CZ291499B6

CZ291499B6 - Způsob výroby chemických látek

Info

Publication number: CZ291499B6
Application number: CZ19961213A
Authority: CZ
Inventors: Hiroyuki Kojima; Kazuhiko Totsuka
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc.
Priority date: 1993-10-28
Filing date: 1994-10-26
Publication date: 2003-03-12
Also published as: CA2175042A1; PL185681B1; CN1139956A; EP0733712B1; HUT74840A; CZ121396A3; ES2166788T3; WO1995011985A1; DE69429452T2; CA2175042C; CN1082092C; SK283058B6; EP0733712A4; BR9407907A; AU8002694A; DE69429452D1; KR960705947A; DK0733712T3; EP0733712A1; ATE210728T1

Abstract

Produkce c lov²ch chemick²ch l tek, jako jsou L-aminokyseliny, antibiotika, vitaminy, r stov faktory a fyziologicky aktivn slou eniny, kter jsou vytv °eny kvaÜen m za pou it mikroorganismu, je zlepÜov na zv²Üen m produkce redukovan ho nikotinamidadenindinukleotidfosf tu v bu k ch mikroorganismu.\

Description

Způsob výroby chemických látek

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu výroby cílové chemické látky za použití mikroorganismu. K typickým příkladům mikroorganismů, používaných v předkládaném vynálezu, patří mikroorganismy, náležející do rodu Escherichia a koryneformní bakterie, které byly již běžně používané k výrobě různých sloučenin. K cílovým chemickým látkám zde vyráběným patří L-aminokyseliny, antibiotika, vitaminy, růstové faktoiy, fyziologicky aktivní látky a jiné látky, obecně produkované mikroorganismy. Tato přihláška předkládá způsob, zlepšující produktivitu postupu výroby cílové chemické látky za použití mikroorganismů.

Dosavadní stav techniky

Kvašení L-aminokyselin je typicky doloženo jako dobře známý způsob výroby cílové chemické látky za použití mikroorganismu. L-aminokyseliny se používají nejen do koření a jídel, ale také jako složky různých léčebných výživných směsí, jako přídavky krmných směsí pro zvířata, činidla ve farmaceutickém a chemickém průmyslu a dále jako růstové faktory k výrobě L-aminokyselin, jako je L-lysin a L-homoserin za použití mikroorganismu.

Koryneformní bakterie, mikroorganismy patřící do rodů Escherichia, Bacillus, Serratia a podobně, jsou známé jako mikroorganismy, jichž lze použít ke kvasné výrobě L-aminokyselin.

Ke kvasné výrobě L-aminokyselin lze použít divoké typy bakterií (kmeny divokých typů), auxotrofní kmeny indukované z kmenů divokého typu, metabolické regulační mutanty indukované z kmenů divokého typu jako mutanty odolné vůči růžným léčivům, a kmeny, mající vlastnosti jak auxotrofních kmenů, tak i metabolických regulačních mutantů. Sloučeniny, vyžadované auxotrofními kmeny, se liší v závislosti na jednotlivých kmenech a auxotrofní kmeny, které vyžadují shodné sloučeniny, se liší stupněm auxotrofie. Podobně vykazují odlišnosti i metabolické regulační mutanty, získané jako mutanty, odolné vůči různým léčivům.

V nedávné době byla pro kvašení (fermentací) L-aminokyselin používána technika rekombinantní DNA. Teoretický základ této techniky spočívá v posílení biosyntetického systému L-aminokyseliny v hostitelském mikroorganismu obohacením genu(ů), kódujících enzym(y) biosyntézy L-aminokyseliny. Podrobnosti takové techniky jsou popsány například v práci „Amino Acid Fermentation, Society Přes Japan (1986)“.

Ovšem mikroorganismy, běžně používané v kvasné výrobě L-aminokyselin, vykazují biosyntetické dráhy, zahrnující dráhy biosyntézy L-aminokyseliny a dráhy biosyntézy koenzymů, shodné s těmi, které se vyskytují u mikroorganismů divokého typu. Mikroorganismy produkující L-aminokyseliny byly namnoženy desenzitizací inhibice konečným produktem nebo jiným produktem, existujícím v biosyntetické dráze L-aminokyseliny. K dosažení takového namnožení bylo použito například poskytnutí auxotrofních vlastností či odolnosti vůči lékům buňkám mikroorganismu, nebo zmnožení genu(ů), kódujícího biosyntetický enzym (enzym) technikou rekombinace DNA.

Kvašením pomocí mikroorganismů lze vyrábět mnoho sloučenin, odlišných od L-aminokyselin. Jako příklady takových sloučenin jsou uváděny vitaminy a antibiotika. Existuje mnoho typů antibiotik a jako prekurzorů biosyntézy takových antibiotik se používá množství látek. Například se používají cukry, aminokyseliny, kyselina octová, kyseliny propionová a mevalonová. Cílové antibiotikum je z takových prekurzorů vyráběno postupem konverze (přeměny) různých metabolitů, odlišných od prekurzorů. Stejný mechanismus je pozorován u vitaminů a jiných biogenních sloučenin.

Při výrobě výše zmíněných sloučenin za použití mikroorganismu je každá sloučenina vyráběna biosyntetickou dráhou v buňkách mikroorganismu. Jedním z důležitých koenzymů, nezbytným pro účinné fungování odpovídajících enzymů biosyntetického systému, je redukovaný „nikotinamidadenindinukleotidfosfát“, uváděný zde dále jako NADPH. Ovšem vztah mezi NADPH a produkcí sloučenin za použití mikroorganismu nebyl popsán.

Enzym nikotinamiddinukleotidtranshydrogenáza, dále zde pro zjednodušení uváděný jako „transhydrogenáza“, je známý jako jeden z enzymů, které odpovídají za produkci NADPH. Je známo, že tento enzym je přítomný v různých organismech včetně mikroorganismů, patřících k rodu Escherichia. V Escherichia coli, typickém mikroorganismu patřícím do rodu Escherichia, bylo provedeno vyčištění transhydrogenázy (David M. Clarke a Philip D. Bragg; Eur.

