HU221120B1

HU221120B1 - Process for producing different substances with use of microorganism

Info

Publication number: HU221120B1
Application number: HU9601085A
Authority: HU
Inventors: Hiroyuki Kojima; Kazuhiko Totsuka
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 1993-10-28
Filing date: 1994-10-26
Publication date: 2002-08-28
Also published as: CA2175042A1; PL185681B1; CN1139956A; EP0733712B1; HUT74840A; CZ121396A3; ES2166788T3; WO1995011985A1; DE69429452T2; CA2175042C; CN1082092C; SK283058B6; EP0733712A4; BR9407907A; AU8002694A; DE69429452D1; KR960705947A; DK0733712T3; CZ291499B6; EP0733712A1

Abstract

A találmány tárgya eljárás, különböző kívánt célvegyületekelőállítására mikroorganizmus-sejtek alkalmazásával. A találmányszerinti eljárásban alkalmazott mikroorganizmus-sejtektermelékenységét az előállítani kívánt célvegyület vonatkozásábanazáltal növelik, hogy fokozzák a mikroorganizmus redukált nikotin-amid-adenin-dinuk- leotid-foszfát-termelő képességét. A találmányszerinti eljárással előállítható célvegyületek többek között: L-aminosavak, antibiotikumok, vitaminok, növekedési faktorok,fiziológiailag aktív anyagok, valamint mikroorganizmusok általáltalánosan előállított egyéb anyagok. ŕ

Description

A találmány tárgyát egy eljárás képezi különböző kívánt vegyületek előállítására mikroorganizmus alkalmazásával. A találmány szerinti eljárásban előnyösen olyan Escherichia coli nemzetséghez tartozó vagy coryneform baktériumokat alkalmazunk, melyeket hagyományosan is alkalmaznak különböző vegyületek előállítására. A találmány szerinti eljárással előállítható célvegyületek többek között: L-aminosavak, antibiotikumok, vitaminok, növekedési faktorok, fiziológiailag aktív anyagok, valamint mikroorganizmusok által általánosan előállított egyéb anyagok. A találmány szerinti megoldás egy olyan eljárás, amely lehetővé teszi, hogy egy mikroorganizmusok alkalmazásán alapuló célvegyület előállítására szolgáló eljárás (adott esetben ipari eljárás) során a cél vegyületet nagyobb termelékenységgel állíthassuk elő.

Közelebbről, a találmány szerinti eljárásban alkalmazott mikroorganizmus-sejtek termelékenységét az előállítani kívánt célvegyület vonatkozásában úgy növeljük, hogy fokozzuk a mikroorganizmus redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát-termelő képességét.

Az L-aminosavak fermentálása egy olyan közismert eljárás, amely tipikus példája azoknak az eljárásoknak, melyekben valamely célvegyületet mikroorganizmusok alkalmazásával állítanak elő. Az L-aminosavakat nemcsak fiűszerkeverékekben és ételekben használják, hanem szerepet játszanak különböző gyógyászati tápanyagkeverékek összetevőikként is, valamint állati takarmányok adalék anyagaként, gyógyszeripari és vegyipari hatóanyagként, továbbá az L-aminosavak olyan mikroorganizmusok növekedési faktoraiként is használatosak, melyek növekedéséhez L-aminosavakra van szükség, például az L-lizin és L-homoszerin hasznosító mikroorganizmusok esetén. A coryneform baktériumok, az Escherichia, Bacillus és Serratia nemzetségekhez tartozó mikroorganizmusok és hasonlók olyan mikroorganizmusok, melyek közismerten alkalmasak L-aminosavak fermentáció útján történő előállítására.

L-aminosavak fermentáció útján történő termelésére használhatunk vad típusú baktériumokat (vad típusú törzseket), a vad típusú törzsekből előállított auxotróf törzseket, a vad típusú törzsekből előállított anyagcsere-szabályozásban mutáns törzseket, például gyógyszerrezisztens mutánsokat, valamint olyan törzseket, melyek mind auxotrófok, mind pedig anyagcsere-szabályozásban mutánsok. Az auxotróf törzsek számára létfontosságú anyagok törzsenként különbözők, és azok között az auxotróf törzsek között, melyek számára azonos anyag jelenléte létfontosságú, különbség van az auxotrófia mértékét illetően. Hasonlóképpen az anyagcsere-szabályozásban mutáns törzsek, melyeket valamely hatóanyaggal szemben rezisztencia alapján állítottak elő, szintén különbözők lehetnek. Legújabban az Laminosavak fermentálásában a rekombináns DNS-technológiát is alkalmazzák. Ezek az eljárások azon alapulnak, hogy valamely gazda-mikroorganizmus L-aminosav-bioszintetikus rendszerének működését fokozzák, valamely L-aminosav bioszintézisében részt vevő enzimek) génjének (génjeinek) feldúsítása útján. Ilyen eljárásokat részletesen megtalálunk például a következő kézikönyvben: „Amino Acid Fermentation, Society Press, Japan (1986)”.

Mindazáltal az L-aminosavak fermentációs előállítására hagyományosan használt mikroorganizmusok bioszintetikus reakcióútjai - beleértve az L-aminosavak és koenzimek bioszintetikus reakcióútjait is - azonosak a megfelelő vad típusú mikroorganizmusok anyagcsere-reakcióútjaival. Az L-aminosavakat termelő mikroorganizmusokat úgy szelektálták, hogy L-aminosavbioszintetikus reakcióútjuk érzéketlen legyen a végtermék vagy hasonló anyagcseretermék által okozott gátlásra. Olyan alkalmas törzsek kiválasztására, melyek például auxotróf sajátságúak, vagy valamely hatóanyaggal szemben rezisztensek, vagy meg van sokszorozva bennük valamely bioszintetikus enzim(ek) génje (génjei), előállíthatok például a rekombináns DNS-technológia alkalmazásával.

Fermentáció útján mikroorganizmusok alkalmazásával az L-aminosavakon kívül számos egyéb anyag is előállítható. Ilyen anyagok például az antibiotikumok és a vitaminok. A fermentációval előállított antibiotikumok prekurzoraiként számos különböző antibiotikumot és egyéb anyagot alkalmaznak. Ilyen prekurzorok lehetnek például a cukrok, az aminosavak, az ecetsav, a propionsav és a mevalonsav. A cél-antibiotikumot az ilyen prekurzorból a mikroorganizmus egy olyan folyamat során állítja elő, amelyben a prekurzoron kívül különböző metabolitok átalakulnak. Hasonló mechanizmust figyeltek meg a vitaminok és egyéb biogén anyagok esetén is.

