JP2005037388A - 試料内で励起された、および／または後方散乱した光放射を、対物レンズ二重配置により光学的に捕捉するための配置およびその方法 - Google Patents

Abstract

【課題】試料内で励起された、および／または後方散乱した光線の光学的捕捉のための配置および方法を提供する。
【解決手段】試料Ｓへの照明Ｌおよび／または試料光の検出が、試料Ｓの異なった側に配置された少なくとも２つの対物レンズＯを通して行なわれ、試料照明光が、少なくとも１つの軸の中に位置する試料平面と捕捉平面との間にある光路のひとみ平面Ｐに、またはひとみ平面近くにフォーカシングされ、この平面に照明光を検出光から空間分離するための手段を配備する。
【選択図】図１

Description

本発明は顕微鏡法の中で、特に蛍光顕微鏡法、レーザ走査型顕微鏡法、蛍光相関分光計法および走査型近傍界顕微鏡法の中で、主として生物学の試料、プレパラートおよび付随する成分を検査するための方法に関する。それと共に、作用物質をスクリーニングするための蛍光検出に基づく方法（ハイ・スループット・スクリーニング）も含まれる。多重蛍光により試料を両側からリアルタイムで同時に照明および／または検出することによって、試料を同時検査することが可能となる。

生物学プレパラートを検査するための光学顕微鏡の古典的な利用分野の１つに、蛍光顕微鏡法（文献：ポーリー（Ｐａｗｌｅｙ）「生物学共焦点顕微鏡法ハンドブック」；Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９５５）がある。そこでは特定の色素が細胞部分を個別に標識付けするために使用される。
色素の励起は多くは高エネルギー光子の吸収を介して行われる（一光子励起）。高エネルギー光子による色素分子の励起と並んで、数個のより小さいエネルギーの光子による励起も可能である。この種の色素励起は多光子吸収と名づけられている（文献：コルル、キノ（Ｃｏｒｌｅ、Ｋｉｎｏ）；「共焦点走査型光学顕微鏡法と関連画像システム」；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９６）。

厚いプレパラートを検査するためには、特にＤＥ１９７０２７５３Ａ１に記述されているようなレーザ走査型顕微鏡が適している。三次元に照らし出された像から、対応する一光子もしくは多光子吸収と結合した特別な検出配置によって、対物レンズの焦平面内に存在する平面（光学的断面）のみが再生される。続いて、コンピュータ支援のもと、数枚のｘ−ｙ平面内の光学的断面をさまざまな試料の深さｚで描画することにより、試料の三次元像を生成することができる。

従来技術としていわゆる線形スキャナが知られている（文献：コルル、キノ（Ｃｏｒｌｅ、Ｋｉｎｏ）；「共焦点走査型光学顕微鏡と関連画像システム」；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９６）。これの原理的な構成は本質的にＬＳＭに対応する。しかしながら、点焦点の代わりに線が試料内へ結像し、検査すべき試料は一方向のみに走査される。点の代わりに線を走査することによって、画像撮影レートを大幅に増加させることができる。それゆえこの走査法は、高速経過プロセスをリアルタイムで観察する（リアルタイム顕微鏡）ために使用できる。ＤＥ７５０５には線形スキャナについて別の方法および配置が記述されている。

従来技術に基づくリアルタイム顕微鏡のための別な配置では、完全な検査対象のフィールドは拡大光源により照明される。しかしながら、走査すべき全フィールドのうち特別な点パターンだけは、高速回転ディスクによって処理される。これらの方法に関する文献では、多くニポウディスクと名づけられる（文献：コルル、キノ（Ｃｏｒｌｅ、Ｋｉｎｏ）；「共焦点走査型光学顕微鏡法と関連画像システム」；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９６）。

従来技術に基づく別の方法、いわゆる構造化照明法では、振幅構造（たとえば格子）の光学結像における変調深度を像鮮明度の基準として利用する。詳細な記述については、Ｔ．ウィルソン（Ｔ．Ｗｉｌｓｏｎ）他「従来型顕微鏡内で構造化された光を使うことにより光学的な区分化を得る方法」；Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２（２４）１９９７を参照。

従来技術から、二つの対物レンズを持つさまざまな配置が知られている。それらは以下のことを可能にする：
１）色素蛍光の効果的な収集（ＤＥ１９９４２９９８参照）
２）レーザ走査型顕微鏡−４ Ｐｉ顕微鏡内で点形の試料照明により光学的分解能を高めること（文献：シュラーダー（Ｓｃｈｒａｄｅｒ）他；Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｏｌｕｍｅ ７５， Ｏｃｔｏｂｅｒ １９９８， １６５９−１６６８）
３）コヒーレント試料照明を有する広視野顕微鏡、いわゆる定在波顕微鏡内で光学的分解能を高めること（Ｆ．ランニ（Ｌａｎｎｉ）、生医学における蛍光の応用、第１版、Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８６）
４）非コヒーレント試料照明を有する広視野顕微鏡、いわゆる１２Ｍ，１３Ｍおよび１５Ｍ内で光学的分解能を高めること（Ｍ．Ｇ．Ｌ．グスタフソン（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ）、Ｄ．Ａ．アガード（Ａｇａｒｄ）、Ｊ．Ｗ．セダト（Ｓｅｄａｔ）、「１００ｎｍ以上の軸方向分解能を有する１５Ｍ：３Ｄ広視野光学顕微鏡」、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．（Ｏｘｆｏｒｄ）１９５，１０−１６（１９９９））
ＤＥ１９７０２７５３Ａ１ ＤＥ７５０５ ポーリー（Ｐａｗｌｅｙ）「生物学共焦点顕微鏡法ハンドブック」；Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９５５ コルル、キノ（Ｃｏｒｌｅ、Ｋｉｎｏ）；「共焦点走査型光学顕微鏡と関連画像システム」；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９６ Ｔ．ウィルソン（Ｔ．Ｗｉｌｓｏｎ）他「従来型顕微鏡内で構造化された光を使うことにより光学的な区分化を得る方法」；Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２（２４）１９９７

