean II® Kit firmy BIO 101 (La Jolla, CA) . Značení sondy 32P bylo provedeno pomocí soupravy Megaprime™ DNA labelling systém firmy Amersham International (Little Chalfont, UK).
Genomová DNA RRMAx byla naštěpena restrikčním enzymem BamHI, který štěpí DNA transformačního vektoru na 3 místech, a sice v polohách 2321, 5544 a 8413 podle sekvence id. č. 5. Hybridizace odpovídající membrány se Southernovým přenosem se sondou pokrývající gen oriV nevedla k žádnému signálu. Z toho lze usuzovat, že gen oriV není přítomen v RRMax.
Hybridizace odpovídající membrány se Southernovým přenosem se sondami pokrývajícími geny ori-322 a aad nevedla k žádnému signálu. Z toho lze usuzovat, že gen geny ori-322 a aad nejsou přítomny v RRMax.
Hybridizace odpovídající membrány se Southernovým přenosem se sondou pokrývající gen nptll nevedla k žádnému signálu. Z toho lze usuzovat, že gen nptll také není přítomen v RRMax.
Příklad 6
Stabilita linie RRMax
Štěpení genomové DNA enzymem Bell a Southernůvpřenos se sodnou cp4/epsps byly provedeny stejně jak bylo popsáno v příkladu 2. Čtyři rostliny z generace 2 a 3 a pět rostlin z generace 4 byly použity pro analýzu. Kromě toho byly užity tři netransgenní rostliny jako negativní kontrola. Analýzy primární transformace ukázaly jediný fragment velikosti 3,2 kb. Southernova analýza generací potomstva ukazovala také jediný fragment velikosti 3,2 kb. Pokud je vnesená DNA děděna z generace na generaci, pak lze očekávat ve všech rostlinách stejný fragment velikosti 3,2 kb.
• ·
Štěpení genomové DNA enzymem HindlII a Southernův přenos s vnitřním fragmentem genu gox jako sodnou byly provedeny stejně jak bylo popsáno v příkladu 2. Analýzy primární transformace ukázaly jediný fragment velikosti 2,0 kb. Southernova analýza generací potomstva ukazovala také jediný fragment velikosti 2,0 kb, což ukazuje na stabilní dědičnost tohoto znaku.
Příklad 7
PCR charakteristika RRMax
Genomová DNA z linie RRMax byla připravena postupem popsaným v příkladu 2. přibližně 0,5 μg DNA bylo užito jako templát v PCR reakci s kombinací primerů, které měly sekvence uvedené v tabulce 6. Specifické kombinace primerů a velikost amplifikovaných fragmentů jsou uvedeny v tabulce 7. V závislosti na kombinaci páru primerů byla teplota pro nasednutí primerů (annealing) mezi 55 °C a 65 °C v každém ze 30 až 35 amplifikačních cyklů.
Tabulka 6
Sekvence primerů
| Primer | Sekvence | Popis |
| A | 5'-TCAACCTACAGCTGATTTGGACG-3' (sekvence id. č. 17) | blízko spojení pravé hranice |
| B | 5'-GACCGGAACGACAATCTGATC-3’ (sekvence id. č. 18) | blízko spojení pravé hranice |
| C | 5'-TAGGGAAGTCCAAATCAGCCG-3' (sekvence id. č. 19) | blízko spojení levé hranice |
| D | 5'-TTTGGACCGGAACTTTCCAGAAG-3' (sekvence id. č. 20) | blízko spojení levé hranice |
• ·
Tabulka 6 - pokračování
| Primer | Sekvence | Popis |
| a | 5'-CTAACTTGCGCCATCGGAGAAAC-3' (sekvence id. č. 21) | uvnitř genu cp4/epsps |
| b | 5'-ACTTGTCACCTGGAATACGGAC-3' (sekvence id. č. 22) | uvnitř genu cp4/epsps |
| c | 5' -ATTCTTGAGCTCATCAAGCAGCC-3' (sekvence id. č. 23) | uvnitř genu cp4/epsps |
| e | 5'-AAGGTTGGTATCGCTGGAGCTG-3' (sekvence id. č. 24) | uvnitř sekvence gox |
| f | 5’-TCTCCACAATGGCTTCCTCTATG-3' (sekvence id. č. 25) | uvnitř sekvence gox |
Tabulka 7
Specifické kombinace primerů
| Kombinace | Velikost amplifikovaného fragmentu |
| A + a | 757 bp |
| A+b | 1057 bp |
| A + c | 2352 bp |
| B + a | 739 bp (sekvence id. č. 27) |
| B + b | 1039 bp |
| B + c | 2334 bp |
| C + e | 888 bp |
| C + f | 1224 bp |
| D + e | 834 bp |
| D + f | 1178 bp |
• ·
SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 8012 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTI-SENSE: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
AACGACAATC TGATCCCCAT CAAGCTTGAG CTCAGGATTT AGCAGCATTC CAGATTGGGT 60
TCAATCAACA AGGTACGAGC CATATCACTT TATICAAATT GGTATCGCCA AAACCAAGAA 120
GGAACTCCCA TCCTCAAAGG TTTGTAAGGA AGAATTCTCA GTCCAAAGCC TCAACAAGGT 180
CAGGGTACAG AGTCTCCAAA CCATTAGCCA AAAGCTACAG GAGATCAATG AAGAATCTTC 240
AATCAAAGTA AACTACTGTT CCAGCACATG CATCATGGTC AGTAAGTTTC AGAAAAAGAC 300
ATCCACCGAA GACTTAAAGT TAGTGGGCAT CTTTGAAAGT AATCTTGTCA ACATCGAGCA 360
99 • · · · ·
9
| 27 | ft · · ftft • ftftft ftft ·· | • · • · | ||||
| GCTGGCTIGT | GGGGACCAGA | CAAAAAAGGA | AT3GTGCAGA | ATTCTTAGGC | GCACCTACCA | 420 |
| AAAGCATCTT | TGCCTTTATT | GCAAAGATAA | AGCAGATTCC | TCTAGTACAA | GTGGGGAACA | 480 |
| AAATAACGTG | GAAAAGAGCT | GTCCTGACAG | CCCACTCACT | AATGCGTATG | ACGAACGCAG | 540 |
| TGACGACCAC | AAAAGAATTC | CCTCTATATA | AGAAGGCATT | cattcccatt | TGAAGGATCA | 600 |
| TCAGATACTG | AACCAATCCT | TCTAGAAGAT | CTAAGCTTAT | CGATAAGCTT | GATGTAATTG | 660 |
| GAGGAAGATC | AAAATTTTCA | ATCCCCATTC | TTCGATTGCT | TCAATTGAAG | TTTCTCCGAT | 720 |
| GGCGCAAGTT | AGCAGAATCT | GCAATGGTGT | GCAGAACCCA | TCTCTTATCT | CCAATCTCTC | 780 |
| GAAATCCAGT | CAACGCAAAT | CTCCCTTATC | GGTTTCTCTG | AAGACGCAGC | AGCATCCACG | 840 |
| AGCITATCCG | ATTTCGTCGT | CGTGGGGATT | GAAGAAGAGT | GGGATGACGT | TAATTGGCTC | 900 |
| TGAGCTICGT | CCTCTTAAGG | TCATGTCTTC | TGTTTCCACG | GCGTGCATGC | TTCACGGTGC | 960 |
| AAGCAGCCGT | CCAGCAACTG | CTCGTAAGTC | CTCTCGTCTT | TCT3GAACCG | TCCGTATTCC | 1020 |
| AGGTGACAAG | TCTATCTCCC | ACAGGTCCTT | CATGTTTGGA | GGTCTCGCTA | GCGGTGAAAC | 1080 |
| TCGTATCACC | GGTCTTTTGG | TGTTATCAAC | ACTGGTAAGG | CTATGCAAGC | 1140 | |
| TATGGGTGCC | AGAATCCGTA | AGGAAGGTCA | TACTTGGATC | ATTGATGGTG | TTGGTAACGG | 1200 |
| TGGACTCCTT | GCTCCTGAGG | CTCCTCTCGA | TTTCGGTAAC | GCTGCAACTG | GTTCCCGTTT | 1260 |
| GACTATGGGT | CTTGTTGGTG | TTTACGATn? | CGATAGCACT | TTCATTGGTG | ACGCTTCTCT | 1320 |
| CACTAAGCGT | CCAATGGGTC | gtctgttcaa | CCCACTTCGC | GAAATGGGTG | TGCAGGTGA4 | 1380 |
| GTCTGAAGAC | GGTCATCGTC | TTCCAGTTAC | CTTGCGTGGA | CCAAAGACTC | CAACGCCAAT | 1440 |
| CACCTACAGG | GTACCTATGG | CTTCCGCTCA | AGTCAAGTCC | GCTGTTCTGC | TTGCTGGTCT | 1500 |
| CAACACCCCA | GGTATCACCA | CTGTTATCGA | GCCAATCATG | ACTCGTGACC | ACACTGAAAA | 1560 |
| GATGCTTCAA | GGTTTTGGTG | CTAACCTTAC | CGTTGAGACT | GATGCTGACG | GTGTGCGTAC | 1620 |
| CATCCGTCTT | GAAGGTCGTG | GTAAGCTCAC | CGGTCAAGTG | ATTGATGTTC | CAGGTGATCC | 1680 |
| ATCCTCTACT | GCTTTCCCAT | TCGTTGCTGC | CTTGCTTCTT | CCAGGTTCCG | ACGTCACCAT | 1740 |
| CCTTAACGTT | TTGATGAACC | CAACCCGTAC | TGGTCTCATC | TTCACTCTGC | AGGAAATGGG | 1800 |
| TGCCGACATC | GAAGTGATCA | ACCCACGTCT | TGCTGGTGGA | GAAGACGTGG | CTGACTTGCG | 1860 |
| TGTTCGTTCT | TCTACTTTGA AGGGTGTTAC | TGTTCCAGAA | GACCGTGCTC | CTTCTATGAT | 1920 | |
| CGACGAGTAT | CCAATTCTCG | CTGTTGCAGC | TGCATTCGCT | GAAGGTGCTA | CCGTTATGAA | 1980 |
| CGGTTTGGAA | GAACTCCGTG | TTAAGGAAAG | CGACCGTCTT | TCTGCTGTCG | CAAACGGTCT | 2040 |
• · • · · • · · · · • · ·
| 28 | • | • · · · · · · | • · | |||
| CAAGCTCAAC | GGTGTTGATT GCGATGAAGG | TGAGACTTCT | CTCGTCGTGC | GTGGTCGTCC | 2100 | |
| TGACGGTAAG | GGTCTCGGTA ACGCTTCTGG | AGCAGCTGTC | GCTACCCACC | TCGATCACCG | 2160 | |
| TATCGCTATG | AGCTTCCTCG | TTATGGGTCT | CGTTTCTGAA | AACCCTGTTA | CTGTTGATGA | 2220 |
| TGCTACTATG | ATCGCTACTA | GCTTCCCAGA | GTTCATGGAT | TTGATGGCTG | GTCTTGGAGC | 2280 |
| TAAGATCGAA | CTCTCCGACA | CTAAGGCTGC | TTGATGAGCT | CAAGAATTCG | AGCTCGGTAC | 2340 |
| CGGATCCTCT | AGCTAGAGCT | TTCGTTCGTA | TCATCGGTTT | CGACAACGTT | CGTCAAGTTC | 2400 |
| AATGCATCAG | TTTCATTGCG | CACACACCAG | AATCCTACTG | AGTTCGAGTA | TTATGGCATT | 2460 |
| GGGAAAACTG | TTTTTCITGT | ACCATTTGTT | GTGCTTGTAA | TTTACTGTGT | TTTTTATTCG | 2520 |
| GTTTTCGCTA | TCGAACTGTG | AAATGGAAAT | GGATGGAGAA | GAGTTAATCA | ATGATATGGT | 2580 |
| CCTTTTGTTC | ATTCTCAAAT | TAATATTATT | •iUJ-MUTlVl· | CTTATTTGTT | GTGTGTTGAA | 2640 |
| TTTGAAATTA | TAAGAGATAT | GCAAACATTT | TGTTTTGAGT | AAAAATGTGT | CAAATCGTGG | 2700 |
| CCTCTAATGA | CCGAAGTTAA | TATGAGGAGT | AAAACACTTG | TAGTTGTACC | ATTATGCTTA | 2760 |
| TTCACTAGGC | aacaaatata | TTTTCAGACC | TAGAAAAGCT | GCAAATGTTA | CTGAATACAA | 2820 |
| GTATGTCCTC | TTGTGTTTTA | GACATTTATG | AACTTTCCTT | TATGTAATTT | TCCAGAATCC | 2880 |
| TTGTCAGATT | CTAATCATTG | CTTTATAATT | ATAGTTATAC | TCATGGATTT | GTAGTTGAGT | 2940 |
| atgaaaatat | TTTTTAATGC | ATTTTATGAC | TTGCCAATTG | attgacaaca | TGCATCAATC | 3000 |
| GACCTGCAGC | CACTCGAAGC | GGCCGCGTTC | AAGCTTCTGC | AGGTCCGATG | TGAGACTTTT | 3060 |
| CAACAAAGGG | TAATATCCGG | AAACCTCCTC | GGATTCCATT | GCCCAGCTAT | CTGTCACTTT | 3120 |
| ATTGTGAAGA | TAGTGGAAAA | GGAAGGTGGC | TCCTACAAAT | GCCATCATTG | CGATAAAGGA | 3180 |
| AAGGCCATCG | TTGAAGATGC | CTCTGCCGAC | AGTGGTCCCA | AAGATGGACC | CCCACCCACG | 3240 |
| AGGAGCATCG | TGGAAAAAGA | AGACGTTCCA | ACCACGTCTT | CAAAGCAAGT | GGATTGATGT | 3300 |
