HU231357B1 - Eljárás és berendezés minta fluoreszcencia-vizsgálatára - Google Patents
Eljárás és berendezés minta fluoreszcencia-vizsgálatára Download PDFInfo
- Publication number
- HU231357B1 HU231357B1 HUP1600037A HUP1600037A HU231357B1 HU 231357 B1 HU231357 B1 HU 231357B1 HU P1600037 A HUP1600037 A HU P1600037A HU P1600037 A HUP1600037 A HU P1600037A HU 231357 B1 HU231357 B1 HU 231357B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- fluorescence
- fluorescent
- holographic
- recording
- sensor
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 64
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 64
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 34
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 26
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 20
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 claims description 19
- 238000013507 mapping Methods 0.000 claims description 12
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 10
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 10
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 10
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 10
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000011835 investigation Methods 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 3
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 20
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 18
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 14
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 10
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010053210 Phycocyanin Proteins 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 3
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 3
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 3
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241000206572 Rhodophyta Species 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 229930002869 chlorophyll b Natural products 0.000 description 1
- NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M chlorophyll b Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C=O)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M 0.000 description 1
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009647 digital holographic microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 238000001093 holography Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000011206 morphological examination Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1434—Optical arrangements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
- G01N21/6458—Fluorescence microscopy
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/41—Refractivity; Phase-affecting properties, e.g. optical path length
- G01N21/45—Refractivity; Phase-affecting properties, e.g. optical path length using interferometric methods; using Schlieren methods
- G01N21/453—Holographic interferometry
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
-
- G—PHYSICS
- G03—PHOTOGRAPHY; CINEMATOGRAPHY; ANALOGOUS TECHNIQUES USING WAVES OTHER THAN OPTICAL WAVES; ELECTROGRAPHY; HOLOGRAPHY
- G03H—HOLOGRAPHIC PROCESSES OR APPARATUS
- G03H1/00—Holographic processes or apparatus using light, infrared or ultraviolet waves for obtaining holograms or for obtaining an image from them; Details peculiar thereto
- G03H1/04—Processes or apparatus for producing holograms
- G03H1/0443—Digital holography, i.e. recording holograms with digital recording means
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
- G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
- G01N21/4788—Diffraction
-
- G—PHYSICS
- G03—PHOTOGRAPHY; CINEMATOGRAPHY; ANALOGOUS TECHNIQUES USING WAVES OTHER THAN OPTICAL WAVES; ELECTROGRAPHY; HOLOGRAPHY
- G03H—HOLOGRAPHIC PROCESSES OR APPARATUS
- G03H1/00—Holographic processes or apparatus using light, infrared or ultraviolet waves for obtaining holograms or for obtaining an image from them; Details peculiar thereto
- G03H1/04—Processes or apparatus for producing holograms
- G03H1/0443—Digital holography, i.e. recording holograms with digital recording means
- G03H2001/0447—In-line recording arrangement
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Computing Systems (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Description
Eljárás és berendezés minta fluoreszcencia-vizsgálatára
A találmány minta fluoreszcencia-vizsgálatára szolgáló eljárásra és berendezésre vonatkozik. A találmány szerinti vizsgált minta előnyösen áttetsző és folyékony, és a találmány a mintában fluoreszcens objektumok azonosítására szolgál.
Hagyományos áramlási-citométerek (flow-citométerek) képesek nagy sebességgel számolni fluoreszcens tulajdonsággal rendelkező (autofluoreszcens (pl. klorofill), illetve fluoreszcensen festett, jelölt) objektumokat egy áramló folyadékmintában. Viszont jellemzően nem képesek megfelelő felbontású képet alkotni az áthaladó mért objektumokról.
Az áramló testek számlálásán túl alakjuknak, térbeli formájuknak a meghatározása is lényeges lehet, ennek érdekében a fluoreszcens tulajdonságokkal rendelkező objektumokat tartalmazó folyadékmintákat holografikus vizsgálatnak is alávetik.
Több olyan megoldás ismert, amelyben egyetlen érzékelővel készítenek a folyadékmintáról holografikus és fluoreszcencia- (fluoreszcens tulajdonságokat megjelenítő) felvételeket időben egymás után. Ilyen megoldást ismertetnek az US 2004/0156098 A1, US 7,362,449 B2 és US 2012/0148140 A1 dokumentumokban. Ezen megoldások nagy hátránya, hogy a két felvétel között a vizsgált objektumok (akár az álló folyadékban tapasztalható természetes mozgásuk következtében is) elmozdulhatnak. A mozgásra való érzékenység miatt ezen megoldások nem alkalmasak áramló közegek vizsgálatára. Az ilyen megoldások további nagy hátránya, hogy mivel a holografikus és a fluoreszcencia-felvétel ugyanazon érzékelővel készül, ez az érzékelő sem fluoreszcencia-, sem a holografikus felvételnek megfelelően nem választható meg, azaz egyik típusú felvételre sem lehet az érzékelő paramétereit optimálisan megválasztani.
- 2 Fluoreszcencia-felvétel és holografikus felvételkészítést is alkalmaznak az US 2015/0056607 A1 dokumentumban, de ezekkel különböző térrészben elhelyezkedő mintát vizsgálnak, azaz a két mérés csak statisztikailag kombinálható.
Az US 2014/0376816 A1 dokumentumban áramló folyadékban lévő objektumok analizálására és válogatására alkalmas eszközt ismertetnek. A dokumentumban ismertetnek egy olyan megoldást, amelyben egy adott térrészről holografikus és fluoreszcens leképezést is rögzítenek leképző optika alkalmazása nélkül egyetlen érzékelő szomszédos területeire. Annak érdekében, hogy az érzékelő különböző területeire vetítődjön a holografikus érzékelőrészhez tartozó kép és a fluoreszcencia-érzékelőrészhez tartozó kép, az érzékelőt viszonylagosan messze kell tenni a vizsgálandó mintát tartalmazó cellától. Leképző optikai hiányában emiatt azonban rendkívül gyenge fluoreszcens jelet lehet rögzíteni és a holografikus képnek is nagyon gyenge lesz a felbontása. Ráadásul, az érzékelő kiválasztását és működési paramétereit nem lehet specifikusan a fluoreszcens vagy a holografikus mérésre optimalizálni, mert mindkét funkciót egyszerre kell kiszolgálnia.
Az US 2014/0376816 A1 dokumentumban egy olyan kiviteli alakot is ismertetnek, amelyben egy képalkotó zóna egy áramlási csatorna mentén két részre van osztva. Ezen két rész egyike holografikus felvétel, a másik fluoreszcencia-felvétel készítésére alkalmas. Ezek a felvételek tehát egy áramlási csatorna mentén készülnek. Az US 2014/0376816 A1 dokumentum mindkét fentebb ismertetett kiviteli alakjában egyazon érzékelő két különböző területén készül a holografikus és a fluoreszcencia-felvétel.
Bizonyos ismert megoldásokban egyetlen kamerával rögzítik mind a fluoreszcens, mind a holografikus képet, azonban a detektálandó fényerő (ami meghatározza a detektálásukhoz szükséges expozíciós időt és erősítést, érzékenységet) egészen eltérő, így a rögzítéshez szükséges felbontásnak is különböznie kellene optimális esetben, de ez a közös kamera miatt nem lehetséges. Ezen ismert megoldásokban ráadásul több különböző féle fluoreszcens jel egyszerre történő mérése is igen nehéz (vagy megoldhatatlan).
- 3 A közös érzékelő miatt semmiképpen nem lehet szinkron mérni, ami miatt viszont átfolyós minta esetén a fluoreszcens és a holografikus kép regisztrációja szinte lehetetlen (extrémen lassú átfolyás esetén lehetséges csak nagy hibával).
Az ismert megoldások fényében felmerült az igény olyan eljárás és berendezés iránt, amelyekkel egy mintában található fluoreszcens objektumok nagy részletességgel rekonstruálhatók, és a nem-fluoreszcens objektumoktól elválaszthatók.
A találmány elsődleges célja olyan eljárás és berendezés megalkotása, amelyek a lehető legnagyobb mértékben mentesek a technika állása szerinti megoldások hátrányaitól.
A találmány további célja olyan eljárás és berendezés megalkotása, amelyekkel biztosítható fluoreszcens objektumok holografikus képének jó felbontással történő előállítása és a fluoreszcens objektumok elkülönítése a nem-fluoreszcens objektumoktól.
A találmány további célja olyan eljárás és berendezés megalkotása, amelyekben a fenti cél elérése mellett a holografikus rekonstrukció erőforrás igénye lényegesen csökkenthető ismert megoldásokhoz viszonyítva.
A találmány célja olyan eljárás és berendezés megalkotása, amelyekben az alkalmazott fluoreszcencia-érzékelő és holografikus érzékelő paraméterei az ilyen eszközökkel szemben támasztott igényeknek megfelelően, egymástól függetlenül választhatók meg.
A találmány vonatkozásában kitűzött célokat az 1. igénypont szerinti eljárással és a 8. igénypont szerinti berendezéssel értük el. A találmány előnyös kiviteli alakjai az aligénypontokban vannak meghatározva.
A továbbiakban a találmány példaképpeni előnyös kiviteli alakjait rajzokkal ismertetjük, ahol az
1. ábra a találmány szerinti berendezés egy kiviteli alakját szemléltető blokkvázlat, a
- 4 2A-2C ábrák a találmány szerinti eljárás egy kiviteli alakjában a felvételkészítési rendet szemléltető vázlatos grafikonokat szemléltetnek, a
3A ábra egy példaképpeni fluoreszcencia-felvétel, a
3B ábra a 3A ábrához tartozó holografikus felvétel, a
3C ábra a 3B ábrán bekeretezett rész rekonstrukciója, és a
4. ábra egy további példaképpeni fluoreszcencia-felvétel.
A találmány szerinti eljárás minta fluoreszcencia-vizsgálatára szolgál. Amint az alább be fogjuk mutatni, a találmány szerinti eljárás különösen előnyösen alkalmazható folyékony, áttetsző mintára. Egy ilyen mintában jellemzően a víz, mint folyékony áttetsző közeg szállít olyan fluoreszcens objektumokat, amelyek megfelelő fluoreszcens gerjesztés hatására fluoreszcens fény emittálnak, azaz fluoreszcens választ adnak. A fluoreszcens válasz hullámhossza eltér a gerjesztő fény hullámhosszától, és jellemzően a válasz hosszabb hullámhosszú, mint a gerjesztés.
A találmány szerinti eljárással vizsgált mintát célszerűen átfolyósan, a mintatartón megfelelő (megfelelően lassú) sebességgel átvezetjük.
A találmány szerinti eljárás mindemellett természetesen alkalmas álló minta vizsgálatára is. A találmány szerinti eljárás továbbá alkalmas olyan szilárd minta vizsgálatára, amelyben kellőképpen vékony ahhoz, hogy a benne lévő fluoreszcens objektumokat gerjesszük és emittált fényüket érzékelni tudjuk. Az ilyen vékony mintákról a találmány szerinti eljárás megvalósításához szükséges holografikus felvétel jellemzően készíthető. Megfelelően rövid expozíciós időkkel a találmány szerinti eljárás és berendezés gáz halmazállapotú minták vizsgálatára is alkalmas.
A találmány szerinti eljárás példaképpen előnyösen a találmány szerinti berendezéssel hajtható végre, amelynek egy kiviteli alakját az 1. ábrán szemléltetjük.
A találmány szerinti eljárás során a minta egy adott vizsgált mintatérfogatát (azaz egy éppen vizsgálat alatt lévő mintatérfogatot) fluoreszcens gerjesztő fénnyel bevilágítjuk és az adott vizsgált mintatérfogatnak a fluoreszcens gerjesztő fény
- 5 hatására kibocsátott fluoreszcens emittált fényét leképezve fluoreszcenciafelvételt készítünk. A fluoreszcens emittált fény leképezése történhet közvetlenül (leképző elem közbeiktatása nélkül) az érzékelő síkjára, vagy - amint lentebb látni fogjuk - előnyösen leképzőlencse közbeiktatásával. Az 1. ábrán szemléltetett kiviteli alakban az adott vizsgált mintatérfogat a mintának az a része, amely a gerjesztés során éppen 10 mintatartó-térrészben tartózkodik.
Fluoreszcencia-felvételen olyan felvételt értünk, amely fluoreszcens objektumok által kibocsátott emittált fluoreszcens fény érzékelőre való leképezésével készül, azaz fluoreszcens forrásból származó fény leképzésének megjelenítésére szolgál. A holografikus felvételen pedig olyan felvételt értünk, amelyen holografikus információt rögzítünk; a holografikus felvétel holografikusan rekonstruálható információt tartalmaz.