Amennyiben a fent említett anyagokat mikroorganizmusok alkalmazásával állítjuk elő, a kívánt anyag a mikroorganizmus-sejten belül, valamely bioszintetikus reakcióúton keresztül termelődik. A mikroorganizmusok bioszintetikus rendszerében szerepet játszó enzimek egyik fontos koenzime, amely az enzimek hatékony működéséhez esszenciálisán szükséges, a redukált nikotinamidadenin-dinukleotid-foszfát (melyet a továbbiakban a „NADPH”-nak fogunk jelölni). Mindazáltal mindeddig nem számoltak be olyan eredményről, amely mikroorganizmusok alkalmazásán alapuló célvegyület-előállítási eljárásokban a célvegyületek termelése és a NADPH közötti összefüggésre utalt volna.

A nikotinamid-dinukleotid transzhidrogenáz (amit a továbbiakban sok esetben egyszerűen csak „transzhidrogenáz”-ként fogunk említeni) az egyik olyan enzim, melyről ismeretes, hogy szerepet játszik a NADPH termelődésében. Ismeretes, hogy ez az enzime megtalálható számos élőlényben, többek között az Escherichia nemzetséghez tartozó mikroorganizmusokban is. Escherichia coli-ban - mely baktérium az Escherichia nemzetséghez tartozó tipikus mikroorganizmus - nemcsak igazolták ennek az enzimnek a jelenlétét, hanem meg is tisztították a transzhidrogenázt [Dávid M. Clarké és Philip D. Bragg: J. Bacteriology., 149, 717 (1985)], megklónozták az enzimet klónozó gént [Dávid M. Clarké és Philip D. Bragg: J. Bacteriology, 162, 367 (1985)], és meghatározták a gén nukleotidsorrendjét is [Dávid M. Clarké, Tip W. Loo, Shirley Gillam és Philip D. Bragg: Eur. J. Biochem., 158, 647 (1986)]. Mindazáltal az enzim fiziológiai funkciója még mindig

HU 221 120 Β1 csaknem ismeretlen. Ezt jól példázza a tény, hogy azok a variánsok, melyek erre az enzimre vonatkozóan defektívek, semmilyen fenotípusos sajátság alapján nem ismerhetők fel. A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tűztük ki egy olyan eljárás kifejlesztését, amellyel bizonyos célvegyületeket mikroorganizmusok alkalmazásával fokozott termelékenységgel állíthatunk elő, és amely eljárás a következő lépéseket tartalmazza: a mikroorganizmusokat olyan tápközegben tenyésztjük, amely lehetővé teszi, hogy a célvegyület termelődjék, és a tápközegben halmozódjék fel, majd a célvegyületet a tápközegből kinyerjük.

Célvegyületek előállítására szolgáló eljárások termelékenységét hagyományosan úgy fokozták, hogy megszüntették a szintézis szabályozhatóságát valamely végtermék(ek) vagy hasonlók útján, amely a célvegyület valamely bioszintetikus reakcióútján keletkezett, vagy valamely, a célvegyület szintéziséhez szükséges koenzim bioszintetikus reakció útján, mely reakcióutak jelen voltak az alkalmazott mikroorganizmusokban. A találmány szerinti megoldás megvalósítása során célul tűztük ki, hogy különböző célvegyületek előállítása során a termelékenységet teljesen új, az eddig elmondottaktól különböző elvi alapon fokozzuk.

A különböző vegyületek, például az L-aminosavak bioszintézise során az élőlényekben számos redukciós reakció játszódik le. Sok esetben az élő sejtek fiziológiás redukálószerként a NADPH-t alkalmazzák. Például az L-glutaminsav bioszintetikus reakcióútja során a glutamin dehidrogenáz enzim működéséhez NADPH-koenzimet igényel. Az L-lizin bioszintetikus reakcióútján pedig az aszpartát-szemialdehid dehidrogenáz, dihidropikolát reduktáz enzim igényli a NADPH-koenzimet.

A többi L-aminosav bioszintetikus reakcióútján is fontos szerepet játszik a NADPH-koenzim. Ezenfelül számos L-aminosav bioszintetikus reakcióútján az Lglutaminsav esszenciális aminocsoport-donor, ezért az L-aminosavak bioszintézise során az aminocsoportok beépüléséhez is szükséges a NADPH.

A NADPH elsősorban a glükóz anyagcsere során termelődik, egy pentóz-foszfát-ciklusban, amelyben szerepet játszanak a glükóz-6-foszfát dehidrogenáz és a foszfoglükonát dehidrogenáz enzimek. Kiszámítható, hogy a pentóz-foszfát-ciklusban egy molekula glükóz lebomlása során 12 molekula NADPH keletkezik, mivel a ciklus végterméke szén-dioxid.

Továbbá, a redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid (a továbbiakban: NADH) a NADPH-hoz rendkívül hasonló molekula, azonban a legtöbb esetben az L-aminosavak bioszintézisében nem játszik szerepet. A NADH a trikarbonsavciklusban bioszintetizálódik, és általában a sejtekben elegendő mennyiségben jelen van.

Az L-aminosavak bioszintetikus reakcióútjairól elmondhatjuk, hogy amennyiben a kívánt L-aminosav bioszintézise glükózból kiindulva történik, számos olyan melléktermék keletkezik, melyet a sejt nem képes hatékonyan hasznosítani. Feltételezhető, hogy az ilyen melléktermékek rendszerint a trikarbonsavcikluson keresztül oxidálódnak, minek eredményeként a sejtben nagy mennyiségű NADH keletkezik.

A következő hipotézist állítottuk fel: amennyiben valamely mikroorganizmus alkalmazásával egy termelési eljárás során valamely célvegyületet termeltetünk, a mikroorganizmusnak nagy mennyiségű NADPH-ra van szüksége, minek következtében a rendelkezésre álló glükóz a NADPH termelődése során elkerülhetetlenül elfogy, amiből következően a célvegyület cukorfogyásra számított termelékenysége csökken (1. hipotézis).

Felállítottuk továbbá a következő hipotézist is: amennyiben valamely mikroorganizmus alkalmazásával egy célvegyületet termeltetünk, a mikroorganizmusban elkerülhetetlenül felhalmozódnak célvegyület termelése során olyan melléktermékek, melyeket a sejt nem képes hatékonyan hasznosítani, mely melléktermékek a trikarbonsavcikluson keresztül bomlanak le, mely folyamat növeli a sejtben a NADH-koncentrációt (2. hipotézis). A fenti 1. és 2. hipotézisek alapján feltételeztük, hogy amennyiben a sejten belüli NADH-t hatékonyan át tudjuk alakítani NADPH-vá, megtakaríthatjuk azt a cukormennyiséget, amit a mikroorganizmus a NADPH bioszintézise érdekében fogyaszt el, és ily módon a célvegyületet nagyobb termelékenységgel állíthatjuk elő. Azt is feltételeztük továbbá, hogy a transzhidrogenáz enzim alkalmas arra, hogy a trikarbonsavciklusban keletkezett NADH-t NADPH-vá alakítsuk át.