従来技術に基づく方法の短所：
４Ｐｉ顕微鏡は、点走査の方法としては作業が遅く、横方向の構造化およびそれによる横方向の分解能増強が可能でない。
広視野法は、対象物情報の明確な分類のために非コヒーレント光源を必要とする。さらに、空間フィルタリング（共焦点性）の使用ができず、そして厚い試料の場合、それにより信号対雑音比を悪化させる高い信号バックグラウンドが存在する。さらに、非線型試料相互作用にとって高いピーク強度を漂白なしに達成することが、照明平面が大きくないことから困難である。

対物レンズ二重配置内で、励起光を試料放出光から分離することが、従来技術に基づき、ストークスシフト利用の下でスペクトル分離することにより、あるいは試料の照明／検出に使用される光学系の開口数を減少させることにより、もしくはさまざまな偏光方向に分割することによって行われる。従来技術の詳細については、非特許文献１（ポーリー（Ｐａｗｌｅｙ）「生物学共焦点顕微鏡法ハンドブック」（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９５５））を参照。

従来技術に基づくすべての方法、特に対物レンズ二重配置使用時の短所としては、励起光の試料放出光からの分離が、対物レンズ二重配置内では波長に依存して、または典型的には―必要なスペクトル特性および照明線の数に依存して―７０％ないし９０％への効率低下でなされる点である。色素蛍光の励起にさまざまな波長が使用されれば、フィルタは、それ相応に適合もしくは交換されなければならず、そのため光学配置の追調整が特に対物レンズ二重配置内の光線の干渉性重畳があるところで必要となる。

加えて従来技術に基づく方法は、光線が光学分離素子に大きな傾斜で当たる光学システムにおける使用には適していない。それは、これによってたとえばダイクロイック・ビームスプリッタのところでスペクトル特性が変わったり、または偏光スプリッタのところで偏光分割の効率が悪化したりするからである。

ＤＥ１０２５７２３７Ａ１に基づく方法および配置に、本発明に従って二対物レンズ構成を使用した場合について述べる。それによると、非常に有利なことに、試料内で励起され、および／または後方散乱する光放射（たとえば蛍光／ルミネセンス）から励起光を高い効率で分けることができる。特別な素子の使用により、コヒーレントな試料照明および非コヒーレントな試料検出の固有特性は利用し尽くされる。この場合、分離が、従来技術とは違って使用される波長に依存せず、したがって特に多蛍光顕微鏡法での使用に、すなわちさまざまな色素の同時励起に特に適している。

さまざまな励起波長もしくは分光学的検出波長領域を使用する場合、特にＥＰ９７７０６９Ａ２に記述されているようないわゆるマルチトラッキングにおいて、励起放射を検出放射から分離するための素子の機械的切り替え、およびしばしばこれに付随する、使用時の光学配置の追調整は必要がない。
さらに、試料から検出器の方向に散乱した光を、直接路で反射した光から分離することも可能である。特に、励起光放射を試料内で励起されおよび／または後方散乱した光放射から分離するための素子は、強いビーム傾斜角が現れる場所への組み込みに適している。
光学的分解能は、本発明に基づく配置を取ることで、励起光路を検出光路から分離するための従来技術に基づく配置に比べ悪化することはない。
さらに、試料相互作用の場所における照明配分は手動操作でできる。これによっていわゆる関心域（ＲＯＩ）がリアルタイムで走査できる。加えて広視野顕微鏡法から知られている、たとえば傾斜照明のような照明法が実現できる。

本発明はさらに、４Ｐｉまたは１５Ｍ配置に付随する短所を克服し、それと共に点走査法の長所を広視野法の長所と統合し、横方向および軸方向の分解能を最大限アップさせることを課題としている。
たとえばいわゆるチップリーダなど、色素をスクリーニングするための配置は、その光学的構成においてレーザ走査型顕微鏡に似ている。

しかしそれらは、巨視的試料の検査のため、明らかに大きな像フィールドを走査し、たとえばバイオチップ上の作用物質をスクリーニングする。走査フィールドのエッジの長さは、この場合数十ミリメートルである。これらの走査フィールドは、たとえばガルボスキャナの走査角の拡大によって、顕微鏡配置の中間像内にある試料の配置によって、または中間像を試料上へ拡大結像させる特別な対物レンズ配置（マクロ対物レンズ）によって達せられる。

貫流細胞計が細胞およびその他粒子の検査および分類に使用される。細胞はこのため液状に溶かされていて、毛細管によってポンピングされる。細胞検査にはレーザビームを横から毛細管内へフォーカシングする。細胞はさまざまな色素または蛍光性の生分子により着色されている。測定されるのは励起された蛍光および後方散乱した励起光である。