A találmány szerinti eljárásban a fluoreszcencia-felvétel készítésével időben átfedő módon az adott vizsgált mintatérfogatról holografikus felvételt készítünk. A találmány szerinti eljárásban tehát a fentiek szerint meghatározott ugyanazon adott vizsgált mintatérfogatról készítünk időben átfedő módon fluoreszcenciafelvételt és holografikus felvételt.
A fluoreszcencia-felvétel alatt tehát azt értjük, hogy a gerjesztés hatására kibocsátott fluoreszcens emittált fényről (azaz a fluoreszcens válaszról) készítünk felvételt, azaz a felvételen a fluoreszcens választ rögzítjük; a fluoreszcenciafelvételen a lehető legnagyobb mértékben kizárólag azon objektumokról látható információ, amelyek fluoreszkálnak (fluoreszcens választ adnak a megfelelő fluoreszcens gerjesztésre).
A holografikus felvétel pedig az adott vizsgált mintatérfogat hologramját tartalmazza, amelyet egy megfelelő holografikus elrendezéssel készítünk az adott vizsgált mintatérfogatról. Egy ilyen elrendezés lehet például az 1. ábra szerinti kiviteli alakban szemléltetett in-line holografikus elrendezés, de értelemszerűen alkalmazhatók más holografikus elrendezések is. A holografikus felvétel előnyösen egy digitális holografikus felvétel, az alkalmazott érzékelő pedig egy digitális holografikus érzékelő. Digitális holografikus elrendezés
- 6 alkalmazása esetén a találmányban alkalmazni tudjuk a digitális holográfiával járó előnyöket.
A fluoreszcencia-felvételt és a holografikus felvételt egyaránt az adott vizsgált mintatérfogatról készítjük, és ebbe a mintatérfogatba érkezik a gerjesztő fény is.
A gerjesztő fény természetéből fakadóan nem feltétlenül világítja meg a teljes adott vizsgált mintatérfogatot egyenletesen, azonban a gerjesztő fényt előnyösen úgy alkalmazzuk, hogy inkább egy kicsit nagyobb térfogatot világítson meg, mint az adott vizsgált mintatérfogat. Ez utóbbi esetben az adott vizsgált mintatérfogatban lévő fluoreszcens objektumok mindegyike előnyösen gerjeszthető.
A fluoreszcencia-felvétel tehát az adott vizsgált mintatérfogatról készül. Az adott vizsgált mintatérfogatról való felvételkészítésen azt értjük, hogy az adott vizsgált mintatérfogat, azaz annak az érzékelőn egy kétdimenziós vetülete a lehető legnagyobb mértékben meg fog jelenni a fluoreszcencia-felvételen (rákerül a fluoreszcencia-felvételre), és ezenkívül megjelenhet az adott vizsgált mintatérfogaton kívül eső részekről is információ. A holografikus felvétel készítését is így kell érteni (mivel a holografikus nyaláb is jellemzően túllóg oldalirányban az adott vizsgált mintatérfogaton). Az ily módon készített felvételeken meg lehet keresni a közös részt, amely lényegében az adott vizsgált mintatérfogat leképezése lesz.
A találmány szerinti eljárás során továbbá a fluoreszcencia-felvételen fluoreszcens objektum-azonosítási lépést hajtunk végre, és amennyiben a fluoreszcens objektum-azonosítási lépésben az adott vizsgált mintatérfogatban legalább egy fluoreszcens objektumot azonosítunk, akkor a legalább egy fluoreszcens objektumhoz a fluoreszcencia-felvételen rendre legalább egy objektum pozíciót rendelünk, valamint a holografikus felvételt rekonstruálva rekonstruált holografikus felvételt állítunk elő és a rekonstruált holografikus felvételen a legalább egy objektum pozíció alapján a legalább egy fluoreszcens objektum rekonstruált modelljét (rekonstruált képét, háromdimenziós modelljét) azonosítjuk. A rekonstruált kép azonosításán azt értjük, hogy meghatározzuk, hogy a teljes holografikus felvétel rekonstrukciójából mely elkülöníthető
- 7 rekonstruált modell tartozik a fluoreszcens objektumhoz. A fluoreszcens objektum-azonosítási lépést lentebb részletesen taglaljuk, ebben a lépésben megvizsgáljuk a fluoreszcencia-felvételt és megállapítjuk, hogy a rögzített információk alapján van-e azon felvétel-részlet (akár csak egy képpont), amely egy fluoreszcens objektumhoz tartozik, azaz a fluoreszcens objektum által emittált fény képződött le a fluoreszcencia-felvétel azon részére.
Az eljárás ezen további lépéseit tehát csak akkor hajtjuk végre, ha a fluoreszcens objektum-azonosítási lépésben legalább egy fluoreszcens objektumot beazonosítunk a fluoreszcencia-felvétel alapján. Amennyiben az aktuálisan jelen lévő adott vizsgált mintatérfogatban található fluoreszcens objektum, akkor a fluoreszcencia-felvételen emittált fényének leképezése, azaz képe (továbbiakban: objektum-képe) jelenik meg. Ezen objektum-kép segítségével lehet a fluoreszcens objektumokat a fluoreszcencia-felvételen beazonosítani. Azt kell tehát a fluoreszcens objektum-azonosítási lépésben megvizsgálni, hogy található-e fluoreszcens objektum objektum-képe a fluoreszcencia-felvételen és ha van ilyen objektum-kép egyáltalán, akkor minden ilyen objektum-képet beazonosítani. A beazonosítással az objektum-kép helye alapján minden egyes fluoreszcens objektumhoz objektum pozíciót rendelünk. Amennyiben az éppen vizsgált mintatérfogat nem tartalmaz olyan fluoreszcens objektumot, amelyről (értékelhető) objektum-kép lenne leképezve a fluoreszcencia-érzékelőn, akkor az eljárás jelen lépéseit nem végezzük el (átfolyós minta esetén ilyenkor továbbmegyünk egy további mintatérfogat vizsgálatára).
Az objektum pozíció kisméretű, pontszerű objektum-képekre értelemszerűen meghatározható, ha egy objektum-kép nagyobb kiterjedésű, akkor ahhoz valamilyen módon - például az objektum-kép mértani középpontját kijelölve - kell objektum pozíciót rendelni.
Amennyiben tehát beazonosítottunk (találtunk) legalább egy fluoreszcens objektumot az adott vizsgált mintatérfogatban, rekonstruáljuk a szintén az ahhoz a mintatérfogathoz tartozó holografikus felvételt. Ez a rekonstruált holografikus felvétel tartalmazni fogja a beazonosított fluoreszcens objektum rekonstruált képét, azaz háromdimenziós modelljét. A rekonstruált holografikus felvétel
- 8 azonban jellemzően olyan további objektumok rekonstruált képét (3D modelljét) is fogja tartalmazni, amelyek nem lettek fluoreszcens objektumként beazonosítva (a hologram-rekonstrukciót nem tudjuk erre nézve szelektíven végrehajtani). A jellemzően nagyszámú rekonstruált objektum közül a legalább egy fluoreszcens objektumot a találmány szerinti eljárással nagyon előnyösen könnyedén meg tudjuk találni. Mivel a fluoreszcencia-felvételt és a holografikus felvételt a fentiek szerint egyaránt az adott vizsgált mintatérfogatról készítettük, meghatározható, hogy a holografikus felvételen mely pozíció tartozik a fluoreszcencia-felvétel alapján beazonosított objektum pozícióhoz. A holografikus felvételen meghatározott pozíció alapján pedig megadható, hogy mely rekonstruált kép (3D modell) tartozik a fluoreszcens objektumhoz. Természetesen több fluoreszcens objektum jelenléte esetén a több objektum pozíció alapján több 3D modellt választunk ki ily módon.
A találmány szerinti berendezés tehát működése során az előnyösen átfolyó mintában keresi a fluoreszcensen emittáló objektumokat. Amikor detektál egy ilyet a fluoreszcencia-felvételen, akkor az ezzel párhuzamosan rögzített holografikus kép alapján rekonstruálja az adott fluoreszcens objektum képét. Ehhez kihasználja, hogy a két felvétel lényegében ugyanarról a mintatérfogatról készül és időben átfedően, így a fluoreszcencia-felvételen beazonosított pozíció megkereshető a holografikus felvételen. A megkereséshez a fentiek szerint a két felvétel előnyösen térben és időben egymáshoz regisztrálva van, amin azt értjük, hogy a két felvételen azonosítva van az a tartomány (ablak), amely mindkét felvételen megjelenik, és ezek között meghatározzuk a hozzárendelést, azaz, hogy az egyiken meghatározott pozícióhoz a másikon milyen pozíció tartozik.
Összefoglalva, a fluoreszcens (fluoreszkáló) objektum fluoreszcencia-felvétel alapján meghatározott pozíciója megmutatja, hol található az objektum a cellában (x, y koordinátákat szolgáltat), míg fluoreszcens objektum pontos mélységét (z) a holografikus rekonstrukció határozza meg (az adott objektum holografikus felvételen való megtalálásához azonban elegendő az x, y koordináták ismerete).
- 9 A fentiek szerint a találmány kiterjed egy olyan, minta fluoreszcencia-vizsgálatára alkalmas berendezésre is, amelyen a találmány szerinti eljárás példaképpen végrehajtható. A találmány szerinti berendezés egy kiviteli alakját az 1. ábrán szemléltetjük.
Az ábra szerinti berendezés tartalmaz - a vizsgálat alá vetett - minta egy adott vizsgált mintatérfogatának befogadására alkalmas 10 mintatartó-térrészt, a 10 mintatartó-térrész fluoreszcens gerjesztő fénnyel való bevilágítására alkalmas egy vagy több, a jelen kiviteli alakban kettő 12a, 12b gerjesztő fényforrást, a 10 mintatartó-térrészben vizsgálat során tartózkodó adott vizsgált mintatérfogatnak a fluoreszcens gerjesztő fény hatására kibocsátott fluoreszcens emittált fényét leképezve fluoreszcencia-felvétel készítésére alkalmas 14 fluoreszcenciaérzékelőt, és az adott vizsgált mintatérfogatról holografikus felvétel készítésére alkalmas, holografikus 16 fényforrást és holografikus 18 érzékelőt tartalmazó holografikus elrendezést. A 10 mintatartó térrész fala jellemzően átlátszó, azaz a gerjesztő fény, az emittált fény és a holografikus fényforrás fénye át tudnak azon hatolni (előnyösen fénytörés, intenzitáscsökkenés nélkül).
Fluoreszcencia-érzékelőn olyan érzékelőt értünk, amely fluoreszcens objektumok által kibocsátott emittált fluoreszcens fény rögzítésére szolgál, azaz amelyre fluoreszcens forrásból származó fényt képzünk le. A holografikus érzékelőn pedig olyan érzékelőt értünk, amely holografikus információ rögzítésére szolgál. Mindkét érzékelő (képalkotó eszköz) fényérzékelő (jellemzően eltérő felbontással, érzékenységgel), csak a funkciójuk tér el, azaz, hogy milyen fény (az emittált fluoreszcens fény vagy a holografikus fényforrás fénye) rögzítésére alkalmazzuk ezen érzékelőket. Nevükben a fluoreszcencia és a holografikus jelző tehát nem valamely eleve meglévő tulajdonságuk megjelenítésére, csupán az érzékelők egymástól való megkülönböztetésére szolgál; így ez a jelző akár el is hagyható. Ugyanez teljesül a fluoreszcencia- és holografikus felvételekre is, amely elnevezésekben a jelzők azt jelenítik meg, hogy milyen jellegű fény leképezését kívánjuk az adott felvételen rögzíteni; így a jelzők ezen nevekben is a megkülönböztetést szolgálják, akár el is hagyhatók abból. A fentiek alkalmazandók az alább ismertetésre kerülő 22 fluoreszcencialeképzőlencsére is.
- 10 A találmány szerinti berendezés jelen kiviteli alakjában a 14 fluoreszcenciaérzékelő és a 18 holografikus érzékelő a 10 mintatartó-térrészhez viszonyítva egymással átellenesen, a 10 mintatartó-térrésszel együtt közös optikai tengelyen vannak elrendezve. Ilyen elrendezés esetén a mintatartó-térrészről nagyon előnyösen készíthető a fluoreszcencia- és a holografikus felvétel, mivel ilyenkor mindkét érzékelő ugyanúgy lát rá a 10 mintatartó-térrészre csak ellenkező irányból. A találmány szerinti berendezés az ábra szerinti kiviteli alakban tartalmaz a holografikus 16 fényforrásból származó tárgyhullámot a közös optikai tengelyre leképző és a 10 mintatartó-térrész felé irányító, a holografikus 16 fényforrás fényét visszaverő és a fluoreszcens emittált fényt átengedő 20 becsatolóelemet.