Kísérleteket végeztünk a fenti hipotézisek igazolására. Alapos kísérleti munkával igazoltuk, hogy egy Escherichia nemzetségből származó baktériumból izolált transzhidrogenáz gént tartalmazó DNS-fragmens alkalmazásával lehetséges mikroorganizmusok redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-termelő képességét fokozni. Azt találtuk továbbá, hogy különböző célvegyületek termelése során a termelékenység fokozódik az említett fokozott redukált nikotinamid-adenin-dinukleotidfoszfát-termelő képességű mikroorganizmusokban.

Az alábbiakban felsoroljuk a találmány szerinti megoldás legelőnyösebb megvalósítási módjait:

(1) Eljárás valamely célvegyület előállítására mikroorganizmus alkalmazásával, mely eljárás a következő lépéseket foglalja magában:

valamely mikroorganizmust olyan tápközegben tenyésztünk, amely alkalmas arra, hogy a mikroorganizmus a célvegyületet előállítsa, és az a tápközegben felhalmozódjék; és a célvegyületet a tápközegből kinyerjük, és amely eljárás szerint fokozott redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát-termelő képességű mikroorganizmusokat alkalmazunk.

(2) Az (1) megvalósítási mód szerinti eljárás, amelyben célvegyületként valamely L-aminosavat állítunk elő.

(3) A (2) megvalósítási mód szerinti eljárás, amelyben L-aminosavként a következő aminosavak valamelyikét állítjuk elő: L-treonin, L-lizin, L-glutaminsav, L-leucin, L-izoleucin, L-valin és L-fenil-alanin.

(4) Az (1) vagy (2) megvalósítási mód szerinti eljárás, amelyben mikroorganizmusként Escherichia nemzetséghez tartozó mikroorganizmust alkalmazunk.

(5) Az (1) vagy (2) megvalósítási mód szerinti eljárás, amelyben mikroorganizmusként coryneform baktériumot alkalmazunk.

HU 221 120 Β1 (6) Az (1)-(5) megvalósítási módok bármelyike szerinti eljárás, amelyben az alkalmazott mikroorganizmus redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát-termelő képességét oly módon javítjuk, hogy a mikroorganizmus-sejtben a nikotinamid-nukleotid transzhidrogenáz enzim aktivitását fokozzuk.

(7) A (6) megvalósítási mód szerinti eljárás, amelyben az alkalmazott mikroorganizmus redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát-termelő képességét oly módon javítjuk, hogy a mikroorganizmus-sejtben a nikotinamid-nukleotid transzhidrogenáz gén expressziójának mértékét fokozzuk.

(8) A (7) megvalósítási mód szerinti eljárás, amelyben az alkalmazott mikroorganizmus redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát-termelő képességét oly módon fokozzuk, hogy a mikroorganizmus-sejtben növeljük a nikotinamid-nukleotid transzhidrogenáz gén kópiaszámát.

A találmány szerinti, mikroorganizmus alkalmazásán alapuló eljárással előállíthatunk például különböző L-aminosavakat, például L-treonint, L-lizint, L-glutaminsavat, L-leucint, L-izoleucint, L-valint vagy L-fenil-analint. A találmány szerinti eljárással előállíthatunk egyéb olyan célvegyületeket is, melyek bioszintéziséhez NADPH szükséges, ilyen célvegyületek például a nukleinsavak, például a guanilsav vagy az inozilsav, a vitaminok, az antibiotikumok, a növekedési faktorok és egyéb fiziológiailag aktív anyagok, melyeket előállítanak hagyományos mikroorganizmusok alkalmazásán alapuló eljárásokkal is. Továbbá fölösleges hangsúlyoznunk azt a tényt, hogy természetesen a találmány szerinti eljárással elő lehet állítani olyan célvegyületeket is, melyeket mindeddig nem termeltettek mikroorganizmusokkal, feltéve, hogy a célvegyület bioszintéziséhez NADPH jelenléte szükséges. A streptomycin bioszintézise esetén például a dTDP-4-oxo-4,6-didezoxiD-glükóz szintéziséhez, mely dTDP-glükózból indul ki, szükséges a NADPH jelenléte. Ezenfelül a peptid antibiotikumok esetén például aminosavak szolgálnak prekurzorokként, és ezért bioszintézisükhöz természetesen szükséges NADPH jelenléte. Továbbá, a β-laktám-antibiotikum penicillin prekurzorai az L-valin, L-cisztein és az L-a-adipinsav, és ezért a penicillin bioszintéziséhez is szükséges NADPH jelenléte. Amennyiben meg kívánjuk állapítani, hogy egy bizonyos célvegyület bioszintéziséhez szükséges-e NADPH jelenléte, ezt a tényt megtudhatjuk, ha megvizsgáljuk az illető célvegyület bioszintetikus reakcióútját, amennyiben azt már felderítették.

A találmány szerinti megoldásban használható mikroorganizmusok tekintetében nincsen semmi speciális korlátozás, feltéve, hogy olyan mikroorganizmusról van szó, melyet már eddig is alkalmaztak különféle célvegyületek előállítására, ilyenek például az Escherichia nemzetséghez tartozó baktériumok, a coryneform baktériumok, a Bacillus nemzetséghez tartozó baktériumok, valamint a Serratia nemzetséghez tartozó baktériumok. Előnyösen olyan mikroorganizmust alkalmazunk, melynek esetén rendelkezésünkre áll valamely olyan DNSfragmens, amely tartalmazza egy, az adott mikroorganizmusból izolált plazmid replikációs origóját, tartalmaz egy transzhidrogenázként működő enzimet kódoló gént, valamint lehetőség van arra, hogy a transzhidrogenáz gén kópiaszámát a mikroorganizmus-sejten belül növeljük. Másrészt elmondhatjuk, hogy előnyösen olyan törzset alkalmazunk, amely már eredetileg is nagy mennyiségben volt képes a kívánt célvegyületet előállítani, és a találmány szerinti megoldás alkalmazásával egy ilyen törzs termelőképességét fokozzuk. Ez azért van így, mert a korábban ismertetett 1. és 2. hipotézis alapján várható, hogy egy eleve nagy termelőképességű törzs esetén a találmány szerinti megoldás alkalmazásával a termelőképesség még inkább fokozható. A találmány szerinti megoldásban L-treonin célvegyület előállítása esetén alkalmazhatunk például Escherichia coli B1996-törzset, L-fenil-alanin előállítása esetén alkalmazhatunk például Escherichia coli AJ12604-törzset (FERM BP-3579), L-glutaminsav előállítása esetén alkalmazhatunk például Escherichia coli AJ 12624törzset (FERM BP-3853), és L-lizin előállítása esetén alkalmazhatunk például Brevibacterium lactofermentum AJ3990-törzset (FERM P-3387, ATCC 31269) és hasonlókat.