試料蛍光信号の励起光からの分離はダイクロイック・ビームスプリッタにより行われる。従来技術は「貫流細胞計法と分類」、第２版、Ｍ．Ｒ．メラメド（Ｍｅｌａｍｅｄ）、Ｔ．リンドモ（Ｌｉｎｄｍｏ）、Ｍ．Ｌ．メンデルゾーン（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ）、Ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０，ｐｐ８１−１０７に記述されている。

本発明に基づく解決法は、像形成顕微鏡法システムにも、解析顕微鏡法システムにも使用可能である。顕微鏡システムは、生物学プレパラートを光学的分解能２００ｎｍまでで三次元検査するためのレーザ走査型顕微鏡、表面を１０ｎｍまでの分解能で高分解能検査するための走査型近傍界顕微鏡、分子濃度を定量的に決定するための、および分子拡散を測定するための蛍光相関顕微鏡のような像形成システムである。
さらに、色素をスクリーニングするための蛍光検出に基づいた方法、および貫流細胞計法のための方法が含まれている。
前記システムのすべてには、プレパラートを個別に標識付けするための蛍光色素が使用される。
前記課題は、独立特許請求項に基づく方法および配置によって解決される。好ましい別な態様は従属請求項の対象である。

本発明に基づく方法によって、同時に使用可能な色素の特色数、すなわち同時に検査可能なたとえば細胞の特性数を多くすることができる。強く重なり合う、もしくは互いに近接して存在する個別色素のスペクトルの特色については、従来技術に従えば、個々の色素の蛍光信号を別々に検出するために、検出される波長領域または開口数が制限されなければならない。これによって検出感度は低下し、すなわちより高い増幅の利用が必要なので、検出器の雑音が高められることとなる。これは本発明に基づく方法および配置によって阻止される。

以下に、試料内で励起され、および／または後方散乱した光放射（以下検出光）が、非常に効率的にかつ波長に依存することなく、対物レンズ二重配置内の励起光から分離される、さまざまな配置についてより詳しく説明する。それゆえそれらの配置は特に高速なマルチトラッキングに適している。試料内で励起された光放射は、以下では、主として大きな立体角で試料から射出される無指向性の光のことをいう。これは特に試料内で励起された蛍光およびルミネセンス光である。

１．対物レンズ二重配置による広視野照明および広視野観察
図１は模式的に本発明に基づく対物レンズ二重配置を有する広視野顕微鏡用配置を示す。
広視野顕微鏡においては、試料は、ほとんどの場合、広いスペクトル帯域幅の光源により、検査すべき視野内にある試料の数点において、同時に２つの側面から均一に照明され、および／または試料信号が検出される。このため光源Ｌは、顕微鏡装置のひとみ内へ、すなわち各対物レンズの後方焦平面の中またはその近くへ、または各対物レンズの後方焦平面に共役な平面（記入符号はそれぞれ後方焦平面Ｐ１（ひとみ））内に、各１基の光学系ＴＬを介して焦点を結ぶ。

２つの側面からプレパラートを照明する場合の光源放射の分割はスプリッタＴによって行われ、それはたとえば固定または可変の分割率を有する偏光分割器または中性分割器として形成することができる。偏光分割器が使用されるならば、両ビームアームが同一の偏光を有するように、偏光は１本の光路内で１ラムダ／２プレートを介して回転させられる。光源の光は、後方の焦点が正しくＰにある各１基の別の光学系Ｏによって、たとえば顕微鏡対物レンズによって、平行ビームで検査すべき試料Ｓ内へ２つの側面から結像する。破線で示した線は照明光路を示す。

たとえば蛍光励起の場合、観察光路は、実線で示されている。試料相互作用の種類に基づき、たとえば蛍光励起またはルミネセンス励起の場合、試料から射出された光は小さい空間コヒーレンスを有し、すなわち試料内で励起された各点は、本質的には隣接する点に依存せず点放射器として全空間方向へ射出する。

光学系Ｏ（たとえば顕微鏡対物レンズ）は、鏡筒レンズＴＬ２と共に、および必要ならリレー光学系ＲＬにより、個々の点放射器を顕微鏡装置の中間像平面ＺＢ内へ結像させる。その場合ひとみＨＦＴ／Ｐは、さまざまな伝播方向の互いに非コヒーレントな波面により一様に照らし出される（実線／光路）。

中間像平面内では、従来技術から知られているように、ＣＣＤカメラまたは接眼レンズを試料の検出および／または観察に使用することができる。検出器の前にはビーム結合器Ｃが、両光学系Ｏによって集められた試料信号を空間的に重ね合わせるために存在する。
光路の重ね合わせは、直接検出器上でもひとみの分割によって行うことができる。蛍光またはルミネセンスを撮像するとき、試料から後方散乱する励起光を抑制するために、放出フィルタ（ダイクロイック・フィルタ）Ｆが旋回挿入される。

ひとみＨＦＴ／Ｐ内には、図３Ｂに示される、ＤＥ１０２ ５７ ２３７Ａ１対応の本発明に基づく、励起光と検出光との分離用素子ＨＦＴが存在する。ＨＦＴは白で示した領域ＨＲでは完全反射する。灰色で示した、特にＸＹ座標原点のまわりの領域ＨＴは、試料信号が射出する波長領域について高い透過性を持つ。最も単純な場合、ＨＲ領域は小さい鏡とすることができる。