Az 1. ábrán is szemléltetett módon tehát a 14 fluoreszcencia-érzékelő és a 18 holografikus érzékelő is a 10 mintatartó-térrész felé néz, azaz ezen érzékelők segítségével a berendezés az egyik irányból a fluoreszcens tulajdonságait rögzíti a 10 mintatartó-térrészben lévő (azaz például egy mérőcellán átfolyó) mintatérfogatnak, míg a másik irányból egy - előnyösen digitális - holografikus mérést hajt végre.
Mivel a találmány szerinti eljárás és berendezés alkalmazásaiban (például vízminőség ellenőrzés) a cél általában egy nagy térfogat átvizsgálása, előnyösen viszonylag nagy vastagságú (akár 0,8 mm vastag is lehet, a holografikus érzékelőn 1 μm-es felbontás elérése esetén is) átfolyós mérő cellát alkalmazunk (amelynek magában foglalja a vizsgálat alá vetett mintatartó-térrész). Ennek megfelelően a vizsgálatra szolgáló mintatartó-térrész is elérheti akár a 0,8 mm vastagságot, ami a közös optikai tengely menti kiterjedésének felel meg.
Ahhoz, hogy egy ilyen cellán belül, nagy mélységben megfelelő módon lehessen mérni egy digitális kamerával az emittált fluoreszcens fényt, előnyösen leképezést alkalmazunk, amely példaképpen kismértékű optikai nagyítás vagy kicsinyítés. Egy ilyen kiviteli alakot szemléltet az 1. ábra. Ezen kiviteli alakban a berendezés tartalmaz a közös optikai tengelyen a 14 fluoreszcencia-érzékelő és a 20 becsatolóelem között elrendezett 22 fluoreszcencia-leképzőlencsét.
- 11 A 22 fluoreszcencia-leképzőlencse kicsinyítési/nagyítási mértéke előnyösen 0,51,5 közötti, még előnyösebben 0,9 és 1,1 közötti, különösen hozzávetőlegesen 1. Jellemzően olyan 22 fluoreszcencia-leképzőlencsét alkalmazunk, amelynek kicsinyítési/nagyítási mértéke 1 körüli, azaz se nem nagyít, se nem kicsinyít. Amennyiben az 1 körüli nagyítási/kicsinyítési mértékű lencséhez tartozó mélységélesség (jóval) kisebb lenne a 10 mintatartó-térrész közös optikai tengely irányú kiterjedésénél, akkor kisebb kicsinyítési/nagyítási mértékkel rendelkező leképzőlencse alkalmazásával a mélységélesség növelhető, és akár elérhető az is, hogy a mélységélesség közel megegyezzen a mintatartó-térrész z-irányú kiterjedésével. Amennyiben az 1 körüli nagyítási/kicsinyítési mértékű lencsével a mélységélesség nagyobb lenne a z-irányú kiterjedésnél, akkor a nagyítási/kicsinyítési mérték 1 fölé emelhető, azaz nagyítólencse rendezhető el fluoreszcencia-leképzőlencseként. A nagyítási/kicsinyítési mérték növelésére azonban nincsen szükség, mivel ebben az esetben az 1 körüli nagyítási/kicsinyítési mértékhez tartozó mélységélesség is megfelelő.
A fentebb kifejtetteket értjük azon, hogy az eljárás és berendezés egy kiviteli alakjában kicsinyítési/nagyítási mértéke beállításával a fluoreszcencialeképzőlencse mélységélessége a mintatartó-térrésznek a közös optikai tengely irányú (továbbiakban: z-irány) kiterjedéséhez van megválasztva, amelynek köszönhetően előnyösen választható olyan mélységélesség, amellyel a mintatartó-térrész mélységében lényegében teljesen leképezhető a fluoreszcencia-érzékelőre. Amennyiben tehát a leképezés mélységélessége a mintatartót a mélységi irányában lényegében átfogja, a vizsgálandó objektumok detektálhatóak maradnak (nem tűnnek el fókuszálatlanság miatt), bárhol legyenek is a mérőcellán belül.
Az 1. ábrán látható 22 fluoreszcencia-leképzőlencse alkalmazásának és megfelelő paramétereinek (kicsinyítés/nagyítás, mélységélesség) köszönhetően a mintatartó mélységében leképezhető a fluoreszcencia-érzékelőre (a mintatartó teljes mélységéből emittált fénynyalábok leképződnek az érzékelőre). A 22 fluoreszcencia-leképzőlencse elrendezésének további előnye, hogy alkalmazásával leküzdhető az emittált fluoreszcens fény intenzitásának távolsággal történő (négyzetes) gyengülése, mivel a még kellően erős intenzitású
- 12 fluoreszcens fényt leképzi a fluoreszcencia-érzékelőre a 22 fluoreszcencialeképzőlencse. Az olyan ismert fluoreszcens minta vizsgáló berendezésekben, amelyekben a fluoreszcencia-felvételt és a holografikus felvételt ugyanarra az érzékelőre rögzítik, általában nem rendezhető el olyan fluoreszcencialeképzőlencse, amely a mélységélességet a kívánalmaknak megfelelően befolyásolja, annál is inkább, mert az ilyen rendszerekben a holografikus felvételhez célszerűen alkalmazott nagy nagyítású lencsét célszerű alkalmazni.
A kis nagyítással kapott fluoreszcencia-felvétel ugyan nem alkalmas a fluoreszcens objektumok felismerésére (a felvételen az objektumok elmosódottak lesznek a kis nagyítás, kis felbontás (és esetleg fókuszon kívüliség) miatt, az alkalmazott nagyítás alakmeghatározásra az előforduló fluoreszcens objektumok mérete miatt nem elegendő), a detektálásukra, beazonosításukra azonban igen, és arra viszont előnyösen a mintatartó nagy mélységében. Lényegében az alakfelismeréshez csak olyan felvétel lenne esetleg alkalmas, amely nagy nagyítással készül. Ekkor a mélységélesség nagyon kicsi lenne. Ugyanakkor számításba veendő az is, hogy a fluoreszcens objektumok emittált fénye akkor detektálható nagy biztonsággal, ha kellően hosszú expozíciós idővel készítjük a fluoreszcencia-felvételt (máskülönben a fluoreszcens objektumok objektum-képe jellemzően halvány lesz). A viszonylagosan hosszú expozíciós idő viszont azt okozza, hogy az expozíciós idő alatt a fluoreszcens objektumok elmozdulhatnak, ami szintén rontaná annak esélyét, hogy fel lehessen azokat ismerni egy fluoreszcencia-felvételről. Ezért is alkalmazzák a fluoreszcens áramlási-citométereket lényegében kizárólag a fluoreszcens objektumok számlálására.
Alább látni fogjuk, hogy a fluoreszcens képrögzítés fentebb taglalt sajátosságai nem jelentkeznek hátrányként a találmány szerinti eljárásban és berendezésben, hiszen a találmány szerint a fluoreszcencia-felvételt csak a fluoreszcens objektumok beazonosításához alkalmazzuk (nem a felismerésükre), amihez lényegében elegendő, ha a fluoreszcens objektumok leképzése, objektum-képe megjelenik a fluoreszcencia-felvételen. Alább látni fogjuk, hogy a találmány szerint a fluoreszcencia-felvételek készítéséhez szükséges viszonylagosan hosszú expozíciós idő sem okoz gondot.
- 13 Az objektum-felismerés, morfológiai osztályozás, a minta fluoreszcens tartalmának kiértékelése érdekében a találmány szerinti berendezés egy alkalmasan kialakított holografikus elrendezést is tartalmaz. Amennyiben nagyító-lencsét is elrendezünk, lényegében holografikus mikroszkópról beszélhetünk. A holografikus felvételből rekonstruált kép (a vizsgált objektumok térbeli modellje) alapján a fluoreszcenciával rendelkező objektumok már morfológiai szempontok alapján osztályozhatóak, mivel a fluoreszcenciafelvételen történő pozíció meghatározás (az objektum pozíció meghatározása) segítségével a rekonstruált holografikus képen az ilyen objektumok beazonosíthatók elhelyezkedésük alapján.
Az ismert áramlási-citométerekkel ellentétben a találmány szerinti eljárásban és berendezésben az sem jelent gondot, ha egyszerre akár több fluoreszcens objektum is jelen van a vizsgált mintatérfogatban (a mérés során a mérőcellában/mintatartóban tartózkodó mintamennyiség). A mintában jelen lévő objektumok fluoreszcenciáját a fentieknek megfelelően lehetséges egy megfelelő érzékenységű (ld. alább) kamerával vizsgálni (az olyan ismert megoldásokban, ahol fluoreszcencia-felvételt és a holografikus felvételt ugyanazzal az érzékelővel rögzítjük, nincs lehetőség arra, hogy az érzékelő érzékenységét az alkalmazáshoz azaz a fluoreszcencia- vagy holografikus felvétel készítéséhez válasszuk meg).
A fluoreszcencia-felvétel rögzítésére szolgáló kamera felvétele alapján meg lehet tehát határozni minta adott vizsgált térfogatában a fluoreszcens objektumok pozícióját (pontosabban 3D-s pozíciójuk 2D-s vetületét). Mivel a fluoreszcenciafelvétel és a holografikus felvétel ugyanarról az állapotról - azaz egy adott vizsgált mintatérfogatról - készül, a két felvétel tartalma egymáshoz rendelhető, megkereshető (regisztrálható) a két felvételen az egyazon objektumhoz tartozó információ. A fluoreszcencia-felvétel expozíciós ideje jellemzően jóval hosszabb, mint a holografikus felvételé, ezen expozíciós idő alatt készítjük el a holografikus felvételt jóval rövidebb expozíciós idővel; a két felvétel tehát időben átfedő módon készül. Ezt segíti elő a fluoreszcens objektum pozíciójának meghatározása a fluoreszcencia-felvételen, mert ezáltal - a két felvétel megfelelő egymáshoz
- 14 regisztráltsága esetén - a pozíció segítségével az adott objektum a holografikus felvételen is beazonosítható lesz.
A fluoreszcencia-felvétel készítésére szolgáló érzékelő előnyösen nagy érzékenységű (hogy a viszonylagosan gyenge fluoreszcens jelet a lehető legjobban érzékelni tudjuk), de viszonylag kis felbontású. A holografikus felvételt pedig előnyösen nagy felbontású érzékelővel készítjük, amelynek érzékenysége a fluoreszcencia-érzékelőhöz képest kicsi (a holografikus érzékelő esetén nincs szükség nagy érzékenységű érzékelőre, mivel a felvétel létrehozásához alkalmazott holografikus fényforrás (pl. lézer vagy LED) fényének intenzitása nem alacsony). Egy példaképpeni megvalósításban, 5,3 Volt/Lux-sec volt a fluoreszcenciát mérő (színes) kamera érzékenysége, míg a holografikus elrendezésben alkalmazott digitális holografikus kameráé pedig 0,724 Volt/Luxsec.
A találmány szerinti berendezés és eljárás egy kiviteli alakjában 4-7 Volt/Lux-sec érzékenységű fluoreszcencia-érzékelőt alkalmazunk, és/vagy 0,5-2 Volt/Lux-sec érzékenységű holografikus érzékelőt alkalmazunk. Ebben a kiviteli alakban megválaszthatjuk előnyösen a fluoreszcencia- vagy a holografikus érzékelőt is úgy, hogy az adott alkalmazáshoz megfelelő érzékenységűek legyenek, különösen előnyösen mindkét (fluoreszcencia- és holografikus) érzékelő érzékenységét a fenti tartományokból választjuk, így a berendezés mindkét érzékelője esetén az alkalmazáshoz leginkább illő érzékelőt alkalmazhatjuk.
A találmány egy kiviteli alakjában a fluoreszcencia-felvétel elkészítéséhez 40-200 ms expozíciós időt (Tf), és/vagy a holografikus felvétel elkészítéséhez pedig 0,55 ms expozíciós időt (Th) alkalmazunk.