Amennyiben a találmány szerinti megoldásban az alkalmazott mikroorganizmustól függően már korábban is használt közismert tápközeget alkalmazunk, nem várható, hogy bármilyen problémával szembekerülnénk. Közelebbről: a találmány szerinti megoldás kivitelezésére alkalmasak az olyan közönséges táptalajok, melyek tartalmaznak szénforrást, nitrogénforrást, szervetlen ionokat és adott esetben egyéb szerves komponenseket. A találmány szerinti megoldás megvalósításához semmilyen különleges táptalaj nem szükséges.

Szénforrásként alkalmazhatunk cukrokat, például glükózt, laktózt, galaktózt, ffuktózt, valamint keményítő hidrolizátumot; alkoholokat, például glicerint és szorbitolt; valamint szerves savakat, például fumársavat, citromsavat, borostyánkősavat és hasonlókat. Nitrogénforrásként alkalmazhatunk például szervetlen ammóniumsókat, például ammónium-szulfátot, ammónium-kloridot és ammónium-foszfátot; szerves nitrogént, például szójabab-hidrolizátumot; ammóniagázt; valamint vizes ammóniaoldatot.

Nyomnyi mennyiségben jelen levő szerves tápanyagként szükség lehet például Bl-vitamin, L-homoszerin és L-tirozin alkalmazására; vagy kívánt esetben tartalmazhat a táptalaj megfelelő mennyiségű élesztőkivonatot is. Kívánt esetben adhatunk a tápközegben kis mennyiségben kálium-foszfátot, magnézium-szulfátot, vasionokat, mangánionokat és hasonlókat.

A tenyésztést a már eddig is alkalmazott jól ismert körülmények között végezzük, mely körülmények az alkalmazott mikroorganizmustól függenek. Közelebbről: előnyös a tenyésztést 16-120 órán keresztül, aerob körülmények között folytatni. A tenyészet hőmérsékletét úgy szabályozzuk, hogy az 25 és 45 °C között legyen, a tenyészet pH-ját pedig 5 és 8 között szabályozzuk a tenyésztés időtartama alatt. A pH állítására adott esetben szervetlen vagy szerves savakat vagy lúgos anyagokat, valamint ammóniagázt alkalmazhatunk.

HU 221 120 Bl

A tenyésztés befejezését követően a találmány szerinti megoldásban semmilyen különleges eljárást nem szükséges alkalmazni a termelődött célvegyület izolálására. Közelebbről a találmány szerinti megoldás alkalmazásával a célvegyületet hagyományos jói ismert eljárások kombinálásával izolálhatjuk, ilyenek például az ioncserélő gyanták alkalmazása, a kicsapásos eljárások és hasonlók.

A találmány szerinti megoldás alkalmazásával úgy fokozhatjuk például egy mikroorganizmus NADPHtermelő képességét, hogy fokozzuk a mikroorganizmussejtek transzhidrogenáz enzimaktivitását.

A mikroorganizmus-sejtekben oly módon fokozhatjuk például a transzhidrogenáz enzimaktivitást, hogy egy transzhidrogenáz gén expressziójának mértékét fokozzuk. Eljárhatunk úgy továbbá, a transzhidrogenáz enzimaktivitás fokozása céljából, hogy egy transzhidrogenáz gént úgy módosítunk, hogy arról fokozott aktivitású transzhidrogenáz termelődjék.

Egy transzhidrogenáz gén expressziójának mértékét valamely mikroorganizmus-sejtben úgy fokozhatjuk például, hogy a transzhidrogenáz gén kópiaszámát növeljük.

Amennyiben a transzhidrogenáz gén kópiaszámát fokozni kívánjuk valamely mikroorganizmus-sejtben, szükséges, hogy rendelkezzünk egy olyan DNS-fragmenssel, amely az említett gént tartalmazza. Megklónoztak például egy transzhidrogenáz gént az Escherichia nemzetséghez tartozó Escherichia coli K12törzsből, és a gén nukleotidsorrendjét meg is határozták [D. M. Clarké és munkatársai: Eur. J. Biochem., 158, 647 (1986)]. Ily módon az említett gént tartalmazó DNS-fragmenst előállíthatjuk D. M. Clarké és munkatársai eljárása szerint. Továbbá a kívánt DNS-fragmens előállítható valamely hibridizációs eljárás alkalmazásával is, amely szerint a D. M. Clarké és munkatársai által feltárt nukleotidszekvencia alapján szintetikus DNS-hibridizációs próbát állítunk elő, de előállíthatjuk a kívánt fragmenst PCR-eljárással is, amelyben az említett DNS-szekvencia alapján tervezett szintetikus DNSláncindítókat alkalmazunk. Amennyiben a transzhidrogenáz gént tartalmazó DNS-fragmenst az alkalmazni kívánt mikroorganizmusban önállóan replikálódni képes vektorba Egáljuk, melyet aztán az említett mikroorganizmusba juttatunk, lehetővé válik a transzhidrogenáz gén kópiaszámának növelése.