| GATGGTCCGA | TGTGAGACTT | TTCAACAAAG | GGTAATATCC | GGAAACCTCC | TCGGATTCCA | 3360 |
| TTGCCCAGCT | ATCTGTCACT | TTATTGTGAA | GATAGTGGAA | AAGGAAGGTG | GCTCCTACAA | 3420 |
| ATGCCATCAT | TGCGATAAAG | GAAAGGCCAT | CGTTGAAGAT | GCCTCTGCCG | ACAGTGGTCC | 3480 |
| CAAAGATGGA | CCCCCACCCA | CGAGGAGCAT | CGTGGAAAAA | GAAGACGTTC | CAACCACGTC | 3540 |
| TTCAAAGCAA | GTGGATTGAT | GTGATATCTC | CACTGACGTA | AGGGATGACG | CACAATCCCA | 3600 |
| CTATCCTTCG | CAAGACCCTT | CCTCTATATA AGGAAGTTCA | TTTCATTTGG | AGAGGACACG | 3660 |
·· · · • ·
| 29 | • · · · · · • ·· · · • · · · · · • · · · · ···· ·· ·* | • • · · • · · • · • · | ||||
| CTGACAAGCT | GACTCTAGCA | GATCTCCATG | GTCCGTCCTG | TAGAAACCCC | AACCCGTGAA | 3720 |
| ATCAAAAAAC | TCGACGGCCT | GTGGGCATTC | AGTCTGGATC | GCGAAAACTC | TCGAATTCAT | 3780 |
| CAGCGTIGGT | GGGAAAGCGC | GTTACAAGAA | AGCCGGGCAA | TTCCTGTGCC | AGGCAGTTTT | 3840 |
| AACGATCAGT | TCGCCGATGC | AGATATTCGT | AATTATCCGG | GCAACGTCTC | GTATCAGCGC | 3900 |
| GAAGTCTTTA | TACCGAAAGG | TIGGGCAGGC | CAGCGTATCG | TCCTCCGTIT | CGATCCGGTC | 3960 |
| ACTCATTACG | GCAAAGTGTG | GGTCAATAAT | CAGGAAGTGA | TGGAGCATCA | GGGCGGCTAT | 4020 |
| ACGCCATTTG | AAGCCGATGT | CACGCCGTAT | GTTATTGCCG | GGAAAAGTGT | ACGTATCACC | 4080 |
| GTTIGTGTGA | ACAACGAACT | GAACTGGCAG | ACTATCCCGC | CGGGAATGGT | GATTACCGAC | 4140 |
| GAAAACGGCA | AGAAAAAGCA | GTCTTACTTC | CATCAITTCT | TTAACTATGC | CGGAATCCAT | 4200 |
| CGCAGCGTAA | TGCTCTACAC | CACGCCGAAC | ACCTCGGTGG | ACGATATCAC | CGTCGTCACG | 4260 |
| CATGTCGCGC | AAGACTGTAA | CCACGCGTCT | GTTGACTGGC | AGGTCGTCGC | CAATGGTGAT | 4320 |
| GTCAGCGTTG | AACTGCGTGA | TGCGGATCAA | CAGGTGGTTG | CAACTGGACA | AGGCACTAGC | 4380 |
| GGGACTTTGC | AAGTGGTGAA | TCCGCACCTC | TGGCAACCGG | GTGAAGGTTA | TCTCTATGAA | 4440 |
| CTGTGCGTCA | CAGCCAAAAG | CCAGACAGAG | TCTCATATCT | ACCCGCITCG | CGTCGGCATC | 4500 |
| CGGTCAGTGG | CAGTGAAGGG | CGAACAGITC | CTGATTAACC | ACAAACCGTT | CTACTTTACT | 4560 |
| GGCTTTGGTC | GTCATGAAGA | TGCGGACTTA | CGTGGCAAAG | GATTCGATAA | CGTGCTGA7G | 4620 |
| GTGCACGACC | ACGCA1TAAT | GGACTGGATT | GGGGCCAACT | CCTACCGTAC | CTCGCATTAC | 4680 |
| CCTTACGCTG | AAGAGATGCT | CGACTGGGCA | GATGAACATC | GCATCGTGGT | GATTCATGAA | 4740 |
| ACTGCTGCTG | TCGGCTTTAA | CCTCTCTTTA | GGCATTGGTT | TCGAAGCGGG | CAACAAGCCG | 4800 |
| AAAGAACTGT | ACAGCGAAGA | GGCAGTCAAC | GGGGAAACTC | AGCAAGCGCA | CTTACAGGCG | 4860 |
| ATTAAAGAGC | TGATAGCGCG | TCACAAAAAC | CACCCAAGCG | TCGTCATCTC | GAGTATTGCC | 4920 |
| AACGAACCGG | ATACCCGTCC | TGCACGGGAA | TATTTCGGCA | TTTCGCCACT | GGCGGAAGCA | 4980 |
| ACGCGTAAAC | TCGACCCGAC | GCGTCCGATC | ACCTGCGTCA | ATCTAATCTT | CTGCGACGCT | 5040 |
| CACACCGATA | CCATCAGCGA | TCTCTTTCAT | GTGCTGTGCC | TCAACCGTTA | ITACGGATCG | 5100 |
| TATGTCCAAA | GCGGCGATTT | GGAAACGGCA | GAGAAGGTAC | TCGAAAAAGA | ACTTCTGGCC | 5160 |
| TGGCAGGAGA | AACTGCATCA | GCCGATTATC | ATCACCGAAT | ACGGCGTGGA | TACGTTAGCC | 5220 |
| GGGCTGCACT | CAATGTACAC | CGACATCTCG | AGTGAAGAGT ATCAGTCTCC | ATCGCTCGAT | 5280 | |
| ATGTATCACC | GCGTCTTTGA | TCGCGTCAGC | GCCGTCGTCG | GTGAACAGGT | ATGGAATTTC | 5340 |
| 30 | ·· ·· ·· • · · · · · • ·· · · • · · · · · • · · · · ···· · · ·· | • · • · ··· · • · · • 9 • · | ||||
| GCCGATTTTG | CGACCTCGCA | AGGCATATTG | CGCGTTGGCG | GTAACAAGAA | AGGGATCTTC | 5400 |
| ACTCGCGACC | GCAAACCGAA | GTCGGCGGCT | TITCTGCTGC | AAAAACGCTG | GACTGGCATG | 5460 |
| AACTTCGGTG | AAAAACCGCA | GCAGGGAGGC | AAACAATGAA | TCAACAACTC | TCCTGGCGCA | 5520 |
| CCATCGTCGG | CTACAGCCTC | GGTGGGGAAT | TCGAGCTCGC | CCGGGGATCC | TCTAGCTAGA | 5580 |
| GCTTTCGTTC | GTATCATCGG | TTTCGACAAC | GTTCGTCAAG | TTCAATGCAT | CAGTTTCATT | 5640 |
| GCGCACACAC | CAGAATCCTA | CTGAGTTCGA | GTATTATGGC | ATTGGGAAAA | CTGTTTTTCT | 5700 |
| TGTACCATTT | GTTGTGCTTG | TAATTTACTG | TGTTTTTTAT | TCGGTTTTCG | CTATCGAACT | 5760 5820 5880 |
| GTGAAATGGA | AATGGATGGA | GAAGAGTIAA | TGAATGATAT | GGTCCTITIG | TTCATTCTCA TTATAAGAGA | |
| AATTAATATT | ATTTGTTTjLT | TCTCTTATTT | GTIGTGTGTT | GAATTTGAAA | ||
| TATGCAAACA | TTTTGTTTTG | AGTAAAAATG | TGTCAAATCG | T3GCCTCTAA | TGACCGAAGT | 5940 |
| TAATATGAGG | AGTAAAACAC | TTGTAGTTGT | ACCATTATGC | TTATTCACTA | GGCAACAAAT | 6000 |
| ATATTTTCAG | ACCTAGAAAA | GCTGCAAATG | TTACTGAATA | CAAGTATGTC | CTCTTGTGTT | 6060 |
| TTAGACATTT | ATGAACTTTC | CTITATGTAA | THTCCAGAA | TCCTTGTCAG | ATTCTAATCA | 6120 |
| TTGCTTTATA | ATTATAGTTA | TACTCATCGA | TTTGTAGTTG | agtatgaaaa | ΤΑΤΊΤΊΤΤΑΑ | 6180 |
| TGCATTTTAT | GACTTGCCAA | TTGATTGACA | ACATGCATCA | ATCGACCIGC | AGCCCAAGCT | 6240 |
| TGAGCTCAGG | ATTTAGCAGC | ATTCCAGATT | GGGTTCAATC | AACAAGGTAC | GAGCCATATC | 6300 |
| ACTTTATTCA | AATTGGTATC | GCCAAAACCA | agaaggaact | CCCATCCTCA | AAGGTTTGTA | 6360 |
| AGGAAGAATT | CTCAGTCCAA | AGCCTCAACA | AGGTCAGGGT | ACAGAGTCTC | CAAACCATTA | 6420 |
| GCCAAAAGCT | ACAGGAGATC | AATGAAGAAT | CTTCAATCAA | AGTAAACTAC | TGTTCCAGCA | 6480 |
| CATGCATCAT | GGTCAGTAAG | TTTCAGAAAA | AGACATCCAC | CGAAGACTTA | AAGTTAGTGG | 6540 |
| GCATCTTTGA | AAGTAATCTT | GTCAACATCG | AGCAGCIGGC | TTGTGGGGAC | CAGACAAAAA | 6600 |
| AGGAATGGTG | CAGAATTGTT | AGGCGCA.CCT | ACCAAAAGCA | TCTTTGCCTT | TATIGCAAAG | 6660 |
| ATAAAGCAGA | TTCCTCTAGT | ACAAGTGGGG | AACAAAATAA | CGTGGAAAAG | AGCTGTCCTG | 6720 |
| ACAGCOCACT | CACTAATGCG | TATGACGAAC | GCAGTGACGA | CCACAAAAGA ATTCCCTCTA | 6780 | |
| TATAAGAAGG | CATTCATTCC | CATTTGAAGG | ATCATCAGAT | ACTGAACCAA | TCCTTCTAGA | 6840 |
| AGATCTCCAC | AATGGCTIOC | TCTATGCTCT | CTTCCGCTAC | TATGGTTGCC | TCTCCGGCTC | 6900 |
| AGGCCACTAT | GGTCGCTCCT | TTCAACGGAC | TTAAGTCCTC | CGCTGCCTTC | CCAGCCACCC | 6960 |
• · · • · • · • 4
| 31 | ···· · · ·· | • 4 | ||||
| GCAAGGCTAA | CAACGACATT | ACTTCCATCA | CAAGCAACGG | CGGAAGAGTT | AACTGCATGC | 7020 |
| AGGTGTGGCC | TCCGATTCGA | AAGAAGAAGT | TTCAGACTCT | CTCTTACCTT | CCTGACCTTA | 7080 |
| CCGATTCCGG | TGGTCGCGTC | AACTGCATGC | AGGCCATGGC | TGAGAACCAC | AAGAAGGTTG | 7140 |
| GTATCGCTGG | AGCTGGAATC | GTTGGTGTTT | GCACTGCTTT | GATGCTTCAA | CGTCGTGGAT | 7200 |
| TCAAGGTTAC | CTTGATTGAT | CCAAACCCAC | CAGGTCAAGG | TGcricriTC | GGTAACGCTG | 7260 |
| GTTGCTTCAA | CGGTTCCTCC | GTTGTTCCAA | TCTCCATCCC | AGGAAACTTC | ACTAGCGTTC | 7320 |
| CAAAGTGGCT | TCTTGACCCA | ATGGGTCCAT | TCTCCATCCG | TTTCAGCTAC | TTTCCAACCA | 7380 |
| TCATGCCTTG | GTTGATTCGT | TTCTTGCTTG | CTGGAAGACC | aaacaaggtg | AAGGAGCAAG | 7440 |
| CTAAGGCACT | CCGTAACCTC | ATCAAGTCCA | CTCTGCCTTT | GATCAAGTCC | TTGGCTGAGG | 7500 |
| AGGCTGATGC | TAGCCACCTT | ATCCGTCACG | AAGGTCACCT | TACCGTCTAC | CGTGGAGAAG | 7560 |
| CAGACTTCGC | CAAGGACCGT | GGAGGTT3GG | AACTTCGTCG | TCTCAACGGT | GTTCGTACTC | 7620 |
| AAATCCTCAG | CGCTGATGCA | TTGCGTGA1T | TCGATCCTAA | CTTGTCTCAC | GCCTTTACCA | 7680 |
| AGGGAATCCT | TATCGAAGAG | AACGGTCACA | CCATCAACCC | ACAAGGTCTC | GTCACTCTCT | 7740 |
| TGTTTCGTCG | TTTCATCGCT | AACGGTGGAG | AGTTCGTGTC | TGCTCGTCTT | ATCGGATTCG | 7800 |
| AGACTGAAGG | TCGTGCTCTC | AAGGGTATCA | CCACCACCAA | CGGTCTTCTT | GCTGTTGATG | 7860 |
| CAGCTGTTGT | TGCAGCTGGT | GCACACTCCA | AGTCTCTTCC | TAACTCCCTT | GGTGATGACA | 7920 |
| TCCCATTGGA | TACCGAACGT | GGATACCACA | TCGTGATCGC | CAACCCAGAA | GCTGCTCCAC | 7980 |
| GTATTCCAAC | TACCGATGCT | TCTGGAAAGT | TC | 8012 |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
| (A) (B) (C) (D) | DÉLKA: 89 párů baží TYP: nukleová kyselina TYP VLÁKNA: dvojité TOPOLOGIE: lineární | ||
| (ii) | TYP | MOLEKULY: | DNA (genomová) |
| (iii) | HYPOTETICKÁ: | NE | |
| (iii) | ANTI-SENSE: ) | NE |
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
GGATTGTGTT TGGGTTTTGT CTGTGTGTTT AATGTGTTTA AGGGATGAAT TAGAATGCTC
ITAATCAACC TACAGCTCAT TTGGACCGG 89 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: 697 párů baží | |||
| (B) (C) (D) | TYP: nukleová kyselina TYP VLÁKNA: dvojité | ||
| TOPOLOGIE: | lineární | ||
| ii) | TYP | MOLEKULY: | DNA (genomová) |
| iii) | HYPOTETICKÁ: | NE | |
| iii) | ANTI-SENSE: NE |
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
CGGTCCAAAT TTGTTTACAT TGTGTCCAAA TTTCGGCTGA TTTGGACTTC CCTAGCTATG 60
CCAACTAAGC TAATAAAAAA CATGAAACAA CAATTACAAA CTGTCGAGCA CACCTTCTAC 120
AAACTAGCTT AGATTTCTAT TGGAAGTTAC AAAACAGTAA AACTACCAAT AGGATACTAA 180
ATTAAACATA TTAAACTATT ACTCCTCAAA AGCTTGTACA ATTTGCAGAA GAAATGATGG 240
TTCCCCAAAA GCTTCAAAGG GAACCTGCTG GGAAGCCTCC TGGGACGCTG GGGATGCTGG 300
CAGCAGCATA CCTTCGCTTG AAGTACTCTT CTCTCATTGG TTTTCCTTCC CTTGCCCATG 360
TGGTCTTCAT ATGGCCTCAT TACTTCCCAA GGGCTTCAAA TCAGTAGGTG GTGGCAACCA 420
AAAGCATCAA AAACATCTCC TAAAACTAGC TTATACAACC GGATTACATG AGCTTATACT 480
AGCTTAACTC TTAAAGCATG ATTAACATAA TGATGTTTAA GGTGTCATTA AGTATTACTA 540
ATCTTGCTTA AGTAGAGATT AACATAGGAT TAGCCTAATC AAGTTGCTTA AGTAAGGTTT 600