J. Biochem. 149, 517-523, 1985) klonování genu, který ji kóduje (David M. Clarke a Philip

D. Bragg; J. Bacteriology 162, 367-373, 1985), a stanovení sekvence nukleotidů genu) David M. Clarke, Tip W. Loo, Shirley Gillam a Philip D. Bragg; Eur. J. Biochem. 158, 647-653, 1986), stejně jako byla potvrzena (ozřejměna) existence enzymu. Fyziologická funkce enzymu je však stále téměř neznámá. To typicky ukazuje skutečnost, že defektní varianty enzymu nevykazují žádnou fenotypovou expresi.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je zlepšit produktivitu výroby cílové chemické látky za použití mikroorganismu, zahrnující kroky kultivace mikroorganismu v kultivačním médiu k umožnění produkce cílové sloučeniny a její akumulace v kultivačním médiu, a shromažďování cílové sloučeniny z kultivačního média.

Produktivita výroby cílové chemické látky byla běžně zvyšována desenzitizací zpětné regulace syntézy konečným produktem (produkty nebo podobnými látkami, vyráběnými biosyntetickou cestou (dráhou) cílové sloučeniny a koenzymu, vyžadovaného pro syntézu cílové chemické látky, která existuje v buňkách mikroorganismu. Konkrétním předmětem předkládaného vynálezu je zajištění prostředků ke zlepšení produktivity výroby cílové chemické látky podle zcela nové teorie, lišící se od teorie, která byla uvedena výše.

Při biosyntéze sloučenin, jako jsou L-aminokyseliny, dochází v živoucím organismu k různým redukčním reakcím. Koenzym NADPH je v mnoha případech fyziologicky používán jako intravitální redukční sloučenina. Enzym glutamátdehydrogenáza například vyžaduje NADPH jako koenzym při biosyntéze kyseliny L-glutamové. Aspartátsemialdehyddehydrogenáza a dihydrodipikolátreduktáza vyžaduje NADPH jako koenzym při biosyntéze L-lysinu.

NADPH má jako koenzym důležitou roli i u jiných cest biosyntézy L-aminokyselin. Kyselina L-glutamová je navíc nezbytná jako donor aminové skupiny u mnoha cest biosyntézy L-aminokyselin a proto jek zabezpečení aminoskupin pro biosyntézu L-aminokyselin vyžadován rovněž NADPH.

NADPH se převážně připravuje využitím metabolismu glukózy v pentózofosfátovém cyklu, v němž jsou obsaženy enzymy glukóza-6-fosfátdehydrogenáza a fosfoglukonátdehydrogenáza. V pentózofosfátovém cyklu lze vypočítat, že účinnost produkce NADPH činí 12 molekul na jednu molekulu glukózy za uvolnění oxidu uhličitého.

Redukovaný nikotinamidadenindinukleotid, dále zde uváděný jako NADH, je molekulou extrémně podobnou NADPH, která však ve většině případů nemůže být využívána pro biosyntézu L-aminokyselin jako koenzym. NADH je biosyntetizován v cyklu TCA (citrátovém cyklu) a v buňce je obvykle přítomno jeho dostatečné množství.

-2CZ 291499 B6

Stejně jako u cest biosyntézy L-aminokyselin, jsou v postupu biosyntézy požadovaných

L-aminokyselin z glukózy často produkovány intravitální složky, které nemohou být účinně upotřebeny. Předpokládá se, že takové složky jsou běžně oxidovány v citrátovém cyklu, čímž je vytvářeno velké množství NADH.

Autoři tohoto vynálezu stanovili hypotézu, že během produkce cílové chemické látky ve výrobním postupu za využití mikroorganismu je vyžadováno velké množství NADPH, k doplňování NADPH je nezbytně spotřebovávána glukóza a následně se snižuje produktivita výroby cílové sloučeniny v poměru ke spotřebovanému cukru (hypotéza 1).

Autoři tohoto vynálezu dále stanovili hypotézu, že intravitální složky, které nemohou být účinně využity během produkce cílové chemické látky, jsou nevyhnutelně v procesu výroby cílové chemické látky pomocí mikroorganismu akumulovány a metabolizovány v citrátovém cyklu, výsledkem čehož je zvýšení koncentrace NADH v buňce (hypotéza 2).

Na základě výše popsaných hypotéz 1 a 2 se předpokládá, že pokud může být intracelulámí NADH účinně přeměňován na NADPH, může být cukr, vyžadovaný pro biosyntézu NADPH pomocí mikroorganismu, zachován a cílová chemická látka může být vyráběna s vyšší produktivitou. Současně se předpokládá, že transhydrogenáza může být použita jako prostředek pro konverzi (přeměnu) NADH, vznikajícího v citrátovém cyklu, na NADPH.

Autoři vynálezu provedli studie na základě výše uvedeného konceptu. Výsledkem důkladných studií byl úspěch autorů vynálezu v tom, že fragment DNA, obsahující gen transhydrogenázy, byl získán z bakterie patřící do rodu Escherichia, a schopnost mikroorganismu produkovat redukovaný nikotinamidadenindinukleotidfosfát byla použitím fragmentu DNA zvýšena. Autoři vynálezu dále zjistili, že produktivita výroby cílové chemické látky se u výše uvedených mikroorganismů, majících zvýšenou schopnost produkovat NADPH, zlepšuje.