Amennyiben egy Escherichia nemzetséghez tartozó baktériumból kívánjuk a transzhidrogenáz gént megklónozni PCR-eljárás alkalmazásával, az alkalmazott DNS-láncindítót megszintetizálhatjuk például az Escherichia coli esetén ismert szekvencia alapján [D. M. Clarké és munkatársai: Eur. J. Biochem., 158, 647 (1986)]. Mivel a transzhidrogenáz enzim két alegységből áll, szükség lehet mint a pntA-, mind pedig a pntBgének amplifikálására. Alkalmazhatjuk például az alábbi szekvenciájú láncindítókat: 5’-CTGATTTTTGGA TCCAGATCACAG-3’ (szekvenciaazonosító szám: 1) és 5’-CGTTCTGTTA AGCTTTCTCAATAA-3’ (szekvenciaazonosító szám: 2), mely láncindítók alkalmazásával egy körülbelül 3 kb hosszúságú régiót amplifíkálhatunk, amely tartalmazza mind a ptnA-, mind pedig a ptnB-gént. Ezek a láncindítók kismértékben különböznek a D. M. Clarké és munkatársai által megadott láncindító szekvenciáktól. A szekvencia kis megváltoztatásával azonban lehetőség nyílt arra, hogy a ptnA- és ptnB-génektől 5’-irányban beépítsünk egy BamHI-hasítóhelyet, és a ptnA- és ptnB-génektől 3’irányban pedig beépítsünk egy HindlII-hasítóhelyet. A gének szekvenciájában és környezetükben nem található sem BamHI-, sem pedig HindlII-hasítóhely. Ezért ezen hasítóhelyek beépítése megkönnyíti az amplifikált DNS-fragmens klónozását a beépített restrikciós hasítóhelyeket felismerő enzimek alkalmazásával, és ily módon lehetővé válik a kialakított fragmens különböző vektorokba történő beépítése. A DNS-láncindítókat önmagában ismert eljárással szintetizáltatjuk meg, például egy „Model 380B” típusú Applied Biosystem által forgalmazott DNS-szintetizátor alkalmazásával, a foszfor-amidid-módszer felhasználásával [Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)]. Az PCR-eljárást végrehajthatjuk például a „Model PJ2000” típusú hőciklizáló berendezés alkalmazásával, melyet a Takara Shuzo Co. cég forgalmaz, és Taq DNS polimeráz felhasználásával, a gyártó előírásai szerint.

A transzhidrogenáz gént tartalmazó DNS-fragmenst előállíthatjuk egyéb mikroorganizmusokból kiindulva is, nem csak az Escherichia nemzetséghez tartozó baktériumokból. A kívánt DNS-fragmenst előállíthatjuk például valamely hibridizációs módszer alkalmazásával, olyan szintetikus DNS-hibridizációs próbát használva, melyet a D. M. Clarké és munkatársai által feltárt nukleotidszekvencia alapján terveztünk, de előállíthatjuk a kívánt DNS-fragmenst PCR-eljárással is, olyan szintetikus DNS-láncindítók alkalmazásával, melyeket szintén az említett nukleotidszekvencia alapján terveztünk.

A hibridizációs eljárásban alkalmazandó DNSpróba vagy a PCR-es klónozási eljárásban alkalmazandó DNS-láncindítók szekvenciáját megfelelő módon megtervezhetjük például az Escherichia coli esetén ismeretes szekvencia alapján [D. M. Clarké és munkatársai: Eur. J. Biochem., 158, 647 (1986)]. Nyilvánvaló, hogy a keresett gén szekvenciája valamennyi különböző mikroorganizmus esetén különböző. Ezért kívánatos olyan szintetikus DNS-eket előállítani, melyek szekvenciája valamely konzervált régió szekvenciájával egyezik meg, mely konzervált régió hasonló szekvenciájú valamennyi kívánt mikroorganizmusból származó transzhidrogenáz gén esetén.

A PCR-eljárással amplifikált transzhidrogenáz gént olyan vektorba Egáljuk, amely képes az Escherichia nemzetséghez tartozó baktériumokban önállóan replikálódni, amennyiben az a célunk, hogy a transzhidrogenáz gént az Escherichia nemzetséghez tartozó baktériumba juttassuk, vagy az Escherichia nemzetséghez tartozó baktériumsejtekbe juttassuk. Amennyiben az előállított transzhidrogenáz gént tartalmazó DNS-fragmenst nem az Escherichia nemzetséghez tartozó baktériumba, hanem valamely más mikroorganizmusba kívánjuk juttatni, az említett DNS-fragmenst olyan vek5

HU 221 120 Β1 torba ligáljuk, amely képes önállóan replikálódni azon mikroorganizmus-sejtekben, melyekbe az említett DNS-fragmenst be kívánjuk juttatni, és a vektort bejuttatjuk az említett sejtekbe.

A találmány szerinti megoldásban vektorként előnyösen plazmidvektor-DNS-t alkalmazunk, alkalmazhatjuk például a következő plazmidokat: pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, RSF1010 és hasonlók. Az elmondottakon túl alkalmazhatunk fág-DNSvektorokat is. Abból a célból, hogy a kívánt mikroorganizmusban a bejuttatott transzhidrogenáz gént hatékonyan expresszáltatni tudjuk, alkalmazhatunk valamely mikroorganizmusokban működőképes promotert is, például lac-, trp- vagy PL-promotert. Az elmondottakon túl, a transzhidrogenáz gén kópiaszámának növelése céljából eljárhatunk úgy is, hogy az említett gént tartalmazó DNS-fragmenst a mikroorganizmus kromoszómájába integrálta tjük, például transzpozon alkalmazásán alapuló eljárással [Berg D. E. és Berg C. M.: Bio/Technol., 1, 417 (1983)], de alkalmazhatunk erre a célra μfágot (2-109985 számú japán szabadalmi leírás), vagy homológ rekombinációt is [„Experiments in Molecular Genetics”, Cold Spring Harbor Láb. (1972)].

Amennyiben az említett gént valamely coryneform baktériumba kívánjuk bejuttatni, a találmány szerinti megoldásban előnyösen vektor-DNS-ként olyan plazmidvektort alkalmazunk, amely képes önállóan replikálódni coryneform baktériumban, például a pAM33Oplazmidot (1-11280 számú japán szabadalmi közzétételi irat), vagy a pHM1519-plazmidot (58-77895 számújapán szabadalmi leírás).

Abból a célból, hogy a potenciálisan fokozott transzhidrogenáz enzimaktivitású törzsek közül kiválasszuk a valóban fokozott transzhidrogenáz enzimaktivitással rendelkező törzseket, alkalmazhatunk például egy önmagában ismert eljárást [Dávid M. Clarké és Philip D. Bragg: Journal of Bacteriology, 162, 367 (1985)], amely alkalmas arra, hogy igazoljuk a transzhidrogenáz enzimaktivitás fokozódását.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.

Az 1. ábrán a pMW: :THY-plazmid előállításának vázlatát láthatjuk.

A 2. ábrán a pHSG:: TH YB-plazmid előállításának vázlatát mutatjuk be.

A 3. ábrán a pSU:: THY-plazmid előállításának vázlatát láthatjuk.

A találmány szerinti megoldást az alábbiakban a bemutatott példák segítségével kívánjuk részletesebben szemléltetni.