本発明によれば、ＨＲ領域に励起光が焦点を結ぶ。試料から直接路で反射した光は、再び特にＨＲ領域を通じて光源へ到達する。試料から拡散、散乱した励起光および／または試料内で励起された光は、ＨＦＴに、その全表面に対する顕微鏡光学系のひとみの大きさに応じて当たるが、その場合ＨＴ領域上へ当たっている成分はレフレクタＭ１／Ｍ２により方向ＴＬへ偏向し、中間像ＤＥ／ＺＢ内での観察に提供される。この配置ではＭＤＢにおいてＨＲ領域上へ当たった検出光の成分のみが失われることになる。

ＨＴ領域のＨＲ領域に対する面積比率：
Ｒ＝（Ａ_{Ｐｕｐｉｌｌｅ}−Ａ_ＨＴ）／Ａ_{Ｐｕｐｉｌｌｅ}＝（ｒ_{Ｐｕｐｉｌｌｅ} ^２−ｒ_ＨＴ ^２）／ｒ_{Ｐｕｐｉｌｌｅ} ^２
ただし、広視野顕微鏡のＨＴ領域の半径は、典型例では約５ｍｍで、ＨＲ領域は約＜０．５ｍｍである。それゆえ比率について、つまりＭＤＢのビーム分割効率はＲ＝９９％になることがわかる。この効率は使用される波長に依存しない。

２．対物レンズ二重配置および試料信号の戻り反射による広視野での試料の照明および検出
図２に、対物レンズ二重配置および試料信号の戻り反射による広視野での試料の線状照明および検出に関する、本発明に基づくさらに別な配置の概要が図示されている。破線は照明光線の光路を示し、図１における光路と同一である。
試料Ｓからあらゆる空間方向へ放射される光は対物レンズＯにより集められる。図２においてＨＦＴの方向に放射された試料の光はＨＦＴおよびミラーＭ１を経て直接路で検出器ＤＥへ向かう。ミラーＭ２の方向に放射された光はＭ２によって反射され、試料を通過して検出器ＤＥに到達する。照明光の取り込みのためにミラーＭ２の上に傾斜した反射領域１があり、これによってＴＬの方向から来る照明光が対物レンズＯの方向に導かれる（図２のＭ２の拡大図参照）。
この配置は特に、あらゆる空間方向に放射する、ＤＥ１９９４２９９８に対応した試料信号の効率良い収集に適している。

３．対物レンズ二重配置による広視野での試料の線状照明および検出
図４に、対物レンズ二重配置における広視野での試料の線状照明および検出に関する本発明による配置の概略を示している。実線は照明光線の光路を表わす。
ラインスキャナの場合、試料ＳはたとえばＸ軸に沿った線焦点で照明される。線焦点はラインと垂直の座標で移動する。そのため、光源Ｌは光学系ＺＬによって中間像面あるいは顕微鏡装置のひとみに線状にフォーカシングされる。

たとえばシリンダレンズなどのＺＬによってＹ方向でのひとみＰ結像により、試料平面には、回折限界による線状の強度分布がＸ軸に沿って現れる。試料上のＸ軸に沿った線形の強度分布は、さらに、従来技術に基づき回折素子あるいはホログラフィック素子によって達成することができる（文献：「回折光学系による製品設計の改善」フォトニクス・スペクトラ（Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｓｐｅｃｔｒａ）、ローリン（Ｌａｕｒｉｎ）出版社、１９９５年９月）。

さらにＵＳ４８２６２９９に記述されているように、いわゆるパウエルレンズも適用できる。パウエルレンズはシリンダレンズと比較して、たとえばシングルモードレーザに典型的なガウス曲線形の照明強度分布の場合、ラインに沿ってより均一な強度分布をもたらす。パウエルレンズおよび回折素子あるいはホログラフィック素子はここでたとえば光源とスキャナとの間の顕微鏡装置のひとみ面に配置すると特に有利である。

試料Ｓを２方向から照明するために光源ＬをスプリッタＴを用いて２つの光路に分割する。両光路は顕微鏡配置のひとみにあるスキャナＳＣ／Ｐ（完全反射ミラー）の反対側に当る。ミラーＭ５およびＭ６によってこの２つの照明光線の光路間の遅延を調節できる。スキャナＳＣは図５のようにビーム結合器の前に配置することもできる。

もう一方の光学系ＴＬによって光は顕微鏡配置のひとみＨＦＴ／Ｐに結像する。顕微鏡配置のこれらひとみの面にはＹ軸に沿ってそれぞれ線焦点ができる。このひとみ面は相互に、また対物レンズの逆方向の焦点面に対しても共役な顕微鏡装置の平面であり、それによってスキャナＳＣが線状で回折限界により焦点を結んだ強度分布をこれに垂直に（試料のＹ座標に）動かすことができる。Ｐの試料中への結像は操作光学系ＳＯ、鏡筒レンズＴＬ、対物レンズＯを通じて行われる。

素子ＨＦＴ／ＰもＹ方向に線焦点をスキャンするためにスキャナの上に配置することができる。この配置の場合、光学系ＴＬおよびＳＯは省略できる。ライン形成のための透過性光学系ＺＬは原理的には、たとえば焦点がＳＣ／Ｐの上にあるシリンダミラーのような反射性素子に置き換えることもできる。シリンダミラーは図４に描かれているｘｚ平面に４５°で配置される。ミラーはまたこの面に焦点を合わせる作用を持つ。さらにミラーにより光路は光源に対して９０°転向させられる。

たとえば観察用光路は、蛍光励起の例では破線で表してある。たとえば蛍光励起あるいはルミネセンス励起の場合、試料相互作用の種類に基づき、試料からの放出光は空間コヒーレンスが少ない。すなわち刺激を受けた試料の各点は隣接する点とは基本的に無関係に点放射体としてあらゆる空間方向に放射する。