Předkládaný vynález jmenovitě obsahuje:

(1) způsob výroby cílové sloučeniny za použití mikroorganismu, zahrnující kroky: kultivace mikroorganismu v kultivačním médiu k umožnění produkce cílové chemické látky a její akumulace v kultivačním médiu; a shromažďování cílové chemické látky z kultivačního média, přičemž uvedený mikroorganismus byl modifikován tak, aby schopnost uvedeného mikroorganismu produkovat redukovaný nikotinamidadenindinukleotidfosfát z redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu byla zvýšena, čímž je zvýšena produktivita uvedeného mikroorganismu vzhledem k redukovanému nikotinamidadenin dinukleotidfosfátu;

(2) způsob podle (1), kde cílovou chemickou látkou je chemická látka, jejíž biosyntéza vyžaduje redukovaný nikotinamidadenin dinukleotidfosfát;

(3) způsob podle (1), kde cílovou chemickou látkou je L-aminokyselina;

(4) způsob podle (2), kde L-aminokyselina je zvolena ze skupiny, skládající se z L-threoninu, L-lysinu, kyseliny L-glutamové, L-leucinu, L-izoleucinu, L-valinu a L-phenylalaninu;

(5) způsob podle (1) či (2), kde mikroorganismem je mikroorganismus, patřící do rodu Escherichia;

(6) způsob podle (1) či (2), kde mikroorganismem je koryneformní bakterie;

(7) způsob podle kteréhokoli z bodů (1) až (6), kde zvýšení produkce redukovaného nikotinamidadenindinukleotidfosfát (NADPH) mikroorganismem je dosaženo zvýšením enzymové aktivity nikotinamidnukleotidtranshydrogenázy v buňkách mikroorganismu;

-3CZ 291499 B6 (8) způsob podle (7), kde zvýšení produkce redukovaného nikotinamidadenindinukleotidfosfát (NADPH) mikroorganismem je dosaženo zvýšením množství exprimovaného genu, kódujícího nikotinamidnukleotidtranshydrogenázy v buňkách mikroorganismu; a (9) způsob podle (8), kde zvýšení produkce redukovaného nikotinamidadenindinukleotidfosfátu (NADPH) mikroorganismem je dosaženo zvýšením počtu kopií genu, kódujícího nikotinamidnukleotidtranshydrogenázu v buňkách mikroorganismu.

Cílovou chemickou látkou, která má být produkována mikroorganismem podle tohoto vynálezu, jsou různé aminokyseliny, jako L-threonin, L-lysin, kyselina L-glutamová, L-leucin, L-izoleucin, L-valin a L-fenylalanin. Z jiných látek než jsou výše uvedené může být za předpokladu, že je při její biosyntéze požadován NADPH, použitelná jakákoli z látek, které byly až dosud produkovány mikroorganismy, jako jsou nukleové kyseliny jako kyselina guanylová a inosinová, vitaminy, antibiotika, růstové faktory a fyziologicky aktivní sloučeniny.

Dále je nutno říci, že i v případě, kdy sloučenina dosud nebyla vyráběna za použití mikroorganismu, lze aplikovat předkládaný vynález za předpokladu, že je k jeho biosyntéze vyžadován NADPH.

Například při biosyntéze streptomycinu je NADPH používán k syntéze dTDP-4-oxo-4,6-dideoxy-D-glukózy z dTDP-glukózy. Aminokyseliny navíc slouží jako prekurzory v případě peptidových antibiotik, a NADPH je tedy k jejich biosyntéze vyžadován jako samozřejmý materiál. Prekurzory penicilinu, beta-laktamového antibiotika, jsou L-valin, L-cystein a kyselina L-alfa-aminoadipová a k jejich syntéze je vyžadován NADPH.

Pokud je třeba vědět, jaká sloučenina vyžaduje ke své biosyntéze NADPH, může být tato skutečnost zjištěna z dráhy její biosyntézy, pokud byla tato biosyntetická dráha již objevena.

Mikroorganismus pro použití v tomto vynálezu není speciálně vymezen, za předpokladu, že patří k mikroorganismům, které byly až dosud používány k produkci sloučenin, jako jsou bakterie patřící krodu Escherichia, koiyneformní bakterie, bakterie patřící krodu Bacillus a bakterie patřící k rodu Serratia.

Přednost se dává takovému mikroorganismu, u něhož lze získat fragment DNA, obsahující začátek replikace plazmidu a funkce genu transhydrogenázy a počet kopií transhydrogenázového genu mohou být zvýšeny. Na druhé straně se jako kmenu, který je používán pro zlepšení produktivity výroby podle tohoto vynálezu, dává největší přednost kmenu, který má původní (vrozenou) schopnost vytvářet cílovou sloučeninu. Předpokládá se, že u kmenu s vysokou produktivitou se účinek zlepšení produktivity podle tohoto vynálezu projeví velmi silně, neboť jevy podle výše popsaných hypotéz 1 a 2 silně působí.

Příkladem jsou kmen Escherichia coli B-3996 a podobné pro cílovou sloučeninu L-threonin, kmen Escherichia coli AJ12604 (FERM BP-3597) a podobné pro cílovou sloučeninu L-fenylalanin, kmen Escherichia coli AJ12624 FERM BP-3853) a podobné pro cílovou sloučeninu kyselinu L-glutamovou a Brevibacterium lactofermentum AJ3990 (FERM P-3387, ATCC 3129) a podobné pro cílovou sloučeninu L-lysin.

Žádné obtíže nenastávají s médiem, používaným k výrobě cílové chemické látky, pokud se v závislosti na zvoleném mikroorganismu používá dobře známé, až dosud používané médium. Vhodné je zejména obyčejné médium, obsahující zdroj uhlíku, zdroj dusíku, anorganické ionty a podle volby další organické složky. K uskutečňování předkládaného vynálezu není potřebné žádné speciální médium.

-4CZ 291499 B6

Pokud se týká zdroje uhlíku, je možné použít cukry jako glukózu, laktózu, galaktózu, fruktózu a škrobový hydrolyzát; alkoholy jako glycerol a sorbitol; a organické kyseliny jako je kyselina fumarová, kyselina citrónová a kyselina jantarová a podobně.

Jako zdroj dusíku je možné použít anorganické amonné soli jako je sulfát amonný, chlorid amonný a fosfát amonný; organický dusík jako hydrolyzát ze sojových bobů; plynný čpavek a čpavkovou vodu.