TAGAATAAAC CGAGCTAGTT AGGCTTAAGT AGAGATTAAC ATAGGATTAG CCTAATCAAG 660
TTGCTTAAGT AAGGTTTTAG AATAAACCGA GCTAGTT 697 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 8798 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární • · · · ·· · · (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTI-SENSE: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
| GGATTGTGTT | TGGGTTTTGT | CTGTGT3TTT | AATGTGTITA AGGGATGAAT | TAGAATGCTC | 60 | |
| TTAATCAACC | TACAGCTGAT | TTGGACCGGA | ACGACAATCT | GATCCCCATC | AAGCTIGAGC | 120 |
| TCAGGATTTA | GCAGCATTCC | AGATTGGGTT | CAATCAACAA | GGTACGAGCC | ATATCACTTT | 180 |
| ATTCAAATTG | GTATCGCCAA | AACCAAGAAG | GAACTCCCAT | CCTCAAAGGT | TTGTAAGGAA | 240 |
| GAATTCTCAG | TCCAAAGCCT | CAACAAGGTC | AGGGTACAGA | GTCTCCAAAC | CATTAGCCAA | 300 |
| AAGCTACAGG | agatcaatga | AGAATCTTCA | ATCAAAGTAA | ACTACTGTTC | CAGCACATGC | 360 |
| ATCATGGTCA | GTAAGTTTCA | GAAAAAGACA | TCCACCGAAG | ACTTAAAGTT | AGTGGGCATC | 420 |
| TTTGAAAGTA | ATCTTGTCAA | CATCGAGCAG | CIGGCTTGTG | GGGACCAGAC | AAAAAAGGAA | 480 |
| TGGTGCAGAA | TTGTTAGGCG | CACCTACCAA | AAGCATCTTT | GCCTTTATTG | CAAAGATAAA | 540 |
| GCAGATTCCT | CTAGTACAAG | TGGGGAACAA | AATAACGTGG | AAAAGAGCTG | TCCTGACAGC | 600 |
| CCACTCACTA | ATGCGTATGA | CGAACGCAGT | GACGACCACA | AAAGAATTCC | CTCTATATAA | 660 |
| GAAGGCATTC | ATTCCCATTT | GAAGGATCAT | CAGATACTGA | ACCAATCCTT | CTAGAAGATC | 720 |
| TAAGCTTATC | GATAAGCTIG | ATGTAATIGG | AGGAAGATCA | AAATTTTCAA | TCCCCATTCT | 780 |
| TCGATTGCTT | CAATTGAAGT | TTCTCCGATG | GCGCAAGTTA | GCAGAATCTG | CAATGGTGTG | 840 |
| CAGAACCCAT | CTCTTATCTC | CAATCTCTCG | AAATCCAGTC | AACGCAAATC | TCCCTTATCG | 900 |
| GTTTCTCTGA | AGACGCAGCA | GCATCCACGA | GCTTATCCGA | TTTCGTCGTC | GTGGGGATIG | 960 |
| AAGAAGAGTG | GGATGACGTT | AATTGGCTCT | GAGCTTCGTC | CTCTTAAGGT | CAIGTCTTCT | 1020 |
| GTTTCCACGG | CGTGCATGCT | TCACGGTGCA | AGCAGCCGTC | CAGCAACTGC | TCGTAAGTCC | 1080 |
| TCTGGTCTTT | CTGGAACCGT | CCGTATTCCA | GGTGACAAGT | CTATCTCCCA | CAGGTCCTTC | 1140 |
| ATGTTTGGAG | GTCTCGCTAG | CGGTGAAACT | CGTATCACCG | GTCTTTTGGA | AGGTGAAGAT | 1200 |
| GTTATCAACA | CTGGTAAGGC | TATCCAAGCT | ATGGGTGCCA | GAATCCGTAA | GGAAGGTGAT | 1260 |
| ACTTGGATCA | TTGATGGTGT | TGGTAACGGT | GGACTCCTTG | CTCCTGAGGC | TCCTCTCGAT | 1320 |
| TTCGGTAACG | CTGCAACTGG | TTGCCGTTTG | ACTATGGGTC | TTGTTGGTGT | TTACGATTTC | 1380 |
| GATAGCACTT | TCATTGGTGA | CGCTTCTCTC | ACTAAGCGTC | CAATGGGTCG | TGTGTT3AAC | 1440 |
• · • · • · • · · · · · • · ·· ··
| 34 | « | » · · · · · · · | • · | |||
| CCACTTCGCG | AAATGGGTGT | GCAGGTGAAG | TCTGAAGACG | GTGATCGTCT | TCCAGTTACC | 1500 |
| TTGCGTGGAC | CAAAGACTCC | AACGCCAATC | ACCTACAGGG | TACCTATGGC | TTCCGCTCAA | 1560 |
| GTGAAGTCCG | CTGTTCTGCT | TGCTGGTCTC | AACACCCCAG | GTATCACCAC | TGTTATCGAG | 1620 |
| CCAATCATGA | CTCGTGACCA | CACTGAAAAG | ATCCTTCAAG | GTTITGGTGC | TAACCTTACC | 1680 |
| GTTGAGACTG | ATGCTGACGG | TGTGCGTACC | ATCCGTCTTG | AAGGTCGTGG | TAAGCTCACC | 1740 |
| GGTCAAGTGA | TTGATGTTCC | AGGTGATCCA | TCCTCTACTC | CTTTCCCATT | GGITGCTGCC | 1800 |
| TTGCTTGTTC | CAGGTTCCGA | CGTCACCATC | CTTAACGTTT | TGATGAACCC | AACCCGTACT | 1860 |
| GGTCTCATCT | TGACTCTGCA | GGAAATGGGT | GCCGACATCG | AAGTGATCAA | CCCACGTCTT | 1920 |
| GCTGGTGGAG | AAGACGTGGC | TGACTTGCGT | GTTCGTTCTT | CTACTITGAA | GGGTCTTACT | 1980 |
| GTTCCAGAAG | ACCGTCCTCC | TTCTATGATC | GACGAGTATC | CAATTCTCGC | TGTTGCAGCT | 2040 |
| GCATTCGCTG | AAGGTCCTAC | CGTTATCAAC | GGTTTCGAAG | AACTCCGTCT | TAAGGAAAGC | 2100 |
| GACCGTCTTT | CTGCTCTCGC | AAACGGTCTC | AAGCTCAACG | GTCTTCATTC | CGATGAAGGT | 2160 |
| GAGACTTCTC | TCGTCGTGCG | TGGTCGTCCT | GACGGTAAGG | GTCTCGGTAA | CGCTTCTCGA | 2220 |
| GCAGCTGTCG | CTACCCACCT | CGATCACCGT | ATCGCTATGA | GCTTCCTCGT | TATGGGTCTC | 2280 |
| GTTTCTGAAA | ACCCTGTTAC | TGTTGATCAT | GCTACTATGA | TCGCTACTAG | CTTCCCAGAG | 2340 |
| TTCATGGATT | TCAT3GCTGG | TCTTGGAGCT | AAGATCGAAC | TCTCCGACAC | TAAGGCTGCT | 2400 |
| TGATGAGCTC | AAGAATTCGA | GCTCGGTACC | GGATCCTCTA | GCTAGAGCTT | TCGTTCGTAT | 2460 |
| CATCGGTTTC | GACAACGTTC | GTCAAGTTCA | ATGCATCAGT | TTCATTGCGC | ACACACCAGA | 2520 |
| ATCCTACTGA | GTTCGAGTAT | TATGGCATTG | GGAAAACTGT | TTTTCTTCTA | CCATTTGTTG | 2580 |
| TGCTTGTAAT | TTACTCTCTT | TTTTATTCGG | ITTTCGCTAT | CGAACTCTCA | AATGGAAATG | 2640 |
| GATGGAGAAG | AGTTAATGAA | TGATATCGTC | CTTTTCTICA | TTCTCAAATT | ΑΑΤΑΊΤΑΊΤΓ | 2700 |
| GTirmcrc | TTATTTGTTG | TGTGTTCAAT | TTGAAATTAT | AAGAGATATG | CAAACATITT | 2760 |
| GTTTTGAGTA | AAAATCTGTC | AAATCGTCGC | CTCTAATGAC | CGAAGTTAAT | ATGAGGAGTA | 2820 |
| AAACACTT3T | AGTTCTACCA | TTATGCTTAT | TCACTAGGCA | ACAAATATAT | TTTCAGACCT | 2880 |
| AGAAAAGCTG | CAAATGTTAC | TGAATACAAG | TATGTCCTCT | TGTGTTTTAG | ACATTTATGA | 2940 |
| ACTTTCCTTT | ATGTAATTTT | CCAGAATCCT | TCTCAGATTC | TAATCATTCC | TTTATAATTA | 3000 |
| TAGTTATACT | CATCGATTTC | TAGTTCAGTA | TGAAAATATT | TTTTAATGCA | TTTTATGACT | 3060 |
| TGCCAATTGA | TTGACAACAT | GCATCAATCG | ACCTGCAGCC | ACTCGAAGCG | GCCGCGTTCA | 3120 |
| AGCTTCTGCA | GGTCCGATGT | GAGACTTTTC | AACAAAGGGT | AATATCCGGA | AACCTCCTCG | 3180 |
| GATTCCATTG | CCCAGCTATC | TGTCACTTTA | TTCTCAAGAT | AGTGGAAAAG | GAAGGTGGCT | 3240 |
| CCTACAAATG | CCATCATTGC | GATAAAGGAA | AGGCCATCGT | TGAAGATGCC | TCTGCCGACA | 3300 |
| GTGGTCCCAA | AGATGGACCC | CCACCCACGA | GGAGCATCGT | GGAAAAAGAA | GACGTTCCAA | 3360 |
| CCACGTCTTC | AAAGCAAGTG | GATTGATGTG | ATCGTCCGAT | GTGAGACTTT | TCAACAAAGG | 3420 |
| GTAATATCCG | GAAACCTCCT | CGGATTCCAT | TGCCCAGCTA | TCTGTCACTT | TATTGTCAAG | 3480 |
| ATAGTGGAAA | AGGAAGGTGG | CTCCTACAAA | TCCCATCATT | GCGATAAAGG | AAAGGCCATC | 3540 |
| GTTGAAGATG | CCTCTGCCGA | CAGTGGTCCC | aaagatggac | CCCCACCCAC | GAGGAGCATC | 3600 |
| GTGGAAAAAG | AAGACGTTCC | AACCACGTCT | TCAAAGCAAG | TCGATTCATC | TCATATCTCC | 3660 |
| ACTCACGTAA | GGGATGACGC | ACAATCCCAC | TATCCTTCGC | AAGACCCTTC | CTCTATATAA | 3720 |
| GGAAGTTCAT | TTCATTTGGA | gaggacacgc | TGACAAGCTG | ACTCTAGCAG | ATCTCCATGG | 3780 |
| TCCGTCCTGT | AGAAACCCCA | ACCOGTGAAA | TCAAAAAACT | CGACGGCCTC | TGGGCATTCA | 3840 |
| GTCTGGATCG | CGAAAACTGT | GGAATTGATC | AGCGTTGGTG | GGAAAGCGCG | TTACAAGAAA | 3900 |
| GCCGGGCAAT | TGCTGTGCCA | GGCAGTTTTA | ACGATCAGTT | CGCCGATGCA | GATATTCGTA | 3960 |
| ATTATGCGGG | CAACGTCTGG | TATCAGCGCG | AAGTCTTTAT | ACCGAAAGGT | TGGGCAGGCC | 4020 |
| AGCGTATCGT | GCTGCGTTTC | GATCCGGTCA | CTCATTACGG | CAAAGTGTGG | GTCAATAATC | 4080 |
| aggaagtgat | GGAGCATCAG | GGCGGCTATA | CGCCATTTGA | AGCCGATGTC | ACGCCGTATC | 4140 |
| TTATTGCCGG | GAAAAGTGTA | CGTATCACCG | TTTCTGTCAA | CAACGAACTC | AACTGGCAGA | 4200 |
| CTATCCCGCC | GGGAATGGTG | ATTACCGACG | AAAACGGCAA | GAAAAAGCAG | TCTTACTTCC | 4260 |
| ATGATTTCTT | TAACTATGCC | GGAATCCATC | GCAGCGTAAT | GCTCTACACC | ACGCCGAACA | 4320 |
| CCTGGGTGGA | CGATATCACC | GTGGTGACGC | ATGTCGCGCA | AGACTCTAAC | CACGCGTCTC | 4380 |
| TTGACTGGCA | GGTGGTGGCC | AATGGTCATC | TCAGCGTTCA | ACTCCGTCAT | GCGGATCAAC | 4440 |
| AGGTGGTTGC | AACTGGACAA | GGCACTAGCG | GGACTTTCCA | AGTGGTGAAT | CCGCACCTCT | 4500 |
| GGCAACCGGG | TGAAGGTTAT | CTCTATGAAC | TCTGCGTCAC | AGCCAAAAGC | CAGACAGAGT | 4560 |
| GTGATATCTA | CCCGCTTCGC | GTCGGCATCC | GGTCAGTGGC | AGTGAAGGGC | GAACAGTTCC | 4620 |
| TGATTAACCA | CAAACCGTTC | TACTTTACTC | GCTTTGGTCG | TCATGAAGAT | GCGGACTTAC | 4680 |
| GTGGCAAAGG | ATTCGATAAC | GTCCTCATCG | TGCACGACCA | CGCATTAATG | GACTCGATTC | 4740 |
| 36 | • ·> | • · · · · · · • ·· · · ··· · • · · · · ·· · · | ||||
| ··· ·· ·· | • · | |||||
| GGGCCAACTC | CTACCGTACC | TCGCATEACC | CTTACGCTGA | AGAGATGCTC | GACTCGGCAG | 4800 |
| ATGAACATGG | CATCGTGGTG | ATTGATGAAA | CTGCTGCTGT | CGGCTTTAAC | CTCTCTTTAG | 4860 |
| GCATTGGTTT | CGAAGCGGGC | AACAAGCCGA | AAGAACTGTA | CAGCGAAGAG | GCAGTCAACG | 4920 |
| GGGAAACTCA | GCAAGCGCAC | TTACAGGCGA | TTAAAGAGCT | GATAGCGCGT | GACAAAAACC | 4980 |
| ACCCAAGCGT | GGTGATGTGG | AGTATTGCCA | ACGAACCGGA | TACCCGTCCT | GCACGGGAAT | 5040 |
| ATTTCGGCAT | TTCGCCACTG | GCGGAAGCAA | CGCGTAAACT | CGACCCGACG | CGTCCGATCA | 5100 |
| CCTGCGTCAA | TGTAATGTTC | TGCGACGCTC | ACACCGATAC | CATCAGCGAT | CTCTTTGATC | 5160 |
| TGCTGTGCCT | GAACCGTTAT | TACGGATGGT | ATGTCCAAAG | CGGCGATTTG | GAAACGGCAG | 5220 |
| AGAAGGTACT | GGAAAAAGAA | CTTCTGGCCT | GGCAGGAGAA | ACTGCATCAG | CCGATTATCA | 5280 |
| TCACCGAATA | CGGCGTGGAT | ACGTTAGCCG | GGCTGCACTC | AATGTACACC | GACATGTGGA | 5340 |
| GTGAAGAGTA | TCAGTGTGCA | TGGCTGGATA | TGTATCACCG | CGTCTTTGAT | CGCGTCAGCG | 5400 |
| CCGTCGTCGG | TGAACAGGTA | TGGAATTTCG | CCGATTTTGC | GACCTCGCAA | GGCATATTGC | 5460 |
| GCGTTGGCGG | TAACAAGAAA | GGGATCTTCA | CTCGCGACCG | CAAACCGAAG | TCGGCGGCTT | 5520 |