Amennyiben a Tf expozíciós időt a megadott tartományból választjuk, a fluoreszcencia-felvétel jó eséllyel fogja tartalmazni a gyengén emittáló fluoreszcens objektumokból származó fénysugár leképződését. A tartományon belül természetesen az is megszabja a választást, hogy a gerjesztő fénynek milyen az erőssége, illetve, hogy a fluoreszcencia-érzékelőig eljutva az emittált fluoreszcens fény milyen mértékben gyengül. Amennyiben a Th expozíciós időt a fenti tartományból választjuk, akkor holografikus felvételt jó eséllyel
- 15 megfelelően élesre tudjuk készíteni elkerülve a fluoreszcens objektumok elmozdulását. Amennyiben mindkét expozíciós időt rendre a fenti tartományokból választjuk, akkor mindkét előny jelentkezik, azaz mindkét érzékelő alkalmazásának megfelelően hangolható.
A fluoreszcencia-felvételhez alkalmazott hosszabb expozíciós idő mellett célszerű kisebb felbontású érzékelőt alkalmazni a fluoreszcens információ rögzítésére, ugyanis nincs szükségünk nagy felbontású eredményre, viszont a kis felbontás miatt egy ilyen felvétel nagyon gyorsan kiolvasható az érzékelőről. A kis felbontású érzékelők emellett jellemzően nagy érzékenységgel rendelkeznek a viszonylagosan nagy pixelméretek miatt, így egy kis felbontású érzékelővel a fluoreszcencia-érzékelővel szemben támasztott minden igény kielégíthető. Ehhez előnyösen 0,5-3 megapixel/25 mm2 felbontású fluoreszcencia-érzékelőt alkalmazunk. Még előnyösebben alkalmazható 1-2 megapixel/25 mm2, különösen előnyösen hozzávetőlegesen 1,3 megapixel/25 mm2 felbontású érzékelő.
Erre az érzékelőre képezzük le a fluoreszcens objektumok által emittált fényt. Amint fentebb kifejtettük, a leképezésnél előnyösen alkalmazunk leképzőlencsét, amely lehet kicsinyítő/nagyító. Jellemzően a kicsinyítés/nagyítás mértéke közel 1, azaz lényegében nem történik se nagyítás, se kicsinyítés. Ekkor tehát a leképzőlencse körülbelül akkora képet vetít a fluoreszcencia-érzékelőre, amekkora a vizsgált térrésznek a közös tengelyre merőleges kiterjedése. Ez a leképezés jellemzően nem tölt ki egy 5x5 mm-es érzékelőt, ezért a vizsgálat során annak csak egy részét használjuk, példaképpen 256x256 pixelt vagy 320x320 pixelt.
A holografikus felvételt előnyösen kis expozíciós idővel készítjük, az expozíciós időt a fenti tartományból megválasztva. Mivel azonban nagy felbontású felvételre van szükségünk a megfelelő részletességű rekonstrukcióhoz a holografikus felvétel esetében, holografikus érzékelőként a fluoreszcencia-felvételhez alkalmazott érzékelőnél nagyobb felbontású érzékelőt alkalmazunk, aminek azonban a kiolvasási ideje hosszabb, mint a fluoreszcencia-érzékelőé. A holografikus érzékelő előnyösen 5-20 megapixel/25 mm2 felbontású; még
- 16 előnyösebben 10-15 megapixel/25 mm2 felbontású, különösen előnyösen hozzávetőlegesen 12 megapixel/25 mm2 felbontású. Ilyen felbontású érzékelővel már kellő részletességű felvétel készíthető, hogy azt jó minőségben rekonstruálni lehessen. A viszonylag nagy felbontású érzékelők érzékenysége jellemzően alacsonyabb, de a holografikus fényforrás fényének rögzítéséhez teljes mértékben megfelelő.
A fluoreszcencia-felvétel hosszabb expozíciós ideje és a holografikus felvétel hosszabb kiolvasási ideje összehangolható (azonos nagyságrendbe esnek); a következő felvétel készítéséig - vagyis amikorra a vizsgálandó térfogat kicserélődik - mindkét felvétel letöltését el lehet végezni. Számos esetben a következő felvétel készítéséig még ennél is nagyobb idő telik el.
A találmány szerinti eljárás jelentősen gyorsítja a hagyományos digitális holografikus mikroszkóphoz képest a feldolgozást, hiszen ott az összes objektum rekonstrukciójára és alakjának elemzésére szükség van. Ezzel szemben a találmány szerint az adott fluoreszcencia-felvételhez tartozó holografikus felvételt csak akkor rekonstruáljuk, ha a fluoreszcencia-felvételen be lehetett azonosítani (legalább egy) fluoreszcens objektumot. Abban az esetben, ha a fluoreszcenciafelvételen nem lehetett beazonosítani fluoreszcens objektumot, akkor a hozzá tartozó holografikus felvételt figyelmen kívül hagyjuk, és nem rekonstruáljuk. A minta kiértékelését az is segíti, hogy az objektum-pozíció(k) fluoreszcenciafelvételen történő meghatározásával meghatározható az adott felvételen található fluoreszcens objektum(ok) köre (a legtöbb esetben, megfelelően ritka mintára jellemzően egyetlen ilyen objektum egy felvételen). Az objektum-pozíciók segítségével a rekonstruált holografikus felvételen is egyszerűen elkülöníthető az ilyen objektumokhoz tartozó rekonstruált információ, azaz lényegében a háromdimenziós modelljük.
A találmány szerinti eljárás és berendezés nagy előnye az áramlásicitométerekhez képest, hogy a találmány szerint lehetőség van jó felbontású képet (modellt) alkotni az átfolyó mintában található fluoreszcens (autofluoreszcens vagy festett fluoreszcenciával rendelkező) objektumokról és ezzel segíteni a pontosabb osztályozást.
- 17 A kamerák - azaz a fluoreszcencia-érzékelő és a holografikus érzékelő felvételeinek regisztrálására (azaz egymáshoz rendelésére, az általuk leképzett közös terület meghatározására, illetve esetleges eltérő orientációjuk esetén, tehát ha nem teljes mértékben szembe néznek egymással a találmány szerinti berendezésben) előnyösen teszt objektumokat használunk. A teszt objektumok példaképpen néhány jól fluoreszkáló objektumot tartalmaznak, amelyek a holografikus rendszerrel is jól azonosíthatók. Teszt objektumként példaképpen tesztgyöngyöket alkalmazunk. Megfelelő mennyiségű (például három) ilyen tesztgyöngy együttes detektálásakor, azok azonosíthatók a rekonstruált elrendeződésük alapján. A fluoreszcencia- és a holografikus érzékelőn is kimért objektumpozíciók alapján a két érzékelő képének egymáshoz rendeléséhez szükséges elforgatás, eltolás és nagyítás (megfelelő ROI [region of interest érdekesnek talált terület] kiválasztása) megfelelő algoritmus segítségével megkapható, azaz a két érzékelő regisztrációja elvégezhető. A kapott beállítások hasonló módon előnyösen tesztelhetők is újabb teszt objektumokkal. Ez egy félautomatikus kalibrációs eljárás (emberi beavatkozással), de akár teljesen automatizált kalibrációs eljárás is alkalmazható, kidolgozható.
Az egyes objektumok mozgásmintázata alapján is elvégezhető a kalibráció, azaz sorozatfelvételek esetén a nem túl szabályosan mozgó objektumok követésével (szintén mindkét képen folyamatosan meghatározva a pozíciót).
Fluoreszcens jel jó térfogati észleléséhez (nagy mélységélességéhez) tehát kis optikai nagyítás/kicsinyítés vagy kicsinyítés/nagyítás nélküli leképzőlencse alkalmazása szükséges. Ha nem alkalmazunk kicsinyítést/nagyítást, akkor a fluoreszcencia-szenzornak (érzékelőnek) a mérőcella (mintatartó) közvetlen közelében kell lennie. A mérendő objektumoktól viszonylag távol elrendezett érzékelő esetén a mérést nehezíti, hogy a fluoreszcens fény erőssége négyzetesen csökken a távolsággal, és kiterjedt folton jelenik meg (ekkor észlelése és lokalizálása is a növekvő távolsággal egyre nehezebb lenne). Ennek elkerülésére alkalmazható ilyen esetekben a találmány szerint leképzőlencse, amelynek használatával a vizsgált mintatartó-térrész és a fluoreszcenciaérzékelő egymástól távolabb is el lehet rendezve.
- 18 Egyes ismert holografikus rendszerek, különösen azok, amelyekben a fluoreszcencia- és a holografikus felvételt ugyanazzal az érzékelővel készítik, lencse nélküliek, mivel nem rendezhető el olyan lencse, amely mind a fluoreszcencia-érzékelőhöz, mind a holografikus érzékelőhöz megfelelő lenne. A lencse nélküli megoldás növelheti ugyan a mérhető felületet, de a megfelelő egyenletes nagy intenzitású fluoreszcens megvilágítás biztosítása is sokkal nehezebb egy nagy felületen. Ráadásul, a lencse nélküli ismert megoldásokban a holografikus rekonstrukció megkívánt felbontása eléréséhez, mivel alapvetően a pixelméret korlátozza a lencse nélküli rendszer esetén az elérhető felbontást, valamilyen szuperrezolúciós eljárást szükséges alkalmazni. Ehhez több felvétel szükséges, ami jelentősen lassítja mintavételt és bonyolítja a fluoreszcenciafelvétel, felvételek és a szuperrezolúcióhoz készült felvételek regisztrációját.
Amint az 1. ábra szerinti kiviteli alak szemlélteti, megfelelő optikai elemek, objektívek, lencsék használatával viszont a megfelelően erős megvilágítás az egész (kisebb) vizsgált térfogatban könnyen biztosítható.
A különválasztott fluoreszcencia- és holografikus érzékelő miatt a találmány szerint lehetővé válik a megfelelő nagyítás alkalmazása, amellyel a holografikus rendszerben is sokkal egyszerűbben elérhető a szükséges felbontás és így a mérés is sokkal gyorsabb lehet. Ennek megfelelően a találmány szerinti berendezés az 1. ábrán szemléltetett kiviteli alakban tartalmaz a 10 mintatartótérrész és a 18 holografikus érzékelő között elrendezett 24 holografikus leképzőlencsét. A 24 holografikus leképzőlencse nagyítási mértéke előnyösen 1,5-10 közötti, még előnyösebben 2-3 közötti, különösen hozzávetőlegesen 2,5. Ilyen nagyítás alkalmazásával biztosítható a kellően nagy felbontás a jó minőségű rekonstrukció érdekében.
Bár lencsék alkalmazása esetén kisebbnek tűnhet a mérhető felület és térfogat, de a nagyobb vizsgált mintatérfogatok a lencse nélküli esetben a szükséges sok expozíció (szuperrezolúciónál négyzetesen nő a felbontás növelésével) és a fluoreszcencia-felvételek kis mélységélessége miatt ez egyáltalán nem használhatók ki.
- 19 A fentieknek megfelelően egészen mások a fluoreszcencia- és a holografikus érzékelővel szemben támasztott igények is. A találmány szerinti esetben a fluoreszcencia-kamera (érzékelő), melynél a nagy mélységélesség elérése érdekében kis nagyítást kell alkalmazni, előnyösen kis felbontású (nagy pixelmérettel rendelkezik), de nagyon érzékeny, valamint előnyösen nagy erősítésre is képes kis zajjal (nagy az érzékenység). Hasznos, ha a kamera színeket is képes érzékelni, így a különböző színű fluoreszcenciákat megkülönböztetni.
A holografikus kamera esetén, mivel a megfelelő megvilágítás könnyebben biztosítható (mivel jellemzően lézer vagy LED fényforrást alkalmazunk) ezért nem az érzékenység, hanem a kis pixelméret és a minél nagyobb felbontás a fontos. Itt alkalmazható monokróm kamera (érzékelő) is, hiszen a szín információkat a fluoreszcens jelekkel helyettesíthetjük (előnyösen meghatározható, ha több különböző fluoreszcens emittált fénynyaláb van jelen) és a színes megvilágítást a fluoreszcens mérés amúgy is akadályozza.
Látszik, hogy a különböző igényeket a szenzorokkal szemben csak nagy kompromisszumok árán lehetne fedésbe hozni.
Ezért célszerű a találmány szerinti optikai elrendezést alkalmazni, amely az ismert megoldásoknál sokkal hatékonyabb mérőberendezést valósít meg. A holografikus mérés esetén nagy felbontású rekonstrukció eléréséhez szükség lehet megfelelő nagyításra (lencse nélküli esetben, általában a szenzor pixelmérete korlátozza az elérhető felbontást), amihez a találmány esetében van lehetőség objektív alkalmazására. (Megjegyzendő, hogy a lencse nélküli elrendezés jelentősen korlátozza az elérhető felbontást. Nem vagy alig mozgó, alacsony felbontású, nem túl vastag minták feldolgozására alkalmas csak a lencse nélküli rendszer.)