光学系Ｏ（たとえば顕微鏡対物レンズ）は鏡筒レンズＴＬとともに各点放射体を顕微鏡装置の中間像面に結像させる。その場合、ひとみＨＦＴ／Ｐは同じ形をした基本的に互いにインコヒーレントな、さまざまな広がり方向を持つ波面により照明される（実線の光路）。続いて、試料の光は光学系ＴＬ２によりＣＣＤカメラＺＢ／ＤＥ上の中間像（たとえば顕微鏡のＴＶポート）に伝送され、測定される。これにはたとえば蛍光寿命の３Ｄ分解測定用の時間ゲートを有するカメラなど特殊なＣＣＤカメラを使用することができるという利点がある。試料の観察光はＨＦＴ／Ｐで透過され、ＺＢ中に配置されている検出器ＤＥにより検出される。

線焦点はガルボスキャナＳＣにより、ある空間方向に走査される。蛍光あるいはルミンセンスの撮影の際に試料から後方散乱される励起光を抑制するために放出フィルタ（ダイクロイックフィルタ）Ｆを旋回挿入する。

ひとみＨＦＴ／Ｐには図３Ａに示すＨＦＴ素子があり、これは励起光と検出光との分離を行う。この素子の機能は図３Ｂに示す素子に類似している。その違いは単にＨＲ領域の直線状の部分の形成だけである。本発明によりＨＲ領域上に励起光がフォーカシングされる。試料から直接光路に反射した光は再び光源方向へ、特にＨＲ領域に達する。試料の中でランダムに散乱した励起光あるいは励起された光またはその両方が、ＨＦＴに、その全体に対する顕微鏡光学系のひとみの大きさに相応して当たるが、その場合ＨＴ領域に当たる部分は観察のために中間像ＤＥに到達する。

ＨＴ領域のＨＲ領域に対する面積比は次式で与えられる。
Ｒ＝（Ａ_{Ｐｕｐｉｌｌｅ}−Ａ_ＨＴ）／Ａ_{Ｐｕｐｉｌｌｅ}＝（π・ｒ_{Ｐｕｐｉｌｌｅ}−２・ｂ_ＮＴ）／π・ｒ_{Ｐｕｐｉｌｌｅ}
ここで顕微鏡におけるＨＴ領域に対するひとみの半径は典型例では約５ｍｍで、ＨＲの幅は約ｂＨ＜０．２５ｍｍである。これにより比およびそれに伴う光線の分配効率はＭＤＢ波長に関係なくＲ＝９７％である。前述の配置によっても上述の操作方法が実現できる。ビーム分割およびビーム結合は上述のようにスプリッタＴ、統合器Ｃ、およびＤ１あるいはＤ２またはその両方の遅延調整により行う。

４．試料の線状照明および二重対物レンズによる線状検出
図５に試料の線状照明および二重対物レンズによる試料の信号線状検出を行う、本発明による配置が示されている。これには検出用にラインセンサを使用できるという利点がある。これに加えて、試料信号をスペクトル分解して検出が可能であり、またＤＥ１０１５５００２によって開示されている、配置に対応した特別な試料照明方法を適用することができる。

照明光線の光路は図４と同様である。ただしビーム分割および光路（１）と（２）の合成は中間像Ｔ／ＺＢで行う。さらにこの中間像においてスプリッタＴにより観察光から励起光の空間分離を行う。これによって観察光が走査光学系ＳＯ、ミラーＭ、スキャナＳＣ、さらに光学系ＰＯを経て、主として顕微鏡配置の中間像の位置にあるライン検出器ＤＥ／ＺＢに到達する。ひとみＴ２／Ｐにおいて観察光が必要な場合励起光から分離され、その結果観察光が中間像にある素子Ｔの上で励起光（０）の外側の領域（１）および（２）に落ちる。

図３ＣにスプリッタＴ２の概略図を示す。このスプリッタは互いに角度をなす２つの反射領域Ｒ１およびＲ２を有する。励起光は主にＲ２領域に、また観察光は主にＲ１領域に当たる。素子Ｔ２は光路（１）と（２）においてそれぞれ互いに回転して置かれており（図３Ｃにおけるｘｙ平面に対する垂直な軸の周りに１８０°）、その結果観察光はスプリッタＴ／ＺＢ上で励起光の上下の領域（１）および（２）に主に配置される。スプリッタＴ／ＺＢは（図の下部を参照）領域（０）においてたとえば分割率５０／５０の中性スプリッタ、偏光スプリッタあるいは振幅格子により励起光の分割が起こるように構成されている。領域（２）は透明であり、領域（１）は少なくとも観察光に対しては完全反射する。これらの領域は、ＳＣによる走査ラインの走査運動では領域の重畳が起こらないように、大きなサイズになっている。

検出器ＤＥ上には光路（１）と（２）に対するそれぞれの中間像（線焦点）ができる。これは主にライン検出器上に細長いピクセルで当たる。共焦点検出器はそれぞれスリット絞りＳＢ（スリットが図平面の長手方向になる位置）により光路（１）および（２）について焦点を結ぶようにでき、これによって焦点外に生じる検出光は抑制される。スリット絞りの後ろには、位置解像する（線焦点に沿って）ライン検出器または面検出器ＤＥがあり（線がスリット絞りの向きに沿う位置）、これが試料で励起された、および／または後方散乱した光線を検出する。