| TTCTGCTGCA | AAAACGCTGG | ACTGGCATGA | ACTTCGGTGA | AAAACCGCAG | CAGGGAGGCA | 5580 |
| AACAATGAAT | CAACAACTCT | CCTGGCGCAC | CATCGTCGGC | TACAGCCTCG | GTGGGGAATT | 5640 |
| CGAGCTCGCC | CGGGGATCCT | CTAGCTAGAG | CTTTCGTTCG | TATCATCGGT | TTCGACAACG | 5700 |
| TTCGTCAAGT | TCAATGCATC | AGTTTCATTG | CGCACACACC | AGAATCCTAC | TGAGTTCGAG | 5760 |
| TATTATGGCA | TTGGGAAAAC | TGTTTTiClT' | GTACCATTTG | TTGTGCTTCT | AATTTACTGT | 5820 |
| gttttttatt | CGGTTTTCGC | TATCGAACTG | TGAAATGGAA | ATGGATGGAG | AAGAGTTAAT | 5880 |
| GAATGATATG | GTCCTTTTGT | TCATTCTCAA | ATTAATATTA | TTTGTITTTT | CTCTTATTTG | 5940 |
| TTGTGTGTTG | AATTTGAAAT | TATAAGAGAT | ATGCAAACAT | TTTGTTITGA | GTAAAAATGT | 6000 |
| GTCAAATCGT | GGCCTCTAAT | GACCGAAGTT | AATATGAGGA | GTAAAACACT | TGTAGTTGTA | 6060 |
| CCATTATGCT | TATTCACTAG | GCAACAAATA | TATTTTCAGA | CCTAGAAAAG | CTGCAAATGT | 6120 |
| TACTGAATAC | AAGTATGTCC | TCTTGTGTTT | TAGACATTTA | TGAACTTTCC | TTTATGTAAT | 6180 |
| TTTCCAGAAT | CCTTGTCAGA | TTCTAATCAT | TGCTTTATAA | TTATAGTTAT | ACTCATGGAT | 6240 |
| TTGTAGTTGA | GTATGAAAAT | ΑΤΠΠΤΑΑΤ | GCATTTTATG | ACTTGCCAAT | TCATTGACAA | 6300 |
| CATGCATCAA | TCGACCTGCA | GCCCAAGCTT | GAGCTCAGGA | TTTAGCAGCA | TTCCAGATTG | 6360 |
A ·
| GGTTCAATCA | ACAAGGTACG | AGCCATATCA | CTTTATTCAA | ATIOGTATCG | CCAAAACCAA | 6420 |
| GAAGGAACTC | CCATCCTCAA | AGGTTTGTAA | GGAAGAATTC | TCAGTCCAAA | GCCTCAACAA | 6480 |
| GGTCAGGGTA | CAGAGTCTCC | AAACCATTAG | CCAAAAGCTA | CAGGAGATCA | ATGAAGAATC | 6540 |
| TTCAATCAAA | GTAAACTACT | GTTCCAGCAC | ATGCATCATG | GTCAGTAAGT | TTCAGAAAAA | 6600 |
| GACATCCACC | GAAGACTTAA AGTTAGTSGG | CATCTTTGAA AGTAATCTTG | TCAACATCGA | 6660 | ||
| GCAGCTGGCT | TGTGGGGACC | AGACAAAAAA | GGAATGGTGC | AGAATTGTTA | GGCGCACCTA | 6720 |
| CCAAAAGCAT | CTTTGCCTTT | ATIGCAAAGA | TAAAGCAGAT | TCCTCTAGTA | CAAGTGGGGA | 6780 |
| ACAAAATAAC | GTGGAAAAGA | GCTGTCCTGA | CAGCCCACTC | ACTAATGCGT | ATGACGAACG | 6840 |
| CAGTGACGAC | CACAAAAGAA | TTCCCTCTAT | ATAAGAAGGC | ATTCATTCCC | ATTTGAAGGA | 6900 |
| TCATCAGATA | CTGAACCAAT | CCTTCTAGAA | GATCTCCACA | ATGGCTTCCT | CTATGCTCTC | 6960 |
| TTCCGCTACT | ATGGTTGCCT | CTCCGGCTCA | GGCCACTATG | GTCGCTCCTT | TCAACGGACT | 7020 |
| TAAGTCCTCC | GCTGCCTTCC | CAGCCACCCG | CAAGGCTAAC | AACGACATTA | CTTCCATCAC | 7080 |
| aagcaacggc | GGAAGAGTTA | ACTGCATGCA | GGTGTGGCCT | CCGATTGGAA | AGAAGAAGTT | 7140 |
| TGAGACTCTC | TCTTACCTTC | CTGACCTTAC | CGATTCCGGT | GGTCGCGTCA | ACTGCATGCA | 7200 |
| GGCCATGGCT | GAGAACCACA | AGAAGGTTGG | TATCGCTGGA | GCTGGAATCG | TTCGTGTTIG | 7260 |
| CACTGCTTTG | ATGCTTCAAC | GTCGTCGATT | CAAGGTTACC | TTGATTGATC | CAAACCCACC | 7320 |
| AGGTGAAGGT | GCTTCTTTCG | GTAACGCTGG | TIGCTTCAAC | GGTTCCTCCG | TTGTTCCAAT | 7380 |
| GTCCATGCCA | GGAAACTTGA | CTAGCGTTCC | AAAGTGGCTT | CTTGACCCAA | TGGGTCCATT | 7440 |
| GTCCATCCGT | TTCAGCTACT | TTCCAACCAT | CATGCCTTGG | TTGATTCGTT | TCTTGCTTGC | 7500 |
| TGGAAGACCA | AACAAGGTGA | AGGAGCAAGC | TAAGGCACTC | CGTAACCTCA | TCAAGTCCAC | 7560 |
| TGTGCCTTTG | ATCAAGTCCT | TGGCTGAGGA | GGCTGATGCT | AGCCACCTTA | TCCGTCACGA | 7620 |
| AGGTCACCTT | ACCGTGTACC | GTGGAGAAGC | AGACTTCGCC | AAGGACCGTG | GAGGTTGGGA | 7680 |
| ACTTCGTCGT | CTCAACGGTG | TTCGTACTCA | AATCCTCAGC | GCTGATGCAT | TGCGTGATTT | 7740 |
| CGATCCTAAC | TTGTCTCACG | CCTTTACCAA | GGGAATCCTT | ATCGAAGAGA | ACGGTCACAC | 7800 |
| CATCAACCCA | CAAGGTCTCG | TGACTCTCTT | GTTTCGTCGT | TTCATCGCTA | ACGGTGGAGA | 7860 |
| GTTCGTCTCT | GCTCGTGTTA | TCGGATTCGA | GACTGAAGGT | CGTCCTCTCA | AGGGTATCAC | 7920 |
| CACCACCAAC | GGTGTTCTTG | CTGTTGATGC | AGCTGTTGTT | GCAGCIGGTG | CACACTCCAA | 7980 |
| GTCTCTTGCT | AACTCCCTTG | GTGATGACAT | CCCATIGGAT | ACCGAACGTG | GATACCACAT | 8040 |
• · 1 ·*· ····« « · «· · · · ·» ·· ··· ··· · * · · ·
A V · · ♦ ♦ ·· ·· ·*
| CGTGATCGCC | AACCCAGAAG | CTGCTCCACG | TA1TCCAACT | ACCGATGCIT | CTGGAAAGTT | 8100 |
| CCGGTCCAAA | TTTGTTTACA | TTGTGTCCAA | ATTTCGGCTG | ATTT3GACTT | CCCTAGCTAT | 8160 |
| GCCAACTAAG | CTAATAAAAA | ACATGAAACA | ACAATTACAA | ACTGTCGAGC | ACACCTTCTA | 8220 |
| CAAACTAGCT | TAGATITCTA | TTGGAAGTTA | CAAAACAGTA AAACTACCAA | TAGGATACTA | 8280 | |
| AATTAAACAT | ATTAAACTAT | TACTCCTCAA | AAGCTTGTAC | AATTTGCAGA | AGAAATGATG | 8340 |
| GTTGCCCAAA | AGCTTCAAAG | GGAACCTGCT | GGGAAGCCTG | CTGGGACGCT | GGGGATGCTG | 8400 |
| GCAGCAGCAT | ACCTTGGCTT | GAAGTACTCT | TCTCTCATTG | GTTTTGCTTC | CCTTGCCCAT | 8460 |
| GTGGTCTTCA | TATGGCCTCA | TTACTTCCCA | AGGGCITCAA | ATCAGTAGGT | GGTGGCAACC | 8520 |
| AAAAGCATCA | AAAACATCTC | CTAAAACTAG | CTTATACAAC | CGGATTACAT | GAGCTTATAC | 8580 |
| TAGCTTAACT | CTTAAAGCAT | GATTAACATA | ATGATGTTTA | AGGTGTCATT | AAGTATTACT | 8640 |
| AATCTTGCTT | AAGTAGAGAT | TAACATAGGA | TTAGCCTAAT | CAAGTTGCTT | AAGTAAGGTT | 8700 |
| TTAGAATAAA | CCGAGCTAGT | TAGGCTTAAG | TAGAGATTAA | CATAGGATTA | GCCTAATCAA | 8760 |
| GTTGCTTAAG | TAAGGTTTTA | GAATAAACCG | AGCTAGTT | 8798 |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: 8418 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité | |||
| (D) | TOPOLOGIE | : lineární | |
| ii) | TYP | MOLEKULY: | DNA (genomová |
| iii) | HYPOTETICKÁ: | NE | |
| iii) | ANTI-SENSE: | NE |
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
AAGCTTGAGC TCAGGATTTA GCAGCATTCC AGATTGGGTT CAATCAACAA GGTACGAGCC 60
ATATCACTTT ATTCAAATTG GTATCGCCAA AACCAAGAAG GAACTCCCAT CCTCAAAGGT 120
TTGTAAGGAA GAATTCTCAG TCCAAAGCCT CAACAAGGTC AGGGTACAGA GTCTCCAAAC 180
CATTAGCCAA AAGCTACAGG AGATCAATGA AGAATCTTCA ATCAAAGTAA ACTACTGTTC 240
CAGCACATCC ATCATGGTCA GTAAGTTTCA GAAAAAGACA TCCACCGAAG ACTTAAAGTT 300 ttf ·· • · · • a a • » a a »««« ·· «9 • · » • · · · · • a a · • a a · «· ·· • to a * • « a · • « · a a « · ·· · • · a a ·«
| AGTGGGCATC | TTTGAAAGTA | ATCTTGTCAA | CATCGAGCAG | CTCGCTTGTC | GGGACCAGAC | 360 |
| AAAAAAGGAA | TGGTGCAGAA | TTGTTAGGCG | CACCTACCAA | AAGCATCTTT | GCCTTTATTG | 420 |
| CAAAGATAAA | GCAGATTCCT | CTAGTACAAG | TGGGGAACAA | AATAACGTGG | AAAAGAGCTG | 480 |
| TCCTGACAGC | CCACTCACTA | ATCCGTATGA | CGAACGCAGT | GACGACCACA | AAAGAATTCC | 540 |
| CTCTATATAA | GAAGGCATTC | ATTCCCATTT | GAAGGATCAT | CAGATACTGA ACCAATCCTT | 600 | |
| CTAGAAGATC | TAAGCTTATC | GATAAGCTTG | ATGTAATIGG | AGGAAGATCA AAATITTCAA | 660 | |
| TCCCCATTCT | TCGATTGCTT | CAATIGAAGT | TTCTCCGATG | GCGCAAGTTA | GCAGAATCTG | 720 |
| CAATGGTGTG | CAGAACCCAT | CTCTTATCTC | CAATCTCTCG | AAATCCAGTC | AACGCAAATC | 780 |
| TCCCTTATCG | GTTTCTCTGA | AGACGCAGCA | GCATCCACGA | GCTTATCCGA | TTTCGTCGTC | 840 |
| GTGGGGATTG | AAGAAGAGTG | GGATGACGIT | AAITGGCTCT | GAGCTTCGTC | CTCTTAAGGT | 900 |
| CATGTCTTCT | GTTTCCACGG | CGTGCAIGCT | TCACGGTGCA | AGCAGCCGTC | CAGCAACTCC | 960 |
| TCGTAAGTCC | TCTGGTCTTT | CTGGAACCGT | CCGTATTCCA | GGTGACAAGT | CTATCTCCCA | 1020 |
| CAGGTCCTTC | ATGTTTGGAG | GTCTCGCTAG | CGGTGAAACT | CGTATCACCG | GTCTOTGGA | 1080 |
| AGGTGAAGAT | GTTATCAACA | CTGGTAAGGC | TATGCAAGCT | ATGGGTGCCA | GAATCCGTAA | 1140 |
| GGAAGGTGAT | ACTTGGATCA | TTGATCGTGT | TCGTAACGGT | GGACTCCTTC | CTCCTGAGGC | 1200 |
| TCCTCTCGAT | TTCGGTAACG | CTGCAACTGG | TTGCCGTITG | ACTATGGGTC | TTGTTGGTGT | 1260 |
| TTACGATTTC | GATAGCACTT | TCATTCGTCA | CGCTTCTCTC | ACTAAGCGTC | CAATGGGTCG | 1320 |
| tgtgttgaac | CCACTTCGCG | AAATGGGTGT | GCAGGTGAAG | TCTGAAGACG | GTGATCGTCT | 1380 |
| TCCAGTTACC | TTGCGTGGAC | CAAAGACTCC | AACGCCAATC | ACCTACAGGG | TACCTATGGC | 1440 |
| TTCCGCTCAA | GTGAAGTCCG | CTCITCTGCT | TGCTGGTCTC | AACACCCCAG | GTATCACCAC | 1500 |
| TGTTATCGAG | CCAATCATGA | CTCGTGACCA | CACTGAAAAG | ATGCTTCAAG | GTTTTGGTGC | 1560 |
| TAACCTTACC | GTTGAGACTG | ATCCTGACGG | TGTCCGTACC | ATCCGTCTTG | AAGGTCGTCG | 1620 |
| TAAGCTCACC | GGTCAAGTGA | TTGAIGTTCC | aggtgatcca | TCCTCTACTC | CTTTCCCATT | 1680 |
| GGTTGCTGCC | TTGCTIGTTC | CAGGTTCCGA | CGTCACCATC | CTTAACGTTT | TCATGAACCC | 1740 |
| AACCCGTACT | GGTCTCATCT | TGACTCIGCA | GGAAATGGGT | GCCGACATCG | AAGTGATCAA | 1800 |
| CCCACGTCTT | GCTGGTGGAG | AAGACGTGGC | TGACITGCGT | GTTCGTTCTT | CTACTTTGAA | 1860 |
| GGGTGTTACT | GTTCCAGAAG | ACCGTGCTCC | TTCTATGATC | GACGAGTATC | CAATTCTCGC | 1920 |
| TGTTGCAGCT | GCATTCGCTG | AAGGTCCTAC | CGTTATCAAC | GG1TTCGAAG | AACTCOGTCT | 1980 |
• · · · • · · · ««· ··· • · ·»· ·»
·· ···· ··
·· ··· • · · • · ·»
| TAAGGAAAGC | GACCGTCTTT | CTGCTGTCGC | AAACGGTCTC | AAGCTCAACG | GTCTTCATTC | 2040 |
| CGATGAAGGT | GAGACTTCTC | TCGTCGTGCG | TGGTCGTCCT | GACGGTAAGG | GTCTCGGTAA | 2100 |
| CGCTTCTGGA | GCAGCTGTCG | CTACCCACCT | CGATCACCGT | ATCGCTATGA | GCTTCCTCGT | 2160 |
| TATGGGTCTC | GTTTCTGAAA | ACCCTGTTAC | TGTTGATGAT | GCTACTATCA | TCGCTACTAG | 2220 |
| CTTCCCAGAG | TTCATGGATT | TGATGGCTGG | TCTTGGAGCT | AAGATCGAAC | TCTCCGACAC | 2280 |