1. példa

A transzhidrogenáz gén klónozása

Az Escherichia coli transzhidrogenáz enzimét kódoló ptnA- és ptnB-gének nukleotidszekvenciáját már korábban meghatározták [D. M. Clarké és munkatársai: Eur. J. Biochem., 158, 647 (1986)], és közölték, hogy a ptnA- és ptnB-gének sorrendben 502 és 462 aminosavból álló fehérjéket kódolnak. Ezenfelül az is ismert volt, hogy a transzhidrogenáz enzimaktivitás megnyilvánulásához szükség van mind a két fehérje jelenlétére, az is ismert volt továbbá, hogy a ptnA- és ptnBgének a kromoszomális DNS-en egymás után helyezkednek el, valamint az, hogy az elmondottak következtében lehetőség van a két gén egy DNS-fragmensen történő megklónozására.

Az egymást követő klónozási művelet megkönnyítése céljából nemcsak a ptnA- és ptnB-géneket tartalmazó DNS-régiót klónoztuk meg, hanem a génektől 5’irányban elhelyezkedő promoteraktivitású régiót is. Közelebbről, PCR-amplifikáció útján megklónoztuk egy olyan DNS-fragmenst, amely tartalmazta az említett géneket és az említett promoterrégiót is.

A PCR-eljárást önmagában ismert módon hajtottuk végre, a következő szekvenciájú szintetikus láncindító oligonukleotidok alkalmazásával: 5’-CTGATTTTTGGATCCAGATCACAG-3’ (szekvenciaazonosító szám: 1) és 5’-CGTTCTGTTAAGCTTTCTCAA TAA-3’ (szekvenciaazonosító szám: 2). A PCR-eljárásban templát-DNS-ként az Escherichia coli K12MC1061 törzsből izolált teljes genomi DNS-t alkalmaztuk. A genomi DNS izolálását Saitoh és Miura eljárása szerint végeztük [Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)]. A templát-DNS és az említett két PCR-láncindító alkalmazásával amplifikáltuk a cél-DNS-fragmenst, Erlich és munkatársai eljárásai szerint [,,PCR Technology”, Stockton Press, (1989)]. A láncindítóként használt szintetikus DNS-molekulák szekvenciája középső részükben kismértékben különbözött a D. M. Clarké és munkatársai által megadott szintetikus DNSfragmensek szekvenciájától. Erre a változtatásra azért volt szükség, hogy a szintetikus láncindító oligonukleotidok szekvenciájában kialakítsuk a BamHI- és HindlIIhasítóhelyeket. Az újonnan kialakított restrikciós hasítóhelyek megkönnyítették az amplifikált DNS-fragmens vektor-DNS-be történő beépítését. A restrikciós hasítóhelyek kialakítása a PCR-folyamat során a kromoszomális DNS és a láncindító oligonukleotidok között nem párosodó bázisok jelenlétét idézte elő. Mindazáltal a kialakított nem párosodó párosok nem befolyásolták a PCR-es DNS-amplifikáció hatékonyságát, mivel a kialakított restrikciós hasítóhelyek a szintetikus láncindító DNS-fragmensek központi részén helyezkedtek el. A PCR-eljárás végrehajtása után agaróz-gélelektroforézissel igazoltuk egy 3,0 kb nagyságú DNS-fragmens amplifikálódását.

Az amplifikált 3,0 kb-os DNS-fragmenst, valamint a pMV118-plazmidvektort - amely amplicillinrezisztencia-markert tartalmazott (beszerezhető a Nippon Gene Inc.-tői) - megemésztettük BamHI és HindlII restrikciós enzimekkel. Az emésztett DNS-fragmenst DNS ligáz alkalmazásával összeligáltuk az emésztett vektor-DNS-sel, és ily módon rekombináns DNS-molekulát hoztunk létre. A kialakított rekombináns plazmidot pMW: :THY-plazmidnak neveztük (1. ábra).

Az előállított pMW: :THY-plazmiddal Escherichia coli JM109-sejteket (beszerezhető a Takara Shuzo cégtől) transzformáltunk, és ily módon előállítottuk az Escherichia coli JM109 (pMW::THY) transzformánst. Escherichia coli JM109- és Escherichia coli

HU 221 120 Β1

JM109(pMW:: THY)-sejtekből extraktumokat készítettünk, és ismert módszerrel meghatároztuk a sejtkivonatok transzhidrogenáz aktivitását [Dávid M. Clarké és Philip D. Bragg J.: Bacteriology, 162, 367 (1985)]. A kapott eredményeket az 1. táblázatban foglaltuk össze.

1. táblázat

Törzsek	JM109	JM109 (pMW::THY)
Specifikus transzhidrogenáz aktivitás (E/mg fehérje)	1,0	1,7

Amint az az 1. táblázat adataiból kitűnik, az Escherichia coli JM109 (pMW::THY) sejtekben mérhető transzhidrogenáz enzimaktivitás nyilvánvalóan magasabb, mint az Escherichia coli JM109-sejtekben mérhető. A bemutatott eredmények igazolják, hogy a pMW:: THY-plazmidba inszertált DNS-fragmens tartalmazza a transzhidrogenáz gént. A pMW: :THY-plazmidot tartalmazó Escherichia co/z'-sejteket AJ12929törzsnek neveztük el. Az AJ12929-törzset 1993. október 4-én letétbe helyeztük a „National Institute of Bioscience and Humán Technology, Agency of Industrial Science and Technology” intézetnél („Ministry of International Trade and Industry”, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japán; 305), ahol a FERM P-13890 deponálási számot kapta, majd az eredetileg letétbe helyezett törzset a Budapesti Szerződés értelmében elfogadott módon nemzetközi letétbe helyeztük 1994. szeptember 14-én, és a törzs ebből az alkalomból a FERM BP-4798 deponálási számot kapta.

A pMW: :THY-plazmid-DNS-t önmagában ismert eljárás szerint állítottuk elő, és BamHI, valamint HindlII restrikciós enzimekkel emésztettük. A transzhidrogenáz gént tartalmazó 3,0 kb-os DNS-fragmens izolálása céljából. A klóramfenikolrezisztencia-markert tartalmazó pHSG399-plazmidvektort (beszerezhető a Takara Shuzo Co. Ltd. cégtől) BamHI- és HindlIIenzimekkel hasítottuk, és izoláltuk a nagyobbik fragmenst. Ezután összeligáltuk a pHSG399-plazmid nagyobbik BamHI/HindlII-ffagmensét a transzhidrogenáz gént tartalmazó DNS-fragmenssel, DNS-Iigáz alkalmazásával, előállítva ily módon a pHSG: :THY-plazmidot.