Je žádoucí, aby jako organické stopové výživné zdroje byly v médiu v příslušných množstvích obsaženy látky jako vitamin Bl, L-homoserin a L-tyrosin; nebo kvasničný extrakt. Kromě výše uvedených se volitelně přidávají malá množství fosfátu draselného, sulfátu hořečnatého, iontu železa, iontu manganu a podobně.

Kultivace se může provádět za dobře známých, až dosud používaných podmínek, které závisejí na použitém mikroorganismu. Přednost se dává zvláště provádění kultivace po dobu 16-120 hodin za aerobních podmínek. Teplota kultivace je udržována mezi 25 až 40 °C a pH je během kultivace udržováno v rozmezí 5-8. Občas mohou být pro úpravu pH použity anorganické či organické kyselé nebo alkalické sloučeniny.

V předkládaném vynálezu se nevyžaduje žádná speciální metoda pro shromáždění metabolického produktu z kapaliny média po skončení kultivace. Předkládaný vynález může být prováděn zejména spojením běžných, dobře známých metod, jako je metoda iontově výměnné pryskyřice, s metodami srážení a podobně.

Prostředky ke zvýšení produkce NADPH mikroorganismem jsou představovány prostředky pro zvýšení enzymové aktivity transhydrogenázy v mikrobiálních buňkách.

Prostředky pro zvýšení enzymové aktivity transhydrogenázy jsou představovány prostředky ke zvýšení množství exprimovaného transhydrogenázového genu v mikrobiálních buňkách. Jiným prostředkem ke zvýšení enzymové aktivity transhydrogenázy je dále modifikace transhydrogenázového genu a vytvoření transhydrogenázy se zvýšenou aktivitou.

Příkladem prostředků pro zvýšení množství exprimovaného transhydrogenázového genu v mikrobiálních buňkách jsou prostředky ke zvýšení počtu kopií transhydrogenázového genu v mikrobiálních buňkách.

Ke zvýšení počtu kopií transhydrogenázového genu je nezbytný fragment DNA, obsahující výše uvedený gen. Transhydrogenázový gen byl klonován u kmene Escherichia coli K-12 jako bakterie, patřící do rodu Escherichia, a byla stanovena jeho nukleotidové sekvence (D. M. Clarke se spol.; Eur. J. Biochem. 158, 647-653, 1986). Příprava fragmentu DNA, obsahujícího výše uvedený gen, je tedy dosažitelná za použití metody, objevené D. M. Clarkem a spoluautory. Požadovaný fragment DNA může být získán také hybridizační metodou za použití sondy syntetické DNA, připravené podle nukleotidové sekvence, objevené D. M. Clarkem a spoluautory, a metodou PCR za použití syntetizovaných primerů (oček, startérů) DNA, připravených vzhledem kvýše uvedené nukleotidové sekvenci. Pokud je fragment DNA, obsahující transhydrogenázový gen, spojen s DNA vektoru autonomně replikovatelné v cílovém mikroorganismu a je provedena inzerce (vložení) do výše zmíněného mikroorganismu, je možné zvýšit počet kopií transhydrogenázového genu.

DNA primer, používaný během klonování transhydrogenázového genu z bakterie, patřící k rodu Escherichia, za použití metody PCR, může být vhodně připraven například na základě známé sekvence z Escherichia coli (D. M. Clarke se spol.; Eur. J. Biochem. 158, 647-653, 1986). Transhydrogenáza obsahuje dvě podjednotky a tak může být nezbytné amplifikovat oba geny pntA a pntB každé z podjednotek. Vhodné jsou dva primery, 5'-CTGATTTTTGGATCCAGATCACAG-3' (sekvence identifik. číslo 1) a 5 -CGTTCTGTTAAGCTTTCTCAATAA-3'

-5CZ 291499 B6 (sekvence id. č. 2), které mohou amplifikovat (rozšířit) oblast o rozsahu 3 kilobází (kb), obsahující jak geny pntA, tak i pntB. Tyto primery jsou slabě odlišné od sekvence, popsané

D. M. Clarkem a spoluautory. Ovšem vzhledem ke změně sekvence je možné zavést místo štěpení účinkem BamHI protisměrně vzhledem k oběma genům, pntA i pntB, a místo štěpení účinkem Hindlll po směru vzhledem k oběma genům, pntA i pntB. Ani místo pro BamHI, ani místo pro Hindm neexistují v obou genech, ani v jejich blízkosti. Hodí se proto v průběhu klonování amplifikovaného fragmentu DNA za pomoci těchto restrikčních enzymů a při transferu do jiné vektorové DNA. Syntéza příměrové DNA může být prováděna obvyklou metodou za použití přístroje DNA Synthesizer Model 380B, vyráběného firmou Applied Biosystems, a použitím fosfoamiditové metody (vit Tetrahedron Letters 22, 1859, 1981). Metoda PCR může být prováděna za použití přístroje DNA Thermal Cycler Model PJ2000, vyráběného firmou Takara Shuzo Co., Ltd., a za použití Taq DNA polymerázy podle metody, popsané výrobcem.

Fragment DNA, obsahující transhydrogenázový gen, může být získán z jiných mikroorganismů než jsou bakterie, náležející k rodu Escherichia. Požadovaný fragment DNA může být získán použitím metody hybridizace za použití sondy syntetické DNA, připravené jako odpovídající nukleotidové sekvenci, objevené D. M. Clarkem a spoluautory, nebo použitím metody PCR za použití primerů syntetické DNA, připravené jako odpovídající výše uvedené sekvenci nukleotidů.

DNA sonda pro použití při hybridizační metodě nebo DNA primery pro použití v klonování genu za použití metody PCR mohou být vhodně připraveny například na základě sekvence, známé z Escherichia coli (D. M. Clarke se spol.; Eur. J. Biochem. 158, 647-653,1986). Je stanoveno, že nukleotidové sekvence genu je pro každý mikroorganismus odlišná. Je tedy žádoucí připravit syntetické DNA, obsahující části, konzervující transhydrogenázy, z každého mikroorganismu.