| TAAGGCTGCT | TCATGAGCTC | AAGAATTCGA | GCTCGGTACC | GGATCCTCTA | GCTAGAGCTT | 2340 |
| TCGTTCGTAT | CATCGGTTTC | GACAACGTTC | GTCAAGTICA | ATGCATCAGT | TTCATTGCGC | 2400 |
| ACACACCAGA | ATCCTACIGA | GTTCGAGTAT | TATGGCATIG | GGAAAACTGT | TITTCTTCTA | 2460 |
| CCATTTGTTG | TGCTTGTAAT | TTACTGTGTT | TTITAITCGG | TTTTCGCTAT | CGAACTGTGA | 2520 |
| AATGGAAATG | GATGGAGAAG | AGTTAATGAA | TGATATGGTC | CTTTTGTTCA | TTCTCAAATT | 2580 |
| AATATTATTT | gtititicic | TTATTTGTTG | TGTGTTGAAT | TTGAAATTAT | AAGAGATATG | 2640 |
| CAAACATTTT | GTTTTCAGTA | AAAATGTGTC | AAATCGTCGC | CTCTAATCAC | CGAAGTTAAT | 2700 |
| ATGAGGAGTA | AAACACTTCT | AGTTGTACCA | TTATGCTTAT | TCACTAGGCA | ACAAATATAT | 2760 |
| TTTCAGACCT | AGAAAAGCTG | CAAATGTTAC | TGAATACAAG | TATGTCCTCT | TGTGTTTTAG | 2820 |
| ACATTTATGA | ACTITCCTTT | ATCTAATTTT | CCAGAATCCT | TCTCAGATTC | TAATCATIGC | 2880 |
| TTTATAATTA | TAGTTATACT | CATGGATTTG | TAGTIGAGTA | TGAAAATATT | TTTTAATCCA | 2940 |
| TTTTATGACT | TGCCAATTGA | TTGACAACAT | GCATCAATCG | ACCTGCAGCC | ACTCGAAGCG | 3000 |
| GCCGCGTTCA | AGCTTCTGCA | GGTCCGATCT | GAGACTTTTC | AACAAAGGGT | AATATCCGGA | 3060 |
| AACCTCCTCG | GATTCCATTG | CCCAGCTATC | TGTCACTTTA | TTGTGAAGAT | AGTGGAAAAG | 3120 |
| GAAGGTGGCT | CCTACAAATG | CCATCATTGC | GATAAAGGAA | AGGCCATCGT | TGAAGATGCC | 3180 |
| TCTGCCGACA | GTGGTCCCAA | AGATGGACCC | CCACCCACGA | GGAGCATCGT | GGAAAAAGAA | 3240 |
| GACGTTCCAA | CCACGTCTTC | AAAGCAAGTG | GATTGATGTG | ATGGTCCGAT | GTGAGACTTT | 3300 |
| TCAACAAAGG | GTAATATCCG | GAAACCTCCT | CGGATTCCAT | TGCCCAGCTA | TCTGTCACTT | 3360 |
| TATTGTGAAG | ATAGTGGAAA | AGGAAGGTCG | CTCCTACAAA | TCCCATCATT | GCGATAAAGG | 3420 |
| AAAGGCCATC | GTTGAAGATG | CCTCTGCCGA | CAGTGGTCCC | AAAGATGGAC | CCCCACCCAC | 3480 |
| GAGGAGCATC | GTCGAAAAAG | AAGACGTTCC | AACCACGTCT | TCAAAGCAAG | TGGATTGATG | 3540 |
| TGATATCTCC | ACTGACGTAA | GGGATGACGC | ACAATCCCAC | TATCCTTCGC | AAGACCCTTC | 3600 |
• ·
| CTCTATATAA | GGAAGTTCAT | TTCATTTCGA | GAGGACACGC | TGACAAGCTG | ACTCTAGCAG | 3660 |
| ATCTCCATGG | TCCGTCCTGT | AGAAACCCCA | ACCCGTGAAA | TCAAAAAACT | CGACGGCCTG | 3720 |
| TGGGCATTCA | GTCTGGATCG | CGAAAACTGT | GGAATTGATC | AGCGTTGGTG | GGAAAGCGCG | 3780 |
| TTACAAGAAA | GCCGGGCAAT | TGCTGTGCCA | GGCAGTTTTA | ACGATCAGTT | CGCCGATGCA | 3840 |
| GATATTCGTA | ATTATGCGGG | CAACGTCTCG | TATCAGCGCG | AAGTCTTTAT | ACCGAAAGGT | 3900 |
| TGGGCAGGCC | AGCGTATCGT | GCTCCGTITC | GATGCGGTCA | CTCATTACGG | CAAAGTCTCG | 3960 |
| GTCAATAATC | AGGAAGTGAT | GGAGCATCAG | GGCGGCTATA | CGCCATTTGA | AGCCGATGTC | 4020 |
| ACGCCGTATG | TTATTGCCGG | GAAAAGTGTA | CGTATCACCG | TTTCTCTGAA | CAACGAACTG | 4080 |
| AACTGGCAGA | CTATCCCGCC | GGGAATCGTC | ATTACCGACG | AAAACGGCAA | GAAAAAGCAG | 4140 |
| TCTTACTTCC | ATGATTTCTT | TAACTATCCC | GGAATCCATC | GCAGCGTAAT | GCTCTACACC | 4200 |
| ACGCCGAACA | CCTGGGTGGA | CGATATCACC | GTCGTGACGC | ATGTCGCGCA | AGACTCTAAC | 4260 |
| CACGCGTCTG | TTGACTGGCA | GGTGGTCGCC | AATGGTGATG | TCAGCGTTGA | ACTCCGTGAT | 4320 |
| GCGGATCAAC | AGGTGGTTGC | AACTGGACAA | GGCACTAGCG | GGACTTTGCA | agtcgtgaat | 4380 |
| CCGCACCTCT | GGCAACCGGG | TGAAGGTTAT | CTCTATGAAC | TGTGCGTCAC | AGCCAAAAGC | 4440 |
| CAGACAGAGT | GTGATATCTA | CCCGCTTCGC | GTCGGCATCC | GGTCAGTGGC | AGTGAAGGGC | 4500 |
| GAACAGTTCC | TGATTAACCA | CAAACCGTTC | TACTTTACTG | GCTTTCGTCG | TCATGAAGAT | 4560 |
| GCGGACTTAC | GTGGCAAAGG | ATTCGATAAC | GTCCTCATCG | TGCACGACCA | CGCATTAATG | 4620 |
| GACTGGATTG | GGGCCAACTC | CTACCGTACC | TCGCATTACC | CTTACGCTGA | AGAGATGCTC | 4680 |
| GACTGGGCAG | ATGAACATGG | CATCGTGGTG | ATTGATGAAA | CTCCTCCTCT | CGGCTTTAAC | 4740 |
| CTCTCTTTAG | GCATTCGTTT | CGAAGCGGGC | AACAAGCCGA AAGAACTGTA | CAGCGAAGAG | 4800 | |
| GCAGTCAACG | GGGAAACTCA | GCAAGCGCAC | TTACAGGCGA | TTAAAGAGCT | GATAGCGCGT | 4860 |
| GACAAAAACC | ACCCAAGCGT | GGTGATGTGG | AGTATTGCCA | ACGAACCGGA | TACCCGTCCT | 4920 |
| GCACGGGAAT | ATTTCGGCAT | TTCGCCACTG | GCGGAAGCAA | CGCGTAAACT | CGACCCGACG | 4980 |
| CGTCCGATCA | CCTGCGTCAA | TGTAATGTTC | TGCGACGCTC | ACACCGATAC | CATCAGCGAT | 5040 |
| CTCTTTGATG | TCCTCTCCCT | GAACCGTTAT | TACGGATGGT | ATCTCCAAAG | CGGCGATTTG | 5100 |
| GAAACGGCAG | AGAAGGTACT | GGAAAAAGAA | CTTCTGGCCT | GGCAGGAGAA | ACTGCATCAG | 5160 |
| CCGATTATCA | TCACCGAATA | CGGCGTGGAT | ACGTTAGCCG | GGCTCCACTC | AATGTACACC | 5220 |
| GACATGTGGA | GTGAAGAGTA | TCAGTGTGCA | TCGCTGGATA | TGTATCACCG | CGTCTTTCAT | 5280 |
• ·
| CGCGTCAGCG | CCGTCGTCGG | TGAACAGGTA | TGGAATTTCG | CCGATTTTGC | GACCTCGCAA | 5340 |
| GGCATATTGC | GCGTTGGCGG | TAACAAGAAA | GGGATCTTCA | CTCGCGACCG | CAAACCGAAG | 5400 |
| TCGGCGGCTT | TTCTGCTGCA | AAAACGCTGG | ACTGGCATGA | ACTTCGGTGA | AAAACCGCAG | 5460 |
| CAGGGAGGCA | AACAATGAAT | CAACAACTCT | CCTGGCGCAC | CATCGTCGGC | TACAGCCTCG | 5520 |
| GTGGGGAATT | CGAGCTCGCC | CGGGGATCCT | CTAGCTAGAG | CTTTCGTTCG | TATCATCGGT | 5580 |
| TTCGACAACG | TTCGTCAAGT | TCAATGCATC | AGTTTCATTC | CGCACACACC | AGAATCCTAC | 5640 |
| TGAGTTCGAG | TATTATGGCA | TIGGGAAAAC | TGTTCTTCTT | GTACCATTTG | TTGTGCTTGT | 5700 |
| AA.1TTACTGT | GZTmTATT | CGGTTTTCGC | TATCGAACTG | TGAAATGGAA ATGGATGGAG | 5760 | |
| AAGAGTTAAT | GAATGATATC | GTCCTTTTGT | TCATTCTCAA | ΑΊΤΑΑΤΑΤΓΑ | ΊΤΓΟΊΤΓΓΓΓ | 5820 |
| CTCTTATTTG | TTGTGTGTTG | AATTTGAAAT | TATAAGAGAT | ATGCAAACAT | TTTGTTTTGA | 5880 |
| GTAAAAATGT | GTCAAATCGT | GGCCTCTAAT | GACCGAAGTT | AATATGAGGA | GTAAAACACT | 5940 |
| TGTAGTTGTA | CCATTATGCT | TATTCACTAG | GCAACAAATA | TATTTTCAGA | CCTAGAAAAG | 6000 |
| CTGCAAATGT | TACTGAATAC | AAGTATGTCC | TCTTGTGTTT | TAGACATTTA | TCAACTTTCC | 6060 |
| TTTATGTAAT | TTTCCAGAAT | CCTTGTCAGA | TTCTAATCAT | TGCTTTATAA | TTATAGTTAT | 6120 |
| ACTCATGGAT | TTGTAGTTGA | GTATGAAAAT | ΑΊΤΤΤΤΤΑΑΤ | GCATTTTA.TG | ACTIGCCAAT | 6180 |
| TCATTGACAA | CATGCATCAA | TCGACCTGCA | GCCCAAGCTT | GAGCTCAGGA | TTTAGCAGCA | 6240 |
| TTCCAGATTG | GGTTCAATCA | ACAAGGTACG | AGCCATATCA | CTTTATTCAA | ATTCGTATCG | 6300 |
| CCAAAACCAA | GAAGGAACTC | CCATCCTCAA | AGGTTTGTAA | GGAAGAATTC | TCAGTCCAAA | 6360 |
| GCCTCAACAA | GGTCAGGGTA | CAGAGTCTCC | AAACCATTAG | CCAAAAGCTA | CAGGAGATCA | 6420 |
| ATCAAGAATC | TTCAATCAAA | GTAAACTACT | GTTCCAGCAC | ATGCATCATG | GTCAGTAAGT | 6480 |
| TTCAGAAAAA | GACATCCACC | GAAGACTTAA | AGTTAGTGGG | CATCTTTGAA | AGTAATCTTG | 6540 |
| TCAACATCGA | GCAGCTGGCT | TGTGGGGACC | AGACAAAAAA | GGAATGGTCC | AGAATTGTTA | 6600 |
| GGCGCACCTA | CCAAAAGCAT | CTTTGCCTTT | ATTGCAAAGA | TAAAGCAGAT | TCCTCTAGTA | 6660 |
| CAAGTGGGGA | acaaaataac | GTGGAAAAGA | GCTGTCCTGA | CAGCCCACTC | ACTAATGCGT | 6720 |
| ATCACGAACG | CAGTGACGAC | CACAAAAGAA | TTCCCTCTAT | ATAAGAAGGC | ATTCATTCCC | 6780 |
| ATTTGAAGGA | TCATCAGATA | CTGAACCAAT | CCTTCTAGAA | GATCTCCACA | ATGGCTTCCT | 6840 |
| CTATGCTCTC | TTCCGCTACT | ATGGTTGCCT | CTCCGGCTCA GGCCACTATG | GTCGCTCCTT | 6900 |
• · · · · · • ·
| TCAACGGACT | TAAGTCCTCC | GCTGCCTTCC | CAGCCACCCG | CAAGGCTAAC | AACGACATTA | 6960 |
| CTTCCATCAC | AAGCAACGGC | GGAAGAGTTA | ACTGCATGCA | GGTGTGGCCT | CCGATTGGAA | 7020 |
| AGAAGAAGTT | TGAGACTCTC | TCTTACCTTC | CTGACCTTAC | CGATTCCGGT | GGTCGCGTCA | 7080 |
| ACTGCATGCA | GGCCATGGCT | GAGAACCACA | AGAAGGTTGG | TATCGCTGGA | GCTGGAATCG | 7140 |
| TTGGTGTITG | CACTGCTTTG | ATCCTTCAAC | GTCGTGGATT | CAAGGTTACC | TTCATTCATC | 7200 |
| CAAACCCACC | AGGTGAAGGT | GCTTCTTTCG | GTAACGCTGG | TTGCTTCAAC | GGTTCCTCCG | 7260 |
| TTGTTCCAAT | GTCCATGCCA | GGAAACTTGA | CTAGCGTTCC | AAAGTGGCTT | CTTGACCCAA | 7320 |
| TGGGTCCATT | GTCCATCCGT | TTCAGCTACT | TTCCAACCAT | CATGCCTTGG | TTGATTCGTT | 7380 |
| TCTT3CTT3C | T3GAAGACCA | AACAAGGTCA AGGAGCAAGC | TAAGGCACTC | OGTAACCTCA | 7440 | |
| TCAAGTCCAC | TGTGCCTTT3 | ATCAAGTCCT | TGGCTGAGGA | GGCTCATCCT | AGCCACCTTA | 7500 |
| TCCGTCACGA | AGGTCACCTT | ACCGTCTACC | GTGGAGAAGC | AGACTTCGCC | AAGGACCGTG | 7560 |
| GAGGTTGGGA | ACTTCGTCGT | CTCAACGGTG | TTCGTACTCA | AATCCTCAGC | GCTGATGCAT | 7620 |
| TGCGTGATTT | CGATCCTAAC | TTGTCTCACG | CCTTTACCAA | GGGAATCCTT | ATCGAAGAGA | 7680 |
| ACGGTCACAC | CATCAACCCA | CAAGGTCTCG | TCACTCTCTT | GTTTCGTCGT | TTCATCGCTA | 7740 |
| ACGGTGGAGA | GTTCGTGTCT | GCTCGTGTTA | TCGGATICGA | GACTGAAGGT | CGT3CTCTCA | 7800 |
| AGGGTATCAC | CACCACCAAC | GGTGTTCTTG | CTGTTGATGC | AGCTGTTCTT | GCAGCTCGTC | 7860 |
| CACACTCCAA | GTCTCTTGCT | AACTCCCTTC | GTGATGACAT | CCCATTGGAT | ACCGAACGTG | 7920 |
| GATACCACAT | CGTGATCGCC | AACCCAGAAG | CTGCTCCACG | TATTCCAACT | ACCGATCCTT | 7980 |
| CTGGAAAGTT | CATCGCTACT | CCTATGGAGA | TGGGTCTTCG | TGTTCCTCGA | ACCGTTGAGT | 8040 |
| TCGCTGGTCT | CACTGCTGCT | CCTAACTGGA | AGCGTGCTCA | CGTTCTCTAC | ACTCACGCTC | 8100 |