A találmány szerinti eljárással és berendezéssel előnyösen többféle fluoreszcens választ is detektálhatunk egyszerre. Ha a fluoreszcens objektumok által emittált hullámhosszak távol esnek egymástól, akkor egy egyszerű színes (pl. bayer pattern [bayer elrendezés] segítségével kialakított) kamerával ezek elkülöníthetők. De ha közel esnek az emissziós csúcsok egymáshoz, akkor akár
- 20 több fluoreszcencia-kamera alkalmazása is elképzelhető, és ezek fényútját célszerűen dichroikus tükrökkel választjuk el (pl, ha mindkettő vörösben emittál, csak 30 nm-el az egyik feljebb).
A találmány szerinti eljárásban és berendezésben a minta a mérő cellán (mintatartó-térrészen) folyik keresztül. A minta viszonylag ritka, autofluoreszcenciával rendelkező (például klorofill, fikocianin, fikoeritrin, stb.), vagy valamilyen fluoreszcens festéssel megjelölt (FDA - fluoreszcein-diacetát: élő és élettelen elválasztására alkalmas festék, FITC - fluoreszcein-izothiocianát: fluoreszcens festék, stb.) objektumokat tartalmaz.
A megfelelő hullámhosszú fluoreszcens megvilágítást egy vagy több ferdén elhelyezett, a mért térfogatot jól, egyenletesen és megfelelő fényerővel megvilágító gerjesztő 12a, 12b fényforrás biztosítja (vö. 1. ábra). Az 1. ábra szerinti kiviteli alakban a 12a, 12b gerjesztő fényforrás a 10 mintatartó-térrésznek a közös optikai tengelytől eltérő irányból történő bevilágítására alkalmasan (azaz ferdén és előnyösen a közös optikai tengelyhez viszonyítva kis szögben, előnyösen kb. 30-60°-ban) van elrendezve. A jelen kiviteli alakban a berendezés tehát az egymástól eltérő hullámhosszú gerjesztő fény kibocsátására alkalmas gerjesztő 12a, 12b fényforrásokat tartalmazza.
A gerjesztő fényforrások természetesen lehetnek LED-ek, de lézer, vagy megfelelően szűrt halogén fényforrás is alkalmazható gerjesztő fényforrásként.
A találmány szerinti berendezés 1. ábrán szemléltetett kiviteli alakjában tartalmaz a gerjesztő 12a 12b fényforrás és a 10 mintatartó-térrész között elrendezett, a gerjesztő fényt átengedő (más hullámhosszakat minél jobban kiszűrő) 26a, 26b gerjesztési szűrőket (excitációs szűrőket). Ezek alkalmazásával biztosítható, hogy a megvilágítás optimális legyen a megfelelő fluoreszcencia kiváltásához és ne zavarja a holografikus és a fluoreszcens méréseket, azaz a 10 mintatartótérrészre már csak a megfelelő hullámhosszú gerjesztő fény juthasson el.
Mivel a fluoreszcens gerjesztések ferdén, de a mért területre fókuszálva történnek, ezek egyenként hangolhatók, modulálhatók, szűrhetők. Így nagy fényintenzitást képesek biztosítani és egymást nem zavarják.
- 21 Az emittált (auto- vagy festett) fluoreszcenciát megfelelő optikával 20 becsatolóelemen keresztül egy (vagy több) nagy érzékenységű 14 fluoreszcencia-érzékelő (kamera) rögzíti. A célszerűen előtte elhelyezett, a fluoreszcens emittált fényt átengedő (más hullámhosszakat minél jobban kiszűrő) 28 emissziós szűrő gondoskodik arról, hogy csak a fluoreszcens jel jusson be a kamerába, tehát a gerjesztő fény és a holografikus fényforrás fénye is ki legyen szűrve. A jelen kiviteli alakban tehát a berendezés tartalmaz a közös optikai tengelyen a 14 fluoreszcencia-érzékelő és a 20 becsatolóelem között elrendezett, a fluoreszcens emittált fényt átengedő 28 emissziós szűrőt.
A holografikus rendszerhez szükséges megfelelő koherencia hosszal rendelkező megvilágítást példaképpen egy lézer adja. Ennek hullámhossza olyan kell, hogy legyen, hogy az ne zavarja a fluoreszcens mérést, és attól megfelelő szűrővel, az 1. ábra szerinti kiviteli alakban alkalmazott, a 18 holografikus érzékelő és a 10 mintatartó-térrész között elrendezett, a holografikus 16 fényforrás fényét átengedő (más hullámhosszakat minél jobban kiszűrő) 30 első szűrővel jól elválasztható legyen. A 30 szűrő gondoskodik arról, hogy csak a lézer által megvilágított objektumok diffraktált képét rögzítse a holografikus kamera és a fluoreszcens gerjesztő fényt teljesen kivágja A minta holografikus képét megfelelő optika alkalmazása után egy nagy felbontású - előnyösen digitális kamera rögzíti.
A fluoreszcenciát mutató objektumoknak a találmány szerinti eljárásban alkalmazott kiválasztása (azaz fluoreszcencia-felvételen való megkeresése) jelentősen megnöveli a találmány szerinti eljárás és berendezés feldolgozási sebességét, hiszen nem kell az összes holografikus felvételt rekonstruálni, hanem csak azokat melyek számunkra érdekesek, azaz amelyik tartalmazza legalább egy fluoreszcens objektum háromdimenziós modelljét a fluoreszcenciafelvételen végzett azonosítási lépés megállapítása szerint. Ez lehetővé teszi nagyobb felbontású szenzor, nagyobb nagyítás és az ezzel együtt járó kisebb látótér alkalmazását, hiszen az átfolyás sebességét és az átvizsgálható térfogatot már nem a (digitális) hologramok kiértékelésének a sebessége határozza meg. A fluoreszcens jel kijelöli, hogy a vizsgált látótérben hol van egy adott fluoreszcens objektum. Így a rekonstrukciót csak az adott objektumhoz
- 22 tartozó holografikus felvételre kell elvégezni. Ennek a rekonstrukciónak a paramétereit előnyösen egy csökkentett felbontású kép feldolgozásával pontosan meg lehet határozni a nagy felbontású felvétel rekonstruálása előtt. Pontosabban, mint azt az ismert megoldások esetén a feldolgozási idők optimalizálása lehetővé teszi. E körben a rekonstrukciós távolság minél pontosabb meghatározása nagyon fontos. Ha van idő azt meghatározni, akkor a rekonstruált objektumok képe is sokkal jobb lehet. A találmány szerinti eljárás ezt lehetővé teszi. Az objektum tartóját (azon térfogat elhelyezkedését, amely az objektumot befoglalja) is pontosabban meg lehet határozni a találmány szerinti eljárás alkalmazásakor, hiszen akár egy nagyságrenddel több feldolgozási idő marad az egyes valóban érdekes objektumok rekonstrukciójára. A fluoreszcencia-vizsgálatnak alávetett minták jellemzően olyan ritkák a fluoreszcens objektumok szempontjából, hogy átfolyásos rendszerben adagolva a mintát a mintatartóba, csak minden 10. felvételen vagy még ritkábban fog előkerülni egy fluoreszcens objektum. A kiválasztott holografikus felvételek rekonstrukciójára szánható feldolgozási idő ennek köszönhetően növekszik meg. Amennyiben egy rendelkezésre álló minta ennél sűrűbb lenne a fluoreszcens objektumokra nézve akár hígításnak is alá lehet vetni a hatékonyabb feldolgozás, kiértékelés érdekében. Mivel azonban a találmány szerinti eljárást és berendezést példaképpen víztisztítás hatékonyságának ellenőrzésére használjuk (annak meghatározására, hogy mennyi fluoreszcens objektum maradt egy vízmintában a víztisztítás után), jellemzően a felhasználás természetéből fakadóan kisszámú fluoreszcens objektummal kell számolni az egész mintára nézve. Fluoreszcens festés alkalmazásával ellenőrzik, hogy sikeresen kiirtották-e az összes élőlényt a víztisztítás, fertőtlenítés során.
A találmány szerinti eljárás egy kiviteli alakjában legalább kettő fluoreszcenciafelvétel elkészítését követően a legutoljára (aktuálisan) készített fluoreszcenciafelvételből kivonva a (korábbi és az aktuális) fluoreszcencia-felvételek átlagát különbségi fluoreszcencia-képet hozunk létre, és a fluoreszcens objektumazonosítási lépést a különbségi fluoreszcencia-képen végezzük el. A jelen kiviteli alakban a korábbi fluoreszcencia-felvételekkel képzett átlag kivonásával a háttér fluoreszcenciát előnyösen átlagoljuk és így csak az ettől való eltérést vizsgáljuk.
- 23 Tehát az állandó fluoreszcens visszaverődések, buborékok, repedések, kamera hibák automatikusan kiesnek az átlag kivonásával, mert időben állandó a jelük.
Az eljárás fluoreszcens objektum-azonosítási lépésében előnyösen be van állítva egy küszöbérték (a fluoreszcencia-felvételen mérhető fényintenzitás tekintetében), amely alatt a keresés során fellelt fényintenzitás értékeket nem tekintjük fluoreszcens objektumhoz tartozó jelnek. A fluoreszcens objektumok keresése során megkeressük a maximális fényintenzitást a fluoreszcenciafelvételen. Ha van és nagyobb, mint az előre meghatározott küszöb akkor annak egy környezetében is megvizsgáljuk a mért értékeket, amelyek szintén az adott objektumhoz tartozhatnak. Így kizárhatjuk a többszörös detektálást, mert az egy adott objektumhoz tartozó területeket kizárjuk a további fluoreszcens objektumok keresésére irányuló vizsgálatból. A keresést előnyösen képpontonként végezzük, az adott képpontban rögzített fényintenzitást vizsgálva. Amennyiben egymás melletti (térben lehetnek egymás mögött is) objektumokat vizsgálunk (melyek a fluoreszcens objektum-azonosítási lépésben egyetlen fluoreszcens objektumként lennének értelmezve), az a holografikus rekonstrukció során kiderül, és akkor külön lehet elemezni, hogy a kis felbontású fluoreszcencia-kép esetén hogyan kell értelmezni a szegmentálást. Ritka minták esetén a fluoreszcens objektumok ilyen együttállása, egymáshoz közel kerülése ritkán fordul elő.
A fluoreszcencia-kamerán detektáljuk egy objektum 2D pozícióját a vizsgált mintatartó térrészben (mérési cellában). Amikor a vizsgált területen belül több objektum is rekonstruálódik a holografikus felvétel alapján (pl. akár egymástól eltérő mélységben), akkor meg kell határozni, vajon melyik fluoreszkált és melyik nem. Ezt a két mérés összevetésével, együttes elemzésével végezhetjük el a fentiek szerint: lényegében a fluoreszcencia-felvétel jelöli ki a fluoreszkáló objektumokat (és ennek megfelelően a nem fluoreszkáló objektumokat figyelmen kívül hagyhatjuk). Az is előfordul, hogy a fluoreszcens objektum kiterjedt, és ekkor a találmány szerint a két felvétel információi célszerűen összevethetők (például megvizsgálhatjuk, hogy mindkét felvétel tartalma kiterjedt objektumra utal-e).
- 24 A küszöbérték alkalmazásával megkülönböztethetők a fluoreszcens objektumok a háttérzajtól. Mivel a nem mozgó objektumokat a felvételek átlagolásával és az átlagnak az éppen aktuális felvételből való kivonásával eltüntetjük, ezért a különbségképzéssel kapott különbségi fluoreszcencia-képen előnyösen csak a mozgó (átfolyó cellában mozgatott vagy magától úszó) fluoreszcens objektumok látszanak. A használt küszöbérték a fluoreszcens jel függvénye (ha kicsi a jel a küszöb is kicsi). Ennek megfelelően a küszöbértéket az aktuális megvilágításhoz kell beállítani. Megjegyzendő, hogy FDA festés (amikor az objektumokat mesterségesen tesszük fluoreszcenssé megfestéssel) esetén, ahol a háttér fluoreszcenciája a mérés során nő, a küszöb megválasztásánál ezt figyelembe kell venni, követni, azaz időben változó küszöb használatára lehet szükség, azaz ebben a kiviteli alakban az adott mintatérfogat háttér-fluoreszcenciájától függő változó értékű küszöbértéket alkalmazunk. Auto-fluoreszencia mérése esetén a háttér fluoreszcencia nem változik, de ekkor is meg kell vizsgálni mekkora a háttér (ami esetleg nem fluoreszenciából, hanem háttér fény beszűrődéséből ered). A küszöbérték függ a megvilágítástól, a kamera érzékenységétől és dinamika-tartományától, a berendezés erősítésétől, a jel/zaj viszonytól, és a jel erősségétől. Ezek bármelyike változhat például egy-egy részegység lecserélésével.