Transhydrogenázový gen, amplifikovaný (zmnožený) metodou PCR, je při zavádění do bakterie zrodu Escherichia spojen s vektorovou DNA, autonomně replikovatelnou v buňkách bakterie patřící k rodu Escherichia, a zaveden do buněk bakterie, patřící k rodu Escherichia.

V případě zavedení získaného fragmentu DNA s obsahem transhydrogenázového genu do jiného mikroorganismu, než jsou bakterie rodu Escherichia, je výše uvedený fragment spojen s DNA vektoru, autonomně replikovatelnou v buňkách mikroorganismu, podrobeného zavedení (introdukci) výše zmíněného fragmentu DNA, a zaveden do výše uvedených buněk.

DNA plazmidového vektoru je s výhodou schopna použití v předkládaném vynálezu jako DNA vektoru, příkladem kterého jsou pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, RSF1010 a podobně. Z jiných než jsou výše uvedené jsou dostupné rovněž vektory fágové DNA. K účinnému dosažení exprese transhydrogenázy je možné použít také promotor, schopný pracovat v mikroorganismu, jako lac, trp či PL promotor. Navíc pro zvýšení počtu kopí transhydrogenázového genu může být DNA, obsahující výše uvedený gen, začleněna (integrována) do chromozomu metodou, používající transposon (D. E. Berg a C. M. Berg; Bio/Technol. 1, 417,

1983), fága Mu (Japonský patent sč. zveřejnění 2109985), nebo homologní rekombinací (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab., 1972).

Pokud je mikroorganismem, do kterého se zavádí gen, koiyneformní bakterie, je DNA vektorem, který lze použít v tomto vynálezu, plazmidový vektor, autonomně replikovatelný v koryneformní bakterii, jako pAM330 (viz japonský patentový spis číslo 1-11280) a pHM1519 (viz japonský patent s č. zveřejnění 58-77895).

Pro výběr kmene, majícího aktuálně zvýšenou enzymovou aktivitu transhydrogenázy, z příslušných kmenů, u kterých je zvýšení enzymové aktivity transhydrogenázy možné, lze použít například známou metodu (D. M. Clarke a P. D. Bragg, Joumal of Bacteriology 162, 367-373, 1985) jako způsobu potvrzení zvýšení enzymové aktivity transhydrogenázy.

-6CZ 291499 B6

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje přípravu plazmidu pMW::THY z chromozomální DNA a plazmidového vektoru pMW118.

Obrázek 2 ukazuje přípravu plazmidu pHSG::THYB z plazmidu pMW::THY a plazmidového vektoru pHSG399.

Obrázek 3 ukazuje přípravu plazmidu pSU::THY z plazmidu pMW::THY a plazmidového vektoru pSU18.

Nejlepší způsob provádění vynálezu: předkládaný vynález bude dále konkrétněji vysvětlen vzhledem k příkladům.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Klonování transhydrogenázového genu

Nukleotidové sekvence genů pntA a pntB, které kódují transhydrogenázu v Escherichia coli, byly stanoveny již dříve (D. M. Clarke se spol.; Eur. J. Biochem. 158, 647-653, 1986) a bylo uvedeno, že pntA a pntB kódují bílkoviny o 502 aminokyselinových zbytcích a o 462 aminokyselinových zbytcích. Rovněž bylo známo, že obě z výše uvedených bílkovin jsou vyžadovány pro expresi enzymové aktivity transhydrogenázy, že oba geny, pntA i pntB, jsou umístěny v sériích na chromozomální DNA a že tedy oba geny mohou být klonovány najeden fragment DNA.

Pro příhodnost v následných operacích autoři vynálezu současně klonovali nejen oba geny, pntA i pntB, ale i oblast umístěnou protisměrně od těchto genů, která má promotorovou aktivitu. Konkrétně byl fragment DNA, obsahující tyto geny a oblast promotoru, amplifikován metodou PCR k jeho klonování.

Dva syntetické oligonukleotidy o sekvenci 5'-CTGATTTTTGGATCCAGATCACAG-3' (sekvence o id. č. 2) byly syntetizovány běžným postupem jako primery pro metodu PCR. Jako templátová DNA pro metodu PCR byla připravena DNA celkového genomu Escherichia coli K-12 MC 1061 metodou Saitoha a Miuiy (Biochem. Biophys. Acta 72, 619, 1963). Fragment cílové DNA byl amplifikován pomocí PCR za použití dvou příměrových oligonukleotidů a templátové chromozomální DNA podle metody Erlicha a spoluautorů (PCR Technology, Stockton press 1989). Syntetické DNA, použité jako primery, měly nukleotidové sekvence s malou odlišností v příslušných centrálních částech fragmentů syntetické DNA oproti nukleotidové sekvenci, popsané D. M. Clarkem a spoluautory. Účelem je zavedení místa pro štěpení BamHI a místa pro štěpení Hindlll do struktury syntetických oligonukleotidů. Místa štěpení restrikčním enzymem jsou nutná pro inzerci amplifikovaného fragmentu DNA do vektorové DNA. Zavedení restrikčních míst vyvolává nevhodné spojení mezi primeiy a chromozomální DNA v průběhu PCR. Nevhodné spojení však neovlivnilo amplifikací DNA v PCR, neboť restrikční místa byla umístěna v centrálních částech fragmentu syntetické DNA. Amplifikace fragmentu o velikosti 3,0 kilobází (kb) byla potvrzena elektroforézou v agarovém gelu.

Amplifikovaný fragment DNA o velikosti 3,0 kb a plazmidový vektor pMW118, mající markér odolnosti vůči ampicilinu (dostupný od firmy Nippon Gene lne.) byl natráven BamHI a HindUI. Jak natrávený fragment DNA, tak i vektorová DNA byly k přípravě rekombinantní DNA spojeny pomocí DNA ligázy. Výsledný rekombinantní plazmid byl pojmenován pMW::THY (viz obr. 1).

-7CZ 291499 B6

Escherichia coli JMI09 (dostupná od firmy Takara Shuzo Co., Ltd.) byla transformována plazmidem pMW::THY a získána byla transformantní Escherichia coli JM109 (pMW::THY). Enzymová aktivita transhydrogenázy, vyskytující se v roztoku buněčného extraktu jak Escherichia coli JMI09, tak i Escherichia coli JMI09 (pMW::THY), byla měřena známou metodou (D. M. Clarke a P. D. Bragg, J. Bacteriology 162, 367-373, 1985). Výsledek je uveden v tabulce 1.

Tabulka 1

kmeny	JMI 09	JM109 (pMW::THY)
spec, aktivita transhydrogenágy (U/mg bílkoviny)	1,0	1,7

Jak je znázorněno v tabulce 1, je zřejmé, že Escherichia coli JM109 (pMW::THY) měla vyšší enzymovou aktivitu transhydrogenázy než Escherichia coli JM109. Výsledkem bylo ověřeno, že fragment DNA, zavedený do plazmidů pMW::THY, zahrnuje transhydrogenázový gen. Escherichia coli, která je hostitelem plazmidů pMW::THY, byla označena jako kmen AJ12922. Kmen AJ12992 byl uložen v Národním ústavu biologických věd a lidské techniky, Agentura průmyslové vědy a techniky, Ministerstvo mezinárodního obchodu a průmyslu (National Institute of Bioscience and Technology, Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of Intemational Trade and Industry) (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko, kód 305) 4. října 1993 pod přírůstkovým číslem FERM P-13890, 14. října 1994 byl převeden z původního uložení na mezinárodní uložení na základě Budapešťské dohody a uložen pod číslem FERM BP-4798.

DNA plazmidů pMW::THY byla připravena běžnou metodou a natrávena BamHI a HindlU k izolování fragmentu DNA o 3,0 kg, obsahujícího transhydrogenázový gen. Plazmidový vektor pHSG399, mající markér odolnosti vůči chloramfenikolu (dostupný od firmy Takara Shuzo Co., Ltd.), byl rozštěpen pomocí BamHI a HindUI a byl izolován rozměrnější fragment. Pak byly fragment DNA s obsahem transhydrogenázového genu a objemnější fragment BamHI-Hindin z pHSG399 spojeny DNA ligázou k získání plazmidů pHSG::THY.

Plazmid pHSG::THY se může autonomně replikovat v buňkách mikroorganismů, patřících mezi Escherichia, ale není stabilně uchováván v buňkách koryneformních bakterií. Replikační počátek, získaný z autonomně replikovatelného plazmidů, odvozeného z koryneformní bakterie, byl tedy zaveden do plazmidů pHSG::THY.

Plazmid pHM1519, autonomně replikovatelný v buňkách koryneformní bakterie (viz Japonský patent o č. zveřejnění 58-77895) byl štěpen restrikčním enzymem BamHI k získání fragmentu DNA o velikosti 3,0 kb, obsahujícího počáteční místo replikace. Na druhé straně byl plazmid pHSG::THY štěpen BamHI k získání fragmentu DNA. Oba fragmenty DNA byly spojeny DNA ligázou k přípravě plazmidů pHSG::THY (Obr. 2). Escherichia coli, která je hostitelem plazmidů pHSG::THYB, byla označena jako kmen AJ12872. Kmen AJ12872 byl uložen v Národním ústavu biologických věd a lidské techniky, Agentura průmyslové vědy a techniky, Ministerstvo mezinárodního obchodu a průmyslu, 4. října 1993 pod přírůstkovým číslem FERM P-13889,

14. září 1994 byl převeden z původního uložení na mezinárodní uložení na základě Budapešťské dohody a uložen pod číslem FERM BP-4797.

Dále byl plazmid pSU18, který je autonomně replikovatelný v buňkách bakterií, patřících k rodu Escherichia, a mající markér odolnosti vůči kanamycinu (Borja, Bartolome a spolupracovníci, Gene 102, 75-78, 1991) rozštěpen restrikčními enzymy BamHI a HindlU k získání objemnějšího fragmentu. Tento objemnější fragment byl za použití DNA ligázy spojen s fragmentem DNA o 3,0 kb, obsahujícím výše popsaný transhydrogenázový gen k přípravě plazmidů pSU::THY (Obr. 3). Kmen Escherichia coli, který hostí pSU::THY, byl označen jako kmen AJ12930. Tento kmen AJ 12930 byl uložen v Národním ústavu biologických věd a lidské techniky, Agentura pro

-8CZ 291499 B6 pěstování průmyslových mikroorganismů, Agentura průmyslové vědy a techniky, Ministerstvo mezinárodního obchodu a průmyslu, 4. října 1993 pod přírůstkovým číslem FERM P—13891,

14. září 1994 byl převeden z původního uložení na mezinárodní uložení na základě Budapešťské dohody a uložen pod číslem FERM BP—4799.

Ovlivnění produktivity tvorby různých L-aminokyselin v buňkách bakterie, patřící krodu Escherichia, a v buňkách koryneformní bakterie zvýšením transhydrogenázové aktivity byly potvrzeno u obou bakterií.

Příklad 2

Kvasná výroba L-threoninu u kmene se začleněnou transhydrogenázou

Jako L-threonin produkující bakterie Escherichia coli vykazuje kmen B-3996 (viz Japonský patent s č. zveřejnění 3-501682 (PCT)) nejvyšší produkční schopnost ze všech až dosud známých. Proto byl kmen B-3996 použit jako hostitel pro stanovení účinku zesílení transhydrogenázy. Kmen B-3996 nese plazmid pVIC40 (vytištěný spis mezinárodní přihlášky WO 90/04 636), který byl získán inzercí threoninového operonu do vektoru plazmidu pAYC32 s širokým hostitelským rozmezím, nesoucího markér odolnosti vůči streptomycinu (A. Y. Chistoserdov a Y. D. Tsygankov, Plasmid 16, 161—167, 1986). Kmen B-3996 byl uložen ve Výzkumném ústavu pro genetiku a pěstování průmyslových mikroorganismů pod přírůstkovým číslem RIA 1867.

