HU225362B1 - Novel alkaline protease variants and detergents and cleansers containing these novel alkaline protease variants - Google Patents

Description

A találmány új alkalikus proteáz változatokra vonatkozik. Ezek elsődlegesen a Bacillus lentus-ból nyert szubtilizinek számozása szerint a 61., 199. és/vagy a 211. pozícióban optimálisan legalább egy, a molekulák stabilizálására szolgáló módosítást hordozó változatok, melyek előnyösen pontmutációt tartalmaznak a 3. és/vagy 4. helyzeteken. A találmány az ilyen enzimek technikai folyamatokban megvalósuló széles körű alkalmazási lehetőségeire is vonatkozik, és különösen ezen új alkalikus proteáz változatok mosó- és tisztítószerekben történő alkalmazását tartja szem előtt.

A szubtilizin típusú proteázok (szubtilázok, szubtilopeptidázok, EC 3.4.21.62) katalitikus hatású aminosavaik alapján a szerinproteázok közé tartoznak. Természetes körülmények között mikroorganizmusok, különösen Bacillus fajok termelik és szekretálják. Nemspecifikus endopeptidázként hatnak, azaz tetszés szerinti savamidkötést hidrolizálnak, mely főleg a peptidekben vagy a fehérjékben fordul elő. pH-optimum-értékük legtöbbször a lúgos tartományban található. A szakirodalomban ezek áttekintése megtörtént [Siezen: „Subtilases: Subtilisin-like Proteases” 75-95 „Subtilisin enzymes”, kiadó: R. Bott és C. Betzel, New York, (1996)]. A szubtilizin számos technikai alkalmazási lehetőséggel rendelkezik, így kozmetikumokban, és különösen a mosó- és tisztítószerek aktív alkotójaként szerepelhet.

A proteázok más enzimekkel együtt, mint például amilázokkal, lipázokkal vagy cellulázokkal a mosó- és tisztítószerek aktív komponenseként felhasználhatók. Képesek a tisztítandó termékek, mint például a textíliák, vagy elmosásra szánt dolgok fehérjetartalmú szennyezéseinek lebontására. A hidrolízistermékek nagyobb oldékonyságuk alapján a mosóoldattal kimosódnak, vagy a többi mosó- vagy tisztítószer-alkotóba záródnak, feloldódnak, emulgeálódnak vagy szuszpendálódnak. így szinergizmus léphet fel az enzimek és a mosó- és tisztítószerek szokásos alkotóelemei között. A mosó- és tisztítóanyag-proteázok között a szubtilizin kedvező enzimatikus tulajdonságai miatt, mint például stabilitás vagy pH-optimum, kiemelkedő helyet foglal el. A továbbiakban ezek közül a legfontosabbakat, és technikai továbbfejlesztésének legfontosabb stratégiáit bemutatjuk.

A mosószerproteázok fejlesztésének alapvető stratégiája abban áll, hogy a természetes úton mikrobiálisan felépülő enzimet először izoláljuk, majd elvi alkalmasságukat ezen területen levizsgáljuk. Ezek után a fenti molekulák optimalizálása elvégezhető. Ezt tehetjük a szakirodalomban leírtak alapján [WO 93/07276 A1 számú szabadalmi bejelentés], ebben a szabadalmi bejelentésben közzétették (Firmen Chemgen Corp., Gaithersburg, MD, USA, és Vista Chemical Company, Austin, TX, USA), hogy a Bacillus 164-A1 fajból nyerhető proteáz 164-A1 mosó- és tisztítószerekben felhasználható. Az alkalikus proteázok további példái, és forrásaik a következők: Bacillus sp-ből származó PD138, NCIMB 40338 (Fa), Novozymes [WO 93/18140 A1 számú szabadalmi bejelentés], melyet Bacillus fajból fermentációval nyertek, a BP-3376 törzsből származó proteináz K-16 (Fa. Kao Corp., Tokyo, Japan) [5.344.770 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés], és a pszichrofil szervezetekből nyert (Flavobacterium balustinum) proteáz [Fa, Procter & Gamble, Cincinatti, OH,

USA: WO 96/25489 A1 számú szabadalmi bejelentés].

A szubtilizin BPN’, mely a Bacillus amyloliquefaciens-ből nyerhető, illetve a B. subtilis törzsekből, Vasantha és munkatársainak munkája [Vasantha és munkatársai: J. Bacteriol., 159, 811-819 (1984); és Wells és munkatársai: Nucleic Acids Research, 11, 7911-7925 (1983)]. A szubtilizin BPN’ elsősorban szubtilizin referenciaenzimeként ismert. A szakirodalomban leírták például a szubtilizin összes pontmutációját is [EP 130756 A1 számú szabadalmi bejelentés]. Itt csak a 217. pozíciót emeljük ki, mely megfelel a találmány szerinti enzim 211. pozíciójának; itt egyik kicserélést sem hangsúlyozzuk ki, bár mindegyiket megadtuk, ezek a következők: M, W, C vagy K; előnyben részesítjük az A vagy az S aminosavakra történő kicserélést.

A szakirodalomban leírták [CA 2049097 A1 számú szabadalmi bejelentés] ezen molekulák többszörös mutációs formáit is, különösen figyelembe véve ezek alkalmazhatóságát mosó- és tisztítószerekben. Idesorolhatók a következő cserével kialakított változatok, mint például Y217K és Y217L, valamint a kettős mutánsok S63D/Y217K, azaz ezek a kicserélések megfelelnek a B. lentus alkalikus proteáz 211. pozíciójának, előnyösen a 61. és 211. pozíciójának. Természetesen egyetlen aminosavat sem építünk be, amely a szóban forgó bejelentés szerinti proteázok pozíciójának megfelel.

Ezen enzimek hurokrégióiban pontmutációkkal olyan változatokat kapunk, melyek a szubsztráthoz kisebb mértékben kapcsolódnak, miközben a hidrolízis sebessége nagyobb, ahogy ezt a szakirodalomban leírták [WO 95/07991 A2 és WO 95/30010 A1 számú szabadalmi bejelentések]. A szakirodalomban leírták [WO 95/07991 A2 számú szabadalmi bejelentés] a molekula hatodik hurokrégiójában kialakított kettős mutációt, ahol egy további D mutációt is kialakítottak a 217. pozícióban (amely megfelel a Bacillus lentus alkalikus proteáz 211. pozíciójának). Mivel a BPN'-nél természetes körülmények között a 205. pozícióban I található (amely megfelel a 199. pozíciónak), e két pozíció maximalizálása az előbb leírt módon megvizsgálható, azonban a szubtilizinek hurokrégióiban más mutációk kombinációs lehetőségei, valamint az enzimatikus tulajdonságok specifikus megváltoztatásai fennállnak. Ilyen BPN’-változatokat tartalmazó mosószereket a szakirodalomban közzétettek [WO 95/29979 A1 számú szabadalmi bejelentés]. A további öt hurokrégió mutációit a szakirodalomban leírták [WO 95/30010 A1 számú szabadalmi bejelentés], így például a 63. pozícióban (megfelel a 61. pozíciónak), azonban ezekben a pozíciókban csak D-t vagy E-t alkalmaztak. A fenti szabadalmi bejelentésben két olyan aminosavhelyzetet vettek szemügyre, nevezetesen a 3. és 4. pozíciót, melyek nem a hurokrégió részei. Másrészt számos, ezekben a leírásokban megadott kicserélés nem a stabilizálással, különösen nem a szubtilizin stabilizálómutációjvai van kapcsolatban.

A szubtilizin-Carlsberg-proteázt a szakirodalomban bemutatták [Smith és munkatársai: Journal of Biologi2

HU 225 362 Β1 cal Chemistry 243, 2184-2191 (1968); és Jacobs és munkatársai: Nucleic Acids Research 13, 8913-8926 (1985)]. Ezek természetes körülmények között a Bacillus licheniformis-ban épülnek fel, és például Maxatase® márkanéven forgalmazzák (Genencor International Inc., Rochester, New York, USA), valamint Alcalase® márkanéven (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dánemark) kapható. A pontmutációval nyerhető, szubsztráthoz csökkent mértékben kötődő, de egyidejűleg nagyobb hidrolizissebességű változatok a szakirodalomból ismertek [WO 96/28566 A2 számú szabadalmi bejelentés], Itt azokra a változatokra gondolunk, mely molekulák hurokrégiójában egy vagy több kicserélés fordul elő. Az egyes megadott pozíciókban kicserélt mosó- és tisztítószerekben kipróbált változatok, melyek a találmánynak megfelelnek, többszörös mutánsok, melyeknél a G62 cserén kívül (ez megfelel a Bacillus lentus alkalikus proteáz 61. pozíciójának) a következő cseréket végezték el: N, D, Q, Ε, P vagy S, de A cserét nem hajtottak végre, a V204 pozícióban (amely a 199. pozíciónak felel meg) különböző aminosavcseréket végeztek, de l-t nem végeztek, és az L216 pozícióban (amely a 211. pozíciónak felel meg) 14 különböző aminosavcserét hajtottak végre, ideértve az l-t is. Tehát ezzel a bejelentéssel csupán a találmányt érintő 3T változatokat és a 211 D-t írták le, de ismeretes, hogy a szubtilizin-Carlsberg 3. pozíciójában természetes körülmények között T foglal helyet.

A PB92 proteáz természetes körülmények között az alkalofil Bacillus nov. 92 törzsben képződik, és a Fa cég Maxacal® néven forgalmazza (Gist-Brocades, Delft, Niederlande). Ennek eredeti szekvenciáját a szakirodalomban leírták [EP 283075 A2 számú szabadalmi bejelentés]. Az enzim pontmutációval nyerhető változatait, melyek mosó- és tisztítószerekben alkalmazhatók, a szakirodalomban közzétették [WO 94/02618 A1 és EP 328229 A1 számú szabadalmi bejelentések]. Az elsőben csak a 211. pozícióban végeztek kicserélést különböző aminosavakkal, de a D-ről nem számoltak be. A második közleményben közzétették, hogy bizonyos terület, mely a 61-211. aminosavak tartománya, a szubsztrátkötésben vesz részt. A különösen érdekes pozíciók mutagenezise során a 61. pozícióval mégsem foglalkoztak, és a 211. pozícióban az aminosav Y-ra cserélését javasolták, ami csak legalább egy további kicseréléssel teszi lehetővé a mosási teljesítmény növelését.

A szubtilizin 147 és 309 kereskedelmi neve Esperese®, illetőleg Savinase®, ezeket a Fa Novozyme forgalmazza. Eredetileg Bacillus törzsekből származnak, melyeket a szakirodalomban közzétettek [GB 1243784 A számú szabadalmi bejelentés]. Ezen enzimek pontmutációval továbbfejlesztett változatait, melyek mosó- és tisztítószerekben alkalmazhatók, a szakirodalomban közzétették [WO 94/02618 A1, WO 89/06279 A1, WO 95/30011 A2 és

WO 99/27082 A1 számú szabadalmi bejelentések].

A WO 89/06279 A1 számú szabadalmi bejelentés szerzői a következő célokat tűzték maguk elé: nagyobb stabilitás biztosítása oxidációval szemben, megnövelt proteolízissebesség és javított mosási teljesítmény. Kiderült, hogy bizonyos pozíciókban végzett kicserélés a szubtilizin 147 vagy 309 molekulák fizikai vagy kémiai stabilitását képes megváltoztatni (az alkalikus proteáz számozása megfelel a Bacillus lentus DSM 5483 proteázának); ehhez a 199. pozíciót nevezték meg, de speciális kicserélésekről nem írtak. A WO 95/30011 A2 számú szabadalmi bejelentés a szubtilizin 309 változatait mutatja be, melyeket a molekulák hurokterületén pontmutációkkal alakítottak ki, így a szubsztrátabszorpció csökken, miközben a hidrolízis sebessége nő. Ilyen területek a következők is: 61., 199. és 211. pozíciók. A 221. pozícióban L211D kicserélést javasoltak; míg a 61 pozícióban G cseréjét a következő aminosavakra: N, D, Q, Ε, P vagy S, a 199. pozícióban hasonlóan sok cserét javasoltak, de l-t nem. A WO 99/27082 A1 számú szabadalmi bejelentés példája a szubtilizin 309 változatok fejlesztését mutatja be, mellyel a mosási teljesítmény javult, miközben az aktív hurkot inszercióval legalább egy aminosawal megnövelték. Helyettesítésekről sem számoltak be a szóban forgó bejelentésben.

A szubtilizin DY-t eredetileg Nedkov és munkatársai írták le [Nedkor és munkatársai: Bioi. Chem Hoppe-Seyler, 366, 421-430 (1985)]. Például a WO 96/28557 A2 számú szabadalmi bejelentés szerint a mosó- és tisztítószerekben történő optimalizáláshoz a megcélzott pontmutációk az aktív hurokban szerepelhetnek. Idetartoznak a csökkentett abszorpciójú és növelt hidrolizissebességű változatok, mint például a 62. pozícióban végzett kicserélések (ez megfelel a Bacillus lentus alkalikus proteáz 61. pozíciójának), ahol G helyére N, D, Q, Ε, P vagy S aminosavak kerülnek, a 204. pozícióban (megfelel a 199. pozíciónak) nem történt 2041 kicserélés, és a 216. pozícióban (megfelel a 211. pozíciónak) több kicserélést hajtottak végre, mint például D-t is. Mivel a szubtilizin DY a 3. pozíciójában természetes módon T-t tartalmaz, így itt leírtak egy 3T/211D változatot is.

A Thermoactinomyces vulgaris-ban természetes körülmények között képződő termitázt a szakirodalomban leírták [Meloun és munkatársai: FEBS Lett., 195-200 (1983)]. A csökkentett abszorpciójú és megnövelt hidrolízissebességű változatokat a hurokrégióban végzett szubsztitúciókkal nyerték [WO 96/28558 A2 számú szabadalmi bejelentés]. A 221. pozícióban végzett kicseréléseket (ami a Bacillus lentus alkalikus proteáz 211. pozíciójának felel meg) 14 aminosawal végezték, D-vel is, és a 70. pozícióban (megfelel a 61. pozíciónak) a G-t a következőkre cserélték: N, D, Q, Ε, P vagy S. Mivel a termitáz 209. pozíciójában (megfelel a 199. pozíciónak) természetes körülmények között I szerepel, ezért a szóban forgó bejelentésben főleg a 1991 és a 221D változatokat ajánlják a leggyakrabban. Különösen a stabilizálóhatáshoz nem vezető 3. pozíciójú treonin és/vagy a 4. pozíciójú izoleucin cserét javasolták (Bacillus lentus alkalikus proteáz alapján). A termitáz 10. és 11. pozíciójú megfelelő homológjaiban az S, illetve R aminosavak találhatók [WO 91/00345 A1 számú szabadalmi bejelentés]. A fentieken kívül olyan termitázmolekulák is vannak, melyek3

HU 225 362 Β1 ben a szekvenciák a többi szubtilizintől jelentősen eltérnek. így az érett termitázfehérje és a Bacillus lentus DSM 5483 alkalikus proteáz között a homológia 45%-os (62%-ban azonos aminosavak).

Míg a proteináz K és a Bacillus lentus alkalikus proteáz között a homológia kisebb mértékű. Az érett fehérjére vonatkoztatva ez csak 33%-os azonosságot jelent (az aminosavak 46%-ban azonosak). A proteináz K-t eredetileg a Tritirachium album Limber mikroorganizmusban írták le [Jany és Mayer: Bioi. Chem. HoppeSeyler, 366, 485-492 (1985)]. A WO 88/07581 A1 számú szabadalmi bejelentésben közzétették a nagyon hasonló TW3 és TW7 proteázokat, valamint többek között ezek alkalmazását mosó- és tisztítószerekben. A WO 96/28556 A2 számú szabadalmi bejelentésben a proteináz K-ban számos aminosavcserét végeztek a 220. pozícióban (ez megfelel a Bacillus lentus alkalikus proteáz 211. pozíciójának), a D-t is kipróbálták, és a 68. pozícióban (megfelel a 61. pozíciónak) a G-t kicserélték N, D, Q, Ε, P vagy S aminosavakra. Mivel a proteináz K 208. pozíciójában (megfelel a 199. pozíciónak) természetes körülmények között I található, míg a

4. pozícióban (megfelel a 3. pozíciónak) természetes körülmények között T van, ezért legfeljebb a 3T, 1911 és a 211D változatokat javasolták a szóban forgó bejelentésben.

Végül a Bacillus subtilis-bő\ származó bacillipeptidáz F-et említjük még meg, mely 61. és 199. pozíciójában természetes körülmények között alanin és izoleucin aminosavak találhatók. Ez azonban csak kismértékű hasonlóságot mutat a találmány szerinti proteázváltozatokkal: aminosavszinten a homológia értéke csupán 30%, előnyösen 38%-os azonosságot állapítottak meg. Ezek az enzimek a fentiekben említett munkákban [Siezen és munkatársai] megtalálhatók, de ezek használatát mosó- és tisztítószerekben nem említik, valamint ezeket nem védik.

A megfelelő proteázok további technikai alkalmazását, különösen mosó- és tisztítószerekben, a szakirodalomban közzétették [EP 199404 A2, EP 251446 A1, WO 91/06637 A1 és WO 95/10591 A1 számú szabadalmi bejelentések], melyek mint proteáz A, proteáz B, proteáz C, illetőleg proteáz D ismertek (Procter & Gamble Comp., Cincinnati, OH, USA). Az EP 199404 számú szabadalmi bejelentés proteázai különböző BPN’-változatok, melyek EP 130756 A1 számú szabadalmi bejelentésen alapulnak (lásd fent), mégis a szóban forgó bejelentések a releváns helyzetekre nem tartalmaznak változatokat. Az EP 251446 A1 számú szabadalmi bejelentésben számos BPN-változatot tettek közzé, így a 217-es változatokat is (mely megfelel a Bacillus lentus alkalikus proteáz 211. pozíciójának); csak a lehetséges kicseréléseket nevezték meg, melyek a 217D változat tulajdonságaival járnak együtt, bár ezeket mégsem tették közzé. A WO 91106637 A1 számú szabadalmi bejelentés szerint a „proteáz C”-k a BPN’ pontmutációi a 123. és/vagy 274. pozíciókban. A „proteáz D” változatok elsősorban a Bacillus lentus-bó\ nyerhetők, melyek a WO 95/10591 A1 számú szabadalmi bejelentés szerint a 76. pozíció mutációi (a BPN’-számozás alapján, mely megfelel a Bacillus lentus alkalikus proteáz 74. pozíciójának) és ezenkívül más pozíciók is hordoznak. Megemlítendő a 217. pozíció (megfelel a 211. pozíciónak); ennek ellenére D kicserélésről nem számoltak be. Szinte ezzel azonos például a 6.017.871 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben leírt mosó- és tisztítószerekben és kozmetikumokban, vagy a 5.677.272 és 6.066.611 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésekben közzétett fehérítőszerben alkalmazott proteáz, melyben a 76. pozíciójú kicserélések kombinációit alkalmazták, alapjában a 217D is ismert, de ezeket nem részesítették előnyben.

A további ismert proteázok kereskedelmi nevei a következők: Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym, Natalase® és Kannase® (melyek a Novozymes cégtől szerezhetők be), Maxapem®, Purafect®, Purafect OxP® és Properase® (melyek a Genencortól vásárolhatók), Protosol® (Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien) és Wuxi® (Firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China).

A szubtilizin mosási teljesítményének egyik javítási stratégiája abban áll, hogy statisztikusan, vagy az egyes aminosavak ismert funkciói alapján, az ismert molekulákban pontmutációkat alakítunk ki, és a kapott változatok mosási teljesítményre gyakorolt hozzájárulását ellenőrizzük. A stratégia megvalósulhat például a fentiekben említett szabadalmi bejelentésekben közzétett módon [5700676 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés; és EP 130756 A1 számú szabadalmi bejelentés], A szóban forgó találmányok egyikében leírták a 217. pozíció (mely megfelel a Bacillus lentus alkalikus proteáz 211. pozíciójának) aminosavának kicserélését mind a 19 aminosavra, magukban vagy másokkal együtt, mégsem tartalmazzák a releváns kicserélést. Azonos lépéseket tettek az 5.801.038 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban is. Az 5.441.882 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban olyan eljárásokat írnak le, melyekben az enzimatikus tulajdonságok bizonyos egy aminosavat érintő kicserélésekben megváltoznak, magukban vagy mások mellett, de a szóban forgó bejelentés a releváns 217. pozícióban végzett kicserélést nem teszi közzé (mely megfelel a Bacillus lentus alkalikus proteáz 211. pozíciójának). Ezeknek megfelelő változatokat, egy kicseréléssel, a 4.760.025 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben közzétettek, itt is csak a 217. pozícióban, és anélkül, hogy a konkrét kicserélést közzétették volna.

A szubtilizin mosási teljesítményének javítására, melyet az aktív hurokba történő további aminosavbeépítéssel kíséreltek meg elérni, számos bejelentést és stratégiát tettek közzé, ezeket például a következő bejelentésekben ismertették: WO 99/27082 A1 számú szabadalmi bejelentés, WO 00/37599 A1, WO 00/37621 A1-től WO 00/37627 A1-ig és WO 00/71683 A1-től WO 00/71691 A1-ig. Ezen alapelv alapján kell az összes szubtilizint alkalmazni, melyek egyik alcsoportja az I-S1 (igazi szubtilizin), míg a másik az I-S2 (nagymértékben alkalikus szubtilizin).

A teljesítmény növelésének egy másik stratégiája abban áll, hogy a molekula felületi töltése és/vagy izoelekt4

HU 225 362 Β1 romos pontja, és így kölcsönhatása a szubsztráttal megváltoztatható. Az ilyen változatokat a szakirodalomban leírták [5.665.587 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés; EP 405901 A1 számú szabadalom, és WO 91/00334 A1 számú szabadalmi bejelentés]. Ehhez számos pozíció megnevezhető, mint például a 3., 4. és 217. (mely megfelel a Bacillus lentus alkalikus proteáz 3., 4. és 211. pozíciójának), a megfelelő változatokat mégsem tették közzé. A WO 91/00345 A1 számú szabadalmi bejelentés is ezekkel a helyzetekkel foglalkozik, de a ténylegesen megfelelő változatokat nem tették közzé. A pH-értéktől függő, a molekula töltésváltozatainak csökkentésére irányuló eljárásokat a szakirodalomban közzétették [WO 92/11348 A1 számú szabadalmi bejelentés]. Ebből a legjobbak, ahogy ezt a szóban forgó bejelentésből meghatározhatjuk, az S3T és az L211D; konkrét közzététel egyik kicserélésre sem történt. A WO 00/24924 A2 számú szabadalmi bejelentés ezen elv alapján a változatok azonosítási eljárásához vezetett, melyek alkalmazása a mosó- és tisztítószerekben megfelelő lehetne; bár az összes közzétett változat legalább egy, a 103. pozícióban végzett kicserélésre vonatkozik, előnyben részesítve a többszörös változatokat, amikor is a szóban forgó bejelentés a releváns kicseréléseket nem adja meg. A WO 96/34935 A2 számú szabadalmi bejelentés szerint a teljesítmény javítását a mosóés tisztítószerekben a molekula hidrofób jellege is megnövelheti, ami az enzim stabilitására befolyással van.

A WO 99/120727 A2 számú szabadalmi bejelentésből megismerhetjük azokat a szubtilizinváltozatokat, melyek a WO 00/24924 A2 számú szabadalmi bejelentés eljárásával előállíthatok: ezek mindegyike legalább egy kicserélést tartalmaz a 103. pozícióban, kombinálva sok más lehetséges kicseréléssel, ennek ellenére egyik pozíció sem felel meg a Bacillus /enfus-proteáz 61. pozíciójának. Az előnyben részesített többszörös változatok legalább hat kicseréléssel rendelkeznek, hogy a 205. és 217. pozíciók is (melyek megfelelnek a Bacillus lentus alkalikus proteáz 199. és 211. pozícióinak); a több mint 50 ilyen változatból csupán kettő felel meg a releváns 1991 kicserélésnek. Az ilyen mutánsokat a WO 99/20723 A2 és a WO 99120726 A2 számú szabadalmi bejelentésekben közzétették mosó- és tisztítószerben történő alkalmazásokhoz, amit kiegészítettek amilázzal, előnyösen fehérítővel.

Az enzimfejlesztés egy modern iránya, melynek elemei ismertek, az új enzimek statisztikus előállítását egymással rokon fehérjék kombinálásával éri el, melyek a mai napig nem ismert tulajdonságokat mutatnak. Az ilyen eljárások tekinthetők irányított evolúciónak. Idetartoznak például a következő eljárások: a StEP-módszer [Zhao és munkatársai: Nat. Biotechnoi., 16, 258-261 (1998)], a random primingrekombináció [Shao és munkatársai: Nucleic Acids Rés., 26, 681-683 (1998)], a DNS-keverés [Stemmer: Natúré, 370, 389-391 (1994)] vagy a RACHITT [Coco és munkatársai: Nat. Biotechnol., 19, 354-359(2001)].

Egy további, különösen kiteljesített stratégia abban áll, hogy a kérdéses proteázok stabilitását, és ezzel hatékonyságukat is megnövelik. Polimer csatolásával stabilizált proteázok kozmetikumokban alkalmazhatók, ahogy azt a szakirodalomban leírták [5.230.891 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés]; ez lehetővé teszi a termék jobb elviselhetőségét a bőrön. Különösen a mosó- és tisztítószereknél közismertek a pontmutációkkal végzett stabilizálások. így a 6.087.315 és 6.110.884 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmak szerinti proteázok úgy stabilizálhatok, hogy bizonyos tirozinokat más aminosavakra cserélünk. A WO 89/09819 A1 és a WO 89/09830 A1 számú szabadalmi bejelentésekben termostabilis BPN’-változatokat írtak le, melyekben a 217. pozícióban (mely megfelel a Bacillus lentus alkalikus proteáz 211. pozíciójának) K vagy L kicseréléseket végeztek, kiegészítésként a 217K változatnál a 63. pozícióban (megfelel a 61. pozíciónak) a kicserélés S63D-re történt.

A pontmutációkkal végzett stabilizálásra további leírt lehetőségek például a következők:

- Bizonyos aminosavak kicserélése prolinra [WO 92/19729 A1 számú szabadalmi bejelentés, EP 583339 B1 számú szabadalmi bejelentés és 5.858.757 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom, valamint EP 518200 A1 számú szabadalmi bejelentés];

- A molekula felületére polárosabb vagy töltöttebb csoportok felvitele [EP 525610 A1 számú szabadalmi bejelentés, EP 995801 A1 számú szabadalmi bejelentés és 5.453.372 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés], többek között azokban a pozíciókban, amelyek a Bacillus /enfus-proteáz V4-nek felelnek meg, a V4I helyett a szóban forgó bejelentésben kevésbé poláros aminosavakat építettek be;

- A fémionok kötésének megerősítése, különösen a kalciumkötőhely mutagenezisével [WO 88/08028 A1 és WO 88/08033 A1 számú szabadalmi bejelentések];

- Az autolízis blokkolása módosítással vagy mutagenezissel [5.543.302 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom].

Az EP 398539 A1 számú szabadalmi bejelentésben több stabilizálóstratégia kombinációját tették közzé. Ezek alapján a szubtilizin stabilizálható, és így alkalmazása mosó- és előnyösebben tisztítószerekben hatásosabb, melyhez a következők eljárásokat alkalmazták: (1) a kalciumkötőhelyek aminosavainak kicserélése erősebben negatív aminosavakra, (2) az Asn-Gly-t követő aminosavak elvétele vagy mutálása, (3) a metionin kicserélése más aminosavra és (4) kiegészítésként bizonyos aminosavak helyettesítése, melyek a katalitikus központ közelében helyezkednek el. Az első három lehetőség a szóban forgó bejelentésben nem bizonyult helytállónak. A negyedik lehetőség a 61. és a 211. pozíciókat érinti. Bár javasolható, hogy az ezekben a pozíciókban természetes körülmények között előforduló aminosavakat (S63, előnyösen a szubtilizin BPN’-nél Y217), így a G-t és előnyösen az L-et pótoljuk. Ezzel szemben a találmány molekulája éppen ezekben a pozíciókban más aminosavakat alkalmaz, mint G vagy L.

HU 225 362 Β1

A további lehetőségek a Bacillus lentus-bó\ származó szubtilizinekre vonatkoznak, melyek pontmutációval történő stabilizálást jelentenek, ezeket a szakirodalomban leírták [5.340.735, 5.500.364, 5.985.639 és 6.136.553 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentések]. A mutációval megváltoztatott pozíciók felépítése háromdimenziós analízissel felderíthető. A 61. és 211. pozíciók változatait ezekben a bejelentésekben ennek ellenére nem tették közzé.

Például az EP 755999 A1 és WO 98/30669 A1 számú szabadalmi bejelentésekből tudjuk, hogy a proteázok, különösen a mosó- és tisztítószerekben használt javított teljesítményű proteázok, előnyösen a mosó- és tisztítószerekben a tisztítási teljesítmény növelésére amilázzal és további mosószer enzimekkel együtt alkalmazhatók. Például a WO 97/07770 A1 számú szabadalmi bejelentésből ismert, hogy ezek közül néhányat korábban mint mosószerproteázokat használták (lásd lejjebb), de akár kozmetikai célokra is alkalmazhatók. A proteázok egyik további alkalmazási lehetőségét a szakirodalomban leírták [EP 380362 A1 számú szabadalmi bejelentés]. Ezek szintetikusan előállított formákra vonatkoznak, és ezért a fenti bejelentések szerint azok a szubtilizinek felelhetnek meg, melyeket úgy stabilizáltak, hogy a Bacillus lentus alkalikus proteáz 61. pozíciójában (olyan mutáció, mely D-t eredményez) és/vagy 211. pozíciójában (olyan mutáció, mely K vagy L aminosavat eredményez) mutáltattak, vagy ezek mellett további más mutációkat is kialakítottak. Ezzel kapcsolatban a szóban forgó bejelentések releváns kicserélésekről szintén nem számoltak be.

A Bacillus lentus-bói származó alkalikus proteázoknál alkalikusabb proteázok nyerhetők Bacillus fajokból. A WO 91/02792 A1 számú szabadalmi bejelentés szerzői ezek közül az egyik törzset DSM 5483 számon letétbe helyezték; amikor is közzétették a vad típusú enzim szekvenciáját és biokémiai tulajdonságait is. A pontmutációval nyerhető, mosó- és tisztítószerekben alkalmazható ilyen enzimváltozatokat a szakirodalomban közzétették [WO 92/21760 A1 és WO 95/23221 A1 számú szabadalmi bejelentések],

A termelőorganizmusból származó egyik vad típusú enzim, melyet eredetileg az alkalofil Bacillus törzsek szűrésekor kaptak, sokkal nagyobb stabilitást mutatott oxidációval és detergensekkel szemben. A WO 91102792 A1 számú szabadalmi bejelentésben, előnyösen az EP 493398 B1 számú szabadalmi bejelentésben és az 5.352.604 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban ezek heterológ kifejezését írták le Bacillus licheniformis-gazáában (ATCC 53926). A megnevezett amerikai bejelentések igénypontjaiban a 208., 210., 212., 213. és 268. pozíciókat a Bacillus lentus alkalikus proteázaira jellemzőnek nevezték meg; ez számozásában megfelel az érett fehérje következő pozícióinak: 97., 99., 101., 102. és 157., és ezek alapján az enzim különbözik az érett Savinase®-tól. A fenti enzimek háromdimenziós felépítését a szakirodalomban leírták [Goddette és munkatársai: J. Mól. Bioi., 228, 580-595 (1992): „The crystal structure of the Bacillus lentus alkaline protease, Subtilisin BL, at 1.4 A resolution”].

A WO 92/21760 A1 számú szabadalmi bejelentésben, előnyösen az 5.340.735 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban közzétették a vad típusú Bacillus lentus alkalikus proteáz aminosavszekvenciáját (a szekvencia száma: 52) és nukleinsavszekvenciáját (a szekvencia száma: 106). Ebben a bejelentésben 51 különböző változatot vezettek le, melyek egy vagy több pozícióban a vad típusú enzimtől eltérnek, és így stabilabbak. Itt megtalálhatók 53T, V4I és V199I kicserélések is. A bejelentés szerint az M131 változat a legelőnyösebb, ezt letétbe helyezték (ATCC 68614, American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA, http://www.atcc.org), ahol a kicserélés a következő eredményre vezetett: S3T/V4I/A188P/V193M/V199I. Ezt a találmányban kiindulási enzimként használjuk (lásd az 1. példát), és szekvenciáját a 1. és a 2. számon megadtuk, ahol mind aminosavszekvenciáját, mind nukleinsavszekvenciáját feltüntettük. így ezek mindegyike a Bacillus lentus DSM 5483 alkalikus proteázból levezethető. További pozíciók pontmutációjával kialakított, javított stabilitású változatok a következő bejelentésekből vezethetők le: 5.500.364 és 5.985.639 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmak.

A WO 95/23221 A1 számú szabadalmi bejelentésből a mosó- és tisztítószerekben történő alkalmazáshoz Bacillus lentus alkalikus proteáz pontmutáns változatok ismerhetők meg, melyek további fejlesztéséhez a megnevezett molekulát használták. Ezek közül a három kicserélés a következő: S3T, V4I és V199I. Ezekből két vagy három további pontmutációs változatot alakítottak ki a vad típusú enzim alapján, melyet a Bacillus lentus DSM 5483-ból nyertek. Majd további mutációt alakítottak ki a 211. pozícióban, nevezetesen a 211D változatot (változatok: F49, F54 és F55). Logikus folytatása megtalálható a 5.691.295 és 5.855.625 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmakban, melyekben 211D és 211E kicserélési változatokra tartottak igényt. Az ehhez megfelelő stratégiát, ami szubsztrátkötés közelében a töltés megváltoztatására irányult, a szakirodalomban megvilágították [6.197.589 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom].

Ezek mindegyikével hosszú ideig foglalkoztak, melynek oka a technikailag alkalmazható proteázok nagyobb igénye, melyek részben drasztikusan, részben csak kisebb mértékben, kevesebb pozícióban különböznek az ismert proteázoktól. Ez így egy széles tartományt fed le, az igen drasztikustól az igen kis mértékű teljesítménykülönbségekig. Ezek megmutatkoznak mindenekelőtt a mosó- és tisztítószerekben történő alkalmazásoknál. Fejlesztésük az enzimatikus tulajdonságok kiszámíthatóságát és nem utolsósorban alkalmazhatóságukat, például a mosó- és tisztítószerreceptek vonatkozásában, foglalta magában. Itt további tényezők kerülnek a képbe, mint például magas hőmérséklettel szemben mutatott stabilitásuk, az oxidálószerekkel szemben mutatott ellenálló képességük, tenzides denaturálhatóságuk, kicsapóhatásuk, vagy elvárt szinergizmusuk más alkotórészekkel, melyek közül a legfontosabbak csak kísérletileg tárhatók fel.

HU 225 362 Β1

A találmány előtt álló feladat volt olyan szubtilizin megtalálása, mely technikai alkalmazásokban javított teljesítményekre képes. Különösen azokra a felfedezésekre van szükség, melyek a mosó- és előnyösen a tisztítószerekben jobb teljesítményt biztosítanak. Az egyik részfeladat nemcsak a hidrolízis mértékének növelése, hanem a megfelelő receptben történő stabil alkalmazhatóság biztosítása is.

A további részfeladatok olyan nukleinsavak biztosításával állnak kapcsolatban, melyek az ilyen proteázokat kódolják, valamint vektorokkal, gazdasejtekkel és ezek előállítási eljárásainak biztosításával az ilyen proteázok kialakításához. Továbbá a megfelelő anyagok biztosítására is kiterjed, különösen mosó- és tisztítószerek alkalmazási lehetőségeinek bővítésére szolgáló proteázokra. Végül a talált proteázok technikai alkalmazási lehetőségeinek meghatározása szintén a találmány tárgykörébe tartozik.

Meglepetésünkre azt találtuk, hogy a glicin kicserélése a 61. pozícióban másik aminosavra, különösen alifás aminosavra, és különösen alaninra a mosási teljesítményt megnöveli. Más kicseréléseket is figyelembe vehetünk, mint például a 199. pozícióban az aminosav kicserélése izoleucinra, vagy például a 211. pozícióban aszparaginsavra, melyek feltehetően az enzimatikus hatás javára vannak. A megnövelt hatékonyság a stabilitás erősítésével, így a 3. pozíciójú, előnyösen 4. pozíciójú treoninnal és izoleucinnal tovább fokozható.

A találmány előtt álló feladatot a szubtilizin típusú proteázokkal úgy oldottuk meg, hogy a Bacillus lentusszubtilizin 61. pozíciójában a kiindulási enzimen a következő aminosavkicseréléseket végeztük: alanin, Valin, leucin, cisztein, metionin, fenil-alanin, tirozin, triptofán, treonin, hisztidin, lizin vagy arginin, előnyösen alanin, valin, leucin vagy izoleucin, különösen előnyösen alanin.

Fokozottan előnyben részesítjük az olyan megoldásokat, ahol további kicseréléseket teszünk, így a 61. pozícióban, amikora 199. pozícióban izoleucin található; a 61. pozícióban a fentiekben felsorolt kicseréléseket tehetjük, amikor is a 211. pozícióban aszparaginsav található, és a stabilizáláshoz a 3. pozícióban treonin és/vagy a 4. pozícióban izoleucin fordulhat elő. Különösen jó megoldást jelentenek azok a proteázok, melyek a Bacillus lentus alkalikus proteázokból származtathatók, elsősorban a következő két Bacillus lentus alkalikus proteáz változat: S3T/V4I/G61A/V199I vagy S3T/V4I/G61A/V199I/L211D. Ezekben a találmány szerinti esetekben a megnevezett proteázok további fejlesztése és származékképzése megvalósul.

A részfeladatok és a találmány egyes tárgyköreinek megoldásaként a találmány nukleinsavakról is gondoskodik, melyek a találmány szerinti proteázokat kódolják, valamint vektorokat, gazdasejteket és előállítási eljárásokat biztosít, melyek az ilyen proteázok nyeréséhez szükségesek. Továbbá az ilyen proteázok részére megfelelő szereket, különösen mosó- és tisztítószerekhez, a megfelelő mosó- és tisztítószer-eljárásokat, valamint a megfelelő alkalmazási lehetőségeket biztosít.

Végül meghatároztuk a talált proteázok technikai alkalmazási lehetőségeit.

A találmány szellemében fehérje alatt természetes aminosavakból álló, főleg lineáris építőelemekből felépülő, hatását elsődlegesen háromdimenziós struktúrája révén kifejtő polimert értünk. A találmányban a 19 fehérjét felépítő, természetben előforduló L-aminosav nemzetközileg szokásos egy- és hárombetűs kódjait használjuk.

Az ilyen elnevezések kombinációja egy számmal arra a fehérjére utal, melyben a szóban forgó aminosav a megjelölt pozícióban fordul elő. így például az S3 jelentése a 3. pozícióban lévő szerin, amikor is a számozást a szóban forgó fehérje N-terminálisától kezdjük. Ezen a helyen lévő pontmutációt, például amikor a meglévő aminosavat treoninra cseréljük ki, ezen nómenklatúra szerint S3T-vel jelöljük.

A több pontmutációs változatok jelöléséhez ezeket a kicseréléseket ferde vonallal jelölve egymás után írtuk le. Ennek megfelelően az S3T/V4I változat azt jelenti, hogy az adott fehérje 3. pozíciójában a szerint treoninra, míg a 4. pozícióban a valint izoleucinra cseréltük ki. A találmányban a pozíció megadása, melyet a továbbiakban ennek megfelelően használunk, a szóban forgó fehérje érett formájára vonatkozik a szignálpeptid nélkül (lásd lejjebb).

A találmány szellemében enzim alatt olyan fehérjét értünk, mely meghatározott biokémiai funkciót mutat. Proteolitikus enzimek vagy proteolitikus funkcióval rendelkező enzimek alatt azokat értjük, melyek a fehérjék savamidkötéseit hidrolizálják, különösen azokat, melyek a fehérjék belsejében találhatók, és ezért ezeket endopeptidázoknak is nevezhetjük. A szubtilizinproteázok endopeptidázok, melyeket a természetben előforduló Gram-pozitív baktériumok állítják elő, és szekretálják, vagy ezekből, például molekuláris biológiai eljárásokkal előállíthatjuk; és részegységekből állnak, melyek strukturálisan vagy funkcionálisan elkülöníthetők, miközben a természetes szubtilizinproteázokkal homologizálhatók. Ezeket a szakirodalomban leírták [Siezen: „Subtilases: Subtilisin-like Proteases”, 75-95, „Subtilisin enzymes”, kiadó: R. Bott és C. Betzel, New York, (1996)].

Számos fehérje úgynevezett propeptidként, tehát egy szignálpeptiddel együtt keletkezik. Ez a fehérjék N-terminálisán foglal helyet, melynek funkciója legtöbbször a termelősejtből a képződő fehérje periplazmába vagy a tenyészközegbe juttatása, és/vagy a fehérje szabályos hajtogatódásának garantálása. Végül a szignálpeptid természetes körülmények között szignálpeptidáz hatására a fehérjéről lehasad, teszi ezt a képződő új N-terminális megsértése nélkül. A WO 91/02792 A1 számú szabadalmi bejelentés 1. ábrája szerint a Bacillus lentus DSM 5483-ból nyerhető szubtilizin profehérje 380 aminosavból épül fel. Ezzel szemben az érett fehérje csak 269 aminosavból; ahol a számozás az érett fehérjék első aminosavától kezdődik, ebben az esetben alaninnal, a profehérje szekvenciája szerint ez a 112. pozíció. A találmány 1. szekvenciája szerint a Bacillus licheniformis ATCC

HU 225 362 Β1

68614 törzsből nyer szubtilizin szignálpeptidje 111 aminosav hosszúságú, míg az érett peptid 269 aminosavból áll. E nélkül a felosztás nélkül a teljes fehérje 380 aminosav hosszúságú, ahogy az a 2. szekvenciából következik. A különösen előnyben részesített megvalósítási formák szekvenciái ezzel egyeznek.

A technikai alkalmazáshoz az enzimatikus aktivitás az érett pepiidhez kötött, így a megcsonkított profehérje termelését előnyben részesítjük.

A profehérjék a fehérjék inaktív alakjai. Ezek előanyagát a szignálszekvenciával pre-pro-fehérjének nevezzük.

A találmány szellemében nukleinsavak alatt természetesen a nukleotidokból felépülő információt hordozó molekulákat értjük, melyek a fehérje vagy enzim lineáris aminosavsorrendjét kódolják. Előfordulhatnak egyszálú formában, és ehhez az egyszálú formához komplementerként kötődő másik szállal kettős szálú formában. A természetesen tartósan megmaradandó, információt hordozó DNS-t részesítjük előnyben a molekuláris biológiai munkákhoz. Ezzel szemben a találmány megvalósítása során természetes környezetben, mint például egy kísérleti sejtben, RNS alakul ki, ezért az RNS-molekula szintén a találmány megvalósítási formájába tartozik.

A találmány szellemében a fehérjének megfelelő információegységet génnek nevezzük. A DNS-nél mindkét komplementer szál mindhárom lehetséges olvasási keretére figyelemmel vagyunk. Továbbá arra is tekintettel vagyunk, hogy az aminosavakat különböző kodonhármasok is kódolhatják, így egy meghatározott aminosavsorrend több különböző, és viszonylag csak kis azonosságot mutató nukleotidszekvenciából vezethető le (a genetikai kód degenerált). Ezenkívül ismeretes, hogy a különböző mikroorganizmusok eltérő kodonokat használnak. Ez alapján az oltalmi kört mind az aminosavszekvenciákra, mind a nukleotidszekvenciákra ki kell terjeszteni, és a megadott nukleotidszekvenciákat mindig csak egy meghatározott aminosavszekvencia példa sorrendjeként kell tekinteni.

A szakirodalomban jártas szakemberek számára ismert, hogy a teljes gén előállításához például a kémiai szintézis vagy a polimerázláncreakció-eljárások (PCR) molekuláris biológiai és/vagy proteinkémiai standardmódszerekkel együtt végezhetők az ismert DNS- és/vagy az aminosavszekvenciáknak megfelelő nukleinsavszekvenciák alkalmazásával. Az ilyen eljárásokat a szakirodalomban közzétették [„Lexikon dér Biochemie”, Spektrum Akademischer Verlag, Berlin, 1. kötet, 267-271 és 2. kötet 227-229 (1999)]. Ez különösen akkor lehetséges, amikor a letétbe helyezett törzsért a törzsgyűjteménybe visszanyúlhatunk. PCR-primerekkel, amelyeket az ismert szekvencia alapján szintetizálunk, az ilyen törzsekben előforduló gén problémamentesen szintetizálható, klónozható és kívánt esetben tovább alakítható. Idetartoznak például az adott helyre irányított vagy véletlen mutagenezis-módszerek.

A nukleotidszekvencia megváltoztatását, amelyet például az itt ismertetett molekuláris biológiai módszerekkel elvégezhetünk, mutációnak nevezzük. A változtatások típusa szerint megkülönböztetünk deléciós, inszerciós vagy helyettesítéses mutációt; azt a folyamatot amikor a különböző géneket vagy a gének részeit fuzionáltatjuk (shuffling), génmutációnak nevezzük. Az így kialakított szervezeteket mutánsoknak nevezzük. A mutált nukleinsavból levezethető fehérjét változatnak nevezzük, (gy például a deléciós, inszerciós vagy szubsztitúciós mutációk deléciós, inszerciós vagy szubsztitúciós mutáns fúziós gén változatokhoz és deléciós, inszerciós és szubsztitúciós fehérje, illetve fúziós fehérje változatokhoz vezetnek.

A találmány szellemében vektor alatt olyan nukleinsavelemeket tartalmazó konstrukciót értünk, mely kritériumai alapján a kérdéses gént tartalmazza. Ez a fajban vagy a sejtvonalban több generáción vagy sejtosztódáson keresztül képes a befogadó genomjától függetlenül stabilis genetikai elemként fennmaradni. A bakteriális fajoknál a vektorok kiváltképpen plazmidok, azaz cirkuláris genetikai elemek. A géntechnikában egyrészt megkülönböztetünk olyan vektorokat, melyek tárolásra és bizonyos tekintetben a genetikai feladatok ellátására szolgálnak, ezek az úgynevezett klónozóvektorok, másrészt, melyek a gazdasejtben a kérdéses gén funkcióit megvalósítják, azaz a szóban forgó fehérjék kifejezését lehetővé teszik. Ezeket a vektorokat expressziós vektoroknak nevezzük.

A homológiák keresésével, azaz ismert enzimmel történő összehasonlítással, például megadott elrendezésben, a kérdéses enzim, aminosav vagy a nukleotid szekvenciáinak enzimatikus aktivitása kikövetkeztethető. Ez a fehérje más területeivel, melyek tulajdonképpen az adott reakcióban nem vesznek részt, minőségileg vagy mennyiségileg módosítható. Ezek kihatással vannak például az enzim stabilitásra, aktivitására, reakciófeltételekre vagy a szubsztrátspecifitásra.

A proteolitikus enzimek vagy proteázok szakkifejezés alatt így a katalitikusán aktív központokban lévő néhány aminosav mindazon funkcióit értjük, melyek a teljes fehérje megmaradt többi részének vagy egyes részeinek, vagy a megmaradt fehérje több részének tulajdonképpen az aktív területét adják. A találmány szellemében proteolitikus aktivitásnak tekintjük magukat az ilyen módosított funkciókat vagy részaktivitásokat is. Az ilyen segédfunkciók vagy részaktivitások például egyes szubsztrátok, közti- vagy végtermékek kötésére, valamint a hidrolitikus aktivitást befolyásoló szabályozók aktiválására vagy gátlására vagy közbelépésére szolgálnak. így például bizonyos strukturális elemek kiépítése az aktív centrumtól távol is elvégezhető. A második feltétel, hogy a találmány szerinti proteolitikus fehérjének megfeleljen, valójában az, hogy a tulajdonképpen aktív csoport kémiai viselkedése magában vagy a módosított rész hatásával együtt a peptidkötés hidrolízisét adja. Ez alapján az is lehetséges, hogy egyéb proteázok aktivitásai egy vagy több rész bevonásával, például a találmány szerinti fehérje, minőségileg vagy mennyiségileg módosítva legyen. A proteolitikus aktivitásnál egyéb tényezők befolyását

HU 225 362 Β1 ugyancsak figyelembe vesszük. A proteolitikusan aktív enzimek közé tartoznak azok is, melyek aktivitását adott időpontban bizonyos anyagokkal gátolhatjuk. Döntő ezek alapvető képessége az adott proteolízisreakcióban.

Fragmensnek nevezzük az összes fehérjét vagy peptidet, mely kisebb, mint a természetes fehérje, vagy azokat, melyek a teljesen átíródott génnek felelnek meg, és például szintetikusan is megkaphatok. Aminosavszekvenciájuk alapján a megfelelő teljes láncú fehérjévé rendezhetők. Például azonos struktúrát vehetnek fel, vagy proteolitikus vagy más részaktivitást mutathatnak, mint például az egyes szubsztrátkomplexek. A kiindulási fehérjék fragmensei és hiányváltozatai lényegében egyet jelentenek, mivel akár fragmensek, akár a deléciós mutánsok, amelyeknél csak kis darabok hiányoznak, csak egyes részfunkciókat jeleníthetnek meg.

A találmány szerint kimérák vagy hibrid fehérjék alatt azokat a fehérjéket értjük, melyek olyan természetes elemekből épülnek fel, melyek ugyanabból a szervezetből vagy különböző szervezetekből származnak. Az ilyen folyamatot shufflingnak vagy fúziós mutagenezisnek nevezik. Az ilyen fúziók alapján bizonyos fehérjerészek enzimatikus funkciói létrehozhatók vagy módosíthatók. így a találmány szerint annak nincs jelentősége, hogy az ilyen kimérafehérje egyetlen polipeptidláncból vagy több alegységből áll, melyek különböző funkciókra oszlanak. Az utóbbi alternatíva megvalósításához például az is lehetséges, hogy transzlációt, vagy csak az egyik tisztítási lépést követően, megcélzott proteolitikus hasítással az egyetlen kiméra-polipeptidláncot több részre osszuk.

Inszerciós mutációval nyerhető fehérjék alatt azokat a változatokat értjük, melyek ismert eljárásokkal, az egyes nukleinsavak, előnyösebben fehérjefragmensek egybekapcsolásával a kiindulási szekvenciában alakíthatók ki. Ezek lényegében azonosak a kialakított kiméra fehérjékkel. Megkülönböztetésként csupán a fehérjerészek méretében térnek el a teljes fehérjétől. Az ilyen inszerciósan mutált fehérjékben az idegen fehérje kevesebb, minta kimérafehérjékben.

Az inverziós mutagenezis, azaz a részleges szekvenciamegfordítás, a deléció egyik eltérő formája, inszerciónak is tekinthető. Ez csak az eredeti aminosavsorrenddel rendelkező, de különböző molekularészek új csoportosulására érvényes. Ezek az eredeti fehérjék deléciós változatainak, inszerciós változatainak, valamint shuffling változatainak tekinthetők.

A találmány szellemében származékok alatt olyan fehérjéket értünk, melyek aminosavlánca kémiailag módosított. Az ilyen származékképzés például biológiailag, fehérjeszintézissel kapcsoltan a gazdaszervezetben elvégezhető. Ehhez molekuláris biológiai eljárásokat alkalmazhatunk. De kémiailag is elvégezhetők, akár az oldallánc aminosav kémiai átalakításával, akár a fehérjén más kovalens kötéssel. Az ilyen kötéseknél például más fehérjéket használunk, melyek például a találmány szerinti fehérjéhez bifunkciós kémiai vegyületekkel kapcsolhatók.

Ehhez olyan vegyület alkalmazható, mely például lehet más fehérje, ami például a találmány szerinti fehérjéhez bifunkciós kémia vegyületen keresztül kapcsolódik. Az ilyen módosításokkal például a szubsztrátspecifitás vagy a kötés erőssége a szubsztráton befolyásolható, vagy az itt említett enzimatikus aktivitás átmenetileg blokkolható, amennyiben a kapcsolt anyag inhibitor. Ennek például a tárolási idő alatt lehet értelme. Hasonlóan, a makromolekuláris hordozó kovalens kötésének módosítását származékképzésnek tekintjük.

A találmány szerint minden enzimet, fehérjét, fragmenst és származékot, amennyiben azt másképpen nem jelezzük, a fehérje fogalomba egyesítjük.

Az enzim teljesítménye alatt az adott technikai területen kifejtett hatékonyságát értjük. Ez az enzimaktivitáson alapul, de az adott folyamat egyéb releváns tényezőitől is függ. Idetartozik például a stabilitás, a szubsztrátkötés, kölcsönhatása a szubsztrátot hordozó anyaggal, vagy kölcsönhatása más alkotórészekkel, és elsősorban a szinergista hatások.

A találmány szerint mosószer-teljesítmény vagy tisztítószer-teljesítmény alatt azokat a hatásokat értjük, melyek a szóban forgó szennyezett anyagon, mint például textíliákon, vagy adott esetben szilárd felületeken fejtenek ki. Az ilyen anyagok egyik komponense például az enzim, melyet a mosó- és tisztítószerekben hatása miatt alkalmazásra érdemesnek tartunk. Ennek megfelelően az enzim enzimatikus sajátságai alapján nem minden további nélkül alkalmazhatók egyes szerekben a mosási teljesítmény elősegítésére. Itt például olyan további tényezők játszanak szerepet, mint a stabilitás, szubsztrátkötés, a tisztítandó dologgal vagy a szer egyéb alkotórészeivel kialakuló kapcsolódás, különösen a szennyezés eltávolításában megmutatkozó szinergizmus.

A találmány a kitűzött cél végrehajtásához a következő stratégiát folytatta, a Bacillus lentus DSM 5483 törzsből a szubtilizint, amelyet a szakirodalomban közzétettek [WO 91/02792 A1, WO 92/21760 A1 és WO 95/23221 A1 számú szabadalmi bejelentések] és különösen az M131 változatot az S3T/V4I/A188P/V193M/V199I és az F49 változatot S3T/V4I/A188P/V193M/V199I/L211D, a mosó- és tisztítószerekben történő alkalmazáshoz továbbfejlesztette. Az idevonatkozó technikai ismeretek lehetővé tették más megfelelő, különösen nagy mértékben átalakított proteázok, mindenekelőtt szubtilizin típusúak alkalmazását.

A találmány szerint különösen előnyben részesítjük a Bacillus lentus DSM 5483-ból nyert szubtilizinek megfelelő számozásának figyelembevételével az érett fehérje 3., 4., 61., 199. és 211. helyzeteit. Ennek megfelelően az 1. táblázat szerinti legfontosabb szubtilizinek homologizálhatók; ezen homogolizálás minden más szubtilizinre kiterjeszthető. így például a BPN’ szubtilizin ismert szekvenciájához viszonyítva több mint 20 szubtilizint állítottak elő [Siezen: „Subtilases: Subtilisin-like Proteases” 75-95, „Subtilisin enzymes”, kiadó: Bott és Betzel, New York, (1996)].

HU 225 362 Β1

1. táblázat

A találmány szerint öt különösen előnyben részesített pozíció homologizálása

Referencia	Származás	Pozíciók
3.	4.	61.	199.	211.
Bacillus lentus alkalikus proteáz	WO 92/21760 A1	S3	V4	G61	V199	L211
BPN’	Wells és munkatársai (lásd fent)	S3	V4	S63	1205	Y217
Szubtilizin Carlsberg	Smith és munkatársai (lásd fent)	T3	V4	G62	V204	L216
PB92	EP 283075 A2	S3	V4	G61	V199	L211
Szubtilizin 309	WO 89/06279 A1	S3	V4	G61	V199	L211
Termitáz	WO 91/00345 A1	S10	R11	G70	I209	L221
Proteináz K	WO 91/00345 A1	T4	A6	G68	I208	I220

A találmány szerinti Bacillus lentus alkalikus proteáz változatok, azaz az S3T/V4I/G61A/V199I és az S3TA/41/G61AA/199I/L211D aminosavszekvenciáinak 20 elrendezését ezekkel a fontos, bevezetésben leírt szubtilizinekkel mutattuk be a találmány 1. ábráján, nevezetesen ezek a következők: szubtilizin 309 (Savinase®), szubtilizin PB92, szubtilizin Carlsberg és szubtilizin BPN’. 25

A találmány kiterjeszthetősége a szubtilizinek és messzemenően azonos reakciómechanizmusok közötti strukturális összhangon nyugszik. így elvárható, hogy a megnevezett pontmutációk eredményeként a szövegben előforduló molekulák mindig összevethető ha- 30 tást fejtenek ki. A találmány megállapításai alapján különösen elvárhatók, hogy az ilyen szubtilizinek a technika állása alapján mosó- és tisztítószerekben alkalmazva a tisztítóteljesítményt képesek tovább javítani.

A Bacillus lentus alkalikus proteáz számozásának 35 megfelelően a 61. pozíció a technika mai állása alapján (lásd fent) kicserélhető N, D, Q, Ε, P és S aminosavakra, különösen kombinációban más, a találmányban nem érintett pontmutációkkal. A neutrális, hidroxilcsoportot tartalmazó treoninnal, a bázisos hisztidin, lizin, 40 arginin aminosavakkal, az aromás fenil-alaninnal, tirozinnal, triptofánnal, a kéntartalmú ciszteinnel, metioninnal és az alifás alanin, valin, leucin, izoleucin aminosavakkal végzett helyettesítéseket napjainkig nem írták még le; különösen nem azért, hogy az enzim teljesít- 45 ményét növeljék, és éppen ezért alkalmazásuk különösen előnyös egyes szerek mosó- és tisztítási teljesítményének javítására. Ezt teljesíti ez a szabadalmi bejelentés.

A találmány ennek megfelelően a 61. pozícióban a 50 teljesítmény fokozására cseréket hajt végre, előnyösen alifás aminosavra, nevezetesen a következőkre: alanin, valin, leucin vagy izoleucin, különösen előnyös az alaninra történő kicserélés. Ezek az ismérvek vonatkoznak a példákban megvizsgált következő 55 változatokra: Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I és Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I/L211D. Meglepetésünkre azt találtuk, hogy a 61. pozícióban a glicin cseréje más aminosavra, különösen alifás aminosavra, és főleg 60 alaninra, a mosási teljesítmény javítását eredményezte.

Ahogy a Bacillus lentus-bó\ származó egyes szubtilizinváltozatokat megvizsgáltuk, amelyek a találmány szerinti Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I/L211D változattal a legnagyobb mértékű egyezést mutatják, ugyanúgy a WO 95/23221 A1 számú szabadalmi bejelentésben ismertetett F49 Bacillus lentus alkalikus proteáz változatot is összevetettük az ismertetett kicserélésű S3T/V4I/G61A/V199I/L211D változattal. Az S3T/V4I/G61 A/V199l-hez legközelebb álló változat megfelel a WO 92121760 A1 számú szabadalmi bejelentésből ismert, és a WO 95/23221 A1 számú szabadalmi bejelentésben M131-nek Bacillus lentus alkalikus proteáznak nevezett változattal.

Mindkét kicserélés, az A188P és a V193M, a találmány 61. pozíciójú változatainál is fellép. Ahogy az például a WO 95/30011 A2 számú szabadalmi bejelentésből látható, a Bacillus lentus 193. aminosava a szubtilizin 6. hurokjának kezdetén van, míg a 188. aminosav nincs a hurokban, hanem a fehérje kompaktabb területéhez rendelt. így a két mutáció a molekula strukturálisan különböző területein fordul elő.

A találmány kidolgozása során meglepetésünkre azt találtuk, hogy a 188. és a 193. pozíciók visszaalakítása a vad típusú aminosavakra, és egy további mutáció a 61. pozícióban, szintén az 1. hurokban, olyan enzimet eredményez, a korábban ismert enzimekhez képest, különösen a napjainkig megismert Bacillus lentus alkalikus proteáz változatokhoz viszonyítva, hogy mosó- és előnyösen tisztítóteljesítményét tekintve azokat meghaladja. Ezt különösen jól mutatják a 3., 5. és 7. példák eredményei.

Például a CA 2049097 A1, az EP380362 A1 és a WO 95/30010 A1 számú szabadalmi bejelentések (lásd fenn) éppen a 61. pozíció variációit mutatják be, de csak a savas jellegű aminosavaknál. A bejelentések egy sorozatában szubtilizin-pontmutációkat alakítottak ki [WO 96/28556 A2 és WO 95/30011 A2 számú szabadalmi bejelentések] a 61. pozícióban (a legtöbb szubtilizinben itt természetes körülmények között glicin található) kiegészítve a leírt kicserélésekkel (N, D, Q,

HU 225 362 Β1

Ε, Ρ és S), melyek a molekulát helyileg igen nagy mértékben megváltoztatták, és valószínűleg az első hurok által kifejtett szubsztrátkölcsönhatást befolyásolták. Az EP 398539 B1 számú szabadalmi bejelentés ezzel szemben olyan mutációkat javasolt, melyek tulajdonképpen csak a szóban forgó szubtilizin glicinjének bejuttatását eredményezik erre a helyre, miközben a Bacillus lentus-ból származó szubtilizinnél ez természetes körülmények között megvan. Látva a technika állását, meglepő, hogy éppen ebben a pozícióban történő változtatás, különösen alifás oldalláncú aminosavra, és főleg alaninra, az enzim által kifejtett reakcióra előnyösen hat.