検出器上で両方の中間像を重畳するのは上述のひとみ分割（［００２５］［００２６］）により、あるいはライン検出器に垂直な座標におけるひとみの結像により行うことができる。後者に対してはできるだけ光学系ＰＯ（図５）を２個のシリンダ光学系に置き換えることが必要で、その際に１つのシリンダ光学系がＤＥ上に中間像を結像し、２つ目のシリンダ光学系により検出器上に受光器ラインとは垂直にひとみＳＣ／Ｐが結像する。検出器上に両方の観察光路（１）および（２）を重畳させることは、干渉法による試料信号の測定を行う場合特に必要である。この配置においては共通の干渉計を通じて照明光および観察光の結像するのが特に有利であり、それによって高い安定性が実現できる。

５．対物レンズの二重配置およびベンチスキャナあるいは二重スキャナによる試料の線状照明および線状検出
図６に、対物レンズ二重配置による試料の線状照明および線状観察のためのまた別の配置が示されている。図５の配置との違いは試料のスキャナの構成にある。試料スキャナは、この配置ではベンチスキャナ（左に示されている）（これは試料を光学軸に対して横方向に動かす）によって、あるいはそれぞれＴ２のところにある２個の、好ましくは同期して動くスキャナにより実現される。顕微鏡配置でもう１つのひとみ面が不要になるので簡易な構成になる。加えて、素子Ｔ上の領域（０）から（２）のｙ方向の広がりを縮小することができる。

６．構造化された照明および対物レンズ二重配置による照明および観察
図１から図６の本発明による配置を用いて、さらに構造化した照明による線状照明および線状観察の広視野顕微鏡あるいは顕微鏡を作ることができる。
光源Ｌの光はここでも前出のように同じ強度の２個の部分光線に分割されるが、試料Ｓに小さな角度（通常５°未満）をなして当たるので、試料に強度変調すなわち正弦波状の干渉構造が生じる。それには、たとえば図５の少なくとも１個のＴ２／Ｐをｙ軸の周りに回転させる。

強度変調を発生させるその他の方法として、スプリッタＴ（たとえば顕微鏡配置の中間像にある）を振幅格子（５０／５０変調のものが望ましい）で発生させる。その場合、図５において、たとえばスプリッタＴの領域（０）に振幅格子が挿入されなければならない。引き続き、両方の光路を経て試料Ｓへ結像される強度変調は、たとえば少なくとも１個のＴ２／Ｐを、たとえばの図５においてｙ軸の周りで傾斜させることにより試料内で重畳させることができる。この強度変調発生方法の利点は、波長とは関係なしに、偏光と無関係の両部分光が無損失で発生し得る点にある。
また別な方法で複数の振幅格子あるいは位相格子を顕微鏡装置の中間像に置くことができる。中間像は追加の中継光学系（図示してない）により、たとえば図５のＴＬとＬとの間に作られる。

強度変調の位置は少なくとも１個のＨＦＴを、たとえば図５のように、ｙ軸の周りに追加傾斜させることによって移動できる。こうしていろいろな投影方法で作られた位相像は、引き続き、たとえば（共焦点の）光学的断面像として、様々な従来技術のアルゴリズムによりイメージプロセッサで計算し、モニタ上に表示することができる。

本発明に基づく配置ではいずれの場合も領域ＨＴとＨＲの反射特性を入れ替えることもできる。その場合ではＨＲ領域は高い透過性となる。ただしここでは、たとえば図１において光源ＬからのＨＦＴの光路はＨＦＴから検出器ＤＥに至る光路と入れ替えねばならない。さらに、偏光した励起光を使用する場合の素子は偏光性素子とすることもできる。これに関してはＤＥ１０２５７２３７Ａ１も参考になる。

本発明による配置を用いていろいろな操作方法が実現できる。
ａ）試料の照明は同時に２つの側から、照明光線の干渉性重畳付き、あるいはなしで行うことができる。光路の調整は、好ましくはＤ１の移動による遅延によって行える。スプリッタＴは、好ましくは照明光線が試料の照明のために均等に分割されるように調整する。

ｂ）試料信号の検出は同時に２つの側から、試料の１点から送出された試料信号の干渉性重畳付き、あるいはなしで行うことができる。検出光路における光路の調整は主にＤ２の移動による遅延によって行える。試料信号の検出のための光路は、好ましくは検出器ＤＥに同じ信号の強さで到達するように構成される。

ｃ）ａ）とｂ）の操作方法は組み合わせることができる。図４から図６に対応する試料の線状照明による配置と上述の操作方法とも組み合わせると、４Ｐｉあるいは１５Ｍ配置に由来する欠点を克服することができ、横方向および軸方向の最大の分解能向上が期待できる。特に有利なのは照明に長いコヒーレンス長をもつ光源が使えることである。これにより横方向および軸方向に、最大のコントラスト（ほぼ１００％の変調度）を有する構造化が行えるという利点がある。

軸情報を１対１に対応して分類可能にするためには、軸方向の構造化がごく限定された範囲しか現れてはならない。従来技術（１２Ｍ、１３Ｍ、１５Ｍ）による広視野照明の方法では試料のインコヒーレントな照明が用いられている。コヒーレントな光源を広視野照明に用いるいわゆる定在波顕微鏡では、軸方向の試料情報を１対１対応で分類することは不可能であるが、これは甘受される。