Plazmid pMW::THY byl získán z Escherichia coli AJ12929, získané v příkladu 1, metodou Maniatise a spoluautorů (J. Sambrook. E. F. Fritsch a T. Maniatis; Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1., 21, 1989). Získaný pMW::THY plazmid byl zaveden do kmene B-3996 metodou D. M. Morrisona (Methods in Enzymology 68, 326, 1979). Kmen B-3996, transformovaný pMW::THY, byl označen jako kmen B-3996(pMW::THY). Kmeny B-3996 a B-3996(pMW::THY) byly kultivovány za následujících podmínek.

Kultivace byla prováděna 38 hodin pri teplotě 37 °C za míchání rychlostí 114-116 otáček za minutu v médiu o složení, udaném v tabulce 2. V tabulce 2 byly složky A, B a C připraveny odděleně, sterilizovány a ochlazeny, aby byly smíšeny za použití 16/20 objemu složky A, 4/20 objemu složky B a 30 g/1 složky C. Výsledky kultivace jsou uvedeny v tabulce 3. Bylo zjištěno, že zlepšení produktivity tvorby L-threoninu bylo dosaženo zvýšením intracelulámí aktivity transhydrogenázy u bakterie, produkující L-threonin, patřící k rodu Escherichia.

Tabulka 2: Médium k produkci threoninu	(g/D
(A) (NH4)₂SO₄kh₂po₄MgSO₄.7H₂O FeSO₄.7H₂O MnSO₄.5H₂O kvasničný extrakt (Difco) L-Met pH upraveno na 7,0 pomocí KOH, autoklávováno lOminut při teplotě 115 °C (B) 20% glukóza	16 1 1 0,01 0,01 2 0,5 (16/20 objemu)
autoklávována 10 minut při teplotě 115 °C (C) CaCO₃ dle lékopisu autoklávován 2 dny při teplotě 180 °C	(4/20 objemu) (30 g/1)

-9CZ 291499 B6

Antibiotika (streptomycin: 100 gg/mí, kanamycin: 5 pg/ml)

Tabulka 3

kmeny	B-3996	B-3996 (pMW::THY)
threonin (g/1)	12,96	13,99

Příklad 3

Kvasná výroba L-lysinu kmenem se začleněnou transhydrogenázou

Bylo ověřeno, zda je produkce L-lysinu zlepšena zvýšením intracelulámí transhydrogenázové aktivity u koryneformní bakterie, produkující L-lysin. Jako L-lysin vytvářející bakterie, patřící mezi koryneformní bakterie, byl použit kmen AJ3990 Brevibacterium lactofermentum. Kmen AJ3990 byl uložen v Národním ústavu biologických věd a lidské techniky, Agentura průmyslové vědy a techniky, Ministerstvo mezinárodního obchodu a průmyslu a obdržel přírůstkové číslo FERM P-3387. Plazmid pHSG::THYB byl získán z kmene AJ 12872 Escherichia coli, získaného v příkladu 1 metodou Maniatise a spoluautorů (J. Sambrook, E. F. Fritsch a T. Maniatis; Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1., 21, 1989). Získaný plazmid byl zaveden do kmene AJ3390 transformační metodou, užívající elektrického impulsu (viz Japonský patent sč. zveřejnění 2-207791). Kmen AJ3390, transformovaný pHSG::THYB, byl označen jako kmen AJ3390(pHSG::THYB). Kmen AJ3390 a kmen AJ3390(pHSG::THYB) byly kultivovány za následuj ících podmínek.

Kultivace byla prováděna 72 hodin při teplotě 31,5 °C za míchání rychlostí 114—116 otáček za minutu v médiu o složení, uvedeném v tabulce 4. Tři odlišné cukry, glukóza, sacharóza a fruktóza byly použity jako cukr. Výsledky kultivace jsou uvedeny v tabulce 5. Ukázalo se, že produkce L-lysinu u koryneformní bakterie, produkující l-lysin, byla zlepšena zvýšením intracelulámí aktivity transhydrogenázy.

Tabulka 4: médium k produkci lysinu cukr

NH4CI

KH2PO4

MgSO₄.7H₂O

FeSO₄.7H₂O

MnSO₄.5H₂O sojový bílkovinný hydrolyzát (jako zdroj dusíku) thiamin-HCl biotin g/1 g/1 g/1

0,4 g/1 mg mg mg

100 mg

300 mg

Po autoklávování (10 minut při 115°C) byl přidán 3% uhličitan vápenatý, sterilizovaný odděleně.

Tabulka 5

	množství nashromážděného hydrochloridu lysinu (g/1)
AJ 3990	AJ3990 (pHSG::THYB)
glukóza	13,6	14,5
sacharóza	11,1	12,6
fruktóza	8,2	11,9

-10CZ 291499 B6

Příklad 4

Kvasná výroba L-fenylalaninu kmenem se začleněnou transhydrogenázou

Bylo zjišťováno, zda se produkce L-fenylalaninu zlepšila zvýšením intracelulámí aktivity transhydrogenázy v bakterii, schopné produkce L-fenylalaninu, patřící do rodu Escherichia. Jako bakterie se schopností produkce L-fenylalaninu a patřící do rodu Escherichia byl použit kmen Escherichia coli AJ12604. AJ12604 je hostitelem plazmidu pBR-aroG4, který byl získán inzercí (vložením) mutantního genu aroG do vektorového plazmidu pBR22, nesoucího markér odolnosti vůči ampicilinu, a plazmidu pACMAB, kteiý byl získán inzercí mutantního genu pheA do vektorového plazmidu pACYC184 s markérem odolnosti vůči chloramfenikolu (viz Japonský patent sč. zveřejnění 5-236947). Kmen AJ12604 byl uložen v Národním ústavu biologických věd a lidské techniky, Agentura průmyslové vědy a techniky, Ministerstvo mezinárodního obchodu a průmyslu, 28.1edna 1991 pod přírůstkovým číslem FERM P-l 1975, 26. září 1991 byl převeden z původního uložení na mezinárodní uložení na základě Budapešťské dohody a uložen pod číslem FERM BP-3579. Plazmid pSU::THY byl zpětně získán z kmene AJ12930 Escherichia coli, získaného v příkladu 1, metodou Maniatise a spoluautorů (J. Sambrook, E. F. Fritsch a T. Maniatis; Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1., 21, 1989). Získaný plazmid byl zaveden do kmene AJ 12604 metodou D. M. Morrisona (Methods in Enzymology 68, 326, 1979). Kmen AJ12604, transformovaný pSU::THY, byl označen jako kmen AJ12604(pSU::THY). Kmeny AJ12604 a AJ12604(pSU::THY) byly kultivovány za následujících podmínek.