A pHSG: :THY-plazmid önállóan képes replikálódni az Escherichia nemzetséghez tartozó mikroorganizmus-sejtekben, de coryneform baktériumokban nem marad fenn stabilan. Ezért egy coryneform baktériumból izolált önállóan replikálódni képes plazmid replikációs origóját bejuttattuk a pHSG:: THY-plazmidba.

A coryneform baktériumokban önállóan replikálódni képes pHM1519-plazmidot (58-77895 számú japán szabadalmi közzétételi irat), elhasítottuk BamHI-restrikciós enzimmel, majd izoláltuk a 3,0 kb-os, replikációs origót tartalmazó DNS-fragmenst. Másik kísérletben a pHSG: :THY-plazmidot is elhasítottuk BamHIenzimmel, miáltal a plazmid linearizálódott. A két említett fragmenst DNS-ligáz alkalmazásával összeligáltuk, előállítva ily módon a pHSG: :THYB-plazmidot (2. ábra). A pHSG: :THYB-plazmidot tartalmazó Escherichia coli törzset AJ12872-törzsnek neveztük el. Az AJ12872-törzset 1993. október 4-én letétbe helyeztük a „National Institute of Bioscience and Humán Technology, Agency of Industrial Science and Technology” Intézetnél („Ministry of International Trade and Industry”), ahol a FERM P-13889 deponálási számot kapta, majd a Budapesti Szerződés értelmében 1994. szeptember 14-én az eredetileg letétbe helyezett törzset nemzetközi letétbe helyeztük, mely alkalomból a törzs a FERM BP-4797 deponálási számot kapta.

Továbbá a pSU18-plazmidot, amely képes önállóan replikálódni az Escherichia nemzetséghez tartozó baktériumsejtekben, és kanamycinrezisztencia-markert tartalmaz [Borja, Bartolome és munkatársai: Gene, 102, 75 (1991)] elhasítottuk BamHI és HindlII restrikciós enzimekkel, és kinyertük a nagyobbik fragmenst. Ezt a nagy fragmenst összeligáltuk a fent leírt transzhidrogenáz gént tartalmazó 3,0 kb-os DNS-fragmenssel, DNS-ligáz alkalmazásával, és ily módon előállítottuk a pSU:: THY-plazmidot (3. ábra). A pSU:: THY-plazmidot tartalmazó Escherichia coli törzset AJ 12930törzsnek neveztük el. Az AJ12930-törzset 1993. október 4-én letétbe helyeztük a „National Institute of Bioscience and Humán Technology, Agency of Industrial Microorganism Breeding, Agency of Industrial Science and Technology” intézetnél („Ministry of International Trade and Industry”), ahol a FERM P-13891 deponálási számot kapta, majd a letétbe helyezett törzset az eredeti letétből nemzetközi letétbe helyeztük, a Budapesti Szerződés alapján, 1994. szeptember 14-én, mely alkalomból a törzs a FERM BP-4799 deponálási számot kapta.

A továbbiakban olyan kísérletek eredményeit ismertetjük, melyekkel igazoltuk, hogy az Escherichia nemzetséghez tartozó, és coryneform baktériumok termelőképessége különböző L-aminosavak vonatkozásában fokozható a baktériumsejtek transzhidrogenáz aktivitásának fokozása révén.

2. példa

L-treonin fermentációs előállítása kívülről bejuttatott transzhidrogenáz gént tartalmazó mikroorganizmustörzs alkalmazásával

Az L-treonintermelő Escherichia coli baktériumok közül a B-3996 törzs [3-501682 (PCT) japán szabadalmi közzétételi irat] rendelkezik a jelenleg ismert törzsek közül a legnagyobb termelőképességgel. Éppen ezért a Β-3996-törzset használtuk a transzhidrogenáz aktivitás fokozása következményének kiértékelésére. A Β-3996-törzs tartalmaz egy pVIC40 jelű plazmidot (W090/04636 számú nemzetközi közzétételi irat), mely plazmidot úgy állították elő, hogy a pAYC32 jelű széles gazdaspecifitású plazmidba, amely streptomycinrezisztencia-markert tartalmaz [Chistoserdov A. Y. és Tsygankov Y. D.: Plasmid, 16, 161 (1986)] beinszertálták a treonin operont. A 3996-törzset a „Research Ins7

HU 221 120 Β1 titute fór Genetics and Industrial Microorganism Breeding” Intézetnél deponálták RIA1867 deponálási számon.

Az 1. példa szerint előállított AJ12929 jelű Escherichia coli törzsből izoláltuk a pMW: :THY-plazmidot Maniatis és munkatársai eljárása szerint [Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T.: „Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1. 21 (1989)]. Az előállított pMW: :THY-plazmidot bejuttattuk a B-3996törzsbe D. M. Morrison eljárásának alkalmazásával [Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)]. A pMW: :THY-plazmiddal transzformált B-3996törzset B-3996 (pMW::THY) törzsnek neveztük el. A Β-3996-törzset és a B-3996 (pMW:: THY) törzset az alábbi körülmények között tenyésztettük.

A tenyésztést a 2. táblázatban megadott összetételű tápközegben végeztük 38 órán keresztül, 37 °C-on, 114-116 fordulat/perces rázatás mellett. A 2. táblázatban megadott A, B és C összetevőket egymástól elkülönítve készítettük el, külön-külön sterilizáltuk és lehűtöttük azokat, majd a következő arányban kevertük őket össze: 16/20 térfogat A komponens, 4/20 térfogat B komponens, és 30 g/1 C komponens. A kísérleti eredmények igazolták, hogy amennyiben az Escherichia nemzetséghez tartozó L-treonint termelő baktérium intracelluláris transzhidrogenáz aktivitását fokozzuk, az L-treonintermelő képesség fokozódik.