Alkalmazástechnikai szempontból, különösen a mosó- és tisztítószereknél meglepő, hogy ez a mosóés tisztítóteljesítmény javításhoz vezet; előnyösen az ilyen enzimek alkalmazása különböző szennyeződéseknél a mosó- és tisztítóteljesítmény javításához hozzájárul. Ezt a találmány 2. és 7. kivitelezési példájában mutatjuk be.

Ezen megfigyeléseknek megfelelően a további ilyen előnyös változatok a Bacillus lentus-ból származó szubtilizin számozásának megfelelő 61. pozícióban megnevezett kicserélésen túl a 199. pozícióban izoleucinnal rendelkeznek. A Bacillus lentus DSM 5483 törzsből származó szubtilizinekre a kicserélések enzimatikus tulajdonságot befolyásoló hatását a szakirodalomban leírták [WO 92/21760 A1 számú szabadalmi bejelentés].

Továbbá előnyben részesítjük a szubtilizin típusú alkalikus proteázokat, melyek azzal jellemezhetők, hogy a Bacillus lentus-ból származó szubtilizin számozásának megfelelő 119. pozícióban izoleucin, a 211. pozícióban aszparaginsav és a 61. pozícióban a következők közül az egyik aminosav található: alanin, valin, leucin, izoleucin, cisztein, metionin, fenil-alanin, tirozin, triptofán, treonin, hisztidin, lizin vagy arginin, előnyösen alanin, valin, leucin vagy izoleucin, különösen előnyösen alanin. Ideszámítjuk mind a természetes, mind a mutagenezissel nyert molekulákat, a fenti pozíciókban megnevezett aminosavakkal.

A mosó-, és előnyösen a tisztítóteljesítmény szabályozásához a 211. pozíciójú arginin figyelembevételéről a WO 95/23221 A1 számú szabadalmi bejelentés 10. példájában értesülhetünk.

Előnyösen a találmány szerinti alkalikus proteázok azzal jellemezhetők, hogy legalább egy stabilizálással rendelkeznek. Ezzel stabilitása tárolás és/vagy alkalmazása során megnő, előnyösen a megnevezett aminosavak hatására, előnyösen a több kicserélés nagyobb erősödést eredményez.

A találmány szerinti proteázok stabilitása például polimeres kapcsolással megnövelhető. Ilyen eljárást a szakirodalomban leírtak [5.230.891 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom]. Ez megköveteli a fehérje adását a megfelelő szerbe a polimerrel végzett kémiai kapcsolási lépésben.

Előnyösek azok a stabilizálóhatások, melyek magán a molekulán végrehajthatók, mivel ez a fehérjekinyeréshez más feldolgozási lépés csatolását nem igényli. Az ehhez megfelelő pontmutációk a szakirodalomból ismertek, (gy a 6.087.315 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom szerint a proteázok úgy stabilizálhatok, hogy bizonyos tirozinokat más aminosavra cserélünk ki. A találmány szerinti ez úgy történhet, hogy a Bacillus tenfus-fehérje 89., 161., 165., 208. és 257. pozíciójú tirozinjait (2. számú szekvencia alapján) minden megadott helyen kicseréljük, ahol a Bacillus lentus alkalikus proteáz egyébként amúgy is tirozinnal betöltött. A további lehetőségek például a következők:

- Az aminosav kicserélése prolinra [EP 583339 B1 számú szabadalmi bejelentés]; ezt annál az enzimnél lehet végrehajtani, amely a Bacillus lentus-ból nyerhető, ahol a kicserélések a következők: S555P, A96P, A166P, A188P és/vagy S253P.

- A molekulák felszínére polárosabb vagy töltöttebb csoportok bevitele [EP 995801 A1 számú szabadalmi bejelentés].

- A fémionkötődés megváltoztatása, különösen a kalciumkötőhelyeknél, melyet a szakirodalomban leírt módon végezhetünk [WO 88/08028 A1 és WO 88/08033 A1 számú szabadalmi bejelentés]. Az első bejelentés szerint egy vagy több kalciumkötésben részt vevő aminosavat kell kicserélni negatívan töltött aminosavra. Ez elvégezhető a szakirodalomban leírtaknak megfelelően [Goddette és munkatársai: J. Mól. Bioi., 228, 580-595 (1992)], ez a Bacillus lentus-ból nyert szubtilizin kalciumkötőhely két részére vonatkozik: Cal (nagyobb kötőaffinitású), ez a következő helyeket fogja át: 2Q (s), D40 (s, 2x), L73*, N75 (m), 177 (s), V79 (m); és Ca3 (kisebb kötőaffinitást mutat), mely a következő helyekre vonatkozik: A168, A163, Y165, Wasser 273, 317; mindegyik a Bacillus /enfus-szubtilizin-számozás alapján lett megadva.

- A kalciumkötőhely és az ezt követő legalább egy arginin/glicin stabilizálása pontmutáció kialakításával [WO 88/08033 A1 számú szabadalmi bejelentés]; ez például a Bacillus lentus-ból nyerhető szubtiliznek NG-t követő helyeire vonatkozik, így a 60/61, 115/116 és 212/213 helyzetekre.

Az 5.453.372 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom szerint a felszín bizonyos mutációival a denaturálószerek, mint például tenzidek ellen védelmet biztosíthatunk; a fenti bejelentésben megadott helyek a Bacillus lentus alkalikus proteáz következő pozícióinak felelnek meg: 134., 155., 158., 164., 188. és/vagy 189.

A további változtatási lehetőségeket a szakirodalomban leírták [5.340.735, 5.500.364, 5.985.639 és 6.136.553 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom].

Előnyösen az ilyen stabilizálásoknál a találmány szerinti alkalikus proteázok 3. pozíciójú treoninja megfelel a Bacillus lentus-ból izolálható szubtilizinek számozásának. A WO 92/21760 A1 számú szabadalmi bejelentés 3. táblázatából az következik, hogy a molekula ilyen kicserélései a vad típusú enzimnek megfele11

HU 225 362 Β1 lően biztosítja a magasabb hőmérséklettel, valamint a tenzidekkel szembeni stabilizálást. A molekulák N-terminálisa, ahol 3. és 4. pozíciók találhatók, a felszín kialakításában vesz részt, és bár a nyílás vége az aktív centrummal. Ez a laza vég a molekula maradékával, főleg nem kovalens kölcsönhatásokkal tart kapcsolatot, és ez a globuláris felépítés fenntartásához vezet. Anélkül, hogy bármely elmélethez ragaszkodnánk, elfogadható, hogy az össze mutáció, melyek a laza végek flexibilitását csökkentik, a teljes molekula stabilizálásához hozzájárul.

Hasonlóan előnyös a találmány szerinti alkalikus proteázok olyan stabilizálása, melynél a 4. pozíciójú izoleucinnal foglalkozunk, melynek számozása megfelel a Bacillus lentus alkalikus proteáz számozásával. Az ilyen kicserélések stabilizálóhatását a WO 92/21760 A1 számú szabadalmi bejelentés 3. táblázatában megadták.

Különösen előnyösek azok a kicserélések, melyeknél ez treoninra történik a 3. pozícióban, míg izoleucinra a 4. pozícióban, ez stabilizálóhatású, és a tárolási profilt előnyösen módosítja.

így a találmány szerinti szubtilizin a találmány példáiban ismertetett mosó- és előnyösen tisztítószerreceptekben teljesítményfokozást mutatott a szakirodalomban ismert Savinase®-zal szemben, mely ilyen stabilitással nem rendelkezik. Anélkül, hogy bármely elmélethez ragaszkodnánk, gyanítható, hogy a szóban forgó variánsok stabilitása annak köszönhető, hogy az enzim a mosófürdőben elegendő ideig aktív, és ezzel javított teljesítményét alátámasztja.

A molekula teljesítőképességét más módon kivitelezett kicserélés is javíthatja, különösen a mosó- és tisztítószereknél, például a szubsztráttal vagy a szer más alkotórészével kialakuló kölcsönhatáson keresztül. Különösen előnyben részesítjük azokat a megvalósítási formákat, melyekben a találmány szerinti alkalikus proteázok azzal jellemezhetők, hogy a Bacillus lentus-bói származó szubtilizinek szerinti 3. pozícióban treonin, a 4. pozícióban izoleucin, a 61. pozícióban alanin és a 199. pozícióban izoleucin található.

A találmány 3., 5. és 7. példájában az ilyen változatok szerepét a mosó-, előnyösen a tisztítószerek teljesítményében egyes szereknél dokumentáltuk.

Különösen előnyben részesítjük azokat a megvalósítási formákat, melyekben a találmány szerinti alkalikus proteáz azzal jellemezhető, hogy a Bacillus lentus-bó\ származó szubtilizinek szerinti 3. pozícióban treonin, a 4. pozícióban izoleucin, a 61. pozícióban alanin, a 199. pozícióban izleucin található és a 211. pozícióban aszparaginsav található.

A találmány 2., 4. és 6. példájában az ilyen változatok szerepét a mosó-, előnyösen a tisztítószerek teljesítményében egyes szereknél dokumentáltuk.

Az ilyen változások előnyösen elvezetnek a Bacil/us-szubtilizinhez, különösen a Bacillus /enfus-szubtilizinhez.

Ezzel a Sac/7/us-proteázok eleve különböző kedvező technikai alkalmazási lehetőségekhez vezetnek. Idetartozik a magas hőmérséklettel szembeni bizonyos stabilitás, valamint az oxidáló- és denaturálószerekkel szemben kialakuló bizonyos stabilitás. Ezekkel kapcsolatos a mikrobiális proteázok biotechnológiai termelésében megmutatkozó nagy tapasztalat, mely a gazdasejt és a fertmentációs körülmények kiválasztására vagy a kockázatok mérlegelésére vonatkozik, mind például az allergiát kiváltó hatásra.

Különösen a szubtilizin, de elsősorban a Bacillus lentus-ból izolált szubtilizin, mely a természetes módon felépült proteázokból levezethető, a technika jelenlegi állása szerint létrehozható, például a mosó- és tisztítószerekbe történő alkalmazásokhoz. Idetartozik a bevezetőben említett szubtilizin 147, szubtilizin 309 és Bacillus lentus alkalikus proteáz. A tapasztalat, melyet a proteázok előállításában és alkalmazásában megszereztünk, a találmány szerinti további fejlesztések javára van. Idetartozik például ezek kompatibilitása más kémiai vegyületekkel, mint például a mosó- és tisztítószerek alkotórészeivel.

Megfelelő kiindulási törzsként itt a DSM 5483 letéti számú törzset választottuk a német törzsgyűjteményből (Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, http://www.dsmz.de); és például a WO 91/02792 A1, WO 92121760 A1 vagy WO 95/23221 A1 számú szabadalmi bejelentésekben leírt Bacillus lentus törzset. Ezekből vagy ezen törzsek felhasználásával a változatok standard molekuláris biológiai módszerekkel, mint például PCR-rel és közismert pontmutációs eljárásokkal kialakíthatók.

A különösen előnyös és a példákban leírt változatok az 1. példában leírt módon levezethetők Bacillus lentus alkalikus proteázokból, amelyet 68614 ATCC számon letétbe helyeztünk (American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA, http://www.atcc.org). Ezen enzimek nukleotidszekvenciája és aminosavszekvenciája a találmány 1. és 2. szekvenciája.

Ezek a szekvenciák például felhasználhatók primerek kialakításához, a Gram-pozitív baktériumok DNS-készítményeiből, különösen a Gram-pozitív baktériumok, mint például Bacillus lentus, proteázát kódoló nukleinsavai segítségével, adott esetben ismert módon módosíthatók, például a találmány szerinti mutagenezissel, és kifejeztethetők. A genetikai kód degeneráltsága miatt több eltérő nukleinsavra gondolhatunk, melyek ezeket a változatokat kódolhatják, és ennek megfelelően ezeket a találmány szerint előnyben részesített alternatívákat előállíthatjuk.

Idetartozik elsősorban a Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I (a szekvencia száma: 3), és mindenekelőtt a 4. szekvenciánál megadott aminosavszekvencia. Mivel ezek mosóteljesítménye javított, ezért a találmány felhasználási példáiba tartoznak.

Hasonlóan előnyösek a fentiekben említett azon alkalikus proteázok, melyek azzal jellemezhetők, hogy Bacillus lentus DSM 5483-ból, vagy ATCC 68614-ből nyerhető szubtilizinből levezethetők, különösen a Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I/L211D (a szekvencia száma: 6, aminosavszekvencia), melynek nukleotidszekvenciáját az 5. szekvencia adja.

HU 225 362 Β1

Mint ahogy ezekben a kísérletekben, úgy a találmány alkalmazásai példáiban is az erősebb teljesítményjavulást összehasonlító molekulákhoz képest állapítottuk meg. Ezek a fentiekben megadott módon nyerhetők.

Az egyik előnyben részesített megvalósítási formában a fentiekben leírt proteázokból, elsődlegesen fragmentek képzésével vagy deléciós mutagenezissel, inszerciós mutagenezissel, helyettesítési mutagenezissel vagy legalább egyes részeinek fúziójával, legalább egy másik fehérjeváltozatokat állítottunk elő. Az ilyen eljárások a szakirodalomból ismertek.

fgy a megfelelő molekuláris biológiai eljárások például a következő tankönyvben részletesen megtalálhatók [Fritsch, Sambrook és Maniatis: „Molecular cloning: a laboratory manual”, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, (1989)].

Idetartoznak például azok a változatok, melyeknek szubsztitúciós mutagenezissel, vagy további pontmutációkkal további tulajdonságokat kölcsönözhetünk, melyek specifikus alkalmazási lehetőségekre predesztináltak, például a felületi töltés megváltoztatásával [WO 00/36069 A1 számú szabadalmi bejelentés], vagy a szubsztrátkötésben részt vevő hurkok katalitikus hatásának megváltoztatásával [WO 99/27082 A1 számú szabadalmi bejelentés]. A változatok legtöbb része mutagenezisnek vethető alá. így például cél lehet fragmensek kialakítása, vagy deléciós mutánsok létrehozása, a proteázok specifikus részfunkcióinak kiválasztása; vagy ellenkezőleg, például a szubsztrátkötés kizárása, előnyösen a molekula azon régióinak kizárása, melyek más vegyületekkel kölcsönhatásba lépnek.

Inszercióval, szubsztitúcióval vagy fúzióval a találmány szerinti proteázok pótfunkciókkal láthatók el. Idetartozik például bizonyos doménekhez való kapcsolás, esetleg a cellulózkötő doménhez, ahogy azt a szakirodalomban leírták [WO 99/57154 A1-tői WO 99/57157 A1-ig terjedő szabadalmi bejelentések]. Az itt megnevezett aminosavkapcsolók kivitelezhetők, ezeknél a proteáz fúziós fehérje egységei kapcsolóterületet és kapcsolódomént alakítanak ki. Az ilyen kötési domének magából vagy más proteázokból származhatnak, a találmány szerinti fehérje-szubsztrát kötés megerősítése érdekében. Ez a helyi proteázkoncentrációt megnöveli, mely egyes alkalmazásokban, például a nyersanyagok kezelésében előnyös lehet.

A találmány egyik további megvalósítási formája azzal jellemezhető, hogy a találmány szerinti fehérjéből kiegészítésképpen származék képezhető.

Ez a mindenkori alkalmazási cél optimalizálására szolgál. Idetartoznak a kémiai módosítások, ahogy azt például a szakirodalomban leírták [DE 4013142 A1 számú szabadalmi bejelentés]. Például kis és nagy molekulatömegű vegyületekkel kapcsolatok alakíthatók ki, ilyenek a különböző organizmusokban természetes körülmények között a fehérjék bioszintézisével kapcsolatban bekövetkező folyamatok, mint például zsírsavak kapcsolása az N-terminális közelében, vagy az eukarióta gazdasejtekben végbemenő glükozilezés. A találmány megvalósítási formái proteolitikus enzimeket vagy fragmenseket tárnak fel, melyek kiegészítésként származékká alakíthatók.

A találmány szerinti fehérjék mosó- és tisztítószerekben való alkalmazásával kapcsolatban például más mosóaktivitású anyagok vagy enzimek kapcsolása különösen átgondolt lehet. Cellulózkötő domének esetében az összevethető kapcsolótoldalékokat a szakirodalomban leírták [WO 00/18865 A1 és WO 00/57155 A1 számú szabadalmi bejelentések]. Analóg módon mehet végbe makromolekuláris vegyületek, mint például a polietilénglikol kapcsolása, a molekula további tulajdonságainak, mint például stabilitás vagy bőrelviselhetőség módosítására. Az ilyen módosításokat a szakirodalomban leírták [US 230.891 számú szabadalom], ezzel a szóban forgó proteázok kozmetikai alkalmazását lehetővé tették.

A találmány szerinti fehérjék származékainál a legszélesebb értelemben ezen enzimek előállítását is értjük. Ennek megfelelően a fehérjék kinyerése, feldolgozása vagy előállítása igen különböző anyaggal társulhat, ami származhat például a termelőmikroorganizmusok tenyészetéből. Mivel már a termelőmikroorganizmusok tenyésztési körülményei között proteolitikus aktivitás mutatkozik, ezért kimutatható, hogy már a nyerskivonat proteolitikus aktivitású, ami más fehérjeaktivitásokat inaktivál.

A fehérje, például a tárolási stabilitás növelése érdekében, bizonyos más anyagokkal célzottan vegyíthető. Ezért a találmány oltalmi körébe tartoznak valójában a találmány szerinti fehérjék összes készítményei is. Ez független a kérdéses készítmény kifejtett enzimatikus aktivitásától, vagy annak hiányától. Szükség lehet arra, hogy tárolás során az aktivitás kismértékű, vagy ne legyen, és a proteolitikus aktivitás csak az alkalmazás időpontjában fejlődjön ki. Ez például a találmány szerinti fehérje összetekeredési állapotától vagy a készítmény egy vagy több kiegészítő anyagától függhet. Kiváltképp a proteázkészítmény proteázinhibitoros formája ismert a szakirodalomban [WO 00/01826 A2 számú szabadalmi bejelentés]. Idetartoznak a fúziós fehérjék, melyeknél a inhibitorok kapcsolón keresztül, főleg aminosavkapcsolón át, a mindenkori proteázhoz kötöttek [WO 00/01831 A2 számú szabadalmi bejelentés].

Különösen előnyösek lehetnek a találmány szerinti fehérjék megnevezett továbbfejlesztései, származékképzései és előállítási módjai, amennyiben a találmány szerinti alkalmazási lehetőségek további proteolitikus aktivitás kifejtését lehetővé teszik. Előnyösen a mutagenezis és/vagy származékképzés ismert összes módszereivel nyerhető proteázok a kiindulási és főleg a nem derivatizált molekulával szemben megnövelt proteolitikus aktivitással és mindenekelőtt jobb teljesítménnyel rendelkeznek a mindenkori szándékolt alkalmazási területeken. Idetartozik elsősorban a mosási és/vagy tisztítási teljesítmény mosó- és tisztítószerekben.

Ez például a találmány szerinti pontmutációk és további pontmutációk kombinációival lehetségessé válik, melyek a katalizált reakcióra vonatkoznak valahol az aktív központban. Ez például a WO 95/30011 A2 számú

HU 225 362 Β1 szabadalmi bejelentés alapján megvalósítható a szóban forgó találmány szerinti proteázokkal, amikor is a Bacillus /enfus-szubtilizin hurokrégiójában mutációt és további aminosavkiegészítést végeztek. Ilyen munkákat a szakirodalomban közzétettek [WO 00/37599 A1, WO 00137621 A1-től WO 00/37627 A1-ig és WO 00/71683 A1 -tői WO 00/71691 A1-ig],

Az enzim egyes területein végzett deléciók, melyek más hatóanyagokkal a reakcióközegben integrálódnak, és ezzel az összetekeredésre hatnak, a teljes reakciót befolyásolják, további kívánt fejlesztésekkel szem elé tárhatók. A megnövelt hidrolízis eléréséhez ezzel analóg, a más hatású enzimekkel végzett fúziók, itt esetleg más proteázokra is gondolhatunk.

Például a proteolitikus blokád visszafordítása tárolás során, egyes inhibitorok kötésén keresztül, az autoproteolízist megakadályozhatja, és ezzel a reakcióközegben a felhígítás időpontjában a proteolízis sebességének növelésére kihat. Például speciális kötődőmének kapcsolása a tisztítási folyamatban a proteáz koncentrációját a szubsztrát közelében a mosófolyadékkal szemben megnöveli, és ezzel hozzájárul az enzim hatásához, fokozva a szer teljesítményét.

Egy további megvalósítási formában a megnevezett fehérjék vagy származékok azzal jellemezhetők, hogy ezeket pótlólag stabilizálják, vagy a fentiekben vázolt stabilitással rendelkeznek.

A találmány szempontjából a gyakorlatban itt olyan eljárások különösen jól alkalmazhatók, melyek pontmutációk kialakításán alapulnak. Az összes fentiekben bemutatott lehetőség a találmány szerinti változatoknál kombinációban is alkalmazható. A WO 89/09819 A1 számú szabadalmi bejelentés kimutatta több stabilizáló mutáció additív hatását, melyeknél már mind a 3T, mind a 4I, vagy mindkettő stabilizált, polimerrel kapcsolva; vagy más fentiekben leírt módon pótlólag stabilizálható.

A találmány második tárgyköre a nukleinsavakra épít. Idetartoznak azok a mindenkori megfelelő előnyös nukleinsavak, melyek a találmány szerinti fehérjéket vagy származékokat kódolják.

A nukleinsavak majdnem mindegyik jelenleg folyó molekuláris biológiai kutatás és fejlesztés, valamint fehérjetermelés kiindulási pontja. Idetartozik kiváltképp a gének szekvenálása és a hozzájuk tartozó aminosavszekvenciák levezetése, ahogy a mutagenezis és a fehérjék kifejezése is. Az ilyen módszereket a szakirodalomban leírták [Fritsch, Sambrook és Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual”, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, (1989)].

DNS-szinten a találmány szerinti enzimek kialakításához a „fehérjetervezés” általános fogalom alá tartozó módszerek optimalizált eljárásai alkalmazhatók. Különösen azok, melyekkel fehérjeszinten realizálódó tulajdonságokat érhetünk el, mint például a kialakított fehérje oxidációval szembeni ellenálló képessége, stabilitás denaturáló antigének vagy proteázok ellen, magas hőmérséklet, savak vagy erősen lúgos vegyületek elviselése, kalciummal vagy más kofaktorral szembeni változtatások, az immunogenitás vagy az allergiás hatás mérséklése.

A találmány szerinti mutált génekhez például azok tartoznak, melyek egyetlen megcélzott báziskicserélődéssel vagy randomizált pontmutációkkal, az egyes bázisok vagy részszekvenciák deléciójáért, más génekkel vagy génfragmensekkel megvalósuló fúziókért vagy inverziókért felelősek. Az ilyen mutációk vagy módosítások a szóban forgó nukleinsavakból levezetett enzimet a specifikus alkalmazásokra predesztinálják. Az ilyen mutagenezist célirányos vagy véletlenszerű módszerekkel végezhetjük, például a klónozott géneken az aktivitásra irányuló felismeréssel és/vagy kiválasztással (szűrés és szelekció).

Különösen a fehérjefragmenst kódoló nukleinsavaknál mindhárom leolvasási keretet mind értelmes, mind antiszensz irányban figyelembe kell venni. Az ilyen oligonukleotidok polimeráz-láncreakcióval (PCR) kiindulási pontként a nukleinsavak szintézisére fordíthatók. A találmány oltalmi körébe tartoznak különösen azok az oligonukleotidok, melyek a következő aminosavpozíciókat tartalmazó területekre vonatkoznak: 3., 4., 61., 199. és/vagy 211. Ez azokra is érvényes, melyek a variábilis szekvenciapozíciókban vannak, így a primer populációban legalább egy olyan előfordulhat, mely a 3. és/vagy 5. szekvencia részszekvenciáját kódolja. Ez az antiszensz oligonukleotidokra is érvényes, melyek például a kifejezés szabályozásában szerepet játszhatnak.

A találmány szerinti proteázok továbbfejlesztése a szakirodalomban leírtaknak megfelelően elvégezhető [Bryan: „Protein engineering” Biochim. Biophys. Acta, 1543, 203-222 (2000)].

Előnyös ez a találmány szubtilizinproteázokat kódoló nukleinsavainak képviselőire, melyek nukleotidszekvenciája összhangban van a 3. vagy a 5. szekvenciával. Ez az összhang különösen azokra a területekre érvényes, melyek a 4. vagy a 6. aminosavszekvenciának megfelelnek, ahol a 119. pozícióban izoleucin, a 211. pozícióban aszparaginsav, a 3. pozícióban treonin és/vagy a 4. pozícióban izoleucin található, és különösen azokra, melyek a 61. pozíciónak megfelelő alanint kódolják, vagy ezeket a területeket magukban foglalják.

Ahogy a fentiekben és a példákban szemléltettük, e pozíciók ismerete különösen a találmány szerinti alkalikus proteázoknál előnyös. A fenti ismeretek kiterjesztése más szubtilizinekre megtörténhet más molekulákon megfelelő módon végrehajtott mutatációkkal egy vagy több említett pozícióban. Ez célirányosan nukleinsavszinten ismert eljárásokkal (lásd fenn) történhet.

Ez érvényes azokra a nukleinsavakra, melyekből a Bacillus fenfus-proteáz egyik szekvenciája levezethető, és különösen azokra, melyek a Bacillus lentus DSM 5483 proteázra vonatkoznak. A különösen előnyben részesített esetben ez a találmány szerinti Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I vagy Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I/L211D; és/vagy ez érvényes a 3. vagy az 5. szekvenciával megegyezőre. Ez az összhang magára a változatok ismertetett területeire és különösen az egész szekvenciára vonatkozik.

HU 225 362 Β1

Az oltalmi körbe például olyan nukleinsavakat vettünk be, melyek proteolitikusan aktív inszerziós vagy fúziós mutációkat kódolnak. így ezért az aktivitásért felelős terület például a cellulózkötő doménnel fuzionálva lehet, vagy a katalitikusán nem aktív területen pontmutációkat hordozhat, a levezetett fehérjék polimerrel történő kapcsolásának lehetővé tételéhez vagy az allergén hatás csökkentésére.

A találmány egyik tárgya vektorok kialakítása. Idetartoznak azok a vektorok, melyek az előzőekben említett nukleinsavterületeket tartalmazzák, és különösen olyan nukleinsavterületeket fognak át, melyek a megnevezett fehérjét vagy származékot kódolják.

A találmánynak megfelelő nukleinsavakat szállításukhoz megfelelő módon vektorokba ligáljuk. Ezeket a szakirodalomban korábban kimerítően leírták, és mind klónozáshoz, mind kifejezéshez a kereskedelemben nagy számban és sok változatban beszerezhetők. Idetartoznak például a vektorok, mint például a bakteriális plazmidok, a vírusokból vagy bakteriofágokból levezetett vektorok, vagy a túlnyomó részben szintetikus vektorok. Ezek a molekuláris biológiai és biokémiai kutatásoknak megfelelő kiindulópontját jelentik, és a szóban forgó gént vagy a hozzá tartozó fehérjét kifejezik.

Előnyösen a találmány szerinti vektorok klónozóvektorok, melyek az előzőekben említett nukleinsavterületeket tartalmazzák, és különösen olyan nukleinsavterületeket fognak át, melyek az előzőekben megnevezett fehérjét vagy származékot kódolják.

A klónozóvektorok a tárolás mellett, a biológiai sokszorozási, vagy a kérdéses gének szelekcióját biztosítják, a szóban forgó gének molekuláris biológiai jellemzését elősegítve. Egyidejűleg a szóban forgó nukleinsavak transzportálható és tárolható formáit adják, és kiindulópontot jelentenek azokhoz a molekuláris biológiai technikákhoz, melyek nem köthetők sejtekhez, mint például a PCR vagy az in vitro mutageneziseljárások.

Hasonlóan előnyös a találmány szerinti olyan expressziós vektorok alkalmazása, melyek az előzőekben említett nukleinsavterületeket tartalmazzák, és különösen olyan nukleinsavterületeket fognak át, melyek az előzőekben megnevezett fehérjét vagy származékot kódolják, és ezek bioszintézisét lehetővé teszik.

Az ilyen expressziós vektorok alapja a megfelelő nukleinsavak biológiai termelőrendszerben történő realizálása, és ezzel a hozzá tartozó fehérje termelése. Az előnyben részesített megvalósítási formákban ezek olyan expressziós vektorok, melyek a kifejezéshez szükséges valamennyi genetikai elemet magukon hordozzák, például a természetes, eredeti helyen lévő promotert, vagy olyan promotert, mely más szervezetből származik. Ezek az elemek például úgynevezett expressziós kazettába rendezhetők. Különösen előnyben részesíthetjük azokat az expressziós rendszereket, melyek az adott gazdasejthez különösen jól illeszkednek (lásd lejjebb).

A találmány tárgyát olyan sejtek képezik, melyek a találmány szerinti fehérjék vagy származékok fejlesztéséhez, módosításához vagy előállításához felhasználhatók. Idetartoznak különösen azok a sejtek, melyek egy, a fentiekben megnevezett vektort vagy annak ismertetett területeit tartalmazzák, melyek lehetnek plazmidok, de kromoszomális lokalizációjuk is elképzelhető.

Ezek lehetővé teszik a szóban forgó gén sokszorozását, de ezek mutagenezisét, átírását és transzlációját és végül is biotechnológiai előállítását is.

Azokat a gazdasejteket tartjuk előnyösnek, melyek az előzőekben megnevezett fehérjét vagy származékot kifejezik, vagy ezek kifejezését képesek végrehajtani, különösen miután az előzőekben említett nukleinsavterületet beépítették a megnevezett expressziós vektorokba.

A fehérjéket képző gazdasejtek ezek biotechnológiai előállítását lehetővé teszik. Ehhez a szóban forgó gént a vektorba megfelelő módon el kell helyezni, és a vektor segítségével a gazdasejtbe kell transzformálni. Ez a vektor vagy ennek ismertetett területei a gazdasejtben extrakromoszomális elemként fordulhat elő, vagy a kromoszómába integrálódhat.

Gazdasejtként alapjában véve az összes prokarióta, eukarióta vagy Cyanophyfa-organizmus megfelel. Előnyben részesítjük azokat a gazdasejteket, melyek genetikailag jól kezelhetők, például expressziós vektorral végzett transzformálásuk után stabilan fennmaradnak, ilyenek például az egysejtes gombák vagy baktériumok. Idetartoznak előnyösen azok a gazdasejtek, melyek jó mikrobiológiai és biotechnológiai kezelhetőséget mutatnak. Ez például vonatkozhat könnyű tenyészthetőségükre, jó szaporodóképességükre, táptalajjal szembeni igénytelenségükre és az idegen fehérje jó termelésére és kibocsátására. Ennek megfelelően a találmány szerinti fehérjék számos gazdaszervezettel megkaphatok. A különböző technikáknak megfelelően gyakran szükséges olyan rendszerek biztosítása, melyek egyedi kísérletekhez optimális kifejezési rendszert jelentenek.

Az előnyben részesített megvalósítási formákban olyan gazdasejteket mutatunk be, melyek a megfelelő genetikai elemekkel szabályozhatók, például kémiai vegyületek szabályozott adagolásával, a tenyésztési körülmények megváltoztatásával vagy a mindenkori sejtsűrűségtől függően. Ezek a szabályozható kifejezések lehetővé teszik a kérdéses fehérjék nagyon gazdaságos termelését. Az expressziós vektorok és a gazdasejtek megfelelő módon összhangban vannak, például a kifejezéshez szükséges genetikai elemeket (riboszómakötő hely, promoterek, terminátorrégiók) vagy a kodonhasználatot tekintve. Az utóbbi például úgy optimalizálható, hogy a gén minden kodonját, melyek a szóban forgó gazdában csak nehezen transzlálódnak, olyanra cseréljük ki, mely a gazdában a leghatékonyabb.

Az egyik előnyben részesített megvalósítási formában a gazdasejtre jellemző, hogy baktérium, különösen olyan, amely a fehérje kialakítására és környezetbe történő kibocsátására képes.

A baktériumok generációs ideje rövid, és a tenyésztési körülményekkel szembeni igényük kicsi. így olcsó eljárások alakíthatók ki. Ehhez olyan baktériumokkal rendelkezünk, melyek fermentációs tapasztalata gazdag. A speciális termeléshez többféle Gram-negatív

HU 225 362 Β1 vagy Gram-pozitív szervezet megfelel, melyeknél a tápanyagforrásokat, termelési paramétereket, termelési időigényt kísérletileg kiderítették.

A Gram-negatív baktériumok, mint például Escherichia coli, számos fehérjét a periplazmatikus térbe juttatnak. Ez speciális alkalmazásoknál előnyös lehet. A Gram-pozitív baktériumok, mint például a bacillusok, ezzel szemben a fehérjéket a környező táptalajba juttatják, melyből másik előnyben részesített megvalósítási formák alapján a találmány szerinti fehérjék tisztíthatók. A WO 01/81597 számú szabadalmi bejelentésben olyan eljárást tettek közzé, mellyel elérték, hogy a kifejezett fehérjék a Gram-negatív baktériumokból is kijussanak.

Az előnyös baktériumok Gram-pozitív típusúak, elsődlegesen a Bacillus nemzetségbe tartoznak, főleg a következő fajok: Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis vagy Bacillus alcalophilus.

A találmány egyik megvalósítási formája a Bacillus lentus-t használja, különösen a Bacillus lentus DSM 5483 törzset, a találmány szerinti fehérjék (homológ) kifejezéséhez. Mégis előnyben részesítjük a heterológ expressziót. Előnyösen idetartoznak a Bacillus nemzetség baktériumai, melyek a legjobban jellemzett Gram-pozitív baktériumok. Idetartoznak elsődlegesen a következő fajok: Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis vagy más fajok és a törzsek, valamint a Bacillus alcalophilus törzsei. Ezek a Bacillus lentus-szai együtt hasonló kodonhasználattal rendelkeznek és maguk is más szubtilizinekkel egybevethető szubtilizineket szintetizálnak, tehát természetes módon hasonló, megfelelően szabályozott szintézissel rendelkeznek.

Egy további előnyük, hogy a találmány szerint így előállított fehérjék keveréke endogén gazdatörzs által készített szubtilizineket tartalmazhat. A Bacillus lentus alkalikus proteázok ilyen egyszerre történő kifejezését Bacillus licheniformis-ban (ATCC 53926) a WO 91/02792 (EP 493398 B1) számú szabadalmi bejelentésben leírták; ahol több lehetséges expressziós vektort is közzétettek. Ezek a rendszerek a találmányban bemutatott új változatokhoz is alkalmazhatók.

A további előnyben részesített gazdasejtek azzal jellemezhetők, hogy ezek eukarióták, különösen azok, melyek a készülő fehérjét transzláció után képesek módosítani.

A megfelelő eukarióták a gombák, mint például a Actinomyceták vagy élesztők, mint például a Saccharomyces vagy a Kluyveromyces. Az ilyen rendszerek módosításaihoz, különösen a fehérjeszintézissel kapcsolatban, például a kis molekulatömegű vegyületek kapcsolódása tartozik, mint például membrán horgonyzó részek, vagy oligoszacharidok. Az ilyen oligoszacharidmódosítások például az allergiás hatás csökkentésében előnyösek lehetnek.

A találmány egyik tárgya a találmány szerinti proteolitikus enzimek vagy származékok előállítási eljárása. A fentiekben leírt proteolitikus enzimek vagy származékok előállításához azokra az eljárásokra is igényt tartunk, melyek a fentiekben megnevezett nukleinsavakat és/vagy a fentiekben megnevezett vektorokat alkalmazza, valamint a megnevezett gazdasejteket.

így például a fentiekben megnevezett DNS- és aminosavszekvenciák alapján, melyek például a szekvenciákból levezethetők, a megfelelő oligopeptidek és oligonukleotidok egészen a teljes génekig és fehérjékig ismert molekuláris biológiai módszerekkel szintetizálhatok. Az ismert szubtilizint termelő mikroorganizmusokon kívül további természetes szubtilizintermelők is izolálhatok, melyek szubtilizinszekvenciáját megállapították, és ennek megfelelően az itt megadottak szerint továbbfejlesztették. Az ilyen baktériumfajok a megfelelő előállítási eljárásokkal tenyészthetők is. Analóg módon például a WO 91/02792 számú szabadalmi bejelentésben példáiban közzétett vektorokból új expressziós vektorok fejleszthetők. A találmány megvalósítási formái a hozzájuk tartozó nukleinsavszekvenciák alapján sejtmentes kifejezési rendszerekben is alkalmazhatók, melyben a fehérjék szintézise in vitro történik. Az összes fentiekben megadott elem új eljárásokban kombinálható a találmány szerinti fehérjék előállításához. Ezért a találmány szerinti minden egyes fehérje sok kombinációs lehetősége elgondolható, biztosítva az optimális eljárás minden konkrét esetben kísérletek végzésével.

A találmány tárgyköréhez megfelelő szerhez a találmány szerinti fentiekben leírt proteolitikus enzimet mutatunk be. Különösen mosó- és tisztítószerekhez, melynek mennyisége a szerben 2 gg-tól 20 mg-ig terjed.

Gyakorlatilag a találmány szerinti enzim összes technikai alkalmazási lehetősége attól függ, hogy a funkcióképes enzimet megfelelő közegbe helyezzük. így például követelmény a mikrobiológiai alkalmazhatóság olyan szerben, melyben az enzim, főleg nagy tisztaságú formában, a szükséges reakciópartnerekkel vagy kofaktorokkal együtt található. A nyersanyagok vagy a kozmetikai készítményekhez a szer ugyancsak specifikus recepttel jellemezhető. A találmány szerint az összes ilyen receptben a találmány szerinti enzimet kell érteni.

Ezen tárgykör a mosó- vagy tisztítószer előnyben részesített megvalósítási formájának számít. így, ahogy azt a találmány megvalósítási formáiban megmutattuk, meglepetésünkre megállapítható, hogy a 61. pozíciójában a következő aminosavakra kicserélt szubtilizinváltozat (ahol a számozás a Bacillus lentus alkalikus proteáz alapján történt): alanin, valin, leucin, izoleucin, cisztein, metionin, fenil-alanin, tirozin, triptofán, treonin, hisztidin, lizin vagy arginin, különösen alanin, valin, leucin vagy izoleucin, még előnyösebben alanin, mind a textíliák, mind a szilárd felszínek különböző szennyeződéseinek eltávolítására nyilvánvalóan nagyobb teljesítményt biztosít, mint amit a nem mutált molekulával kapunk. Ez a hatás reprodukálhatóan fellép különféle hőmérsékleteken, valamint különböző koncentrációkban.

A fentiekben leírt változatokat tartalmazó szert különösen előnyben részesítjük. Ide előnyösen a következő Bacillus lentus alkalikus proteáz változatok tartoznak: S3T/V4I/G61A/V199I és S3TA/4I/G61AA/199I/L211D, valamint az ezekből levezethető molekulák.

HU 225 362 Β1

A találmány tárgykörében az összes elképzelhető tisztítószerfajtára gondolunk, mind koncentráltakra, mind hígítatlanul alkalmazott szerekre: ipari méretekben, mosógépbe vagy kézi, illetve tisztítómosáshoz adagolva. Idetartoznak például a textíliákhoz, szőnyegekhez vagy természetes rostokhoz adott találmány szerinti mosószerek. Idetartoznak például a mosogatógépek mosogatószerei, vagy a manuális mosogatószerek, vagy a kemény felületek, mint például fém, üveg, porcelán, kerámia, csempe, vas, lakkozott felületek, műanyagok, fa vagy bőr mosószerei, amennyiben a találmány szerinti tisztítószert alkalmazzák.

Mindegyik tisztítószertípus a találmány megvalósítási formáját jelenti, amennyiben a találmány szerinti fehérjék gazdagítják. A találmány megvalósítási formái felölelik az összes napjainkban ismert technikát és/vagy az összes a találmány szerint nyújtott formát. Idetartoznak például a szilárd, por, folyékony vagy pasztaszerű szerek, adott esetben akár több fázisban préseltek vagy nem préseltek, valamint idetartoznak az extrudátumok, szemcsék, tabletták, valamint ostyák, akár nagy csomagokban, akár adagokban csomagolták.

A találmány szerinti szer 1 grammjára nézve a találmány szerinti enzimből 2 pg-20 mg-ot tartalmaz, előnyösen ez 5 pg-17,5 mg, 20 pg-15 mg, 50 pg-10 mg, 100 pg-7,5 mg, 200 pg-5 mg és 500 pg 1 mg. így alkalmanként ez 40 pg-4 g, és előnyösebben 50 pg-3 g, 100 pg-2 g, 200 mg-1 g és különösen előnyösen 400 pg-400 mg.

Az ilyen szer proteázaktivitását a szakirodalomban leírtaknak megfelelően meghatározhatjuk [Tenside, 7, 125-132 (1970)]. Ezt ennek megfelelően PE-ben (proteázegységben) adjuk meg. A szer proteázaktivitása grammonként 1 500 000 proteázegység.

A találmány szerinti enzim mellett a találmány szerinti szer adott esetben tenzideket, mint például nemionos, anionos és/vagy amfoter tenzideket, és/vagy fehérítőanyagot, és/vagy kötőanyagot és adott esetben további szokásos alkotórészt tartalmaz.

A nemionos tenzidek előnyösen az alkoxilezett, előnyösen etoxilezett, különösen a 8-18 szénatomos primer alkoholok és átlagban 1-12 mól etilén-oxid (EO) per mól alkohol felhasználásával készülnek, melyekben az alkoholcsoport lineáris vagy előnyösen a 2. pozícióban metilesen elágazó lehet, illetve a lineáris és a metilesen elágazó csoportúak keverékét tartalmazhatja, így szokásosan az oxo-alkohol-csoportokban találhatók. Mégis különösen előnyösek az alkohol-etoxilátok, melyek természetes eredetű 12-18 szénatomos lineáris alkoholokat tartalmaznak, mint például kókusz-, pálma, faggyúzsír vagy oleil-alkoholt, és átlagban 2-8 mól alkoholból állnak. Az előnyben részesített etoxilezett alkoholok közé tartoznak például a C₁₂_₁₄-alkoholok 3 EO-val vagy 4 EO-val, a Cg.^-alkoholok 7 EO-val, a C₁₃_₁₅-alkoholok 3 EO-val, 5 EO-val, 7 EO-val vagy 8 EO-val, a C₁₂_₁₈-alkoholok 3 EO-val, 5 EO-val vagy 7 EO-val és ezek keverékei, mint például a C₁₂_₁₄-alkoholok 3 EO-val és a C₁₂_₁₈-alkoholok 5 EO-val alkotott keverékei. A megadott etoxilezési fokok statisztikai középértékeket jelentenek, amely a speciális termékeknél egy egész vagy egy törtszám lehet. Előnyösen az alkohol-etoxilát egy bizonyos homológmegoszlást mutat (szűk tartományú etoxilátok, NRE). Ezeken a nemionos tenzideken kívül a zsíralkoholok több mint 12 EO-val is alkalmazhatók. Ezekre példák a faggyúzsíralkoholok 14 EO-val, 25 EO-val, 30 EO-val vagy 40 EO-val.

A nemionos tenzidek egy további előnyben részesített osztálya, melyek vagy csak a magukban lévő nemionos tenzidek, vagy más nemionos tenzidekkel kombinációban adagolhatok, a következők: alkoxilezett, előnyösen etoxilezett vagy etoxilezett és propoxilezett zsírsav-alkil-észterek, előnyösen az alkilláncban 1-4 szénatommal, ilyenek elsősorban a zsírsav-metil-észterek.

A nemionos tenzidek egy további osztálya, melyek előnyösen adagolhatok, az alkil-poliglikozidok (APG). Az alkalmazható alkil-poliglikozidok általános képlete: RO(G)x, ahol R jelentése primer egyenes láncú vagy metilesen elágazó, különösen a 2. pozícióban metilesen elágazó 8-22 szénatomos, előnyösen 12-18 szénatomos alifás csoport, és G jelentése 5-6 szénatomos glükozidegység, előnyösen glükóz. Az oligomerizáció foka, mely a monoglükozidok és oligoglükozidok megoszlását adja, 1-4,0 között elfogadható, előnyösen 1,0 és 2,0 között és legelőnyösebben 1,1-1,4 között van.

Az előnyben részesített alkil-poliglikozidok lineárisak, tehát olyan alkil-poliglikozid, melyben a poliglikozilmaradék egy glukózán és az alkilcsoport az n-alkil-csoporton van.

Az amin-oxid típusú nemionos tenzidek például az N-kókuszalkil-N,N-dimetil-amin-oxid és az N-faggyúalkil-N,N-dihidroxi-etil-amin-oxid, valamint a zsírsav-alkanol-amidok is megfelelnek. Az ilyen nemionos tenzidek mennyisége előnyösen nem több mint az etoxilezett zsíralkoholokké, adott esetben nem több mint ezek fele.

A további megfelelő tenzidek a (II) általános képletű polihidroxi-zsírsav-amidok:

R¹

I (ll)

R-CO-N-[Z] ahol az RCO jelentéses 6-22 szénatomos alifás acilcsoport, R¹ jelentése hidrogén, 1-4 szénatomos akiivagy hidroxil-alkil-csoport és [Z] jelentése egyenes vagy elágazó 3-10 szénantomos polihidroxi-alkil-csoport és 3-10 hidroxilcsoportból áll. A polihidroxi-zsírsav-amidok esetében ismert anyagokról van szó, amelyek általában egyes redukálócukrok ammóniával, alkil-aminnal vagy alkanol-aminnal reduktív aminálásával, és ezt követően zsírsav-alkil-észterrel vagy zsírsav-kloriddal végzett acilezéssel megkaphatok.

A polihidroxi-zsírsav-amidok csoportjához a (III) általános képletű vegyületek tartoznak:

| (Hl)

R-CO-N-[Z]

HU 225 362 Β1 ahol R jelentése egyenes vagy elágazó 7-12 szénatomos alkil- vagy alkenilcsoport, R¹ jelentése egyenes vagy elágazó vagy ciklikus 2-8 szénatomos akilcsoport vagy arilcsoport és R² jelentése egyenes vagy elágazó

1-8 szénatomos egyenes vagy elágazó vagy ciklikus alkilcsoport vagy arilcsoport vagy oxi-alkil-csoport, ahol C-^-alkil- vagy fenilcsoport előnyös, és [Z] jelentése lineáris polihidroxi-alkil-csoport, melynek alkillánca legalább két hidroxilcsoporttal szubsztituált, vagy ezen csoportok alkoxilezett, előnyösen etoxilezett vagy propoxilezett származékai.

Előnyösen [Z] egyes redukálócukrok, mint például glükóz, fruktóz, maltóz, laktóz, galaktóz, mannóz vagy xilóz reduktív aminálásával kapható meg. Az N-alkoxivagy N-aril-oxi-szubsztituált vegyületek úgy állíthatók elő, hogy a zsírsav-metil-észterekkel alkoxidkatalizátorok jelenlétében a kívánt polihidroxi-zsírsav-amiddá átalakítjuk.

Anionos tenzidként például a szulfonát és a szulfát típusúak használhatók. A szulfonát tenzidek közül előnyben részesítjük például a C₉_₁₃-alkil-benzolszulfonátokat, az oleil-szulfonátokat, azaz az alkén- és a hidroxi-alkánszulfonátokat, mint például a diszulfonátokat, amelyeket például C₁₂_₁₈-monoolefinekből, melyek a láncvégeken vagy annak belsejében kettős kötést tartalmaznak, gáz formájú kén-trioxiddal történő szulfonálással, majd ezután a szulfonált termék lúgos vagy savas hidrolízisével kapunk. Azok az alkánszulfonátok is megfelelnek, melyeket például C₁₂_₁₈-alkánokból szulfoklórozással vagy szulfoxidálással és végül hidrolízissel, illetve neutralizálással nyerhetünk. Hasonlóképpen az α-szulfozsírsav- (észterszulfonát) észterek, például a kókusz-, pálmamag- vagy faggyúzsírsavak α-szulfonált metil-észterei is megfelelnek.

Egy további alkalmas anionos tenzid a szulfátéit zsírsav-glicerin-észter. A zsírsav-glicerin-észterek alatt a mono-, di- és triésztereket, valamint ezek keverékeit értjük, amit monoglicerinből 1-3 mól zsírsavas segítségével észterezéssel állítunk elő vagy a trigliceridek 0,3-2 mól glicerinnel történő átészteresítésével kapunk. Ráadásul az előnyben részesített szulfatált 6-22 szénatomos telített zsírsavakból indulnak ki, mint amilyen például a kapronsav, a kaprilsav, a kaprlnsav, a mirisztinsav, a laurinsav, a palmitinsav, a sztearinsav vagy a behénsav (dokozánsav).

Alk(én)il-szulfátként Ci₂_i₈-zsíralkoholok kénsavfélészterek alkáli-, és különösen nátriumsói, például kókuszzsíralkohol, faggyúzsíralkohol, lauril-, mirisztil-, cetil- vagy sztearil-alkohol vagy C₁₀-C₂₀ lánchosszúságú oxo-alkoholok és ezek szekunder alkohollal alkotott félészterei előnyösek. Továbbá a megnevezett lánchosszúságú alk(én)il-szulfátok, melyek szintetikus, petrolkémiai alapokon előállított, egyenes láncú alkilcsoportot tartalmaznak, analóg lebontási gátlást mutatnak, mint a zsírkémiai nyersanyagok vegyületei. Mosástechnikai szempontból a C₁₂-C₁₈-alkil-szulfátok és a C₁₂-C₁₅-alkil-szulfátok, valamint a C₁₄-C₁₅-alkil-szulfátok érdekesek, és előnyben részesítettek. A 2,3-alkil-szulfát is a megfelelő anionos tenzidek közé tartozik.

Azok a kénsavmonoészterek is előnyösek, melyeket 1-6 mól etilén-oxiddal etoxilezett egyenes vagy elágazó láncú C₇_₂₁-alkoholokból, mint például a 2-metilesen elágazó C₉_₁i-alkoholokból, átlagban 3,5 mól etilén-oxiddal, vagy a C₁₂_₁₈ esetében 1-5 mól EO-val készülnek. A kis mennyiségben már megmutatkozó magas habzási képességük miatt a tisztítószerekben csak kis mennyiségben, 5 tömeg%-ig, például 1-5 tömeg%-ban alkalmazzák.

A további alkalmas anionos tenzidek azok az alkil-szulfoborostyánkősavsók, melyeket szulfoszukcinátnak vagy szulfoborostyánkősavészternek is neveznek, és amelyek a szulfoborostyánkősav alkoholokkal, előnyösen zsíralkoholokkal alkotott monoésztereiből és/vagy diésztereiből és adott esetben etoxilezett zsíralkoholokból állítanak elő. Az előnyben részesített szulfoszukcinát Cg_₁₈-zsíralkoholokat vagy ezek keverékét tartalmazzák. A különösen előnyben részesített megvalósítási formában a szulfoszukcinát egy zsíralkoholcsoportot tartalmaz, amelyet etoxilezett zsíralkoholokból vezethetünk le, amelyek maguk a nemionos tenzidek közé számítanak (leírásukat lásd lejjebb). Ráadásul, ezzel szemben a szulfoszukcinát, melynek zsíralkoholcsoportja etoxilezett zsíralkoholból korlátozott homológmegosztással vezethető le, különösen előnyös. Éppúgy az is lehetséges, hogy előnyösen 8-18 szénatomos alk(én)illáncos alk(én)il-borostyánkősavat vagy annak sóját alkalmazzuk.

Anionos tenzidekként különösen a szappanok jönnek tekintetbe. A megfelelők közé a telített zsírsavszappanok, mint például a laurilsav, mirisztilsav, palmitinsav, sztearinsav, hidrogénezett erukasav és a behénsav sói, valamint különösen a természetes zsírsavakból, mint például a kókusz-, pálmamag- vagy faggyúsavakból levezetett szappankeverékek tartoznak.

Az anionos tenzidek, beleértve a szappanokat is, nátrium-, kálium- vagy ammóniumsó formákban, valamint oldható szerves bázisokként, mint például a mono-, di- vagy trietanol-amin fordulhatnak elő. Előnyösen az anionos tenzidek nátrium- vagy káliumsó formákban, különösen nátriumsó formákban fordulnak elő.

A találmány szerinti mosó- és tisztítószerekben a tenzidek a kész szerre viszonyítva előnyösen 5-50 tömeg%-ban, előnyösebben 8-30 tömeg%-ban, és legelőnyösebben 8-30 tömeg%-ban fordulnak elő.

A találmány a következő fehérítőszereket tartalmazhatja. Fehérítőanyagként, a vízben H₂O₂-ot szolgáltató vegyületek közül a következők különös jelentőséggel bírnak: nátrium-perkarbonát, nátrium-perborát-tetrahidrát és a nátrium-perborát-monohidrát. A további alkalmazható fehérítőszerek a következők: peroxopirofoszfát, citrátperhidrát, valamint a H₂0₂-ot szolgáltató persavsók vagy persavak, mint például a perszulfát, illetve a perkénsav. Alkalmazható a karbamid-peroxohidrát-perkarbamid, ami a következő képlettel írható le: H₂N-CO-NaH₂*H₂O₂. A szilárd felületek tisztításához, elsősorban például a gépi mosogatáshoz, a fehérítőszert a szerves fehérítőszerek csoportjából választják, ezek a textíliák esetében is alkalmazhatók. A tipikus szerves fehérítőanyagok közé a

HU 225 362 Β1 diacil-peroxidok, mint például a dibenzoil-peroxid, tartoznak. További tipikus szerves fehérítőszerek a peroxisavak, ahol például különösen az alkil-peroxisavak és az aril-peroxisavak nevezhetők meg. Az előnyben részesített képviselők a peroxi-benzoesavak és ennek gyűrűben helyettesített származékai, mint például alkil-peroxi-benzoesavak, de a következők is idetartoznak: peroxi-a-naftoesav és a magnézium-monoperftalát, az alifás vagy szubsztituált alifás peroxisavak, mint például a peroxi-laurinsav, peroxi-sztearinsav, ε-ftálimido-peroxi-kapronsav (ftálimido-peroxi-hexánsav, PAP), o-karboxi-benzamido-peroxi-kapronsav, N-nonenil-amido-peradipinsav és N-nonenil-amido-perszukcinát, és az alifás és arilalifás peroxi-dikarbonsavak, mint például 1,12-diperoxi-karbonsav, 1,9-diperoxi-azelainsav, diperoxi-szebacinsav, diperoxi-brasszilsav, a diperoxi-ftálsavak, 2-decil-diperoxi-bután-1,4-disav, N,N-tereftaloil-di(6-amino-perkapronsav).

A fehérítőszer mennyisége a mosó- és tisztítószerben 1—40 tömeg% és előnyösen 10-20 tömeg%, ahol előnyösen perborát-monohidrátot vagy perkarbonátot alkalmazunk.

A 60 °C-on vagy a felett végzett mosásoknál a jobb fehérítés elérése érdekében kizárólagos alkotórészként fehérítést biztosító aktivátorokat alkalmazhatunk. A fehérítést aktiválóként olyan vegyületet alkalmazhatunk, amelyek előnyösen 1-10 szénatomos, előnyösebben

2-4 szénatomos alifás peroxokarbonsavakat a perhidrolízisnek megfelelő körülmények között, és/vagy adott esetben a szubsztituált perbenzoesavak adnak. A megfelelő anyagok azok, amelyek a megadott szénatomszámú O- és/vagy N-acil-csoportokat és/vagy adott esetben szubsztituált benzolcsoportot hordoznak. Előnyben részesítjük a többszörösen acilezett alkilén-diaminokat, különösen a tetraacetil-etilén-diamint (TAED), az acilezett triazinszármazékokat, különösen az 1,5-diacetil-2,4-dioxo-hexahidro-1,3,5-triazint (DADHT), az acilezett glükolurileket, különösen a tetraacetil-glükolurilt (TAGÚ), az N-acilimideket, különösen az N-nonanoil-szukcinimidet (NOSI), az acilezett fenolszulfonátokat, különösen az n-nonanoil- vagy izononanoil-oxi-benzolszulfonátot (η-, illetve izo-NOBS), az acilezett hidroxikarbonsavakat, mint például a trietil-O-acetil-citrát (TEOC), a karbonsavanhidrideket, különösen a ftálsavanhidridet, izatosavanhidridet és/vagy borostyánkősavanhidridet, karbonsavamidok, mint például N-metil-diacetamid, glikolid, acilezett többértékű alkoholok, különösen triacetin, etilénglikol-diacetát, izopropenil-acetát, 2,5-diacetoxi-2,5-dihidrofurán és az egyik német szabadalomból [DE 196 16 693 és DE 196 16 767 számú szabadalmi bejelentések] ismert enolészterek, mint például acetilezett szorbitol és mannitol, előnyösen az EP 0 525239 szabadalmi bejelentésben közzétett keverékek (SORMAN), acilezett cukorszármazékok, különösen pentaacetil-glükóz (PAG), pentaacetil-fruktóz, tetraacetil-xilóz és oktaacetil-laktóz, valamint acetilezett, adott esetben N-alkilezett glukamin, illetve glukonolakton, triazol, illetve triazolszármazékok és/vagy farokképző kaprolaktámok és/vagy kaprolaktámszármazékok, előnyösen N-acilezett laktámok, például N-benzoil-kaprolaktám és N-acetil-kaprolaktám, melyek a szakirodalomból ismertek [WO 94/27970, WO 94/28102, WO 94/28103, WO 95/00626, WO 95/14759 és WO 95/17498 számú szabadalmi bejelentések], A német DE 196 16 769 számú szabadalmi bejelentésből ismertek a hidrofilen szubsztituált acil-acetálok, és a német DE 196 16 770 számú szabadalmi bejelentésben, valamint a WO 95/14075 számú szabadalmi bejelentésben leírt acil-laktámok, melyeket szintén előnyben részesítünk. A német DE 4443 177 számú szabadalmi bejelentésből a hagyományosabb fehérítők kombinációi szintén alkalmazhatók. Hasonlóan a nitrilszármazékok, mint a ciano-piridin, nitrilquatok, mint például N-alkil-ammónium-acetonitrilek, és/vagy cianamidszármazékok alkalmazhatók. Az előnyben részesített fehérítőaktivátorok a következők: nátrium-4-(oktanoil-oxi)-benzolszulfonát, n-nonanoilvagy izononanoil-oxi-benzolszulfonát (η-, illetve izoNOBS), undecenil-oxi-benzolszulfonát (UDOBS), nátrium-dodekanoil-oxi-benzolszulfonát (DOBS), dekanoiloxi-benzoesav (DÓBA, OBC 10) és/vagy dodekanoiloxi-benzolszulfonát (OBS 12), valamint N-metil-morfolinum-acetonitril (MMA). Az ilyen fehérítőaktivátorok szokásos módon a teljes összetételre nézve 0,01-20 tömeg%-ban, előnyösen 0,1-15 tömeg%-ben, még előnyösebben 1-10 tömeg%-ban fordulhatnak elő.

A hagyományos fehérítőaktiválókhoz vagy azok helyett úgynevezett fehérítőkatalizátorok adhatók a formatestekbe. Ezek közé a fehérítést erősítő átmenetifémsók illetőleg átmenetifém-komplexek tartoznak, mint például Μη-, Fe-, Co-, Ru- vagy mosókomplexek vagy -karbonilkomplexek. Fehérítőkatalizátorként felhasználhatók a következők is: Μη-, Fe-, Co-, Ru-, Mo-, Ti-, V- és Cu-komplexek, N-t tartalmazó tripodális ligandok, valamint Co-, Fe-, Cu- és Ru-amin-komplexek, amely vegyületeket a szakirodalomban közzétették [DE 197 09 284 A1 számú szabadalmi bejelentés], A szakirodalom szerint acetonitrilszármazékok [WO 99/63038 számú szabadalmi bejelentés] és fehérítőaktiváló átmenetifém-komplex vegyületek az amilázzal kombinációban fehérítőhatást fejtenek ki [WO 99/63041 számú szabadalmi bejelentés].

Rendszerint a találmány szerinti szer egy vagy több kötőanyagot tartalmaz, különösen zeolitot, szilikátot, karbonátot, szerves kötőanyagot, és ha alkalmazásuk ökológiai problémákkal nem jár, akkor a foszfátokat is tartalmazhat. Végül az utóbbiak tisztítószerekbe a gépi mosogatáshoz előnyösen állományanyagok adhatók.

Az alkalmas kristályok a réteges nátrium-szilikátok, melyek általános képlete a következő: NaMSi_xO_2x+iH₂O, ahol M jelentése nátrium vagy hidrogénatom, x értéke 1,9-4 és y értéke 0-20 és előnyösen x értéke 2, 3 vagy 4. Az ilyen kristályos rétegszilikátokat például az EP-A-0 164 514 szabadalmi bejelentésben leírták. Az előnyben részesített kristályos rétegszilikátok képletében M jelentése nátrium és x értéket 2 vagy 3. Mind a β-, mind az δ-nátrium-diszilikátot, Na₂SÍ2O5 yH₂O, előnyben részesítjük. A kereskedelemben például ilyen termék az SKS® (Fa. Clariant). Az SKS-6® túlnyomó részben δ-nátrium-diszilikát, mely19

HU 225 362 Β1 nek képlete: Na₂Si₂O5*yH₂O, míg az SKS-7® túlnyomó részben β-nátrium-diszilikát. Savval reagáltatva (például citromsav vagy szénsav) a δ-nátrium-diszilikátból kanemit keletkezik (NaHSi₂O₅*yH₂O), melynek kereskedelmi neve SKS-9®, illetve SKS-10® (Fa. Clariant). Előnyös lehet ezen rétegszililátok kémiailag módosított változatainak alkalmazása is. így például a rétegszilikát lúgossága megfelelően befolyásolható. A foszfáttal, illetve karbonáttal dotált rétegszilikát kristályfelépítése a δ-nátrium-diszilikáthoz viszonyítva más, gyorsabban oldódik és a δ-nátrium-diszilikáthoz képest kalciumkötő képessége nagyobb. Így az xNa₂O*ySiO₂*z-P₂O₅ összegképletű vegyületeket, melyekben az x és y tartalom arányában 0,35-0,6-ig, a x és z tartalom 1,75-1200 arányban és a y és z tartalom 4-2800 arányban változhat, a szakirodalomban közzétették [DE 19601 063 számú szabadalmi bejelentés]. A rétegszilikátok oldékonysága növelhető, különösen finom részecskés rétegszilikátok alkalmazásával. A kristályos rétegszilikátok összetevői más alkotórészekkel együtt alkalmazhatók. Idetartoznak különösen a cellulózszármazékok, melyek előnyösen szétesést biztosító hatást mutatnak és különösen mosószertablettákban alkalmazhatók, valamint a polikarboxilezett vegyületek, mely közül például a citromsavakat, illetve polimer polikarboxilátokat, például az akrilsavak kopolimereket nevezzük meg.

Az amorf nátrium-szilikátok is alkalmazhatók, melyek Na₂O:SiO₂ aránya 1:2 és 1:3,3, előnyösen 1:2 és 1:2,8, és különösen előnyösen 1:2-1:2,6 között van, melyeknek oldódási késleltetésük van és másodlagos mosási tulajdonságokat mutatnak. Az oldódási késleltetés a hagyományos amorf nátrium-szilikátokkal szemben különbözőképpen, például felületi kezeléssel, kompaundálással, kompaktálással/tömörítéssel vagy kiszárítással idézhető elő. A találmány tárgykörében „amorf alatt „röntgenamorfot” is értünk. Ez azt jelenti, hogy a szilikát a röntgendiffrakciós kísérletekben éles röntgen-visszaverődést nem ad, ami a kristályos anyagokra egyébként tipikus, hanem éppenséggel a szórt röntgensugár egy vagy több maximumot mutat, melyek szélessége a diffrakciós szög többszöröse. Mégis egészen jó képtulajdonságokhoz vezet, ha a sziiikátrészecske az elektrondiffrakciós kísérleteknél elmosódott, de még éles diffrakciós maximumot ad. Ezt úgy magyarázhatjuk, hogy a mikrokristályos termék nagysága 10-től néhány száz nm-ig terjed, és ezek az 50 nm-es, és különösen a 20 nm-es maximumig előnyösnek számítanak. Az ilyen úgynevezett röntgenamorf szilikátokat, amelyek a hagyományos vízüveggel szemben lassabb oldódásúak, előnyben részesítjük. Különösen előnyben részesítjük a tömörített/kompaktált amorf szilikátokat, a kompaundált amorf szilikátokat és a túlszárított röntgenamorf szilikátokat.

Az alkalmazott finom kristályos, szintetikus és kötött vizet tartalmazó zeolit előnyösen a zeolit A és/vagy P. Zeolit P-ként a Zeolith MAP® (a Crosfield cég gyártmánya) különösen előnyös. Megfelelő még a zeolit X is, vagy mint például az A, X és/vagy P keverékek. A kereskedelemben kapható és a találmányban előnyösen alkalmazható példák a következők: a zeolit X-ből és a zeolit A-ból a Co-kristályosított termék (körülbelül 80 tömeg% zeolit X), ez a CONDEA Augusta S.p.A. cég terméke, és amelyet VEGOBOND AX® márkanéven forgalmaznak és a következő általános képlettel jellemezhető:

nNa₂O(1-n)K₂OAI₂O₃(2-2,5)SiO₂(3,5-5,5)H₂O

A megfelelő zeolit közepes részecskemérete kevesebb, mint 10 pm (térfogati megoszlás; mérési módszer: Coulter Counter) és előnyösen 18-22 tömeg%, adott esetben 20-22 tömeg% kötött vizet tartalmaz.

Magától érthető az is, hogy az általánosan ismert foszfátok mint kötőanyagok alkalmazása addig lehetséges, míg azok környezetvédelmi problémákat nem okoznak. A sok, kereskedelemben kapható foszfát közül a következők játszanak jelentős szerepet a mosóés tisztítószerek ipari előállításánál: alkálifém-foszfátok, különösen a pentanátrium-, illetve a pentakáliumtrifoszfát (nátrium-, illetve kálium-polifoszfát).

Az alkálifém-foszfátok a foszforsavak különböző alkálifém- (különösen a nátrium- és kálium-) sóinak összefoglaló elnevezése, amelyeknél a metafoszforsavak (HPO₃)_n és az ortofoszforsavak H₃PO₄ mellett nagyobb molekulatömegű képviselőket különböztethetünk meg. A foszfátok több előnnyel rendelkeznek. Alkálihordozóként működnek, gátolják a mészkőlerakódást a különböző géprészekbe, illetve a mészkő-inkrusztációt a szövetekbe, és ezenkívül a tisztításban hatékonyak.

A nátrium-dihidrogén-foszfát, NaH₂PO₄, dihidrátként (sűrűsége 1,91 g/cm³, olvadási pontja 60 °C) és monohidrátként (sűrűség 2,04 g/cm³) fordul elő. Mindkettő fehér só, vízben könnyen oldódó por, melyek kristályvizüket hevítéssel elveszítik, és 200 °C-on gyenge savban difoszfátot adnak (dinátrium-hidrogén-difoszfát, Na2H2P2O7), magasabb hőmérsékleten nátrium-trimetafoszfát (Na3P3O9) és Maddrell-féle sókká (lásd lejjebb) átalakulnak. A NaH2PO4 savas reakcióban akkor alakul ki, mikor a foszforsavat nátronlúggal pH 4,5 értékre állítják és a levet porlasztják. A kálium-dihidrogén-foszfát (primer vagy egybázisú kálium-foszfát, kálium-bifoszfát, KDP), a KH2PO4, fehér só melynek sűrűsége 2,33 g/cm³, és olvadáspontja 253 °C [a kálium-polifoszfát szétesése és képződése (ΚΡΟ3)χ] és vízben könnyen oldódik.

A dinátrium-hidrogén-foszfát (szekunder nátrium-foszfát), Na₂HPO₄, színtelen vízben könnyen oldódó kristályos só. Vízmentes formában létezik, és vízben 2 mólnál (sűrűség 2,066 g/cm³, vízvesztés 95 °C-on), 7 mólnál (sűrűség 1,68 g/cm³, olvadáspont 48 °C, 5 H2O-vesztéssel) és 12 mólnál (sűrűség 1,52 g/cm³, olvadáspont 35 °C, 5 H2O-vesztés után), 100 °C-on vízmentessé válik és magasabb hőmérsékleten difoszfáttá alakul Na₄P₂O₇. A dinátrium-hidrogén-foszfát foszforsav szódaoldatos semlegesítéssel, fenolftalein-indikátor jelenlétében előállítható. A dikálium-hidrogén-foszfát (másodlagos vagy kétbázisú kálium-foszfát), K₂HPO₄, amfoter tulajdonságú fehér só, mely vízben könnyen oldódik.

A trinátrium-foszfát, tercier nátrium-foszfát, Na₃PO₄, színtelen kristály, dihidrátként sűrűsége 1,62 g/cm³ és

HU 225 362 Β1 olvadáspontja 73-76 °C (szétesik), dekahidrátként (ez megfelel 19-20% P₂O₅-nak) olvadáspontja 100 °C és vízmentes formában (ez megfelel 39-40% P₂O₅-nak) sűrűsége 2,536 g/cm³. A trinátrium-foszfát vízben alkalikus reakcióban könnyen oldódik, és pontosan 1 mól dinátrium-foszfát-oldatból bepárolva állítható elő. A trikálium-foszfát (tercier vagy hárombázisú kálium-foszfát), K3PO4, fehér, elfolyosodó szemcsés por, melynek sűrűségű 2,56 g/cm³, olvadáspontja 1340 °C, és vízben alkalikus reakcióval könnyen oldódik. Például a Thomas salak szénnel és kálium-szulfáttal történő melegítésével jön létre. Magas ára miatt a tisztítószeriparban a könnyebben oldódó, mégis nagy hatású kálium-foszfátot részesítik előnyben a nátriumvegyületekkel szemben.

A tetranátrium-difoszfát (nátrium-pirofoszfát), Na₄P₂O₇, vízmentes formában (sűrűsége 2,534 g/cm³, olvadáspontja 988 °C, de 880 °C-ot tüntetnek fel) és dekahidrátként fordul elő (sűrűsége 1,815-1,836 g/cm³, olvadáspontja vízvesztés után 94 °C). Mindkét anyag színtelen, vízben alkalikus reakcióban a kristályok oldódnak. A Na₄P₂O₇ a dinátrium-foszfát 200 °C feletti hőmérsékletre hevítésével nyerhető, vagy foszforsavat szódával sztöchiometrikus arányban egyesítünk, és az oldatot porlasztással víztelenítjük. A dekahidrát komplexben lévő nehézfémsót tartalmaz és a víz keménységét csökkenti. A kálium-difoszfát (kálium-pirofoszfát), K₄P₂O₇, trihidrát formában létezik, színtelen higroszkópos porként, melynek sűrűsége 2,33 g/cm³, vízben oldódik, így pH-értéke 1%-os oldatban 25 °C-on 10,4.

A NaH₂PO₄, illetőleg a KH₂PO₄ kondenzációjával keletkező magas molekulatömegű nátrium- és kálium-foszfát, melynek ciklikus képviselője a nátrium-, illetőleg a kálium-metafoszfát, és a láncképző típusok, melyek esetében nátrium-, illetve a kálium-polifoszfát különböztethető meg. Különösen az utóbbinál számos megnevezés ismeretes: olvadó vagy glükofoszfát, Graham-féle só, Kurrol- és Maddrel-féle só. Itt az összes magasabb nátrium- és kálium-foszfátot együttesen kondenzált foszfátnak nevezzük.

A technikailag fontos pentanátrium-trifoszfát, Na₅P₃O₁₀ (nátrium-tripolifoszfát), vízmentes vagy 6 vizet tartalmazó kristályosodó, nem higroszkópos fehér vízben oldható só, melyek általános képlete a következő: NaCHPÍOXONaj-Ojn-Na, ahol n=3. Száz gramm vízben szobahőmérsékleten körülbelül 17 g, 60 °C-on körülbelül 20 g, 100 °C-on körülbelül 32 g kristályvízmentes só oldódik; az oldat 100 °C kétórás melegítés után 8%-ban hidrolízissel keletkező ortofoszfátot és 15% difoszfátot tartalmaz. A pentanátrium-trifoszfát előállításánál a foszforsavat a szódaoldattal vagy nátronlúggal sztöchiometrikus arányban reakcióba hozzuk, és az oldatot porlasztással vízmentesítjük. A Graham-féle sóhoz és a nátrium-difoszfáthoz hasonlóan a pentanátrium-trifoszfát több oldhatatlan fémvegyületet tartalmaz (kálisókat stb.). A pentanátrium-trifoszfát K5P3O10 (kálium-tripolifoszfát) például 50 tömeg%-os oldatban kerül forgalomba (>23% P₂O₅, 25% K₂O). A kálium-polifoszfátot a mosó- és tisztítószeriparban széles körben felhasználják. Továbbá nátrium-kálium-tripolifoszfátként is léteznek, melyeket éppen a találmány tárgykörében alkalmazunk. Ezek például akkor keletkeznek, ha a nátrium-trimetafoszfátot KOH-dal hidrolizáljuk: (NaPO₃)₃+2 KOH Na₃K₂P₃O₁₀+H₂O.

Ezek a találmány szerint mint nátrium-tripolifoszfát, kálium-tripolifosztát vagy ezek keverékeként pontosan adagolhatók; a nátrium-tripolifoszfát és a nátrium-kálium-tripolifoszfát keverékek a kálium-tripolifoszfát és a nátrium-kálium-tripolifoszfát keverékek, vagy a nátrium-tripolifoszfát és a kálium-tripolifoszfát és nátriumkálium-tripolifoszfát keverékek szintén alkalmazhatók.

Szerves kötőanyagként a találmány szerinti mosóés tisztítószerekbe különösen a polikarboxilátok vagy a polikarbonsavak, polimer polikarboxilátok, poliaszparaginsavak, poliacetálok, adott esetben oxidált dextrinek, továbbá szer kötőanyagok (lásd lejjebb), mint például foszfonátok adagolhatók.

A használható szerves vázanyagok példái a nátriumsó formában alkalmazható polikarbonsavak, mint például a citromsav, az adipinsav, a borostyánkősav, a glutársav, a borkősav, a cukorsavak, az aminokarbonsavak, a nitrilo-triecetsav (NTA), hacsak az ilyen alkalmazások ökológiai szempontból nem kifogásolhatók, valamint az ezekből készült keverékek. Előnyben részesítjük a polikarbonsavak sóit, mint például a citromsavat, az adipinsavat, a borostyánkősavat, a glutársavat, a borkősavat, a cukorsavakat és az ezekből készült keverékeket.

Savak is adagolhatók. Kötőanyaghatásuk mellett tipikusan savasítókomponensként szerepelhetnek, ezzel nemcsak a mosó- és tisztítószereknél az alacsonyabb és közepes pH-tartományok beállítását biztosítják, hanem a szokásos komponensek pH-értékét is. Ehhez különösen a rendszerre és a környezetre ártalmatlan savak alkalmasak, mint például citromsav, ecetsav, bórsav, almasav, tejsav, glikolsav, borostyánkősav, glutársav, adipinsav, glukonsav és ezek előnyös keverékei. De az ásványi savak is, mint például kénsav, vagy a lúgok, különösen ammónium- vagy alkáli-hidroxid, pH-szabályozóként szolgálhatnak. Az ilyen szabályozók a találmány szerinti szerekben előnyösen nem több mint 20 tömeg%-ban, különösen 1,2-17 tömeg%-ban fordulhatnak elő.

Kötőanyagként további polimer polikarboxilátok is megfelelnek, melyek például a poliakrilsavak vagy a polimetakrilsavak alkálifémsói, például melyek viszonylagos molekulatömege 500-70 000 g/mol.

A polimer polikarboxilátnál megadott móltömegek a találmány szellemében a mindenkori savforma tömegének középértékére vonatkozik, melyet alapvetően gélpermeabilitási kromatográfiával (GPC) határozunk meg UV-detektálás mellett. A meghatározás belső poliakrilsavs-tandarddal történik, mely strukturálisan a vizsgált polimerekkel rokonságban van, és közel azonos molekulatömegű. Ezek lehetővé teszik, hogy a polisztirolszulfonsav standardként szolgáljon. Rendszerint a polisztirolszulfonsavakkal szemben mért móltömegek magasabbak, mint a leírásokban megadottak.

A megfelelő polimer elsődlegesen poliakrilát, melynek előnyösen molekulatömege 2000-20 000 g/mol.

HU 225 362 Β1

Kitűnő oldékonyságuk miatt a csoportból a rövid láncú poliakrilátok előnyösek, melyek móltömege 2000-10 000 g/mol, és különösen előnyösen 3000-5000 g/mol.

Megfelelnek továbbá azok a kopolimer polikarboxilátok is, melyek különösen az akrilsavak metakrilsavakkal és az akrilsavak vagy metakrllsavak maleinsawal alkotott vegyületei. Különösen előnyös az akrilsav kopolimere maleinsawal, melyben az akrilsav 50-90 tömeg% és a maleinsav 50-10 tömeg%. Viszonylagos molekulatömege a szabad savra nézve általában 2000-70 000 g/mol, előnyösen 20 000-50 000 g/mol, és különösen előnyösen 30 000-40 000 g/mol. A (ko)polimer polikarboxilátok vagy porban, vagy vízben kialakított oldatban adagolhatok. A szerben a (ko)polimer polikarboxilátok mennyisége 0,5-20 tömeg%, különösen 1-10 tömeg% lehet.

A vízoldékonyság javításához a polimer allil-szulfonsavakat, mint például allil-oxi-benzolszulfonsavakat és metallil-szulfonsavakat monomerként tartalmazhat.

Különösen előnyben részesített a biológiailag lebomló polimerek két eltérő monomeregységet tartalmaznak, például melyek az akrilsavak monomer sói, és a maleinsav, valamint a vinil-alkohol, illetve a vinil-alkohol származékai vagy az akrilsavak monomer sói, és

2-alkil-allil-szulfonsavat, valamint cukorszármazékot tartalmaznak.

A további előnyben részesített kopolimerek monomerként előnyösen akroleint és akrilsavat/akrilsavsókat, illetve akroleint és vlnil-acetátot tartalmaznak.

Hasonlóan a további előnyben részesített kötőanyagok közé tartoznak a polimer aminodikarbonsavak, ezek sói vagy az ezekből levezethető vegyületek. Különösen előnyösek a pollaszparaginsavak, illetve ezek sói és származékai.

A további megfelelő kötőanyagok közé tartoznak a pollacetálok, melyek a dialdehidek polikarbonsavakkal adott reakciójában keletkeznek, melyek 5-7 szénatomosak és legalább 3 hidroxilcsoporttal rendelkeznek. Az előnyben részesített poliacetálok dialdehideket, mint például glioxált, glutáraldehidet, tereftálaldehidet, valamint ezek keverékeit és polikarbonsavakat, mint például glükonsavat és/vagy glukoheptonsavat tartalmaznak.

A további megfelelő szerves kötőanyagok a dextrinek, például a szénhidrátok oligomerjei, illetve polimerjei, melyek a keményítő részleges hidrolízisével állíthatók elő. Rendszerint a hidrolízist például sawal vagy enzimmel katalizálhatjuk. Előnyösen a hidrolízistermék közepes móltömegű, 400-500 000 g/mol. Ráadásul a poliszacharid dextrózekvivalense (DE) előnyös, mivel DE értéke a 0,5-40, különösen a 2-30 tartományban található, ahol a DE az a szükséges tömeg, mely a poliszacharidok redukálóhatásához szükséges, összevetve a dextrózzal, melynél a DE=100. Használható mind maltodextrin, melynek DE tartománya 3-20 közé esik, mind szárított glükózszirup, melynek DE tartománya 20-37 közé esik, mind az úgynevezett sárgadextrin és fehérdextrin, magasabb móltömegnél 2000-30 000 g/mol között.

Az ilyen dextrinek oxidált származékait olyan oxidációs anyagokkal alakíthatjuk ki, melyek a karbonsavas reakciónál az oxidáláshoz a szacharidgyürű legalább egy alkoholcsoportját biztosítják. Különösen előnyös szerves kötőanyagok a találmány szerinti szerekhez az oxidált keményítők, illetve ezek származékai, melyeket a szakirodalomban közzétettek [EP 472 042, WO 97/25399 és EP 755 944 számú szabadalmi bejelentések].

Az oxi-diszukcinátok és a diszukcinátok más származékai is, előnyösen az etilén-diamin-diszukcinát, megfelelő kötőanyagok. Ehhez előnyösen az etilén-diamin-N.N’-diszukcinát (EDDS) nátrium- vagy magnéziumsó formában fordul elő. Továbbá ebből a szempontból előnyös a glicerin-diszukcinát és a glicerin-triszukcinát is. Az adagolás megfelelő mennyisége a zeolittartalmúaknál és/vagy a szilikáttartalmúaknál 3-15 tömeg%.

A további alkalmazható szerves kötőanyagok közé tartoznak például az acilezett hldroxikarbonsavak, illetve ezek sói, melyek adott esetben lakton formában fordulhatnak elő, és amelyek legalább 4 szénatomot és legalább egy hidroxilcsoportot, valamint maximálisan két savcsoportot tartalmaznak.

A kötőanyagok további képviselői a foszfonátok alcsoportjába tartoznak. Ezek közül különösen előnyösek a hidroxi-alkán-, illetve az amino-alkánfoszfonátok. Hidroxi-alkánfoszfonátok közül az 1-hidroxi-etán1,1-difoszfonát (HEDP) különös jelentőséggel bíró kötőanyag. Ezt előnyösen nátriumsó formában adagoljuk, ahol a dinátriumsó semleges és a tetranátriumsó lúgos (pH 9). Amino-alkánfoszfonátként előnyösek a következők: etilén-diamin-tetrametilén-foszfonát (EDTMP), dietilén-triamin-pentametilén-foszfonát (DTPMP), valamint ezek magasabb rendű homológjai. Ezeket előnyösen semlegesen reagáló nátriumsó formában adagoljuk, például az EDTMP hexanátriumsójaként, illetve a DTPMP hepta- és oktanátriumsójaként. A foszfonátok osztályából ezért kötőanyagként előnyösen HEDP-t alkalmazunk. Az amino-alkánfoszfonátok ehhez kiemelkedő nehézfémkötési képességgel rendelkeznek. Ennek megfelelően, különösen ha a szer fehérítőt is tartalmaz, előnyös lehet az amino-alkánfoszfonátok, különösen a DTPMP alkalmazása, vagy a megnevezett foszfonátok keverékeinek adagolása.

A fenti összes vegyület alkáliföldfémekkel komplexben kialakíthatók és kötőanyagként így alkalmazhatók.

Adott esetben a találmány szerinti szerekben a kötőanyagok 90 tömeg%-ig lehetnek jelen. Előnyösen 75 tömeg%-ot tartalmaznak. A találmány szerinti mosószer kötőanyag-tartalma 5-50 tömeg%. A találmány szerinti kemény felületek tisztítására szolgáló tisztítószerekben, különösen a gépi mosogatógépeknél alkalmazottaknál, 5-88 tömeg% kötőanyag szerepelhet, amikor is az ilyen szerekben előnyösen vízben oldhatatlan kötőanyagot nem alkalmazunk. Egy előnyben részesített megvalósítási formában a találmány szerinti szer különösen az edények gépi tisztításához 20-40 tömeg% vízben oldódó szerves kötőanyagot, így 5 tömeg% alkáli-citrátot, 5-15 tömeg% alkáli-karbonátot és 20-40 tömeg% alkáli-diszilikátot tartalmaz.

HU 225 362 Β1

Az oldószer, mely a folyékony-gélképző mosó- és tisztítószer-összetételekben szerepelhet, például a következőkből származhat: többértékű alkoholok csoportja, alkanol-aminok vagy glikol-éter, amennyiben a megadott koncentrációtartományban vízzel elegyíthető. Előnyösen az oldószert a következők közül választjuk ki: etanol, n- vagy i-propanol, butanolok, etilénglikolmetil-éter, etilénglikol-etil-éter, etilénglikol-propil-éter, etilénglikol-mono-n-butil-éter, dietilénglikol-metil-éter, dietilénglikol-etil-éter, propilénglikol-metil-, -etil- vagy -propil-éter, dipropilénglikol-monometil- vagy -etil-éter, diizopropilénglikol-monometil-, vagy -etil-éter, metoxi-, etoxi- vagy butoxi-triglikol, 1-butoxi-etoxi-2-propanol,

3-metil-3-metoxi-butanol, propilénglikol-t-butil-éter, valamint ezek elegyei.

A találmány szerinti folyékonygél-képző mosó- és tisztítószerekben az oldószer mennyisége 0,1-20 tömeg⁰/), előnyösen 15 tömeg%-nál kevesebb, és előnyösebben 10 tömeg%-nál kevesebb.

A találmány szerinti összetételek viszkozitásának beállítására töményítőszert, illetve töményítő rendszert adagolunk. Ezek a nagy molekulatömegű anyagok, melyek duzzasztószerként ismertek, a folyadékot beszívják és megduzzadnak, és így végül sűrűn folyó valódi vagy kolloid oldatot alakítanak ki.

A megfelelő töményítőszer szervetlen vagy szerves polimer vegyület. A szervetlen töményítőszerek közé számítanak például a polikieselsavak, agyagásványok, mint például zeolit, kieselsavak és a bentonit. A szerves töményítőszerek a természetes polimerekből vezethetők le, melyek változtatható természetes polimerek és teljesen szintetikus polimerek lehetnek. Az ilyen természetes eredetű polimerek példái a következők: agaragar, carrageen, tragantmézga, gumiarábikum, alginát, pektin, poliozok, guarliszt, jánoskenyérfa magjának lisztje, keményítő, dextrin, zselatin és kazein. A változtatható természetes anyagok, melyek töményítőszerként alkalmazhatók, mindegyike a keményítők és a cellulózok módosított változatai. Például a következők ismertek: karboxi-metil-cellulóz és más cellulóz-éterek, hidroxi-etil- és -propil-cellulóz, valamint a maglisztéter. A teljesen szintetikus töményítőszerek példái a következők: polimerek, mint például poliakrilés polimetakrilvegyületek, vinilpolimerek, polikarbonsavak, poliéterek, poliiminek, poliamidok és poliuretánok.

A kész összetételre vonatkoztatva a töményítőszerek mennyisége 5 tömeg%, előnyösen 0,05-2 tömeg⁰/), és legelőnyösebben 0,1-1,5 tömeg%.

A találmány szerinti mosó- és tisztítószerek adott esetben további szokásos alkotórészeket tartalmazhatnak: kibocsátószereket, elektrolitokat és további segédanyagokat, mint például optikai derítőszereket, fakulásgátló anyagokat, ezüstkorrózió-gátlókat, színváltozást gátló anyagokat, habgátlókat, dörzsanyagokat, színanyagokat és/vagy illatanyagokat, valamint mikrobiális hatóanyagokat és/vagy UV-abszorbeáló anyagokat.

A találmány szerinti textíliákat mosó szereket optikai derítőkkel, a diamino-sztilbéndiszulfonsav-származékokkal, illetve ezek alkálifémsóival egészíthetjük ki. Megfelel például a 4,4’-bisz(2-amino-4-morfolino-1,3,5-triazinil-6-amino)-sztilbén-2,2’-diszulfonsav sója, vagy ezzel egyenértékű vegyület, ahol a morfolinocsoport helyett dietanol-amino-csoport, metil-amino-csoport, anilinocsoport vagy 2-etoxi-etil-amino-csoport található. A további derítők típusai lehetnek a szubsztituált difenil-sztirilek, például a 4,4’-bisz(2-szulfosztirilj-difenilek, a 4,4’-bisz(4-klór-3-szulfosztiril)-difenilek, vagy a 4-(4-klór-sztiril)-4’-(2-szulfosztiril)-difenilek alkálisói. Az előzőekben megnevezett optikai derítők elegyei is alkalmazhatók.

A szürkülésgátló anyagok feladata a textilrostokról lemosott szennyeződés szabadon úszó fázisba juttatása és ott tartása. Ide vízben oldódó kolloidok, legtöbbször természetes eredetű anyagok felelnek meg, mint például keményítő, enyv, zselatin, keményítő, cellulóz éterkarbonsavainak vagy éterszulfonsavainak sói vagy a cellulóz vagy keményítő kénsavészterei. A vízben oldható savas csoportú poliamidok erre a célra alkalmazhatók. Továbbá a fentiekben megnevezett keményítőszármazékok, mint például az aldehidkeményítők is felhasználhatók. Az előnyben részesített cellulózéterek a következők: karboxi-metil-cellulóz (Na-só), metil-cellulóz, hidroxi-alkil-cellulóz és kevert éterek, mint például metil-hidroxi-etil-cellulóz, metil-hidroxi-propil-cellulóz, metil-karboxi-metil-cellulóz és ezek keverékei, például a szerre vonatkoztatva 0,1-5 tömeg%-ban.

Az ezüstkorrózió-védelem érdekében a találmány szerinti tisztítószerekben edény-ezüstkorróziógátlókat alkalmazunk. Ezek a szakirodalomban jártas szakemberek számára ismertek, ilyen például a benzotriazol, a vas(lll)-klorid vagy a CoSO₄. A szakirodalomból ismert [EP 0 736 084 B1 számú szabadalmi bejelentés] az is, hogy az enzimek mangán-, titán-, cirkónium-, hafnium-, vanádium-, kobalt- vagy cériumsóival és/vagy komplexeivel együtt jól használhatók ezüstkorrózió elleni védelemre, ahol a megnevezett fémek II, III, IV, V vagy VI oxidációs fokúak. E vegyületekre példák a MnSO₄, V2O5, V₂O₄, VO₂, TiOSO₄, K₂TiFg, Kr₂ZrFe₆, Co(NO₃)₂, Co(NO₃)₃, valamint ezek keverékei.

A „földet kiűző” hatóanyagok vagy a „földet kitaszító” anyagok főleg polimerek, melyek mosószerben való használatukkor a fehérneműrostoknak szennytaszító tulajdonságot kölcsönöznek, és/vagy a szokásos mosószer alkotórészek szennyleoldó képességét támogatják. Hasonló hatás érhető el tisztítószerekben alkalmazva a szilárd felületeken is.

Különösen hatékonyak és már régóta ismertek a földet kitaszító hatóanyagok, melyek a dikarbonsavak-, alkilénglikol- és polialkilénglikol-egységek kopoliészterei. Ide például a polietiléntereftalát és a polietilénglikol kopolimerei vagy kevert polimerei tartoznak [DT 16 17 141, és DT 22 00 911 számú szabadalmi bejelentések]. A szakirodalomban [DT 22 53 063 számú szabadalmi bejelentés] savas szerek ismertek, melyek többek között dibázisos karbonsavak és alkilén- vagy cikloalkilénpoliglikolt tartalmaznak. Ismeretesek etiléntereftalát és polietilén-oxid-tereftalát polimerek, melyeket mosószerekben alkalmaznak [DE 28 57 292, DE 33 24 258 és EP 0 253 567 számú szabadalmi bejelentések], Az EP 066 944 számú szabadalmi bejelen23

HU 225 362 Β1 tés olyan szerre vonatkozik, mely etilénglikol, polietilénglikol, aromás dikarbonsavak és szulfonált aromás dikarbonsavak meghatározott arányú kopoliésztereit tartalmazza. A szakirodalomban [EP 0 185 427 számú szabadalmi bejelentés] ismertek végükön metil- vagy etilcsoportokat tartalmazó poliészterek etilén- és/vagy propiléntereftalát- és polietilén-oxid-tereftalát-egységekkel, és olyan mosószerek, melyek az ilyen földet kitaszító polimert tartalmazzák. Az EP 0 241 984 számú szabadalmi bejelentés poliészterre vonatkozik, mely az oxi-etilén-csoportok és a tereftálsavegységek mellett szubsztituált etilénegységeket, valamint glicerinegységeket tartalmaz. A szakirodalomból [EP 0 241 985 számú szabadalmi bejelentés] ismert olyan poliészter, mely az oxi-etilén-csoportok és tereftálsavegységeken kívül 1,2-propilén-, 1,2-butilén- és/vagy 3-metoxi-1,2propilén-csoportokat, valamint glicerinegységeket tartalmaz, és láncai C-|-C₄ alkilcsoportokkal záródnak. A szakirodalomból [EP 0 272033 számú szabadalmi bejelentés] ismeretesek C₁—C₄-alkil- vagy acilcsoporttal zárt poliészterek, melyek polipropiléntereftalát- és polioxi-etilén-tereftalát-egységeket tartalmaznak. Az EP 0 274 907 számú szabadalmi bejelentés szulfoetil-végcsoporttal zárt tereftaláttartalmú földkibocsátó poliésztert ismertet. Az EP 0 357 280 számú szabadalmi bejelentés szerint a földkibocsátó poliészterek előállíthatok telítetlen végcsoportos szulfonálással tereftalát-, alkilénglikol- és poli-C₂_₄-glikol-egységek segítségével. A WO 95/32232 számú szabadalmi bejelentés aromás szennyleoldó képességű poliészterekre vonatkozik. A szakirodalomból [WO 97/31085 számú szabadalmi bejelentés] ismert, hogy a pamuthoz nincs olyan többfunkciós csoportot tartalmazó polimer, mely földkitaszító hatású lenne. Az első egység például kationos lehet a pamut felületi adszorpciójához, elektrosztatikus kölcsönhatásban, és a második egység hidrofób területet alakít ki, mely a hatóanyag megmaradását biztosítja a pamut-víz határfelületen.

A találmány szerinti textíliákhoz használható szerekhez színfakulást gátló anyagok adagolhatok, elsősorban a következők: poli(vinil-pirrolidon), poli(vinil-imidazol), polimer N-oxidok, mint például poli-(vinil-piridin-N-oxid) és a vinil-pirrolidon vinil-imidazollal alkotott kopolimere.

A gépi tisztítóeljárásokhoz előnyös lehet a habgátlók alkalmazása. Habzásgátlóként alkalmasak például a természetes vagy szintetikus eredetű szappanok, melyek nagy része C₁₈-C₂₄-zslrsav. A megfelelő nem tenzidszerű habzásgátlók például a szerves polisziloxánok és ezek mikrofinom, adott esetben szilánozott kieselsavaival adott keverékei, valamint paraffin, viasz, mikrokristályos viasz és ezek keverékei szilánozott kieselsavakkal vagy bisztearil-etilén-diamiddal. A különböző habzásgátlók keverékei is előnyösen alkalmazhatók, mint például a szilikonokból, paraffinekből vagy viaszokból állók. Előnyösen a habzásgátlók, különösen a szilikon- és/vagy paraffintartalmú habzásgátlók, szemcsések, vízben oldódnak, illetőleg a hordozóanyaghoz kötötten diszpergálhatók. Különösen a paraffinekből és bisztearil-etilén-diamidekből álló keverékek előnyösek.

A találmány szerinti kemény felületek tisztítására alkalmas tisztítószerek dörzshatású alkotórészeket tartalmazhatnak, különösen a következő csoportokból: kvarcliszt, faliszt, műanyagliszt, kréta és mikroüveggömbök, valamint ezek keverékei. A dörzsanyagok a találmány szerinti tisztítószerekben előnyösen nem több mint 20 tömeg%-ban, előnyösebben 5-15 tömeg%-ban fordulnak elő.

A szín- és illatanyagokat a mosó- és tisztítószerekbe a termék esztétikai hatásának javítására adagolunk, és a felhasználó számára a termék „tipikus és összetéveszthetetlen” látványának, valamint érzetének biztosítására. Parfümolajként, illetőleg illatanyagként szaganyagvegyületeket, mint például észter, éter, aldehid, keton és szénhidrogén típusú szintetikus termékek alkalmazhatók. Az észter típusú illatanyag-vegyületek például a következők: benzil-acetát, a fenoxi-etil-izobutirát, p-terc-butil-ciklohexil-acetát, linalil-acetát, dimetilbenzil-karbanil-acetát, fenil-etil-acetát, linalil-benzoát, benzil-formiát, etil-metil-fenil-glicinát, allil-ciklohexil-propionát, sztiraliil-propionát és benzil-szalicilát. Az éterekhez számítanak például a benzil-etil-éter és az Ambroxan, az aldehidekhez számítanak például a 8-18 C-atomos lineáris alkanálok, citrál, citronellál, citronellil-oxi-acetaldehid, ciklámenaldehid, Lilial és Bourgeonal, a ketonok közé tartoznak például a Jonone, α-izometilionon és metil-cedrilketon, az alkoholok közé például az anetol, citronellol, eugenol, geraniol, linalool, fenil-etil-alkohol és a terpineol, a szénhidrogének közé főleg a terpének, mint például a limonén és Pinen tartoznak. Mégis előnyben részesítjük a különböző illatanyagok keverékeinek használatát, melyek közösen vonzó, egyéni illatot biztosítanak. Az ilyen parfümolajokat természetes illatanyag keverékekből is megkaphatjuk, mint például növényi forrásokból, így fenyő-, citrus-, jázmin-, Patchouly-, rózsa- vagy ilang-ilang-olajból. Hasonlóképpen alkalmasak a muskotályzsája-olaj, kamillaolaj, szegfűolaj, mézfűolaj, mentaolaj, fahéjlevélolaj, hársvirágolaj, borókaolaj, vetiveolaj, olibanumolaj, galbanumolaj és labdanumolaj, valamint narancsolaj, neroliol, narancshéjolaj és szantálfaolaj. Általában a találmány szerinti fehérítő- és színanyagok a teljes kiszerelés több mint 0,01 tömeg%-át, míg az illatanyagok legfeljebb 2 tömeg%-át alkothatják.

Az illatanyag közvetlenül a találmány szerinti szerbe beépíthető, de az is előnyös lehet, ha az illatanyagot a hordozóra hordjuk fel, mellyel a parfümök felületi tapadását a fehérneműn megerősítjük, és ezzel a textíliából hosszabb illatfelszabadulást érünk el. Az ilyen hordozóanyagok közé például a ciklodextrin választható, ahol a ciklodextrin-parfüm komplex pótlólagosan még további segédanyagokkal rétegezhető. Egy további illatanyag-hordozó a későbbiekben leírt zeolit X, melynek alkalmazása a tenzides keverékekkel és az illatanyagokkal egyaránt lehetséges.

Az előnyben részesített színanyagok, azok kiválasztása a szakirodalomban jártas szakemberek számára minden nehézség nélkül megtehető, melyek közül előnyös azok kiválasztása, melyek tárolási stabilitása és érzékenysége a szokásos alkotórészekhez ké24

HU 225 362 Β1 pest magas, és a textilrostokat érő fénnyel, valamint behatásokkal szemben ellenállóak, miközben nem színező hatásúak.

A mosó- és tisztítószerek a mikroorganizmusok ellen antimikrobiális hatóanyagokat tartalmazhatnak. Itt a hatásmechanizmus és spektruma alapján megkülönböztetünk bakteriosztatikus és baktericid anyagokat, fungisztatikumokat és fungicideket és így tovább. E csoport fontos anyagai például a következők: benzalkónium-klorid, alkil-aril-szulfonát, halogénezett fenol és fenol-merkuri-acetát. Az antimikrobiális hatás és az antimikrobiális hatóanyagok jelentése a találmányban a szakirodalomban jártas szakemberek számára nyilvánvaló [WallháuBer: Praxis dér Sterilisation, Desinfektion-Konservierung: Keimidentifizierung - Betriebshygiene (5. kiadás) Stuttgart; New York: Thieme, (1995)], melyben leírt összes antimikrobiális hatású vegyület alkalmazása a találmányban elképzelhető. A megfelelő antimikrobiális hatóanyagot előnyösen a következő csoportokból választjuk ki: alkoholok, aminok, aldehidek, antimikrobiális savak, illetőleg ezek sói, karbonsavészterek, savamidok, fenolok, fenolszármazékok, difenilek, difenil-alkánok, karbamidszármazékok, oxigén- és nitrogén-acetálok, valamint formiátok, benzamidin, izotiazolin, ftálimidszármazékok, piridinszármazékok, antimikrobiális felületaktív vegyületek, guanidin, antimikrobiális amfoter vegyületek, kinolinok, 1,2-dibróm-2,4-diciano-bután, jód-2-propil-butil-karbamát, jód, jodofórok, peroxovegyületek, halogénvegyületek, valamint az előzőek keverékei.

Az antimikrobiális hatóanyagokat a következők közül választhatjuk ki: etanol, n-propanol, i-propanol, 1,3-butándiol, fenoxi-etanol, 1,2-propilénglikol, glicerin, undecilénsav, benzoesav, szalicilsav, dihidroecetsav, o-fenil-fenol, N-metil-morfolin-acetonitril (MMA), 2benzil-4-klór-fenol, 2,2'-metilén-bisz(6-bróm-4-klór-fenol), 4,4'-diklór-2’-hidroxi-difenil-éter (Dichlosan), 2,4,4’-triklór-2’-hidroxi-difenil-éter (Trichlosan), klór-hexidin, N-(4-klór-fenil)-N-(3,4-diklór-fenil)-karbamid, N, N ’-(1,10-dekándiil-di-1 -pirid ini l-4-ilidén )-bisz( 1 -oktán-amin)-dihidroklorid, N,N’-bisz(4-klór-fenil)-3,12-diimino-2,4,11,13-tetraaza-tetradekándiimidamid, glukoprotaminok, antimikrobiális felületaktív kvatemer vegyületek, guanidinek, beleértve a bi- és poliguanidineket, mint például 1,6-bisz(2-etil-hexil-biguanido-hexán)-dihidroklorid, 1,6-di(N₁,N₁'-fenil-diguanido-N₅,N5’)-hexán-tetrahidroklorid, 1 .e-diíN^N^-fenil-N-i.N^-metil-diguanido-N₅,N5’)-hexán-dihidroklorid, 1 .e-diíN^N/o-klór-fenil-diguanido-N₅,N₅’)-hexán-dihodroklorid, 1,6-di(N₁,N₁’-2,6-diklór-fenil-diguanido-N₅,N₅’)-hexán-dihidroklorid, 1,6-di[Ni,N.,’-béta-(p-metoxi-fenil)-diguanido-N₅,N₅’]-hexán-dihidroklorid, l.e-diCN^Nl-alfa-metil-béta-fenil-diguanido-N₅,N₅’)-hexán-dihidroklorid, 1,6^1(^,N-f-p-nitro-fenil-diguanido-Ns.Ns’j-hexán-dihidroklorid, omega:omega-di(N₁,N₁’-fenil-diguanido-N₅,N₅’)-di-n-propil-éter-dihidroklorid, omega:omega'-di(N₁,N₁’-p-klór-fenil-diguanido-N₅,N₅')-di-n-propil-éter-tetrahidroklorid, 1,6-di(N·,, N ₃ ’-2,4-diklór-fenil-diguanido-N₅,N₅’)-hexán-tetrahidroklorid, 1,6-01(^,N-|’p-metil-fenil-diguanido-N₅,N₅’)-hexán-dihidroklorid,

1,6-di(N₁ ,N₁’-2,4,5-triklór-fenil-diguanido-N₅,N₅’)-hexán-tetrahidroklorid, 1,6-di(N₁ ,N_d ’-alfa-(p-klór-fenil)etil-diguanido-N₅,N5')-hexán-dihidroklorid, omega:omeg a-d i (N! .NJ-p-klór-fenil-diguanido-Ns.Ng’)m-xilén-dihidroklorid, 1,12-di(N ₃, N-j ’-p-klór-fenil-diguanido-N₅,N₅’)-dodekán-dihidroklorid, 1,10-di(Ni ,N-| ’-fenil-diguanido-N₅,N₅’)-dekán-tetrahidroklorid, 1,12diíN^N^-fenil-diguanido-Ng.Nsl-dodekán-tetrahidroklorid, l.e-dKNi.Nl-o-klór-fenil-diguanido-Ns.Ng’)hexán-dihidroklorid, 1,6^1(^,N.f-0-klór-fenil-diguanido-N₅,N₅’)-hexán-tetrahidroklorid, etilén-bisz(1-tolil-biguanid), etilén-bisz(p-tolil-biguanid), etilén-bisz(3,5-dimetil-fenil-biguanid), etilén-bisz(p-terc-amil-fenil-biguanid), etilén-bisz(nonil-fenil-biguanid), etilén-bisz(fenil-biguanid), etilén-bisz(N-butil-fenil-biguanid), etilén-bisz(2,5-dietoxi-fenil-biguanid), etilén-bisz(2,4-dimetíl-fenil-bíguanid), etilén-bisz(o-dífenil-biguanid), etilén-bisz(kevert amil naftil-biguanid), N-butil-etilén-bisz(fenil-biguanid), trimetilén-bisz(o-tolil-biguanid), N-butil-trimetil-bisz(fenil-biguanid) és ezek megfelelő sói, mint például acetát, glukonát, hidroklorid, hidrobromid, cifrát, biszulfit, fluorid, polimaleát, N-kokozalkil-szarkozinát, foszfit, hipofoszfit, perfluorooktanoát, szilikát, szorbát, szalicilát, maleát, tartarát, fumarát, etilén-diamin-tetraacetát, imino-diacetát, cinnamát, tiocianát, arginát, piromellitát, tetrakarboxi-butirát, benzoát, glutarát, monofluor-foszfát, perfluor-propionát, valamint kívánt keverékei. A további megfelelő anyagok a következők lehetnek: halogénezett xilol- és krezolszármazékok, mint például p-klór-metakrezol vagy p-klór-metaxilol, valamint természetes növényi eredetű antimikrobiális hatóanyagok (például fűszerekből vagy lágyszárúakból), állati, valamint mikrobiális eredetűek. Előnyösen az antimikrobiálisan ható felületaktív kvaterner vegyületek természetes növényi eredetű antimikrobiális és/vagy természetes állati eredetű antimikrobiális anyagok, ahol különösen előnyben részesítjük azokat a növényi eredetű antimikrobiális hatóanyagokat, melyek a következő csoportba tartoznak: koffein, teobromin és teofillin, valamint éterezett olajok, mint például eugenol, timol és geraniol, és/vagy legalább egy természetes állati eredetű antimikrobiális hatóanyagot tartalmaznak, mely a következő csoportba tartozik: tejből nyert fehérje, lizozim és laktoperoxidáz, és/vagy legalább egy antimikrobiálisan ható felületaktív kvatemer vegyületet tartalmaznak, mint például ammónium-, szulfónium-, foszfónium-, jodónium- vagy arzóniumcsoporttal rendelkeznek, peroxovegyületek és klórvegyületek. A mikrobiális eredetű úgynevezett bakteriocinvegyületek szintén alkalmazhatók.

Antimikrobiális hatóanyagként megfelelő kvaterner ammóniumvegyületek általános képlete a következő: (R¹)(R²)(R³)(R⁴)N⁺X~, ahol R¹-R⁴ jelentése azonos vagy eltérő Ci-C₂₂-alkil-csoport, C7-C₂₈-aralkil-csoport vagy heterociklikus csoport, ahol két vagy aromás kötés esetében, mint például piridin, akár három csoport a heterociklus nitrogénjével kapcsolódik, a piridinium- vagy imidazolvegyületeknél, és X jelentése halogenidionok, szulfátionok, hidroxiionok vagy hasonló anionok. Az optimális antimikrobiális hatást előnyösen

HU 225 362 Β1

8-18, különösen 12-16 szénatom közül legalább egy csoporttal biztosítjuk.

A QAV tercier aminná alakítható alkilezőszerrel, mint amilyen például metil-klorid, benzil-klorid, dimetil-szulfát, dodecil-bromid, de etilén-oxiddal is előállítható. A tercier aminok alkilezése hosszabb alkilcsoporttal és két metilcsoporttal különösen könnyen elvégezhető, a tercier aminok kvaternerizálása pedig hosszabb csoportokkal és metilcsoporttal, metil-kloriddal, enyhe reakciókörülmények között is elvégezhető. Aminok, melyek három hosszú alkilcsoporttal vagy hidroxiszubsztituált alkilcsoporttal rendelkeznek, kevésbé reaktívak, és előnyösen dimetil-szulfáttal kvaternerizálhatók.

A megfelelő QAV-ok például a következők: benzalkónium-klorid (N-alkil-N,N-dimetil-benzil-ammóniumklorid, CAS No. 8001-54-5), Benzalkon B (m,p-diklórbenzil-dimetil-C12-alkil-ammónium-klorid, CAS No. 58390-78-6), benzoxónium-klorid [benzil-dodecilbisz(2-hidroxi-etil)-ammónium-klorid]; cetrimonium-bromid (N-hexadecil-N,N-trimetil-ammónium-bromid, CAS No. 57-09-0), benzetónium-klorid (N,N-dimetil-N-[2[2-[p-(1,1,3,3-tetrametil-butil)-fenoxi]-etoxi]-etil]benzil-ammónium-klorid, CAS No. 121-54-0), dialkil-dimetil-ammónium-klorid, mint például di-n-decil-dimetil-ammónium-klorid (CAS No. 7173-51-5-5), didecil-dimetil-ammónium-bromid (CAS No. 2390-68-3), dioktil-dimetil-ammónium-klorid, 1-cetil-piridinium-klorid (CAS No. 123-03-5) és Thiazoliniodid (CAS No. 15764-48-1), valamint ezek keverékei. Különösen előnyben részesítjük azok a QAV-okat, melyeknél a benzalkónium-klorid C₈-C₁₈-alkil-csoportokkal rendelkeznek, így különösen előnyös a C-|₂-C₁₄-aklil-benzildímetil-ammónium-klorid.

A benzalkónium-halogenideket és/vagy a szubsztituált benzalkónium-halogenideket a kereskedelemben beszerezhetjük, ilyenek például a következők: Barquat® ex Lonza, Marquat® ex Mason, Variquat® ex Witco/ Sherex és Hyamine® ex Lonza, valamint Bardac® ex Lonza. További kereskedelemben kapható antimikrobiális hatóanyagok az N-(3-klór-allil)-hexaminium-klorid, mint például a Dowicide® és a Dowicil® ex Dow, a benzetónium-klorid, mint például a Hyamine® 1622 ex Rohm & Haas, a metil-benzetónium-klorid, mint például a Hyamine® 10X ex Rohm & Haas, a cetil-piridinium-klorid, mint például a Cepacolklorid ex Merrell Labs.

Az antimikrobiális hatóanyagokat 0,0001-1 tömeg%-ban, előnyösen 0,001-0,8 tömeg%-ban, előnyösebben 0,005-0,3 tömeg%-ban, és legelőnyösebben 0,01-0,2 tömeg%-ban adagoljuk.

A szer UV-abszorbeálókat tartalmazhat, melyek a kezelt textíliákat bevonják, és a rostok és az egyéb alkotórészek fénnyel szembeni tartósságát vagy fénytörését javítják. Az UV-t abszorbeáló szerves anyagok (fényvédő szűrők) alatt azokat értjük, melyek az ultraibolya sugárzást abszorbeálják és a felvett energiát hosszabb hullámhosszon kibocsátják, például meleget, hőt sugároznak.

Az ilyen kívánt tulajdonságokkal rendelkező vegyületek például a benzofenonok sugárzással dezaktiváló hatású vegyületei és származékai, melyek 2- és/vagy

4-helyen szubsztituáltak. Továbbá a szubsztituált benzotriazolok is alkalmazhatók, melyek 3-pozícióban fenilszubsztituált akrilátok, (fahéjsavszármazékok, adott esetben a 2-pozícióban cianocsoportokkal), valamint a szalicilátok, szerves Ni-komplexek, valamint természetes anyagok, mint például umbelliferon és testsaját urokánsavak. Különös jelentőséggel bírnak a bifenil- és mindenekelőtt a sztilbénszármazékok, melyeket a szakirodalomban leírtak [EP 0728749 számú szabadalmi bejelentés] és a kereskedelemben Tinosorb® FD vagy Tinosorb® FR ex Ciba márkanéven megvásárolhatók. UV-B-abszorbeáló anyagként a következőket nevezzük meg: 3-benzilidén-kámfor, illetve 3-benzilidén-norkámfor és ezek származékai, például

3- (4-metil-benzilidén)-kámfor [EP 0693471 B1 számú szabadalmi bejelentés], 4-amino-benzoesav-származékok, előnyösen 4-(dimetil-amino)-benzoesav-2-etilhexil-észter, 4-(dimetil-amino)-benzoesav-2-oktilészter és 4-(dimetil-amino)-benzoesav-amil-észter, a fahéjsav észterei, előnyösen a 4-metoxi-fahéjsav-2etil-hexil-észter, 4-metoxi-fahéjsav-propil-észter, 4-metoxi-fahéjsav-amil-észter, 2-ciano-3,3-fenil-fahéjsav-2etil-hexil-észter (Octocrylene), a szalicilsavak észterei, előnyösen a szalicilsav-2-etil-hexil-észter, szalicilsav4- izopropil-benzil-észter, szalicilsav-homomentil-észter, a benzofenonok származékai, előnyösen a 2-hidroxi-4-metoxi-benzofenon, 2-hídroxi-4-metoxi-4’metil-benzofenon, 2,2’-dihidroxi-4-metoxi-benzofenon, a benzmalonsavak észterei, előnyösen a 4-metoxibenzmalonsav-di-2-etil-hexil-észter, triazinszármazékok, mint például a 2,4,6-trianilino-(p-karbo-2'-etil-Thexil-oxi)-1,3,5-triazin és oktil-triazon, ahogy azt a szakirodalomban leírták [EP 0818450 számú szabadalmi bejelentés] vagy dioktil-butamido-triazon (Uvasorb® HEB), propán-1,3-dion, mint például az 1-(4-terc-butil-fenil)-3-(4’-metoxi-fenil)-propán-1,3-dion, keto-triciklo(5.2.1.0)dekán-származékok, mint például a szakirodalomban leírt vegyületek [EP 0694521 B1 számú szabadalmi bejelentés]. A továbbá megfelelnek: 2-fenilbenzimidazol-5-szulfonsav és ezek alkáli-, alkáliföldfém-, ammónium-, alkil-ammónium-, alkanol-ammónium- és glukammóniumsói, a benzofenonok szulfonsavszármazékai, előnyösen a 2-hidroxi-4-metoxibenzofenon-5-szulfonsav és sói, a 3-benzilidénkámforok szulfonsavszármazékai, mint például 4-(2oxo-3-bornilidén-metil)-benzolszulfonsav és 2-metil-5-(2-oxo-3-bomilidén)-szulfonsav és ezek sói.

A tipikus UV-A-szűrők közé tartoznak a benzoil-metán-származékok, mint például 1-(4’-terc-butil-fenil)-3(4’-metoxi-fenil)-propán-1,3-dion, 4-terc-butil-4'-metoxi-dibenzoil-metán (Parsol 1789), 1-fenil-3-(4’-izopropil-fenil)-propán-1,3-dion, valamint Enamin-vegyületek, mint például azok, melyeket a szakirodalomban leírtak [DE 19712033 A1 számú szabadalmi bejelentés] (BASF). Az UV-A- és az UV-B-szűrők természetesen keverten is adagolhatók. A megnevezett oldódó anyagokon kívül erre a célra a fényvédő pigmenteket említjük, melyek finoman diszpergált, előnyösen nanométeres tartományba eloszlatott megfelelő fém-oxidok, kü26

HU 225 362 Β1 lönösen cink-oxid és titán-oxid, és amelyek lehetnek vas-, cirkónium-, szilícium-, mangán-, alumínium- és cérium-oxidok és ezek keverékei. Sóként szilikátok (talkum), bárium-szulfát vagy cink-sztearát alkalmazhatók. Az oxidok és a sók pigment formában már a bőrápoló és bőrvédő emulziókba és szépítőszerekbe alkalmazhatók. A részecskék közepes átmérője kevesebb mint 100 nm, előnyösen 5-50 nm és még előnyösebben 15-30 nm között található. Lehetnek gömb formában, de azok a részecskék is adagolhatok, melyek ellipszoid alakúak, vagy egyéb göbszerű formában vannak. A pigmentek felületkezeltek is lehetnek, azaz hidrofil vagy hidrofób formává alakítottam A tipikus példák a burkolt titán-dioxid, mint például a Titan-dioxid T 805 (Degussa) vagy az Eusolex® T2000 (Merck; hidrofób burokként előnyösen szilikon, és előnyösebben trialkoxi-oktil-szilánok vagy Simethicone, jöhet szóba. Előnyösen mikrokristályos cink-oxidot alkalmazunk. A további UV-védőanyagokról a szakirodalomban áttekintést kaphatunk [Finkel: SÖFW-Journal, 122, 543 (1996)].

Az UV-abszorbeálók rendszerint 0,01-5 tömeg%ban, előnyösen 0,03-1 tömeg%-ban adagolhatok.

A mosó- és tisztítószerek szokásos alkotórészei közé tartoznak az általánosan használt mosó- és tisztítóhatású enzimek. Egyidejűleg a találmány megvalósítási formáiban a mosó- és tisztítószer a találmány szerinti fehérjén kívül további ismert enzimeket is tartalmazhat. Idetartoznak például a proteázok, de egyéb enzimek is, mint például oxidoreduktázok, kutinázok, eszterázok és/vagy hemicellulázok, különösen előnyben részesítjük a lipázokat, amilázokat, cellulázokat vagy β-glukanázokat.

Az enzimek, mint például proteázok, amilázok vagy cellulázok évtizedek óta a mosó- és tisztítószerekben alkalmazott komponensek. Mindenkori alkalmazásukat mosási teljesítményük, illetve a szóban forgó anyagok tisztítását biztosító hatékonyságuk szabja meg, így fehérjetartalmú szennyeződések lebontásához proteázokat, keményítőtartalmú szennyeződések eltávolításához amilázokat, és zsírtartalmú szennyeződésekhez pedig lipázokat alkalmazunk. A mosószerekben különösen akkor alkalmazunk cellulázokat, ha azok másodlagos hatása a mosószerekben előnyös, valamint jelenlétük a textíliák rostjaira kedvezőek. A mindenkori hidrolízistermékeket a megmaradt mosó- és tisztítószer-alkotók megtámadják, feloldják, emulgeálják vagy szuszpendálják, vagy nagyobb oldékonyságuk miatt a mosófürdővel kimossák, tehát az enzimek a többi alkotórésszel szinergizmusba lépnek.

A másodlagos mosási teljesítmény cellulózzal összehasonlítható mértékű hozzájárulása miatt, a proteázok képesek kifejteni hatásukat a természetes rostokra különösen a gyapjúra és a selyemre. Az ilyen szövetek felszínén kifejtett hatásukkal az anyagon fényesítőhatást fejtenek ki, és ezzel a nemezelőhatás ellen hatnak.

A további enzimek a szóban forgó tisztítószer-teljesítményt tovább emelik specifikus enzimatikus képességeikkel. Idetartoznak például a hemicellulázok, mint például a β-glukanázok [WO 99/06515 és WO 99/06516 számú szabadalmi bejelentés] az oxidoreduktázok, mint például a Laccasen [WO 00/39306 számú szabadalmi bejelentés] vagy a pektinoldó enzimek [WO 00/42145 számú szabadalmi bejelentés], amelyek speciális anyagként adagolhatok.

A találmány szerinti szerekben történő felhasználáshoz első vonalban a mikroorganizmusokból kivont enzimek jönnek szóba, melyek például a baktériumokból vagy gombákból nyerhetők. Ezek az alkotók ismert módon fermentációval a megfelelő mikroorganizmusból kinyerhetők, ahogy azt például a szakirodalomban közzétették [DE 19 40 488 és DE 21 21 397 számú szabadalmi bejelentés, 3 623 957 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés és 4 264 738 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, EP 008 638, valamint WO 91/02792 számú szabadalmi bejelentés].

A találmány szerinti fehérjét, különösen tárolás során, stabilizálókkal, például denaturálással, széteséssel vagy inaktiválással szemben, valamilyen fizikai behatással, oxidációval vagy proteolitikus hasítással megvédjük.

A stabilizátorok egyik csoportjába a reverzibilis proteázinhibitorok tartoznak, mint például a benzamidin-hidroklorid és a leupeptin, melyeket erre a célra alakítottak ki. Gyakran a következőket használják: borax, bórsavak, boronsavak, ezek sói és észterei, mindenekelőtt aromás csoportokkal alkotott származékaik, mint például ortoszubsztituált [WO 95/12655 A1 számú szabadalmi bejelentés], metaszubsztituált [WO 92/19707 A1 számú szabadalmi bejelentés], paraszubsztituált [5.972.873 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés] fenil-boronsavak, előnyösek ezek sói vagy észterei is. A WO 98/13460 A1 számú szabadalmi bejelentésben és az EP 583534 B1 számú szabadalmi bejelentésben peptidaldehidet tettek közzé, azaz C-terminálisán redukált oligopeptidet, és ezek 2-50 monomeres változatait a mosó- és tisztítószer-proteázok reverzibilis gátlásához. A reverzibilis proteázinhibitorok közé tartoznak az ovomukoid néven ismert anyagok [WO 93/00418 A1 számú szabadalmi bejelentés]. Például a WO 00/01826 A2 számú szabadalmi bejelentésben specifikus, reverzibilis peptidinhibitorokat tettek közzé, melyek a proteázokat tartalmazó szerekben a szubtilizinproteázt gátolják, és ez megfelel a WO 00/01831 A2 számú szabadalmi bejelentésben közzétett proteázból és inhibitorból álló fúziós fehérjének.

A további közismert enzimstabilizátorok a következők: amino-alkoholok, mint például mono-, di-, trietanol- és propanol-amin és ezek keverékei, alifás karbonsavak tizenkét szénatomig, mint például ahogy az a EP 378261 B1 és WO 97/05227 A1 számú szabadalmi bejelentésekből ismert, így borostyánkősav, más dikarbonsavak és a megnevezett savak sói. A DE 19650537 A1 számú szabadalmi bejelentés erre a célra végcsoportjában zárt zsírsav-amid-alkoxilátokat tett közzé. Az alkotóelemként alkalmazott bizonyos szerves savakat a szakirodalomban közzétették [WO 97/18287 A1 számú szabadalmi bejelentés], melyet az adagolt enzim stabilizálására alkalmaztak.

HU 225 362 Β1

Az alacsonyabb rendű alifás alkoholok, valamint mindenekelőtt a poliolok, mint például a glicerin; etilénglikol, propilénglikol vagy szorbit gyakran alkalmazott enzim stabilizátorok. Éppen így kalciumsókat is használhatunk, mint például kalcium-acetátot, vagy az EP 028865 B2 számú szabadalmi bejelentésben leírt kalcium-formiát, és magnéziumsókat, különböző polimereket [EP 378262 B1 számú szabadalmi bejelentés].

A szakirodalomban közzétették a poliamidoligomereket [WO 99143780 A1 számú szabadalmi bejelentés] vagy polimer vegyületeket, mint például lignint [WO 97/00932 A1 számú szabadalmi bejelentés], vízoldékony vinilkopolimereket [EP 828762 B1 számú szabadalmi bejelentés] vagy a következőket [EP 702712 B1 számú szabadalmi bejelentés]: cellulóz-éter, akrilpolimer és poliamid, mely enzimkészítmények az enzimek előállításához a fizikai hatások vagy a pH-érték ingadozásai ellen stabilizátorként szolgálnak.

A poliamin-N-oxid-tartalmú polimer [EP 587550 B1 és EP 581751 B1 számú szabadalmi bejelentések] egyszerre enzimstabilizálóként és színátvivő képesség gátlójaként használható. A további polimer stabilizátorokat a szakirodalomban közzétették [WO 97105227 A1 számú szabadalmi bejelentés] más alkotórészek mellett, kiegészítve lineáris, C₈-C₁₈-polioxilkalkilénekkel. Az alkil-poliglükozidok, ahogy azt a WO 97/43377 A1 és WO 98/45396 A1 számú szabadalmi bejelentésekben közzétették, a találmány szerinti szerek enzimatikus komponenseit stabilizálják, és ezzel teljesítményüket fokozzák. A hálózatos N-tartalmú vegyületek [WO 98117764 A1 számú szabadalmi bejelentés] kettős funkciót töltenek be, így földet kiűző szernek és enzimstabilizátornak tekintik. A hidrofób nemionos polimerek más stabilizátorokkal együtt a WO 97/32958 A1 számú szabadalmi bejelentés szerint a cellulázokat stabilizálják, így ilyen és hasonló szerek a találmány szerinti szer enzimével is szerepelhetnek.

A redukálószerek és az antioxidánsok, ahogy azt a szakirodalomban többek között leírták [EP 780 468 számú szabadalmi bejelentés], az enzimeket az oxidatív szétesés ellen stabilizálják. A kéntartalmú redukálószerek a szakirodalomból ismertek [EP 0 080 748 és EP 0 080 223 számú szabadalmi bejelentések]. További példák a nátrium-szulfit [EP 533 239 számú szabadalmi bejelentés] és a redukálócukrok [EP 656 058 számú szabadalmi bejelentés].

A stabilizátorok sokféle kombinációja alkalmazható, például poliolokból, bórsavból és/vagy boraxból álló kombinációk [WO 96/31589 számú szabadalmi bejelentés], bórsavból vagy bóráiból, redukálósókból és borostyánkősavból vagy más dikarbonsavakból álló kombinációk [EP 126 505 számú szabadalmi bejelentés] vagy bórsavból más borátokból poliolokkal vagy poliaminvegyületekkel és redukálósókkal adott kombinációk [EP 080 223 számú szabadalmi bejelentés]. A peptid-aldehid stabilizátorok hatása a WO 98/13462 számú szabadalmi bejelentés szerint bórsavval kombinációban és/vagy bórsavszármazékokkal és poliolokkal kombinációban fokozható és kalciumionok hozzáadásával ez tovább fokozható [WO 98/13459 számú szabadalmi bejelentés].

A stabilizált enzimaktivitású szerek a találmány előnyben részesített megvalósítási formájába tartoznak. Különösen előnyös olyan enzimekkel, melyek több, fentiekben ismertetett módon stabilizáltak.

Mivel a találmány szerinti szer minden elképzelhető formában ajánlható, ezért a találmány szerinti enzimet, előnyösen fehérjét a mindenkori szerbe adáshoz célirányosan, a találmány megvalósítási formájának megfelelően kiszerelt formában állítjuk elő. Idetartoznak a folyékony, szilárd, szemcsézett vagy kapszulaformák.

A kapszulázott forma az enzim és a többi alkotórészek, mint például fehéritőszerek védelmére vagy szabályozott kibocsátására szolgálhat. A kapszula mérete alapján megkülönböztetünk midi-, mikro- és nanokapszulákat, ahol az enzimek részére különösen a mikrokapszulák felelnek meg. Ilyen kapszulákat a szakirodalomban leírtak [WO 97/24177 és DE 199 18 267 számú szabadalmi bejelentés]. Egy további kapszulázási eljárásban a mosó- és tisztítószerekhez megfelelő enzimeket az enzimoldattal a keményítőt vagy a keményítőszármazékot tartalmazó oldatból keményítőbe, előnyösen keményítőszármazékba kapszulázzuk. A szakirodalomban ilyen kapszulázási eljárást leírtak [WO 01/38471 A1 számú szabadalmi bejelentés: „Verfahren zűr Herstellung von mikroverkapselten Enzymen”].

A fehérjék szilárd szernél például szárított, szemcsézett, kapszulázott, vagy kapszulázott és végül szárított formába helyezhetők. Lehetnek elkülönítetten, azaz fázisonként, vagy más alkotórészekkel együtt azonos fázisban, kompartmentalizáltan vagy anélkül végzett hozzáadással. A mikrokapszulázott enzimeket a szilárd formában úgy kell kialakítani, hogy a víz a jelenlegi technikákkal a vizes oldatokból eltávolítható legyen, például porlasztással, centrifugálással vagy oldószer-mentesítéssel. Az ily módon kapott részecskék átlagmérete 50 és 200 μίτη között található.

A találmány szerinti szerekben az enzim és a találmány szerinti fehérje is, folyékony, gélformáló vagy pasztás kiszerelésben is előfordulhat, ami a technika mai állása szerinti eljárással nyert fehérjéből indul ki, és az elkészítés koncentrált vizes vagy nemvizes oldatban, például folyékony formában, folyadékként, szuszpenzióként vagy emulzióként történik, de lehet gél formában is, vagy kapszulázott szárított porként is adagolni. Az ilyen találmány szerinti mosó- és tisztítószereket folyadékként a szokásos oldószerekkel együtt rendszerint az alkotórészek egyszerű összekeverésével állítják elő, ahol az anyagba, vagy oldatként az automatikus keverőbe adható.

A primer mosási teljesítmény mellett a mosószerekben lévő proteázok további funkciókat is betölthetnek, az egyéb enzimatikus alkotórészeket proteolitikus hasítással aktiválhatják vagy megfelelő hatástartam után inaktiválhatják. Összehangolható szabályozó funkciók a találmány szerinti enzim esetében is lehetségesek. A találmány egyik megvalósítási formájában a fentieken kívül olyan szerek találhatók a proteázra érzékeny

HU 225 362 Β1 anyagból készített kapszulában, melyek például a találmány szerinti fehérjéket a megadott időpontban hidrolizálják, és így tartalmuk kiszabadul. Hasonló összehangolható hatás más többfázisú szereknél is elérhető.

A találmány egy további megvalósítási formájában olyan szereket állít elő a textil nyersanyagok kezeléséhez vagy a textil kezeléséhez, mely azzal jellemezhető, hogy magukban vagy együtt más aktív alkotórészekkel a fentiekben leírt proteolitikus enzimek egyikét tartalmazzák, különösen természetes rostos textíliáknál és különösen gyapjú és selyem esetében.

A természetes rostok, mint például a gyapjú vagy selyem, jellegzetes mikroszkópos felépítéssel rendelkeznek. Az eljárások például a gyapjú szakirodaimában leírtaknak megfelelően végezhetők [Breier: Melliand Textilberichte, 1.4. 263 (2000)], de ez hosszan tartó kedvezőtlen hatásokhoz, így összecsomózódáshoz vezet. Az ilyen hatások elkerülésére a természetes nyersanyagokat a találmány szerinti szerrel kezeljük, mely például hozzájárul, hogy a fehérje felépítésében az uralkodó pikkelyes felszíni struktúrák elsimuljanak, és ezzel összecsomózódásuk ellenében hatnak. Egy különösen előnyben részesített megvalósítási formában olyan szereket állítunk elő, melyek a rostok, a természetes alapú textíliák és különösen a gyapjú vagy a selyem feldolgozásában alkalmazhatók.

Az egyik előnyben részesített megvalósítási formában a proteázt tartalmazó szert úgy dolgoztuk ki, hogy a szokásos kezelési anyagok alkalmazhatók, például amit a mosófolyamatban alkalmazunk, vagy az után, függetlenül attól, hogy a mosáskor már alkalmaztuk. A kívánt hatás a textíliák felületi struktúrájának elsimítására, és/vagy a szövetek károsodásának megelőzésére és/vagy csökkentésére irányul.

A találmány egyik megvalósítási formájában a textíliák vagy a szilárd felületek gépi tisztításához eljárást biztosítunk, mely azzal jellemezhető, hogy a találmány szerinti proteolitikus enzim legalább az egyik eljárási lépésben aktív.

A textíliák gépi tisztításának eljárásait általánosságban azzal jellemezhetjük, hogy több eljárási lépésben különböző tisztításban aktív anyagot alkalmazunk a tisztítandó dolgon, és a hatásidő után lemossuk, vagy hogy a tisztítandó dolgot egyéb módon a tisztítószerrel vagy ennek oldatával kezeljük. Ez igaz a gépi tisztítások eljárásaira is, mindenekelőtt egyéb anyagokra, így azokra a textíliákra, melyeket kemény felszíneken összefognak. Az ilyen eljárások legalább egy eljárási lépésben a találmány szerinti fehérjével gazdagíthatok, és ezek a találmány megvalósítási formáit jelentik.

Az előnyben részesített eljárásban a találmány szerinti enzim mennyisége alkalmanként 40 pg-4 g, és előnyösen 50 pg-3 g, 100 pg-2 g, 200 pg-1 g és különösen előnyösen 400 pg-400 mg.

Mivel a találmány szerinti enzim fehérjeoldó képességgel már rendelkezik, és ezt a közegben fejti ki, másképpen tisztítóereje nincs, mint például a fenékpufferben, ezért a textíliák gépi tisztításánál az ilyen eljárás egyik részlépése az lehet, hogy a kívánt esetekben a stabilizálóvegyületek mellett sók vagy pufferanyagok alkalmazhatók, a találmány szerinti enzim egyedüli tisztításban aktív komponenseként. Ez a találmány különösen előnyben részesített megvalósítási formáját jelenti.

A találmány egyik előnyben részesített megvalósítási formájában a textil nyersanyagok kezeléséhez vagy textilkezeléshez eljárást biztosítunk, mely azzal jellemezhető, hogy a találmány szerinti proteolitikus enzim legalább az egyik eljárási lépésben aktív. Ez például olyan eljárással érhető el, melynél a textíliákat a feldolgozásához előkészítjük, mintegy az anticsomósodás ellen, vagy például olyan eljárással, mely a bevitt textíliák tisztítását a kezelő komponensben gazdagítja. A proteázok fentiekben leírt hatása ellen a kijelölt szövetet az előnyben részesített megvalósítási forma szerint kezeljük, Így a textil nyersanyagot vagy a természetes alkotójú textil nyersanyagot, különösen a gyapjút és selymet.

A találmány egyik sajátos tárgykörében a találmány szerinti proteolitikus enzimeket textíliák vagy kemény felületek tisztításához állítjuk elő. így a találmány szerinti enzimek különösen a fentiekben leírt eljárásokban a textíliák és a szilárd felszínek fehérjetartalmú szennyeződéseinek eltávolítására szolgálnak. Az előnyben részesített megvalósítási formákban a találmány a gépi eljárásokon kívül például a háztartási mosásokkal vagy a textíliák foltjainak kézi eltávolításával vagy szennyezett felületek tisztításával foglalkozik.

Az előnyben részesített eljárásban a találmány szerinti enzim mennyisége alkalmanként 40 pg-4 g, és előnyösen 50 pg-3 g, 100 pg-2 g, 200 pg-1 g és különösen előnyösen 400 gg-400 mg.

A találmány ilyen tárgyköreinek egyik előnyben részesített megvalósítási formája a találmány szerinti proteolitikus enzimek alkalmazásával foglalkozik, ami a mosó- és tisztítószerek alkotórészeinek aktiválására vagy deaktiválására szolgál. Ahogy az ismeretes, a mosó- és tisztítószerek fehérjealkotói proteázokkal inaktiválhatók. Ezeket egyébként inkább nem kívánt hatások megcélzására adagolták, mégis a találmány tárgykörébe tartoznak. Az is lehetséges, hogy először egy másik komponenst proteolízissel aktiválnak, amikor tulajdonképpen a hibrid fehérje, enzimből és ennek megfelelő inhibitorból áll, ahogy azt a szakirodalomban leírták [WO 00/01831 A2 számú szabadalmi bejelentés]. Egy további példa az ilyen szabályozásra vonatkozik az aktív komponens enzimaktivitásának védelmére, ami szabályozáshoz kapszulába zártan fordul elő, amikor is hatását a proteolízis megkezdésével fejti ki. A találmány szerinti fehérjék így inaktiválási, aktiválási és felszabadulási reakciókban alkalmazhatók.

A továbbiakban a mosó- és tisztítóproblematika technikai eljárásain, alkalmazásain és a hozzá tartozó szerein kívül, az összes többi eltérést a találmány tárgykörének megfelelően összegezzük, amennyiben azokat a találmány szerinti fehérjék határozzák meg. Ezt az összeállítást nem tekintjük végleges felsorolásnak, hanem csak a legfontosabbakat állítottuk össze, melyeket jelenleg a találmány szerinti proteázok adagolásából felismertünk. Kiderülhet, hogy további tech29

HU 225 362 Β1 nikai területeken a találmány szerinti proteázok alkalmazásával tovább fejleszthetők, így ezek az oltalmi körök a találmányba tartoznak.

A találmány tárgyköreinek egyik megvalósítási formája a találmány szerinti enzimek alkalmazásaira vonatkozik, melyeket a biokémiai vagy molekuláris biológiai analízisekben felhasználhatunk, különösen enzimatikus analízis eljárások keretében. A találmány és a szakirodalom szerint [Römpp, „Lexikon Chemie” (Version 2.0, Stuttgart/ New York: Georg Thieme Verlag, (1999)] enzimatikus analízis alatt minden olyan biokémiai analitikai műveletet értünk, mely specifikus enzimet vagy szubsztrátot kezel, egyrészről a szubsztrát azonosítására, vagy koncentrációjának megállapítására, másrészről az enzim azonosítására vagy koncentrációjának kiderítésére. Az alkalmazási területek az összes biokémiai alkalmazásokra kiterjednek. Ezen tárgykör egyik előnyben részesített megvalósítási formája a szekvenciaanalízis keretében végzett végcsoport-meghatározásra vonatkozik.

A tárgykör egy további megvalósítási formája a találmány szerinti proteolitikus enzimek alkalmazására vonatkozik, a természetes anyagok vagy a biológiailag értékes anyagok előállításához, (gy a természetes anyagok vagy biológiailag értékes anyagok tisztítási folyamatában jelentős lehet a fehérje szennyezésektől való megszabadításnál. így például a kis molekulatömegű vegyületek, az összes sejtalkotó, vagy a raktározóanyagok kezelésére használható. Ez mind laboratóriumi méretekben, mind ipari méretekben, például értékes anyagok biotechnológiai előállításában végrehajtható.

A találmány szerinti proteolitikus enzimek felhasználása a fehérjék vagy kis molekulatömegű vegyületek szintézisénél a természetes katalitikus reakció átalakító képessége alapján valósul meg, például amikor fehérjefragmenseket kell összekapcsolnunk, vagy amikor a nem túlsúlyban lévő, fehérjéből álló vegyület aminosavait össze kell kapcsolni. Az ilyen alkalmazási lehetőségeket a szakirodalomban javasolták [EP 380362 A1 számú szabadalmi bejelentés].

A találmány ezen tárgykörének egy további megvalósítási formája a találmány szerinti proteolitikus enzimekkel a természetes nyersanyagok kezelését biztosítja, amikor ezeket fehérje szennyezőiktől kell megszabadítani. Elsősorban idetartoznak a mikrobiológiai szennyeződéseket nem tartalmazó nyersanyagok, melyeken itt mezőgazdasági eredetűeket értünk.

Az egyik előnyben részesített megvalósítási forma a felületi kezelések alkalmazására, és különösen a gazdasági jelentőségű bőr nyersanyagok kezelésére vonatkozik. így a cserzési eljárások folyamatában, különösen a lúgos puhításnál [Römpp, „Lexikon Chemie”, Version 2.0, Stuttgart/ New York: Georg Thieme Verlag, (1999)] a vízben oldódó fehérjék proteolitikus enzimek segítségével a bőranyagból kioldhatók. Ehhez a találmány szerinti proteázok alkalmazhatók, különösen lúgos körülmények között és denaturálószerek jelenlétében.

A tárgykör további megvalósítási formája a találmány szerinti proteolitikus enzimek alkalmazására vonatkozik, amennyiben azokat a textíliák előállításához a nyersanyagok kinyerésénél vagy kezelésénél, vagy a köztitermékek kialakításánál használják fel. Erre egy példa a gyapot feldolgozása, ahol a lesimításnak nevezett folyamatban a tok alkotórészeitől meg kell szabadulni, egy másik a gyapot kezelése; de hasonló érvényes a nyersselyemre is. Az enzimatikus eljárások összevethetők a kémiaiakkal, különösen a környezeti összeegyeztethetőségük tekintetében.

Az egyik előnyben részesített megvalósítási formában a találmány szerinti fehérje felhasználható a textíliák védőrétegénél, különösen a közti- vagy az értékes termék eltávolításánál, vagy a felületeik lesimításában, mielőtt egy következő feldolgozási lépésben ezeket tovább alakítják.

A találmány ezen tárgykörének egy további megvalósítási formája a találmány szerinti proteolitikus enzimek felhasználását a textil nyersanyagok kezelésénél érvényesíti, különösen a gyapjú vagy selyem vagy más főleg selymet tartalmazó kevert textíliák felszínének kezelésénél. Ez érvényes mind az ilyen textíliák előállítására, mind a használat során ezek gondozására, például a textíliák tisztításával összefüggésben (lásd fent).

A találmány ezen tárgykörének egy további megvalósítási formája a találmány szerinti proteolitikus enzimek felhasználását a fotófilmek kezelésénél érvényesíti, különösen a zselatint tartalmazó vagy hasonló védőrétegek eltávolításánál. Az ilyen védőrétegek, különösen az ezüstsókat tartalmazó zselatinemulziók a filmeken találhatók, mint például a röntgenfilm egyik rétege, melyet a hordozóanyag megvilágítása után el kell távolítani. Az itt uralkodó lúgos vagy gyengén denaturáló reakciókörülmények miatt a találmány szerinti proteázok különösen jól alkalmazhatók.

A találmány ezen tárgykörének egy további megvalósítási formája a találmány szerinti proteolitikus enzimek felhasználását élelmiszerek vagy takarmányok előállításánál érvényesíti. így a proteázok az élelmiszerek előállításában, azok megváltoztatásában alkalmazhatók. Erre példák a sajtok érési folyamatában vagy más tejtermékek kialakításában végzett alkalmazások. Az ilyen folyamatok a találmány szerinti fehérjével gazdagíthatok, vagy ezekkel teljes egészében végrehajthatók. A nem táplálkozási célú szénhidrátot tartalmazó élelmiszereknél vagy élelmiszer-nyersanyagoknál, mint például a liszt vagy a dextrin, a szóban forgó proteázok a kísérőfehérjék eltávolítására is felhasználhatók. A találmány szerinti proteázok az ilyen felhasználásokhoz is megfelelnek, különösen abban az esetben, amikor ezek lúgos vagy gyengén denaturáló körülmények között történnek.

Ez érvényes a takarmányok előállítására is. Itt a teljes fehérjementesítés mellett az is érdeklődésre tarthat számot, hogy a fehérjét tartalmazó kiindulási anyagot vagy anyagkeveréket a proteázokkal csak kis ideig kezelik, azért, hogy a háziállatok számára könnyebben emészthetővé tegyék.

A találmány ezen tárgykörének egy további megvalósítási formája a találmány szerinti proteolitikus enzimek felhasználását kozmetikai célra érvényesíti. Az

HU 225 362 Β1 igény a találmány szerinti proteolitikus enzimeket tartalmazó kozmetikai szerekre, eljárásokra is kiterjed, melyek a találmány szerinti proteolitikus enzimeket alkalmazzák kozmetikai célokra, különösen az ehhez megfelelő eljárásban vagy szerekben.

Mivel a proteázok az emberi bőr sejtmegújulási folyamatában is szerepet játszanak (dezkvamáció), ezért ezek meghatározó szerepét a szakirodalomban leírták [Egelrud és munkatársai: Acta Derm. Vénéről., 71, 471-474 (1991)]. Ennek megfelelően a proteázok a bőrápoló szerekben bioaktív anyagként felhasználhatók, a száraz bőr leépülésekor a dezmoszómastruktúrák gyarapításával védelmi célra [WO 95/07688 A1 vagy WO 99/18219 A1 számú szabadalmi bejelentés]. A szubtilizinproteázok kozmetikai célra való alkalmazását, különösen a Bacillus lentus alkalikus proteáz változatokét a szakirodalomban leírták [WO 97/07770 A1 számú szabadalmi bejelentés]. A találmány szerinti proteázok is, különösen a mutagenezissel kialakított változatok, vagy amelyek aktivitása megfelelő növekedésre ható anyagokkal szabályozhatók, bőr- vagy hajtisztító- vagy -ápoló szerekbe adagolhatok. Különösen előnyösek azok az enzimkészítmények, melyek ahogy azt a fentiekben leírtuk, például makromolekuláris hordozóhoz kapcsolva stabilizáltak [5.230.891 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés] és/vagy a nagyon allergén régiókban pontmutációval megváltoztatott származékok, mellyel az emberek számára nagyobb bőrtűrést biztosít.

Ennek megfelelően a proteolitikus enzimek alkalmazása kozmetikai célra is a találmány oltalmi körébe tartozik, különösen a megfelelő szerekben, mint például sampon, szappan, vagy vizek, vagy ápolószerek, melyek például krém formában ajánlhatók. Ezek a bőrrétegeket eltávolító gyógyszerekben is alkalmazhatók, ezek szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak.

1. példa

A találmány szerinti proteázok létrehozása

Az összes molekuláris biológiai lépést standard módon végeztük, ahogy azt a szakirodalomban leírták [Fritsch, Sambrook és Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual”, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, (1989); WO 92/21760 A1 számú szabadalmi bejelentés],

A mutációs vektorok előállítása

A mutagenezist a Bacillus lentus alkalikus proteáz M131 változaton hajtottuk végre. Ezt a változatot a szakirodalomban leírták [WO 92121760 A1 számú szabadalmi bejelentés] és letétbe helyezték: Bacillus licheniformis ATCC 68614 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA). Ebben a törzsben a Bacil/us-okban replikálódó pCB56M131 plazmid található, melyben az expressziós kazetta promoterből, riboszómakötő helyből, valamint ATG-startkodonból áll, és az alkalikus proteáz aminoterminálisának 22 aminosavát is felöleli, amit a Bacillus licheniformis ATCC 53926-ból nyertek, a pre-pro-fehérjével fuzionáltak, és amelybe a Bacillus lentus alkalikus proteáz mutált szekvenciáját építettük be. A Bacillus lentus alkalikus proteáz

M131 változat következő mutációi összevethetők a natív szekvenciával: S3T, V4I, A188P, V193M, V199I.

A mutagenezíshez a teljes expressziós kazettát a vektorból BamHI és Sacl restrikciós endonukleázokkal kivágtuk, és hasonlóképpen a BamHI és Sacl enzimekkel vágott pUC18 vektorba klónoztuk (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg). A kapott pUC18M131 vektort ezek után a következő mutációs lépéseknek vetettük alá. A pUC18M131 vektort a 2. ábrán mutattuk be. Dokumentáltuk, hogy a Bacillus lentus alkalikus proteáz M131 DNS-fragmense az expressziós kazettában szerepel, melynek szekvenciaszáma: 1, és az ennek megfelelő aminosavszekvenciát is bemutattuk (a szekvencia száma: 2). Az 1. szekvencián bemutatott BamHl-Sacl fragmens kiterjed a 2. ábrán bemutatott pUC18M131 vektor 1-1771. helyzeteire; a vektor további részei megegyeznek a pUC18 kiindulási plazmiddal.

Mutagenezis

Először a Bacillus lentus DSM 5483 alkalikus proteáz eredeti szekvenciáját a 188. és 193. pozíciókban helyreállítottuk. Ehhez a szakirodalomban leírt eljárást alkalmaztuk (a Fa cég QuikChange® eljárása, Stratagene, La Jolla, CA, USA). Ezek után a mindenkori két komplementer felhasználásával a mutációkat tartalmazó primereket polimeráz-láncreakcióval a mutált plazmidon létrehoztuk. A kiindulási plazmid Dpn I hasítása után, ahogy azt a QuikChange® eljárásban előírták, a reakcióelegyet E. coli XL-1 blue-ba transzformáltuk. Az így kaptuk meg azt a kiónt, mely plazmidja a kérdéses gént tartalmazza, ami adott esetben mutációval kapcsolt restrikciós hellyel könnyen felismerhető, ezt az ellenőrzés miatt minden esetben hagyományos készlettel is megvizsgáltuk láncbontási eljárásban. Hasonló eljárásokat végeztünk a következő mutagenezislépésekben is.

A 188. aminosavpozíció átalakításához a CCA (prolin) és GCC (alanin) tripletteket használtuk az 5’-TCA CAG TAT GGC GCC GGG CTT GAC ATT-3', illetve az 5’-AAT GTC AAG CCC GGC GCC ATA CTG TGA-3’ prímeméi. Ez közvetlenül a mutáció mellett az aminosavszekvenciában nem módosított Narl restrikciós helyet tartalmaz.

A 193. aminosavpozíció átalakításához az ATG (metionin) és ATT (izoleucin) tripletteket használtuk mindkét prímeméi: 5-GGG CTT GAC ATT GTG GCA CCC GGG GTA AAC-3’, valamint 5’-GTT TAC CCC GGG TGC CAC AAT GTC AAG CCC-3’. Ez közvetlenül a mutáció mellett az aminosavszekvenciában nem módosított Xma Cl restrikciós helyet tartalmaz.

Ez egy kettősen mutált plazmidot tartalmazó kiónt szolgáltatott, amennyiben a 61. pozícióban a triplettek a következők: GGG (glicin), GCT (alanin). Ehhez a két komplementer primer a következő: 5’-CAA GAT GGG AAT GCT CAT GGC ACG CAT-3', valamint 5-ATG CGT GCC ATG AGC ATT CCC ATC TTG-3’. Ezzel megkaptuk a Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I változatot.

Ezekből a mutációkból kiindulva megkaptuk a második legelőnyösebb változatot a 221. pozícióban, ahol

HU 225 362 Β1 a meglévő leucint aszparaginra mutáltuk. Ehhez az alkalmazott komplementer primerek szekvenciája a következő: 5-ACG TAT GCC AGC GAC AAC GGT ACA TCG-3’, valamint 5’-CGA TGT ACC GTT GTC GCT GGC ATA CGT-3’. A kapott klón azonosságát ezek után DNS-szekvenálással igazoltuk.

A mutáns S3T/V4I/G61A/V199I gént kódoló proteáz teljes szekvenciáját a 3. számú szekvenciavázlatban adtuk meg. Ebből levezethető az aminosavszekvencia, melyet a 4. szekvenciaszámon adtunk meg. A mutáns S3T/V4I/G61A/V199I/L211D gént kódoló proteáz teljes szekvenciáját az 5. számú szekvenciavázlatban adtuk meg. Ebből levezethető az aminosavszekvencia, melyet a 6. szekvenciaszámon adtunk meg. Ezek a változatok a vad típusú Bacillus lentus DSM 5483 alkalikus proteáztól a megadott pozíciókban eltérnek, ezeket a következőképpen jelöljük: Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I és Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I/L211D.

A mutánsok kifejezése és a fehérjekészítmények előállítása

A mutált szekvenciákat tartalmazó expressziós kazettákat az 1. szekvencia BamHI-SacI fragmenseként a pC856M131 vektorba visszaklónoztuk, és ezzel a Bacillus subtilis DB104-et transzformáltuk. A Bacillus subtilis DB 104 törzs genotípusa: his, nprR2, nprE18, aprA3 [Kawamura és Dói: J. Bacteriol., 160, 442-444 (1984)]. A DNS transzformációját a Bacillus-ba a szakirodalomban leírtaknak megfelelően végeztük [WO 91/02792 számú szabadalmi bejelentés; ez az eredeti módszer változata: Chang és Cohen: Protoplastenmethode, Molec. Gén. Génét., 168, 111-115 (1979)].

Az ezzel nyerhető proteáz pozitív klón igazolását 500 ml MLBSP közegben végeztük (10 g/l kaziton; 20 g/l tripton, 10 g/l élesztőkivonat (ezek mindegyikének gyártója: Fa. Becton Dickinson, Cockeysville); 5 g/l NaCI; 27 g/l nátrium-szukcinát; 100 mg/l MgSO₄*7 H₂O; 75 mg/l CaCI₂*2 H₂O; 0,5 μΜ MnCI₂; 0,5 μΜ FeSO₄; 2% (vegyes) glükóz; 50 mM PlPES-puffer (1 M törzsoldatból, pH=7,2); 75 mM KPO₄ (1,5 M törzsoldatból, pH=7,0); pH=7,0, amit kiegészítettünk KOH-dal, valamint 10 pg/ml tetraciklinnel 2000 ml-es rázólombikban, 72 óráig 37 °C-on inkubálás, és percenként 200 fordulattal kevertük. A sejtek lecentrifugálása után kapott felülúszóban a proteázaktivitást meghatároztuk [Tenside, 1, 125-132 (1970)], ezt használtuk a következő kísérletekhez.

2. példa

A következő példákban standardizáltan szennyezett textíliákat használtunk, melyeket szakirodalmi állásfoglalások adnak meg [Eidgenössischen Material-Prüfungs- und -Versuchsanstalt, St. Gálién, Schweiz (EMPA), vagy Wáschereiforschungsanstalt, Krefeld]. A 2. példában a következő szennyezett textíliákat használtuk: A: (vér/tej/korom pamuton), B: (vér/tej/tus pamuton), C: (vér/tej/tus poliészter-pamut vegyes szöveten) és D: (tojás/korom pamuton).

Az ezekkel szennyezett vizsgálati anyagokon különböző mosási receptek alkalmazásával launderometriás méréseket végeztünk. Ehhez a mosófürdő aránya

1:12, és a mosást 30 percig 40 °C-on végeztük. A dozírozás mosófürdőként a mindenkori szer 5,88 g-ját jelentette. A víz keménysége 16 német fok.

Kontroilmosószerként a következő mosószerreceptek szolgáltak (mindegyiket tömegszázalékban adtuk meg): 4% lineáris alkil-benzolszulfonát (nátriumsó), 4% C₁₂-C₁₈-zsíralkohol-szulfát (nátriumsó), 5,5% C₁₂-C₁₈-zsíralkohol 7 EO-val, 1% nátriumszappan, 11% nátrium-karbonát, 2,5% amorf nátrium-diszilikát, 20% nátrium-perborát-tetrahidrát, 5,5% TAED, 25% Zeolith A, 4,5% polikarboxilát, 0,5% foszfonát, 2,5% habgátló granulátum, 5% nátrium-szulfát, kiegészítésként víz, optikai fehérítőszer, só. A különböző vizsgálati sorozatokhoz a következő proteázokat adagoltuk (ez mindig végkoncentrációt jelent, 2250 PE proteolitikus aktivitású I. mosdófürdő): Bacillus lentus alkalikus proteáz F49 [WO 95/23221 számú szabadalmi bejelentés]; előállítója: Fa. Biozym, Kundl, Österreich), Savinase® (Fa. Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dánemark), előnyösen a találmány szerinti proteáz, a Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61ΑΛ/199I/L211D jelű.

A mosás után a mosott textíliák fehérségi fokát bárium-szulfáthoz viszonyítottuk, melyet 100%-nak tekintettünk. A mérések spektrofotométerrel történtek (Datacolor SF500-2,460 nm, UV-Sperrfilter 3, 30 mm blende, nem fényezett, Lichtart D65,10°, d/8°). A kapott eredményeket százalékos remisszióként adtuk meg, azaz a bárium-szulfáthoz hasonlítva, együtt a mindenkori kiindulási értékekkel, lásd a következő 2. táblázatot. Az adatok 4 mérés átlagát jelentik. Ezek közvetlen visszakövetkeztetéseket tesznek lehetővé a kapott enzim vonatkozásában az alkalmazott szer mosási teljesítményére.

2. táblázat

Alapmosószer kiegészítve	A	B	C	D
Kiindulási érték	22,9	13,0	11,3	26,4
Kontroll proteáz nélkül	34,1	18,5	15,1	42,4
B. lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61Α1Λ/199I/L211D	45,1	33,5	42,5	72,6
S. lentus alkalikus proteáz F49	40,1	28,6	26,8	71,3
Savinase®	43,0	30,5	29,5	48,6
Standard deviáció	0,7	0,7	1,2	0,9

Felismerhető, hogy a Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A1/V199I/L211D az összes szennyezést jobban eltávolította (jobb a teljesítménye), mint a Bacillus lentus alkalikus proteáz 49 és a Savinase®.

3. példa

Pamuttextiljét, melyeket a 2. példa alapján A, B és C formában szennyeztünk ahhoz hasonlóan vizsgáltuk, amint azt a 2. példában megadtuk. A megkülönböztetés alapja, hogy ezekben a példákban egyébként azonos mosási recepteket használtuk. A találmány szerinti Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A1/V199I változatot a következőkkel hasonlítottuk össze: Bacil32

HU 225 362 Β1 lus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/V199I változat és adott esetben az ismert Bacillus lentus alkalikus proteáz F49 és a Savinase® enzimeket használtuk. Ezeket is úgy koncentráltuk, hogy a mindenkori végkoncentráció 2250 PE proteolitikus aktivitást jelent az I. mosófürdőben, és a hőmérséklet szintén 40 °C.

A mérési sorozat mérései és a kiindulási értékek meghatározása a 2. példában megadottak szerint történt. A következő 3. táblázat bemutatja a kapott eredményeket.

3. táblázat

Alapmosószer kiegészítve	A	B	C
Kiindulási érték	13,6	13,2	11,1
Kontroll proteáz nélkül	24,5	17,8	14,4
S. lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61AA/199I	36,2	37,0	46,9
B. lentus alkalikus proteáz S3TA/4I/V199I	31,6	33,1	39,6
B. lentus alkalikus proteáz F49	28,7	28,6	25,9
Savinase®	29,0	30,8	29,0
Standard deviáció	1,0	0,8	1,3

összevetve mindkét Bacillus lentus alkalikus proteáz változatot, az S3T/V4l/G61A/V199l-et és az S3T/V4l/199l-et, felismerhető, hogy a 61. pozícióban lévő glicin kicserélése alifás aminosavra, azaz alaninra, az enzim jobb teljesítményéhez vezetett azonos recepttel a különböző szennyezéseknél és a különböző szöveteknél. Ezek nyilvánvalóan túlszárnyalták az ismert Bacillus lentus alkalikus proteáz F49-et és a Savinase®-t.

4. példa

Az edényeket, melyek felszíne szilárd és fényes, standardizáltan szennyeztünk: (A) tojásfehérje és (B) tojás/tej, majd háztartási mosogatógépben öblítettük 45 °C-on normálprogrammal (Typ Miele® G 676). Az öblítőprogramhoz 20 g öblítőszert használtunk, ahol a víz keménysége 16 német fok.

Öblítőszerként, melyeket az alaprecepttel alkalmaztunk, a következő összetételű szert használtunk (tömegszázalékban): 55% nátrium-tripolifoszfát (vízmentesre számoltuk), 4% amorf nátrium-diszilikát (vízmentesre számoltuk), 22% nátrium-karbonát, 9% nátrium-perborát, 2% TAED, 2% nemionos tenzid, a maradék a következő: víz, színanyag, parfüm. Ehhez az alaprecepthez különböző proteázokat adtunk: Bacillus lentus alkalikus proteáz F49, Savinase®, előnyösen a találmány szerinti Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V99I/L211D változatot, ezeket minden esetben az öblítőprogramba 10 000 PE-ben adtuk. Ez grammonként megfelel körülbelül 0,1 mg proteázfehérje per tisztítószer koncentrátumnak.

Az öblítés után a szennyezéseltávolítást gravimetriásán értékeltük és százalékban adtuk meg. Ehhez a szennyezett és a kiöblített edény súlykülönbségét és az edény kiindulási súly és a nem kiöblített edény súlyának különbségét a kiindulási súlyhoz viszonyítva meghatároztuk. Ezeket a viszonyokat százalékban fejeztük ki. A kapott eredményeket a 4. táblázatban állítottuk össze. Itt kilenc mérés átlagát tüntettük fel. Ezek közvetlen visszakövetkeztetést tesznek lehetővé a kapott enzim vonatkozásában az alkalmazott szer mosási teljesítményére.

4. táblázat

Alapmosószer kiegészítve	A	B
B. lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I/L211D	29,8	33,2
B. lentus alkalikus proteáz F49	26,3	22,4
Savinase®	12,5	12,0

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V99I/L211D tisztítási teljesítménye gépi mosogatógépben a többi vizsgált proteázhoz képest erősebb, de legalábbis egyenrangú; és ez már kisebb mennyiségben is nagyobb aktivitást jelent.

5. példa

Az edényeket, melyek felszíne szilárd és fényes, az előző példában megadott szennyeződésekkel vizsgáltuk, kiegészítve (D)-vel (Lasagne), majd hasonló módon öblítettük 45 °C-on. Az öblítőprogramhoz 20 g öblítőszert használtunk, ahol a víz keménysége 16 német fok. A különbség abban állt, hogy ebben a példában, bár azonos tisztítórecepteket használtunk, a következőket hasonlítottuk össze: a találmány szerinti Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4l/G61A/V199l-t a Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4IA/199I változattal, valamint az ismert proteázokkal: Bacillus lentus alkalikus proteáz F49 és Savinase®. Ezeket minden esetben úgy koncentráltuk, hogy az öblítőprogramban 10 000 PE aktivitás legyen. A méréseket az előző példában megadott módon végeztük. A kapott eredményeket a 5. táblázatban állítottuk össze.

5. táblázat

Alapöblítő kiegészítve	A	B	C	D
B. lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I	20,3	17,3	72,3	82,3
fi. lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/V199I	19,3	15,5	61,6	77,1
β. lentus alkalikus proteáz F49	28,5	23,0	69,3	74,5
Savinase®	13,6	13,5	67,5	64,5

Felismerhető, hogy a Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A1/V199I változata a Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/V199I még tisztítószerekben alkalmazva is a különböző szennyeződésekre erősebb hatást fejt ki. Ez a teljesítményfokozás csak a 61. pozíció megváltoztatására vezethető vissza. Az összes

HU 225 362 Β1

Alapöblítő kiegészítve	B	D
B. lentus alkalikus proteáz F49	40,6	87,5
Savinase®	14,0	80,6

vizsgált szennyeződésnél jobb eredményt adott, mint a

Savinase®; és szemben a C és D szennyezéssel jobb eredményhez vezetett, mint a Bacillus lentus alkalikus proteáz F49.

6. példa

Ahogy a 4. példában ismertettük, az edényt standard módon az adott szennyezőkkel láttuk el, és hasonló tisztítási receptekkel és módon 45 °C-on öblítettük. Az egyetlen különbség az volt, hogy a mindenkori proteá- 10 zokból 20 000 PE-t adtunk. Ez megfelel körülbelül 0,2 mg proteáz tisztítási koncentrátumnak. Az 5. példában leírtakhoz hasonlóan a méréseket elvégeztük, és ezek eredményét a következő 6. táblázatban összeállítottuk.

6. táblázat

Alapmosószer kiegészítve	A	B
B. lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I/L211D	35,3	39,1
6. lentus alkalikus proteáz F49	33,2	32,7
Savinase®	12,4	14,0

A nagyobb mennyiségben alkalmazott proteázok a találmány szerinti proteázoknál nagyobb aktivitását ²⁵ eredményeztek szemben az ismert gépi öblítőszerekkel, mint például a Bacillus lentus alkalikus proteáz F49 és a Savinase®.

7. példa 30

Az előző példához hasonló módon az edényeket B és D szennyezésekkel láttuk el, és vizsgáltuk a találmány szerinti Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4l/G61A/V199l-vel, a Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/V199I változattal, a Bacillus lentus al- 35 kalikus proteáz F49-cel vagy a Savinase®-zal. Ezeket úgy koncentráltuk, hogy a proteolitikus aktivitás az öblítőprogramban 20 000 PE legyen. A hőmérsékletet 45 °C-ra állítottuk be. A méréseket az 5. példában leírtaknak megfelelően végeztük. A kapott eredményeket ⁴θ a 7. táblázatban tüntettük fel.

7. táblázat

Alapöblítő kiegészítve	B	D
B. lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I	34,7	89,4
B. lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/V199I	30,7	88,4

Felismerhető, hogy a Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A1/V199I változata a Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4l/V199l-hez képest még tisztítószerekben alkalmazva is a különböző szennyeződésekre erősebb hatást fejt ki. Ez a teljesítményfokozás csak a 61. pozíció megváltoztatására vezethető vissza. Ez az összes vizsgált szennyeződésnél jobb eredményt adott, mint a Savinase®; és a D szennyezésnél jobb eredményhez vezetett, mint a Bacillus lentus alkalikus proteáz F49.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.

1. ábra: A találmány szerinti Bacillus lentus alkalikus proteáz változat aminosavszekvenciájának elrendezése összevetve a legfontosabb ismert szubtilizinekkel, így az érettel és a megváltoztatott formákkal: ahol az S3T/V4I/G61A/V199I a találmány szerinti Bacillus lentus alkalikus proteáz változat; S3T/V4I/G61A/V199I/L211D a találmány szerinti Bacillus lentus alkalikus proteáz változat; a szubtilizin 309 a Bacillus lentus-bó\ származó szubtilizin [WO 89/06279 A1 számú szabadalmi bejelentés]; szubtilizin P892, mely a Bacillus nov. 92 fajból származik [EP 283075 A2 számú szabadalmi bejelentés]; szubtilizin Carlsberg a Bacillus licheniformis-bó\ izolálható [Smith és munkatársai: J. Bioi. Chem., 243, 2184-2191 (1968); szubtilizin BP’ a Bacillus amyloliquefaciens eredetű [Wells és munkatársai: Nucleic Acids Research, 11, 7911-7925 (1983)];

Konszenzus: Több helyen egybevág a megadott szekvenciák helyzeteivel.

2. ábra: A mutagenizált pUC18M131 vektor

Az 1. számú szekvencián bemutatott BamHI-SacI fragmens átfogja az 1-1771. pozíciókat; a vektor többi része a kiindulási plazmid pUC18-cal azonos (Fa. Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg). A további egyedi hasítási helyek felét az áttekinthetőség végett nem tüntettük fel.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a leírásban említett szekvenciákat, valamint számítógéppel olvasható formában is mellékeljük.

Claims (10)

A találmány új alkalikus proteáz változatokra vonatkozik. Ezek elsődlegesen a Bacillus lentus-ból nyert szubtilizinek számozása szerint a 61., 199. és/vagy a 211. pozícióban optimálisan legalább egy, a molekulák stabilizálására szolgáló módosítást hordozó változatok, melyek előnyösen pontmutációt tartalmaznak a 3. és/vagy 4. helyzeteken. A találmány az ilyen enzimek technikai folyamatokban megvalósuló széles körű alkalmazási lehetőségeire is vonatkozik, és különösen ezen új alkalikus proteáz változatok mosó- és tisztítószerekben történő alkalmazását tartja szem előtt. A szubtilizin típusú proteázok (szubtilázok, szubtilopeptidázok, EC 3.4.21.62) katalitikus hatású aminosavaik alapján a szerinproteázok közé tartoznak. Természetes körülmények között mikroorganizmusok, különösen Bacillus fajok termelik és szekretálják. Nemspecifikus endopeptidázként hatnak, azaz tetszés szerinti savamidkötést hidrolizálnak, mely főleg a peptidekben vagy a fehérjékben fordul elő. pH-optimum-értékük legtöbbször a lúgos tartományban található. A szakirodalomban ezek áttekintése megtörtént [Siezen: „Subtilases: Subtilisin-like Proteases” 75-95 „Subtilisin enzymes”, kiadó: R. Bott és C. Betzel, New York, (1996)]. A szubtilizin számos technikai alkalmazási lehetőséggel rendelkezik, így kozmetikumokban, és különösen a mosó- és tisztítószerek aktív alkotójaként szerepelhet. A proteázok más enzimekkel együtt, mint például amilázokkal, lipázokkal vagy cellulázokkal a mosó- és tisztítószerek aktív komponenseként felhasználhatók. Képesek a tisztítandó termékek, mint például a textíliák, vagy elmosásra szánt dolgok fehérjetartalmú szennyezéseinek lebontására. A hidrolízistermékek nagyobb oldékonyságuk alapján a mosóoldattal kimosódnak, vagy a többi mosó- vagy tisztítószer-alkotóba záródnak, feloldódnak, emulgeálódnak vagy szuszpendálódnak. így szinergizmus léphet fel az enzimek és a mosó- és tisztítószerek szokásos alkotóelemei között. A mosó- és tisztítóanyag-proteázok között a szubtilizin kedvező enzimatikus tulajdonságai miatt, mint például stabilitás vagy pH-optimum, kiemelkedő helyet foglal el. A továbbiakban ezek közül a legfontosabbakat, és technikai továbbfejlesztésének legfontosabb stratégiáit bemutatjuk. A mosószerproteázok fejlesztésének alapvető stratégiája abban áll, hogy a természetes úton mikrobiálisan felépülő enzimet először izoláljuk, majd elvi alkalmasságukat ezen területen levizsgáljuk. Ezek után a fenti molekulák optimalizálása elvégezhető. Ezt tehetjük a szakirodalomban leírtak alapján [WO 93/07276 A1 számú szabadalmi bejelentés], ebben a szabadalmi bejelentésben közzétették (Firmen Chemgen Corp., Gaithersburg, MD, USA, és Vista Chemical Company, Austin, TX, USA), hogy a Bacillus 164-A1 fajból nyerhető proteáz 164-A1 mosó- és tisztítószerekben felhasználható. Az alkalikus proteázok további példái, és forrásaik a következők: Bacillus sp-ből származó PD138, NCIMB 40338 (Fa), Novozymes [WO 93/18140 A1 számú szabadalmi bejelentés], melyet Bacillus fajból fermentációval nyertek, a BP-3376 törzsből származó proteináz K-16 (Fa. Kao Corp., Tokyo, Japan) [5.344.770 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés], és a pszichrofil szervezetekből nyert (Flavobacterium balustinum) proteáz [Fa, Procter & Gamble, Cincinatti, OH, USA: WO 96/25489 A1 számú szabadalmi bejelentés]. A szubtilizin BPN’, mely a Bacillus amyloliquefaciens-ből nyerhető, illetve a B. subtilis törzsekből, Vasantha és munkatársainak munkája [Vasantha és munkatársai: J. Bacteriol., 159, 811-819 (1984); és Wells és munkatársai: Nucleic Acids Research, 11, 7911-7925 (1983)]. A szubtilizin BPN’ elsősorban szubtilizin referenciaenzimeként ismert. A szakirodalomban leírták például a szubtilizin összes pontmutációját is [EP 130756 A1 számú szabadalmi bejelentés]. Itt csak a 217. pozíciót emeljük ki, mely megfelel a találmány szerinti enzim 211. pozíciójának; itt egyik kicserélést sem hangsúlyozzuk ki, bár mindegyiket megadtuk, ezek a következők: M, W, C vagy K; előnyben részesítjük az A vagy az S aminosavakra történő kicserélést. A szakirodalomban leírták [CA 2049097 A1 számú szabadalmi bejelentés] ezen molekulák többszörös mutációs formáit is, különösen figyelembe véve ezek alkalmazhatóságát mosó- és tisztítószerekben. Idesorolhatók a következő cserével kialakított változatok, mint például Y217K és Y217L, valamint a kettős mutánsok S63D/Y217K, azaz ezek a kicserélések megfelelnek a B. lentus alkalikus proteáz 211. pozíciójának, előnyösen a 61. és 211. pozíciójának. Természetesen egyetlen aminosavat sem építünk be, amely a szóban forgó bejelentés szerinti proteázok pozíciójának megfelel. Ezen enzimek hurokrégióiban pontmutációkkal olyan változatokat kapunk, melyek a szubsztráthoz kisebb mértékben kapcsolódnak, miközben a hidrolízis sebessége nagyobb, ahogy ezt a szakirodalomban leírták [WO 95/07991 A2 és WO 95/30010 A1 számú szabadalmi bejelentések]. A szakirodalomban leírták [WO 95/07991 A2 számú szabadalmi bejelentés] a molekula hatodik hurokrégiójában kialakított kettős mutációt, ahol egy további D mutációt is kialakítottak a 217. pozícióban (amely megfelel a Bacillus lentus alkalikus proteáz 211. pozíciójának). Mivel a BPN'-nél természetes körülmények között a 205. pozícióban I található (amely megfelel a 199. pozíciónak), e két pozíció maximalizálása az előbb leírt módon megvizsgálható, azonban a szubtilizinek hurokrégióiban más mutációk kombinációs lehetőségei, valamint az enzimatikus tulajdonságok specifikus megváltoztatásai fennállnak. Ilyen BPN’-változatokat tartalmazó mosószereket a szakirodalomban közzétettek [WO 95/29979 A1 számú szabadalmi bejelentés]. A további öt hurokrégió mutációit a szakirodalomban leírták [WO 95/30010 A1 számú szabadalmi bejelentés], így például a 63. pozícióban (megfelel a 61. pozíciónak), azonban ezekben a pozíciókban csak D-t vagy E-t alkalmaztak. A fenti szabadalmi bejelentésben két olyan aminosavhelyzetet vettek szemügyre, nevezetesen a 3. és 4. pozíciót, melyek nem a hurokrégió részei. Másrészt számos, ezekben a leírásokban megadott kicserélés nem a stabilizálással, különösen nem a szubtilizin stabilizálómutációjvai van kapcsolatban. A szubtilizin-Carlsberg-proteázt a szakirodalomban bemutatták [Smith és munkatársai: Journal of Biologi2 HU 225 362 Β1 cal Chemistry 243, 2184-2191 (1968); és Jacobs és munkatársai: Nucleic Acids Research 13, 8913-8926 (1985)]. Ezek természetes körülmények között a Bacillus licheniformis-ban épülnek fel, és például Maxatase® márkanéven forgalmazzák (Genencor International Inc., Rochester, New York, USA), valamint Alcalase® márkanéven (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dánemark) kapható. A pontmutációval nyerhető, szubsztráthoz csökkent mértékben kötődő, de egyidejűleg nagyobb hidrolizissebességű változatok a szakirodalomból ismertek [WO 96/28566 A2 számú szabadalmi bejelentés], Itt azokra a változatokra gondolunk, mely molekulák hurokrégiójában egy vagy több kicserélés fordul elő. Az egyes megadott pozíciókban kicserélt mosó- és tisztítószerekben kipróbált változatok, melyek a találmánynak megfelelnek, többszörös mutánsok, melyeknél a G62 cserén kívül (ez megfelel a Bacillus lentus alkalikus proteáz 61. pozíciójának) a következő cseréket végezték el: N, D, Q, Ε, P vagy S, de A cserét nem hajtottak végre, a V204 pozícióban (amely a 199. pozíciónak felel meg) különböző aminosavcseréket végeztek, de l-t nem végeztek, és az L216 pozícióban (amely a 211. pozíciónak felel meg) 14 különböző aminosavcserét hajtottak végre, ideértve az l-t is. Tehát ezzel a bejelentéssel csupán a találmányt érintő 3T változatokat és a 211 D-t írták le, de ismeretes, hogy a szubtilizin-Carlsberg 3. pozíciójában természetes körülmények között T foglal helyet. A PB92 proteáz természetes körülmények között az alkalofil Bacillus nov. 92 törzsben képződik, és a Fa cég Maxacal® néven forgalmazza (Gist-Brocades, Delft, Niederlande). Ennek eredeti szekvenciáját a szakirodalomban leírták [EP 283075 A2 számú szabadalmi bejelentés]. Az enzim pontmutációval nyerhető változatait, melyek mosó- és tisztítószerekben alkalmazhatók, a szakirodalomban közzétették [WO 94/02618 A1 és EP 328229 A1 számú szabadalmi bejelentések]. Az elsőben csak a 211. pozícióban végeztek kicserélést különböző aminosavakkal, de a D-ről nem számoltak be. A második közleményben közzétették, hogy bizonyos terület, mely a 61-211. aminosavak tartománya, a szubsztrátkötésben vesz részt. A különösen érdekes pozíciók mutagenezise során a 61. pozícióval mégsem foglalkoztak, és a 211. pozícióban az aminosav Y-ra cserélését javasolták, ami csak legalább egy további kicseréléssel teszi lehetővé a mosási teljesítmény növelését. A szubtilizin 147 és 309 kereskedelmi neve Esperese®, illetőleg Savinase®, ezeket a Fa Novozyme forgalmazza. Eredetileg Bacillus törzsekből származnak, melyeket a szakirodalomban közzétettek [GB 1243784 A számú szabadalmi bejelentés]. Ezen enzimek pontmutációval továbbfejlesztett változatait, melyek mosó- és tisztítószerekben alkalmazhatók, a szakirodalomban közzétették [WO 94/02618 A1, WO 89/06279 A1, WO 95/30011 A2 és WO 99/27082 A1 számú szabadalmi bejelentések]. A WO 89/06279 A1 számú szabadalmi bejelentés szerzői a következő célokat tűzték maguk elé: nagyobb stabilitás biztosítása oxidációval szemben, megnövelt proteolízissebesség és javított mosási teljesítmény. Kiderült, hogy bizonyos pozíciókban végzett kicserélés a szubtilizin 147 vagy 309 molekulák fizikai vagy kémiai stabilitását képes megváltoztatni (az alkalikus proteáz számozása megfelel a Bacillus lentus DSM 5483 proteázának); ehhez a 199. pozíciót nevezték meg, de speciális kicserélésekről nem írtak. A WO 95/30011 A2 számú szabadalmi bejelentés a szubtilizin 309 változatait mutatja be, melyeket a molekulák hurokterületén pontmutációkkal alakítottak ki, így a szubsztrátabszorpció csökken, miközben a hidrolízis sebessége nő. Ilyen területek a következők is: 61., 199. és 211. pozíciók. A 221. pozícióban L211D kicserélést javasoltak; míg a 61 pozícióban G cseréjét a következő aminosavakra: N, D, Q, Ε, P vagy S, a 199. pozícióban hasonlóan sok cserét javasoltak, de l-t nem. A WO 99/27082 A1 számú szabadalmi bejelentés példája a szubtilizin 309 változatok fejlesztését mutatja be, mellyel a mosási teljesítmény javult, miközben az aktív hurkot inszercióval legalább egy aminosawal megnövelték. Helyettesítésekről sem számoltak be a szóban forgó bejelentésben. A szubtilizin DY-t eredetileg Nedkov és munkatársai írták le [Nedkor és munkatársai: Bioi. Chem Hoppe-Seyler, 366, 421-430 (1985)]. Például a WO 96/28557 A2 számú szabadalmi bejelentés szerint a mosó- és tisztítószerekben történő optimalizáláshoz a megcélzott pontmutációk az aktív hurokban szerepelhetnek. Idetartoznak a csökkentett abszorpciójú és növelt hidrolizissebességű változatok, mint például a 62. pozícióban végzett kicserélések (ez megfelel a Bacillus lentus alkalikus proteáz 61. pozíciójának), ahol G helyére N, D, Q, Ε, P vagy S aminosavak kerülnek, a 204. pozícióban (megfelel a 199. pozíciónak) nem történt 2041 kicserélés, és a 216. pozícióban (megfelel a 211. pozíciónak) több kicserélést hajtottak végre, mint például D-t is. Mivel a szubtilizin DY a 3. pozíciójában természetes módon T-t tartalmaz, így itt leírtak egy 3T/211D változatot is. A Thermoactinomyces vulgaris-ban természetes körülmények között képződő termitázt a szakirodalomban leírták [Meloun és munkatársai: FEBS Lett., 195-200 (1983)]. A csökkentett abszorpciójú és megnövelt hidrolízissebességű változatokat a hurokrégióban végzett szubsztitúciókkal nyerték [WO 96/28558 A2 számú szabadalmi bejelentés]. A 221. pozícióban végzett kicseréléseket (ami a Bacillus lentus alkalikus proteáz 211. pozíciójának felel meg) 14 aminosawal végezték, D-vel is, és a 70. pozícióban (megfelel a 61. pozíciónak) a G-t a következőkre cserélték: N, D, Q, Ε, P vagy S. Mivel a termitáz 209. pozíciójában (megfelel a 199. pozíciónak) természetes körülmények között I szerepel, ezért a szóban forgó bejelentésben főleg a 1991 és a 221D változatokat ajánlják a leggyakrabban. Különösen a stabilizálóhatáshoz nem vezető 3. pozíciójú treonin és/vagy a 4. pozíciójú izoleucin cserét javasolták (Bacillus lentus alkalikus proteáz alapján). A termitáz 10. és 11. pozíciójú megfelelő homológjaiban az S, illetve R aminosavak találhatók [WO 91/00345 A1 számú szabadalmi bejelentés]. A fentieken kívül olyan termitázmolekulák is vannak, melyek3 HU 225 362 Β1 ben a szekvenciák a többi szubtilizintől jelentősen eltérnek. így az érett termitázfehérje és a Bacillus lentus DSM 5483 alkalikus proteáz között a homológia 45%-os (62%-ban azonos aminosavak). Míg a proteináz K és a Bacillus lentus alkalikus proteáz között a homológia kisebb mértékű. Az érett fehérjére vonatkoztatva ez csak 33%-os azonosságot jelent (az aminosavak 46%-ban azonosak). A proteináz K-t eredetileg a Tritirachium album Limber mikroorganizmusban írták le [Jany és Mayer: Bioi. Chem. HoppeSeyler, 366, 485-492 (1985)]. A WO 88/07581 A1 számú szabadalmi bejelentésben közzétették a nagyon hasonló TW3 és TW7 proteázokat, valamint többek között ezek alkalmazását mosó- és tisztítószerekben. A WO 96/28556 A2 számú szabadalmi bejelentésben a proteináz K-ban számos aminosavcserét végeztek a 220. pozícióban (ez megfelel a Bacillus lentus alkalikus proteáz 211. pozíciójának), a D-t is kipróbálták, és a 68. pozícióban (megfelel a 61. pozíciónak) a G-t kicserélték N, D, Q, Ε, P vagy S aminosavakra. Mivel a proteináz K 208. pozíciójában (megfelel a 199. pozíciónak) természetes körülmények között I található, míg a

1. Szubtilizin típusú alkalikus proteázok, azzal jellemezve, hogy a Bacillus lentus-bó\ nyert szubtilizinek számozása szerint a 61. pozícióban az aminosavat alaninra cseréljük ki.

1. ábra: A találmány szerinti Bacillus lentus alkalikus proteáz változat aminosavszekvenciájának elrendezése összevetve a legfontosabb ismert szubtilizinekkel, így az érettel és a megváltoztatott formákkal: ahol az S3T/V4I/G61A/V199I a találmány szerinti Bacillus lentus alkalikus proteáz változat; S3T/V4I/G61A/V199I/L211D a találmány szerinti Bacillus lentus alkalikus proteáz változat; a szubtilizin 309 a Bacillus lentus-bó\ származó szubtilizin [WO 89/06279 A1 számú szabadalmi bejelentés]; szubtilizin P892, mely a Bacillus nov. 92 fajból származik [EP 283075 A2 számú szabadalmi bejelentés]; szubtilizin Carlsberg a Bacillus licheniformis-bó\ izolálható [Smith és munkatársai: J. Bioi. Chem., 243, 2184-2191 (1968); szubtilizin BP’ a Bacillus amyloliquefaciens eredetű [Wells és munkatársai: Nucleic Acids Research, 11, 7911-7925 (1983)];

Konszenzus: Több helyen egybevág a megadott szekvenciák helyzeteivel.

1:12, és a mosást 30 percig 40 °C-on végeztük. A dozírozás mosófürdőként a mindenkori szer 5,88 g-ját jelentette. A víz keménysége 16 német fok.

Kontroilmosószerként a következő mosószerreceptek szolgáltak (mindegyiket tömegszázalékban adtuk meg): 4% lineáris alkil-benzolszulfonát (nátriumsó), 4% C₁₂-C₁₈-zsíralkohol-szulfát (nátriumsó), 5,5% C₁₂-C₁₈-zsíralkohol 7 EO-val, 1% nátriumszappan, 11% nátrium-karbonát, 2,5% amorf nátrium-diszilikát, 20% nátrium-perborát-tetrahidrát, 5,5% TAED, 25% Zeolith A, 4,5% polikarboxilát, 0,5% foszfonát, 2,5% habgátló granulátum, 5% nátrium-szulfát, kiegészítésként víz, optikai fehérítőszer, só. A különböző vizsgálati sorozatokhoz a következő proteázokat adagoltuk (ez mindig végkoncentrációt jelent, 2250 PE proteolitikus aktivitású I. mosdófürdő): Bacillus lentus alkalikus proteáz F49 [WO 95/23221 számú szabadalmi bejelentés]; előállítója: Fa. Biozym, Kundl, Österreich), Savinase® (Fa. Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dánemark), előnyösen a találmány szerinti proteáz, a Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61ΑΛ/199I/L211D jelű.

A mosás után a mosott textíliák fehérségi fokát bárium-szulfáthoz viszonyítottuk, melyet 100%-nak tekintettünk. A mérések spektrofotométerrel történtek (Datacolor SF500-2,460 nm, UV-Sperrfilter 3, 30 mm blende, nem fényezett, Lichtart D65,10°, d/8°). A kapott eredményeket százalékos remisszióként adtuk meg, azaz a bárium-szulfáthoz hasonlítva, együtt a mindenkori kiindulási értékekkel, lásd a következő 2. táblázatot. Az adatok 4 mérés átlagát jelentik. Ezek közvetlen visszakövetkeztetéseket tesznek lehetővé a kapott enzim vonatkozásában az alkalmazott szer mosási teljesítményére.

1. példa

A találmány szerinti proteázok létrehozása

Az összes molekuláris biológiai lépést standard módon végeztük, ahogy azt a szakirodalomban leírták [Fritsch, Sambrook és Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual”, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, (1989); WO 92/21760 A1 számú szabadalmi bejelentés],

A mutációs vektorok előállítása

A mutagenezist a Bacillus lentus alkalikus proteáz M131 változaton hajtottuk végre. Ezt a változatot a szakirodalomban leírták [WO 92121760 A1 számú szabadalmi bejelentés] és letétbe helyezték: Bacillus licheniformis ATCC 68614 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA). Ebben a törzsben a Bacil/us-okban replikálódó pCB56M131 plazmid található, melyben az expressziós kazetta promoterből, riboszómakötő helyből, valamint ATG-startkodonból áll, és az alkalikus proteáz aminoterminálisának 22 aminosavát is felöleli, amit a Bacillus licheniformis ATCC 53926-ból nyertek, a pre-pro-fehérjével fuzionáltak, és amelybe a Bacillus lentus alkalikus proteáz mutált szekvenciáját építettük be. A Bacillus lentus alkalikus proteáz

M131 változat következő mutációi összevethetők a natív szekvenciával: S3T, V4I, A188P, V193M, V199I.

A mutagenezíshez a teljes expressziós kazettát a vektorból BamHI és Sacl restrikciós endonukleázokkal kivágtuk, és hasonlóképpen a BamHI és Sacl enzimekkel vágott pUC18 vektorba klónoztuk (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg). A kapott pUC18M131 vektort ezek után a következő mutációs lépéseknek vetettük alá. A pUC18M131 vektort a 2. ábrán mutattuk be. Dokumentáltuk, hogy a Bacillus lentus alkalikus proteáz M131 DNS-fragmense az expressziós kazettában szerepel, melynek szekvenciaszáma: 1, és az ennek megfelelő aminosavszekvenciát is bemutattuk (a szekvencia száma: 2). Az 1. szekvencián bemutatott BamHl-Sacl fragmens kiterjed a 2. ábrán bemutatott pUC18M131 vektor 1-1771. helyzeteire; a vektor további részei megegyeznek a pUC18 kiindulási plazmiddal.

Mutagenezis

Először a Bacillus lentus DSM 5483 alkalikus proteáz eredeti szekvenciáját a 188. és 193. pozíciókban helyreállítottuk. Ehhez a szakirodalomban leírt eljárást alkalmaztuk (a Fa cég QuikChange® eljárása, Stratagene, La Jolla, CA, USA). Ezek után a mindenkori két komplementer felhasználásával a mutációkat tartalmazó primereket polimeráz-láncreakcióval a mutált plazmidon létrehoztuk. A kiindulási plazmid Dpn I hasítása után, ahogy azt a QuikChange® eljárásban előírták, a reakcióelegyet E. coli XL-1 blue-ba transzformáltuk. Az így kaptuk meg azt a kiónt, mely plazmidja a kérdéses gént tartalmazza, ami adott esetben mutációval kapcsolt restrikciós hellyel könnyen felismerhető, ezt az ellenőrzés miatt minden esetben hagyományos készlettel is megvizsgáltuk láncbontási eljárásban. Hasonló eljárásokat végeztünk a következő mutagenezislépésekben is.

A 188. aminosavpozíció átalakításához a CCA (prolin) és GCC (alanin) tripletteket használtuk az 5’-TCA CAG TAT GGC GCC GGG CTT GAC ATT-3', illetve az 5’-AAT GTC AAG CCC GGC GCC ATA CTG TGA-3’ prímeméi. Ez közvetlenül a mutáció mellett az aminosavszekvenciában nem módosított Narl restrikciós helyet tartalmaz.

A 193. aminosavpozíció átalakításához az ATG (metionin) és ATT (izoleucin) tripletteket használtuk mindkét prímeméi: 5-GGG CTT GAC ATT GTG GCA CCC GGG GTA AAC-3’, valamint 5’-GTT TAC CCC GGG TGC CAC AAT GTC AAG CCC-3’. Ez közvetlenül a mutáció mellett az aminosavszekvenciában nem módosított Xma Cl restrikciós helyet tartalmaz.

Ez egy kettősen mutált plazmidot tartalmazó kiónt szolgáltatott, amennyiben a 61. pozícióban a triplettek a következők: GGG (glicin), GCT (alanin). Ehhez a két komplementer primer a következő: 5’-CAA GAT GGG AAT GCT CAT GGC ACG CAT-3', valamint 5-ATG CGT GCC ATG AGC ATT CCC ATC TTG-3’. Ezzel megkaptuk a Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I változatot.

Ezekből a mutációkból kiindulva megkaptuk a második legelőnyösebb változatot a 221. pozícióban, ahol

HU 225 362 Β1 a meglévő leucint aszparaginra mutáltuk. Ehhez az alkalmazott komplementer primerek szekvenciája a következő: 5-ACG TAT GCC AGC GAC AAC GGT ACA TCG-3’, valamint 5’-CGA TGT ACC GTT GTC GCT GGC ATA CGT-3’. A kapott klón azonosságát ezek után DNS-szekvenálással igazoltuk.

A mutáns S3T/V4I/G61A/V199I gént kódoló proteáz teljes szekvenciáját a 3. számú szekvenciavázlatban adtuk meg. Ebből levezethető az aminosavszekvencia, melyet a 4. szekvenciaszámon adtunk meg. A mutáns S3T/V4I/G61A/V199I/L211D gént kódoló proteáz teljes szekvenciáját az 5. számú szekvenciavázlatban adtuk meg. Ebből levezethető az aminosavszekvencia, melyet a 6. szekvenciaszámon adtunk meg. Ezek a változatok a vad típusú Bacillus lentus DSM 5483 alkalikus proteáztól a megadott pozíciókban eltérnek, ezeket a következőképpen jelöljük: Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I és Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I/L211D.

A mutánsok kifejezése és a fehérjekészítmények előállítása

A mutált szekvenciákat tartalmazó expressziós kazettákat az 1. szekvencia BamHI-SacI fragmenseként a pC856M131 vektorba visszaklónoztuk, és ezzel a Bacillus subtilis DB104-et transzformáltuk. A Bacillus subtilis DB 104 törzs genotípusa: his, nprR2, nprE18, aprA3 [Kawamura és Dói: J. Bacteriol., 160, 442-444 (1984)]. A DNS transzformációját a Bacillus-ba a szakirodalomban leírtaknak megfelelően végeztük [WO 91/02792 számú szabadalmi bejelentés; ez az eredeti módszer változata: Chang és Cohen: Protoplastenmethode, Molec. Gén. Génét., 168, 111-115 (1979)].

Az ezzel nyerhető proteáz pozitív klón igazolását 500 ml MLBSP közegben végeztük (10 g/l kaziton; 20 g/l tripton, 10 g/l élesztőkivonat (ezek mindegyikének gyártója: Fa. Becton Dickinson, Cockeysville); 5 g/l NaCI; 27 g/l nátrium-szukcinát; 100 mg/l MgSO₄*7 H₂O; 75 mg/l CaCI₂*2 H₂O; 0,5 μΜ MnCI₂; 0,5 μΜ FeSO₄; 2% (vegyes) glükóz; 50 mM PlPES-puffer (1 M törzsoldatból, pH=7,2); 75 mM KPO₄ (1,5 M törzsoldatból, pH=7,0); pH=7,0, amit kiegészítettünk KOH-dal, valamint 10 pg/ml tetraciklinnel 2000 ml-es rázólombikban, 72 óráig 37 °C-on inkubálás, és percenként 200 fordulattal kevertük. A sejtek lecentrifugálása után kapott felülúszóban a proteázaktivitást meghatároztuk [Tenside, 1, 125-132 (1970)], ezt használtuk a következő kísérletekhez.

1,6-di(N₁ ,N₁’-2,4,5-triklór-fenil-diguanido-N₅,N₅’)-hexán-tetrahidroklorid, 1,6-di(N₁ ,N_d ’-alfa-(p-klór-fenil)etil-diguanido-N₅,N5')-hexán-dihidroklorid, omega:omeg a-d i (N! .NJ-p-klór-fenil-diguanido-Ns.Ng’)m-xilén-dihidroklorid, 1,12-di(N ₃, N-j ’-p-klór-fenil-diguanido-N₅,N₅’)-dodekán-dihidroklorid, 1,10-di(Ni ,N-| ’-fenil-diguanido-N₅,N₅’)-dekán-tetrahidroklorid, 1,12diíN^N^-fenil-diguanido-Ng.Nsl-dodekán-tetrahidroklorid, l.e-dKNi.Nl-o-klór-fenil-diguanido-Ns.Ng’)hexán-dihidroklorid, 1,6^1(^,N.f-0-klór-fenil-diguanido-N₅,N₅’)-hexán-tetrahidroklorid, etilén-bisz(1-tolil-biguanid), etilén-bisz(p-tolil-biguanid), etilén-bisz(3,5-dimetil-fenil-biguanid), etilén-bisz(p-terc-amil-fenil-biguanid), etilén-bisz(nonil-fenil-biguanid), etilén-bisz(fenil-biguanid), etilén-bisz(N-butil-fenil-biguanid), etilén-bisz(2,5-dietoxi-fenil-biguanid), etilén-bisz(2,4-dimetíl-fenil-bíguanid), etilén-bisz(o-dífenil-biguanid), etilén-bisz(kevert amil naftil-biguanid), N-butil-etilén-bisz(fenil-biguanid), trimetilén-bisz(o-tolil-biguanid), N-butil-trimetil-bisz(fenil-biguanid) és ezek megfelelő sói, mint például acetát, glukonát, hidroklorid, hidrobromid, cifrát, biszulfit, fluorid, polimaleát, N-kokozalkil-szarkozinát, foszfit, hipofoszfit, perfluorooktanoát, szilikát, szorbát, szalicilát, maleát, tartarát, fumarát, etilén-diamin-tetraacetát, imino-diacetát, cinnamát, tiocianát, arginát, piromellitát, tetrakarboxi-butirát, benzoát, glutarát, monofluor-foszfát, perfluor-propionát, valamint kívánt keverékei. A további megfelelő anyagok a következők lehetnek: halogénezett xilol- és krezolszármazékok, mint például p-klór-metakrezol vagy p-klór-metaxilol, valamint természetes növényi eredetű antimikrobiális hatóanyagok (például fűszerekből vagy lágyszárúakból), állati, valamint mikrobiális eredetűek. Előnyösen az antimikrobiálisan ható felületaktív kvaterner vegyületek természetes növényi eredetű antimikrobiális és/vagy természetes állati eredetű antimikrobiális anyagok, ahol különösen előnyben részesítjük azokat a növényi eredetű antimikrobiális hatóanyagokat, melyek a következő csoportba tartoznak: koffein, teobromin és teofillin, valamint éterezett olajok, mint például eugenol, timol és geraniol, és/vagy legalább egy természetes állati eredetű antimikrobiális hatóanyagot tartalmaznak, mely a következő csoportba tartozik: tejből nyert fehérje, lizozim és laktoperoxidáz, és/vagy legalább egy antimikrobiálisan ható felületaktív kvatemer vegyületet tartalmaznak, mint például ammónium-, szulfónium-, foszfónium-, jodónium- vagy arzóniumcsoporttal rendelkeznek, peroxovegyületek és klórvegyületek. A mikrobiális eredetű úgynevezett bakteriocinvegyületek szintén alkalmazhatók.

Antimikrobiális hatóanyagként megfelelő kvaterner ammóniumvegyületek általános képlete a következő: (R¹)(R²)(R³)(R⁴)N⁺X~, ahol R¹-R⁴ jelentése azonos vagy eltérő Ci-C₂₂-alkil-csoport, C7-C₂₈-aralkil-csoport vagy heterociklikus csoport, ahol két vagy aromás kötés esetében, mint például piridin, akár három csoport a heterociklus nitrogénjével kapcsolódik, a piridinium- vagy imidazolvegyületeknél, és X jelentése halogenidionok, szulfátionok, hidroxiionok vagy hasonló anionok. Az optimális antimikrobiális hatást előnyösen

HU 225 362 Β1

1-8 szénatomos egyenes vagy elágazó vagy ciklikus alkilcsoport vagy arilcsoport vagy oxi-alkil-csoport, ahol C-^-alkil- vagy fenilcsoport előnyös, és [Z] jelentése lineáris polihidroxi-alkil-csoport, melynek alkillánca legalább két hidroxilcsoporttal szubsztituált, vagy ezen csoportok alkoxilezett, előnyösen etoxilezett vagy propoxilezett származékai.

Előnyösen [Z] egyes redukálócukrok, mint például glükóz, fruktóz, maltóz, laktóz, galaktóz, mannóz vagy xilóz reduktív aminálásával kapható meg. Az N-alkoxivagy N-aril-oxi-szubsztituált vegyületek úgy állíthatók elő, hogy a zsírsav-metil-észterekkel alkoxidkatalizátorok jelenlétében a kívánt polihidroxi-zsírsav-amiddá átalakítjuk.

Anionos tenzidként például a szulfonát és a szulfát típusúak használhatók. A szulfonát tenzidek közül előnyben részesítjük például a C₉_₁₃-alkil-benzolszulfonátokat, az oleil-szulfonátokat, azaz az alkén- és a hidroxi-alkánszulfonátokat, mint például a diszulfonátokat, amelyeket például C₁₂_₁₈-monoolefinekből, melyek a láncvégeken vagy annak belsejében kettős kötést tartalmaznak, gáz formájú kén-trioxiddal történő szulfonálással, majd ezután a szulfonált termék lúgos vagy savas hidrolízisével kapunk. Azok az alkánszulfonátok is megfelelnek, melyeket például C₁₂_₁₈-alkánokból szulfoklórozással vagy szulfoxidálással és végül hidrolízissel, illetve neutralizálással nyerhetünk. Hasonlóképpen az α-szulfozsírsav- (észterszulfonát) észterek, például a kókusz-, pálmamag- vagy faggyúzsírsavak α-szulfonált metil-észterei is megfelelnek.

Egy további alkalmas anionos tenzid a szulfátéit zsírsav-glicerin-észter. A zsírsav-glicerin-észterek alatt a mono-, di- és triésztereket, valamint ezek keverékeit értjük, amit monoglicerinből 1-3 mól zsírsavas segítségével észterezéssel állítunk elő vagy a trigliceridek 0,3-2 mól glicerinnel történő átészteresítésével kapunk. Ráadásul az előnyben részesített szulfatált 6-22 szénatomos telített zsírsavakból indulnak ki, mint amilyen például a kapronsav, a kaprilsav, a kaprlnsav, a mirisztinsav, a laurinsav, a palmitinsav, a sztearinsav vagy a behénsav (dokozánsav).

Alk(én)il-szulfátként Ci₂_i₈-zsíralkoholok kénsavfélészterek alkáli-, és különösen nátriumsói, például kókuszzsíralkohol, faggyúzsíralkohol, lauril-, mirisztil-, cetil- vagy sztearil-alkohol vagy C₁₀-C₂₀ lánchosszúságú oxo-alkoholok és ezek szekunder alkohollal alkotott félészterei előnyösek. Továbbá a megnevezett lánchosszúságú alk(én)il-szulfátok, melyek szintetikus, petrolkémiai alapokon előállított, egyenes láncú alkilcsoportot tartalmaznak, analóg lebontási gátlást mutatnak, mint a zsírkémiai nyersanyagok vegyületei. Mosástechnikai szempontból a C₁₂-C₁₈-alkil-szulfátok és a C₁₂-C₁₅-alkil-szulfátok, valamint a C₁₄-C₁₅-alkil-szulfátok érdekesek, és előnyben részesítettek. A 2,3-alkil-szulfát is a megfelelő anionos tenzidek közé tartozik.

Azok a kénsavmonoészterek is előnyösek, melyeket 1-6 mól etilén-oxiddal etoxilezett egyenes vagy elágazó láncú C₇_₂₁-alkoholokból, mint például a 2-metilesen elágazó C₉_₁i-alkoholokból, átlagban 3,5 mól etilén-oxiddal, vagy a C₁₂_₁₈ esetében 1-5 mól EO-val készülnek. A kis mennyiségben már megmutatkozó magas habzási képességük miatt a tisztítószerekben csak kis mennyiségben, 5 tömeg%-ig, például 1-5 tömeg%-ban alkalmazzák.

A további alkalmas anionos tenzidek azok az alkil-szulfoborostyánkősavsók, melyeket szulfoszukcinátnak vagy szulfoborostyánkősavészternek is neveznek, és amelyek a szulfoborostyánkősav alkoholokkal, előnyösen zsíralkoholokkal alkotott monoésztereiből és/vagy diésztereiből és adott esetben etoxilezett zsíralkoholokból állítanak elő. Az előnyben részesített szulfoszukcinát Cg_₁₈-zsíralkoholokat vagy ezek keverékét tartalmazzák. A különösen előnyben részesített megvalósítási formában a szulfoszukcinát egy zsíralkoholcsoportot tartalmaz, amelyet etoxilezett zsíralkoholokból vezethetünk le, amelyek maguk a nemionos tenzidek közé számítanak (leírásukat lásd lejjebb). Ráadásul, ezzel szemben a szulfoszukcinát, melynek zsíralkoholcsoportja etoxilezett zsíralkoholból korlátozott homológmegosztással vezethető le, különösen előnyös. Éppúgy az is lehetséges, hogy előnyösen 8-18 szénatomos alk(én)illáncos alk(én)il-borostyánkősavat vagy annak sóját alkalmazzuk.

Anionos tenzidekként különösen a szappanok jönnek tekintetbe. A megfelelők közé a telített zsírsavszappanok, mint például a laurilsav, mirisztilsav, palmitinsav, sztearinsav, hidrogénezett erukasav és a behénsav sói, valamint különösen a természetes zsírsavakból, mint például a kókusz-, pálmamag- vagy faggyúsavakból levezetett szappankeverékek tartoznak.

Az anionos tenzidek, beleértve a szappanokat is, nátrium-, kálium- vagy ammóniumsó formákban, valamint oldható szerves bázisokként, mint például a mono-, di- vagy trietanol-amin fordulhatnak elő. Előnyösen az anionos tenzidek nátrium- vagy káliumsó formákban, különösen nátriumsó formákban fordulnak elő.

A találmány szerinti mosó- és tisztítószerekben a tenzidek a kész szerre viszonyítva előnyösen 5-50 tömeg%-ban, előnyösebben 8-30 tömeg%-ban, és legelőnyösebben 8-30 tömeg%-ban fordulnak elő.

A találmány a következő fehérítőszereket tartalmazhatja. Fehérítőanyagként, a vízben H₂O₂-ot szolgáltató vegyületek közül a következők különös jelentőséggel bírnak: nátrium-perkarbonát, nátrium-perborát-tetrahidrát és a nátrium-perborát-monohidrát. A további alkalmazható fehérítőszerek a következők: peroxopirofoszfát, citrátperhidrát, valamint a H₂0₂-ot szolgáltató persavsók vagy persavak, mint például a perszulfát, illetve a perkénsav. Alkalmazható a karbamid-peroxohidrát-perkarbamid, ami a következő képlettel írható le: H₂N-CO-NaH₂*H₂O₂. A szilárd felületek tisztításához, elsősorban például a gépi mosogatáshoz, a fehérítőszert a szerves fehérítőszerek csoportjából választják, ezek a textíliák esetében is alkalmazhatók. A tipikus szerves fehérítőanyagok közé a

HU 225 362 Β1 diacil-peroxidok, mint például a dibenzoil-peroxid, tartoznak. További tipikus szerves fehérítőszerek a peroxisavak, ahol például különösen az alkil-peroxisavak és az aril-peroxisavak nevezhetők meg. Az előnyben részesített képviselők a peroxi-benzoesavak és ennek gyűrűben helyettesített származékai, mint például alkil-peroxi-benzoesavak, de a következők is idetartoznak: peroxi-a-naftoesav és a magnézium-monoperftalát, az alifás vagy szubsztituált alifás peroxisavak, mint például a peroxi-laurinsav, peroxi-sztearinsav, ε-ftálimido-peroxi-kapronsav (ftálimido-peroxi-hexánsav, PAP), o-karboxi-benzamido-peroxi-kapronsav, N-nonenil-amido-peradipinsav és N-nonenil-amido-perszukcinát, és az alifás és arilalifás peroxi-dikarbonsavak, mint például 1,12-diperoxi-karbonsav, 1,9-diperoxi-azelainsav, diperoxi-szebacinsav, diperoxi-brasszilsav, a diperoxi-ftálsavak, 2-decil-diperoxi-bután-1,4-disav, N,N-tereftaloil-di(6-amino-perkapronsav).

A fehérítőszer mennyisége a mosó- és tisztítószerben 1—40 tömeg% és előnyösen 10-20 tömeg%, ahol előnyösen perborát-monohidrátot vagy perkarbonátot alkalmazunk.

A 60 °C-on vagy a felett végzett mosásoknál a jobb fehérítés elérése érdekében kizárólagos alkotórészként fehérítést biztosító aktivátorokat alkalmazhatunk. A fehérítést aktiválóként olyan vegyületet alkalmazhatunk, amelyek előnyösen 1-10 szénatomos, előnyösebben

1. táblázat

A találmány szerint öt különösen előnyben részesített pozíció homologizálása

Referencia Származás Pozíciók 3. 4. 61. 199. 211. Bacillus lentus alkalikus proteáz WO 92/21760 A1 S3 V4 G61 V199 L211 BPN’ Wells és munkatársai (lásd fent) S3 V4 S63 1205 Y217 Szubtilizin Carlsberg Smith és munkatársai (lásd fent) T3 V4 G62 V204 L216 PB92 EP 283075 A2 S3 V4 G61 V199 L211 Szubtilizin 309 WO 89/06279 A1 S3 V4 G61 V199 L211 Termitáz WO 91/00345 A1 S10 R11 G70 I209 L221 Proteináz K WO 91/00345 A1 T4 A6 G68 I208 I220

A találmány szerinti Bacillus lentus alkalikus proteáz változatok, azaz az S3T/V4I/G61A/V199I és az S3TA/41/G61AA/199I/L211D aminosavszekvenciáinak 20 elrendezését ezekkel a fontos, bevezetésben leírt szubtilizinekkel mutattuk be a találmány 1. ábráján, nevezetesen ezek a következők: szubtilizin 309 (Savinase®), szubtilizin PB92, szubtilizin Carlsberg és szubtilizin BPN’. 25

A találmány kiterjeszthetősége a szubtilizinek és messzemenően azonos reakciómechanizmusok közötti strukturális összhangon nyugszik. így elvárható, hogy a megnevezett pontmutációk eredményeként a szövegben előforduló molekulák mindig összevethető ha- 30 tást fejtenek ki. A találmány megállapításai alapján különösen elvárhatók, hogy az ilyen szubtilizinek a technika állása alapján mosó- és tisztítószerekben alkalmazva a tisztítóteljesítményt képesek tovább javítani.

A Bacillus lentus alkalikus proteáz számozásának 35 megfelelően a 61. pozíció a technika mai állása alapján (lásd fent) kicserélhető N, D, Q, Ε, P és S aminosavakra, különösen kombinációban más, a találmányban nem érintett pontmutációkkal. A neutrális, hidroxilcsoportot tartalmazó treoninnal, a bázisos hisztidin, lizin, 40 arginin aminosavakkal, az aromás fenil-alaninnal, tirozinnal, triptofánnal, a kéntartalmú ciszteinnel, metioninnal és az alifás alanin, valin, leucin, izoleucin aminosavakkal végzett helyettesítéseket napjainkig nem írták még le; különösen nem azért, hogy az enzim teljesít- 45 ményét növeljék, és éppen ezért alkalmazásuk különösen előnyös egyes szerek mosó- és tisztítási teljesítményének javítására. Ezt teljesíti ez a szabadalmi bejelentés.

A találmány ennek megfelelően a 61. pozícióban a 50 teljesítmény fokozására cseréket hajt végre, előnyösen alifás aminosavra, nevezetesen a következőkre: alanin, valin, leucin vagy izoleucin, különösen előnyös az alaninra történő kicserélés. Ezek az ismérvek vonatkoznak a példákban megvizsgált következő 55 változatokra: Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I és Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I/L211D. Meglepetésünkre azt találtuk, hogy a 61. pozícióban a glicin cseréje más aminosavra, különösen alifás aminosavra, és főleg 60 alaninra, a mosási teljesítmény javítását eredményezte.

Ahogy a Bacillus lentus-bó\ származó egyes szubtilizinváltozatokat megvizsgáltuk, amelyek a találmány szerinti Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I/L211D változattal a legnagyobb mértékű egyezést mutatják, ugyanúgy a WO 95/23221 A1 számú szabadalmi bejelentésben ismertetett F49 Bacillus lentus alkalikus proteáz változatot is összevetettük az ismertetett kicserélésű S3T/V4I/G61A/V199I/L211D változattal. Az S3T/V4I/G61 A/V199l-hez legközelebb álló változat megfelel a WO 92121760 A1 számú szabadalmi bejelentésből ismert, és a WO 95/23221 A1 számú szabadalmi bejelentésben M131-nek Bacillus lentus alkalikus proteáznak nevezett változattal.

Mindkét kicserélés, az A188P és a V193M, a találmány 61. pozíciójú változatainál is fellép. Ahogy az például a WO 95/30011 A2 számú szabadalmi bejelentésből látható, a Bacillus lentus 193. aminosava a szubtilizin 6. hurokjának kezdetén van, míg a 188. aminosav nincs a hurokban, hanem a fehérje kompaktabb területéhez rendelt. így a két mutáció a molekula strukturálisan különböző területein fordul elő.

A találmány kidolgozása során meglepetésünkre azt találtuk, hogy a 188. és a 193. pozíciók visszaalakítása a vad típusú aminosavakra, és egy további mutáció a 61. pozícióban, szintén az 1. hurokban, olyan enzimet eredményez, a korábban ismert enzimekhez képest, különösen a napjainkig megismert Bacillus lentus alkalikus proteáz változatokhoz viszonyítva, hogy mosó- és előnyösen tisztítóteljesítményét tekintve azokat meghaladja. Ezt különösen jól mutatják a 3., 5. és 7. példák eredményei.

Például a CA 2049097 A1, az EP380362 A1 és a WO 95/30010 A1 számú szabadalmi bejelentések (lásd fenn) éppen a 61. pozíció variációit mutatják be, de csak a savas jellegű aminosavaknál. A bejelentések egy sorozatában szubtilizin-pontmutációkat alakítottak ki [WO 96/28556 A2 és WO 95/30011 A2 számú szabadalmi bejelentések] a 61. pozícióban (a legtöbb szubtilizinben itt természetes körülmények között glicin található) kiegészítve a leírt kicserélésekkel (N, D, Q,

HU 225 362 Β1

Ε, Ρ és S), melyek a molekulát helyileg igen nagy mértékben megváltoztatták, és valószínűleg az első hurok által kifejtett szubsztrátkölcsönhatást befolyásolták. Az EP 398539 B1 számú szabadalmi bejelentés ezzel szemben olyan mutációkat javasolt, melyek tulajdonképpen csak a szóban forgó szubtilizin glicinjének bejuttatását eredményezik erre a helyre, miközben a Bacillus lentus-ból származó szubtilizinnél ez természetes körülmények között megvan. Látva a technika állását, meglepő, hogy éppen ebben a pozícióban történő változtatás, különösen alifás oldalláncú aminosavra, és főleg alaninra, az enzim által kifejtett reakcióra előnyösen hat.

Alkalmazástechnikai szempontból, különösen a mosó- és tisztítószereknél meglepő, hogy ez a mosóés tisztítóteljesítmény javításhoz vezet; előnyösen az ilyen enzimek alkalmazása különböző szennyeződéseknél a mosó- és tisztítóteljesítmény javításához hozzájárul. Ezt a találmány 2. és 7. kivitelezési példájában mutatjuk be.

Ezen megfigyeléseknek megfelelően a további ilyen előnyös változatok a Bacillus lentus-ból származó szubtilizin számozásának megfelelő 61. pozícióban megnevezett kicserélésen túl a 199. pozícióban izoleucinnal rendelkeznek. A Bacillus lentus DSM 5483 törzsből származó szubtilizinekre a kicserélések enzimatikus tulajdonságot befolyásoló hatását a szakirodalomban leírták [WO 92/21760 A1 számú szabadalmi bejelentés].

Továbbá előnyben részesítjük a szubtilizin típusú alkalikus proteázokat, melyek azzal jellemezhetők, hogy a Bacillus lentus-ból származó szubtilizin számozásának megfelelő 119. pozícióban izoleucin, a 211. pozícióban aszparaginsav és a 61. pozícióban a következők közül az egyik aminosav található: alanin, valin, leucin, izoleucin, cisztein, metionin, fenil-alanin, tirozin, triptofán, treonin, hisztidin, lizin vagy arginin, előnyösen alanin, valin, leucin vagy izoleucin, különösen előnyösen alanin. Ideszámítjuk mind a természetes, mind a mutagenezissel nyert molekulákat, a fenti pozíciókban megnevezett aminosavakkal.

A mosó-, és előnyösen a tisztítóteljesítmény szabályozásához a 211. pozíciójú arginin figyelembevételéről a WO 95/23221 A1 számú szabadalmi bejelentés 10. példájában értesülhetünk.

Előnyösen a találmány szerinti alkalikus proteázok azzal jellemezhetők, hogy legalább egy stabilizálással rendelkeznek. Ezzel stabilitása tárolás és/vagy alkalmazása során megnő, előnyösen a megnevezett aminosavak hatására, előnyösen a több kicserélés nagyobb erősödést eredményez.

A találmány szerinti proteázok stabilitása például polimeres kapcsolással megnövelhető. Ilyen eljárást a szakirodalomban leírtak [5.230.891 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom]. Ez megköveteli a fehérje adását a megfelelő szerbe a polimerrel végzett kémiai kapcsolási lépésben.

Előnyösek azok a stabilizálóhatások, melyek magán a molekulán végrehajthatók, mivel ez a fehérjekinyeréshez más feldolgozási lépés csatolását nem igényli. Az ehhez megfelelő pontmutációk a szakirodalomból ismertek, (gy a 6.087.315 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom szerint a proteázok úgy stabilizálhatok, hogy bizonyos tirozinokat más aminosavra cserélünk ki. A találmány szerinti ez úgy történhet, hogy a Bacillus tenfus-fehérje 89., 161., 165., 208. és 257. pozíciójú tirozinjait (2. számú szekvencia alapján) minden megadott helyen kicseréljük, ahol a Bacillus lentus alkalikus proteáz egyébként amúgy is tirozinnal betöltött. A további lehetőségek például a következők:

- Az aminosav kicserélése prolinra [EP 583339 B1 számú szabadalmi bejelentés]; ezt annál az enzimnél lehet végrehajtani, amely a Bacillus lentus-ból nyerhető, ahol a kicserélések a következők: S555P, A96P, A166P, A188P és/vagy S253P.

- A molekulák felszínére polárosabb vagy töltöttebb csoportok bevitele [EP 995801 A1 számú szabadalmi bejelentés].

- A fémionkötődés megváltoztatása, különösen a kalciumkötőhelyeknél, melyet a szakirodalomban leírt módon végezhetünk [WO 88/08028 A1 és WO 88/08033 A1 számú szabadalmi bejelentés]. Az első bejelentés szerint egy vagy több kalciumkötésben részt vevő aminosavat kell kicserélni negatívan töltött aminosavra. Ez elvégezhető a szakirodalomban leírtaknak megfelelően [Goddette és munkatársai: J. Mól. Bioi., 228, 580-595 (1992)], ez a Bacillus lentus-ból nyert szubtilizin kalciumkötőhely két részére vonatkozik: Cal (nagyobb kötőaffinitású), ez a következő helyeket fogja át: 2Q (s), D40 (s, 2x), L73*, N75 (m), 177 (s), V79 (m); és Ca3 (kisebb kötőaffinitást mutat), mely a következő helyekre vonatkozik: A168, A163, Y165, Wasser 273, 317; mindegyik a Bacillus /enfus-szubtilizin-számozás alapján lett megadva.

- A kalciumkötőhely és az ezt követő legalább egy arginin/glicin stabilizálása pontmutáció kialakításával [WO 88/08033 A1 számú szabadalmi bejelentés]; ez például a Bacillus lentus-ból nyerhető szubtiliznek NG-t követő helyeire vonatkozik, így a 60/61, 115/116 és 212/213 helyzetekre.

Az 5.453.372 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom szerint a felszín bizonyos mutációival a denaturálószerek, mint például tenzidek ellen védelmet biztosíthatunk; a fenti bejelentésben megadott helyek a Bacillus lentus alkalikus proteáz következő pozícióinak felelnek meg: 134., 155., 158., 164., 188. és/vagy 189.

A további változtatási lehetőségeket a szakirodalomban leírták [5.340.735, 5.500.364, 5.985.639 és 6.136.553 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom].

Előnyösen az ilyen stabilizálásoknál a találmány szerinti alkalikus proteázok 3. pozíciójú treoninja megfelel a Bacillus lentus-ból izolálható szubtilizinek számozásának. A WO 92/21760 A1 számú szabadalmi bejelentés 3. táblázatából az következik, hogy a molekula ilyen kicserélései a vad típusú enzimnek megfele11

HU 225 362 Β1 lően biztosítja a magasabb hőmérséklettel, valamint a tenzidekkel szembeni stabilizálást. A molekulák N-terminálisa, ahol 3. és 4. pozíciók találhatók, a felszín kialakításában vesz részt, és bár a nyílás vége az aktív centrummal. Ez a laza vég a molekula maradékával, főleg nem kovalens kölcsönhatásokkal tart kapcsolatot, és ez a globuláris felépítés fenntartásához vezet. Anélkül, hogy bármely elmélethez ragaszkodnánk, elfogadható, hogy az össze mutáció, melyek a laza végek flexibilitását csökkentik, a teljes molekula stabilizálásához hozzájárul.

Hasonlóan előnyös a találmány szerinti alkalikus proteázok olyan stabilizálása, melynél a 4. pozíciójú izoleucinnal foglalkozunk, melynek számozása megfelel a Bacillus lentus alkalikus proteáz számozásával. Az ilyen kicserélések stabilizálóhatását a WO 92/21760 A1 számú szabadalmi bejelentés 3. táblázatában megadták.

Különösen előnyösek azok a kicserélések, melyeknél ez treoninra történik a 3. pozícióban, míg izoleucinra a 4. pozícióban, ez stabilizálóhatású, és a tárolási profilt előnyösen módosítja.

így a találmány szerinti szubtilizin a találmány példáiban ismertetett mosó- és előnyösen tisztítószerreceptekben teljesítményfokozást mutatott a szakirodalomban ismert Savinase®-zal szemben, mely ilyen stabilitással nem rendelkezik. Anélkül, hogy bármely elmélethez ragaszkodnánk, gyanítható, hogy a szóban forgó variánsok stabilitása annak köszönhető, hogy az enzim a mosófürdőben elegendő ideig aktív, és ezzel javított teljesítményét alátámasztja.

A molekula teljesítőképességét más módon kivitelezett kicserélés is javíthatja, különösen a mosó- és tisztítószereknél, például a szubsztráttal vagy a szer más alkotórészével kialakuló kölcsönhatáson keresztül. Különösen előnyben részesítjük azokat a megvalósítási formákat, melyekben a találmány szerinti alkalikus proteázok azzal jellemezhetők, hogy a Bacillus lentus-bói származó szubtilizinek szerinti 3. pozícióban treonin, a 4. pozícióban izoleucin, a 61. pozícióban alanin és a 199. pozícióban izoleucin található.

A találmány 3., 5. és 7. példájában az ilyen változatok szerepét a mosó-, előnyösen a tisztítószerek teljesítményében egyes szereknél dokumentáltuk.

Különösen előnyben részesítjük azokat a megvalósítási formákat, melyekben a találmány szerinti alkalikus proteáz azzal jellemezhető, hogy a Bacillus lentus-bó\ származó szubtilizinek szerinti 3. pozícióban treonin, a 4. pozícióban izoleucin, a 61. pozícióban alanin, a 199. pozícióban izleucin található és a 211. pozícióban aszparaginsav található.

A találmány 2., 4. és 6. példájában az ilyen változatok szerepét a mosó-, előnyösen a tisztítószerek teljesítményében egyes szereknél dokumentáltuk.

Az ilyen változások előnyösen elvezetnek a Bacil/us-szubtilizinhez, különösen a Bacillus /enfus-szubtilizinhez.

Ezzel a Sac/7/us-proteázok eleve különböző kedvező technikai alkalmazási lehetőségekhez vezetnek. Idetartozik a magas hőmérséklettel szembeni bizonyos stabilitás, valamint az oxidáló- és denaturálószerekkel szemben kialakuló bizonyos stabilitás. Ezekkel kapcsolatos a mikrobiális proteázok biotechnológiai termelésében megmutatkozó nagy tapasztalat, mely a gazdasejt és a fertmentációs körülmények kiválasztására vagy a kockázatok mérlegelésére vonatkozik, mind például az allergiát kiváltó hatásra.

Különösen a szubtilizin, de elsősorban a Bacillus lentus-ból izolált szubtilizin, mely a természetes módon felépült proteázokból levezethető, a technika jelenlegi állása szerint létrehozható, például a mosó- és tisztítószerekbe történő alkalmazásokhoz. Idetartozik a bevezetőben említett szubtilizin 147, szubtilizin 309 és Bacillus lentus alkalikus proteáz. A tapasztalat, melyet a proteázok előállításában és alkalmazásában megszereztünk, a találmány szerinti további fejlesztések javára van. Idetartozik például ezek kompatibilitása más kémiai vegyületekkel, mint például a mosó- és tisztítószerek alkotórészeivel.

Megfelelő kiindulási törzsként itt a DSM 5483 letéti számú törzset választottuk a német törzsgyűjteményből (Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, http://www.dsmz.de); és például a WO 91/02792 A1, WO 92121760 A1 vagy WO 95/23221 A1 számú szabadalmi bejelentésekben leírt Bacillus lentus törzset. Ezekből vagy ezen törzsek felhasználásával a változatok standard molekuláris biológiai módszerekkel, mint például PCR-rel és közismert pontmutációs eljárásokkal kialakíthatók.

A különösen előnyös és a példákban leírt változatok az 1. példában leírt módon levezethetők Bacillus lentus alkalikus proteázokból, amelyet 68614 ATCC számon letétbe helyeztünk (American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA, http://www.atcc.org). Ezen enzimek nukleotidszekvenciája és aminosavszekvenciája a találmány 1. és 2. szekvenciája.

Ezek a szekvenciák például felhasználhatók primerek kialakításához, a Gram-pozitív baktériumok DNS-készítményeiből, különösen a Gram-pozitív baktériumok, mint például Bacillus lentus, proteázát kódoló nukleinsavai segítségével, adott esetben ismert módon módosíthatók, például a találmány szerinti mutagenezissel, és kifejeztethetők. A genetikai kód degeneráltsága miatt több eltérő nukleinsavra gondolhatunk, melyek ezeket a változatokat kódolhatják, és ennek megfelelően ezeket a találmány szerint előnyben részesített alternatívákat előállíthatjuk.

Idetartozik elsősorban a Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I (a szekvencia száma: 3), és mindenekelőtt a 4. szekvenciánál megadott aminosavszekvencia. Mivel ezek mosóteljesítménye javított, ezért a találmány felhasználási példáiba tartoznak.

Hasonlóan előnyösek a fentiekben említett azon alkalikus proteázok, melyek azzal jellemezhetők, hogy Bacillus lentus DSM 5483-ból, vagy ATCC 68614-ből nyerhető szubtilizinből levezethetők, különösen a Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I/L211D (a szekvencia száma: 6, aminosavszekvencia), melynek nukleotidszekvenciáját az 5. szekvencia adja.

HU 225 362 Β1

Mint ahogy ezekben a kísérletekben, úgy a találmány alkalmazásai példáiban is az erősebb teljesítményjavulást összehasonlító molekulákhoz képest állapítottuk meg. Ezek a fentiekben megadott módon nyerhetők.

Az egyik előnyben részesített megvalósítási formában a fentiekben leírt proteázokból, elsődlegesen fragmentek képzésével vagy deléciós mutagenezissel, inszerciós mutagenezissel, helyettesítési mutagenezissel vagy legalább egyes részeinek fúziójával, legalább egy másik fehérjeváltozatokat állítottunk elő. Az ilyen eljárások a szakirodalomból ismertek.

fgy a megfelelő molekuláris biológiai eljárások például a következő tankönyvben részletesen megtalálhatók [Fritsch, Sambrook és Maniatis: „Molecular cloning: a laboratory manual”, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, (1989)].

Idetartoznak például azok a változatok, melyeknek szubsztitúciós mutagenezissel, vagy további pontmutációkkal további tulajdonságokat kölcsönözhetünk, melyek specifikus alkalmazási lehetőségekre predesztináltak, például a felületi töltés megváltoztatásával [WO 00/36069 A1 számú szabadalmi bejelentés], vagy a szubsztrátkötésben részt vevő hurkok katalitikus hatásának megváltoztatásával [WO 99/27082 A1 számú szabadalmi bejelentés]. A változatok legtöbb része mutagenezisnek vethető alá. így például cél lehet fragmensek kialakítása, vagy deléciós mutánsok létrehozása, a proteázok specifikus részfunkcióinak kiválasztása; vagy ellenkezőleg, például a szubsztrátkötés kizárása, előnyösen a molekula azon régióinak kizárása, melyek más vegyületekkel kölcsönhatásba lépnek.

Inszercióval, szubsztitúcióval vagy fúzióval a találmány szerinti proteázok pótfunkciókkal láthatók el. Idetartozik például bizonyos doménekhez való kapcsolás, esetleg a cellulózkötő doménhez, ahogy azt a szakirodalomban leírták [WO 99/57154 A1-tői WO 99/57157 A1-ig terjedő szabadalmi bejelentések]. Az itt megnevezett aminosavkapcsolók kivitelezhetők, ezeknél a proteáz fúziós fehérje egységei kapcsolóterületet és kapcsolódomént alakítanak ki. Az ilyen kötési domének magából vagy más proteázokból származhatnak, a találmány szerinti fehérje-szubsztrát kötés megerősítése érdekében. Ez a helyi proteázkoncentrációt megnöveli, mely egyes alkalmazásokban, például a nyersanyagok kezelésében előnyös lehet.

A találmány egyik további megvalósítási formája azzal jellemezhető, hogy a találmány szerinti fehérjéből kiegészítésképpen származék képezhető.

Ez a mindenkori alkalmazási cél optimalizálására szolgál. Idetartoznak a kémiai módosítások, ahogy azt például a szakirodalomban leírták [DE 4013142 A1 számú szabadalmi bejelentés]. Például kis és nagy molekulatömegű vegyületekkel kapcsolatok alakíthatók ki, ilyenek a különböző organizmusokban természetes körülmények között a fehérjék bioszintézisével kapcsolatban bekövetkező folyamatok, mint például zsírsavak kapcsolása az N-terminális közelében, vagy az eukarióta gazdasejtekben végbemenő glükozilezés. A találmány megvalósítási formái proteolitikus enzimeket vagy fragmenseket tárnak fel, melyek kiegészítésként származékká alakíthatók.

A találmány szerinti fehérjék mosó- és tisztítószerekben való alkalmazásával kapcsolatban például más mosóaktivitású anyagok vagy enzimek kapcsolása különösen átgondolt lehet. Cellulózkötő domének esetében az összevethető kapcsolótoldalékokat a szakirodalomban leírták [WO 00/18865 A1 és WO 00/57155 A1 számú szabadalmi bejelentések]. Analóg módon mehet végbe makromolekuláris vegyületek, mint például a polietilénglikol kapcsolása, a molekula további tulajdonságainak, mint például stabilitás vagy bőrelviselhetőség módosítására. Az ilyen módosításokat a szakirodalomban leírták [US 230.891 számú szabadalom], ezzel a szóban forgó proteázok kozmetikai alkalmazását lehetővé tették.

A találmány szerinti fehérjék származékainál a legszélesebb értelemben ezen enzimek előállítását is értjük. Ennek megfelelően a fehérjék kinyerése, feldolgozása vagy előállítása igen különböző anyaggal társulhat, ami származhat például a termelőmikroorganizmusok tenyészetéből. Mivel már a termelőmikroorganizmusok tenyésztési körülményei között proteolitikus aktivitás mutatkozik, ezért kimutatható, hogy már a nyerskivonat proteolitikus aktivitású, ami más fehérjeaktivitásokat inaktivál.

A fehérje, például a tárolási stabilitás növelése érdekében, bizonyos más anyagokkal célzottan vegyíthető. Ezért a találmány oltalmi körébe tartoznak valójában a találmány szerinti fehérjék összes készítményei is. Ez független a kérdéses készítmény kifejtett enzimatikus aktivitásától, vagy annak hiányától. Szükség lehet arra, hogy tárolás során az aktivitás kismértékű, vagy ne legyen, és a proteolitikus aktivitás csak az alkalmazás időpontjában fejlődjön ki. Ez például a találmány szerinti fehérje összetekeredési állapotától vagy a készítmény egy vagy több kiegészítő anyagától függhet. Kiváltképp a proteázkészítmény proteázinhibitoros formája ismert a szakirodalomban [WO 00/01826 A2 számú szabadalmi bejelentés]. Idetartoznak a fúziós fehérjék, melyeknél a inhibitorok kapcsolón keresztül, főleg aminosavkapcsolón át, a mindenkori proteázhoz kötöttek [WO 00/01831 A2 számú szabadalmi bejelentés].

Különösen előnyösek lehetnek a találmány szerinti fehérjék megnevezett továbbfejlesztései, származékképzései és előállítási módjai, amennyiben a találmány szerinti alkalmazási lehetőségek további proteolitikus aktivitás kifejtését lehetővé teszik. Előnyösen a mutagenezis és/vagy származékképzés ismert összes módszereivel nyerhető proteázok a kiindulási és főleg a nem derivatizált molekulával szemben megnövelt proteolitikus aktivitással és mindenekelőtt jobb teljesítménnyel rendelkeznek a mindenkori szándékolt alkalmazási területeken. Idetartozik elsősorban a mosási és/vagy tisztítási teljesítmény mosó- és tisztítószerekben.

Ez például a találmány szerinti pontmutációk és további pontmutációk kombinációival lehetségessé válik, melyek a katalizált reakcióra vonatkoznak valahol az aktív központban. Ez például a WO 95/30011 A2 számú

HU 225 362 Β1 szabadalmi bejelentés alapján megvalósítható a szóban forgó találmány szerinti proteázokkal, amikor is a Bacillus /enfus-szubtilizin hurokrégiójában mutációt és további aminosavkiegészítést végeztek. Ilyen munkákat a szakirodalomban közzétettek [WO 00/37599 A1, WO 00137621 A1-től WO 00/37627 A1-ig és WO 00/71683 A1 -tői WO 00/71691 A1-ig],

Az enzim egyes területein végzett deléciók, melyek más hatóanyagokkal a reakcióközegben integrálódnak, és ezzel az összetekeredésre hatnak, a teljes reakciót befolyásolják, további kívánt fejlesztésekkel szem elé tárhatók. A megnövelt hidrolízis eléréséhez ezzel analóg, a más hatású enzimekkel végzett fúziók, itt esetleg más proteázokra is gondolhatunk.

Például a proteolitikus blokád visszafordítása tárolás során, egyes inhibitorok kötésén keresztül, az autoproteolízist megakadályozhatja, és ezzel a reakcióközegben a felhígítás időpontjában a proteolízis sebességének növelésére kihat. Például speciális kötődőmének kapcsolása a tisztítási folyamatban a proteáz koncentrációját a szubsztrát közelében a mosófolyadékkal szemben megnöveli, és ezzel hozzájárul az enzim hatásához, fokozva a szer teljesítményét.

Egy további megvalósítási formában a megnevezett fehérjék vagy származékok azzal jellemezhetők, hogy ezeket pótlólag stabilizálják, vagy a fentiekben vázolt stabilitással rendelkeznek.

A találmány szempontjából a gyakorlatban itt olyan eljárások különösen jól alkalmazhatók, melyek pontmutációk kialakításán alapulnak. Az összes fentiekben bemutatott lehetőség a találmány szerinti változatoknál kombinációban is alkalmazható. A WO 89/09819 A1 számú szabadalmi bejelentés kimutatta több stabilizáló mutáció additív hatását, melyeknél már mind a 3T, mind a 4I, vagy mindkettő stabilizált, polimerrel kapcsolva; vagy más fentiekben leírt módon pótlólag stabilizálható.

A találmány második tárgyköre a nukleinsavakra épít. Idetartoznak azok a mindenkori megfelelő előnyös nukleinsavak, melyek a találmány szerinti fehérjéket vagy származékokat kódolják.

A nukleinsavak majdnem mindegyik jelenleg folyó molekuláris biológiai kutatás és fejlesztés, valamint fehérjetermelés kiindulási pontja. Idetartozik kiváltképp a gének szekvenálása és a hozzájuk tartozó aminosavszekvenciák levezetése, ahogy a mutagenezis és a fehérjék kifejezése is. Az ilyen módszereket a szakirodalomban leírták [Fritsch, Sambrook és Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual”, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, (1989)].

DNS-szinten a találmány szerinti enzimek kialakításához a „fehérjetervezés” általános fogalom alá tartozó módszerek optimalizált eljárásai alkalmazhatók. Különösen azok, melyekkel fehérjeszinten realizálódó tulajdonságokat érhetünk el, mint például a kialakított fehérje oxidációval szembeni ellenálló képessége, stabilitás denaturáló antigének vagy proteázok ellen, magas hőmérséklet, savak vagy erősen lúgos vegyületek elviselése, kalciummal vagy más kofaktorral szembeni változtatások, az immunogenitás vagy az allergiás hatás mérséklése.

A találmány szerinti mutált génekhez például azok tartoznak, melyek egyetlen megcélzott báziskicserélődéssel vagy randomizált pontmutációkkal, az egyes bázisok vagy részszekvenciák deléciójáért, más génekkel vagy génfragmensekkel megvalósuló fúziókért vagy inverziókért felelősek. Az ilyen mutációk vagy módosítások a szóban forgó nukleinsavakból levezetett enzimet a specifikus alkalmazásokra predesztinálják. Az ilyen mutagenezist célirányos vagy véletlenszerű módszerekkel végezhetjük, például a klónozott géneken az aktivitásra irányuló felismeréssel és/vagy kiválasztással (szűrés és szelekció).

Különösen a fehérjefragmenst kódoló nukleinsavaknál mindhárom leolvasási keretet mind értelmes, mind antiszensz irányban figyelembe kell venni. Az ilyen oligonukleotidok polimeráz-láncreakcióval (PCR) kiindulási pontként a nukleinsavak szintézisére fordíthatók. A találmány oltalmi körébe tartoznak különösen azok az oligonukleotidok, melyek a következő aminosavpozíciókat tartalmazó területekre vonatkoznak: 3., 4., 61., 199. és/vagy 211. Ez azokra is érvényes, melyek a variábilis szekvenciapozíciókban vannak, így a primer populációban legalább egy olyan előfordulhat, mely a 3. és/vagy 5. szekvencia részszekvenciáját kódolja. Ez az antiszensz oligonukleotidokra is érvényes, melyek például a kifejezés szabályozásában szerepet játszhatnak.

A találmány szerinti proteázok továbbfejlesztése a szakirodalomban leírtaknak megfelelően elvégezhető [Bryan: „Protein engineering” Biochim. Biophys. Acta, 1543, 203-222 (2000)].

Előnyös ez a találmány szubtilizinproteázokat kódoló nukleinsavainak képviselőire, melyek nukleotidszekvenciája összhangban van a 3. vagy a 5. szekvenciával. Ez az összhang különösen azokra a területekre érvényes, melyek a 4. vagy a 6. aminosavszekvenciának megfelelnek, ahol a 119. pozícióban izoleucin, a 211. pozícióban aszparaginsav, a 3. pozícióban treonin és/vagy a 4. pozícióban izoleucin található, és különösen azokra, melyek a 61. pozíciónak megfelelő alanint kódolják, vagy ezeket a területeket magukban foglalják.

Ahogy a fentiekben és a példákban szemléltettük, e pozíciók ismerete különösen a találmány szerinti alkalikus proteázoknál előnyös. A fenti ismeretek kiterjesztése más szubtilizinekre megtörténhet más molekulákon megfelelő módon végrehajtott mutatációkkal egy vagy több említett pozícióban. Ez célirányosan nukleinsavszinten ismert eljárásokkal (lásd fenn) történhet.

Ez érvényes azokra a nukleinsavakra, melyekből a Bacillus fenfus-proteáz egyik szekvenciája levezethető, és különösen azokra, melyek a Bacillus lentus DSM 5483 proteázra vonatkoznak. A különösen előnyben részesített esetben ez a találmány szerinti Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I vagy Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I/L211D; és/vagy ez érvényes a 3. vagy az 5. szekvenciával megegyezőre. Ez az összhang magára a változatok ismertetett területeire és különösen az egész szekvenciára vonatkozik.

HU 225 362 Β1

Az oltalmi körbe például olyan nukleinsavakat vettünk be, melyek proteolitikusan aktív inszerziós vagy fúziós mutációkat kódolnak. így ezért az aktivitásért felelős terület például a cellulózkötő doménnel fuzionálva lehet, vagy a katalitikusán nem aktív területen pontmutációkat hordozhat, a levezetett fehérjék polimerrel történő kapcsolásának lehetővé tételéhez vagy az allergén hatás csökkentésére.

A találmány egyik tárgya vektorok kialakítása. Idetartoznak azok a vektorok, melyek az előzőekben említett nukleinsavterületeket tartalmazzák, és különösen olyan nukleinsavterületeket fognak át, melyek a megnevezett fehérjét vagy származékot kódolják.

A találmánynak megfelelő nukleinsavakat szállításukhoz megfelelő módon vektorokba ligáljuk. Ezeket a szakirodalomban korábban kimerítően leírták, és mind klónozáshoz, mind kifejezéshez a kereskedelemben nagy számban és sok változatban beszerezhetők. Idetartoznak például a vektorok, mint például a bakteriális plazmidok, a vírusokból vagy bakteriofágokból levezetett vektorok, vagy a túlnyomó részben szintetikus vektorok. Ezek a molekuláris biológiai és biokémiai kutatásoknak megfelelő kiindulópontját jelentik, és a szóban forgó gént vagy a hozzá tartozó fehérjét kifejezik.

Előnyösen a találmány szerinti vektorok klónozóvektorok, melyek az előzőekben említett nukleinsavterületeket tartalmazzák, és különösen olyan nukleinsavterületeket fognak át, melyek az előzőekben megnevezett fehérjét vagy származékot kódolják.

A klónozóvektorok a tárolás mellett, a biológiai sokszorozási, vagy a kérdéses gének szelekcióját biztosítják, a szóban forgó gének molekuláris biológiai jellemzését elősegítve. Egyidejűleg a szóban forgó nukleinsavak transzportálható és tárolható formáit adják, és kiindulópontot jelentenek azokhoz a molekuláris biológiai technikákhoz, melyek nem köthetők sejtekhez, mint például a PCR vagy az in vitro mutageneziseljárások.

Hasonlóan előnyös a találmány szerinti olyan expressziós vektorok alkalmazása, melyek az előzőekben említett nukleinsavterületeket tartalmazzák, és különösen olyan nukleinsavterületeket fognak át, melyek az előzőekben megnevezett fehérjét vagy származékot kódolják, és ezek bioszintézisét lehetővé teszik.

Az ilyen expressziós vektorok alapja a megfelelő nukleinsavak biológiai termelőrendszerben történő realizálása, és ezzel a hozzá tartozó fehérje termelése. Az előnyben részesített megvalósítási formákban ezek olyan expressziós vektorok, melyek a kifejezéshez szükséges valamennyi genetikai elemet magukon hordozzák, például a természetes, eredeti helyen lévő promotert, vagy olyan promotert, mely más szervezetből származik. Ezek az elemek például úgynevezett expressziós kazettába rendezhetők. Különösen előnyben részesíthetjük azokat az expressziós rendszereket, melyek az adott gazdasejthez különösen jól illeszkednek (lásd lejjebb).

A találmány tárgyát olyan sejtek képezik, melyek a találmány szerinti fehérjék vagy származékok fejlesztéséhez, módosításához vagy előállításához felhasználhatók. Idetartoznak különösen azok a sejtek, melyek egy, a fentiekben megnevezett vektort vagy annak ismertetett területeit tartalmazzák, melyek lehetnek plazmidok, de kromoszomális lokalizációjuk is elképzelhető.

Ezek lehetővé teszik a szóban forgó gén sokszorozását, de ezek mutagenezisét, átírását és transzlációját és végül is biotechnológiai előállítását is.

Azokat a gazdasejteket tartjuk előnyösnek, melyek az előzőekben megnevezett fehérjét vagy származékot kifejezik, vagy ezek kifejezését képesek végrehajtani, különösen miután az előzőekben említett nukleinsavterületet beépítették a megnevezett expressziós vektorokba.

A fehérjéket képző gazdasejtek ezek biotechnológiai előállítását lehetővé teszik. Ehhez a szóban forgó gént a vektorba megfelelő módon el kell helyezni, és a vektor segítségével a gazdasejtbe kell transzformálni. Ez a vektor vagy ennek ismertetett területei a gazdasejtben extrakromoszomális elemként fordulhat elő, vagy a kromoszómába integrálódhat.

Gazdasejtként alapjában véve az összes prokarióta, eukarióta vagy Cyanophyfa-organizmus megfelel. Előnyben részesítjük azokat a gazdasejteket, melyek genetikailag jól kezelhetők, például expressziós vektorral végzett transzformálásuk után stabilan fennmaradnak, ilyenek például az egysejtes gombák vagy baktériumok. Idetartoznak előnyösen azok a gazdasejtek, melyek jó mikrobiológiai és biotechnológiai kezelhetőséget mutatnak. Ez például vonatkozhat könnyű tenyészthetőségükre, jó szaporodóképességükre, táptalajjal szembeni igénytelenségükre és az idegen fehérje jó termelésére és kibocsátására. Ennek megfelelően a találmány szerinti fehérjék számos gazdaszervezettel megkaphatok. A különböző technikáknak megfelelően gyakran szükséges olyan rendszerek biztosítása, melyek egyedi kísérletekhez optimális kifejezési rendszert jelentenek.

Az előnyben részesített megvalósítási formákban olyan gazdasejteket mutatunk be, melyek a megfelelő genetikai elemekkel szabályozhatók, például kémiai vegyületek szabályozott adagolásával, a tenyésztési körülmények megváltoztatásával vagy a mindenkori sejtsűrűségtől függően. Ezek a szabályozható kifejezések lehetővé teszik a kérdéses fehérjék nagyon gazdaságos termelését. Az expressziós vektorok és a gazdasejtek megfelelő módon összhangban vannak, például a kifejezéshez szükséges genetikai elemeket (riboszómakötő hely, promoterek, terminátorrégiók) vagy a kodonhasználatot tekintve. Az utóbbi például úgy optimalizálható, hogy a gén minden kodonját, melyek a szóban forgó gazdában csak nehezen transzlálódnak, olyanra cseréljük ki, mely a gazdában a leghatékonyabb.

Az egyik előnyben részesített megvalósítási formában a gazdasejtre jellemző, hogy baktérium, különösen olyan, amely a fehérje kialakítására és környezetbe történő kibocsátására képes.

A baktériumok generációs ideje rövid, és a tenyésztési körülményekkel szembeni igényük kicsi. így olcsó eljárások alakíthatók ki. Ehhez olyan baktériumokkal rendelkezünk, melyek fermentációs tapasztalata gazdag. A speciális termeléshez többféle Gram-negatív

HU 225 362 Β1 vagy Gram-pozitív szervezet megfelel, melyeknél a tápanyagforrásokat, termelési paramétereket, termelési időigényt kísérletileg kiderítették.

A Gram-negatív baktériumok, mint például Escherichia coli, számos fehérjét a periplazmatikus térbe juttatnak. Ez speciális alkalmazásoknál előnyös lehet. A Gram-pozitív baktériumok, mint például a bacillusok, ezzel szemben a fehérjéket a környező táptalajba juttatják, melyből másik előnyben részesített megvalósítási formák alapján a találmány szerinti fehérjék tisztíthatók. A WO 01/81597 számú szabadalmi bejelentésben olyan eljárást tettek közzé, mellyel elérték, hogy a kifejezett fehérjék a Gram-negatív baktériumokból is kijussanak.

Az előnyös baktériumok Gram-pozitív típusúak, elsődlegesen a Bacillus nemzetségbe tartoznak, főleg a következő fajok: Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis vagy Bacillus alcalophilus.

A találmány egyik megvalósítási formája a Bacillus lentus-t használja, különösen a Bacillus lentus DSM 5483 törzset, a találmány szerinti fehérjék (homológ) kifejezéséhez. Mégis előnyben részesítjük a heterológ expressziót. Előnyösen idetartoznak a Bacillus nemzetség baktériumai, melyek a legjobban jellemzett Gram-pozitív baktériumok. Idetartoznak elsődlegesen a következő fajok: Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis vagy más fajok és a törzsek, valamint a Bacillus alcalophilus törzsei. Ezek a Bacillus lentus-szai együtt hasonló kodonhasználattal rendelkeznek és maguk is más szubtilizinekkel egybevethető szubtilizineket szintetizálnak, tehát természetes módon hasonló, megfelelően szabályozott szintézissel rendelkeznek.

Egy további előnyük, hogy a találmány szerint így előállított fehérjék keveréke endogén gazdatörzs által készített szubtilizineket tartalmazhat. A Bacillus lentus alkalikus proteázok ilyen egyszerre történő kifejezését Bacillus licheniformis-ban (ATCC 53926) a WO 91/02792 (EP 493398 B1) számú szabadalmi bejelentésben leírták; ahol több lehetséges expressziós vektort is közzétettek. Ezek a rendszerek a találmányban bemutatott új változatokhoz is alkalmazhatók.

A további előnyben részesített gazdasejtek azzal jellemezhetők, hogy ezek eukarióták, különösen azok, melyek a készülő fehérjét transzláció után képesek módosítani.

A megfelelő eukarióták a gombák, mint például a Actinomyceták vagy élesztők, mint például a Saccharomyces vagy a Kluyveromyces. Az ilyen rendszerek módosításaihoz, különösen a fehérjeszintézissel kapcsolatban, például a kis molekulatömegű vegyületek kapcsolódása tartozik, mint például membrán horgonyzó részek, vagy oligoszacharidok. Az ilyen oligoszacharidmódosítások például az allergiás hatás csökkentésében előnyösek lehetnek.

A találmány egyik tárgya a találmány szerinti proteolitikus enzimek vagy származékok előállítási eljárása. A fentiekben leírt proteolitikus enzimek vagy származékok előállításához azokra az eljárásokra is igényt tartunk, melyek a fentiekben megnevezett nukleinsavakat és/vagy a fentiekben megnevezett vektorokat alkalmazza, valamint a megnevezett gazdasejteket.

így például a fentiekben megnevezett DNS- és aminosavszekvenciák alapján, melyek például a szekvenciákból levezethetők, a megfelelő oligopeptidek és oligonukleotidok egészen a teljes génekig és fehérjékig ismert molekuláris biológiai módszerekkel szintetizálhatok. Az ismert szubtilizint termelő mikroorganizmusokon kívül további természetes szubtilizintermelők is izolálhatok, melyek szubtilizinszekvenciáját megállapították, és ennek megfelelően az itt megadottak szerint továbbfejlesztették. Az ilyen baktériumfajok a megfelelő előállítási eljárásokkal tenyészthetők is. Analóg módon például a WO 91/02792 számú szabadalmi bejelentésben példáiban közzétett vektorokból új expressziós vektorok fejleszthetők. A találmány megvalósítási formái a hozzájuk tartozó nukleinsavszekvenciák alapján sejtmentes kifejezési rendszerekben is alkalmazhatók, melyben a fehérjék szintézise in vitro történik. Az összes fentiekben megadott elem új eljárásokban kombinálható a találmány szerinti fehérjék előállításához. Ezért a találmány szerinti minden egyes fehérje sok kombinációs lehetősége elgondolható, biztosítva az optimális eljárás minden konkrét esetben kísérletek végzésével.

A találmány tárgyköréhez megfelelő szerhez a találmány szerinti fentiekben leírt proteolitikus enzimet mutatunk be. Különösen mosó- és tisztítószerekhez, melynek mennyisége a szerben 2 gg-tól 20 mg-ig terjed.

Gyakorlatilag a találmány szerinti enzim összes technikai alkalmazási lehetősége attól függ, hogy a funkcióképes enzimet megfelelő közegbe helyezzük. így például követelmény a mikrobiológiai alkalmazhatóság olyan szerben, melyben az enzim, főleg nagy tisztaságú formában, a szükséges reakciópartnerekkel vagy kofaktorokkal együtt található. A nyersanyagok vagy a kozmetikai készítményekhez a szer ugyancsak specifikus recepttel jellemezhető. A találmány szerint az összes ilyen receptben a találmány szerinti enzimet kell érteni.

Ezen tárgykör a mosó- vagy tisztítószer előnyben részesített megvalósítási formájának számít. így, ahogy azt a találmány megvalósítási formáiban megmutattuk, meglepetésünkre megállapítható, hogy a 61. pozíciójában a következő aminosavakra kicserélt szubtilizinváltozat (ahol a számozás a Bacillus lentus alkalikus proteáz alapján történt): alanin, valin, leucin, izoleucin, cisztein, metionin, fenil-alanin, tirozin, triptofán, treonin, hisztidin, lizin vagy arginin, különösen alanin, valin, leucin vagy izoleucin, még előnyösebben alanin, mind a textíliák, mind a szilárd felszínek különböző szennyeződéseinek eltávolítására nyilvánvalóan nagyobb teljesítményt biztosít, mint amit a nem mutált molekulával kapunk. Ez a hatás reprodukálhatóan fellép különféle hőmérsékleteken, valamint különböző koncentrációkban.

A fentiekben leírt változatokat tartalmazó szert különösen előnyben részesítjük. Ide előnyösen a következő Bacillus lentus alkalikus proteáz változatok tartoznak: S3T/V4I/G61A/V199I és S3TA/4I/G61AA/199I/L211D, valamint az ezekből levezethető molekulák.

HU 225 362 Β1

A találmány tárgykörében az összes elképzelhető tisztítószerfajtára gondolunk, mind koncentráltakra, mind hígítatlanul alkalmazott szerekre: ipari méretekben, mosógépbe vagy kézi, illetve tisztítómosáshoz adagolva. Idetartoznak például a textíliákhoz, szőnyegekhez vagy természetes rostokhoz adott találmány szerinti mosószerek. Idetartoznak például a mosogatógépek mosogatószerei, vagy a manuális mosogatószerek, vagy a kemény felületek, mint például fém, üveg, porcelán, kerámia, csempe, vas, lakkozott felületek, műanyagok, fa vagy bőr mosószerei, amennyiben a találmány szerinti tisztítószert alkalmazzák.

Mindegyik tisztítószertípus a találmány megvalósítási formáját jelenti, amennyiben a találmány szerinti fehérjék gazdagítják. A találmány megvalósítási formái felölelik az összes napjainkban ismert technikát és/vagy az összes a találmány szerint nyújtott formát. Idetartoznak például a szilárd, por, folyékony vagy pasztaszerű szerek, adott esetben akár több fázisban préseltek vagy nem préseltek, valamint idetartoznak az extrudátumok, szemcsék, tabletták, valamint ostyák, akár nagy csomagokban, akár adagokban csomagolták.

A találmány szerinti szer 1 grammjára nézve a találmány szerinti enzimből 2 pg-20 mg-ot tartalmaz, előnyösen ez 5 pg-17,5 mg, 20 pg-15 mg, 50 pg-10 mg, 100 pg-7,5 mg, 200 pg-5 mg és 500 pg 1 mg. így alkalmanként ez 40 pg-4 g, és előnyösebben 50 pg-3 g, 100 pg-2 g, 200 mg-1 g és különösen előnyösen 400 pg-400 mg.

Az ilyen szer proteázaktivitását a szakirodalomban leírtaknak megfelelően meghatározhatjuk [Tenside, 7, 125-132 (1970)]. Ezt ennek megfelelően PE-ben (proteázegységben) adjuk meg. A szer proteázaktivitása grammonként 1 500 000 proteázegység.

A találmány szerinti enzim mellett a találmány szerinti szer adott esetben tenzideket, mint például nemionos, anionos és/vagy amfoter tenzideket, és/vagy fehérítőanyagot, és/vagy kötőanyagot és adott esetben további szokásos alkotórészt tartalmaz.

A nemionos tenzidek előnyösen az alkoxilezett, előnyösen etoxilezett, különösen a 8-18 szénatomos primer alkoholok és átlagban 1-12 mól etilén-oxid (EO) per mól alkohol felhasználásával készülnek, melyekben az alkoholcsoport lineáris vagy előnyösen a 2. pozícióban metilesen elágazó lehet, illetve a lineáris és a metilesen elágazó csoportúak keverékét tartalmazhatja, így szokásosan az oxo-alkohol-csoportokban találhatók. Mégis különösen előnyösek az alkohol-etoxilátok, melyek természetes eredetű 12-18 szénatomos lineáris alkoholokat tartalmaznak, mint például kókusz-, pálma, faggyúzsír vagy oleil-alkoholt, és átlagban 2-8 mól alkoholból állnak. Az előnyben részesített etoxilezett alkoholok közé tartoznak például a C₁₂_₁₄-alkoholok 3 EO-val vagy 4 EO-val, a Cg.^-alkoholok 7 EO-val, a C₁₃_₁₅-alkoholok 3 EO-val, 5 EO-val, 7 EO-val vagy 8 EO-val, a C₁₂_₁₈-alkoholok 3 EO-val, 5 EO-val vagy 7 EO-val és ezek keverékei, mint például a C₁₂_₁₄-alkoholok 3 EO-val és a C₁₂_₁₈-alkoholok 5 EO-val alkotott keverékei. A megadott etoxilezési fokok statisztikai középértékeket jelentenek, amely a speciális termékeknél egy egész vagy egy törtszám lehet. Előnyösen az alkohol-etoxilát egy bizonyos homológmegoszlást mutat (szűk tartományú etoxilátok, NRE). Ezeken a nemionos tenzideken kívül a zsíralkoholok több mint 12 EO-val is alkalmazhatók. Ezekre példák a faggyúzsíralkoholok 14 EO-val, 25 EO-val, 30 EO-val vagy 40 EO-val.

A nemionos tenzidek egy további előnyben részesített osztálya, melyek vagy csak a magukban lévő nemionos tenzidek, vagy más nemionos tenzidekkel kombinációban adagolhatok, a következők: alkoxilezett, előnyösen etoxilezett vagy etoxilezett és propoxilezett zsírsav-alkil-észterek, előnyösen az alkilláncban 1-4 szénatommal, ilyenek elsősorban a zsírsav-metil-észterek.

A nemionos tenzidek egy további osztálya, melyek előnyösen adagolhatok, az alkil-poliglikozidok (APG). Az alkalmazható alkil-poliglikozidok általános képlete: RO(G)x, ahol R jelentése primer egyenes láncú vagy metilesen elágazó, különösen a 2. pozícióban metilesen elágazó 8-22 szénatomos, előnyösen 12-18 szénatomos alifás csoport, és G jelentése 5-6 szénatomos glükozidegység, előnyösen glükóz. Az oligomerizáció foka, mely a monoglükozidok és oligoglükozidok megoszlását adja, 1-4,0 között elfogadható, előnyösen 1,0 és 2,0 között és legelőnyösebben 1,1-1,4 között van.

Az előnyben részesített alkil-poliglikozidok lineárisak, tehát olyan alkil-poliglikozid, melyben a poliglikozilmaradék egy glukózán és az alkilcsoport az n-alkil-csoporton van.

Az amin-oxid típusú nemionos tenzidek például az N-kókuszalkil-N,N-dimetil-amin-oxid és az N-faggyúalkil-N,N-dihidroxi-etil-amin-oxid, valamint a zsírsav-alkanol-amidok is megfelelnek. Az ilyen nemionos tenzidek mennyisége előnyösen nem több mint az etoxilezett zsíralkoholokké, adott esetben nem több mint ezek fele.

A további megfelelő tenzidek a (II) általános képletű polihidroxi-zsírsav-amidok:

R¹

I (ll)

R-CO-N-[Z] ahol az RCO jelentéses 6-22 szénatomos alifás acilcsoport, R¹ jelentése hidrogén, 1-4 szénatomos akiivagy hidroxil-alkil-csoport és [Z] jelentése egyenes vagy elágazó 3-10 szénantomos polihidroxi-alkil-csoport és 3-10 hidroxilcsoportból áll. A polihidroxi-zsírsav-amidok esetében ismert anyagokról van szó, amelyek általában egyes redukálócukrok ammóniával, alkil-aminnal vagy alkanol-aminnal reduktív aminálásával, és ezt követően zsírsav-alkil-észterrel vagy zsírsav-kloriddal végzett acilezéssel megkaphatok.

A polihidroxi-zsírsav-amidok csoportjához a (III) általános képletű vegyületek tartoznak:

| (Hl)

R-CO-N-[Z]

HU 225 362 Β1 ahol R jelentése egyenes vagy elágazó 7-12 szénatomos alkil- vagy alkenilcsoport, R¹ jelentése egyenes vagy elágazó vagy ciklikus 2-8 szénatomos akilcsoport vagy arilcsoport és R² jelentése egyenes vagy elágazó

2. Az 1. igénypont szerinti alkalikus proteáz, azzal jellemezve, hogy a Bacillus lentus-bói nyert szubtilizinek számozása szerint a 199. pozícióban izoleucin található.

2. ábra: A mutagenizált pUC18M131 vektor

Az 1. számú szekvencián bemutatott BamHI-SacI fragmens átfogja az 1-1771. pozíciókat; a vektor többi része a kiindulási plazmid pUC18-cal azonos (Fa. Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg). A további egyedi hasítási helyek felét az áttekinthetőség végett nem tüntettük fel.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a leírásban említett szekvenciákat, valamint számítógéppel olvasható formában is mellékeljük.

SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE <110> Henkel Kommaditgesellschaft auf Aktién PCT/EPO₂/11725 <120> Új alkalikus proteáz változatok és az ezeket tartalmazó mosó- és tisztítószerek <130>H4726 <140>

<191>

<150> DE 10153792.1-41 <151> 2001-10-31 <160>6

HU 225 362 Β1 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1773 <212> DNS <213> Bacillus licheniformis ATCC 68 614 <220 <221 > CDS <222> (233)...(1375) <220 <221> mat_peptid <222> (566)...(1375) <400 1 ggatcctcgg gacctctttc cctgccaggc tgaagcggtc tattcatact ttcgaactga 60 acatttttct aaaacagtta ttaataacca aaaaatttta aattggtcct ccaaaaaaat 120 aggcctacca tataattcat tttttttcta taataaatta acagaataat tggaatagat 180 tatattatcc ttctatttaa attattctga ataaagagga ggagagtgag ta atg atg 238

Met Met -110

agg Arg aaa Lys aag Lys agt ttt Ser Phe -105 tgg Trp ctt Leu ggg Gly atg ctg Met Leu -100 acg Thr gcc Alá ttc Phe atg Met ctc Leu -95 gtg Val 286 ttc acg atg gca tcg atc gca tcg get get gag gaa gca aaa gaa aaa 334 Phe Thr Met Alá Ser Ile Alá Ser Alá Alá Glu Glu Alá Lys Glu Lys -90 -85 -80 tat tta att ggc ttt aat gag cag gaa get gtc agt gag ttt gta gaa 382 Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gin Glu Alá Val Ser Glu Phe Val Glu -75 -70 -65 caa gta gag gca aat gac gag gtc gcc att ctc tct gag gaa gag gaa 430 Gin Val Glu Alá Asn Asp Glu Val Alá Ile Leu Ser Glu Glu Glu Glu -60 -55 -50 gtc gaa att gaa ctg ctt cat gag ttt gaa acg att cet gtt tta tcc 478 Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val Leu Ser -45 -40 -35 -30 gtt gag tta agc cca gaa gat gtg gac gcg ctt gaa ctt gat cca gcg 526 Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Alá Leu Glu Leu Asp Pro Alá -25 -20 -15 att tct tat att gaa gag gat gca gaa gta acg aca atg gcg caa aca 574 Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Alá Glu Val Thr Thr Met Alá Gin Thr -10 -5 -1 1 atc cca tgg gga att agc cgt gtg caa gcc ccg get gcc cat aac cgt 622 Ile Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gin Alá Pro Alá Alá His Asn Arg 5 10 15 gga ttg aca ggt tct ggt gta aaa gtt get gtc ctc gat aca ggt att 670 Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Alá Val Leu Asp Thr Gly Ile 20 25 30 35 tcc act cat cca gac tta aat att cgt ggt ggc get agc ttt gta cca 718 Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Alá Ser Phe Val Pro 40 45 50

HU 225 362 Β1

766

ggg Gly gaa Glu cca Pro tcc Ser 55 act Thr caa Gin gat Asp ggg Gly aat Asn 60 ggg Gly cat His ggc Gly acg Thr cat His 65 gtg Val gcc Alá ggg acg att get get tta aac aat tcg att ggc gtt ctt ggc gta gcg Gly Thr Ile Alá Alá Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Alá 70 75 80 cet agt gcg gaa cta tac get gtt aaa gtt tta gga gcc gac ggt aga Pro Ser Alá Glu Leu Tyr Alá Val Lys Val Leu Gly Alá Asp Gly Arg 85 90 95 ggt gca atc agc tcg att gcc caa ggg ttg gaa tgg gca ggg aac aat Gly Alá Ile Ser Ser Ile Alá Gin Gly Leu Glu Trp Alá Gly Asn Asn 100 105 110 115 ggc atg cac gtt get aat ttg agt tta gga agc cet tcg cca agt gcc Gly Met His Val Alá Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro Ser Alá 120 125 130 aca ctt gag caa get gtt aat agc gcg act tct aga ggc gtt ctt gtt Thr Leu Glu Gin Alá Val Asn Ser Alá Thr Ser Arg Gly Val Leu Val 135 140 145 gta gcg gca tct ggg aat tea ggt gca agc tea atc agc tat ccg gcc Val Alá Alá Ser Gly Asn Ser Gly Alá Ser Ser Ile Ser Tyr Pro Alá 150 155 160 cgt tat gcg aac gca atg gca gtc gga get act gac caa aac aac aac Arg Tyr Alá Asn Alá Met Alá Val Gly Alá Thr Asp Gin Asn Asn Asn 165 170 175 ege gcc agc ttt tea cag tat ggc cca ggg ctt gac att atg gca cca Arg Alá Ser Phe Ser Gin Tyr Gly Pro Gly Leu Asp Ile Met Alá Pro 180 185 190 195 ggg gta aac att cag agc aca tac cca ggt tea acg tat gcc agc tta Gly Val Asn Ile Gin Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Alá Ser Leu 200 205 210 aac ggt aca tcg atg get act cet cat gtt gca ggt gca gca gcc ctt Asn Gly Thr Ser Met Alá Thr Pro His Val Alá Gly Alá Alá Alá Leu 215 220 225 gtt aaa caa aag aac cca tct tgg tcc aat gta caa atc ege aac cat Val Lys Gin Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gin Ile Arg Asn His 230 235 240 cta aag aat acg gca acg agc tta gga agc acg aac ttg tat gga agc Leu Lys Asn Thr Alá Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr Gly Ser 295 250 255 gga ctt gtc aat gca gaa gcg gca aca ege taa tcaataaaaa aaccgtgtgc Gly Leu Val Asn Alá Glu Alá Alá Thr Arg 260 265 270

814

862

910

958

1006

1054

1102

1150

1198

1246

1294

1342

1395 gcttaaaggg caaaaatcga caatggaaaa tttcgtactc cacagctttt gcgtaaaggg ttcacgtctt tccgtttttc tttgtgtatg ttgtttaaag ttgactttca tggtacctcc aatcgaaaaa ctctttacgc tggcatattt ttctactatg agagaacaga tcgcaggtct atttaagtat ggaaaggtct

1455

1515

1575

1635 tcgcaggtct tatcgctata tcgtttgctt gatcaatgtc

HU 225 362 Β1 gaagctgccg ctcaataaca tattctaaca aatagcatat agaaaaagct agtgttttta gcactagctt tttcttcatt ctgatgaagg ttgttcaata ttttgaatcc gttccatgat cgtcgggtac cgagctct <210 2 <211 >380 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis ATCC 68 614

1695

1755

<400> 2 Met 1 Met Arg Lys Lys 5 Ser Phe Trp Leu Gly 10 Met Leu Thr Alá Phe 15 Met Leu Val Phe Thr 20 Met Alá Ser lle Alá 25 Ser Alá Alá Glu Glu 30 Alá Lys Glu Lys Tyr Leu 35 lle Gly Phe Asn 40 Glu Gin Glu Alá Val 45 Ser Glu Phe Val Glu Gin Val 50 Glu Alá Asn 55 Asp Glu Val Alá lle 60 Leu Ser Glu Glu Glu 65 Glu Val Glu lle Glu 70 Leu Leu His Glu Phe 75 Glu Thr He Pro Val 80 Leu Ser Val Glu Leu 85 Ser Pro Glu Asp Val 90 Asp Alá Leu Glu Leu 95 Asp Pro Alá lle Ser 100 Tyr He Glu Glu Asp 105 Alá Glu Val Thr Thr 110 Met Alá Gin Thr lle Pro 115 Trp Gly lle Ser 120 Arg Val Gin Alá Pro 125 Alá Alá His Asn Arg Gly Leu 130 Thr Gly Ser 135 Gly Val Lys Val Alá 140 Val Leu Asp Thr Gly 145 lle Ser Thr His Pro 150 Asp Leu Asn He Arg 155 Gly Gly Alá Ser Phe 160 Val Pro Gly Glu Pro 165 Ser Thr Gin Asp Gly 170 Asn Gly His Gly Thr 175 His Val Alá Gly Thr 180 He Alá Alá Leu Asn 185 Asn Ser lle Gly Val 190 Leu Gly Val Alá Pro Ser 195 Alá Glu Leu Tyr 200 Alá Val Lys Val Leu 205 Gly Alá Asp Gly Arg Gly Alá 210 lle Ser Ser 215 lle Alá Gin Gly Leu 220 Glu Trp Alá Gly Asn 225 Asn Gly Met His Val 230 Alá Asn Leu Ser Leu 235 Gly Ser Pro Ser Pro 240 Ser Alá Thr Leu Glu 245 Gin Alá Val Asn Ser 250 Alá Thr Ser Arg Gly 255 Val Leu Val Val Alá 260 Alá Ser Gly Asn Ser 265 Gly Alá Ser Ser He 270 Ser Tyr

HU 225 362 Β1

Pro Alá Arg Tyr Alá Asn Alá Met Alá 280 Val Gly Alá Thr 285 Asp Gin Asn 275 Asn Asn Arg Alá Ser Phe Ser Gin Tyr Gly Pro Gly Leu Asp Ile Met 290 295 300 Alá Pro Gly Val Asn Ile Gin Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Alá 305 310 315 320 Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Alá Thr Pro His Val Alá Gly Alá Alá 325 330 335 Alá Leu Val Lys Gin Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gin Ile Arg 340 345 350 Asn His Leu Lys Asn Thr Alá Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr 355 360 365 Gly Ser Gly Leu Val Asn Alá Glu Alá Alá Thr Arg

370 375 380 <210>3 <211> 1143 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>

<223> Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I <220>

<221 > CDS <222> (1)...(1143) <220>

<221 > roat_peptid <222> (334)...(1143) <400> 3

atg atg Met Met -110 agg Arg aaa Lys aag Lys agt ttt Ser Phe -105 tgg Trp ctt Leu ggg Gly atg ctg Met Leu -100 acg Thr gcc Alá ttc Phe atg Met ctc gtg ttc acg atg gca tcg atc gca tcg get get gag gaa gca aaa Leu Val Phe Thr Met Alá Ser Ile Alá Ser Alá Alá Glu Glu Alá Lys -95 -90 -85 -80 gaa aaa tat tta att ggc ttt aat gag cag gaa get gtc agt gag ttt Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gin Glu Alá Val Ser Glu Phe -75 -70 -65 gta gaa caa gta gag gca aat gac gag gtc gcc att ctc tet gag gaa Val Glu Gin Val Glu Alá Asn Asp Glu Val Alá Ile Leu Ser Glu Glu -60 -55 -50 gag gaa gtc gaa att gaa ctg ctt cat gag ttt gaa acg att cet gtt Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val -45 -40 -35 tta tcc gtt gag tta agc cca gaa gat gtg gac gcg ctt gaa ctt gat Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Alá Leu Glu Leu Asp -30 -25 -20

144

192

240

288

HU 225 362 Β1

cca gcg att lle tet Ser tat Tyr att lle -10 gaa Glu gag Glu gat Asp gca Alá gaa gta Glu Val -5 acg aca atg Met -1 gcg Alá 1 336 Pro -15 Alá Thr Thr caa aca atc cca tgg gga att agc cgt gtg caa gcc ccg get gcc cat 384 Gin Thr He Pro Trp Gly lle Ser Arg Val Gin Alá Pro Alá Alá His 5 10 15 aac cgt gga ttg aca ggt tet ggt gta aaa gtt get gtc ctc gat aca 432 Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Alá Val Leu Asp Thr 20 25 30 ggt att tcc act cat cca gac tta aat att cgt ggt ggc get agc ttt 480 Gly lle Ser Thr His Pro Asp Leu Asn lle Arg Gly Gly Alá Ser Phe 35 40 45 gta cca ggg gaa cca tcc act caa gat ggg aat get cat ggc acg cat 528 Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gin Asp Gly Asn Alá His Gly Thr His 50 55 60 65 gtg gcc ggg acg att get get tta aac aat teg att ggc gtt ctt ggc 576 Val Alá Gly Thr He Alá Alá Leu Asn Asn Ser lle Gly Val Leu Gly 70 75 80 gta gcg cet agt gcg gaa cta tac get gtt aaa gtt tta gga gcc gac 624 Val Alá Pro Ser Alá Glu Leu Tyr Alá Val Lys Val Leu Gly Alá Asp 85 90 95 ggt aga ggt gca atc agc teg att gcc caa ggg ttg gaa tgg gca ggg 672 Gly Arg Gly Alá He Ser Ser lle Alá Gin Gly Leu Glu Trp Alá Gly 100 105 no aac aat ggc atg cac gtt get aat ttg agt tta gga agc cet teg cca 720 Asn Asn Gly Met His Val Alá Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro 115 120 125 agt gcc aca ctt gag caa get gtt aat agc gcg act tet aga ggc gtt 768 Ser Alá Thr Leu Glu Gin Alá Val Asn Ser Alá Thr Ser Arg Gly Val 130 135 140 145 ctt gtt gta gcg gca tet ggg aat tea ggt gca agc tea atc agc tat 816 Leu Val Val Alá Alá Ser Gly Asn Ser Gly Alá Ser Ser He Ser Tyr 150 155 160 ccg gcc cgt tat gcg aac gca atg gca gtc gga get act gac caa aac 864 Pro Alá Arg Tyr Alá Asn Alá Met Alá Val Gly Alá Thr Asp Gin Asn 165 170 175 aac aac ege gcc agc ttt tea cag tat ggc gcc ggg ctt gac att gtg 912 Asn Asn Arg Alá Ser Phe Ser Gin Tyr Gly Alá Gly Leu Asp lle Val 180 185 190 gca CCC ggg gta aac att cag agc aca tac cca ggt tea acg tat gcc 960 Alá Pro Gly Val Asn lle Gin Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Alá 195 200 205 agc tta aac ggt aca teg atg get act cet cat gtt gca ggt gca gca 1008 Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Alá Thr Pro His Val Alá Gly Alá Alá 210 215 220 225

HU 225 362 Β1

gcc Alá ctt Leu gtt Val aaa Lys caa Gin 230 aag Lys aac Asn cca Pro tct Ser tgg Trp 235 tcc Ser aat Asn gta Val caa Gin atc Ile 240 ege Arg 1056 aac cat cta aag aat acg gca acg agc tta gga agc acg aac ttg tat 1104 Asn His Leu Lys Asn Thr Alá Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr 295 250 255 gga agc gga ctt gtc aat gca gaa gcg gca aca ege taa 1143 Gly Ser Gly Leu Val Asn Alá Glu Alá Alá Thr Arg

260 265 270 <210>4 <211 >380 <212> PRT <213> Mesterséges szekvencia <223> Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I <400> 4

Met 1 Met Arg Lys Lys 5 Ser Phe Trp Leu Gly 10 Met Leu Thr Alá Phe 15 Met Leu Val Phe Thr Met Alá Ser Ile Alá Ser Alá Alá Glu Glu Alá Lys 20 25 30 Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gin Glu Alá Val Ser Glu Phe 35 40 45 Val Glu Gin Val Glu Alá Asn Asp Glu Val Alá Ile Leu Ser Glu Glu 50 55 60 Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val 65 70 75 80 Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Alá Leu Glu Leu Asp 85 90 95 Pro Alá Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Alá Glu Val Thr Thr Met Alá 100 105 110 Gin Thr Ile Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gin Alá Pro Alá Alá His 115 120 125 Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Alá Val Leu Asp Thr 130 135 140 Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Alá Ser Phe 145 150 155 160 Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gin Asp Gly Asn Alá His Gly Thr His 165 170 175 Val Alá Gly Thr Ile Alá Alá Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly 180 185 190 Val Alá Pro Ser Alá Glu Leu Tyr Alá Val Lys Val Leu Gly Alá Asp 195 200 205 Gly Arg Gly Alá Ile Ser Ser Ile Alá Gin Gly Leu Glu Trp Alá Gly 210 215 220

HU 225 362 Β1

Asn Asn 225 Gly Met His Val 230 Alá Asn Leu Ser Leu 235 Gly Ser Pro Ser Pro 240 Ser Alá Thr Leu Glu Gin Alá Val Asn Ser Alá Thr Ser Arg Gly Val 245 250 255 Leu Val Val Alá Alá Ser Gly Asn Ser Gly Alá Ser Ser Ile Ser Tyr 260 265 270 Pro Alá Arg Tyr Alá Asn Alá Met Alá Val Gly Alá Thr Asp Gin Asn 275 280 285 Asn Asn Arg Alá Ser Phe Ser Gin Tyr Gly Alá Gly Leu Asp Ile Val 290 295 300 Alá Pro Gly Val Asn Ile Gin Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Alá 305 310 315 320 Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Alá Thr Pro His Val Alá Gly Alá Alá 325 330 335 Alá Leu Val Lys Gin Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gin Ile Arg 340 345 350 Asn His Leu Lys Asn Thr Alá Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr 355 360 365 Gly Ser Gly Leu Val Asn Alá Glu Alá Alá Thr Arg

370 375 380 <210>5 <211>1143 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia

<220> <223> Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I/L211D <220> <221 > CDS <222> (1)...(1143) <220> <221 > mat_peptid <222> (334)... (1143) <400> 5 atg atg agg aaa aag agt ttt tgg ctt ggg atg ctg acg gcc ttc atg 48 Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Alá Phe Met -110 -105 -100 ctc gtg ttc acg atg gca tcg atc gca tcg get get gag gaa gca aaa 96 Leu Val Phe Thr Met Alá Ser Ile Alá Ser Alá Alá Glu Glu Alá Lys -95 -90 -85 -80 gaa aaa tat tta att ggc ttt aat gag cag gaa get gtc agt gag ttt 144 Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gin Glu Alá Val Ser Glu Phe -75 -70 -65 gta gaa caa gta gag gca aat gac gag gtc gcc att ctc tet gag gaa 192 Val Glu Gin Val Glu Alá Asn Asp Glu Val Alá Ile Leu Ser Glu Glu -60 -55 -50

HU 225 362 Β1

gag Glu gaa Glu gtc Val -45 gaa Glu att Ile gaa Glu ctg Leu ctt Leu -40 cat His gag Glu ttt Phe gaa Glu acg Thr -35 att Ile cet Pro gtt Val 240 tta tcc gtt gag tta agc cca gaa gat gtg gac gcg ctt gaa ctt gat 288 Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Alá Leu Glu Leu Asp -30 -25 -20 cca gcg att tet tat att gaa gag gat gca gaa gta acg aca atg gcg 336 Pro Alá Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Alá Glu Val Thr Thr Met Alá -15 -10 -5 -1 1 caa aca atc cca tgg gga att agc cgt gtg caa gcc ccg get gcc cat 384 Gin Thr Ile Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gin Alá Pro Alá Alá His 5 10 15 aac cgt gga ttg aca ggt tet ggt gta aaa gtt get gtc ctc gat aca 432 Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Alá Val Leu Asp Thr 20 25 30 ggt att tcc act cat cca gac tta aat att cgt ggt ggc get agc ttt 480 Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Alá Ser Phe 35 40 45 gta cca ggg gaa cca tcc act caa gat ggg aat get cat ggc acg cat 528 Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gin Asp Gly Asn Alá His Gly Thr His 50 55 60 65 gtg gcc ggg acg att get get tta aac aat teg att ggc gtt ctt ggc 576 Val Alá Gly Thr Ile Alá Alá Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly 70 75 80 gta gcg cet agt gcg gaa cta tac get gtt aaa gtt tta gga gcc gac 624 Val Alá Pro Ser Alá Glu Leu Tyr Alá Val Lys Val Leu Gly Alá Asp 85 90 95 ggt aga ggt gca atc agc teg att gcc caa ggg ttg gaa tgg gca ggg 672 Gly Arg Gly Alá Ile Ser Ser Ile Alá Gin Gly Leu Glu Trp Alá Gly 100 105 110 aac aat ggc atg cac gtt get aat ttg agt tta gga agc cet teg cca 720 Asn Asn Gly Met His Val Alá Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro 115 120 125 agt gcc aca ctt gag caa get gtt aat agc gcg act tet aga ggc gtt 768 Ser Alá Thr Leu Glu Gin Alá Val Asn Ser Alá Thr Ser Arg Gly Val 130 135 140 145 ctt gtt gta gcg gca tet ggg aat tea ggt gca agc tea atc agc tat 816 Leu Val Val Alá Alá Ser Gly Asn Ser Gly Alá Ser Ser Ile Ser Tyr 150 155 160 ccg gcc cgt tat gcg aac gca atg gca gtc gga get act gac caa aac 864 Pro Alá Arg Tyr Alá Asn Alá Met Alá Val Gly Alá Thr Asp Gin Asn 165 170 175 aac aac ege gcc agc ttt tea cag tat ggc gcc ggg ctt gac att gtg 912 Asn Asn Arg Alá Ser Phe Ser Gin Tyr Gly Alá Gly Leu Asp Ile Val 180 185 190

HU 225 362 Β1

gca Alá CCC Pro 195 ggg Gly gta Val aac Asn att lle cag Gin 200 agc Ser aca Thr tac Tyr cca Pro ggt Gly 205 tea Ser acg Thr tat Tyr gcc Alá 960 agc gac aac ggt aca tcg atg get act cet cat gtt gca ggt gca gca 1008 Ser Asp Asn Gly Thr Ser Met Alá Thr Pro His Val Alá Gly Alá Alá 210 215 220 225 gcc ott gtt aaa caa aag aac cca tet tgg tcc aat gta caa atc ege 1056 Alá Leu Val Lys Gin Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gin He Arg 230 235 240 aac cat cta aag aat acg gca acg agc tta gga agc acg aac ttg tat 1104 Asn His Leu Lys Asn Thr Alá Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr 245 250 255 gga agc gga ctt gtc aat gca gaa gcg gca aca ege taa 1143 Gly Ser Gly Leu Val Asn Alá Glu Alá Alá Thr Arg 260 265 270

<210 6 <211 >380 <212> PRT <213> Mesterséges szekvencia <223> Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61ΑΛ/199I/L211D

<400> 6 Phe Trp Leu Gly 10 Met Leu Thr Alá Phe 15 Met Met 1 Met Arg Lys Lys 5 Ser Leu Val Phe Thr Met Alá Ser lle Alá Ser Alá Alá Glu Glu Alá Lys 20 25 30 Glu Lys Tyr Leu He Gly Phe Asn Glu Gin Glu Alá Val Ser Glu Phe 35 40 45 Val Glu Gin Val Glu Alá Asn Asp Glu Val Alá lle Leu Ser Glu Glu 50 55 60 Glu Glu Val Glu lle Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr He Pro Val 65 70 75 80 Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Alá Leu Glu Leu Asp 85 90 95 Pro Alá He Ser Tyr He Glu Glu Asp Alá Glu Val Thr Thr Met Alá 100 105 110 Gin Thr He Pro Trp Gly He Ser Arg Val Gin Alá Pro Alá Alá His 115 120 125 Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Alá Val Leu Asp Thr 130 135 140 Gly He Ser Thr His Pro Asp Leu Asn lle Arg Gly Gly Alá Ser Phe 145 150 155 160 Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gin Asp Gly Asn Alá His Gly Thr His

165 170 175

HU 225 362 Β1

Val Alá Gly Thr 180 Ile Alá Alá Leu Asn Asn 185 Ser Ile Gly Val 190 Leu Gly Val Alá Pro Ser Alá Glu Leu Tyr Alá Val Lys Val Leu Gly Alá Asp 195 200 205 Gly Arg Gly Alá Ile Ser Ser Ile Alá Gin Gly Leu Glu Trp Alá Gly 210 215 220 Asn Asn Gly Met His Val Alá Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro 225 230 235 240 Ser Alá Thr Leu Glu Gin Alá Val Asn Ser Alá Thr Ser Arg Gly Val 245 250 255 Leu Val Val Alá Alá Ser Gly Asn Ser Gly Alá Ser Ser Ile Ser Tyr 260 265 270 Pro Alá Arg Tyr Alá Asn Alá Met Alá Val Gly Alá Thr Asp Gin Asn 275 280 285 Asn Asn Arg Alá Ser Phe Ser Gin Tyr Gly Alá Gly Leu Asp Ile Val 290 295 300 Alá Pro Gly Val Asn Ile Gin Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Alá 305 310 315 320 Ser Asp Asn Gly Thr Ser Met Alá Thr Pro His Val Alá Gly Alá Alá 325 330 335 Alá Leu Val Lys Gin Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gin Ile Arg 340 345 350 Asn His Leu Lys Asn Thr Alá Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr 355 360 365 Gly Ser Gly Leu Val Asn Alá Glu Alá Alá Thr Arg 370 375 380

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

2. táblázat

Alapmosószer kiegészítve A B C D Kiindulási érték 22,9 13,0 11,3 26,4 Kontroll proteáz nélkül 34,1 18,5 15,1 42,4 B. lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61Α1Λ/199I/L211D 45,1 33,5 42,5 72,6 S. lentus alkalikus proteáz F49 40,1 28,6 26,8 71,3 Savinase® 43,0 30,5 29,5 48,6 Standard deviáció 0,7 0,7 1,2 0,9

Felismerhető, hogy a Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A1/V199I/L211D az összes szennyezést jobban eltávolította (jobb a teljesítménye), mint a Bacillus lentus alkalikus proteáz 49 és a Savinase®.

2. példa

A következő példákban standardizáltan szennyezett textíliákat használtunk, melyeket szakirodalmi állásfoglalások adnak meg [Eidgenössischen Material-Prüfungs- und -Versuchsanstalt, St. Gálién, Schweiz (EMPA), vagy Wáschereiforschungsanstalt, Krefeld]. A 2. példában a következő szennyezett textíliákat használtuk: A: (vér/tej/korom pamuton), B: (vér/tej/tus pamuton), C: (vér/tej/tus poliészter-pamut vegyes szöveten) és D: (tojás/korom pamuton).

Az ezekkel szennyezett vizsgálati anyagokon különböző mosási receptek alkalmazásával launderometriás méréseket végeztünk. Ehhez a mosófürdő aránya

2-alkil-allil-szulfonsavat, valamint cukorszármazékot tartalmaznak.

A további előnyben részesített kopolimerek monomerként előnyösen akroleint és akrilsavat/akrilsavsókat, illetve akroleint és vlnil-acetátot tartalmaznak.

Hasonlóan a további előnyben részesített kötőanyagok közé tartoznak a polimer aminodikarbonsavak, ezek sói vagy az ezekből levezethető vegyületek. Különösen előnyösek a pollaszparaginsavak, illetve ezek sói és származékai.

A további megfelelő kötőanyagok közé tartoznak a pollacetálok, melyek a dialdehidek polikarbonsavakkal adott reakciójában keletkeznek, melyek 5-7 szénatomosak és legalább 3 hidroxilcsoporttal rendelkeznek. Az előnyben részesített poliacetálok dialdehideket, mint például glioxált, glutáraldehidet, tereftálaldehidet, valamint ezek keverékeit és polikarbonsavakat, mint például glükonsavat és/vagy glukoheptonsavat tartalmaznak.

A további megfelelő szerves kötőanyagok a dextrinek, például a szénhidrátok oligomerjei, illetve polimerjei, melyek a keményítő részleges hidrolízisével állíthatók elő. Rendszerint a hidrolízist például sawal vagy enzimmel katalizálhatjuk. Előnyösen a hidrolízistermék közepes móltömegű, 400-500 000 g/mol. Ráadásul a poliszacharid dextrózekvivalense (DE) előnyös, mivel DE értéke a 0,5-40, különösen a 2-30 tartományban található, ahol a DE az a szükséges tömeg, mely a poliszacharidok redukálóhatásához szükséges, összevetve a dextrózzal, melynél a DE=100. Használható mind maltodextrin, melynek DE tartománya 3-20 közé esik, mind szárított glükózszirup, melynek DE tartománya 20-37 közé esik, mind az úgynevezett sárgadextrin és fehérdextrin, magasabb móltömegnél 2000-30 000 g/mol között.

Az ilyen dextrinek oxidált származékait olyan oxidációs anyagokkal alakíthatjuk ki, melyek a karbonsavas reakciónál az oxidáláshoz a szacharidgyürű legalább egy alkoholcsoportját biztosítják. Különösen előnyös szerves kötőanyagok a találmány szerinti szerekhez az oxidált keményítők, illetve ezek származékai, melyeket a szakirodalomban közzétettek [EP 472 042, WO 97/25399 és EP 755 944 számú szabadalmi bejelentések].

Az oxi-diszukcinátok és a diszukcinátok más származékai is, előnyösen az etilén-diamin-diszukcinát, megfelelő kötőanyagok. Ehhez előnyösen az etilén-diamin-N.N’-diszukcinát (EDDS) nátrium- vagy magnéziumsó formában fordul elő. Továbbá ebből a szempontból előnyös a glicerin-diszukcinát és a glicerin-triszukcinát is. Az adagolás megfelelő mennyisége a zeolittartalmúaknál és/vagy a szilikáttartalmúaknál 3-15 tömeg%.

A további alkalmazható szerves kötőanyagok közé tartoznak például az acilezett hldroxikarbonsavak, illetve ezek sói, melyek adott esetben lakton formában fordulhatnak elő, és amelyek legalább 4 szénatomot és legalább egy hidroxilcsoportot, valamint maximálisan két savcsoportot tartalmaznak.

A kötőanyagok további képviselői a foszfonátok alcsoportjába tartoznak. Ezek közül különösen előnyösek a hidroxi-alkán-, illetve az amino-alkánfoszfonátok. Hidroxi-alkánfoszfonátok közül az 1-hidroxi-etán1,1-difoszfonát (HEDP) különös jelentőséggel bíró kötőanyag. Ezt előnyösen nátriumsó formában adagoljuk, ahol a dinátriumsó semleges és a tetranátriumsó lúgos (pH 9). Amino-alkánfoszfonátként előnyösek a következők: etilén-diamin-tetrametilén-foszfonát (EDTMP), dietilén-triamin-pentametilén-foszfonát (DTPMP), valamint ezek magasabb rendű homológjai. Ezeket előnyösen semlegesen reagáló nátriumsó formában adagoljuk, például az EDTMP hexanátriumsójaként, illetve a DTPMP hepta- és oktanátriumsójaként. A foszfonátok osztályából ezért kötőanyagként előnyösen HEDP-t alkalmazunk. Az amino-alkánfoszfonátok ehhez kiemelkedő nehézfémkötési képességgel rendelkeznek. Ennek megfelelően, különösen ha a szer fehérítőt is tartalmaz, előnyös lehet az amino-alkánfoszfonátok, különösen a DTPMP alkalmazása, vagy a megnevezett foszfonátok keverékeinek adagolása.

A fenti összes vegyület alkáliföldfémekkel komplexben kialakíthatók és kötőanyagként így alkalmazhatók.

Adott esetben a találmány szerinti szerekben a kötőanyagok 90 tömeg%-ig lehetnek jelen. Előnyösen 75 tömeg%-ot tartalmaznak. A találmány szerinti mosószer kötőanyag-tartalma 5-50 tömeg%. A találmány szerinti kemény felületek tisztítására szolgáló tisztítószerekben, különösen a gépi mosogatógépeknél alkalmazottaknál, 5-88 tömeg% kötőanyag szerepelhet, amikor is az ilyen szerekben előnyösen vízben oldhatatlan kötőanyagot nem alkalmazunk. Egy előnyben részesített megvalósítási formában a találmány szerinti szer különösen az edények gépi tisztításához 20-40 tömeg% vízben oldódó szerves kötőanyagot, így 5 tömeg% alkáli-citrátot, 5-15 tömeg% alkáli-karbonátot és 20-40 tömeg% alkáli-diszilikátot tartalmaz.

HU 225 362 Β1

Az oldószer, mely a folyékony-gélképző mosó- és tisztítószer-összetételekben szerepelhet, például a következőkből származhat: többértékű alkoholok csoportja, alkanol-aminok vagy glikol-éter, amennyiben a megadott koncentrációtartományban vízzel elegyíthető. Előnyösen az oldószert a következők közül választjuk ki: etanol, n- vagy i-propanol, butanolok, etilénglikolmetil-éter, etilénglikol-etil-éter, etilénglikol-propil-éter, etilénglikol-mono-n-butil-éter, dietilénglikol-metil-éter, dietilénglikol-etil-éter, propilénglikol-metil-, -etil- vagy -propil-éter, dipropilénglikol-monometil- vagy -etil-éter, diizopropilénglikol-monometil-, vagy -etil-éter, metoxi-, etoxi- vagy butoxi-triglikol, 1-butoxi-etoxi-2-propanol,

2-4 szénatomos alifás peroxokarbonsavakat a perhidrolízisnek megfelelő körülmények között, és/vagy adott esetben a szubsztituált perbenzoesavak adnak. A megfelelő anyagok azok, amelyek a megadott szénatomszámú O- és/vagy N-acil-csoportokat és/vagy adott esetben szubsztituált benzolcsoportot hordoznak. Előnyben részesítjük a többszörösen acilezett alkilén-diaminokat, különösen a tetraacetil-etilén-diamint (TAED), az acilezett triazinszármazékokat, különösen az 1,5-diacetil-2,4-dioxo-hexahidro-1,3,5-triazint (DADHT), az acilezett glükolurileket, különösen a tetraacetil-glükolurilt (TAGÚ), az N-acilimideket, különösen az N-nonanoil-szukcinimidet (NOSI), az acilezett fenolszulfonátokat, különösen az n-nonanoil- vagy izononanoil-oxi-benzolszulfonátot (η-, illetve izo-NOBS), az acilezett hidroxikarbonsavakat, mint például a trietil-O-acetil-citrát (TEOC), a karbonsavanhidrideket, különösen a ftálsavanhidridet, izatosavanhidridet és/vagy borostyánkősavanhidridet, karbonsavamidok, mint például N-metil-diacetamid, glikolid, acilezett többértékű alkoholok, különösen triacetin, etilénglikol-diacetát, izopropenil-acetát, 2,5-diacetoxi-2,5-dihidrofurán és az egyik német szabadalomból [DE 196 16 693 és DE 196 16 767 számú szabadalmi bejelentések] ismert enolészterek, mint például acetilezett szorbitol és mannitol, előnyösen az EP 0 525239 szabadalmi bejelentésben közzétett keverékek (SORMAN), acilezett cukorszármazékok, különösen pentaacetil-glükóz (PAG), pentaacetil-fruktóz, tetraacetil-xilóz és oktaacetil-laktóz, valamint acetilezett, adott esetben N-alkilezett glukamin, illetve glukonolakton, triazol, illetve triazolszármazékok és/vagy farokképző kaprolaktámok és/vagy kaprolaktámszármazékok, előnyösen N-acilezett laktámok, például N-benzoil-kaprolaktám és N-acetil-kaprolaktám, melyek a szakirodalomból ismertek [WO 94/27970, WO 94/28102, WO 94/28103, WO 95/00626, WO 95/14759 és WO 95/17498 számú szabadalmi bejelentések], A német DE 196 16 769 számú szabadalmi bejelentésből ismertek a hidrofilen szubsztituált acil-acetálok, és a német DE 196 16 770 számú szabadalmi bejelentésben, valamint a WO 95/14075 számú szabadalmi bejelentésben leírt acil-laktámok, melyeket szintén előnyben részesítünk. A német DE 4443 177 számú szabadalmi bejelentésből a hagyományosabb fehérítők kombinációi szintén alkalmazhatók. Hasonlóan a nitrilszármazékok, mint a ciano-piridin, nitrilquatok, mint például N-alkil-ammónium-acetonitrilek, és/vagy cianamidszármazékok alkalmazhatók. Az előnyben részesített fehérítőaktivátorok a következők: nátrium-4-(oktanoil-oxi)-benzolszulfonát, n-nonanoilvagy izononanoil-oxi-benzolszulfonát (η-, illetve izoNOBS), undecenil-oxi-benzolszulfonát (UDOBS), nátrium-dodekanoil-oxi-benzolszulfonát (DOBS), dekanoiloxi-benzoesav (DÓBA, OBC 10) és/vagy dodekanoiloxi-benzolszulfonát (OBS 12), valamint N-metil-morfolinum-acetonitril (MMA). Az ilyen fehérítőaktivátorok szokásos módon a teljes összetételre nézve 0,01-20 tömeg%-ban, előnyösen 0,1-15 tömeg%-ben, még előnyösebben 1-10 tömeg%-ban fordulhatnak elő.

A hagyományos fehérítőaktiválókhoz vagy azok helyett úgynevezett fehérítőkatalizátorok adhatók a formatestekbe. Ezek közé a fehérítést erősítő átmenetifémsók illetőleg átmenetifém-komplexek tartoznak, mint például Μη-, Fe-, Co-, Ru- vagy mosókomplexek vagy -karbonilkomplexek. Fehérítőkatalizátorként felhasználhatók a következők is: Μη-, Fe-, Co-, Ru-, Mo-, Ti-, V- és Cu-komplexek, N-t tartalmazó tripodális ligandok, valamint Co-, Fe-, Cu- és Ru-amin-komplexek, amely vegyületeket a szakirodalomban közzétették [DE 197 09 284 A1 számú szabadalmi bejelentés], A szakirodalom szerint acetonitrilszármazékok [WO 99/63038 számú szabadalmi bejelentés] és fehérítőaktiváló átmenetifém-komplex vegyületek az amilázzal kombinációban fehérítőhatást fejtenek ki [WO 99/63041 számú szabadalmi bejelentés].

Rendszerint a találmány szerinti szer egy vagy több kötőanyagot tartalmaz, különösen zeolitot, szilikátot, karbonátot, szerves kötőanyagot, és ha alkalmazásuk ökológiai problémákkal nem jár, akkor a foszfátokat is tartalmazhat. Végül az utóbbiak tisztítószerekbe a gépi mosogatáshoz előnyösen állományanyagok adhatók.

Az alkalmas kristályok a réteges nátrium-szilikátok, melyek általános képlete a következő: NaMSi_xO_2x+iH₂O, ahol M jelentése nátrium vagy hidrogénatom, x értéke 1,9-4 és y értéke 0-20 és előnyösen x értéke 2, 3 vagy 4. Az ilyen kristályos rétegszilikátokat például az EP-A-0 164 514 szabadalmi bejelentésben leírták. Az előnyben részesített kristályos rétegszilikátok képletében M jelentése nátrium és x értéket 2 vagy 3. Mind a β-, mind az δ-nátrium-diszilikátot, Na₂SÍ2O5 yH₂O, előnyben részesítjük. A kereskedelemben például ilyen termék az SKS® (Fa. Clariant). Az SKS-6® túlnyomó részben δ-nátrium-diszilikát, mely19

HU 225 362 Β1 nek képlete: Na₂Si₂O5*yH₂O, míg az SKS-7® túlnyomó részben β-nátrium-diszilikát. Savval reagáltatva (például citromsav vagy szénsav) a δ-nátrium-diszilikátból kanemit keletkezik (NaHSi₂O₅*yH₂O), melynek kereskedelmi neve SKS-9®, illetve SKS-10® (Fa. Clariant). Előnyös lehet ezen rétegszililátok kémiailag módosított változatainak alkalmazása is. így például a rétegszilikát lúgossága megfelelően befolyásolható. A foszfáttal, illetve karbonáttal dotált rétegszilikát kristályfelépítése a δ-nátrium-diszilikáthoz viszonyítva más, gyorsabban oldódik és a δ-nátrium-diszilikáthoz képest kalciumkötő képessége nagyobb. Így az xNa₂O*ySiO₂*z-P₂O₅ összegképletű vegyületeket, melyekben az x és y tartalom arányában 0,35-0,6-ig, a x és z tartalom 1,75-1200 arányban és a y és z tartalom 4-2800 arányban változhat, a szakirodalomban közzétették [DE 19601 063 számú szabadalmi bejelentés]. A rétegszilikátok oldékonysága növelhető, különösen finom részecskés rétegszilikátok alkalmazásával. A kristályos rétegszilikátok összetevői más alkotórészekkel együtt alkalmazhatók. Idetartoznak különösen a cellulózszármazékok, melyek előnyösen szétesést biztosító hatást mutatnak és különösen mosószertablettákban alkalmazhatók, valamint a polikarboxilezett vegyületek, mely közül például a citromsavakat, illetve polimer polikarboxilátokat, például az akrilsavak kopolimereket nevezzük meg.

Az amorf nátrium-szilikátok is alkalmazhatók, melyek Na₂O:SiO₂ aránya 1:2 és 1:3,3, előnyösen 1:2 és 1:2,8, és különösen előnyösen 1:2-1:2,6 között van, melyeknek oldódási késleltetésük van és másodlagos mosási tulajdonságokat mutatnak. Az oldódási késleltetés a hagyományos amorf nátrium-szilikátokkal szemben különbözőképpen, például felületi kezeléssel, kompaundálással, kompaktálással/tömörítéssel vagy kiszárítással idézhető elő. A találmány tárgykörében „amorf alatt „röntgenamorfot” is értünk. Ez azt jelenti, hogy a szilikát a röntgendiffrakciós kísérletekben éles röntgen-visszaverődést nem ad, ami a kristályos anyagokra egyébként tipikus, hanem éppenséggel a szórt röntgensugár egy vagy több maximumot mutat, melyek szélessége a diffrakciós szög többszöröse. Mégis egészen jó képtulajdonságokhoz vezet, ha a sziiikátrészecske az elektrondiffrakciós kísérleteknél elmosódott, de még éles diffrakciós maximumot ad. Ezt úgy magyarázhatjuk, hogy a mikrokristályos termék nagysága 10-től néhány száz nm-ig terjed, és ezek az 50 nm-es, és különösen a 20 nm-es maximumig előnyösnek számítanak. Az ilyen úgynevezett röntgenamorf szilikátokat, amelyek a hagyományos vízüveggel szemben lassabb oldódásúak, előnyben részesítjük. Különösen előnyben részesítjük a tömörített/kompaktált amorf szilikátokat, a kompaundált amorf szilikátokat és a túlszárított röntgenamorf szilikátokat.

Az alkalmazott finom kristályos, szintetikus és kötött vizet tartalmazó zeolit előnyösen a zeolit A és/vagy P. Zeolit P-ként a Zeolith MAP® (a Crosfield cég gyártmánya) különösen előnyös. Megfelelő még a zeolit X is, vagy mint például az A, X és/vagy P keverékek. A kereskedelemben kapható és a találmányban előnyösen alkalmazható példák a következők: a zeolit X-ből és a zeolit A-ból a Co-kristályosított termék (körülbelül 80 tömeg% zeolit X), ez a CONDEA Augusta S.p.A. cég terméke, és amelyet VEGOBOND AX® márkanéven forgalmaznak és a következő általános képlettel jellemezhető:

nNa₂O(1-n)K₂OAI₂O₃(2-2,5)SiO₂(3,5-5,5)H₂O

A megfelelő zeolit közepes részecskemérete kevesebb, mint 10 pm (térfogati megoszlás; mérési módszer: Coulter Counter) és előnyösen 18-22 tömeg%, adott esetben 20-22 tömeg% kötött vizet tartalmaz.

Magától érthető az is, hogy az általánosan ismert foszfátok mint kötőanyagok alkalmazása addig lehetséges, míg azok környezetvédelmi problémákat nem okoznak. A sok, kereskedelemben kapható foszfát közül a következők játszanak jelentős szerepet a mosóés tisztítószerek ipari előállításánál: alkálifém-foszfátok, különösen a pentanátrium-, illetve a pentakáliumtrifoszfát (nátrium-, illetve kálium-polifoszfát).

Az alkálifém-foszfátok a foszforsavak különböző alkálifém- (különösen a nátrium- és kálium-) sóinak összefoglaló elnevezése, amelyeknél a metafoszforsavak (HPO₃)_n és az ortofoszforsavak H₃PO₄ mellett nagyobb molekulatömegű képviselőket különböztethetünk meg. A foszfátok több előnnyel rendelkeznek. Alkálihordozóként működnek, gátolják a mészkőlerakódást a különböző géprészekbe, illetve a mészkő-inkrusztációt a szövetekbe, és ezenkívül a tisztításban hatékonyak.

A nátrium-dihidrogén-foszfát, NaH₂PO₄, dihidrátként (sűrűsége 1,91 g/cm³, olvadási pontja 60 °C) és monohidrátként (sűrűség 2,04 g/cm³) fordul elő. Mindkettő fehér só, vízben könnyen oldódó por, melyek kristályvizüket hevítéssel elveszítik, és 200 °C-on gyenge savban difoszfátot adnak (dinátrium-hidrogén-difoszfát, Na2H2P2O7), magasabb hőmérsékleten nátrium-trimetafoszfát (Na3P3O9) és Maddrell-féle sókká (lásd lejjebb) átalakulnak. A NaH2PO4 savas reakcióban akkor alakul ki, mikor a foszforsavat nátronlúggal pH 4,5 értékre állítják és a levet porlasztják. A kálium-dihidrogén-foszfát (primer vagy egybázisú kálium-foszfát, kálium-bifoszfát, KDP), a KH2PO4, fehér só melynek sűrűsége 2,33 g/cm³, és olvadáspontja 253 °C [a kálium-polifoszfát szétesése és képződése (ΚΡΟ3)χ] és vízben könnyen oldódik.