Kultivace byla prováděna 16 hodin při teplotě 37 °C za míchání rychlostí 114-116 otáček za minutu v médiu o složení, udaném v tabulce 6. Výsledky kultivace jsou uvedeny v tabulce 7. Bylo zjištěno, že produkce L-fenylalaninu byla u bakterie produkující L-fenylalanin a patřící do rodu Escherichia zlepšena zvýšením intracelulámí aktivity transhydrogenázy.

Tabulka 6: médium k produkci fenylalaninu

Glukóza	20 g/1
Na₂HPO₄	29,4 g/1
KH₂PO₄	6 g/1
NaCl	1 g/i
NHtCl	2 g/1
citrát sodný	20 g/1
L-glutamát sodný	0,4 g/1
MgSO₄.7H₂O	3 g/1
thiamin-HCl	2 mg
L-tyrosin	75 mg

Po autoklávování (10 minut při 115 °C) byl přidán 3% uhličitan vápenatý, sterilizovaný odděleně.

Tabulka 7

Kmen	AJ12604	AJ12604(pSU::THY)
Množství nashromážď. L-fenylalaninu (g/1)	4,28	4,89
3,75	4,28

-11 CZ 291499 B6

PŘEHLED SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE (i) Přihlašovatel: Ajinomoto Co. Inc.

ii) Název vynálezu: Způsob výroby chemických látek (iii) Počet sekvencí: 2 (iv) Adresa pro doručování:

(A) adresát:

(B) ulice:

(C) město:

(D) země (kraj):

(E) stát:

(F) PSČ:

(vi) Údaje běžného přihlášení:

(A) číslo přihlášky:

(B) datum podání:

(C) klasifikace:

(vii) Údaje přednostního přihlášení:

(A) číslo přihlášky:

(B) datum podání:

(viii) Zástupce přihlašovatele:

(A) jméno:

(B) číslo registrace:

(C) reference/č. jednací:

(ix) Spojení:

(A) telefon:

(B) telefax:

(2) Informace o sekvenci identif. č. 1:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 24 (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitost: jednovláknová (D) uspořádání: lineární (ii) Molekulární typ: jiná syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (xi) Popis sekvence: sekv. s identifikačním č. 1:

CTGATTTTTG GATCCAGATC ACAG (2) Informace o sekvenci identif. č. 2:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 24 (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitost: jednovláknová (D) uspořádání: lineární (ii) Molekulární typ: jiná syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (xi) Popis sekvence: sekv. s identifikačním č. 2:

CGTTCTGTTA AGCTTTCTCA ATAA

Claims

1. Způsob výroby cílové chemické látky za použití mikroorganismu, zahrnující kroky:

kultivace mikroorganismu v kultivačním médiu k umožnění produkce cílové chemické látky a její akumulace v uvedeném kultivačním médiu; a shromažďování cílové chemické látky z uvedeného kultivačního média, vyznačující se tím, že uvedený mikroorganismus byl modifikován tak, aby schopnost uvedeného mikroorganismu produkovat redukovaný nikotinamidadenindinukleotidfosfát z redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu byla zvýšena, čímž je zvýšena produktivita uvedeného mikroorganismu vzhledem k redukovanému nikotinamidadenindinukleotidfosfátu.

2. Způsob výroby cílové chemické látky podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedenou cílovou chemickou látkou je chemická látka, jejíž biosyntéza vyžaduje redukovaný nikotinamidadenindinukletidfosfát.

3. Způsob výroby cílové chemické látky podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedenou cílovou chemickou látkou je L-aminokyselina.

4. Způsob výroby chemické látky podle nároku 3, vyznačující se tím, že uvedená L-aminokyselina je zvolena ze skupiny, skládající se z L-threoninu, L-lysinu, kyseliny L-glutamové, L-leucinu, L-izoleucinu, L-valinu a L-fenylalaninu.

5. Způsob výroby cílové chemické látky podle kteréhokoli z nároků laž4, vyznačující setím, že uvedeným mikroorganismem je mikroorganismus, patřící do rodu Escherichia.

6. Způsob výroby cílové chemické látky podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující setím, že uvedeným mikroorganismem je koryneformní bakterie.

7. Způsob výroby cílové chemické látky podle kteréhokoli z nároků laž6, vyznačující se tím, že schopnost uvedeného mikroorganismu produkovat redukovaný nikotinamidadenindinukleotidfosfát z redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu se zvětší zvýšením enzymové aktivity nikotinamidnukleotidtranshydrogenázy v buňkách zmíněného mikroorganismu.

8. Způsob výroby cílové chemické látky podle nároku 7, vyznačující se tím, že schopnost uvedeného mikroorganismu produkovat redukovaný nikotinamidadenindinukleotidfosfát z redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu se zvětší zvýšením množství exprimovaného genu, kódujícího nikotinamidnukleotidtranshydrogenázu v buňkách zmíněného mikroorganismu.

9. Způsob výroby cílové chemické látky podle nároku 8, vyznačující se tím, že schopnost uvedeného mikroorganismu produkovat redukovaný nikotinamidadenindinukleotidfosfát z redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu se zvětší zvýšením počtu kopií daného genu, kódujícího nikotinamidnukleotidtranshydrogenázu v buňkách zmíněného mikroorganismu.