| GTAAGTTGCT | TCCAGCTCTC | GCTCCTCCCA | GTTCTGAAGA | ACGTTACTCC | AAGTGGATGG | 8160 |
| GTTTCCGTCC | AAGCATCCCA | GATTCCCTTC | CAGTGATTGG | TCGTGCTACC | CGTACTCCAG | 8220 |
| ACGTTATCTA | CGCTTTCGGT | CACGGTCACC | TCGGTATGAC | TGGTGCTCCA ATGACCGCAA | 8280 | |
| CCCTCGTTTC | TGAGCTCCTC | GCAGGTGAGA | AGACCTCTAT | CGACATCTCT | CCATTCGCAC | 8340 |
| CAAACCGTTT | CGGTATTGGT | AAGTCCAAGC | AAACTCGTCC | TGCATCCTAA GTGGGAATTC | 8400 |
GAGCTCGGTA CCGGATCC
8418 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
• · · · ··· ···· • · · · ···· · · · · ······· · · • · · · ·· ·· ·· ·· ··
| (A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché | |||
| (D) | TOPOLOGIE | : lineární | |
| (ii) | TYP | MOLEKULY: | DNA (genomová) |
| (iii) | HYPOTETICKÁ: | NE | |
| (iii) | ANTI-SENSE: | NE |
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6: CACCGGTCTT TTGGAAGGTG AAG 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché | |||
| (D) | TOPOLOGIE | : lineární | |
| (ii) | TYP | MOLEKULY: | DNA (genomová |
| (iii) | HYPOTETICKÁ: | NE | |
| (iii) | ANTI-SENSE: | NE |
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
AACGAGACCC ATAACGAGGA AGC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTI-SENSE: NE (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
AAACAGTCCC GTGCATCCCC AAC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
• · · · ··· 0 0 0 0 • · · 0 0 · 0 * 0 00 0
0000000 0 0 0 · · 0 00 00 00 00 00
| (A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina | |||
| (C) (D) | TYP VLÁKNA: jednoduché | ||
| TOPOLOGIE | : lineární | ||
| (ii) | TYP | MOLEKULY: | DNA (genomová) |
| (iii) | HYPOTETICKÁ: | NE | |
| (iii) | ANTI-SENSE: | NE |
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9: GACGCTCTCC TTGATTCTGT CCC 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTI-SENSE: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:
CAAGAAGGTT GGTATCGCTG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
| (A) (B) (C) (D) | DÉLKA: 23 párů baží TYP: nukleová kyselina TYP VLÁKNA: jednoduché TOPOLOGIE: lineární | ||
| (ii) | TYP | MOLEKULY: | DNA (genomová) |
| (iii) | HYPOTETICKÁ: | NE | |
| (iii) | ANTI-SENSE: | NE |
TCTTTTGTGG TCGTCACTGC GTT (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:
• · • · • · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
······· · · • · · · ·· ·· · · ·· · ·
| (A) (B) (C) (D) | DÉLKA: 24 párů baží TYP: nukleová kyselina TYP VLÁKNA: jednoduché TOPOLOGIE: lineární | ||
| (li) | TYP | MOLEKULY: | DNA (genomová) |
| (iii) | HYPOTETICKÁ: | NE | |
| (iii) | i ANTI-SENSE: | NE |
(Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12: GCGAGCTCTA ATACGACTCA CTAT 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: 23 párů baží B) TYP: nukleová kyselina | |||
| (C) (D) | TYP VLÁKNA: jednoduché | ||
| TOPOLOGIE | : lineární | ||
| (ii) | TYP | MOLEKULY: | DNA (genomová |
| (iii) | HYPOTETICKÁ: | NE | |
| (iii) | ANTI-SENSE: | NE |
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13: CGCGAGCTCA ATTAACCCTC ACT 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:
(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTI-SENSE: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:
TCTGTACCCT GACCTTGTTG • · · 0 0 0 · 0 0 0 0 0 0 0 · 0 0 0 0 · ·· 0
000 000· 0 0 0000 00 00 00 00 00 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTI-SENSE: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:
CGTGGATACC ACATCGTGAT 20 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
| (A) (B) (C) (D) | DÉLKA: 19 párů baží TYP: nukleová kyselina TYP VLÁKNA: jednoduché TOPOLOGIE: lineární | ||
| li) | TYP | MOLEKULY: | DNA (genomová |
| iii) | HYPOTETICKÁ: | NE | |
| iii) | ANTI-SENSE: | NE |
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16: ACCTTCGCTT GAAGTACTC , 0 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTI-SENSE: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:
TCAACCTACA GCTGATTTCG ACC • · · · · 4 4 · 4 · 4 • · · · ·«·· · ·« * • •••444 4 4 • · · · ·· ·· 44 ·· 44 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:
(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTI-SENSE: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18: GGACCGGAAC GACAATCTGA TC 22 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTI-SENSE: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:
CTAGGGAAGT CCAAATCAGC CG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTI-SENSE: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:
TTTGGACCGG AACTTTCCAG AAG ···· ··· ···· ··· · ···· · ·· · ······· · · ···· ·· ·· ·· ·· ·· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTI-SENSE: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21: CTAACTTGCG CCATCGGAGA AAC 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
| (A) (B) (C) (D) | DÉLKA: 23 párů baží TYP: nukleová kyselina TYP VLÁKNA: jednoduché TOPOLOGIE: lineární | ||
| ii) | TYP | MOLEKULY: | DNA (genomová |
| iii) | HYPOTETICKÁ: | NE | |
| iii) | ANTI-SENSE: | NE |
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22: GACTTGTCAC CTGGAATACG GAC 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTI-SENSE: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:
ATTCTICAGC TCATCAAGCA GCC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24: (i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:
| (ii) | (A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární TYP MOLEKULY: DNA (genomová) | ||
| • | (iii) | HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iii) | ANTI-SENSE: | NE | |
| (xi) | POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24 |
AAGGTTGGTA TCGCTGGAGC TG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25: (i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina | |||
| (C) (D) | TYP VLAKNA: jednoduché | ||
| TOPOLOGIE | : lineární | ||
| (ii) | TYP | MOLEKULY: | DNA (genomová) |
| (iii) | HYPOTETICKÁ: | NE | |
| (iii) | ANTI-SENSE: | NE |
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:
TCTCCACAAT GGCTTCCTCT ATG 23
···· ·· ·· ·· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 671 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTI-SENSE: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:
CAAGATGGAT TGCACGCAGG TTCTCCGGCC GCTTGGGTGG AGAGGCTATT CGGCTATGAC 60
TGGGCACAAC AGACAATCGG CTGCTCTGAT GCCGCCGTGT TCCGGCTCTC AGCGCAGGGG 120
CGCCCGGTTC TTTTTGTCAA GACCGACCTC TCCGGTGCCC TGAATGAACT GCAGGACGAG 180
GCAGCGCGGC TATCGTGGCT GGCCACGACG GGCGTTCCTT GCGCAGCTGT GCTCGACGTT 240
GTCACTGAAG CGGGAAGGGA CTGGCTGCTA TIGGGCGAAG TGCCGGGGCA GGATCTCCTG 300
TCATCTCACC TTGCTCCTGC CGAGAAAGTA TCCATCATCG CTGATGCAAT GCGGCGGCTG 360
CATACGCTTG ATCCGGCTAC CTGCCCATTC GACCACCAAG CGAAACATCG CATCGAGCGA 420
GCACGTACTC GGATGGAAGC CGGTCTTGTC GATCAGGATG ATCTGGACGA AGAGCATCAG 480
GGGCTCGCGC CAGCCGAACT GTTCGCCAGG CTCAAGGCGC GCATGCCCGA CGGCGAGGAT 540
CTCGTCGTCA CCCATGGCGA TCCCTCCTTC CCGAATATCA TGGTGGAAAA TGGCCGCTTT 600
TCTGGATTCA TCGACTGTGG CCGGCTGGGT GTGGCGGACC GCTATCAGGA CATAGCGTTG 660
GCTACCCGTG A
671 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
·· ··
| (A) (B) (C) (D) | DÉLKA: 739 párů baží TYP: nukleová kyselina TYP VLÁKNA: dvojité TOPOLOGIE: lineární | |||
| i | (ii ) | TYP | MOLEKULY: | DNA (genomová) |
| < | (iii) | HYPOTETICKÁ: | NE | |
| (iii) | ANTI-SENSE: NE |
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:
| GGACCGGAAC | GACAATCTGA | TCCCCATCAA | GCTTGAGCTC | AGGATTTAGC | AGCATICCAG | 60 |
| ATTGGGTT2A | A1CAACAAGG | TACGAGCCAT | ATCACTTTAT | TCAAATTGGT | ATCGCCAAAA | 120 |
| CCAAGAAGGA | ACTCCCATCC | TCAAAGGTTT | GTAAGGAAGA | AITCTCAGTC | CAAAGCCTCA | 180 |
| ACAAGGTCAG | GGTACAGAGT | CTCCAAACCA | TTAGCCAAAA | GCTACAGGAG | ATCAATGAAG | 240 |
| AATCTTCAAT | CAAAGTAAAC | TACTGTTCCA | GCACATGCAT | CATGGTCAGT | AAGTTICAGA | 300 |
| AAAAGACATC | CACCGAAGAC | TTAAAGTTAG | TGGGCATCTT | TGAAAGTAAT | CTTGTCAACA | 360 |
| TCGAGCAGCT | GGCTTGTGGG | GACCAGACAA | AAAAGGAATG | GTGCAGAATT | GTTAGGCGCA | 420 |
| CCTACCAAAA | GCATCTTTGC | CTTTATIGCA | AAGATAAAGC | AGATTCCTCT | AGTACAAGTG | 480 |
| GGGAACAAAA | TAACGTGGAA | AAGAGCTGTC | CTGACAGCCC | ACTCACTAAT | GCGTATGACG | 540 |
| AACGCAGTGA | CGACCACAAA | AGAATTCCCT | CTATATAAGA | AGGCATTCAT | TCCCATTTGA | 600 |
| AGGATCATCA | GATACTGAAC | CAATCCTTCT | AGAAGATCTA | AGCTTATCGA | TAAGCTICAT | 660 |
| GTAATTGGAG | GAAGATCAAA | ATTTTCAATC | CCCATTCTIC | GATTGCTTCA | ATTGAAGTTT | 720 |
CTCCGAT3GC GCAAGTTAG
Claims (13)
- PATENTOVÉ NÁROKY • 0 · · · · · · · 4 ·· • · · · ··· · « » · • · · · · · · * « · · ·1. Rostlina cukrové řepy, včetně jejího potomstva, která exprimuje enzymovou aktivitu cp4/epsps, a která při amplifikaci v polymerázové řetězové reakci (PCR) s genomovou DNA jako templátem poskytne fragment DNA velikosti 739 bp, když se použije dvojice oligonukleotidových primerů charakterizovaných sekvencemi id. č. 18 a id. č. 21.