A dinátrium-hidrogén-foszfát (szekunder nátrium-foszfát), Na₂HPO₄, színtelen vízben könnyen oldódó kristályos só. Vízmentes formában létezik, és vízben 2 mólnál (sűrűség 2,066 g/cm³, vízvesztés 95 °C-on), 7 mólnál (sűrűség 1,68 g/cm³, olvadáspont 48 °C, 5 H2O-vesztéssel) és 12 mólnál (sűrűség 1,52 g/cm³, olvadáspont 35 °C, 5 H2O-vesztés után), 100 °C-on vízmentessé válik és magasabb hőmérsékleten difoszfáttá alakul Na₄P₂O₇. A dinátrium-hidrogén-foszfát foszforsav szódaoldatos semlegesítéssel, fenolftalein-indikátor jelenlétében előállítható. A dikálium-hidrogén-foszfát (másodlagos vagy kétbázisú kálium-foszfát), K₂HPO₄, amfoter tulajdonságú fehér só, mely vízben könnyen oldódik.

A trinátrium-foszfát, tercier nátrium-foszfát, Na₃PO₄, színtelen kristály, dihidrátként sűrűsége 1,62 g/cm³ és

HU 225 362 Β1 olvadáspontja 73-76 °C (szétesik), dekahidrátként (ez megfelel 19-20% P₂O₅-nak) olvadáspontja 100 °C és vízmentes formában (ez megfelel 39-40% P₂O₅-nak) sűrűsége 2,536 g/cm³. A trinátrium-foszfát vízben alkalikus reakcióban könnyen oldódik, és pontosan 1 mól dinátrium-foszfát-oldatból bepárolva állítható elő. A trikálium-foszfát (tercier vagy hárombázisú kálium-foszfát), K3PO4, fehér, elfolyosodó szemcsés por, melynek sűrűségű 2,56 g/cm³, olvadáspontja 1340 °C, és vízben alkalikus reakcióval könnyen oldódik. Például a Thomas salak szénnel és kálium-szulfáttal történő melegítésével jön létre. Magas ára miatt a tisztítószeriparban a könnyebben oldódó, mégis nagy hatású kálium-foszfátot részesítik előnyben a nátriumvegyületekkel szemben.

A tetranátrium-difoszfát (nátrium-pirofoszfát), Na₄P₂O₇, vízmentes formában (sűrűsége 2,534 g/cm³, olvadáspontja 988 °C, de 880 °C-ot tüntetnek fel) és dekahidrátként fordul elő (sűrűsége 1,815-1,836 g/cm³, olvadáspontja vízvesztés után 94 °C). Mindkét anyag színtelen, vízben alkalikus reakcióban a kristályok oldódnak. A Na₄P₂O₇ a dinátrium-foszfát 200 °C feletti hőmérsékletre hevítésével nyerhető, vagy foszforsavat szódával sztöchiometrikus arányban egyesítünk, és az oldatot porlasztással víztelenítjük. A dekahidrát komplexben lévő nehézfémsót tartalmaz és a víz keménységét csökkenti. A kálium-difoszfát (kálium-pirofoszfát), K₄P₂O₇, trihidrát formában létezik, színtelen higroszkópos porként, melynek sűrűsége 2,33 g/cm³, vízben oldódik, így pH-értéke 1%-os oldatban 25 °C-on 10,4.

A NaH₂PO₄, illetőleg a KH₂PO₄ kondenzációjával keletkező magas molekulatömegű nátrium- és kálium-foszfát, melynek ciklikus képviselője a nátrium-, illetőleg a kálium-metafoszfát, és a láncképző típusok, melyek esetében nátrium-, illetve a kálium-polifoszfát különböztethető meg. Különösen az utóbbinál számos megnevezés ismeretes: olvadó vagy glükofoszfát, Graham-féle só, Kurrol- és Maddrel-féle só. Itt az összes magasabb nátrium- és kálium-foszfátot együttesen kondenzált foszfátnak nevezzük.

A technikailag fontos pentanátrium-trifoszfát, Na₅P₃O₁₀ (nátrium-tripolifoszfát), vízmentes vagy 6 vizet tartalmazó kristályosodó, nem higroszkópos fehér vízben oldható só, melyek általános képlete a következő: NaCHPÍOXONaj-Ojn-Na, ahol n=3. Száz gramm vízben szobahőmérsékleten körülbelül 17 g, 60 °C-on körülbelül 20 g, 100 °C-on körülbelül 32 g kristályvízmentes só oldódik; az oldat 100 °C kétórás melegítés után 8%-ban hidrolízissel keletkező ortofoszfátot és 15% difoszfátot tartalmaz. A pentanátrium-trifoszfát előállításánál a foszforsavat a szódaoldattal vagy nátronlúggal sztöchiometrikus arányban reakcióba hozzuk, és az oldatot porlasztással vízmentesítjük. A Graham-féle sóhoz és a nátrium-difoszfáthoz hasonlóan a pentanátrium-trifoszfát több oldhatatlan fémvegyületet tartalmaz (kálisókat stb.). A pentanátrium-trifoszfát K5P3O10 (kálium-tripolifoszfát) például 50 tömeg%-os oldatban kerül forgalomba (>23% P₂O₅, 25% K₂O). A kálium-polifoszfátot a mosó- és tisztítószeriparban széles körben felhasználják. Továbbá nátrium-kálium-tripolifoszfátként is léteznek, melyeket éppen a találmány tárgykörében alkalmazunk. Ezek például akkor keletkeznek, ha a nátrium-trimetafoszfátot KOH-dal hidrolizáljuk: (NaPO₃)₃+2 KOH Na₃K₂P₃O₁₀+H₂O.

Ezek a találmány szerint mint nátrium-tripolifoszfát, kálium-tripolifosztát vagy ezek keverékeként pontosan adagolhatók; a nátrium-tripolifoszfát és a nátrium-kálium-tripolifoszfát keverékek a kálium-tripolifoszfát és a nátrium-kálium-tripolifoszfát keverékek, vagy a nátrium-tripolifoszfát és a kálium-tripolifoszfát és nátriumkálium-tripolifoszfát keverékek szintén alkalmazhatók.

Szerves kötőanyagként a találmány szerinti mosóés tisztítószerekbe különösen a polikarboxilátok vagy a polikarbonsavak, polimer polikarboxilátok, poliaszparaginsavak, poliacetálok, adott esetben oxidált dextrinek, továbbá szer kötőanyagok (lásd lejjebb), mint például foszfonátok adagolhatók.

A használható szerves vázanyagok példái a nátriumsó formában alkalmazható polikarbonsavak, mint például a citromsav, az adipinsav, a borostyánkősav, a glutársav, a borkősav, a cukorsavak, az aminokarbonsavak, a nitrilo-triecetsav (NTA), hacsak az ilyen alkalmazások ökológiai szempontból nem kifogásolhatók, valamint az ezekből készült keverékek. Előnyben részesítjük a polikarbonsavak sóit, mint például a citromsavat, az adipinsavat, a borostyánkősavat, a glutársavat, a borkősavat, a cukorsavakat és az ezekből készült keverékeket.

Savak is adagolhatók. Kötőanyaghatásuk mellett tipikusan savasítókomponensként szerepelhetnek, ezzel nemcsak a mosó- és tisztítószereknél az alacsonyabb és közepes pH-tartományok beállítását biztosítják, hanem a szokásos komponensek pH-értékét is. Ehhez különösen a rendszerre és a környezetre ártalmatlan savak alkalmasak, mint például citromsav, ecetsav, bórsav, almasav, tejsav, glikolsav, borostyánkősav, glutársav, adipinsav, glukonsav és ezek előnyös keverékei. De az ásványi savak is, mint például kénsav, vagy a lúgok, különösen ammónium- vagy alkáli-hidroxid, pH-szabályozóként szolgálhatnak. Az ilyen szabályozók a találmány szerinti szerekben előnyösen nem több mint 20 tömeg%-ban, különösen 1,2-17 tömeg%-ban fordulhatnak elő.

Kötőanyagként további polimer polikarboxilátok is megfelelnek, melyek például a poliakrilsavak vagy a polimetakrilsavak alkálifémsói, például melyek viszonylagos molekulatömege 500-70 000 g/mol.

A polimer polikarboxilátnál megadott móltömegek a találmány szellemében a mindenkori savforma tömegének középértékére vonatkozik, melyet alapvetően gélpermeabilitási kromatográfiával (GPC) határozunk meg UV-detektálás mellett. A meghatározás belső poliakrilsavs-tandarddal történik, mely strukturálisan a vizsgált polimerekkel rokonságban van, és közel azonos molekulatömegű. Ezek lehetővé teszik, hogy a polisztirolszulfonsav standardként szolgáljon. Rendszerint a polisztirolszulfonsavakkal szemben mért móltömegek magasabbak, mint a leírásokban megadottak.

A megfelelő polimer elsődlegesen poliakrilát, melynek előnyösen molekulatömege 2000-20 000 g/mol.

HU 225 362 Β1

Kitűnő oldékonyságuk miatt a csoportból a rövid láncú poliakrilátok előnyösek, melyek móltömege 2000-10 000 g/mol, és különösen előnyösen 3000-5000 g/mol.

Megfelelnek továbbá azok a kopolimer polikarboxilátok is, melyek különösen az akrilsavak metakrilsavakkal és az akrilsavak vagy metakrllsavak maleinsawal alkotott vegyületei. Különösen előnyös az akrilsav kopolimere maleinsawal, melyben az akrilsav 50-90 tömeg% és a maleinsav 50-10 tömeg%. Viszonylagos molekulatömege a szabad savra nézve általában 2000-70 000 g/mol, előnyösen 20 000-50 000 g/mol, és különösen előnyösen 30 000-40 000 g/mol. A (ko)polimer polikarboxilátok vagy porban, vagy vízben kialakított oldatban adagolhatok. A szerben a (ko)polimer polikarboxilátok mennyisége 0,5-20 tömeg%, különösen 1-10 tömeg% lehet.

A vízoldékonyság javításához a polimer allil-szulfonsavakat, mint például allil-oxi-benzolszulfonsavakat és metallil-szulfonsavakat monomerként tartalmazhat.

Különösen előnyben részesített a biológiailag lebomló polimerek két eltérő monomeregységet tartalmaznak, például melyek az akrilsavak monomer sói, és a maleinsav, valamint a vinil-alkohol, illetve a vinil-alkohol származékai vagy az akrilsavak monomer sói, és

3. Szubtilizin típusú alkalikus proteázok, azzal jellemezve, hogy a Bacillus lentus-bó\ nyert szubtilizinek számozása szerint a 199. pozícióban az aminosavat izoleucinra, a 211. pozícióban aszparaginsavra és a 61. pozícióban az aminosavat alaninra cseréljük ki.

3. táblázat

Alapmosószer kiegészítve A B C Kiindulási érték 13,6 13,2 11,1 Kontroll proteáz nélkül 24,5 17,8 14,4 S. lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61AA/199I 36,2 37,0 46,9 B. lentus alkalikus proteáz S3TA/4I/V199I 31,6 33,1 39,6 B. lentus alkalikus proteáz F49 28,7 28,6 25,9 Savinase® 29,0 30,8 29,0 Standard deviáció 1,0 0,8 1,3

összevetve mindkét Bacillus lentus alkalikus proteáz változatot, az S3T/V4l/G61A/V199l-et és az S3T/V4l/199l-et, felismerhető, hogy a 61. pozícióban lévő glicin kicserélése alifás aminosavra, azaz alaninra, az enzim jobb teljesítményéhez vezetett azonos recepttel a különböző szennyezéseknél és a különböző szöveteknél. Ezek nyilvánvalóan túlszárnyalták az ismert Bacillus lentus alkalikus proteáz F49-et és a Savinase®-t.

3. példa

Pamuttextiljét, melyeket a 2. példa alapján A, B és C formában szennyeztünk ahhoz hasonlóan vizsgáltuk, amint azt a 2. példában megadtuk. A megkülönböztetés alapja, hogy ezekben a példákban egyébként azonos mosási recepteket használtuk. A találmány szerinti Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A1/V199I változatot a következőkkel hasonlítottuk össze: Bacil32

HU 225 362 Β1 lus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/V199I változat és adott esetben az ismert Bacillus lentus alkalikus proteáz F49 és a Savinase® enzimeket használtuk. Ezeket is úgy koncentráltuk, hogy a mindenkori végkoncentráció 2250 PE proteolitikus aktivitást jelent az I. mosófürdőben, és a hőmérséklet szintén 40 °C.

A mérési sorozat mérései és a kiindulási értékek meghatározása a 2. példában megadottak szerint történt. A következő 3. táblázat bemutatja a kapott eredményeket.

3- (4-metil-benzilidén)-kámfor [EP 0693471 B1 számú szabadalmi bejelentés], 4-amino-benzoesav-származékok, előnyösen 4-(dimetil-amino)-benzoesav-2-etilhexil-észter, 4-(dimetil-amino)-benzoesav-2-oktilészter és 4-(dimetil-amino)-benzoesav-amil-észter, a fahéjsav észterei, előnyösen a 4-metoxi-fahéjsav-2etil-hexil-észter, 4-metoxi-fahéjsav-propil-észter, 4-metoxi-fahéjsav-amil-észter, 2-ciano-3,3-fenil-fahéjsav-2etil-hexil-észter (Octocrylene), a szalicilsavak észterei, előnyösen a szalicilsav-2-etil-hexil-észter, szalicilsav4- izopropil-benzil-észter, szalicilsav-homomentil-észter, a benzofenonok származékai, előnyösen a 2-hidroxi-4-metoxi-benzofenon, 2-hídroxi-4-metoxi-4’metil-benzofenon, 2,2’-dihidroxi-4-metoxi-benzofenon, a benzmalonsavak észterei, előnyösen a 4-metoxibenzmalonsav-di-2-etil-hexil-észter, triazinszármazékok, mint például a 2,4,6-trianilino-(p-karbo-2'-etil-Thexil-oxi)-1,3,5-triazin és oktil-triazon, ahogy azt a szakirodalomban leírták [EP 0818450 számú szabadalmi bejelentés] vagy dioktil-butamido-triazon (Uvasorb® HEB), propán-1,3-dion, mint például az 1-(4-terc-butil-fenil)-3-(4’-metoxi-fenil)-propán-1,3-dion, keto-triciklo(5.2.1.0)dekán-származékok, mint például a szakirodalomban leírt vegyületek [EP 0694521 B1 számú szabadalmi bejelentés]. A továbbá megfelelnek: 2-fenilbenzimidazol-5-szulfonsav és ezek alkáli-, alkáliföldfém-, ammónium-, alkil-ammónium-, alkanol-ammónium- és glukammóniumsói, a benzofenonok szulfonsavszármazékai, előnyösen a 2-hidroxi-4-metoxibenzofenon-5-szulfonsav és sói, a 3-benzilidénkámforok szulfonsavszármazékai, mint például 4-(2oxo-3-bornilidén-metil)-benzolszulfonsav és 2-metil-5-(2-oxo-3-bomilidén)-szulfonsav és ezek sói.

A tipikus UV-A-szűrők közé tartoznak a benzoil-metán-származékok, mint például 1-(4’-terc-butil-fenil)-3(4’-metoxi-fenil)-propán-1,3-dion, 4-terc-butil-4'-metoxi-dibenzoil-metán (Parsol 1789), 1-fenil-3-(4’-izopropil-fenil)-propán-1,3-dion, valamint Enamin-vegyületek, mint például azok, melyeket a szakirodalomban leírtak [DE 19712033 A1 számú szabadalmi bejelentés] (BASF). Az UV-A- és az UV-B-szűrők természetesen keverten is adagolhatók. A megnevezett oldódó anyagokon kívül erre a célra a fényvédő pigmenteket említjük, melyek finoman diszpergált, előnyösen nanométeres tartományba eloszlatott megfelelő fém-oxidok, kü26

HU 225 362 Β1 lönösen cink-oxid és titán-oxid, és amelyek lehetnek vas-, cirkónium-, szilícium-, mangán-, alumínium- és cérium-oxidok és ezek keverékei. Sóként szilikátok (talkum), bárium-szulfát vagy cink-sztearát alkalmazhatók. Az oxidok és a sók pigment formában már a bőrápoló és bőrvédő emulziókba és szépítőszerekbe alkalmazhatók. A részecskék közepes átmérője kevesebb mint 100 nm, előnyösen 5-50 nm és még előnyösebben 15-30 nm között található. Lehetnek gömb formában, de azok a részecskék is adagolhatok, melyek ellipszoid alakúak, vagy egyéb göbszerű formában vannak. A pigmentek felületkezeltek is lehetnek, azaz hidrofil vagy hidrofób formává alakítottam A tipikus példák a burkolt titán-dioxid, mint például a Titan-dioxid T 805 (Degussa) vagy az Eusolex® T2000 (Merck; hidrofób burokként előnyösen szilikon, és előnyösebben trialkoxi-oktil-szilánok vagy Simethicone, jöhet szóba. Előnyösen mikrokristályos cink-oxidot alkalmazunk. A további UV-védőanyagokról a szakirodalomban áttekintést kaphatunk [Finkel: SÖFW-Journal, 122, 543 (1996)].

Az UV-abszorbeálók rendszerint 0,01-5 tömeg%ban, előnyösen 0,03-1 tömeg%-ban adagolhatok.

A mosó- és tisztítószerek szokásos alkotórészei közé tartoznak az általánosan használt mosó- és tisztítóhatású enzimek. Egyidejűleg a találmány megvalósítási formáiban a mosó- és tisztítószer a találmány szerinti fehérjén kívül további ismert enzimeket is tartalmazhat. Idetartoznak például a proteázok, de egyéb enzimek is, mint például oxidoreduktázok, kutinázok, eszterázok és/vagy hemicellulázok, különösen előnyben részesítjük a lipázokat, amilázokat, cellulázokat vagy β-glukanázokat.

Az enzimek, mint például proteázok, amilázok vagy cellulázok évtizedek óta a mosó- és tisztítószerekben alkalmazott komponensek. Mindenkori alkalmazásukat mosási teljesítményük, illetve a szóban forgó anyagok tisztítását biztosító hatékonyságuk szabja meg, így fehérjetartalmú szennyeződések lebontásához proteázokat, keményítőtartalmú szennyeződések eltávolításához amilázokat, és zsírtartalmú szennyeződésekhez pedig lipázokat alkalmazunk. A mosószerekben különösen akkor alkalmazunk cellulázokat, ha azok másodlagos hatása a mosószerekben előnyös, valamint jelenlétük a textíliák rostjaira kedvezőek. A mindenkori hidrolízistermékeket a megmaradt mosó- és tisztítószer-alkotók megtámadják, feloldják, emulgeálják vagy szuszpendálják, vagy nagyobb oldékonyságuk miatt a mosófürdővel kimossák, tehát az enzimek a többi alkotórésszel szinergizmusba lépnek.

A másodlagos mosási teljesítmény cellulózzal összehasonlítható mértékű hozzájárulása miatt, a proteázok képesek kifejteni hatásukat a természetes rostokra különösen a gyapjúra és a selyemre. Az ilyen szövetek felszínén kifejtett hatásukkal az anyagon fényesítőhatást fejtenek ki, és ezzel a nemezelőhatás ellen hatnak.

A további enzimek a szóban forgó tisztítószer-teljesítményt tovább emelik specifikus enzimatikus képességeikkel. Idetartoznak például a hemicellulázok, mint például a β-glukanázok [WO 99/06515 és WO 99/06516 számú szabadalmi bejelentés] az oxidoreduktázok, mint például a Laccasen [WO 00/39306 számú szabadalmi bejelentés] vagy a pektinoldó enzimek [WO 00/42145 számú szabadalmi bejelentés], amelyek speciális anyagként adagolhatok.

A találmány szerinti szerekben történő felhasználáshoz első vonalban a mikroorganizmusokból kivont enzimek jönnek szóba, melyek például a baktériumokból vagy gombákból nyerhetők. Ezek az alkotók ismert módon fermentációval a megfelelő mikroorganizmusból kinyerhetők, ahogy azt például a szakirodalomban közzétették [DE 19 40 488 és DE 21 21 397 számú szabadalmi bejelentés, 3 623 957 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés és 4 264 738 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, EP 008 638, valamint WO 91/02792 számú szabadalmi bejelentés].

A találmány szerinti fehérjét, különösen tárolás során, stabilizálókkal, például denaturálással, széteséssel vagy inaktiválással szemben, valamilyen fizikai behatással, oxidációval vagy proteolitikus hasítással megvédjük.

A stabilizátorok egyik csoportjába a reverzibilis proteázinhibitorok tartoznak, mint például a benzamidin-hidroklorid és a leupeptin, melyeket erre a célra alakítottak ki. Gyakran a következőket használják: borax, bórsavak, boronsavak, ezek sói és észterei, mindenekelőtt aromás csoportokkal alkotott származékaik, mint például ortoszubsztituált [WO 95/12655 A1 számú szabadalmi bejelentés], metaszubsztituált [WO 92/19707 A1 számú szabadalmi bejelentés], paraszubsztituált [5.972.873 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés] fenil-boronsavak, előnyösek ezek sói vagy észterei is. A WO 98/13460 A1 számú szabadalmi bejelentésben és az EP 583534 B1 számú szabadalmi bejelentésben peptidaldehidet tettek közzé, azaz C-terminálisán redukált oligopeptidet, és ezek 2-50 monomeres változatait a mosó- és tisztítószer-proteázok reverzibilis gátlásához. A reverzibilis proteázinhibitorok közé tartoznak az ovomukoid néven ismert anyagok [WO 93/00418 A1 számú szabadalmi bejelentés]. Például a WO 00/01826 A2 számú szabadalmi bejelentésben specifikus, reverzibilis peptidinhibitorokat tettek közzé, melyek a proteázokat tartalmazó szerekben a szubtilizinproteázt gátolják, és ez megfelel a WO 00/01831 A2 számú szabadalmi bejelentésben közzétett proteázból és inhibitorból álló fúziós fehérjének.

A további közismert enzimstabilizátorok a következők: amino-alkoholok, mint például mono-, di-, trietanol- és propanol-amin és ezek keverékei, alifás karbonsavak tizenkét szénatomig, mint például ahogy az a EP 378261 B1 és WO 97/05227 A1 számú szabadalmi bejelentésekből ismert, így borostyánkősav, más dikarbonsavak és a megnevezett savak sói. A DE 19650537 A1 számú szabadalmi bejelentés erre a célra végcsoportjában zárt zsírsav-amid-alkoxilátokat tett közzé. Az alkotóelemként alkalmazott bizonyos szerves savakat a szakirodalomban közzétették [WO 97/18287 A1 számú szabadalmi bejelentés], melyet az adagolt enzim stabilizálására alkalmaztak.

HU 225 362 Β1

Az alacsonyabb rendű alifás alkoholok, valamint mindenekelőtt a poliolok, mint például a glicerin; etilénglikol, propilénglikol vagy szorbit gyakran alkalmazott enzim stabilizátorok. Éppen így kalciumsókat is használhatunk, mint például kalcium-acetátot, vagy az EP 028865 B2 számú szabadalmi bejelentésben leírt kalcium-formiát, és magnéziumsókat, különböző polimereket [EP 378262 B1 számú szabadalmi bejelentés].

A szakirodalomban közzétették a poliamidoligomereket [WO 99143780 A1 számú szabadalmi bejelentés] vagy polimer vegyületeket, mint például lignint [WO 97/00932 A1 számú szabadalmi bejelentés], vízoldékony vinilkopolimereket [EP 828762 B1 számú szabadalmi bejelentés] vagy a következőket [EP 702712 B1 számú szabadalmi bejelentés]: cellulóz-éter, akrilpolimer és poliamid, mely enzimkészítmények az enzimek előállításához a fizikai hatások vagy a pH-érték ingadozásai ellen stabilizátorként szolgálnak.

A poliamin-N-oxid-tartalmú polimer [EP 587550 B1 és EP 581751 B1 számú szabadalmi bejelentések] egyszerre enzimstabilizálóként és színátvivő képesség gátlójaként használható. A további polimer stabilizátorokat a szakirodalomban közzétették [WO 97105227 A1 számú szabadalmi bejelentés] más alkotórészek mellett, kiegészítve lineáris, C₈-C₁₈-polioxilkalkilénekkel. Az alkil-poliglükozidok, ahogy azt a WO 97/43377 A1 és WO 98/45396 A1 számú szabadalmi bejelentésekben közzétették, a találmány szerinti szerek enzimatikus komponenseit stabilizálják, és ezzel teljesítményüket fokozzák. A hálózatos N-tartalmú vegyületek [WO 98117764 A1 számú szabadalmi bejelentés] kettős funkciót töltenek be, így földet kiűző szernek és enzimstabilizátornak tekintik. A hidrofób nemionos polimerek más stabilizátorokkal együtt a WO 97/32958 A1 számú szabadalmi bejelentés szerint a cellulázokat stabilizálják, így ilyen és hasonló szerek a találmány szerinti szer enzimével is szerepelhetnek.

A redukálószerek és az antioxidánsok, ahogy azt a szakirodalomban többek között leírták [EP 780 468 számú szabadalmi bejelentés], az enzimeket az oxidatív szétesés ellen stabilizálják. A kéntartalmú redukálószerek a szakirodalomból ismertek [EP 0 080 748 és EP 0 080 223 számú szabadalmi bejelentések]. További példák a nátrium-szulfit [EP 533 239 számú szabadalmi bejelentés] és a redukálócukrok [EP 656 058 számú szabadalmi bejelentés].

A stabilizátorok sokféle kombinációja alkalmazható, például poliolokból, bórsavból és/vagy boraxból álló kombinációk [WO 96/31589 számú szabadalmi bejelentés], bórsavból vagy bóráiból, redukálósókból és borostyánkősavból vagy más dikarbonsavakból álló kombinációk [EP 126 505 számú szabadalmi bejelentés] vagy bórsavból más borátokból poliolokkal vagy poliaminvegyületekkel és redukálósókkal adott kombinációk [EP 080 223 számú szabadalmi bejelentés]. A peptid-aldehid stabilizátorok hatása a WO 98/13462 számú szabadalmi bejelentés szerint bórsavval kombinációban és/vagy bórsavszármazékokkal és poliolokkal kombinációban fokozható és kalciumionok hozzáadásával ez tovább fokozható [WO 98/13459 számú szabadalmi bejelentés].

A stabilizált enzimaktivitású szerek a találmány előnyben részesített megvalósítási formájába tartoznak. Különösen előnyös olyan enzimekkel, melyek több, fentiekben ismertetett módon stabilizáltak.

Mivel a találmány szerinti szer minden elképzelhető formában ajánlható, ezért a találmány szerinti enzimet, előnyösen fehérjét a mindenkori szerbe adáshoz célirányosan, a találmány megvalósítási formájának megfelelően kiszerelt formában állítjuk elő. Idetartoznak a folyékony, szilárd, szemcsézett vagy kapszulaformák.

A kapszulázott forma az enzim és a többi alkotórészek, mint például fehéritőszerek védelmére vagy szabályozott kibocsátására szolgálhat. A kapszula mérete alapján megkülönböztetünk midi-, mikro- és nanokapszulákat, ahol az enzimek részére különösen a mikrokapszulák felelnek meg. Ilyen kapszulákat a szakirodalomban leírtak [WO 97/24177 és DE 199 18 267 számú szabadalmi bejelentés]. Egy további kapszulázási eljárásban a mosó- és tisztítószerekhez megfelelő enzimeket az enzimoldattal a keményítőt vagy a keményítőszármazékot tartalmazó oldatból keményítőbe, előnyösen keményítőszármazékba kapszulázzuk. A szakirodalomban ilyen kapszulázási eljárást leírtak [WO 01/38471 A1 számú szabadalmi bejelentés: „Verfahren zűr Herstellung von mikroverkapselten Enzymen”].

A fehérjék szilárd szernél például szárított, szemcsézett, kapszulázott, vagy kapszulázott és végül szárított formába helyezhetők. Lehetnek elkülönítetten, azaz fázisonként, vagy más alkotórészekkel együtt azonos fázisban, kompartmentalizáltan vagy anélkül végzett hozzáadással. A mikrokapszulázott enzimeket a szilárd formában úgy kell kialakítani, hogy a víz a jelenlegi technikákkal a vizes oldatokból eltávolítható legyen, például porlasztással, centrifugálással vagy oldószer-mentesítéssel. Az ily módon kapott részecskék átlagmérete 50 és 200 μίτη között található.

A találmány szerinti szerekben az enzim és a találmány szerinti fehérje is, folyékony, gélformáló vagy pasztás kiszerelésben is előfordulhat, ami a technika mai állása szerinti eljárással nyert fehérjéből indul ki, és az elkészítés koncentrált vizes vagy nemvizes oldatban, például folyékony formában, folyadékként, szuszpenzióként vagy emulzióként történik, de lehet gél formában is, vagy kapszulázott szárított porként is adagolni. Az ilyen találmány szerinti mosó- és tisztítószereket folyadékként a szokásos oldószerekkel együtt rendszerint az alkotórészek egyszerű összekeverésével állítják elő, ahol az anyagba, vagy oldatként az automatikus keverőbe adható.

A primer mosási teljesítmény mellett a mosószerekben lévő proteázok további funkciókat is betölthetnek, az egyéb enzimatikus alkotórészeket proteolitikus hasítással aktiválhatják vagy megfelelő hatástartam után inaktiválhatják. Összehangolható szabályozó funkciók a találmány szerinti enzim esetében is lehetségesek. A találmány egyik megvalósítási formájában a fentieken kívül olyan szerek találhatók a proteázra érzékeny

HU 225 362 Β1 anyagból készített kapszulában, melyek például a találmány szerinti fehérjéket a megadott időpontban hidrolizálják, és így tartalmuk kiszabadul. Hasonló összehangolható hatás más többfázisú szereknél is elérhető.

A találmány egy további megvalósítási formájában olyan szereket állít elő a textil nyersanyagok kezeléséhez vagy a textil kezeléséhez, mely azzal jellemezhető, hogy magukban vagy együtt más aktív alkotórészekkel a fentiekben leírt proteolitikus enzimek egyikét tartalmazzák, különösen természetes rostos textíliáknál és különösen gyapjú és selyem esetében.

A természetes rostok, mint például a gyapjú vagy selyem, jellegzetes mikroszkópos felépítéssel rendelkeznek. Az eljárások például a gyapjú szakirodaimában leírtaknak megfelelően végezhetők [Breier: Melliand Textilberichte, 1.4. 263 (2000)], de ez hosszan tartó kedvezőtlen hatásokhoz, így összecsomózódáshoz vezet. Az ilyen hatások elkerülésére a természetes nyersanyagokat a találmány szerinti szerrel kezeljük, mely például hozzájárul, hogy a fehérje felépítésében az uralkodó pikkelyes felszíni struktúrák elsimuljanak, és ezzel összecsomózódásuk ellenében hatnak. Egy különösen előnyben részesített megvalósítási formában olyan szereket állítunk elő, melyek a rostok, a természetes alapú textíliák és különösen a gyapjú vagy a selyem feldolgozásában alkalmazhatók.

Az egyik előnyben részesített megvalósítási formában a proteázt tartalmazó szert úgy dolgoztuk ki, hogy a szokásos kezelési anyagok alkalmazhatók, például amit a mosófolyamatban alkalmazunk, vagy az után, függetlenül attól, hogy a mosáskor már alkalmaztuk. A kívánt hatás a textíliák felületi struktúrájának elsimítására, és/vagy a szövetek károsodásának megelőzésére és/vagy csökkentésére irányul.

A találmány egyik megvalósítási formájában a textíliák vagy a szilárd felületek gépi tisztításához eljárást biztosítunk, mely azzal jellemezhető, hogy a találmány szerinti proteolitikus enzim legalább az egyik eljárási lépésben aktív.

A textíliák gépi tisztításának eljárásait általánosságban azzal jellemezhetjük, hogy több eljárási lépésben különböző tisztításban aktív anyagot alkalmazunk a tisztítandó dolgon, és a hatásidő után lemossuk, vagy hogy a tisztítandó dolgot egyéb módon a tisztítószerrel vagy ennek oldatával kezeljük. Ez igaz a gépi tisztítások eljárásaira is, mindenekelőtt egyéb anyagokra, így azokra a textíliákra, melyeket kemény felszíneken összefognak. Az ilyen eljárások legalább egy eljárási lépésben a találmány szerinti fehérjével gazdagíthatok, és ezek a találmány megvalósítási formáit jelentik.

Az előnyben részesített eljárásban a találmány szerinti enzim mennyisége alkalmanként 40 pg-4 g, és előnyösen 50 pg-3 g, 100 pg-2 g, 200 pg-1 g és különösen előnyösen 400 pg-400 mg.

Mivel a találmány szerinti enzim fehérjeoldó képességgel már rendelkezik, és ezt a közegben fejti ki, másképpen tisztítóereje nincs, mint például a fenékpufferben, ezért a textíliák gépi tisztításánál az ilyen eljárás egyik részlépése az lehet, hogy a kívánt esetekben a stabilizálóvegyületek mellett sók vagy pufferanyagok alkalmazhatók, a találmány szerinti enzim egyedüli tisztításban aktív komponenseként. Ez a találmány különösen előnyben részesített megvalósítási formáját jelenti.

A találmány egyik előnyben részesített megvalósítási formájában a textil nyersanyagok kezeléséhez vagy textilkezeléshez eljárást biztosítunk, mely azzal jellemezhető, hogy a találmány szerinti proteolitikus enzim legalább az egyik eljárási lépésben aktív. Ez például olyan eljárással érhető el, melynél a textíliákat a feldolgozásához előkészítjük, mintegy az anticsomósodás ellen, vagy például olyan eljárással, mely a bevitt textíliák tisztítását a kezelő komponensben gazdagítja. A proteázok fentiekben leírt hatása ellen a kijelölt szövetet az előnyben részesített megvalósítási forma szerint kezeljük, Így a textil nyersanyagot vagy a természetes alkotójú textil nyersanyagot, különösen a gyapjút és selymet.

A találmány egyik sajátos tárgykörében a találmány szerinti proteolitikus enzimeket textíliák vagy kemény felületek tisztításához állítjuk elő. így a találmány szerinti enzimek különösen a fentiekben leírt eljárásokban a textíliák és a szilárd felszínek fehérjetartalmú szennyeződéseinek eltávolítására szolgálnak. Az előnyben részesített megvalósítási formákban a találmány a gépi eljárásokon kívül például a háztartási mosásokkal vagy a textíliák foltjainak kézi eltávolításával vagy szennyezett felületek tisztításával foglalkozik.

Az előnyben részesített eljárásban a találmány szerinti enzim mennyisége alkalmanként 40 pg-4 g, és előnyösen 50 pg-3 g, 100 pg-2 g, 200 pg-1 g és különösen előnyösen 400 gg-400 mg.

A találmány ilyen tárgyköreinek egyik előnyben részesített megvalósítási formája a találmány szerinti proteolitikus enzimek alkalmazásával foglalkozik, ami a mosó- és tisztítószerek alkotórészeinek aktiválására vagy deaktiválására szolgál. Ahogy az ismeretes, a mosó- és tisztítószerek fehérjealkotói proteázokkal inaktiválhatók. Ezeket egyébként inkább nem kívánt hatások megcélzására adagolták, mégis a találmány tárgykörébe tartoznak. Az is lehetséges, hogy először egy másik komponenst proteolízissel aktiválnak, amikor tulajdonképpen a hibrid fehérje, enzimből és ennek megfelelő inhibitorból áll, ahogy azt a szakirodalomban leírták [WO 00/01831 A2 számú szabadalmi bejelentés]. Egy további példa az ilyen szabályozásra vonatkozik az aktív komponens enzimaktivitásának védelmére, ami szabályozáshoz kapszulába zártan fordul elő, amikor is hatását a proteolízis megkezdésével fejti ki. A találmány szerinti fehérjék így inaktiválási, aktiválási és felszabadulási reakciókban alkalmazhatók.

A továbbiakban a mosó- és tisztítóproblematika technikai eljárásain, alkalmazásain és a hozzá tartozó szerein kívül, az összes többi eltérést a találmány tárgykörének megfelelően összegezzük, amennyiben azokat a találmány szerinti fehérjék határozzák meg. Ezt az összeállítást nem tekintjük végleges felsorolásnak, hanem csak a legfontosabbakat állítottuk össze, melyeket jelenleg a találmány szerinti proteázok adagolásából felismertünk. Kiderülhet, hogy további tech29

HU 225 362 Β1 nikai területeken a találmány szerinti proteázok alkalmazásával tovább fejleszthetők, így ezek az oltalmi körök a találmányba tartoznak.

A találmány tárgyköreinek egyik megvalósítási formája a találmány szerinti enzimek alkalmazásaira vonatkozik, melyeket a biokémiai vagy molekuláris biológiai analízisekben felhasználhatunk, különösen enzimatikus analízis eljárások keretében. A találmány és a szakirodalom szerint [Römpp, „Lexikon Chemie” (Version 2.0, Stuttgart/ New York: Georg Thieme Verlag, (1999)] enzimatikus analízis alatt minden olyan biokémiai analitikai műveletet értünk, mely specifikus enzimet vagy szubsztrátot kezel, egyrészről a szubsztrát azonosítására, vagy koncentrációjának megállapítására, másrészről az enzim azonosítására vagy koncentrációjának kiderítésére. Az alkalmazási területek az összes biokémiai alkalmazásokra kiterjednek. Ezen tárgykör egyik előnyben részesített megvalósítási formája a szekvenciaanalízis keretében végzett végcsoport-meghatározásra vonatkozik.

A tárgykör egy további megvalósítási formája a találmány szerinti proteolitikus enzimek alkalmazására vonatkozik, a természetes anyagok vagy a biológiailag értékes anyagok előállításához, (gy a természetes anyagok vagy biológiailag értékes anyagok tisztítási folyamatában jelentős lehet a fehérje szennyezésektől való megszabadításnál. így például a kis molekulatömegű vegyületek, az összes sejtalkotó, vagy a raktározóanyagok kezelésére használható. Ez mind laboratóriumi méretekben, mind ipari méretekben, például értékes anyagok biotechnológiai előállításában végrehajtható.

A találmány szerinti proteolitikus enzimek felhasználása a fehérjék vagy kis molekulatömegű vegyületek szintézisénél a természetes katalitikus reakció átalakító képessége alapján valósul meg, például amikor fehérjefragmenseket kell összekapcsolnunk, vagy amikor a nem túlsúlyban lévő, fehérjéből álló vegyület aminosavait össze kell kapcsolni. Az ilyen alkalmazási lehetőségeket a szakirodalomban javasolták [EP 380362 A1 számú szabadalmi bejelentés].

A találmány ezen tárgykörének egy további megvalósítási formája a találmány szerinti proteolitikus enzimekkel a természetes nyersanyagok kezelését biztosítja, amikor ezeket fehérje szennyezőiktől kell megszabadítani. Elsősorban idetartoznak a mikrobiológiai szennyeződéseket nem tartalmazó nyersanyagok, melyeken itt mezőgazdasági eredetűeket értünk.

Az egyik előnyben részesített megvalósítási forma a felületi kezelések alkalmazására, és különösen a gazdasági jelentőségű bőr nyersanyagok kezelésére vonatkozik. így a cserzési eljárások folyamatában, különösen a lúgos puhításnál [Römpp, „Lexikon Chemie”, Version 2.0, Stuttgart/ New York: Georg Thieme Verlag, (1999)] a vízben oldódó fehérjék proteolitikus enzimek segítségével a bőranyagból kioldhatók. Ehhez a találmány szerinti proteázok alkalmazhatók, különösen lúgos körülmények között és denaturálószerek jelenlétében.

A tárgykör további megvalósítási formája a találmány szerinti proteolitikus enzimek alkalmazására vonatkozik, amennyiben azokat a textíliák előállításához a nyersanyagok kinyerésénél vagy kezelésénél, vagy a köztitermékek kialakításánál használják fel. Erre egy példa a gyapot feldolgozása, ahol a lesimításnak nevezett folyamatban a tok alkotórészeitől meg kell szabadulni, egy másik a gyapot kezelése; de hasonló érvényes a nyersselyemre is. Az enzimatikus eljárások összevethetők a kémiaiakkal, különösen a környezeti összeegyeztethetőségük tekintetében.

Az egyik előnyben részesített megvalósítási formában a találmány szerinti fehérje felhasználható a textíliák védőrétegénél, különösen a közti- vagy az értékes termék eltávolításánál, vagy a felületeik lesimításában, mielőtt egy következő feldolgozási lépésben ezeket tovább alakítják.

A találmány ezen tárgykörének egy további megvalósítási formája a találmány szerinti proteolitikus enzimek felhasználását a textil nyersanyagok kezelésénél érvényesíti, különösen a gyapjú vagy selyem vagy más főleg selymet tartalmazó kevert textíliák felszínének kezelésénél. Ez érvényes mind az ilyen textíliák előállítására, mind a használat során ezek gondozására, például a textíliák tisztításával összefüggésben (lásd fent).

A találmány ezen tárgykörének egy további megvalósítási formája a találmány szerinti proteolitikus enzimek felhasználását a fotófilmek kezelésénél érvényesíti, különösen a zselatint tartalmazó vagy hasonló védőrétegek eltávolításánál. Az ilyen védőrétegek, különösen az ezüstsókat tartalmazó zselatinemulziók a filmeken találhatók, mint például a röntgenfilm egyik rétege, melyet a hordozóanyag megvilágítása után el kell távolítani. Az itt uralkodó lúgos vagy gyengén denaturáló reakciókörülmények miatt a találmány szerinti proteázok különösen jól alkalmazhatók.

A találmány ezen tárgykörének egy további megvalósítási formája a találmány szerinti proteolitikus enzimek felhasználását élelmiszerek vagy takarmányok előállításánál érvényesíti. így a proteázok az élelmiszerek előállításában, azok megváltoztatásában alkalmazhatók. Erre példák a sajtok érési folyamatában vagy más tejtermékek kialakításában végzett alkalmazások. Az ilyen folyamatok a találmány szerinti fehérjével gazdagíthatok, vagy ezekkel teljes egészében végrehajthatók. A nem táplálkozási célú szénhidrátot tartalmazó élelmiszereknél vagy élelmiszer-nyersanyagoknál, mint például a liszt vagy a dextrin, a szóban forgó proteázok a kísérőfehérjék eltávolítására is felhasználhatók. A találmány szerinti proteázok az ilyen felhasználásokhoz is megfelelnek, különösen abban az esetben, amikor ezek lúgos vagy gyengén denaturáló körülmények között történnek.

Ez érvényes a takarmányok előállítására is. Itt a teljes fehérjementesítés mellett az is érdeklődésre tarthat számot, hogy a fehérjét tartalmazó kiindulási anyagot vagy anyagkeveréket a proteázokkal csak kis ideig kezelik, azért, hogy a háziállatok számára könnyebben emészthetővé tegyék.

A találmány ezen tárgykörének egy további megvalósítási formája a találmány szerinti proteolitikus enzimek felhasználását kozmetikai célra érvényesíti. Az

HU 225 362 Β1 igény a találmány szerinti proteolitikus enzimeket tartalmazó kozmetikai szerekre, eljárásokra is kiterjed, melyek a találmány szerinti proteolitikus enzimeket alkalmazzák kozmetikai célokra, különösen az ehhez megfelelő eljárásban vagy szerekben.

Mivel a proteázok az emberi bőr sejtmegújulási folyamatában is szerepet játszanak (dezkvamáció), ezért ezek meghatározó szerepét a szakirodalomban leírták [Egelrud és munkatársai: Acta Derm. Vénéről., 71, 471-474 (1991)]. Ennek megfelelően a proteázok a bőrápoló szerekben bioaktív anyagként felhasználhatók, a száraz bőr leépülésekor a dezmoszómastruktúrák gyarapításával védelmi célra [WO 95/07688 A1 vagy WO 99/18219 A1 számú szabadalmi bejelentés]. A szubtilizinproteázok kozmetikai célra való alkalmazását, különösen a Bacillus lentus alkalikus proteáz változatokét a szakirodalomban leírták [WO 97/07770 A1 számú szabadalmi bejelentés]. A találmány szerinti proteázok is, különösen a mutagenezissel kialakított változatok, vagy amelyek aktivitása megfelelő növekedésre ható anyagokkal szabályozhatók, bőr- vagy hajtisztító- vagy -ápoló szerekbe adagolhatok. Különösen előnyösek azok az enzimkészítmények, melyek ahogy azt a fentiekben leírtuk, például makromolekuláris hordozóhoz kapcsolva stabilizáltak [5.230.891 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés] és/vagy a nagyon allergén régiókban pontmutációval megváltoztatott származékok, mellyel az emberek számára nagyobb bőrtűrést biztosít.

Ennek megfelelően a proteolitikus enzimek alkalmazása kozmetikai célra is a találmány oltalmi körébe tartozik, különösen a megfelelő szerekben, mint például sampon, szappan, vagy vizek, vagy ápolószerek, melyek például krém formában ajánlhatók. Ezek a bőrrétegeket eltávolító gyógyszerekben is alkalmazhatók, ezek szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak.

3-metil-3-metoxi-butanol, propilénglikol-t-butil-éter, valamint ezek elegyei.

A találmány szerinti folyékonygél-képző mosó- és tisztítószerekben az oldószer mennyisége 0,1-20 tömeg⁰/), előnyösen 15 tömeg%-nál kevesebb, és előnyösebben 10 tömeg%-nál kevesebb.

A találmány szerinti összetételek viszkozitásának beállítására töményítőszert, illetve töményítő rendszert adagolunk. Ezek a nagy molekulatömegű anyagok, melyek duzzasztószerként ismertek, a folyadékot beszívják és megduzzadnak, és így végül sűrűn folyó valódi vagy kolloid oldatot alakítanak ki.

A megfelelő töményítőszer szervetlen vagy szerves polimer vegyület. A szervetlen töményítőszerek közé számítanak például a polikieselsavak, agyagásványok, mint például zeolit, kieselsavak és a bentonit. A szerves töményítőszerek a természetes polimerekből vezethetők le, melyek változtatható természetes polimerek és teljesen szintetikus polimerek lehetnek. Az ilyen természetes eredetű polimerek példái a következők: agaragar, carrageen, tragantmézga, gumiarábikum, alginát, pektin, poliozok, guarliszt, jánoskenyérfa magjának lisztje, keményítő, dextrin, zselatin és kazein. A változtatható természetes anyagok, melyek töményítőszerként alkalmazhatók, mindegyike a keményítők és a cellulózok módosított változatai. Például a következők ismertek: karboxi-metil-cellulóz és más cellulóz-éterek, hidroxi-etil- és -propil-cellulóz, valamint a maglisztéter. A teljesen szintetikus töményítőszerek példái a következők: polimerek, mint például poliakrilés polimetakrilvegyületek, vinilpolimerek, polikarbonsavak, poliéterek, poliiminek, poliamidok és poliuretánok.

A kész összetételre vonatkoztatva a töményítőszerek mennyisége 5 tömeg%, előnyösen 0,05-2 tömeg⁰/), és legelőnyösebben 0,1-1,5 tömeg%.

A találmány szerinti mosó- és tisztítószerek adott esetben további szokásos alkotórészeket tartalmazhatnak: kibocsátószereket, elektrolitokat és további segédanyagokat, mint például optikai derítőszereket, fakulásgátló anyagokat, ezüstkorrózió-gátlókat, színváltozást gátló anyagokat, habgátlókat, dörzsanyagokat, színanyagokat és/vagy illatanyagokat, valamint mikrobiális hatóanyagokat és/vagy UV-abszorbeáló anyagokat.

A találmány szerinti textíliákat mosó szereket optikai derítőkkel, a diamino-sztilbéndiszulfonsav-származékokkal, illetve ezek alkálifémsóival egészíthetjük ki. Megfelel például a 4,4’-bisz(2-amino-4-morfolino-1,3,5-triazinil-6-amino)-sztilbén-2,2’-diszulfonsav sója, vagy ezzel egyenértékű vegyület, ahol a morfolinocsoport helyett dietanol-amino-csoport, metil-amino-csoport, anilinocsoport vagy 2-etoxi-etil-amino-csoport található. A további derítők típusai lehetnek a szubsztituált difenil-sztirilek, például a 4,4’-bisz(2-szulfosztirilj-difenilek, a 4,4’-bisz(4-klór-3-szulfosztiril)-difenilek, vagy a 4-(4-klór-sztiril)-4’-(2-szulfosztiril)-difenilek alkálisói. Az előzőekben megnevezett optikai derítők elegyei is alkalmazhatók.

A szürkülésgátló anyagok feladata a textilrostokról lemosott szennyeződés szabadon úszó fázisba juttatása és ott tartása. Ide vízben oldódó kolloidok, legtöbbször természetes eredetű anyagok felelnek meg, mint például keményítő, enyv, zselatin, keményítő, cellulóz éterkarbonsavainak vagy éterszulfonsavainak sói vagy a cellulóz vagy keményítő kénsavészterei. A vízben oldható savas csoportú poliamidok erre a célra alkalmazhatók. Továbbá a fentiekben megnevezett keményítőszármazékok, mint például az aldehidkeményítők is felhasználhatók. Az előnyben részesített cellulózéterek a következők: karboxi-metil-cellulóz (Na-só), metil-cellulóz, hidroxi-alkil-cellulóz és kevert éterek, mint például metil-hidroxi-etil-cellulóz, metil-hidroxi-propil-cellulóz, metil-karboxi-metil-cellulóz és ezek keverékei, például a szerre vonatkoztatva 0,1-5 tömeg%-ban.

Az ezüstkorrózió-védelem érdekében a találmány szerinti tisztítószerekben edény-ezüstkorróziógátlókat alkalmazunk. Ezek a szakirodalomban jártas szakemberek számára ismertek, ilyen például a benzotriazol, a vas(lll)-klorid vagy a CoSO₄. A szakirodalomból ismert [EP 0 736 084 B1 számú szabadalmi bejelentés] az is, hogy az enzimek mangán-, titán-, cirkónium-, hafnium-, vanádium-, kobalt- vagy cériumsóival és/vagy komplexeivel együtt jól használhatók ezüstkorrózió elleni védelemre, ahol a megnevezett fémek II, III, IV, V vagy VI oxidációs fokúak. E vegyületekre példák a MnSO₄, V2O5, V₂O₄, VO₂, TiOSO₄, K₂TiFg, Kr₂ZrFe₆, Co(NO₃)₂, Co(NO₃)₃, valamint ezek keverékei.

A „földet kiűző” hatóanyagok vagy a „földet kitaszító” anyagok főleg polimerek, melyek mosószerben való használatukkor a fehérneműrostoknak szennytaszító tulajdonságot kölcsönöznek, és/vagy a szokásos mosószer alkotórészek szennyleoldó képességét támogatják. Hasonló hatás érhető el tisztítószerekben alkalmazva a szilárd felületeken is.

Különösen hatékonyak és már régóta ismertek a földet kitaszító hatóanyagok, melyek a dikarbonsavak-, alkilénglikol- és polialkilénglikol-egységek kopoliészterei. Ide például a polietiléntereftalát és a polietilénglikol kopolimerei vagy kevert polimerei tartoznak [DT 16 17 141, és DT 22 00 911 számú szabadalmi bejelentések]. A szakirodalomban [DT 22 53 063 számú szabadalmi bejelentés] savas szerek ismertek, melyek többek között dibázisos karbonsavak és alkilén- vagy cikloalkilénpoliglikolt tartalmaznak. Ismeretesek etiléntereftalát és polietilén-oxid-tereftalát polimerek, melyeket mosószerekben alkalmaznak [DE 28 57 292, DE 33 24 258 és EP 0 253 567 számú szabadalmi bejelentések], Az EP 066 944 számú szabadalmi bejelen23

HU 225 362 Β1 tés olyan szerre vonatkozik, mely etilénglikol, polietilénglikol, aromás dikarbonsavak és szulfonált aromás dikarbonsavak meghatározott arányú kopoliésztereit tartalmazza. A szakirodalomban [EP 0 185 427 számú szabadalmi bejelentés] ismertek végükön metil- vagy etilcsoportokat tartalmazó poliészterek etilén- és/vagy propiléntereftalát- és polietilén-oxid-tereftalát-egységekkel, és olyan mosószerek, melyek az ilyen földet kitaszító polimert tartalmazzák. Az EP 0 241 984 számú szabadalmi bejelentés poliészterre vonatkozik, mely az oxi-etilén-csoportok és a tereftálsavegységek mellett szubsztituált etilénegységeket, valamint glicerinegységeket tartalmaz. A szakirodalomból [EP 0 241 985 számú szabadalmi bejelentés] ismert olyan poliészter, mely az oxi-etilén-csoportok és tereftálsavegységeken kívül 1,2-propilén-, 1,2-butilén- és/vagy 3-metoxi-1,2propilén-csoportokat, valamint glicerinegységeket tartalmaz, és láncai C-|-C₄ alkilcsoportokkal záródnak. A szakirodalomból [EP 0 272033 számú szabadalmi bejelentés] ismeretesek C₁—C₄-alkil- vagy acilcsoporttal zárt poliészterek, melyek polipropiléntereftalát- és polioxi-etilén-tereftalát-egységeket tartalmaznak. Az EP 0 274 907 számú szabadalmi bejelentés szulfoetil-végcsoporttal zárt tereftaláttartalmú földkibocsátó poliésztert ismertet. Az EP 0 357 280 számú szabadalmi bejelentés szerint a földkibocsátó poliészterek előállíthatok telítetlen végcsoportos szulfonálással tereftalát-, alkilénglikol- és poli-C₂_₄-glikol-egységek segítségével. A WO 95/32232 számú szabadalmi bejelentés aromás szennyleoldó képességű poliészterekre vonatkozik. A szakirodalomból [WO 97/31085 számú szabadalmi bejelentés] ismert, hogy a pamuthoz nincs olyan többfunkciós csoportot tartalmazó polimer, mely földkitaszító hatású lenne. Az első egység például kationos lehet a pamut felületi adszorpciójához, elektrosztatikus kölcsönhatásban, és a második egység hidrofób területet alakít ki, mely a hatóanyag megmaradását biztosítja a pamut-víz határfelületen.

A találmány szerinti textíliákhoz használható szerekhez színfakulást gátló anyagok adagolhatok, elsősorban a következők: poli(vinil-pirrolidon), poli(vinil-imidazol), polimer N-oxidok, mint például poli-(vinil-piridin-N-oxid) és a vinil-pirrolidon vinil-imidazollal alkotott kopolimere.

A gépi tisztítóeljárásokhoz előnyös lehet a habgátlók alkalmazása. Habzásgátlóként alkalmasak például a természetes vagy szintetikus eredetű szappanok, melyek nagy része C₁₈-C₂₄-zslrsav. A megfelelő nem tenzidszerű habzásgátlók például a szerves polisziloxánok és ezek mikrofinom, adott esetben szilánozott kieselsavaival adott keverékei, valamint paraffin, viasz, mikrokristályos viasz és ezek keverékei szilánozott kieselsavakkal vagy bisztearil-etilén-diamiddal. A különböző habzásgátlók keverékei is előnyösen alkalmazhatók, mint például a szilikonokból, paraffinekből vagy viaszokból állók. Előnyösen a habzásgátlók, különösen a szilikon- és/vagy paraffintartalmú habzásgátlók, szemcsések, vízben oldódnak, illetőleg a hordozóanyaghoz kötötten diszpergálhatók. Különösen a paraffinekből és bisztearil-etilén-diamidekből álló keverékek előnyösek.

A találmány szerinti kemény felületek tisztítására alkalmas tisztítószerek dörzshatású alkotórészeket tartalmazhatnak, különösen a következő csoportokból: kvarcliszt, faliszt, műanyagliszt, kréta és mikroüveggömbök, valamint ezek keverékei. A dörzsanyagok a találmány szerinti tisztítószerekben előnyösen nem több mint 20 tömeg%-ban, előnyösebben 5-15 tömeg%-ban fordulnak elő.

A szín- és illatanyagokat a mosó- és tisztítószerekbe a termék esztétikai hatásának javítására adagolunk, és a felhasználó számára a termék „tipikus és összetéveszthetetlen” látványának, valamint érzetének biztosítására. Parfümolajként, illetőleg illatanyagként szaganyagvegyületeket, mint például észter, éter, aldehid, keton és szénhidrogén típusú szintetikus termékek alkalmazhatók. Az észter típusú illatanyag-vegyületek például a következők: benzil-acetát, a fenoxi-etil-izobutirát, p-terc-butil-ciklohexil-acetát, linalil-acetát, dimetilbenzil-karbanil-acetát, fenil-etil-acetát, linalil-benzoát, benzil-formiát, etil-metil-fenil-glicinát, allil-ciklohexil-propionát, sztiraliil-propionát és benzil-szalicilát. Az éterekhez számítanak például a benzil-etil-éter és az Ambroxan, az aldehidekhez számítanak például a 8-18 C-atomos lineáris alkanálok, citrál, citronellál, citronellil-oxi-acetaldehid, ciklámenaldehid, Lilial és Bourgeonal, a ketonok közé tartoznak például a Jonone, α-izometilionon és metil-cedrilketon, az alkoholok közé például az anetol, citronellol, eugenol, geraniol, linalool, fenil-etil-alkohol és a terpineol, a szénhidrogének közé főleg a terpének, mint például a limonén és Pinen tartoznak. Mégis előnyben részesítjük a különböző illatanyagok keverékeinek használatát, melyek közösen vonzó, egyéni illatot biztosítanak. Az ilyen parfümolajokat természetes illatanyag keverékekből is megkaphatjuk, mint például növényi forrásokból, így fenyő-, citrus-, jázmin-, Patchouly-, rózsa- vagy ilang-ilang-olajból. Hasonlóképpen alkalmasak a muskotályzsája-olaj, kamillaolaj, szegfűolaj, mézfűolaj, mentaolaj, fahéjlevélolaj, hársvirágolaj, borókaolaj, vetiveolaj, olibanumolaj, galbanumolaj és labdanumolaj, valamint narancsolaj, neroliol, narancshéjolaj és szantálfaolaj. Általában a találmány szerinti fehérítő- és színanyagok a teljes kiszerelés több mint 0,01 tömeg%-át, míg az illatanyagok legfeljebb 2 tömeg%-át alkothatják.

Az illatanyag közvetlenül a találmány szerinti szerbe beépíthető, de az is előnyös lehet, ha az illatanyagot a hordozóra hordjuk fel, mellyel a parfümök felületi tapadását a fehérneműn megerősítjük, és ezzel a textíliából hosszabb illatfelszabadulást érünk el. Az ilyen hordozóanyagok közé például a ciklodextrin választható, ahol a ciklodextrin-parfüm komplex pótlólagosan még további segédanyagokkal rétegezhető. Egy további illatanyag-hordozó a későbbiekben leírt zeolit X, melynek alkalmazása a tenzides keverékekkel és az illatanyagokkal egyaránt lehetséges.

Az előnyben részesített színanyagok, azok kiválasztása a szakirodalomban jártas szakemberek számára minden nehézség nélkül megtehető, melyek közül előnyös azok kiválasztása, melyek tárolási stabilitása és érzékenysége a szokásos alkotórészekhez ké24

HU 225 362 Β1 pest magas, és a textilrostokat érő fénnyel, valamint behatásokkal szemben ellenállóak, miközben nem színező hatásúak.

A mosó- és tisztítószerek a mikroorganizmusok ellen antimikrobiális hatóanyagokat tartalmazhatnak. Itt a hatásmechanizmus és spektruma alapján megkülönböztetünk bakteriosztatikus és baktericid anyagokat, fungisztatikumokat és fungicideket és így tovább. E csoport fontos anyagai például a következők: benzalkónium-klorid, alkil-aril-szulfonát, halogénezett fenol és fenol-merkuri-acetát. Az antimikrobiális hatás és az antimikrobiális hatóanyagok jelentése a találmányban a szakirodalomban jártas szakemberek számára nyilvánvaló [WallháuBer: Praxis dér Sterilisation, Desinfektion-Konservierung: Keimidentifizierung - Betriebshygiene (5. kiadás) Stuttgart; New York: Thieme, (1995)], melyben leírt összes antimikrobiális hatású vegyület alkalmazása a találmányban elképzelhető. A megfelelő antimikrobiális hatóanyagot előnyösen a következő csoportokból választjuk ki: alkoholok, aminok, aldehidek, antimikrobiális savak, illetőleg ezek sói, karbonsavészterek, savamidok, fenolok, fenolszármazékok, difenilek, difenil-alkánok, karbamidszármazékok, oxigén- és nitrogén-acetálok, valamint formiátok, benzamidin, izotiazolin, ftálimidszármazékok, piridinszármazékok, antimikrobiális felületaktív vegyületek, guanidin, antimikrobiális amfoter vegyületek, kinolinok, 1,2-dibróm-2,4-diciano-bután, jód-2-propil-butil-karbamát, jód, jodofórok, peroxovegyületek, halogénvegyületek, valamint az előzőek keverékei.