A felvételek készítésének időzítését a már fentebb is említett 2A-2C ábrák szemléltetik. A fluoreszcencia- és a holografikus felvételek időben átfedő módon készülnek. Ezt szemléltetik a 2A és 2B ábrák, amelyeken rendre fluoreszcenciafelvételhez tartozó Tf expozíciós idő, és holografikus felvételhez tartozó Th expozíciós idő van szemléltetve. A 2A és 2B ábrák egymással összefüggésben értelmezendők, mutatják a Tf és Th expozíciós idők jellemző hosszának egymáshoz viszonyulását és azt is szemléltetik, hogy a két felvétel rögzítését nagyjából egyidejűleg kezdjük meg, azaz az időbeli átfedésük előnyösen így van biztosítva. A hosszú T f expozíciós idő alatt a holografikus felvétel más időzítéssel is elkészíthető. A fluoreszcencia-felvételhez jellemzően jóval hosszabb expozíciós időt alkalmazunk, de mivel kisebb felbontású a szükséges kamera ezért jellemzően nagyságrendileg egyforma időkig tart a két felvétel elkészítése és kiolvasása (a fluoreszcencia-felvétel esetében az expozíciós idő hosszú, de a
- 25 kiolvasás gyors, a holografikus felvétel esetében pedig az expozíciós idő rövid, de a kiolvasás a nagyobb felbontás miatt hosszabb ideig tart). Mivel a hosszú expozíció alatt el tudnak mozdulni az objektumok, ezért számolunk egy kis mozgási elmosódással (mozgás blur-rel). Ez viszont épp a kis felbontás miatt elhanyagolható, azaz az adott objektumnak a holografikus felvételen történő beazonosíthatóságát lényegében nem befolyásolja.
A mozgási elmosódás megjelenése az alábbiak szerint, a 2C ábrával szemléltetve egy kiviteli alakban előnyösen ki is használható. Ebben a kiviteli alakban a fluoreszcencia-felvétel Tf expozíciós idejének egy Tf2 részperiódásában az adott mintatérfogatot két, egymástól eltérő hullámhosszú gerjesztő fénnyel világítjuk be, egy másik Tfi részperiódusában pedig a két gerjesztő fény közül csak az egyikkel világítjuk be az adott mintatérfogatot, a fluoreszcens gerjesztő fények hatására kibocsátott fluoreszcens emittált fényt leképezve készítjük a fluoreszcencia-felvételt, és a fluoreszcens objektumazonosítási lépésben legalább egy fluoreszcens objektum azonosítása esetén a legalább egy fluoreszcens objektum objektum-képének a fluoreszcenciafelvételen tapasztalható elmozdulása alapján mindkét részperiódusban alkalmazott gerjesztő fénnyel gerjesztett fluoreszcens objektumot és/vagy csak a részperiódusok egyikében alkalmazott gerjesztő fénnyel gerjesztett fluoreszcens objektumot azonosítunk.
Egy ilyen megvilágítási sémát szemléltet a 2C ábra, amelyen meg van jelölve a teljes Tf expozíciós idő; az ábra szerinti esetben a Tfi hosszúságú részperiódusban egyetlen gerjesztő megvilágítást alkalmazunk (példaképpen csak a 12a gerjesztő fényforrás működtetjük), a Tf2 részperiódusban azonban bekapcsoljuk a másik gerjesztést is, így már két egymástól eltérő hullámhosszal jellemezhető gerjesztő fénnyel világítjuk be az éppen vizsgálat alatt álló mintatérfogatot. Az is elképzelhető, hogy egy első részperiódusban alkalmazunk egyidejűleg két megvilágítást, és az azt követő második részperiódusban az egyiket kikapcsolva már csak egyetlen megvilágítást alkalmazunk. Az eljárás jelen kiviteli alak szerinti lépései egy ily módon készült felvételen is végrehajthatók.
- 26 A jelen kiviteli alak tehát arra alkalmazható, hogy a fluoreszcencia-érzékelővel (kamerával) egyébként külön speciális szűrő nélkül nem megkülönböztethető fluoreszcens jeleket (például klorofill vörös fluoreszcenciáját (680nm), amelyet kék megvilágítás (470nm) vált ki, és fikocianin vörös (650nm) fluoreszcenciáját, amelyet borostyán (595nm) megvilágítás vált ki) meg lehessen különböztetni. A példában a megfelelő időpontban bekapcsolt borostyán megvilágítás alapján megkülönböztethetők a fikocianint is tartalmazó sejtek, amelyeknél a mozgási elmosódás speciális mintázatot mutat (a két objektumhoz tartozó mozgási elmosódás különböző lesz, mivel a felvételen rögzített mozgás különböző időtartamú, így az expozíciós idő alatt elmozdulást megjelenítő mozgási elmosódás különböző mértékű).
A 3A-3B ábrák példaképpeni összetartozó fluoreszcencia- és holografikus felvételeket szemléltetnek, a 3C ábra pedig a 3B ábrán látható holografikus felvétel rekonstrukciója. A 3A ábrán három objektum képe jelenik meg, azaz a példához tartozó vizsgálatban a felvétel készítésének időpillanatában három fluoreszcens objektum tartózkodik a vizsgált mintatartó térrészben. Az adott példában a fluoreszcencia-felvétel alapján zöld és vörös fluoreszcencia is megkülönböztethető (a vörös fluoreszcencia származik a példában autofluoreszcenciából, a zöld pedig festéssel kapott fluoreszcenciából), a legbaloldalibb objektum képe vörös, a másik kettőé zöld. Az egyes objektumképek nyilakkal vannak megjelölve.
A 3B ábra a 3A ábrán látható fluoreszcencia-felvételhez tartozó holografikus felvétel. A 3B ábrán látható, hogy a fluoreszcens objektumok képén kívül még számos más objektum képe is megjelenik (azaz a hozzájuk tartozó interferenciamintázat). A találmány nagy előnye, hogy a 3B ábra holografikus felvételén látható nagyszámú objektum-kép közül a találmány szerinti eljárással kiválaszhatók a fluoreszcens objektumokhoz tartozó képek. Amint a 3A és 3B ábrák összevetéséből is látható, a fluoreszcencia-felvétel objektum-képeinek pozíciója alapján kiválaszthatók a holografikus felvétel objektum-képei közül azok, amelyek a fluoreszcens objektumokhoz tartoznak.
- 27 A 3C ábra a 3B ábrán a fehér négyzettel körülvett objektum-kép (interferenciamintázat) rekonstrukcióját mutatja, amelyen megfigyelhető a fluoreszcens objektum rekonstruált alakja. A 3C ábra szerinti rekonstruált képen a holografikus felvétel elkészítéséhez alkalmazott in-line elrendezés miatt keletkező ikerkép miatt láthatók gyűrűk. Az ikerkép zavaró hatását ismert módszerekkel csökkenteni lehet, azonban morfológiai vizsgálatot, azaz a fluoreszcens objektumra kapott háromdimenziós modell vizsgálatát a gyűrűk jelenléte nem befolyásolja (az ikerkép eltávolítása lassú, így nem alkalmazzuk).
A 4. ábrán egy viszonylagosan hosszú expozíciós idővel felvett fluoreszcenciafelvétel látható. A fluoreszcens objektum elmozdulása miatt az objektum-kép „vonalat húz maga után”, azaz mozgási elmosódás keletkezik. A fentiek szerint ez alkalmas lehet arra, hogy a fluoreszcens gerjesztés megfelelő időzítésű változtatásával elválasszuk az amúgy azonos színnel fluoreszkáló objektumokat.
A nagyobb mértékű mozgási elmosódás elkerülése érdekében átfolyásos minta esetén a minta előnyösen nagyon lassan folyik a felvételek alatt (a fenti, előnyösen kihasználható kismértékű mozgási elmosódás jellemzően akár álló minta esetén is jelentkezik). A felvételek elkészítése után viszont egy pumpa alkalmazásával a folyadék mozgása felgyorsítható, majd egy következő felvétel idejére újból lelassítható. Az expozíciók tehát előnyösen a (pumpával) elmozdított minta megállása, lelassulása után történnek. Ennek az ideje használt expozíciós és letöltési időkhöz képest nem hosszú, nem lassítja jelentősen a berendezés működését, azaz a felvételek előnyösen viszonylag gyors egymásutánban készíthetők. A berendezés egy példaképpeni megvalósításában másodpercenként történik expozíció, de valószínűleg a 3-4Hz sebesség is elérhető (ekkor már az is előnyként jelentkezik, hogy a fluoreszcencia-felvételhez tartozó expozíciós idő és a holografikus felvétel letöltési ideje összehangolható, körülbelül ugyanakkora mértékű lehet).
Hasonló működést nem tud mutatni olyan ismert berendezés, ahol azonos szenzort használnak a detektálásra. A fluoreszcens jel mérésére hosszú expozíciós idő, nagy erősítés kell és hosszú megvilágítás, míg a holografikus felvételhez nagy felbontás és rövid expozíciós idők kellenek (esetleg színes
- 28 felvételre lehetőség) Emiatt az ismert berendezésekben ezek egyszerre nem végezhetők el, hanem csak egymás után. Ekkor azonban az objektumok azonosítása csak akkor végezhető el, ha nem vagy nagyon lassan mozognak. Ha az ilyen ismert berendezésekben szuperrezolúciót is kell alkalmazni, ami a lencse nélküli rendszerek esetén gyakran követelmény, akkor az tovább csökkenti a feldolgozás sebességét és még nehezebb a fluoreszcencia- és a holografikus képek regisztrációja. Ráadásul, az ismert berendezésekben nem teljesíthető az a követelmény sem, hogy a holografikus rendszer, ha lencse nélküli, akkor a jó felbontást kis objektum-szenzor távolság esetén adja, míg a fluoreszcens gerjesztő fény kiszűréséhez alkalmazott dichroikus tükör (ez példaképpen egy interferencia-szűrő, amely nagy optikai denzitást, kioltást tud biztosítani), ami ekkor a fluoreszcens gerjesztő fény kiszűréséhez feltétlenül szükséges, általában 2-3 mm vastag a gyártástechnológiája miatt, tehát ennél kisebb objektum-szenzor távolság egy ilyen ismert megoldásban nem lehetséges.
Az átfolyási sebességet előnyösen úgy kell beállítani, hogy egy objektum csak egy hologramon szerepeljen, de ne mosódjon el, tehát az expozíciós idő alatt pixelméretnél kisebb távot tegyen meg. Két felvétel készítése között viszont kicserélődjön a teljes vizsgált térfogat, hiszen ekkor nem mérjük ugyanazokat az objektumokat.
Az eljárás egy kiviteli alakjában tehát átfolyósan mozgó mintát alkalmazunk és rendre az adott mintatérfogat kicserélődését követően az eljárás lépéseit legalább egy újabb adott mintatérfogatra elvégezzük.
Ha például 80ms a fluoreszcencia-érzékelő expozíciós ideje (gyakorlatilag ennyi idő alatt gyűlik össze elég fény a pontos detekcióhoz, de ez kamera és fluoreszcens megvilágítás függő) ezalatt azt akarjuk, hogy néhány pixelnyit mozduljon el csak az objektum. 5 pixel-es elmozdulás esetén ez a holografikus érzékelőn - ha a fluoreszcencia-érzékelő felbontása például 256x256, a holografikus érzékelőé pedig 2048x2048 - 8x ekkora elmozdulást okoz (2048/256=8), ami 40pixel/80ms. Ennyire kell például lelassítani a minta átfolyási sebességét. Mivel a holografikus felvétel készítésénél rövid (1 ms
- 29 nagyságrendjébe eső) expozíciós idővel dolgozunk, ilyen sebesség csak elhanyagolható mozgási elmosódást okoz. A felvétel után lehet tovább mozgatni a mintát, akár nagy sebességgel is, hiszen az átvizsgált térfogatot ez nem befolyásolja.
A holografikus érzékelő például 10-15 megapixeles (ennek használhatjuk a fentiek szerint egy 2048x2048-as résztartományát); egy átlagos érzékelő 5x5 mm-es. Ekkora képeknek a számítógépre való letöltése jellemzően kb. 4-5 frame/sec sebességgel történik; egy-egy felvétel letöltése kb. 200 ms, de akár 500 ms is lehet. Vannak ugyan ennél sokkal gyorsabb kamerák, de ezek nagyon drágák és a kapott képek, hologramok feldolgozási ideje ennél sokkal lassabb, azaz nem éri meg ilyet alkalmazni. Az holografikus expozíció például lézerek villantásával történik, ami milliszekundumos nagyságrendű. Tehát a felvétel során az objektumok, illetve a hologramjuk állni látszik és még egy pixelnyivel se mozdul el (nincs mozgási elmosódás, ami elrontaná a felbontást).
A fluoreszcencia-érzékelő kis felbontású (például 1-2 megapixeles) és a nagyítás különbségek miatt ennek is csak kis részét használjuk ki (pl. 300x300 pixelt); egy érzékelő jellemzően 5x5 mm-es. A fentieknek megfelelően viszonylag hosszú expozíciós időket és nagy erősítést kell alkalmazni, hogy a gyenge fluoreszcens jelből elég fényt tudjon összegyűjteni. Itt persze a használható expozíciós idő a fluoreszcens gerjesztő fény intenzitásán is múlik (erős megvilágításhoz rövidebb expozíciós idő tartozik). A fentiekkel összhangban jellemzően a fluoreszcenciafelvételekhez 40-200ms expozíciós időt alkalmaztunk. Hosszabb expozíciós idők esetén az objektum a felvétel közben jobban el tudna mozdulni, ami akadályozhatja a pontos pozíció meghatározását, de rövid expozíciók esetén ez gyakorlatilag elhanyagolható. A fluoreszcencia-felvételen tapasztalható mozgási elmosódásra alapuló fluoreszcens objektum elkülönítéshez (ld. 2C ábra) ilyen expozíciós idők alkalmazása megfelelő.
Egy példaképpeni esetben tehát 256x256 képponttal rendelkező fluoreszcenciafelvételt és 2048x2048 képponttal rendelkező holografikus felvételt készítünk. Az alkalmazott leképezések kicsinyítési/nagyítási mértékétől is függ, hogy az érzékelő mekkora felületét használjuk. Még ennél is lehet nagyobb a felbontások
- 30 közötti eltérés, de az objektumok helyének fluoreszcencia-felvételen történő becslését ez ronthatja. Ritka minta esetén, ahol az objektumok messze vannak egymástól és így fluoreszenciájuktól függetlenül nem átfedők, akár ennél nagyobb felbontás különbséget is alkalmazhatunk.
Lehetőség van megfelelő szűrők alkalmazásával több különböző fluoreszcens jel egyidejű rögzítésére is. Ekkor biztosítani kell, hogy az alkalmazott megvilágítások (gerjesztő fények) ne zavarják egymást és az emittált hullámhosszak valahogy elválaszthatók legyenek egymástól. Például alkalmazhatunk 470 nm-es és 600 nm-es megvilágítást (gerjesztési szűrőkként 10 nm-es sávszűrőket alkalmazva). Az alkalmazott emissziós szűrő 500nm feletti fényt enged át (ezzel akadályozzuk meg, hogy a 470 nm-es gerjesztő fény a fluoreszcencia-érzékelőre jusson), és egy (20 nm-es sávszélességű) sávkizáró (ún. ’notch’) szűrőt alkalmazunk a 600nm megvilágítás kiszűrésére, hogy az se juthasson el a fluoreszcenciaérzékelőre. Ekkor képesek vagyunk detektálni FDA festett mintát (~520 nm hullámhosszú emittált fény, élő-élettelen teszthez), klorofill B autofluoreszcenciát (~680 nm-es emisszió), fikocianin emissziót (~650 nm-es emisszió, kékalga) és fikoeritrint (570 nm-es emisszó, kékalga, vörös alga), míg a hologramokat például 405 nm-es hullámhosszú fénnyel rögzítjük.
A berendezésben előnyösen (így az 1. ábra szerinti kiviteli alakban is) ferdén, kis szög alatt biztosítjuk a fluoreszcens megvilágításokat. Ezzel lehetővé válik több különböző fluoreszcens megvilágítás egyidejű használata és csökkenthető az alkalmazott dichroikus szűrőkkel (az 1. ábra szerinti kiviteli alakban a 20 becsatolóelem lehet fluoreszcens emittált fényekre nézve dichroikus szűrő, mivel előnyösen csak ezeket engedi át a fluoreszcencia-érzékelőre) szemben az elvárás. Azaz, ha szembe világítana a szenzorral a fluoreszcens megvilágítás, akkor sokkal nagyobb kioltást kéne biztosítania a dichroikus szűrőnek, mint ha ferdén világítjuk meg a mintát, hiszen ekkor csak a szórt fényt kell kiszűrnünk. Mivel az egyes fluoreszcens megvilágítások külön modulok (12a és 12b gerjesztő fényforrások) ezért biztosítható a megfelelő fókuszálásuk és sávszélesség szűrésük, azaz könnyebben optimalizálható az emissziós szűrő is, amely az 1. ábra szerinti kiviteli alakban 28 emissziós szűrő. Más elrendezés esetén az összevezetésük, fókuszálásuk bonyolult, drága és nem igazán hatékony
- 31 optikailag. A jelen kiviteli alak szerinti megoldással nem kell több alul vagy felül áteresztő tükröt alkalmazni, melyek drágák, hatásfokuk csak 90% körüli, és így komoly fényveszteséghez vezethetnek, és (mind a fluoreszcencia-, mind a holografikus) leképezés minőségét rontanák, hiszen több felületen törik meg az alkalmazott fény.
Előnyösen afokális optikát alkalmazhatunk a hologramok felvételéhez. Ennek az elrendezésnek a nagy előnye más elrendezésekkel szemben, hogy nem síkhullám megvilágítás esetén is biztosítja, hogy a különböző objektumok nagyítása a rendszeren belül állandó, azaz az objektum pozíciójától nem függ. Így nem szükséges az alkalmazott nagyítást kalibrálni.
A lényege az alkalmazott elrendezésnek az, hogy nem egy lencsét (objektívet) alkalmazunk a megfelelő nagyítás elérésére, hanem egy lencserendszert, amely lényegében távcsőként van elrendezve. Ez azért előnyös, mert ugyan az egy lencsés rendszer holografikus rekonstrukcióval együtt az objektum távolságától független nagyítást generál, de csak akkor, ha a megvilágítás párhuzamos. Ha ez nincs így akkor a távolságtól függően más és más lesz a rekonstruált objektumok nagyítása (ez kalibrálható, de nem egyszerű). Afokális elrendezés alkalmazása esetén viszont az afokális elrendezés nagyításával lehet számolni a megvilágítástól gyakorlatilag függetlenül. Ez jellemzően nem befolyásolja az objektumok szegmentálását, hiszen azt jelenleg az optimális objektum rekonstrukcióiból végezzük el. Az optimális rekonstrukciót pedig a különböző távolságokban történő rekonstrukciók összehasonlításával (kisebb felbontással számolva természetesen), speciális fókuszmértékek alkalmazásával határozzuk meg. A találmány szerinti eljárás alkalmazásakor előnyösen még arra is van idő, hogy a rekonstrukcióhoz tartozó távolságot is pontosabban meghatározzuk.
A találmány szerinti berendezésben előnyösen elrendezhetünk 31 dichroikus tükröt is, amelynek a feladata a mikroszkóp objektívről, azaz a holografikus leképzőlencséről visszaverődő fluoreszcens jelnek az eltérítése (a 31 dichroikus szűrő nem a közös optikai tengelyre merőlegesen, hanem ahhoz képest kissé ferdén van elrendezve). Ez a jel egyébként szintén bejutna a fluoreszcenciakamerába és ott egy további, másik oldalról felvett (defókuszált, homályosabb)
- 32 képét adná a mért térfogatnak. Előnyösen a 30 szűrő és a 31 dichroikus tükör helyettesíthető egyetlen, a 31 dichroikus tükör helyén elrendezett optikai elemmel, ekkor a 30 szűrő elhagyható.
A berendezés holografikus elrendezésében példaképpen in-line elrendezést alkalmazunk, azaz a megvilágítás szolgáltatja a referencia nyalábot is. Ilyen elrendezést akkor célszerű használni, ha a vizsgált minta ritka, azaz a mért objektumokon való szóródást a referencia kis perturbációjaként lehet kezelni. Elrendezés előnye az egyszerűség és a rezgésekkel szembeni érzéketlenség, robosztusság. Más elrendezések is szóba jöhetnek on-axis in-line és off-axis elrendezések, de ott gondoskodni kell a referenciának külön úton a holografikus érzékelőre vezetéséről. Ezekkel kiterjedtebb, kevésbé átlátszó minták is vizsgálhatók és az objektumok fázisa is könnyebben rekonstruálható (egyszerűbb gyorsabb numerikus módszerek alkalmazhatók), de bonyolultabb optikai berendezést feltételez és igen érzékeny a rezgésekre.
Célszerű törekedni arra, hogy a holografikus elrendezésben alkalmazott hullámfront szabályos legyen (lehetőleg síkhullámmal jól közelíthető), ezt például egymódusú lézerrel lehet biztosítani, ahol az emittáló felszín előnyösen kicsi, mert a nagy kiterjedés korlátozhatná az elérhető felbontást.
A találmány szerinti berendezésben a becsatolóelem példaképpen egy dichroikus aluláteresztő tükörrel van megvalósítva, amely a rövid hullámhosszú fényt visszaveri, míg a hosszabbakat átengedi. A berendezésünkben ez arra való, hogy a holografikus elrendezéshez biztosítsuk a koherens megvilágítást, azt rávezessük a mintára, majd a holografikus érzékelőre (a holografikus megvilágítás fényét a dichroikus aluláteresztő tükör visszaveri), míg a fluoreszcensen emittált fény átjut rajta és a fluoreszcencia-kamera ezen keresztül látja a mérőcellát. A dichroikus aluláteresztő tükör előnyösen az 1. ábrán is látható módon, a közös optikai tengellyel 45°-ot bezáróan van elrendezve.
A találmány szerinti eljárásban a berendezés fentebb bemutatott egyes jellemzői, különösen a leképzőlencsék, szűrők alkalmazása, az érzékelőkben előnyösen alkalmazott felbontások és érzékenységi értékek a találmány szerinti eljárásban a berendezés egyéb jellemzőitől függetlenül is alkalmazhatók.
- 33 A találmány szerinti eljárás és berendezés képes ötvözni az áramlási-citométerek fluoreszcens mérési képességét a holografikus (előnyösen digitális holografikus) felvételekből kiaknázható előnyökkel. Előnyösen digitális holografikus mikroszkópia alkalmazásával a megtalált objektumoknak nagy felbontású, osztályozásra alkalmas képét is rekonstruálni képes oly módon, hogy a holografikus mikroszkóp által felvett képen levő néhány tucat objektumból a fluoreszcencia-kép alapján kijelöli a fluoreszkáló objektumokat.
A találmány természetesen nem korlátozódik a részletesen bemutatott előnyös kiviteli alakokra, hanem további változatok, módosítások és továbbfejlesztések is lehetségesek az igénypontok által meghatározott oltalmi körben.