- 2. Rostlina podle nároku 1, kde DNA charakterizovaná sekvencí id. č. 27 tvoří část genomu rostliny.
- 3. Rostlina podle nároku 1, která při amplifikaci v PCR s genomovou DNA jako templátem poskytne fragment DNA velikosti 834 bp, když se použije dvojice oligonukleotidových primerů charakterizovaných sekvencemi id. č. 20 a id. č. 24.
- 4. Rostlina podle nároku 1, která při amplifikaci v PCR s genomovou DNA jako templátem poskytne fragment DNA velikosti 1057 bp, když se použije dvojice oligonukleotidových primerů charakterizovaných sekvencemi id. č. 17 a id. č. 22.
- 5. Rostlina podle nároku 1, která při amplifikaci v PCR s genomovou DNA jako templátem poskytne fragment DNA velikosti 1224 bp, když se použije dvojice oligonukleotidových primerů charakterizovaných sekvencemi id. č. 19 a id. č. 25.
- 6. Rostlina podle nároku 1, kde DNA charakterizovaná sekvencí id. č. 1 tvoří část genomu rostliny.
- 7. Rostlina podle nároku 6, kde uvedená nukleotidová sekvence nahrazuje sekvence vysoce repetitivní DNA.
- 8. Rostlina podle nároku 6, kde části genomu přímo spojené s uvedenou nukleotidovou sekvencí jsou charakterizovány sekvencemi id. č. 2 a id. č. 3.
- 9. Rostlina podle nároku 7, kde DNA charakterizovaná sekvencí id. č. 4 tvoří část genomu rostliny.
- 10. Semena rostliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9.
- 11. Semena z rostliny podle nároku 6 uložené pod číslem NCIMB 97087006/2.
- 12. Způsob přípravy transgenní rostliny cukrové řepy podle nároku 1 vyznačující se tím, že sea) transformují děložní lístky in vitro pěstované cukrové řepy prostřednictvím Agrobacterium nesoucího vektor obsahující úsek DNA kódující cp4/epsps,b) regenerují výhonky v přítomnosti glyfosatu,c) výhonky přenesou do půdy ve skleníku,d) rostlinky ošetří glyfosatem,e) vizuálně hodnotí vitalita rostlin a chloróza listů pomocí stupnice 0 až 9,f) selektují rostliny hodnocené z hlediska vitality a chlorózy listů stupněm 9, ag) množí selektované rostliny obvyklými šlechtitelskými způsoby.• · · · 0 0 0 k · · • »· · ···· 0 O 0 • · · ···· 0 • 04« 0« 00 « · 0 0 ··
- 13.Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že vektor kódující protein cp4/epsps je vektor obsahující úsek DNA, který má nukleotidovou sekvenci id. č. 5 / 14.t15.Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že regenerované výhonky se analyzují pomocí PCR na přítomnost DNA kódující cp4/epsps.Rostlina cukrové řepy tolerantní ke glyfosatu, včetně transformací umožňuj ícím jejího potomstva, která se získá zprostředkovanou Agrobacterium s genem expresi cp4/epsps v rostlině, přičemž uvedená rostlina postrádá jak pravou tak i levou hraniční sekvenci T-DNA.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11200397P | 1997-10-31 | 1997-10-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ235199A3 true CZ235199A3 (cs) | 1999-09-15 |
| CZ300208B6 CZ300208B6 (cs) | 2009-03-18 |
Family
ID=22341613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0235199A CZ300208B6 (cs) | 1997-10-31 | 1998-10-29 | Transgenní rostlina tolerantní k herbicidu glyfosatu a zpusob prípravy takové rostliny |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6204436B1 (cs) |
| EP (1) | EP0950109A1 (cs) |
| JP (1) | JP2001503280A (cs) |
| CN (1) | CN1148453C (cs) |
| AU (1) | AU1558099A (cs) |
| CA (1) | CA2279258A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ300208B6 (cs) |
| DE (1) | DE19881833B4 (cs) |
| DK (1) | DK199900916A (cs) |
| FI (1) | FI991221A0 (cs) |
| GB (1) | GB2337263A (cs) |
| HK (1) | HK1025360A1 (cs) |
| HU (1) | HUP0001729A3 (cs) |
| PL (1) | PL197872B1 (cs) |
| RU (1) | RU2224024C2 (cs) |
| SE (1) | SE520353C2 (cs) |
| SK (1) | SK88599A3 (cs) |
| TR (1) | TR199901515T1 (cs) |
| UA (1) | UA85364C2 (cs) |
| WO (1) | WO1999023232A1 (cs) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5633435A (en) | 1990-08-31 | 1997-05-27 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases |
| UA85364C2 (uk) * | 1997-10-31 | 2009-01-26 | Сінгента Партісіпейшнс Аг | Рослина цукрового буряку, стійка до гліфосату |
| US6489542B1 (en) | 1998-11-04 | 2002-12-03 | Monsanto Technology Llc | Methods for transforming plants to express Cry2Ab δ-endotoxins targeted to the plastids |
| PE20010635A1 (es) * | 1999-10-08 | 2001-08-15 | Smithkline Beecham Corp | Inhibidores de fab i utiles para el tratamiento de infecciones bacterianas |
| AU2575701A (en) * | 1999-12-07 | 2001-06-18 | Monsanto Company | Sugarbeet regeneration and transformation |
| TR200702139T2 (tr) * | 1999-12-16 | 2007-06-21 | Monsanto Technology Llc | Yeni bitki tanım yapıları |
| US7105718B2 (en) | 2000-03-31 | 2006-09-12 | The Regents Of The University Of Colorado | Compositions and methods for regulating metabolism in plants |
| AU2002215363B2 (en) | 2000-10-25 | 2006-10-12 | Monsanto Technology Llc | Cotton event PV-GHGT07(1445) and compositions and methods for detection thereof |
| ATE509110T1 (de) | 2000-10-30 | 2011-05-15 | Monsanto Technology Llc | Canola event pv-bngt(rt73), zusammensetzungen und verfahren zum nachweis davon |
| US7241567B2 (en) | 2000-11-30 | 2007-07-10 | Ses Europe N.V./S.A. | T227-1 flanking sequence |
| AU2002255913B2 (en) * | 2001-03-27 | 2007-10-18 | Syngenta Seeds, Inc. | Uses of white corn hybrids |
| JP4387804B2 (ja) * | 2001-04-06 | 2009-12-24 | アフィニアム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | ＦａｂＩ阻害剤 |
| EG26529A (en) * | 2001-06-11 | 2014-01-27 | مونسانتو تكنولوجى ل ل سى | Prefixes for detection of DNA molecule in cotton plant MON15985 which gives resistance to damage caused by insect of squamous lepidoptera |
| CN1681923B (zh) * | 2002-07-18 | 2010-06-02 | 孟山都技术有限公司 | 利用人工的多核苷酸及其组合物来减少转基因沉默的方法 |
| JP4859460B2 (ja) * | 2002-12-06 | 2012-01-25 | アフィニウム ファーマシューティカルズ， インク． | ヘテロ環化合物、その製造方法および治療におけるその使用 |
| EP2267136B1 (en) | 2003-01-31 | 2013-09-11 | Monsanto Technology LLC | Glyphosate tolerant alfalfa events and methods for detection thereof |
| AU2004211592B2 (en) * | 2003-02-12 | 2008-04-10 | Monsanto Technology Llc | Cotton event MON 88913 and compositions and methods for detection thereof |
| PL214713B1 (pl) * | 2003-02-20 | 2013-09-30 | Kws Saat Ag | Burak cukrowy odporny na glifosat, nasiono, komórka, tkanka lub czesc takiego buraka cukrowego, sposób identyfikacji buraka cukrowego odpornego na glifosat oraz zestaw testowy do identyfikacji transgenicznego buraka cukrowego odpornego na glifosat |
| US7335816B2 (en) * | 2003-02-28 | 2008-02-26 | Kws Saat Ag | Glyphosate tolerant sugar beet |
| EP1608377B1 (en) * | 2003-03-17 | 2008-10-01 | Affinium Pharmaceuticals, Inc. | Pharmaceutical compositions comprising inhibitors of fab i and further antibiotics |
| CA2547563C (en) | 2003-12-15 | 2014-02-18 | Monsanto Technology Llc | Corn plant mon88017 and compositions and methods for detection thereof |
| DK1828167T3 (da) * | 2004-06-04 | 2014-10-20 | Debiopharm Int Sa | Acrylamidderivater som antibiotiske midler |
| EP1789543A2 (en) * | 2004-06-24 | 2007-05-30 | Monsanto Technology, LLC | Microbial glyphosate resistant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases |
| DE102004057291C5 (de) * | 2004-11-26 | 2010-08-26 | Südzucker AG Mannheim/Ochsenfurt | Lagerungsinduzierte Promotoren |
| AP2693A (en) | 2005-05-27 | 2013-07-16 | Monsanto Technology Llc | Soybean event MON89788 and methods for detection thereof |
| US20090156578A1 (en) * | 2005-12-05 | 2009-06-18 | PAULS Henry | 3-Heterocyclylacrylamide Compounds as Fab I Inhibitors and Antibacterial Agents |
| EP1984390A2 (en) * | 2006-01-23 | 2008-10-29 | Board of Trustees of Michigan State University | Methods for breeding glyphosate resistant plants and compositions thereof |
| US20080092255A1 (en) * | 2006-03-27 | 2008-04-17 | Edgerton Michael D | Methods of producing and using cold temperature tolerant plants, seeds, and crops |
| BR122016025844B1 (pt) | 2006-05-26 | 2018-05-15 | Monsanto Technology Llc | "composição derivada de planta de milho transgênica compreendendo o evento mon89034 ou partes da mesma". |
| US8318720B2 (en) * | 2006-07-20 | 2012-11-27 | Affinium Pharmaceuticals, Inc. | Acrylamide derivatives as Fab I inhibitors |
| EP2125802A4 (en) | 2007-02-16 | 2014-08-20 | Debiopharm Int Sa | SALTS, PRODRUGS AND POLYMORPHES OF FAB I INHIBITORS |
| WO2010135324A1 (en) | 2009-05-18 | 2010-11-25 | Monsanto Technology Llc | Use of glyphosate for disease suppression and yield enhancement in soybean |