その反面、図４から図６までによる試料の線状照明では、焦点範囲の外側に離れて落ちる変調強度、つまりフォーカシングされた照明により、軸方向の構造化に制約が生じる。その場合以下のような光学的分解能が得られる。
１） 操作方法ａ）を用いた場合、１２Ｍの配置と同等
２） 操作方法ｂ）を用いた場合、１３Ｍの配置と同等
３） 操作方法ｂ）を用いた場合、１５Ｍの配置と同等

線状照明の場合では、従来技術と比較して、特にコヒーレントな光源および試料信号の線状検出により以下のような利点がある。
・平行処理の本発明方法は点走査処理よりも明らかに高速である。
・平行な光束を試料に対して傾斜させることにより横方向および軸方向の構造化が容易に可能になるので、光路への要求が緩和される。
・ＬＳＭに匹敵し、また検出側に面検出器を用いることにより大きなフレキシビリティを有する検出モジュールが使用できる。たとえばマトリックス検出の場合、ある軸で試料信号のスペクトル情報を、またそれに垂直な軸では試料の位置情報を測定することができる。
・散乱光の抑制強化のために、追加調節可能な空間フィルタリングをスリット絞りにより実現でき、これによって特に厚い試料の場合における動力学検出領域が大きくなる。
・試料との非線形の相互作用あるいは相互作用の飽和化には、少なくとも１つの軸における試料照明のフォーカシングに基づく高いピーク強度が提供される。
・互いに向き合っている対物レンズの光路を傾けることにより横方向および軸方向の構造化が実現できる。

さらに、たとえば図１でレンズＴＬを光軸に対して垂直に少し動かすことにより、試料に当たっている照明の角度を変えることができる。それによって設定に応じて、たとえば傾斜照明あるいは暗視野照明などいろいろな照明方法が実現できる。
原則的には、スキャナＳＣの機能は、少なくとも１つの面においては、これに相当するベンチスキャナ（対物スキャナ）に置き換えることができる。

本発明に基づく対物レンズ二重配置を有する広視野顕微鏡用配置 対物レンズ二重配置および試料信号の戻り反射による広視野での試料の線状照明および検出に関する本発明に基づく別な配置 ＨＦＴ素子（Ａ）（Ｂ）、スプリッタＴ２の概略図（Ｃ） 対物レンズ二重配置における広視野での試料の線状照明および検出に関する別の配置 試料の線状照明および二重対物レンズによる試料の信号線状検出を行う別の配置 対物レンズ二重配置による試料の線状照明および線状観察のための別の配置

符号の説明

Ｐ１ 焦平面
Ｌ 光源
Ｔ スプリッタ
ＴＬ 光学系
ＴＬ２ 鏡筒レンズ
ＲＬ リレー光学系
Ｏ 対物レンズ
Ｓ 試料
ＨＦＴ／Ｐ ひとみ
Ｍ１，Ｍ２ レフレクタ
Ｔ／ＺＢ スプリッタ
ＤＥ／ＺＢ ライン検出器
ＺＬ 光学系
ＳＢ スリット絞り
ＳＣ スキャナ
ＳＯ 操作光学系
ＺＢ 中間像平面
Ｒ１，Ｒ２ 反射領域

Claims (45)