Az antimikrobiális hatóanyagokat a következők közül választhatjuk ki: etanol, n-propanol, i-propanol, 1,3-butándiol, fenoxi-etanol, 1,2-propilénglikol, glicerin, undecilénsav, benzoesav, szalicilsav, dihidroecetsav, o-fenil-fenol, N-metil-morfolin-acetonitril (MMA), 2benzil-4-klór-fenol, 2,2'-metilén-bisz(6-bróm-4-klór-fenol), 4,4'-diklór-2’-hidroxi-difenil-éter (Dichlosan), 2,4,4’-triklór-2’-hidroxi-difenil-éter (Trichlosan), klór-hexidin, N-(4-klór-fenil)-N-(3,4-diklór-fenil)-karbamid, N, N ’-(1,10-dekándiil-di-1 -pirid ini l-4-ilidén )-bisz( 1 -oktán-amin)-dihidroklorid, N,N’-bisz(4-klór-fenil)-3,12-diimino-2,4,11,13-tetraaza-tetradekándiimidamid, glukoprotaminok, antimikrobiális felületaktív kvatemer vegyületek, guanidinek, beleértve a bi- és poliguanidineket, mint például 1,6-bisz(2-etil-hexil-biguanido-hexán)-dihidroklorid, 1,6-di(N₁,N₁'-fenil-diguanido-N₅,N5’)-hexán-tetrahidroklorid, 1 .e-diíN^N^-fenil-N-i.N^-metil-diguanido-N₅,N5’)-hexán-dihidroklorid, 1 .e-diíN^N/o-klór-fenil-diguanido-N₅,N₅’)-hexán-dihodroklorid, 1,6-di(N₁,N₁’-2,6-diklór-fenil-diguanido-N₅,N₅’)-hexán-dihidroklorid, 1,6-di[Ni,N.,’-béta-(p-metoxi-fenil)-diguanido-N₅,N₅’]-hexán-dihidroklorid, l.e-diCN^Nl-alfa-metil-béta-fenil-diguanido-N₅,N₅’)-hexán-dihidroklorid, 1,6^1(^,N-f-p-nitro-fenil-diguanido-Ns.Ns’j-hexán-dihidroklorid, omega:omega-di(N₁,N₁’-fenil-diguanido-N₅,N₅’)-di-n-propil-éter-dihidroklorid, omega:omega'-di(N₁,N₁’-p-klór-fenil-diguanido-N₅,N₅')-di-n-propil-éter-tetrahidroklorid, 1,6-di(N·,, N ₃ ’-2,4-diklór-fenil-diguanido-N₅,N₅’)-hexán-tetrahidroklorid, 1,6-01(^,N-|’p-metil-fenil-diguanido-N₅,N₅’)-hexán-dihidroklorid,

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalikus proteáz, azzal jellemezve, hogy legalább egyszeresen stabilizált.

4. táblázat

Alapmosószer kiegészítve A B B. lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I/L211D 29,8 33,2 B. lentus alkalikus proteáz F49 26,3 22,4 Savinase® 12,5 12,0

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V99I/L211D tisztítási teljesítménye gépi mosogatógépben a többi vizsgált proteázhoz képest erősebb, de legalábbis egyenrangú; és ez már kisebb mennyiségben is nagyobb aktivitást jelent.

4. példa

Az edényeket, melyek felszíne szilárd és fényes, standardizáltan szennyeztünk: (A) tojásfehérje és (B) tojás/tej, majd háztartási mosogatógépben öblítettük 45 °C-on normálprogrammal (Typ Miele® G 676). Az öblítőprogramhoz 20 g öblítőszert használtunk, ahol a víz keménysége 16 német fok.

Öblítőszerként, melyeket az alaprecepttel alkalmaztunk, a következő összetételű szert használtunk (tömegszázalékban): 55% nátrium-tripolifoszfát (vízmentesre számoltuk), 4% amorf nátrium-diszilikát (vízmentesre számoltuk), 22% nátrium-karbonát, 9% nátrium-perborát, 2% TAED, 2% nemionos tenzid, a maradék a következő: víz, színanyag, parfüm. Ehhez az alaprecepthez különböző proteázokat adtunk: Bacillus lentus alkalikus proteáz F49, Savinase®, előnyösen a találmány szerinti Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V99I/L211D változatot, ezeket minden esetben az öblítőprogramba 10 000 PE-ben adtuk. Ez grammonként megfelel körülbelül 0,1 mg proteázfehérje per tisztítószer koncentrátumnak.

Az öblítés után a szennyezéseltávolítást gravimetriásán értékeltük és százalékban adtuk meg. Ehhez a szennyezett és a kiöblített edény súlykülönbségét és az edény kiindulási súly és a nem kiöblített edény súlyának különbségét a kiindulási súlyhoz viszonyítva meghatároztuk. Ezeket a viszonyokat százalékban fejeztük ki. A kapott eredményeket a 4. táblázatban állítottuk össze. Itt kilenc mérés átlagát tüntettük fel. Ezek közvetlen visszakövetkeztetést tesznek lehetővé a kapott enzim vonatkozásában az alkalmazott szer mosási teljesítményére.

4-helyen szubsztituáltak. Továbbá a szubsztituált benzotriazolok is alkalmazhatók, melyek 3-pozícióban fenilszubsztituált akrilátok, (fahéjsavszármazékok, adott esetben a 2-pozícióban cianocsoportokkal), valamint a szalicilátok, szerves Ni-komplexek, valamint természetes anyagok, mint például umbelliferon és testsaját urokánsavak. Különös jelentőséggel bírnak a bifenil- és mindenekelőtt a sztilbénszármazékok, melyeket a szakirodalomban leírtak [EP 0728749 számú szabadalmi bejelentés] és a kereskedelemben Tinosorb® FD vagy Tinosorb® FR ex Ciba márkanéven megvásárolhatók. UV-B-abszorbeáló anyagként a következőket nevezzük meg: 3-benzilidén-kámfor, illetve 3-benzilidén-norkámfor és ezek származékai, például

4. pozícióban (megfelel a 3. pozíciónak) természetes körülmények között T van, ezért legfeljebb a 3T, 1911 és a 211D változatokat javasolták a szóban forgó bejelentésben.

Végül a Bacillus subtilis-bő\ származó bacillipeptidáz F-et említjük még meg, mely 61. és 199. pozíciójában természetes körülmények között alanin és izoleucin aminosavak találhatók. Ez azonban csak kismértékű hasonlóságot mutat a találmány szerinti proteázváltozatokkal: aminosavszinten a homológia értéke csupán 30%, előnyösen 38%-os azonosságot állapítottak meg. Ezek az enzimek a fentiekben említett munkákban [Siezen és munkatársai] megtalálhatók, de ezek használatát mosó- és tisztítószerekben nem említik, valamint ezeket nem védik.

A megfelelő proteázok további technikai alkalmazását, különösen mosó- és tisztítószerekben, a szakirodalomban közzétették [EP 199404 A2, EP 251446 A1, WO 91/06637 A1 és WO 95/10591 A1 számú szabadalmi bejelentések], melyek mint proteáz A, proteáz B, proteáz C, illetőleg proteáz D ismertek (Procter & Gamble Comp., Cincinnati, OH, USA). Az EP 199404 számú szabadalmi bejelentés proteázai különböző BPN’-változatok, melyek EP 130756 A1 számú szabadalmi bejelentésen alapulnak (lásd fent), mégis a szóban forgó bejelentések a releváns helyzetekre nem tartalmaznak változatokat. Az EP 251446 A1 számú szabadalmi bejelentésben számos BPN-változatot tettek közzé, így a 217-es változatokat is (mely megfelel a Bacillus lentus alkalikus proteáz 211. pozíciójának); csak a lehetséges kicseréléseket nevezték meg, melyek a 217D változat tulajdonságaival járnak együtt, bár ezeket mégsem tették közzé. A WO 91106637 A1 számú szabadalmi bejelentés szerint a „proteáz C”-k a BPN’ pontmutációi a 123. és/vagy 274. pozíciókban. A „proteáz D” változatok elsősorban a Bacillus lentus-bó\ nyerhetők, melyek a WO 95/10591 A1 számú szabadalmi bejelentés szerint a 76. pozíció mutációi (a BPN’-számozás alapján, mely megfelel a Bacillus lentus alkalikus proteáz 74. pozíciójának) és ezenkívül más pozíciók is hordoznak. Megemlítendő a 217. pozíció (megfelel a 211. pozíciónak); ennek ellenére D kicserélésről nem számoltak be. Szinte ezzel azonos például a 6.017.871 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben leírt mosó- és tisztítószerekben és kozmetikumokban, vagy a 5.677.272 és 6.066.611 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésekben közzétett fehérítőszerben alkalmazott proteáz, melyben a 76. pozíciójú kicserélések kombinációit alkalmazták, alapjában a 217D is ismert, de ezeket nem részesítették előnyben.

A további ismert proteázok kereskedelmi nevei a következők: Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym, Natalase® és Kannase® (melyek a Novozymes cégtől szerezhetők be), Maxapem®, Purafect®, Purafect OxP® és Properase® (melyek a Genencortól vásárolhatók), Protosol® (Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien) és Wuxi® (Firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China).

A szubtilizin mosási teljesítményének egyik javítási stratégiája abban áll, hogy statisztikusan, vagy az egyes aminosavak ismert funkciói alapján, az ismert molekulákban pontmutációkat alakítunk ki, és a kapott változatok mosási teljesítményre gyakorolt hozzájárulását ellenőrizzük. A stratégia megvalósulhat például a fentiekben említett szabadalmi bejelentésekben közzétett módon [5700676 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés; és EP 130756 A1 számú szabadalmi bejelentés], A szóban forgó találmányok egyikében leírták a 217. pozíció (mely megfelel a Bacillus lentus alkalikus proteáz 211. pozíciójának) aminosavának kicserélését mind a 19 aminosavra, magukban vagy másokkal együtt, mégsem tartalmazzák a releváns kicserélést. Azonos lépéseket tettek az 5.801.038 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban is. Az 5.441.882 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban olyan eljárásokat írnak le, melyekben az enzimatikus tulajdonságok bizonyos egy aminosavat érintő kicserélésekben megváltoznak, magukban vagy mások mellett, de a szóban forgó bejelentés a releváns 217. pozícióban végzett kicserélést nem teszi közzé (mely megfelel a Bacillus lentus alkalikus proteáz 211. pozíciójának). Ezeknek megfelelő változatokat, egy kicseréléssel, a 4.760.025 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben közzétettek, itt is csak a 217. pozícióban, és anélkül, hogy a konkrét kicserélést közzétették volna.

A szubtilizin mosási teljesítményének javítására, melyet az aktív hurokba történő további aminosavbeépítéssel kíséreltek meg elérni, számos bejelentést és stratégiát tettek közzé, ezeket például a következő bejelentésekben ismertették: WO 99/27082 A1 számú szabadalmi bejelentés, WO 00/37599 A1, WO 00/37621 A1-től WO 00/37627 A1-ig és WO 00/71683 A1-től WO 00/71691 A1-ig. Ezen alapelv alapján kell az összes szubtilizint alkalmazni, melyek egyik alcsoportja az I-S1 (igazi szubtilizin), míg a másik az I-S2 (nagymértékben alkalikus szubtilizin).

A teljesítmény növelésének egy másik stratégiája abban áll, hogy a molekula felületi töltése és/vagy izoelekt4

HU 225 362 Β1 romos pontja, és így kölcsönhatása a szubsztráttal megváltoztatható. Az ilyen változatokat a szakirodalomban leírták [5.665.587 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés; EP 405901 A1 számú szabadalom, és WO 91/00334 A1 számú szabadalmi bejelentés]. Ehhez számos pozíció megnevezhető, mint például a 3., 4. és 217. (mely megfelel a Bacillus lentus alkalikus proteáz 3., 4. és 211. pozíciójának), a megfelelő változatokat mégsem tették közzé. A WO 91/00345 A1 számú szabadalmi bejelentés is ezekkel a helyzetekkel foglalkozik, de a ténylegesen megfelelő változatokat nem tették közzé. A pH-értéktől függő, a molekula töltésváltozatainak csökkentésére irányuló eljárásokat a szakirodalomban közzétették [WO 92/11348 A1 számú szabadalmi bejelentés]. Ebből a legjobbak, ahogy ezt a szóban forgó bejelentésből meghatározhatjuk, az S3T és az L211D; konkrét közzététel egyik kicserélésre sem történt. A WO 00/24924 A2 számú szabadalmi bejelentés ezen elv alapján a változatok azonosítási eljárásához vezetett, melyek alkalmazása a mosó- és tisztítószerekben megfelelő lehetne; bár az összes közzétett változat legalább egy, a 103. pozícióban végzett kicserélésre vonatkozik, előnyben részesítve a többszörös változatokat, amikor is a szóban forgó bejelentés a releváns kicseréléseket nem adja meg. A WO 96/34935 A2 számú szabadalmi bejelentés szerint a teljesítmény javítását a mosóés tisztítószerekben a molekula hidrofób jellege is megnövelheti, ami az enzim stabilitására befolyással van.

A WO 99/120727 A2 számú szabadalmi bejelentésből megismerhetjük azokat a szubtilizinváltozatokat, melyek a WO 00/24924 A2 számú szabadalmi bejelentés eljárásával előállíthatok: ezek mindegyike legalább egy kicserélést tartalmaz a 103. pozícióban, kombinálva sok más lehetséges kicseréléssel, ennek ellenére egyik pozíció sem felel meg a Bacillus /enfus-proteáz 61. pozíciójának. Az előnyben részesített többszörös változatok legalább hat kicseréléssel rendelkeznek, hogy a 205. és 217. pozíciók is (melyek megfelelnek a Bacillus lentus alkalikus proteáz 199. és 211. pozícióinak); a több mint 50 ilyen változatból csupán kettő felel meg a releváns 1991 kicserélésnek. Az ilyen mutánsokat a WO 99/20723 A2 és a WO 99120726 A2 számú szabadalmi bejelentésekben közzétették mosó- és tisztítószerben történő alkalmazásokhoz, amit kiegészítettek amilázzal, előnyösen fehérítővel.

Az enzimfejlesztés egy modern iránya, melynek elemei ismertek, az új enzimek statisztikus előállítását egymással rokon fehérjék kombinálásával éri el, melyek a mai napig nem ismert tulajdonságokat mutatnak. Az ilyen eljárások tekinthetők irányított evolúciónak. Idetartoznak például a következő eljárások: a StEP-módszer [Zhao és munkatársai: Nat. Biotechnoi., 16, 258-261 (1998)], a random primingrekombináció [Shao és munkatársai: Nucleic Acids Rés., 26, 681-683 (1998)], a DNS-keverés [Stemmer: Natúré, 370, 389-391 (1994)] vagy a RACHITT [Coco és munkatársai: Nat. Biotechnol., 19, 354-359(2001)].

Egy további, különösen kiteljesített stratégia abban áll, hogy a kérdéses proteázok stabilitását, és ezzel hatékonyságukat is megnövelik. Polimer csatolásával stabilizált proteázok kozmetikumokban alkalmazhatók, ahogy azt a szakirodalomban leírták [5.230.891 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés]; ez lehetővé teszi a termék jobb elviselhetőségét a bőrön. Különösen a mosó- és tisztítószereknél közismertek a pontmutációkkal végzett stabilizálások. így a 6.087.315 és 6.110.884 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmak szerinti proteázok úgy stabilizálhatok, hogy bizonyos tirozinokat más aminosavakra cserélünk. A WO 89/09819 A1 és a WO 89/09830 A1 számú szabadalmi bejelentésekben termostabilis BPN’-változatokat írtak le, melyekben a 217. pozícióban (mely megfelel a Bacillus lentus alkalikus proteáz 211. pozíciójának) K vagy L kicseréléseket végeztek, kiegészítésként a 217K változatnál a 63. pozícióban (megfelel a 61. pozíciónak) a kicserélés S63D-re történt.

A pontmutációkkal végzett stabilizálásra további leírt lehetőségek például a következők:

- Bizonyos aminosavak kicserélése prolinra [WO 92/19729 A1 számú szabadalmi bejelentés, EP 583339 B1 számú szabadalmi bejelentés és 5.858.757 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom, valamint EP 518200 A1 számú szabadalmi bejelentés];

- A molekula felületére polárosabb vagy töltöttebb csoportok felvitele [EP 525610 A1 számú szabadalmi bejelentés, EP 995801 A1 számú szabadalmi bejelentés és 5.453.372 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés], többek között azokban a pozíciókban, amelyek a Bacillus /enfus-proteáz V4-nek felelnek meg, a V4I helyett a szóban forgó bejelentésben kevésbé poláros aminosavakat építettek be;

- A fémionok kötésének megerősítése, különösen a kalciumkötőhely mutagenezisével [WO 88/08028 A1 és WO 88/08033 A1 számú szabadalmi bejelentések];

- Az autolízis blokkolása módosítással vagy mutagenezissel [5.543.302 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom].

Az EP 398539 A1 számú szabadalmi bejelentésben több stabilizálóstratégia kombinációját tették közzé. Ezek alapján a szubtilizin stabilizálható, és így alkalmazása mosó- és előnyösebben tisztítószerekben hatásosabb, melyhez a következők eljárásokat alkalmazták: (1) a kalciumkötőhelyek aminosavainak kicserélése erősebben negatív aminosavakra, (2) az Asn-Gly-t követő aminosavak elvétele vagy mutálása, (3) a metionin kicserélése más aminosavra és (4) kiegészítésként bizonyos aminosavak helyettesítése, melyek a katalitikus központ közelében helyezkednek el. Az első három lehetőség a szóban forgó bejelentésben nem bizonyult helytállónak. A negyedik lehetőség a 61. és a 211. pozíciókat érinti. Bár javasolható, hogy az ezekben a pozíciókban természetes körülmények között előforduló aminosavakat (S63, előnyösen a szubtilizin BPN’-nél Y217), így a G-t és előnyösen az L-et pótoljuk. Ezzel szemben a találmány molekulája éppen ezekben a pozíciókban más aminosavakat alkalmaz, mint G vagy L.

HU 225 362 Β1

A további lehetőségek a Bacillus lentus-bó\ származó szubtilizinekre vonatkoznak, melyek pontmutációval történő stabilizálást jelentenek, ezeket a szakirodalomban leírták [5.340.735, 5.500.364, 5.985.639 és 6.136.553 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentések]. A mutációval megváltoztatott pozíciók felépítése háromdimenziós analízissel felderíthető. A 61. és 211. pozíciók változatait ezekben a bejelentésekben ennek ellenére nem tették közzé.

Például az EP 755999 A1 és WO 98/30669 A1 számú szabadalmi bejelentésekből tudjuk, hogy a proteázok, különösen a mosó- és tisztítószerekben használt javított teljesítményű proteázok, előnyösen a mosó- és tisztítószerekben a tisztítási teljesítmény növelésére amilázzal és további mosószer enzimekkel együtt alkalmazhatók. Például a WO 97/07770 A1 számú szabadalmi bejelentésből ismert, hogy ezek közül néhányat korábban mint mosószerproteázokat használták (lásd lejjebb), de akár kozmetikai célokra is alkalmazhatók. A proteázok egyik további alkalmazási lehetőségét a szakirodalomban leírták [EP 380362 A1 számú szabadalmi bejelentés]. Ezek szintetikusan előállított formákra vonatkoznak, és ezért a fenti bejelentések szerint azok a szubtilizinek felelhetnek meg, melyeket úgy stabilizáltak, hogy a Bacillus lentus alkalikus proteáz 61. pozíciójában (olyan mutáció, mely D-t eredményez) és/vagy 211. pozíciójában (olyan mutáció, mely K vagy L aminosavat eredményez) mutáltattak, vagy ezek mellett további más mutációkat is kialakítottak. Ezzel kapcsolatban a szóban forgó bejelentések releváns kicserélésekről szintén nem számoltak be.

A Bacillus lentus-bói származó alkalikus proteázoknál alkalikusabb proteázok nyerhetők Bacillus fajokból. A WO 91/02792 A1 számú szabadalmi bejelentés szerzői ezek közül az egyik törzset DSM 5483 számon letétbe helyezték; amikor is közzétették a vad típusú enzim szekvenciáját és biokémiai tulajdonságait is. A pontmutációval nyerhető, mosó- és tisztítószerekben alkalmazható ilyen enzimváltozatokat a szakirodalomban közzétették [WO 92/21760 A1 és WO 95/23221 A1 számú szabadalmi bejelentések],

A termelőorganizmusból származó egyik vad típusú enzim, melyet eredetileg az alkalofil Bacillus törzsek szűrésekor kaptak, sokkal nagyobb stabilitást mutatott oxidációval és detergensekkel szemben. A WO 91102792 A1 számú szabadalmi bejelentésben, előnyösen az EP 493398 B1 számú szabadalmi bejelentésben és az 5.352.604 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban ezek heterológ kifejezését írták le Bacillus licheniformis-gazáában (ATCC 53926). A megnevezett amerikai bejelentések igénypontjaiban a 208., 210., 212., 213. és 268. pozíciókat a Bacillus lentus alkalikus proteázaira jellemzőnek nevezték meg; ez számozásában megfelel az érett fehérje következő pozícióinak: 97., 99., 101., 102. és 157., és ezek alapján az enzim különbözik az érett Savinase®-tól. A fenti enzimek háromdimenziós felépítését a szakirodalomban leírták [Goddette és munkatársai: J. Mól. Bioi., 228, 580-595 (1992): „The crystal structure of the Bacillus lentus alkaline protease, Subtilisin BL, at 1.4 A resolution”].

A WO 92/21760 A1 számú szabadalmi bejelentésben, előnyösen az 5.340.735 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban közzétették a vad típusú Bacillus lentus alkalikus proteáz aminosavszekvenciáját (a szekvencia száma: 52) és nukleinsavszekvenciáját (a szekvencia száma: 106). Ebben a bejelentésben 51 különböző változatot vezettek le, melyek egy vagy több pozícióban a vad típusú enzimtől eltérnek, és így stabilabbak. Itt megtalálhatók 53T, V4I és V199I kicserélések is. A bejelentés szerint az M131 változat a legelőnyösebb, ezt letétbe helyezték (ATCC 68614, American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA, http://www.atcc.org), ahol a kicserélés a következő eredményre vezetett: S3T/V4I/A188P/V193M/V199I. Ezt a találmányban kiindulási enzimként használjuk (lásd az 1. példát), és szekvenciáját a 1. és a 2. számon megadtuk, ahol mind aminosavszekvenciáját, mind nukleinsavszekvenciáját feltüntettük. így ezek mindegyike a Bacillus lentus DSM 5483 alkalikus proteázból levezethető. További pozíciók pontmutációjával kialakított, javított stabilitású változatok a következő bejelentésekből vezethetők le: 5.500.364 és 5.985.639 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmak.

A WO 95/23221 A1 számú szabadalmi bejelentésből a mosó- és tisztítószerekben történő alkalmazáshoz Bacillus lentus alkalikus proteáz pontmutáns változatok ismerhetők meg, melyek további fejlesztéséhez a megnevezett molekulát használták. Ezek közül a három kicserélés a következő: S3T, V4I és V199I. Ezekből két vagy három további pontmutációs változatot alakítottak ki a vad típusú enzim alapján, melyet a Bacillus lentus DSM 5483-ból nyertek. Majd további mutációt alakítottak ki a 211. pozícióban, nevezetesen a 211D változatot (változatok: F49, F54 és F55). Logikus folytatása megtalálható a 5.691.295 és 5.855.625 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmakban, melyekben 211D és 211E kicserélési változatokra tartottak igényt. Az ehhez megfelelő stratégiát, ami szubsztrátkötés közelében a töltés megváltoztatására irányult, a szakirodalomban megvilágították [6.197.589 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom].

Ezek mindegyikével hosszú ideig foglalkoztak, melynek oka a technikailag alkalmazható proteázok nagyobb igénye, melyek részben drasztikusan, részben csak kisebb mértékben, kevesebb pozícióban különböznek az ismert proteázoktól. Ez így egy széles tartományt fed le, az igen drasztikustól az igen kis mértékű teljesítménykülönbségekig. Ezek megmutatkoznak mindenekelőtt a mosó- és tisztítószerekben történő alkalmazásoknál. Fejlesztésük az enzimatikus tulajdonságok kiszámíthatóságát és nem utolsósorban alkalmazhatóságukat, például a mosó- és tisztítószerreceptek vonatkozásában, foglalta magában. Itt további tényezők kerülnek a képbe, mint például magas hőmérséklettel szemben mutatott stabilitásuk, az oxidálószerekkel szemben mutatott ellenálló képességük, tenzides denaturálhatóságuk, kicsapóhatásuk, vagy elvárt szinergizmusuk más alkotórészekkel, melyek közül a legfontosabbak csak kísérletileg tárhatók fel.

HU 225 362 Β1

A találmány előtt álló feladat volt olyan szubtilizin megtalálása, mely technikai alkalmazásokban javított teljesítményekre képes. Különösen azokra a felfedezésekre van szükség, melyek a mosó- és előnyösen a tisztítószerekben jobb teljesítményt biztosítanak. Az egyik részfeladat nemcsak a hidrolízis mértékének növelése, hanem a megfelelő receptben történő stabil alkalmazhatóság biztosítása is.

A további részfeladatok olyan nukleinsavak biztosításával állnak kapcsolatban, melyek az ilyen proteázokat kódolják, valamint vektorokkal, gazdasejtekkel és ezek előállítási eljárásainak biztosításával az ilyen proteázok kialakításához. Továbbá a megfelelő anyagok biztosítására is kiterjed, különösen mosó- és tisztítószerek alkalmazási lehetőségeinek bővítésére szolgáló proteázokra. Végül a talált proteázok technikai alkalmazási lehetőségeinek meghatározása szintén a találmány tárgykörébe tartozik.

Meglepetésünkre azt találtuk, hogy a glicin kicserélése a 61. pozícióban másik aminosavra, különösen alifás aminosavra, és különösen alaninra a mosási teljesítményt megnöveli. Más kicseréléseket is figyelembe vehetünk, mint például a 199. pozícióban az aminosav kicserélése izoleucinra, vagy például a 211. pozícióban aszparaginsavra, melyek feltehetően az enzimatikus hatás javára vannak. A megnövelt hatékonyság a stabilitás erősítésével, így a 3. pozíciójú, előnyösen 4. pozíciójú treoninnal és izoleucinnal tovább fokozható.

A találmány előtt álló feladatot a szubtilizin típusú proteázokkal úgy oldottuk meg, hogy a Bacillus lentusszubtilizin 61. pozíciójában a kiindulási enzimen a következő aminosavkicseréléseket végeztük: alanin, Valin, leucin, cisztein, metionin, fenil-alanin, tirozin, triptofán, treonin, hisztidin, lizin vagy arginin, előnyösen alanin, valin, leucin vagy izoleucin, különösen előnyösen alanin.

Fokozottan előnyben részesítjük az olyan megoldásokat, ahol további kicseréléseket teszünk, így a 61. pozícióban, amikora 199. pozícióban izoleucin található; a 61. pozícióban a fentiekben felsorolt kicseréléseket tehetjük, amikor is a 211. pozícióban aszparaginsav található, és a stabilizáláshoz a 3. pozícióban treonin és/vagy a 4. pozícióban izoleucin fordulhat elő. Különösen jó megoldást jelentenek azok a proteázok, melyek a Bacillus lentus alkalikus proteázokból származtathatók, elsősorban a következő két Bacillus lentus alkalikus proteáz változat: S3T/V4I/G61A/V199I vagy S3T/V4I/G61A/V199I/L211D. Ezekben a találmány szerinti esetekben a megnevezett proteázok további fejlesztése és származékképzése megvalósul.

A részfeladatok és a találmány egyes tárgyköreinek megoldásaként a találmány nukleinsavakról is gondoskodik, melyek a találmány szerinti proteázokat kódolják, valamint vektorokat, gazdasejteket és előállítási eljárásokat biztosít, melyek az ilyen proteázok nyeréséhez szükségesek. Továbbá az ilyen proteázok részére megfelelő szereket, különösen mosó- és tisztítószerekhez, a megfelelő mosó- és tisztítószer-eljárásokat, valamint a megfelelő alkalmazási lehetőségeket biztosít.

Végül meghatároztuk a talált proteázok technikai alkalmazási lehetőségeit.

A találmány szellemében fehérje alatt természetes aminosavakból álló, főleg lineáris építőelemekből felépülő, hatását elsődlegesen háromdimenziós struktúrája révén kifejtő polimert értünk. A találmányban a 19 fehérjét felépítő, természetben előforduló L-aminosav nemzetközileg szokásos egy- és hárombetűs kódjait használjuk.

Az ilyen elnevezések kombinációja egy számmal arra a fehérjére utal, melyben a szóban forgó aminosav a megjelölt pozícióban fordul elő. így például az S3 jelentése a 3. pozícióban lévő szerin, amikor is a számozást a szóban forgó fehérje N-terminálisától kezdjük. Ezen a helyen lévő pontmutációt, például amikor a meglévő aminosavat treoninra cseréljük ki, ezen nómenklatúra szerint S3T-vel jelöljük.

A több pontmutációs változatok jelöléséhez ezeket a kicseréléseket ferde vonallal jelölve egymás után írtuk le. Ennek megfelelően az S3T/V4I változat azt jelenti, hogy az adott fehérje 3. pozíciójában a szerint treoninra, míg a 4. pozícióban a valint izoleucinra cseréltük ki. A találmányban a pozíció megadása, melyet a továbbiakban ennek megfelelően használunk, a szóban forgó fehérje érett formájára vonatkozik a szignálpeptid nélkül (lásd lejjebb).

A találmány szellemében enzim alatt olyan fehérjét értünk, mely meghatározott biokémiai funkciót mutat. Proteolitikus enzimek vagy proteolitikus funkcióval rendelkező enzimek alatt azokat értjük, melyek a fehérjék savamidkötéseit hidrolizálják, különösen azokat, melyek a fehérjék belsejében találhatók, és ezért ezeket endopeptidázoknak is nevezhetjük. A szubtilizinproteázok endopeptidázok, melyeket a természetben előforduló Gram-pozitív baktériumok állítják elő, és szekretálják, vagy ezekből, például molekuláris biológiai eljárásokkal előállíthatjuk; és részegységekből állnak, melyek strukturálisan vagy funkcionálisan elkülöníthetők, miközben a természetes szubtilizinproteázokkal homologizálhatók. Ezeket a szakirodalomban leírták [Siezen: „Subtilases: Subtilisin-like Proteases”, 75-95, „Subtilisin enzymes”, kiadó: R. Bott és C. Betzel, New York, (1996)].

Számos fehérje úgynevezett propeptidként, tehát egy szignálpeptiddel együtt keletkezik. Ez a fehérjék N-terminálisán foglal helyet, melynek funkciója legtöbbször a termelősejtből a képződő fehérje periplazmába vagy a tenyészközegbe juttatása, és/vagy a fehérje szabályos hajtogatódásának garantálása. Végül a szignálpeptid természetes körülmények között szignálpeptidáz hatására a fehérjéről lehasad, teszi ezt a képződő új N-terminális megsértése nélkül. A WO 91/02792 A1 számú szabadalmi bejelentés 1. ábrája szerint a Bacillus lentus DSM 5483-ból nyerhető szubtilizin profehérje 380 aminosavból épül fel. Ezzel szemben az érett fehérje csak 269 aminosavból; ahol a számozás az érett fehérjék első aminosavától kezdődik, ebben az esetben alaninnal, a profehérje szekvenciája szerint ez a 112. pozíció. A találmány 1. szekvenciája szerint a Bacillus licheniformis ATCC

HU 225 362 Β1

68614 törzsből nyer szubtilizin szignálpeptidje 111 aminosav hosszúságú, míg az érett peptid 269 aminosavból áll. E nélkül a felosztás nélkül a teljes fehérje 380 aminosav hosszúságú, ahogy az a 2. szekvenciából következik. A különösen előnyben részesített megvalósítási formák szekvenciái ezzel egyeznek.

A technikai alkalmazáshoz az enzimatikus aktivitás az érett pepiidhez kötött, így a megcsonkított profehérje termelését előnyben részesítjük.

A profehérjék a fehérjék inaktív alakjai. Ezek előanyagát a szignálszekvenciával pre-pro-fehérjének nevezzük.

A találmány szellemében nukleinsavak alatt természetesen a nukleotidokból felépülő információt hordozó molekulákat értjük, melyek a fehérje vagy enzim lineáris aminosavsorrendjét kódolják. Előfordulhatnak egyszálú formában, és ehhez az egyszálú formához komplementerként kötődő másik szállal kettős szálú formában. A természetesen tartósan megmaradandó, információt hordozó DNS-t részesítjük előnyben a molekuláris biológiai munkákhoz. Ezzel szemben a találmány megvalósítása során természetes környezetben, mint például egy kísérleti sejtben, RNS alakul ki, ezért az RNS-molekula szintén a találmány megvalósítási formájába tartozik.

A találmány szellemében a fehérjének megfelelő információegységet génnek nevezzük. A DNS-nél mindkét komplementer szál mindhárom lehetséges olvasási keretére figyelemmel vagyunk. Továbbá arra is tekintettel vagyunk, hogy az aminosavakat különböző kodonhármasok is kódolhatják, így egy meghatározott aminosavsorrend több különböző, és viszonylag csak kis azonosságot mutató nukleotidszekvenciából vezethető le (a genetikai kód degenerált). Ezenkívül ismeretes, hogy a különböző mikroorganizmusok eltérő kodonokat használnak. Ez alapján az oltalmi kört mind az aminosavszekvenciákra, mind a nukleotidszekvenciákra ki kell terjeszteni, és a megadott nukleotidszekvenciákat mindig csak egy meghatározott aminosavszekvencia példa sorrendjeként kell tekinteni.

A szakirodalomban jártas szakemberek számára ismert, hogy a teljes gén előállításához például a kémiai szintézis vagy a polimerázláncreakció-eljárások (PCR) molekuláris biológiai és/vagy proteinkémiai standardmódszerekkel együtt végezhetők az ismert DNS- és/vagy az aminosavszekvenciáknak megfelelő nukleinsavszekvenciák alkalmazásával. Az ilyen eljárásokat a szakirodalomban közzétették [„Lexikon dér Biochemie”, Spektrum Akademischer Verlag, Berlin, 1. kötet, 267-271 és 2. kötet 227-229 (1999)]. Ez különösen akkor lehetséges, amikor a letétbe helyezett törzsért a törzsgyűjteménybe visszanyúlhatunk. PCR-primerekkel, amelyeket az ismert szekvencia alapján szintetizálunk, az ilyen törzsekben előforduló gén problémamentesen szintetizálható, klónozható és kívánt esetben tovább alakítható. Idetartoznak például az adott helyre irányított vagy véletlen mutagenezis-módszerek.

A nukleotidszekvencia megváltoztatását, amelyet például az itt ismertetett molekuláris biológiai módszerekkel elvégezhetünk, mutációnak nevezzük. A változtatások típusa szerint megkülönböztetünk deléciós, inszerciós vagy helyettesítéses mutációt; azt a folyamatot amikor a különböző géneket vagy a gének részeit fuzionáltatjuk (shuffling), génmutációnak nevezzük. Az így kialakított szervezeteket mutánsoknak nevezzük. A mutált nukleinsavból levezethető fehérjét változatnak nevezzük, (gy például a deléciós, inszerciós vagy szubsztitúciós mutációk deléciós, inszerciós vagy szubsztitúciós mutáns fúziós gén változatokhoz és deléciós, inszerciós és szubsztitúciós fehérje, illetve fúziós fehérje változatokhoz vezetnek.

A találmány szellemében vektor alatt olyan nukleinsavelemeket tartalmazó konstrukciót értünk, mely kritériumai alapján a kérdéses gént tartalmazza. Ez a fajban vagy a sejtvonalban több generáción vagy sejtosztódáson keresztül képes a befogadó genomjától függetlenül stabilis genetikai elemként fennmaradni. A bakteriális fajoknál a vektorok kiváltképpen plazmidok, azaz cirkuláris genetikai elemek. A géntechnikában egyrészt megkülönböztetünk olyan vektorokat, melyek tárolásra és bizonyos tekintetben a genetikai feladatok ellátására szolgálnak, ezek az úgynevezett klónozóvektorok, másrészt, melyek a gazdasejtben a kérdéses gén funkcióit megvalósítják, azaz a szóban forgó fehérjék kifejezését lehetővé teszik. Ezeket a vektorokat expressziós vektoroknak nevezzük.

A homológiák keresésével, azaz ismert enzimmel történő összehasonlítással, például megadott elrendezésben, a kérdéses enzim, aminosav vagy a nukleotid szekvenciáinak enzimatikus aktivitása kikövetkeztethető. Ez a fehérje más területeivel, melyek tulajdonképpen az adott reakcióban nem vesznek részt, minőségileg vagy mennyiségileg módosítható. Ezek kihatással vannak például az enzim stabilitásra, aktivitására, reakciófeltételekre vagy a szubsztrátspecifitásra.

A proteolitikus enzimek vagy proteázok szakkifejezés alatt így a katalitikusán aktív központokban lévő néhány aminosav mindazon funkcióit értjük, melyek a teljes fehérje megmaradt többi részének vagy egyes részeinek, vagy a megmaradt fehérje több részének tulajdonképpen az aktív területét adják. A találmány szellemében proteolitikus aktivitásnak tekintjük magukat az ilyen módosított funkciókat vagy részaktivitásokat is. Az ilyen segédfunkciók vagy részaktivitások például egyes szubsztrátok, közti- vagy végtermékek kötésére, valamint a hidrolitikus aktivitást befolyásoló szabályozók aktiválására vagy gátlására vagy közbelépésére szolgálnak. így például bizonyos strukturális elemek kiépítése az aktív centrumtól távol is elvégezhető. A második feltétel, hogy a találmány szerinti proteolitikus fehérjének megfeleljen, valójában az, hogy a tulajdonképpen aktív csoport kémiai viselkedése magában vagy a módosított rész hatásával együtt a peptidkötés hidrolízisét adja. Ez alapján az is lehetséges, hogy egyéb proteázok aktivitásai egy vagy több rész bevonásával, például a találmány szerinti fehérje, minőségileg vagy mennyiségileg módosítva legyen. A proteolitikus aktivitásnál egyéb tényezők befolyását

HU 225 362 Β1 ugyancsak figyelembe vesszük. A proteolitikusan aktív enzimek közé tartoznak azok is, melyek aktivitását adott időpontban bizonyos anyagokkal gátolhatjuk. Döntő ezek alapvető képessége az adott proteolízisreakcióban.

Fragmensnek nevezzük az összes fehérjét vagy peptidet, mely kisebb, mint a természetes fehérje, vagy azokat, melyek a teljesen átíródott génnek felelnek meg, és például szintetikusan is megkaphatok. Aminosavszekvenciájuk alapján a megfelelő teljes láncú fehérjévé rendezhetők. Például azonos struktúrát vehetnek fel, vagy proteolitikus vagy más részaktivitást mutathatnak, mint például az egyes szubsztrátkomplexek. A kiindulási fehérjék fragmensei és hiányváltozatai lényegében egyet jelentenek, mivel akár fragmensek, akár a deléciós mutánsok, amelyeknél csak kis darabok hiányoznak, csak egyes részfunkciókat jeleníthetnek meg.

A találmány szerint kimérák vagy hibrid fehérjék alatt azokat a fehérjéket értjük, melyek olyan természetes elemekből épülnek fel, melyek ugyanabból a szervezetből vagy különböző szervezetekből származnak. Az ilyen folyamatot shufflingnak vagy fúziós mutagenezisnek nevezik. Az ilyen fúziók alapján bizonyos fehérjerészek enzimatikus funkciói létrehozhatók vagy módosíthatók. így a találmány szerint annak nincs jelentősége, hogy az ilyen kimérafehérje egyetlen polipeptidláncból vagy több alegységből áll, melyek különböző funkciókra oszlanak. Az utóbbi alternatíva megvalósításához például az is lehetséges, hogy transzlációt, vagy csak az egyik tisztítási lépést követően, megcélzott proteolitikus hasítással az egyetlen kiméra-polipeptidláncot több részre osszuk.

Inszerciós mutációval nyerhető fehérjék alatt azokat a változatokat értjük, melyek ismert eljárásokkal, az egyes nukleinsavak, előnyösebben fehérjefragmensek egybekapcsolásával a kiindulási szekvenciában alakíthatók ki. Ezek lényegében azonosak a kialakított kiméra fehérjékkel. Megkülönböztetésként csupán a fehérjerészek méretében térnek el a teljes fehérjétől. Az ilyen inszerciósan mutált fehérjékben az idegen fehérje kevesebb, minta kimérafehérjékben.

Az inverziós mutagenezis, azaz a részleges szekvenciamegfordítás, a deléció egyik eltérő formája, inszerciónak is tekinthető. Ez csak az eredeti aminosavsorrenddel rendelkező, de különböző molekularészek új csoportosulására érvényes. Ezek az eredeti fehérjék deléciós változatainak, inszerciós változatainak, valamint shuffling változatainak tekinthetők.

A találmány szellemében származékok alatt olyan fehérjéket értünk, melyek aminosavlánca kémiailag módosított. Az ilyen származékképzés például biológiailag, fehérjeszintézissel kapcsoltan a gazdaszervezetben elvégezhető. Ehhez molekuláris biológiai eljárásokat alkalmazhatunk. De kémiailag is elvégezhetők, akár az oldallánc aminosav kémiai átalakításával, akár a fehérjén más kovalens kötéssel. Az ilyen kötéseknél például más fehérjéket használunk, melyek például a találmány szerinti fehérjéhez bifunkciós kémiai vegyületekkel kapcsolhatók.

Ehhez olyan vegyület alkalmazható, mely például lehet más fehérje, ami például a találmány szerinti fehérjéhez bifunkciós kémia vegyületen keresztül kapcsolódik. Az ilyen módosításokkal például a szubsztrátspecifitás vagy a kötés erőssége a szubsztráton befolyásolható, vagy az itt említett enzimatikus aktivitás átmenetileg blokkolható, amennyiben a kapcsolt anyag inhibitor. Ennek például a tárolási idő alatt lehet értelme. Hasonlóan, a makromolekuláris hordozó kovalens kötésének módosítását származékképzésnek tekintjük.

A találmány szerint minden enzimet, fehérjét, fragmenst és származékot, amennyiben azt másképpen nem jelezzük, a fehérje fogalomba egyesítjük.

Az enzim teljesítménye alatt az adott technikai területen kifejtett hatékonyságát értjük. Ez az enzimaktivitáson alapul, de az adott folyamat egyéb releváns tényezőitől is függ. Idetartozik például a stabilitás, a szubsztrátkötés, kölcsönhatása a szubsztrátot hordozó anyaggal, vagy kölcsönhatása más alkotórészekkel, és elsősorban a szinergista hatások.

A találmány szerint mosószer-teljesítmény vagy tisztítószer-teljesítmény alatt azokat a hatásokat értjük, melyek a szóban forgó szennyezett anyagon, mint például textíliákon, vagy adott esetben szilárd felületeken fejtenek ki. Az ilyen anyagok egyik komponense például az enzim, melyet a mosó- és tisztítószerekben hatása miatt alkalmazásra érdemesnek tartunk. Ennek megfelelően az enzim enzimatikus sajátságai alapján nem minden további nélkül alkalmazhatók egyes szerekben a mosási teljesítmény elősegítésére. Itt például olyan további tényezők játszanak szerepet, mint a stabilitás, szubsztrátkötés, a tisztítandó dologgal vagy a szer egyéb alkotórészeivel kialakuló kapcsolódás, különösen a szennyezés eltávolításában megmutatkozó szinergizmus.

A találmány a kitűzött cél végrehajtásához a következő stratégiát folytatta, a Bacillus lentus DSM 5483 törzsből a szubtilizint, amelyet a szakirodalomban közzétettek [WO 91/02792 A1, WO 92/21760 A1 és WO 95/23221 A1 számú szabadalmi bejelentések] és különösen az M131 változatot az S3T/V4I/A188P/V193M/V199I és az F49 változatot S3T/V4I/A188P/V193M/V199I/L211D, a mosó- és tisztítószerekben történő alkalmazáshoz továbbfejlesztette. Az idevonatkozó technikai ismeretek lehetővé tették más megfelelő, különösen nagy mértékben átalakított proteázok, mindenekelőtt szubtilizin típusúak alkalmazását.

A találmány szerint különösen előnyben részesítjük a Bacillus lentus DSM 5483-ból nyert szubtilizinek megfelelő számozásának figyelembevételével az érett fehérje 3., 4., 61., 199. és 211. helyzeteit. Ennek megfelelően az 1. táblázat szerinti legfontosabb szubtilizinek homologizálhatók; ezen homogolizálás minden más szubtilizinre kiterjeszthető. így például a BPN’ szubtilizin ismert szekvenciájához viszonyítva több mint 20 szubtilizint állítottak elő [Siezen: „Subtilases: Subtilisin-like Proteases” 75-95, „Subtilisin enzymes”, kiadó: Bott és Betzel, New York, (1996)].

HU 225 362 Β1

5 különösen a zselatin vagy hasonló védőréteg eltávolítására.

39. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti proteolitikus enzimek alkalmazása élelmiszerek vagy takarmányok előállításához.

5. A 4. igénypont szerinti alkalikus proteáz, azzal jellemezve, hogy a Bacillus lentus-bó\ nyert szubtilizinek számozása szerint a 3. pozícióban treonint tartalmaz.

5. táblázat

Alapöblítő kiegészítve A B C D B. lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I 20,3 17,3 72,3 82,3 fi. lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/V199I 19,3 15,5 61,6 77,1 β. lentus alkalikus proteáz F49 28,5 23,0 69,3 74,5 Savinase® 13,6 13,5 67,5 64,5

Felismerhető, hogy a Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A1/V199I változata a Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/V199I még tisztítószerekben alkalmazva is a különböző szennyeződésekre erősebb hatást fejt ki. Ez a teljesítményfokozás csak a 61. pozíció megváltoztatására vezethető vissza. Az összes

HU 225 362 Β1

Alapöblítő kiegészítve B D B. lentus alkalikus proteáz F49 40,6 87,5 Savinase® 14,0 80,6

vizsgált szennyeződésnél jobb eredményt adott, mint a

Savinase®; és szemben a C és D szennyezéssel jobb eredményhez vezetett, mint a Bacillus lentus alkalikus proteáz F49.

5. példa

Az edényeket, melyek felszíne szilárd és fényes, az előző példában megadott szennyeződésekkel vizsgáltuk, kiegészítve (D)-vel (Lasagne), majd hasonló módon öblítettük 45 °C-on. Az öblítőprogramhoz 20 g öblítőszert használtunk, ahol a víz keménysége 16 német fok. A különbség abban állt, hogy ebben a példában, bár azonos tisztítórecepteket használtunk, a következőket hasonlítottuk össze: a találmány szerinti Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4l/G61A/V199l-t a Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4IA/199I változattal, valamint az ismert proteázokkal: Bacillus lentus alkalikus proteáz F49 és Savinase®. Ezeket minden esetben úgy koncentráltuk, hogy az öblítőprogramban 10 000 PE aktivitás legyen. A méréseket az előző példában megadott módon végeztük. A kapott eredményeket a 5. táblázatban állítottuk össze.

6. A 4. vagy az 5. igénypont szerinti alkalikus proteáz, azzal jellemezve, hogy a Bacillus lentus-bó\ nyert szubtilizinek számozása szerint a 4. pozíciójában izoleucin található.

6. táblázat

Alapmosószer kiegészítve A B B. lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I/L211D 35,3 39,1 6. lentus alkalikus proteáz F49 33,2 32,7 Savinase® 12,4 14,0

A nagyobb mennyiségben alkalmazott proteázok a találmány szerinti proteázoknál nagyobb aktivitását ²⁵ eredményeztek szemben az ismert gépi öblítőszerekkel, mint például a Bacillus lentus alkalikus proteáz F49 és a Savinase®.

6. példa

Ahogy a 4. példában ismertettük, az edényt standard módon az adott szennyezőkkel láttuk el, és hasonló tisztítási receptekkel és módon 45 °C-on öblítettük. Az egyetlen különbség az volt, hogy a mindenkori proteá- 10 zokból 20 000 PE-t adtunk. Ez megfelel körülbelül 0,2 mg proteáz tisztítási koncentrátumnak. Az 5. példában leírtakhoz hasonlóan a méréseket elvégeztük, és ezek eredményét a következő 6. táblázatban összeállítottuk.

7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti alkalikus proteáz, azzal jellemezve, hogy a Bacillus lentus-bó\ nyert szubtilizinek számozása szerint a 3. pozícióban treonin, a 4. pozícióban izoleucin, a 61. pozícióban alanin és a 199. pozícióban izoleucin van.

7. táblázat

Alapöblítő kiegészítve B D B. lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I 34,7 89,4 B. lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/V199I 30,7 88,4

Felismerhető, hogy a Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A1/V199I változata a Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4l/V199l-hez képest még tisztítószerekben alkalmazva is a különböző szennyeződésekre erősebb hatást fejt ki. Ez a teljesítményfokozás csak a 61. pozíció megváltoztatására vezethető vissza. Ez az összes vizsgált szennyeződésnél jobb eredményt adott, mint a Savinase®; és a D szennyezésnél jobb eredményhez vezetett, mint a Bacillus lentus alkalikus proteáz F49.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.

7. példa 30

Az előző példához hasonló módon az edényeket B és D szennyezésekkel láttuk el, és vizsgáltuk a találmány szerinti Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4l/G61A/V199l-vel, a Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/V199I változattal, a Bacillus lentus al- 35 kalikus proteáz F49-cel vagy a Savinase®-zal. Ezeket úgy koncentráltuk, hogy a proteolitikus aktivitás az öblítőprogramban 20 000 PE legyen. A hőmérsékletet 45 °C-ra állítottuk be. A méréseket az 5. példában leírtaknak megfelelően végeztük. A kapott eredményeket ⁴θ a 7. táblázatban tüntettük fel.

8. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti alkalikus proteáz, azzal jellemezve, hogy a Bacillus lentus-bó\ nyert szubtilizinek számozása szerint a 3. pozícióban treonin, a 4. pozícióban izoleucin, a 61. pozícióban alanin, a 199. pozícióban izoleucin, és a 211. pozícióban aszparaginsav található.

HU 225 362 Β1

8-18, különösen 12-16 szénatom közül legalább egy csoporttal biztosítjuk.

A QAV tercier aminná alakítható alkilezőszerrel, mint amilyen például metil-klorid, benzil-klorid, dimetil-szulfát, dodecil-bromid, de etilén-oxiddal is előállítható. A tercier aminok alkilezése hosszabb alkilcsoporttal és két metilcsoporttal különösen könnyen elvégezhető, a tercier aminok kvaternerizálása pedig hosszabb csoportokkal és metilcsoporttal, metil-kloriddal, enyhe reakciókörülmények között is elvégezhető. Aminok, melyek három hosszú alkilcsoporttal vagy hidroxiszubsztituált alkilcsoporttal rendelkeznek, kevésbé reaktívak, és előnyösen dimetil-szulfáttal kvaternerizálhatók.

A megfelelő QAV-ok például a következők: benzalkónium-klorid (N-alkil-N,N-dimetil-benzil-ammóniumklorid, CAS No. 8001-54-5), Benzalkon B (m,p-diklórbenzil-dimetil-C12-alkil-ammónium-klorid, CAS No. 58390-78-6), benzoxónium-klorid [benzil-dodecilbisz(2-hidroxi-etil)-ammónium-klorid]; cetrimonium-bromid (N-hexadecil-N,N-trimetil-ammónium-bromid, CAS No. 57-09-0), benzetónium-klorid (N,N-dimetil-N-[2[2-[p-(1,1,3,3-tetrametil-butil)-fenoxi]-etoxi]-etil]benzil-ammónium-klorid, CAS No. 121-54-0), dialkil-dimetil-ammónium-klorid, mint például di-n-decil-dimetil-ammónium-klorid (CAS No. 7173-51-5-5), didecil-dimetil-ammónium-bromid (CAS No. 2390-68-3), dioktil-dimetil-ammónium-klorid, 1-cetil-piridinium-klorid (CAS No. 123-03-5) és Thiazoliniodid (CAS No. 15764-48-1), valamint ezek keverékei. Különösen előnyben részesítjük azok a QAV-okat, melyeknél a benzalkónium-klorid C₈-C₁₈-alkil-csoportokkal rendelkeznek, így különösen előnyös a C-|₂-C₁₄-aklil-benzildímetil-ammónium-klorid.

A benzalkónium-halogenideket és/vagy a szubsztituált benzalkónium-halogenideket a kereskedelemben beszerezhetjük, ilyenek például a következők: Barquat® ex Lonza, Marquat® ex Mason, Variquat® ex Witco/ Sherex és Hyamine® ex Lonza, valamint Bardac® ex Lonza. További kereskedelemben kapható antimikrobiális hatóanyagok az N-(3-klór-allil)-hexaminium-klorid, mint például a Dowicide® és a Dowicil® ex Dow, a benzetónium-klorid, mint például a Hyamine® 1622 ex Rohm & Haas, a metil-benzetónium-klorid, mint például a Hyamine® 10X ex Rohm & Haas, a cetil-piridinium-klorid, mint például a Cepacolklorid ex Merrell Labs.

Az antimikrobiális hatóanyagokat 0,0001-1 tömeg%-ban, előnyösen 0,001-0,8 tömeg%-ban, előnyösebben 0,005-0,3 tömeg%-ban, és legelőnyösebben 0,01-0,2 tömeg%-ban adagoljuk.

A szer UV-abszorbeálókat tartalmazhat, melyek a kezelt textíliákat bevonják, és a rostok és az egyéb alkotórészek fénnyel szembeni tartósságát vagy fénytörését javítják. Az UV-t abszorbeáló szerves anyagok (fényvédő szűrők) alatt azokat értjük, melyek az ultraibolya sugárzást abszorbeálják és a felvett energiát hosszabb hullámhosszon kibocsátják, például meleget, hőt sugároznak.

Az ilyen kívánt tulajdonságokkal rendelkező vegyületek például a benzofenonok sugárzással dezaktiváló hatású vegyületei és származékai, melyek 2- és/vagy

9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti alkalikus proteáz, azzal jellemezve, hogy egyike a Bacillus-szubtilizineknek, különösen a Bacillus /enfus-szubtilizinből levezethető szubtilizinformának.

10. A 9. igénypont szerinti alkalikus proteáz, azzal jellemezve, hogy egyike a Bacillus lentus DSM 5483 szubtilizinekből levezethető szubtilizineknek, előnyösen a 4. számon megadott Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I aminosavszekvenciájával rendelkezik.

11. A 9. vagy a 10. igénypont szerinti alkalikus proteáz, azzal jellemezve, hogy egyike a Bacillus lentus DSM 5483 szubtilizinekből levezethető szubtilizineknek, előnyösen a 6. számon megadott Bacillus lentus alkalikus proteáz S3T/V4I/G61A/V199I/L211D aminosavszekvenciájával rendelkezik.

12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti proteázokból levezethető fehérje, különösen melyeket fragmentálással, deléciós mutagenezissel, inszerciós mutagenezissel, helyettesítéses mutagenezissel vagy legalább részben egy másik fehérjével fúzióban nyerhetünk.

13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, azzal jellemezve, hogy származékát pótlólag alakítjuk ki.

14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti fehérje vagy származék, azzal jellemezve, hogy pótlólag stabilizáljuk.

15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerint megnevezett fehérjét vagy származékot kódoló nukleinsav.

16. A szubtilizinproteázt kódoló nukleinsav, melynek nukleinsavszekvenciája megegyezik a 3. vagy 5. szekvenciával, különösen azokon a területeken, ahol a 4. vagy 6. aminosavszekvencia 199. pozíciójában izoleucin, 211. pozíciójában aszparaginsav, 3. pozíciójában treonin, és/vagy 4. pozíciójában izoleucin, és különösen a 61. pozíciójában alanin aminosavat kódoló régió van.

17. A 15. vagy a 16. igénypont szerinti vektor, mely a megnevezett nukleinsavterületeket tartalmazza, és különösen olyan nukleinsavat tartalmaz, mely az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét vagy származékot kódolja.

18. Klónozóvektor, mely a 15. vagy a 16. igénypont szerinti nukleinsavterületet tartalmazza, és különösen olyan nukleinsavat tartalmaz, mely az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét vagy származékot kódolja.

19. Expressziós vektor, mely a 15. vagy a 16. igénypont szerinti nukleinsavterületet tartalmazza, és különösen olyan nukleinsavat tartalmaz, mely az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét vagy származékot kódolja, és ezek kifejezését lehetővé teszi.

20. Sejt, mely a 17-19. igénypontok bármelyike szerinti vektort tartalmazza.

21. Gazdasejt, mely az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét vagy származékot kifejezi, vagy ezek kifejezését képes gerjeszteni, különösen a 15. vagy a 16. igénypont szerinti nukleinsavak bevitele után, még előnyösebben a 20. igénypont szerinti expressziós vektor bevitele után.

22. A 21. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy baktérium, különösen olyan, amely a képződő fehérjéket a környező táptalajba szekretálja.

23. A 22. igénypont szerinti baktérium, azzal jellemezve, hogy Gram-pozitív, különösen a Bacillus nemzetségbe tartozó baktérium, előnyösebben a Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis vagy Bacillus alcalophilus fejok.

24. A 20. vagy a 21. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy eukarióta eredetű, előnyösen a képződő fehérje poszttranszlációs módosítására képes sejttípus.

25. Eljárás az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti proteolitikus enzim vagy származék előállításra, azzal jellemezve, hogy a 15. vagy 16. igénypont szerinti nukleinsavat és/vagy a 17-19. igénypontok bármelyike szerinti vektorokat, és/vagy a 20-24. igénypontok bármelyike szerinti gazdasejteket alkalmazzuk.

26. Szer, amely 1-14. igénypontok bármelyike szerinti proteolitikus enzimet tartalmazza, különösen mosó- és tisztítószer, különösen ahol a szer 1 grammjában az enzim mennyisége 2 pg-20 mg.

27. A 26. igénypont szerinti szer, amely a fentieken kívül a következő enzimeket tartalmazhatja: egyéb proteázok, amilázok, cellulázok, hemicellulázok, oxidoreduktázok és/vagy lipázok.

28. Textil nyersanyagok kezeléséhez vagy feldolgozásához szer, amely magában vagy más aktív alkotórészekkel az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti proteolitikus enzimet tartalmazza, különösen természetes alapú rostok vagy textíliák és előnyösen gyapjú és selyem kezeléséhez.

29. Eljárás textíliák vagy szilárd felületek gépi tisztításához, azzal jellemezve, hogy legalább az egyik eljárási lépésben az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti proteolitikus enzimet alkalmazzuk, alkalmanként előnyösen 40 pg—4 g mennyiségben, különösen előnyösen 400 pg—100 mg-ot.

30. Eljárás textil nyersanyagok kezeléséhez vagy feldolgozásához, azzal jellemezve, hogy magában vagy más aktív alkotórészekkel az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti proteolitikus enzimet alkalmazzuk, különösen természetes alapú rostok vagy textíliák és előnyösen gyapjú és selyem kezeléséhez.

31. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti proteolitikus enzimek alkalmazása textíliák vagy szilárd felületek tisztítására, alkalmanként előnyösen 40 pg-4 g, különösen előnyösen 400 pg-400 mg mennyiségben.

32. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti proteolitikus enzimek alkalmazása a mosó- vagy tisztítószerek alkotórészeinek aktiválására vagy deaktiválására.

33. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti proteolitikus enzimek alkalmazása biokémiai analízishez, vagy kis molekulatömegű vegyületek vagy fehérjék szintézisénél.

34. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti proteolitikus enzimek alkalmazása természetes vagy biológiailag értékes anyagok előállításához, tisztításához vagy szintéziséhez.

HU 225 362 Β1

35. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti proteolitikus enzimek alkalmazása felületi kezelésekhez, különösen bőrfeldolgozási eljárásokban.

36. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti proteolitikus enzimek alkalmazása textíliák előállításában a nyersanyagok vagy a köztitermékek kinyeréséhez vagy kezeléséhez, különösen a szövetek védőrétegeinek eltávolításához.

37. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti proteolitikus enzimek alkalmazása textil nyersanyagok kezeléséhez vagy textíliák ápolásához, különösen a gyapjú és selyem vagy gyapjú- vagy selyemtartalmú kevert textíliák kezeléséhez.

38. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti proteolitikus enzimek alkalmazása fotófilmek kezeléséhez,

10 40. Kozmetikum, amely az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti proteolitikus enzimet tartalmazza.