| BR112014031635B1 (pt) | 2012-06-19 | 2022-01-11 | Debiopharm International Sa | Derivados de pró-fármaco de (e)-n-metil-n-( (3-metilbenzofuran-2-il) metil)-3-(7-oxo-5,6,7,8- tetraidro- 1, 8- naftirindin-3-il) acrilamida |
| CN103695446B (zh) * | 2013-01-31 | 2016-08-03 | 北京未名凯拓作物设计中心有限公司 | 一种来源于恶臭假单胞菌的epsp合酶基因及其应用 |
| EP3419628B1 (en) | 2016-02-26 | 2020-10-14 | Debiopharm International SA | Medicament for treatment of diabetic foot infections |
| DE102016015741A1 (de) | 2016-04-12 | 2017-11-30 | Kws Saat Se | Kernkodierte männliche Sterilität durch Mutation in Cytochrom P450 Oxidase |
| DE102016106656A1 (de) | 2016-04-12 | 2017-10-12 | Kws Saat Se | Kernkodierte männliche Sterilität durch Mutation in Cytochrom P450 Oxidase |
| CN107164514A (zh) * | 2017-06-22 | 2017-09-15 | 中华人民共和国黄埔出入境检验检疫局 | 转基因甜菜gtsb77品系特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒 |
| EP3628160A1 (en) | 2018-09-25 | 2020-04-01 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Use of glyphosate herbicide for controlling unwanted vegetation in beta vulgaris growing areas |
| EP3628738A1 (en) * | 2018-09-25 | 2020-04-01 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Method for controlling weed beets and other weeds |
| CN111118055A (zh) * | 2020-01-03 | 2020-05-08 | 鲁东大学 | 高糖品种甜菜转基因体系的建立方法 |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5094945A (en) | 1983-01-05 | 1992-03-10 | Calgene, Inc. | Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase, production and use |
| US4535060A (en) | 1983-01-05 | 1985-08-13 | Calgene, Inc. | Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use |
| US4940835A (en) | 1985-10-29 | 1990-07-10 | Monsanto Company | Glyphosate-resistant plants |
| NZ217113A (en) * | 1985-08-07 | 1988-06-30 | Monsanto Co | Production of eucaryotic plants which are glyphosate resistant, vectors (transformation and expression), chimeric gene and plant cells |
| US4971908A (en) | 1987-05-26 | 1990-11-20 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase |
| US5312910A (en) | 1987-05-26 | 1994-05-17 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase |
| US5145783A (en) | 1987-05-26 | 1992-09-08 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-endolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase |
| US5550318A (en) | 1990-04-17 | 1996-08-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| US7705215B1 (en) | 1990-04-17 | 2010-04-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| HU220773B1 (hu) | 1990-01-22 | 2002-05-28 | Dekalb Genetics Corporation | Eljárás termő transzgenikus kukoricanövények előállítására |
| US5484956A (en) | 1990-01-22 | 1996-01-16 | Dekalb Genetics Corporation | Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin |
| DK0536330T3 (da) | 1990-06-25 | 2002-04-22 | Monsanto Technology Llc | Glyphosattolerante planter |
| US5633435A (en) * | 1990-08-31 | 1997-05-27 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases |
| FR2673643B1 (fr) | 1991-03-05 | 1993-05-21 | Rhone Poulenc Agrochimie | Peptide de transit pour l'insertion d'un gene etranger dans un gene vegetal et plantes transformees en utilisant ce peptide. |
| US5631152A (en) | 1994-10-26 | 1997-05-20 | Monsanto Company | Rapid and efficient regeneration of transgenic plants |
| PT889692E (pt) | 1996-03-29 | 2002-10-31 | Monsanto Europe Sa | Novo uso de n-(fosfonometil)glicina e seus derivados |
| US5859348A (en) | 1996-07-17 | 1999-01-12 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Imidazolinone and sulfonyl urea herbicide resistant sugar beet plants |
| US6376754B1 (en) | 1997-03-07 | 2002-04-23 | Asgrow Seed Company | Plants having resistance to multiple herbicides and its use |
| DK0975778T3 (da) | 1997-04-03 | 2007-10-08 | Dekalb Genetics Corp | Anvendelse af glyphostat-resistende majslinier |
| UA85364C2 (uk) * | 1997-10-31 | 2009-01-26 | Сінгента Партісіпейшнс Аг | Рослина цукрового буряку, стійка до гліфосату |
-
1998
- 1998-10-29 UA UA99063655A patent/UA85364C2/uk unknown
- 1998-10-29 CZ CZ0235199A patent/CZ300208B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-10-29 JP JP52534299A patent/JP2001503280A/ja active Pending
- 1998-10-29 EP EP98959811A patent/EP0950109A1/en not_active Withdrawn
- 1998-10-29 RU RU99116249/13A patent/RU2224024C2/ru active
- 1998-10-29 HU HU0001729A patent/HUP0001729A3/hu unknown
- 1998-10-29 GB GB9915068A patent/GB2337263A/en not_active Withdrawn
- 1998-10-29 CA CA002279258A patent/CA2279258A1/en not_active Abandoned
- 1998-10-29 PL PL334135A patent/PL197872B1/pl unknown
- 1998-10-29 WO PCT/EP1998/006859 patent/WO1999023232A1/en not_active Application Discontinuation
- 1998-10-29 CN CNB988016362A patent/CN1148453C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-29 DE DE19881833T patent/DE19881833B4/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-29 TR TR1999/01515T patent/TR199901515T1/xx unknown
- 1998-10-29 SK SK885-99A patent/SK88599A3/sk unknown
- 1998-10-29 US US09/182,117 patent/US6204436B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-29 AU AU15580/99A patent/AU1558099A/en not_active Abandoned
-
1999
- 1999-05-28 FI FI991221A patent/FI991221A0/fi not_active Application Discontinuation
- 1999-06-10 SE SE9902189A patent/SE520353C2/sv not_active IP Right Cessation
- 1999-06-28 DK DK199900916A patent/DK199900916A/da not_active Application Discontinuation
- 1999-11-04 US US09/434,039 patent/US6531649B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-07-26 HK HK00104622A patent/HK1025360A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP0001729A3 (en) | 2002-04-29 |
| DE19881833B4 (de) | 2007-05-10 |
| SE520353C2 (sv) | 2003-07-01 |
| TR199901515T1 (xx) | 2000-11-21 |
| FI991221L (fi) | 1999-05-28 |
| PL334135A1 (en) | 2000-02-14 |
| UA85364C2 (uk) | 2009-01-26 |
| WO1999023232A1 (en) | 1999-05-14 |
| CN1148453C (zh) | 2004-05-05 |
| RU2224024C2 (ru) | 2004-02-20 |
| CZ300208B6 (cs) | 2009-03-18 |
| PL197872B1 (pl) | 2008-05-30 |
| SK88599A3 (en) | 2000-03-13 |
| DK199900916A (da) | 1999-06-28 |
| HUP0001729A2 (hu) | 2000-09-28 |
| SE9902189D0 (sv) | 1999-06-10 |
| US6204436B1 (en) | 2001-03-20 |
| GB9915068D0 (en) | 1999-08-25 |
| CN1242803A (zh) | 2000-01-26 |
| WO1999023232B1 (en) | 1999-07-15 |
| DE19881833T1 (de) | 2000-02-10 |
| CA2279258A1 (en) | 1999-05-14 |
| US6531649B1 (en) | 2003-03-11 |
| JP2001503280A (ja) | 2001-03-13 |
| SE9902189L (sv) | 1999-08-19 |
| GB2337263A8 (en) | 2000-02-24 |
| EP0950109A1 (en) | 1999-10-20 |
| FI991221A0 (fi) | 1999-05-28 |
| GB2337263A (en) | 1999-11-17 |
| HK1025360A1 (en) | 2000-11-10 |
| AU1558099A (en) | 1999-05-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ235199A3 (cs) | Transgenní rostlina tolerantní k herbicidu glyfosatu a způsob přípravy takové rostliny | |
| Mannerlöf et al. | Transgenic sugar beet tolerant to glyphosate | |
| EP0731632B1 (en) | Agrobacterium tumefaciens transformation of musa species | |
| US7935869B2 (en) | Chimeric gene with several herbicide tolerance genes, plant cell and plant resistant to several herbicides | |
| KR100388121B1 (ko) | 식물의형질전환에사용될수있는키메라유전자내의터미네이터부위로서작용할수있는분리된dna서열 | |
| US6268549B1 (en) | DNA sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides | |
| EP0242236B1 (en) | Plant cells resistant to glutamine synthetase inhibitors, made by genetic engineering | |
| ES2262514T3 (es) | Plantas resistentes a herbicidas. | |
| JPH0576369A (ja) | 植物形質転換用キメラ遺伝子 | |
| US6750378B2 (en) | Maize H3C4 promoter combined with the first intron of rice actin, chimeric gene comprising it and transformed plant | |
| WO2004055191A1 (en) | Expression of hydroxyphenylpyruvate dioxygenase in plastids of plants for herbicide tolerance | |
| US20190017067A1 (en) | Glyphosate tolerant plants having modified 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene regulation | |
| Zhang | Transgenic cotton breeding | |
| US20240368619A1 (en) | Methods and compositions for ppo herbicide tolerance | |
| US20240301012A1 (en) | Soybeans with combinations of gene mutations | |
| DE60028751T2 (de) | Herbizidresistente pflanzen | |
| WO2024047605A1 (en) | Methods and compositions for ppo herbicide tolerance | |
| WO2021260632A1 (en) | Plant cell treatments to improve plant transformation | |
| Evans | The use of microorganisms in plant breeding | |
| MXPA99000639A (en) | Chemical gene for various genes of herbicide tolerance, cell vegetable plants tolerantesa various herbici |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20131029 |