1. 試料内で励起された、および／または後方散乱した光線の光学的捕捉のための配置であって、
   試料への照明および／または試料光の検出が、試料の異なった側に配置された少なくとも２つの対物レンズを通して行なわれ、
   試料照明光が、少なくとも１つの軸の中に位置する試料平面と捕捉平面との間にある光路のひとみ平面に、またはひとみ平面近くにフォーカシングされ、この平面に照明光を検出光から空間分離するための手段が配備されている配置。
2. 試料から出る蛍光および／またはルミネセンス光および／またはりん光および／または拡散、散乱した照明光が検出される請求項１に記載の配置。
3. コヒーレントな試料照明光が少なくとも部分的にはインコヒーレントな試料光に変換される先行請求項の１つに記載の配置。
4. 照明光のコヒーレンス度が試料との相互作用により引き下げられる先行請求項の１つに記載の配置。
5. 複数の試料点が同時に照明される先行請求項の１つに記載の配置。
6. 点からラインが形成される先行請求項の１つに記載の配置。
7. 試料上のラインの位置が変えられる先行請求項の１つに記載の配置。
8. 同時に照明された点の形態が顕微鏡配置の視野に対応している先行請求項の１つに記載の配置。
9. 空間分離手段が反射性である少なくとも１つの第１部分および透過性である少なくとも１つの第２部分から成っていて、反射性部分が照明光の結合のために、透過性部分が検出光の検出方向への通過のために用いられる、あるいは透過性部分が照明光の結合のために、反射性部分が検出光の分離のために用いられる、先行請求項の１つに記載の配置。
10. 反射性または透過性に形成されている中央部分、およびそれを取り囲む透過性または反射性に形成されている第２の部分を有するビームスプリッタの配備された、先行請求項の１つに記載の配置。
11. 照明が試料の両側からなされ、試料の一方の側では、試料を通過して試料のもう一方の側にある検出器の方への試料光の戻り反射が起きる、先行請求項の１つに記載の配置。
12. 照明が試料の両側からなされ、試料の一方の側では、試料を通過して試料のもう一方の側にある検出器の方への試料光の戻り反射が起きる、先行請求項の１つに記載の配置。
13. 検出が試料の両側からなされ、試料の一方の側では、試料を通過する照明の戻り反射が起きる、先行請求項の１つに記載の配置。
14. 照明側のひとみ内に走査装置が配備されていて、照明が顕微鏡視野の部分領域で好ましくは線状に当てられ、検出側ではノンデスキャン検出が行われる、先行請求項の１つに記載の配置。
15. ノンデスキャン検出のための検出器マトリクスが配備されている、先行請求項の１つに記載の配置。
16. 観察光をミラーおよび走査装置を通して戻し、顕微鏡の別なひとみ内で観察光と検出光の分離を行い、試料光を検出器に結像させる、先行請求項の１つに記載の配置。
17. 検出が中間像でなされる、請求項１６に記載の配置。
18. 照明側および検出側の中間像に、
    試料光を検出方向へ反射させるための、反射性である第１セグメントと、
    試料光を検出方向へ透過させるための、少なくとも部分的には透過性である第２セグメントと、
    立体的な構造を持つ、照明の空間的分離のためのビームスプリッティング用である第３の素子または反射性である第３の素子または透過性である第３の素子を有している分離素子と、
    が配置されていて、
    検出方向に向かって分離器前に配置された試料の異なった側のそれぞれのひとみの中に、照明光について検出光の場合とは異なる偏向方向を生成するための、少なくとも２つの領域を持つ反射性素子が配置されている、先行請求項の１つに記載の配置。
19. 光学手段により、第１検出器軸にひとみが、第１軸に垂直な第２検出器軸に中間像が結像する、先行請求項の１つに記載の配置。
20. 第３のセグメントが、少なくとも１つの方向に透過性および／または反射性の異なった領域を通る構造化部分を有している、請求項１８または１９に記載の配置。
21. スペクトル分解により試料光の検出が行われる、先行請求項の１つに記載の配置。
22. 試料への照明が広域に亘って行われる、先行請求項の１つに記載の配置。
23. レーザ走査型顕微鏡内でなされる、先行請求項の１つに記載の配置。
24. 単光子励起を伴う、先行請求項の１つに記載の配置。
25. 非線形励起を伴う、先行請求項の１つに記載の配置。
26. 試料相互作用の飽和が起きるように、励起の選択がなされている、先行請求項の１つに記載の配置。
27. 光学中心軸が本質的には互いに一致している対物レンズが、試料の別々の側で相向い合う位置に配備されている、先行請求項の１つに記載の配置。
28. 照明光の干渉性重畳を伴う、または伴わない試料照明が２方の側から同時に行われ、その結果試料照明のための光線の焦点領域が軸方向および／または横方向に少なくとも部分的に重なり合う、先行請求項の１つに記載の配置における操作方法。
29. 少なくとも１つの試料点から発せられた試料信号の干渉性重畳を伴う、または伴わない試料信号の検出が２方の側から同時に行われ、その結果試料信号検出のための光線の焦点領域が軸方向および／または横方向に少なくとも部分的に重なり合う、先行請求項の１つに記載の配置における操作方法。
30. 請求項２８および２９に記載されたステップの組み合せによる、先行請求項の１つに記載の配置における操作方法。
31. 照明光路および／または検出光路の少なくとも１つの光路長が、照明光路および／または検出光路が同じか、またはほぼ同じになるように適合調整される、先行請求項の１つに記載の配置における操作方法。
32. 試料の照明および／または試料光の検出が、線形照明により試料の別々の側に配置された少なくとも２つの対物レンズを通して行われる、試料中で励起された、および／または後方散乱した光線の光学的捕捉のための配置。
33. 試料の２方の側からの線形照明および／または試料の２方の側からの検出がなされる請求項３２に記載の配置。
34. コヒーレントな照明の配備された請求項３２または３３に記載の配置。
35. 線形照明のためのラインスキャナが配備された先行請求項の１つに記載の配置。
36. ラインの生成のために照明光が軸照準でフォーカシングされる、先行請求項の１つに記載の配置。
37. 照明光の干渉性重畳を伴う、または伴わない試料照明が２方の側から同時に行われ、その結果試料照明のための光線の焦点領域が軸方向および／または横方向に少なくとも部分的に重なり合う、先行請求項３２〜３６の１つに記載の配置における操作方法。
38. 少なくとも１つの試料点から発せられた試料信号の干渉性重畳を伴う、または伴わない試料信号の検出が、２方の側から同時に行われ、その結果試料信号検出のための光線の焦点領域が軸方向および／または横方向に少なくとも部分的に重なり合う、先行請求項３２〜３６の１つに記載の配置における操作方法。
39. 請求項３７および３８に記載されたステップの組み合せによる、先行請求項３２〜３７の１つに記載の配置における操作方法。
40. 照明光路および／または検出光路の少なくとも１つの光路長が、照明光路および／または検出光路が同じかまたはほぼ同じになるように適合調整される、先行請求項３２〜３９の１つに記載の配置における操作方法。
41. 試料照明光が光軸に垂直な少なくとも１つの方向に構造化部分を有している、先行請求項３２〜４０の１つに記載の配置における操作方法。
42. 試料との相対関係の中で、様々な構造状態を持つ試料信号が記録される、請求項４１に記載の方法。
43. この試料信号が試料再構成の計算に使用される、請求項４２に記載の方法。
44. 計算では次のステップ、すなわち
    １）様々な情報要素の分離
    ２）情報要素のフーリエ空間へのシフト
    ３）様々な情報要素の再結合
    のステップが踏まれる請求項４３に記載の方法。
45. 上記構造が周期的である、請求項４１〜４４に記載の方法。

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