Claims (18)
1. Eljárás minta fluoreszcencia-vizsgálatára, amelynek során
- a minta egy adott vizsgált mintatérfogatát fluoreszcens gerjesztő fénnyel bevilágítjuk és az adott vizsgált mintatérfogatnak a fluoreszcens gerjesztő fény hatására kibocsátott fluoreszcens emittált fényét leképezve fluoreszcencia-felvételt készítünk, és
- a fluoreszcencia-felvétel készítésével időben átfedő módon az adott vizsgált mintatérfogatról holografikus felvételt készítünk, azzal j e l l e m e z v e, hogy az eljárást minta fluoreszcencia-vizsgálatára szolgáló berendezéssel hajtjuk végre, amely tartalmaz
- a minta egy adott vizsgált mintatérfogatának befogadására alkalmas mintatartó-térrészt (10),
- a mintatartó-térrész (10) fluoreszcens gerjesztő fénnyel való bevilágítására alkalmas egy vagy több gerjesztő fényforrást (12a, 12b),
- a mintatartó-térrészben (10) vizsgálat során tartózkodó adott vizsgált mintatérfogatnak a fluoreszcens gerjesztő fény hatására kibocsátott fluoreszcens emittált fényét leképezve fluoreszcencia-felvétel készítésére alkalmas fluoreszcencia-érzékelőt (14),
- az adott vizsgált mintatérfogatról holografikus felvétel készítésére alkalmas, holografikus fényforrást (16) és holografikus érzékelőt (18) tartalmazó holografikus elrendezést, és a fluoreszcencia-érzékelő (14) és a holografikus érzékelő (18) a mintatartó-térrészhez (10) viszonyítva egymással átellenesen, a mintatartó-térrésszel (10) együtt közös optikai tengelyen vannak elrendezve, valamint
- a holografikus fényforrásból (16) származó tárgyhullámot a közös optikai tengelyre leképező és a mintatartó-térrész (10) felé irányító, a holografikus fényforrás (16) fényét visszaverő és a fluoreszcens emittált fényt átengedő becsatolóelemet (20), és a fluoreszcencia-felvételen fluoreszcens objektum-azonosítási lépést hajtunk végre, és amennyiben a fluoreszcens objektum-azonosítási lépésben az adott vizsgált mintatérfogatban legalább egy fluoreszcens objektumot azonosítunk, akkor
- a legalább egy fluoreszcens objektumhoz a fluoreszcencia-felvételen rendre legalább egy objektum pozíciót rendelünk, valamint
- a holografikus felvételt rekonstruálva rekonstruált holografikus felvételt állítunk elő és a rekonstruált holografikus felvételen a legalább egy objektum pozíció alapján a legalább egy fluoreszcens objektum rekonstruált modelljét azonosítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy átfolyósan mozgó mintát alkalmazunk és rendre az adott vizsgált mintatérfogat kicserélődését követően az eljárás lépéseit legalább egy újabb adott vizsgált mintatérfogatra elvégezzük.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább kettő fluoreszcencia-felvétel elkészítését követően a legutoljára készített fluoreszcencia-felvételből kivonva a fluoreszcencia-felvételek átlagát különbségi fluoreszcencia-képet hozunk létre, és a fluoreszcens objektum-azonosítási lépést a különbségi fluoreszcencia-képen végezzük el.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fluoreszcens objektum-azonosítási lépésben fluoreszcens objektum beazonosításához küszöbértéket alkalmazunk.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az adott mintatérfogat háttér-fluoreszcenciájától függő változó értékű küszöbértéket alkalmazunk.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy
- a fluoreszcencia-felvétel expozíciós idejének (Tf) egy részperiódusában (Tf2) az adott vizsgált mintatérfogatot két, egymástól eltérő hullámhosszú gerjesztő fénnyel világítjuk be, egy másik részperiódusában (Tfi) pedig a két gerjesztő fény közül csak az egyikkel világítjuk be az adott vizsgált mintatérfogatot,
- a fluoreszcens gerjesztő fények hatására kibocsátott fluoreszcens emittált fényt leképezve készítjük a fluoreszcencia-felvételt, és
- a fluoreszcens objektum-azonosítási lépésben legalább egy fluoreszcens objektum azonosítása esetén a legalább egy fluoreszcens objektum objektum-képének a fluoreszcencia-felvételen tapasztalható elmozdulása alapján mindkét részperiódusban (Tfi, Tf2) alkalmazott gerjesztő fénnyel gerjesztett fluoreszcens objektumot és/vagy csak a részperiódusok (Tfi, Tf2) egyikében alkalmazott gerjesztő fénnyel gerjesztett fluoreszcens objektumot azonosítunk.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fluoreszcencia-felvétel elkészítéséhez 40-200 ms expozíciós időt (Tf) alkalmazunk, és/vagy a holografikus felvétel elkészítéséhez 0,5-5 ms expozíciós időt (Th) alkalmazunk.
8. Minta fluoreszcencia-vizsgálatára szolgáló berendezés, amely tartalmaz
- a minta egy adott vizsgált mintatérfogatának befogadására alkalmas mintatartó-térrészt (10),
- a mintatartó-térrész (10) fluoreszcens gerjesztő fénnyel való bevilágítására alkalmas egy vagy több gerjesztő fényforrást (12a, 12b),
- a mintatartó-térrészben (10) vizsgálat során tartózkodó adott vizsgált mintatérfogatnak a fluoreszcens gerjesztő fény hatására kibocsátott fluoreszcens emittált fényét leképezve fluoreszcencia-felvétel készítésére alkalmas fluoreszcencia-érzékelőt (14), és
- az adott vizsgált mintatérfogatról holografikus felvétel készítésére alkalmas, holografikus fényforrást (16) és holografikus érzékelőt (18) tartalmazó holografikus elrendezést, azzal j e l l e m e z v e, hogy
- a fluoreszcencia-érzékelő (14) és a holografikus érzékelő (18) a mintatartó-térrészhez (10) viszonyítva egymással átellenesen, a mintatartó-térrésszel (10) együtt közös optikai tengelyen vannak elrendezve, és
- tartalmaz a holografikus fényforrásból (16) származó tárgyhullámot a közös optikai tengelyre leképező és a mintatartó-térrész (10) felé irányító, a holografikus fényforrás (16) fényét visszaverő és a fluoreszcens emittált fényt átengedő becsatolóelemet (20).
9. A 8. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy tartalmaz a közös optikai tengelyen a fluoreszcencia-érzékelő (14) és a becsatolóelem (20) között elrendezett fluoreszcencia-leképzőlencsét (22).
10. A 9. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy kicsinyítési/nagyítási mértéke beállításával a fluoreszcencialeképzőlencse (22) mélységélessége a mintatartó-térrésznek (10) a közös optikai tengely irányú kiterjedéséhez van megválasztva.
11. A 9. vagy 10. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy a fluoreszcencia-leképzőlencse (22) kicsinyítési/nagyítási mértéke 0,5-1,5 közötti.
12. A 8-11. igénypontok bármelyike szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy tartalmaz a mintatartó-térrész (10) és a holografikus érzékelő (18) között elrendezett holografikus leképzőlencsét (24).
13. A 12. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy a holografikus leképző lencse nagyítási mértéke 1,5-10 közötti.
14. A 8-13. igénypontok bármelyike szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy tartalmaz a közös optikai tengelyen elrendezett
- a fluoreszcencia-érzékelő (14) és a becsatolóelem (20) között elrendezett, a fluoreszcens emittált fényt átengedő emissziós szűrőt (28), és/vagy
- holografikus érzékelő (18) és a mintatartó-térrész (10) között elrendezett, a holografikus fényforrás (16) fényét átengedő első szűrőt (30).
15. Az 8-14. igénypontok bármelyike szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy tartalmaz a gerjesztő fényforrás (12a, 12b) és a mintatartó-térrész (10) között elrendezett, a gerjesztő fényt átengedő gerjesztési szűrőt (26a, 26b).
16. A 8-15. igénypontok bármelyike szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy a gerjesztő fényforrás (12a, 12b) a mintatartó-térrésznek (10) a közös optikai tengelytől eltérő irányból történő bevilágítására alkalmasan van elrendezve.
17. Az 8-16. igénypontok bármelyike szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy több, egymástól eltérő hullámhosszú gerjesztő fény kibocsátására alkalmas gerjesztő fényforrást (12a, 12b) tartalmaz.
18. A 8-17. igénypontok bármelyike szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy a fluoreszcencia-érzékelő (14) 0,5-3 megapixel/25 mm2 felbontású és/vagy a holografikus érzékelő (18) pedig 5-20 megapixel/25 mm2 felbontású.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HUP1600037A HU231357B1 (hu) | 2016-01-25 | 2016-01-25 | Eljárás és berendezés minta fluoreszcencia-vizsgálatára |
| PCT/HU2016/000078 WO2017130009A1 (en) | 2016-01-25 | 2016-12-08 | Method and apparatus for fluorescence analysis of a sample |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HUP1600037A HU231357B1 (hu) | 2016-01-25 | 2016-01-25 | Eljárás és berendezés minta fluoreszcencia-vizsgálatára |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP1600037A1 HUP1600037A1 (hu) | 2017-07-28 |
| HU231357B1 true HU231357B1 (hu) | 2023-03-28 |
Family
ID=89992060
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HUP1600037A HU231357B1 (hu) | 2016-01-25 | 2016-01-25 | Eljárás és berendezés minta fluoreszcencia-vizsgálatára |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| HU (1) | HU231357B1 (hu) |
| WO (1) | WO2017130009A1 (hu) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7158220B2 (ja) * | 2018-09-11 | 2022-10-21 | 浜松ホトニクス株式会社 | 測定装置および測定方法 |
| US20210187503A1 (en) * | 2019-12-19 | 2021-06-24 | Personal Genomics Taiwan, Inc. | Apparatus and system for single-molecule nucleic acids detection |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5162990A (en) * | 1990-06-15 | 1992-11-10 | The United States Of America As Represented By The United States Navy | System and method for quantifying macrophage phagocytosis by computer image analysis |
| DK0980516T3 (da) * | 1997-05-05 | 2003-04-22 | Chemometec As | Fremgangsmåde og system til bestemmelse af partikler i en flydende prøve |
| US8077310B2 (en) * | 2006-08-30 | 2011-12-13 | Accuri Cytometers, Inc. | System and method of capturing multiple source excitations from a single location on a flow channel |
| US9164479B2 (en) * | 2011-09-16 | 2015-10-20 | University Of Massachusetts | Systems and methods of dual-plane digital holographic microscopy |
| EP2602608B1 (en) * | 2011-12-07 | 2016-09-14 | Imec | Analysis and sorting of biological cells in flow |
-
2016
- 2016-01-25 HU HUP1600037A patent/HU231357B1/hu unknown
- 2016-12-08 WO PCT/HU2016/000078 patent/WO2017130009A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2017130009A1 (en) | 2017-08-03 |
| HUP1600037A1 (hu) | 2017-07-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7009699B2 (en) | Method for investigating a sample | |
| US3916205A (en) | Differential counting of leukocytes and other cells | |
| US7420674B2 (en) | Method and arrangement for analyzing samples | |
| JP4670031B2 (ja) | 試料内で励起および／または後方散乱を経た光ビームの光学的検出のための装置 | |
| JP5457262B2 (ja) | 膜電位変化検出装置および膜電位変化検出方法 | |
| CN104515469B (zh) | 用于检查微观样本的光显微镜和显微镜学方法 | |
| US8809809B1 (en) | Apparatus and method for focusing in fluorescence microscope | |
| US8988771B2 (en) | Method for evaluating fluorescence results in a microscope image | |
| JP6790013B2 (ja) | 細胞サンプルのサイトメトリー解析方法 | |
| US20230384223A1 (en) | Method and fluorescence microscope for determining the location of individual fluorescent dye molecules by means of adaptive scanning | |
| JP2009537021A (ja) | 蛍光顕微鏡法におけるレーザー照射システム | |
| EP3532822B1 (en) | Trans-illumination imaging with use of interference fringes to enhance contrast and find focus | |
| CN103091297A (zh) | 一种基于随机荧光漂白的超分辨显微方法和装置 | |
| US20200033192A1 (en) | Method and Apparatus of Filtering Light Using a Spectrometer Enhanced with Additional Spectral Filters with Optical Analysis of Fluorescence and Scattered Light from Particles Suspended in a Liquid Medium Using Confocal and Non Confocal Illumination and Imaging | |
| US20230384224A1 (en) | Methods and apparatus for light-microscopic multicscale recording of biological specimens | |
| US20200379227A1 (en) | Method For Analyzing Fluorescent Particles in an Immunoassay | |
| CA2531563A1 (en) | Analysing biological entities | |
| JP7472134B2 (ja) | 試料の３次元領域の蛍光信号を検出するための方法および装置 | |
| JP2005037388A (ja) | 試料内で励起された、および／または後方散乱した光放射を、対物レンズ二重配置により光学的に捕捉するための配置およびその方法 | |
| US11199500B2 (en) | Method and microscopy system for recording a microscopic fluorescence image of a sample region containing a biological sample | |
| US20140022373A1 (en) | Correlative drift correction | |
| Hibbs et al. | Practical confocal microscopy | |
| HU231357B1 (hu) | Eljárás és berendezés minta fluoreszcencia-vizsgálatára | |
| Dunn et al. | Ratio imaging instrumentation | |
| NL1040008C2 (en) | Optical and integrated inspection apparatus and method. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HC9A | Change of name, address |
Owner name: SZAMITASTECHNIKAI ES AUTOMATIZALASI KUTATO INTEZET, HU Free format text: FORMER OWNER(S): MTA SZAMITASTECHNIKAI ES AUTOMATIZALASI KUTATO INTEZET, HU |