2. táblázat

A treonintermelő tápközeg összetétele

		g/1
(A)	(NH₄)₂SO₄	16
	kh₄po₄	1
	MgSO₄7H₂O	1
	FeSO₄7H₂O	0,01
	MnSO₄5H₂O	0,01
	Élesztőkivonat (Difco)	2
	L-Met	0,5

A pH-t 7,0-ra állítjuk KOH alkalmazásával, majd 115 °C-on 10 percig autoklávozzuk (16/20)

(B)	20% glükóz 115 °C-on 10 percig autoklávozzuk (4/20 térfogat)
(C)	Pharmacopoiea CaCO₃ 180 °C-on 2 napig autoklávozzuk (30 g/1)

Antibiotikumok (sztreptomicin: 100 pg/ml, kanamycin: 5 pg/ml)

3. táblázat

Törzsek	B-3996	B-3996 (pMW::THY)
treonin (g//l)	12,97	13,99

3. példa

L-lizin fermentációs előállítása kívülről bejuttatott transzhidrogenázt tartalmazó mikroorganizmus-törzs alkalmazásával

A példában bemutatott kísérlettel azt kívántuk eldönteni, hogy egy L-lizin termelő coryneform baktériumban az intracelluláris transzhidrogenáz aktivitás fokozása fokozza-e az L-lizintermelő képességet. L-lizintermelő coryneform baktériumként Brevibacterium lactofermentum AJ3990-törzset alkalmaztunk. Az AJ3990-törzset a „National Institute of Bioscience and Humán Technology, Agency of Industrial Science and Technology” Intézetnél helyezték letétbe („Ministry of International Trade and Industry”), FERM P-3387 deponálási számon. Az 1. példa szerint előállított Escherichia coli AJ 12872 törzsből Maniatis és munkatársai eljárásával [Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1, 21 (1989)] izoláltuk a pHSG::THYB-plazmidot. Az izolált plazmidot elektromos pulzus alkalmazásán alapuló transzformációs eljárással (2-207 791 számú japán szabadalmi közzétételi irat) juttattuk be az AJ-3390-törzsbe. A pHSG::THYB-plazmiddal transzformáit AJ3990-törzset AJ3390(pHSG: : THYB)törzsnek neveztük el. Az AJ3990 törzset és az AJ3990(pHSG: :THYB)-törzset az alábbi körülmények között tenyésztettük.

A tenyésztést a 4. táblázatban megadott összetételű tápközegben 72 órán keresztül 31,5 °C-on végeztük, 114-116 fordulat/perc rázatás mellett. A tápközegben cukorként három különböző cukrot alkalmaztunk: glükózt, szacharózt és ffuktózt. A tenyésztések eredményét az 5. táblázat foglalja össze. A kísérlet eredményeként kitűnt, hogy amennyiben egy L-lizintermelő coryneform baktériumban fokozzuk az intracelluláris transzhidrogenáz aktivitást, az L-lizintermelő képesség fokozódik.

4. táblázat

Lizintermeltető tápközeg

Cukor	36 g/1
NH₄C1	20 g/1
kh₂po₄	1 g/1
MgSO₄6H₂O	0,4 g/1
FeSO₄7H₂O	10 mg
MnSO₄4H₂O	8 mg
Szójababfehérje-hidrolizátum (nitrogénforrásként)	1 mg
Tiamin-HCl	100 mg
Biotin	300 mg

Miután az oldatot 10 percig 115 °C-on autoklávozzuk, 3% elkülönítve sterilizált kalcium-karbonátot adunk hozzá.

HU 221 120 Β1

5. táblázat

A felhalmozódott lizin-hidroklorid mennyisége (g/1)

	AJ3990	AJ3990(pHSG::THYB)
Glükóz	13,6	14,5
Szaharóz	11,1	12,6
Fruktóz	8,2	11,9

4. példa

L-fenil-alanin fermentációs előállítása kívülről bejuttatott transzhidrogenázt tartalmazó törzs alkalmazásával

A példában bemutatott kísérlettel azt kívántuk eldönteni, hogy vajon egy Escherichia nemzetséghez tartozó L-fenil-alanint termelő baktériumban az intracelluláris transzhidrogenáz aktivitás fokozása fokozza-e az L-fenil-alanin-termelő képességet. Escherichia nemzetséghez tartozó L-fenil-alanin-termelő baktériumként az Escherichia coli AJ12604-törzset használtuk. Az AJ12604-törzs tartalmazza a pBR-aroG4-plazmidot melyet úgy állítottak elő, hogy az ampicillinrezisztencia-markert tartalmazó pBR322-plazmidvektorba beépítettek egy mutáns aroG-gént -, valamint a pACMAB-plazmidot, melyet úgy állítottak elő, hogy a chloramphenicolrezisztencia-markert tartalmazó pACYC184-vektorplazmidba beépítettek egy mutáns pheA-gént (5-236947 számú japán szabadalmi közzétételi irat). Az AJ12604-törzset 1991. január 28-án helyeztük letétbe a „National Institute of Bioscience and Humán Technology, Agency of Industrial Science and Technology” Intézetnél („Ministry of International Trade and Industry”), ahol a FERM P-11975 deponálási számot kapta, majd a letétbe helyezett törzset 1991. szeptember 26-án az eredeti letétből nemzetközi letétbe helyeztük a Budapesti Szerződés értelmében, mely alkalomból a törzs a FERM BP-3579 deponálási számot kapta. Az 1. példa szerint előállított AJ 12930 jelű Escherichia törzsből Maniatis és munkatársai eljárása szerint [Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 7, 21 (1989)] izoláltuk a pSU: :THY-plazmidot. Az előállított plazmidot D. M. Morrison eljárása szerint [Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)] bejuttattuk az AJ12604-törzsbe. A pSU: :THY-plazmiddal transzformáit AJ12604-törzset AJ12604(pSU: : THY)törzsnek neveztük el. Az AJ12604-törzset és az AJ12604(pSU: :THY)-törzset az alábbi körülmények között tenyésztettük.

A tenyésztést a 6. táblázatban megadott összetételű tápközegben végeztük 16 órán át, 37 °C-on, 114-116 fordulat/perc-es rázatás mellett. A tenyésztés eredményeit a 7. táblázat foglalja össze. A kísérlet eredményei igazolták, hogy amennyiben egy Escherichia nemzetséghez tartozó L-fenil-alanin-termelő baktériumban fokozzuk az intracelluláris transzhidrogenáz aktivitást, az L-fenil-alanin-termelő képesség is fokozódik.

6. táblázat

Fenil-alanin-termeltető tápközeg

	(g/1)
Glükóz	20
Na₂HPO₄	29,4
KH₂PO₄	6
NaCl	1
NH₄C1	2
Nátrium-citrát	20
Nátrium-L-glutamát	0,4
MgSO₄7H₂O	3
CaCl₂	0,23
Tiamin-HCl	2 mg
L-tirozin	75 mg

perces 115 °C-on végzett autoklávozást követően 3% külön sterilezett kalcium-karbonátot adunk a tápoldathoz.

7. táblázat

Törzs	AJ 12604	AJ 12604 (pSU: :THY)
L-fenil-alanin	4,28	4,89
felhalmozódás mennyisége (g/1)	3,75	4,28

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 24

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: egyéb... szintetikus DNS

HIPOTETIKUS: nem

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTGATTTTTG GATCCAGATC ACAG 24 A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: