HU214986B - Eljárás N,O-szulfatált heparozánokat tartalmazó készítmények előállítására - Google Patents

Description

A találmány Ν,Ο-szulfatált heparozánokat tartalmazó készítmények előállítására vonatkozik.

Ismert, hogy a glikozaminoglikánok állati szövetekből extrakcióval előállítható termékek. Egyes glikozaminoglikánok igen előnyös antikoaguláns (véralvadásgátló) és antitrombotikus sajátságokkal rendelkeznek. E vegyületcsalád tipikus termékei a heparin, a heparin fragmentumai és származékaik, valamint a heparán-szulfát és dermatán-szulfát; ezek hátránya azonban, hogy eredetük következtében - nagyon költségesek.

Közelebbről ismeretes, hogy a dermatán-szulfát különböző polimerizációs fokú polimerek egy csoportját képviseli, amelyek uronsavcsoportból (iduronil- vagy glükuronil-szerkezettel) és acetil-4-szulfo-galaktózaminil-csoportból álló ismétlődő egységekből épülnek fel [H. W. Stuhlsatz: „The Methodology of Connective Tissue Research” („Kötőszövetek kutatási módszertana”) (1976) 137-146. old.]. A természetes eredetű dermatánszulfát molekulatömege 20 000 és 40 000 dalton között van. E termék antikoaguláns és trombózis elleni hatásai különösen előnyösek [F. Femandez és munkatársai: Brit. J. Haematology 64, 309 (1986)].

Ismeretes továbbá [I. Björk és U. Lindahl: „Molecular and Cellular Biochemistry (Molekuláris és sejtbiokémia”) (1982), szerk. W. Junk, Hollandia], hogy a véralvadás összetett fiziológiai jelenség, amelynek mechanizmusa vázlatosan a következő:

Érintkezési (kontakt) aktiválódás

I

XII. faktor —> Xlla faktor

I

XI. faktor —> Xla faktor

IX. faktor —> IXa* faktor I

Vlla szöveti faktor

X. faktor —> Xa* faktor <— X. faktor I Va

Protrombin II-----> Trombin Ha

I

Fibrinogen —> Fibrin XlIIa.

Bizonyos serkentő hatások (stimulusok), így kontakt aktiválás és szöveti faktorok hatása következtében bekövetkezik a vérplazmában lévő véralvadási faktorok sorozatának egymás után következő aktiválódása (a fenti vázlatban ezeket római számokkal és az „a” indexszel jelöltük; az index jelenti az aktivált formát, az index nélküli római szám a nem aktivált formát.

A stimulus természetétől függetlenül a sor végső lépései azonosak; a Xa faktor aktiválja a II faktort (amely protrombin néven is ismert), amely aktivált formában (Ila faktor, trombin néven is ismert) kiváltja az oldható fíbrinogén részleges proteolízisét, s így felszabadul az oldhatatlan fibrin, a vérrög fő alkotórésze.

Normális fiziológiai körülmények között a szabályzó fehérjék - így az antitrombin III (ATIII) és a heparin-kofaktor II (HCII) - is jelen vannak a plazmában.

Az antitrombin III a fenti vázlatban *-gal jelölt valamennyi alvadási faktorral szemben gátló hatást fejt ki. Ez a gátlás heparin vagy heparin-típusú szintetikus oligoszacharidok jelenlétében jelentős mértékben erősödik [D. H. Atha és munkatársai: Biochemistry, 24, 6723 (1985)].

A heparin-kofaktor II csak a Ila faktorra (trombin) fejt ki gátló hatást, amely utóbbi a véralvadás utolsó lépésének katalizátora. Ez a hatás heparin vagy dermatán-szulfát jelenlétében lényegesen erősebb [D. M. Tollefsen: J. Bioi. Chem. 258, 6713 (1983)].

A Xa vagy Ila faktor gátlása kedvező alapot ad antikoaguláns és antitrombotikus hatás elérésére, mivel az említett két faktor részt vesz a véralvadás utolsó két lépésében, amelyek az alvadást kiváltó stimulustól függetlenek.

A Ila faktor szelektív gátlásának megvalósítására különösen előnyös lehetőség adódik abból, hogy a heparin-kofaktor II specifikus, és gátló hatásának fokozódása megcélozható. A dermatán-szulfát az eddig ismert ilyen típusú, legerősebben fokozó hatású vegyület.

Ismert továbbá, hogy a heparin fő láncának kialakulása két lépésben megy végbe. A heparin bioszintézise egy proteoglikán prekurzorból indul, amelynek poliszacharid-része különböző polimerizációs fokú polimerekből áll; e polimerek 379 dalton molekulatömegű β-D-glükuronil-(l->4)-a-N-acetil-a-D-glükóz-aminil-(l->4)- egységek (diszacharid-egységek) ismétlődésével épülnek fel. Ezt a poliszacharid-egységet általában N-acetil-heparozánnak nevezik [J. Navia: Anal. Biochem. 735, 134 (1983)]. A bioszintézisnek ez az első lépése az egyedüli, ahol valóban „diszacharid-egységről” beszélhetünk, mivel a bioszintézis második lépése ezt az egyszerű vázat lényegesen módosítja [„L’héparine, fabrication, structure, propriétés, analyses” („A heparin: gyártása, szerkezete, tulajdonságai, elemzése”), J. P. Duclos 81-83. old. (1984), kiadó: Masson, Franciaország],

Valójában a bioszintézisből eredő, természetes eredetű heparin adott esetben 2-helyzetben szulfátéit glükuronsav- és iduronsav-molekulákból (uronsavakból) álló, adott esetben az aminrész 6-helyzetében szulfátéit és 2-helyzetében szulfátéit vagy acetilezett glükózaminmolekulákkal kombinált poliszacharid.

Statisztikus értelemben a heparin szerkezete az (i) általános képlettel ábrázolható, ahol A jelentése hidrogénatom vagy SO₃- csoport, B jelentése SO₃- vagy acetilcsoport, és n értéke 20-tól 30-ig terjedő egész szám; ez megfelel egy 12000-18 000 dalton méretű molekulatömegnek (lásd az 0116 801 számú európai közrebocsátási iratot).

A „hidrogénatom és SO₃- csoport”, valamint az „SO₃- és acetilcsoport” az A és B jelentésében azt mutatja, hogy a fenti 20-30 diszacharid-egységben az A egyes esetekben hidrogénatom, más esetekben SO₃csoport, más esetekben acetilcsoport.

Ugyanígy a kötés azt jelenti, hogy a 20-30 diszacharid-egységben a COO- csoport konfigurációja egyes esetekben a (ii) képlet szerinti (azaz a G-glükuronsavnak megfelelő); és az n számú egység többségében a COO- csoport konfigurációja a (iii) képlet szerinti (azaz az L-iduronsavnak megfelelő).

Ennek következtében a különböző depolimerizáló módszerek segítségével kapott heparin vagy heparinfragmentumok olyan makromolekulák, amelyek mind glükuronsav-, mind iduronsav-egységeket tartalmaznak.

HU 214 986 Β

Egyes depolimerizáló módszerek lehetővé teszik olyan heparinffagmentumok előállítását, amelyek molekulatömege 2000 és 9000 dalton közötti, és szulfatálási mértékük legalább 20%-kal nagyobb, mint a kiinduló anyagként alkalmazott hepariné. Ilyen „szuperszulfatált” heparinokat ismertetnek a 0 116 801 számú európai közrebocsátási iratban; ezek a heparinok uronsav-egységekként a fentebb említett (ii) és (iii) szerkezetű egységeket tartalmazzák.

Ismert továbbá, hogy egyes Escherichia coli törzshöz tartozó baktériumok kapszuláris poliszacharidot termelnek - ezt általában K5 antigénnek nevezik amely ismétlődő β^1ϋ^Γοηί1-(1->4)-α-Ν^οεΐί1-ϋglükózaminil-(l->4)-egységekből épül fel [W. F. Vann és munkatársai: Eur. J. Biochem. 116, 359 (1981)].

E poliszacharidot - amelynek kémiai jellege azonos a heparin proteoglikán-prekurzorának poliszacharid-részével — az alábbiakban N-acetil-heparozánnak nevezzük. E termék molekulatömege 10⁵ és 2xl0⁶ dalton közötti, és az „uronsav”-egységek vonatkozásában igen szabályos szerkezetű: kizárólag D-glíikuronsav-egységeket tartalmaz [W. F. Vann és munkatársai: Eur. J. Biochem. 116, 359 (1981); valamint az 0 333 243 számú európai közrebocsátási irat].

Az utóbb idézett európai közrebocsátási iratban ismertetik az O-szulfatált K5 poliszacharidot, valamint egyes fragmentumait, amelyek 4, 6 vagy 8 „cukor”egységből állnak és szintén O-szulfatáltak. E termékek antiangiogén és daganatgátló hatásúak, és e hatásuk aránya az antikoaguláns sajátságaikhoz viszonyítva kedvező. Ugyanebben az idézett dokumentumban 4,6, 8 vagy 10 „cukor”-egységből álló N-acetil-heparozán-fragmentumokat is közölnek.

Az utóbb idézett európai közrebocsátási iratban leírják továbbá egy O-szulfatált N-acetil-heparozán szerkezetű penta-szacharid előállítását teljes kémiai szintézissel.

Azt találtuk, hogy 1500 és 15 000 dalton között változó molekulatömegű N,O-szulfatált heparozánok heparin-kofaktor II jellegű antikoaguláns hatással, és igen erős Xa elleni hatással rendelkeznek.

A jelen találmány tárgyát képező N,O-szulfatált heparozánok tehát az irodalomban eddig közölt, más termékektől új szerkezetükben, különösen azok szulfatálási fokában (szulfatálás a glükózamin amincsoportján is), továbbá farmakológiai sajátságaikban is különböznek: többek között például antikoaguláns hatásuk erősebb, mint a heparin-kofaktor II (HCII) vagy a dermatán-szulfát hatása, és farmakokinetikai jellemzőik igen előnyösek. Valójában a jelen találmány szerinti termékek - amelyeket parciális kémiai szintézissel állítunk elő - a gyógyászatban általában alkalmazott glikozaminoglikánok farmakológiai sajátságaival, különösen a heparin tulajdonságaival rendelkeznek, és alkalmasak lehetnek a véralvadás szabályozására, közelebbről antitrombotikus hatású szerekként is alkalmazást nyerhetnek.

Mindezek alapján találmányunk tárgyát képezi eljárás 70-100% 1500 és 15 000 dalton közötti molekulatömegű láncokból vagy láncok keverékéből álló, (I) általános képletű ismétlődő diszacharid-egységet tartalmazó N,O-szulfatált heparozánt, ahol

E jelentése az N,O-szulfatált heparozánok diszacharid-egységeinek 0-80%-ában acetilcsoport, a többi diszacharid-egységben pedig szulfátcsoport, vagy adott esetben hidrogénatom, és

G jelentése hidrogénatom vagy szulfátcsoport, és amelynek szulfát/karboxil arányban kifejezett szulfatálási foka 1,5 és 3,0 közötti érték, valamint ezeknek az N,O-szulfatált heparozánoknak a gyógyászati szempontból elfogadható sóit tartalmazó készítmény előállítására, amely szerint az alábbi lépéssorozatot végezzük:

a) lépés: Escherichia coli (K5) törzset tenyésztünk;

b) lépés: az így keletkezett N-acetil-heparozánt - adott esetben előzetesen tisztítva - izoláljuk és tisztítjuk, s így 70-100% mennyiségben olyan Nacetil-heparozánt tartalmazó terméket kapunk, amely 1500 és 15 000 dalton közötti molekulatömegű láncokból vagy láncok keverékéből áll, és amely a (II) képletű ismétlődő diszacharid-egységet tartalmazza;

c) lépés: az így kapott N-acetil-heparozán terméket részlegesen dezacetilezzük, s így olyan heparozán terméket kapunk, amely 70-100% mennyiségben 1500 és 15 000 dalton közötti molekulatömegű láncokból vagy láncok keverékéből áll, és amely a (III) általános képletű, ismétlődő diszacharid-egységet tartalmazza, amelyben R’ a diszacharid-egységek 0-80%ában acetilcsoportot jelent, és a diszacharidegységek többi részében hidrogénatomot jelent;

d) lépés: az így kapott heparozán-terméket részlegesen

Ν,Ο-szulfatáljuk; vagy az így kapott heparozán-terméket részlegesen Ν,Ο-szulfatáljuk, majd teljesen (totálisan) Nszulfatáljuk; vagy az így kapott heparozán-terméket teljesen vagy részlegesen N-szulfatáljuk, és ezt követően teljesen vagy részlegesen O-szulfatáljuk, és adott esetben - az a), b), c) vagy d) lépés végén - egy vagy több molekulatömeg-frakcionálási lépést végzünk.

A találmány azokra a készítményekre is vonatkozik, amelyek a találmány szerinti N,O-szulfatált heparozánt legalább 70 tömeg% mennyiségben, előnyösen legalább 90 tömeg% mennyiségben tartalmazzák.

A találmány szerinti N,O-szulfatált heparozánok azonos, jól meghatározott molekulatömegű poliszacharidláncokból állhatnak; ezek molekulatömege 1500-tól 15 000 daltonig terjed; ezek az N,O-szulfatált heparozánok különböző molekulatömegű láncok keverékéből is állhatnak, amelyek molekulatömege 1500 és 15 000 dalton között van. E láncok molekulatömegének szórása nagyobb vagy kisebb lehet. Valójában a találmány szerinti N,O-szulfatált heparozánok olyan láncokból állhatnak, amelyek molekulatömege között a különbség megközelítőleg legfeljebb 13 500 dalton, vagy - ellenkezőleg - csak olyan láncokból állhatnak,

HU 214 986 Β amelyek molekulatömege közötti különbség körülbelül 300 dalton, amely megfelel egy uronsav-egységnek (Dglükoronsavnak vagy származékainak) vagy glükózamin szerkezeti egységnek. Nyilvánvaló továbbá, hogy - minden egyes Ν,Ο-szulfatált heparozán alkatától függően - a legkisebb molekulatömegű vagy a legnagyobb molekulatömegű láncok molekulatömege 1500 és 15 000 dalton között bármilyen érték lehet.

A „G” jelentése hidrogénatom vagy szulfátcsoport” kifejezés arra utal, hogy a diszacharid-egységben G jelentése egyes helyzetekben hidrogénatom, és többi helyzetekben szulfátcsoport. Ugyanígy egyes diszacharid-egységekben E jelentése acetilcsoport, és a többi egységekben szulfátcsoport vagy adott esetben hidrogénatom. Ennek következtében a találmány szerinti Ν,Ο-szulfatált heparozánok diszacharid-egységei nem azonosak.

Az (I) általános képlet ismétlődő diszacharid-egységet ábrázol, amely egy glükózamin-egységből és egy D-glükuronsav-egységből áll. Ezek az egységek megfordítva is lehetnek; közelebbről, ha figyelembe vesszük, hogy az (I) általános képletű diszacharidszerkezet n-szer ismétlődik, és hogy a láncok nem-redukáló egysége ugyanúgy lehet egy glükózamin-egység [amint ezt az (I) képlet mutatja] 4-helyzetű hidroxilcsoporttal, amely glükózamin-egység szulfátéit vagy más formában van - vagy egy D-glükuronsav, amely adott esetben a C4-C5 helyzetben kettőskötést tartalmaz, és szulfátéit vagy más formában van. A redukáló szerkezeti egység ugyanúgy lehet D-glükuronsav [amint ezt az (I) képlet ábrázolja], amely az anomer oxigénatomon hidrogént visel, vagy egy glükózaminegység vagy 2,5-anhidromanno-szerkezet, amely a nitro-depolimerizáció következménye (2,5-anhidro-Dmannóz), s amelyet adott esetben oxidáció (2,5anhidro-D-mannonsav) vagy redukció (2,5-anhidro-Dmannit) követ.

Előnyösek azok a termékek, amelyekben a jelen találmány szerinti Ν,Ο-szulfatált heparozánok két vége azaz redukáló és nem-redukáló végződése: uronsav, szulfatált vagy nem-szulfatált formában; glükózaminegység, szulfátéit vagy nem-szulfatált formában; vagy N-acetil-glükózamin-egység, szulfatált vagy nemszulfatált formában; vagy 2,5-anhidro-manno szerkezetű egység.

Előnyösek azok az Ν,Ο-szulfatált heparozánok, amelyek redukáló és nem-redukáló végződésekként szulfatált vagy nem-szulfatált formában lévő uronsavegységeket tartalmazó láncokból állnak, vagy szulfatált vagy nem-szulfatált formában lévő glükózamin-egységeket, vagy szulfatált vagy nem-szulfatált formában lévő N-acetil-glükózamin-egységeket tartalmaznak.

A találmány szerinti Ν,Ο-szulfatált heparozánt 70-100% mennyiségben tartalmazó termék előállítása céljából Escherichia coli (K5) törzsként előnyösen Escherichia coli SEBR 3292 törzset alkalmazunk. Ez a törzs a Bi 8337-41 (010: K5: H₄) ATCC 23 506 törzsből származik [részletes leírását lásd: D. S. Gupta és munkatársai: FEMS Microbiology Letter, 14, 75 (1982), valamint W. Vann: Eur. J. Biochem. 116, 359 (1981)].

Az Escherichia coli SEBR 3282 törzs pozitív választ ad a Kaiser és munkatársai eljárásával [J. Clin. Microbiol. 19, 264 (1984)] végzett K-5 specifikus fág-tipizáló vizsgálat (teszt) során. Ez tehát nyilvánvalóan egy Escherichia coli (K5) törzs. E törzset a CNCM-nél deponáltuk a párizsi Pasteur Institute intézményben 1-1013 tételszám alatt. Természetesen lehetséges e törzs valamely, akár spontán, akár mesterségesen létrehozott mutánsának, valamint más megfelelő Escherichia coli (K5) törzsnek, például a Bi 626-42 (012: KsiNM ATCC 23 508) törzsnek az alkalmazása is.

Tenyésztő közegként előnyösen nitrogéntartalmú anyagban gazdag közeget, például élesztőkivonatban és kazeinhidrolizátumban dús közeget alkalmazunk, mert ez nagy mennyiségű aminosavak olcsó forrása.

Az Escherichia coli (K5) törzset a biomassza gyarapodásának megszűnése után előnyösen legalább 2 órán át tenyésztjük.

Abból a célból, hogy 70-100%-ban olyan N-acetilheparozán-terméket kapjunk, amely 1500 és 15 000 dalton közötti molekulatömegű láncok keverékéből áll, és amelynek szerkezetére a (II) képletű diszacharid-egységek ismétlődése a jellemző - az N-acetil-heparozán izolálását és tisztítását úgy végezzük, hogy legalább egy lépésben kicsapjuk, és egy lépésben ioncserélő kromatográfiát végzünk. E lépést előnyösen Q-Sepharose oszloppal vagy ezzel egyenértékű oszloppal hajtjuk végre. A kicsapást megfelelő szerves oldószerrel, de különösen valamilyen alkohollal, előnyösen etanollal valósítjuk meg. Ennek során az N-acetil-heparozán sóformában - előnyösen nátriumsója formájában - lehet.

Egy előnyös izolálási és tisztítási eljárást például a következőképpen körvonalazhatunk: a₄) lépés: kicsapás etanollal; bj) lépés: dialízis;

c₄) lépés: kicsapás etanollal, és ezt követő dehidratálás és szárítás;

d j lépés: tisztítás anioncserélő kromatográfiával; e₄) lépés: a dj lépésben kapott eluátum kicsapása etanollal, majd dehidratálás, szárítás és aprítás (őrlés).

Ami az aj, b j és ej lépést illeti, ezek végrehajtásának sorrendje nem kritikus jellegű; az aj és ej egyike elhagyható.

Az ej lépésben az etanolos kicsapás nem alapvetően fontos. Az N-acetil-heparozán izolálása más módszerekkel - például a d j lépésben kapott eluátum vákuumbepárlásával - is lehetséges.

Abból a célból, hogy 70-100%-ban olyan N-acetilheparozán-terméket kapjunk, amely 1500 és 15 000 dalton közötti molekulatömegű láncok keverékéből áll, az izolálást és tisztítást az alábbi módon is végezhetjük, a’j lépés: dialízis b’j lépés: tisztítás savas közegben, a 3,5 és 1,8 közötti pH-értékű vizes oldatokban oldhatatlan szennyezések eltávolítása;

c’j lépés: kicsapás etanollal, ezt követő dehidratálás és szárítás;

d’j lépés: alkálikus hidrolízis és dialízis;

ej) lépés: tisztítás anioncserélő kromatográfiával; és F j lépés: tisztítás kizárásos kromatográfiával.

HU 214 986 Β

Ez utóbbi izolálás és tisztítás szintén előnyös találmány szerinti eljárás.

Az alkálikus hidrolízist 30-80 °C hőmérséklettartományban nátrium-hidroxid-oldattal végezzük.

Az izolálási és tisztítási eljárások végrehajtása során kiinduló termékként felhasználhatjuk a tenyésztés befejezésekor kapott szuszpenziót — ebben az esetben előzetes szűrés szükséges - vagy egy olyan terméket, amelyet már előzőleg egy alábbi lépésekből álló tisztítási eljárásnak vetettünk alá:

a”]) lépés: a tenyésztés befejezésekor kapott szuszpenzió centrifugálás a;

b”]) lépés: a felülúszó érintkeztetése valamilyen alkálikus kémhatású oldattal;

c” lépés: előszűrés; és d”j) lépés: koncentrálás (töményítés) előre meghatározott méretű (méretkizáró) nyílásokat tartalmazó membránszűrővel;

e”]) lépés: dialízis.

Azé”!) lépés nem alapvető fontosságú.

Alkálikus oldatként 0,1 N nátrium-hidroxid-oldatot alkalmazhatunk.

Előnyösen úgy járunk el, hogy a tenyésztés befejezésekor kapott terméket a fentebb leírt módszerrel előzetesen tisztítjuk.

Az Escherichia coli (K5) törzsek tenyésztése, valamint a fentebb leírt izolálási és tisztítási eljárások, továbbá az előzetes tisztítási lépés lehetővé teszik olyan N-acetil-heparozán-termékek előállítását, amelyek 70-100%-ban 1500 és 15 000 dalton közötti molekulatömegű láncok keverékéből állnak, és amelyekre jellemző, hogy szerkezetük a (II) képletű diszacharid-egységek ismétlődéséből áll.

Valójában a fentiekben leírt izolálási és tisztítási eljárások, valamint az előzetes tisztítási lépés eredményeként olyan N-acetil-heparozán-terméket kaphatunk, amely legalább 80-100%-ban 1500 és 15 000 dalton közötti molekulatömegű láncok keverékét tartalmazza.

Az 1500 és 15 000 dalton közötti molekulaméretű láncok keverékéből álló N-acetil-heparozánok új termékek.

A találmány szerinti eljárással, Escherichia coli SEBR 3282 törzs vagy más alkalmas törzs felhasználásával előállított új N-acetil-heparozánok vége - a redukáló és a nem-redukáló végződések - uronsav vagy N-acetil-glükózamin-egységek.

A láncok túlnyomó részében a lánc nem-redukáló végét egy (a) képletű uronsav-egység alkotja.

Az 1500 és 15000 dalton közötti molekulatömegű láncok keverékéből álló, és (II) képletű diszacharidegységek ismétlődésével felépülő N-acetil-heparozán dúsítását különböző mértékig, adott esetben egészen az N-acetil-heparozán elkülönítéséig végezhetjük. A dúsítást a szokásos molekulatömeg-frakcionáló eljárásokkal, például gélszűrő kromatográfiával és ultraszűréssel végezhetjük [A. A. Horner: Biochem. J. 262, 953 (1989); G. Pyler és munkatársai: J. Bioi. Chem. 263, 5197 (1988); valamint U. Lindahl és munkatársai: J. Bioi. Chem. 259, 12368 (1984)]. Alkalmazhatjuk továbbá az etanolos frakcionálást (lásd a 0 287 477 számú európai közrebocsátási iratot). Az utóbbi frakcionálási módszer - a számba vehető eljárások közül - különösen értékes.

A fentebb leírt N-acetil-heparozánokat közbenső termékekként alkalmazzuk a találmány szerinti N,Oszulfatált heparozánok, valamint más származékok előállításában.

A találmány szerinti Ν,Ο-szulfatált heparozánok előállítására más ismert N-acetil-heparozánokat is alkalmazhatunk: például olyan N-acetil-heparozánokat, amelyek főként azonos számú diszacharid-egységből felépülő poliszacharid-láncokat tartalmaznak (lásd a 0 333 243 számú európai közrebocsátási iratot), különösen 6, 8 vagy 10 „cukor”-egységből állnak, s ahol az N-acetil-heparozán-frakciók átlagosan 10 monoszacharid-egységből felépülő láncokból állnak [Gupta és munkatársai: FEMS Microbiology Letters 16, 13 (1983)]; vagy alkalmazhatunk nagyobb molekulatömegű Nacetil-heparozánokat is, amelyek ismert módon depolimerizálhatók.

A találmány szerinti Ν,Ο-szulfatált heparozánok a nagy molekulatömegű, ismert (K5) poliszacharidból más eljárásokkal állíthatók elő. Ez esetben depolimerizáló lépést kell végeznünk.

Ezt a depolimerizációt elvégezhetjük a nagy molekulatömegű N-acetil-heparozán dezacetilezése előtt vagy annak dezacetilezése után, az N-szulfatálás után vagy másként az Ν,Ο-szulfatálás után.

Amint fentebb leírtuk, a depolimerizáció végrehajtható az irodalomban az alacsony molekulatömegű heparinok előállítására leírt módszerekkel: például perjodát alkalmazásával, szabad gyökökkel végzett depolimerizációval; β-eliminációs reakcióval; vagy salétromsavval (lásd a 40 144, 37319 és 121 067 számú európai szabadalmi leírásokat). E módszereket példaként adjuk meg, és nem jelentenek korlátozást; a glikozaminoglikánok depolimerizációjára alkalmas bármilyen módszer használható.

Ha az Ν,Ο-szulfatált heparozánokat egy nagy molekulatömegű (előzetesen dezacetilezett és adott esetben N-szulfatált) N-acetil-heparozán depolimerizációjával állítjuk elő salétromsav hatására, akkor a találmány szerinti Ν,Ο-szulfatált heparozánoknak a redukáló egysége 2,5anhidromanno-, különösen 2,5-anhidro-D-mannóz-szerkezetű lehet. A salétromsavval végzett depolimerizációt végrehajthatjuk az N-dezacetilezés vagy az N-szulfatálás lépése után. Ha ezt a lépést oxidáció vagy redukció követi, akkor olyan Ν,Ο-szulfatált heparozánokat kapunk, amelyek redukáló egysége 2,5-anhidro-D-mannonsav, illetve 2,5-anhidro-D-mannit-szerkezetű.

A 70-100% mennyiségben N-acetil-heparozánt tartalmazó termékek parciális dezacetilezését - amely 70-100%-ban, sőt 80-100%-ban 1500 és 15000 dalton közötti molekulatömegű láncok keverékéből álló heparozánt eredményez, amelynek szerkezetére jellemző a fenti (III) képletű diszacharid-egységek ismétlődése - dezacetilezőszerrel kezelve végezzük.

Dezacetilezőszerként például foszfor-pentaszulfidot, trietil-oxónium-fluoborátot, nátrium-hidroxidot vagy hidrazint használhatunk, ezek közül a két utóbbi

HU 214 986 Β különösen előnyös. A dezacetilezés céljára erős ásványi savakat, így sósavat, kénsavat is alkalmazhatunk. A reakcióidő a választott munkafeltételektől, különösen a reakcióelegy hőmérsékletétől és a dezacetilezőszemek a reakcióelegyben fennálló koncentrációjától függ.

Az 1500 és 15000 dalton közötti molekulatömegű láncok keverékéből álló, szerkezeti szempontból jellemzően a (ΠΙ) képletű diszacharid-egységek ismétlődésével felépülő heparozán dúsítását az általánosan alkalmazott molekulatömeg-frakcionálási eljárásokkal végezhetjük, amelyeket már előbb is említettünk (gélszűrő kromatográfia, ultraszűrés és etanolos frakcionálás). Ebben az esetben olyan terméket kaphatunk, amely 90-100%-ban 1500 és 15000 dalton közötti molekulatömegű láncok keverékéből áll, és szerkezetére a (III) képletű diszacharid-egységek ismétlődése a jellemző.

1500 és 15 000 dalton közötti molekulatömegű láncok keverékéből álló heparozánok előállítására nagy molekulatömegű N-acetil-heparozánokat is alkalmazhatunk. A nagy molekulatömegű heparozánokat - amelyeket a dezacetilezés eredményeként kapunk - a kis molekulatömegű heparinok előállítására már előzőleg leírt, e leírásban is említett depolimerizáló eljárásokkal végezhetjük. A depolimerizációból kapott termékeket azután frakcionálhatjuk abból a célból, hogy a találmány szerinti, előnyös heparozánokhoz jussunk.

Az 1500 és 15 000 dalton közötti molekulatömegű láncok keverékéből álló, szerkezeti szempontból a (III) általános képletű diszacharid-egységek ismétlődésével jellemzett heparozánok - ahol a (III) képletben R’ acetilcsoportot jelent a diszacharid-egységek 0-80%ában, és hidrogénatomot jelent a többi diszacharid-egységben - új termékek, és ennek megfelelően szintén a találmány részét képezik.

Előnyösek azok a találmány szerinti heparozánok, amelyek 1500 és 15 000 dalton közötti molekulatömegű láncok keverékéből állnak, és amelyek szerkezetére jellemző, hogy a (III) általános képletű diszacharid-egységek ismétlődésével épülnek fel, ahol a (III) képletben R’ mint acetilcsoport a diszacharid-egységek legfeljebb 60%-ában van jelen.

Azok a heparozán-termékek, amelyek legalább 70 tömeg% fentiekben leírt heparozánt tartalmaznak, szintén a jelen találmány tárgyát képezik.

Ezek a heparozánok és heparozán-termékek hasznos közbenső termékek a jelen találmány tárgyát képező Ν,Ο-szulfatált heparozánok előállítására, felhasználhatók azonban más termékek előállítására is: például olyan termékek előállítására, amelyeket azután a D-glükuronsav-egységben epimerizációnak vetünk alá.

A részleges Ν,Ο-szulfatálási lépés előtt a heparozánokat szerves bázissal sóvá vagy kvatemer ammóniumsóvá alakíthatjuk. A heparozánok kvatemer ammóniumsóinak kialakítására előnyösen a tetrabutil-ammónium-sókat használhatjuk.

A részleges Ν,Ο-szulfatáló lépést a 2 584 728 számú francia szabadalmi leírásban (megfelel a FR-85/10787 alapszámú szabadalmi bejelentésnek; bejelentésének időpontja 1987. november 10.) között eljárással poláris, aprotikus oldószerben - például dimetil-formamidban, dimetil-szulfoxidban, hexametil-foszforamidban, acetonitrilben vagy ezeknek az oldószereknek a keverékében - kén-trioxidnak valamilyen szerves bázissal, például trimetil-aminnak, trietil-aminnal vagy piridinnel képzett komplexe alkalmazásával végezzük. A parciális Ν,Ο-szulfatálást végrehajthatjuk piridinben oldott klór-szulfonsavval is. Előnyösen kén-trioxid/piridin komplexet alkalmazunk.

Használhatunk más szulfatálószereket is, különösen olyan ágenseket, amelyeket Ε. E. Gilbert közöl [Chem. Review 62, 549 (1962)]. A Ν,Ο-szulfatálási reakció általában 0 °C és 100 °C közötti, előnyösen 10 °C és 50 °C közötti hőmérséklet-tartományban, 6 és 14 óra közötti időtartammal hajtjuk végre.

Az előállítási eljárás során a részleges N,O-szulfatáló reakció végeztével a 70-100% Ν,Ο-szulfatált heparozánt tartalmazó Ν,Ο-szulfatált heparozánterméket kicsapjuk úgy, hogy addig adunk hozzá nátrium-kloridot, amíg koncentrációja a 0,33 mol/liter értéket el nem éri, majd megfelelő mennyiségű etanolt adunk hozzá. Az így kivált csapadékot 0,5 mólos nátrium-klorid-oldatban felvesszük és ezt az oldatot közömbösítjük. A megfelelő mennyiségű etanol hozzáadása után kapott csapadékot elkülönítjük, ultratiszta vízben felvesszük, vízzel szemben dializáljuk, majd liofilizáljuk és szárítjuk.

A fentiekben leírt Ν,Ο-szulfatáló lépést, valamint a kapott Ν,Ο-szulfatált heparozán-termék tisztítási lépését egyszer vagy többször ismételhetjük. A tisztítási eljárást példaként közöljük, s ez nem zárja ki egyenértékű eljárások alkalmazását.

A fenti Ν,Ο-szulfatáló lépést előnyösen egy teljes N-szulfatáló lépés követi, amelyet általában víztartalmú oldószerben, előnyösen bázisos pH mellett valamilyen szulfatálószerrel - így például kén-trioxidnak valamilyen szerves bázissal alkotott komplexével, például trietil-aminos komplexével - valósítunk meg.

A teljes N-szulfatáló lépés végeztével a kapott Ν,Οszulfatált heparozánterméket kicsapjuk úgy, hogy az oldathoz addig adunk nátrium-kloridot, amíg annak koncentrációja a 0,5 mol/litert el nem éri, majd etanolt teszünk hozzá. Az így képződött csapadékot 0,5 mólos nátrium-klorid-oldatban ismét feloldjuk, etanollal újra kicsapjuk, majd ultratiszta vízben felvesszük, vízzel szemben dializáljuk, liofilizáljuk, végül szárítjuk.

Az így kapott Ν,Ο-szulfatált heparozántermékben az Ν,Ο-szulfatált heparozán a fentebb már említett, szokásos molekulatömeg-frakcionálási eljárásokkal dúsítjuk. E dúsítás végrehajtása előnyös.

A találmány szerinti Ν,Ο-szulfatált heparozánokat, valamint a találmány szerinti új Ν,Ο-szulfatált heparozánt legalább 70% mennyiségben tartalmazó Ν,Ο-szulfatált heparozán-termékeket előnyösen egy végső N-szulfatáló reakció alkalmazásával állítjuk elő. Ebben az esetben az (I) általános képletben - amely az ismétlődő szerkezeti egységet ábrázolja - E acetil-csoportot és szulfátcsoportot jelent.

A találmány szerinti Ν,Ο-szulfatált heparozánok úgy is előállíthatok, hogy előbb egy N-szulfatálást, majd ezt követően O-szulfatálást hajtunk végre. Előnyösen ezt az utóbbi eljárásváltozatot alkalmazzuk.

HU 214 986 Β

Az N-szulfatálást kén-trioxid valamilyen szerves bázissal, például trietil-aminnal, trimetil-aminnal vagy piridinnel alkotott komplexével hajtjuk végre; alkalmazhatunk azonban e célra piridinben oldott klórszulfonsavat is. Előnyösen kén-trioxid trimetil-aminnal képzett komplexét használjuk, és az N-szulfatáló reakciót 20 °C és 80 °C közötti hőmérsékleten, lúgos-vizes közegben végezzük. Az N-szulfatáló reakció befejezése után a kapott terméket megfelelő mennyiségű etanol hozzáadásával kicsapjuk. Az így kivált csapadékot ultratiszta vízben felvesszük, ultratiszta vízzel szemben dializáljuk, majd liofílizáljuk és szárítjuk. A tisztítási eljárást példaként adjuk meg, s ez nem záqa ki egyenértékű eljárások alkalmazását. A tisztítási lépéseket többször megismételhetjük.

A találmány szerinti eljárásban az O-szulfatáló lépés előtt az N-szulfatált heparozánt előnyösen szerves bázissal képzett sójával vagy kvatemer ammóniumsóvá alakítjuk. Kvatemer ammóniumsó kialakítása szempontjából a tetrabutil-ammóniumsó használata előnyös.

Az O-szulfatáló reakciót előnyösen formamidban vagy más - kémiai szempontból egyenértékű - oldószerben, például kén-trioxid és valamilyen szerves bázis, például trimetil-amin, trietil-amin vagy piridin komplexének alkalmazásával hajtjuk végre; előnyösen kén-trioxid/piridin komplexet használunk. Az Oszulfatáló reakciót általában 10 °C és 50 °C közötti hőmérsékleten végezzük.

Ezt követően az Ν,Ο-szulfatált heparozánt úgy csapjuk ki, hogy a reakcióközeghez nátrium-kloridot adunk, amíg a nátrium-klorid koncentrációja a 0,33 mol/litert el nem éri, majd a reakcióközeghez megfelelő mennyiségű etanolt adunk. Ezt követően az Ν,Οszulfatált heparozán-terméket tisztítjuk; ennek során a fentebb már részletesen leírt lépéseket (kicsapás etanollal, dialízis, liofilizálás, szárítás) hajtjuk végre.

A találmány értelmében az előnyös Ν,Ο-szulfatált heparozán legalább 90 tömeg% mennyiségben 11 000 daltonnái kisebb molekulatömegű láncok keverékét tartalmazza. Kívánatos, hogy ez az Ν,Ο-szulfatált heparozán 0,2 pmol/mg-nél kisebb mennyiségben tartalmazzon szabad amino (NH₂) csoportokat.

Az acetilcsoport előnyösen legfeljebb a diszacharidegységek 60%-ban van jelen; kívánatos, hogy a szulfatálás foka - a szulfát/karboxil arányban kifejezve - 1,5 és 3,0 között legyen.

Előnyösek azok a találmány szerinti Ν,Ο-szulfatált heparozánok, amelyek átlagos molekulatömege megközelítőleg 4000-7000 dalton, és szulfatálási fokuk - a szulfát/karboxil arányban kifejezve - 1,7 és 3 között van, valamint megközelítőleg 80% N-dezacetilezett, Ν,Οszulfatált heparozánt (ahol az acetil-csoport-tartalom megközelítőleg 20%) tartalmaznak, amelyeknek legalább 70 tömeg%-a 5000 és 7000 dalton közötti molekulatömegű láncokból áll, és szulfatálási foka 1,8-2,5; vagy másként, megközelítőleg 80% N-dezacetilezett, Ν,Οszulfatált heparozánt tartalmaznak (ahol az acetil-csoport-tartalom megközelítőleg 20%), amelyek legalább 70 tömeg%-a 10 000 és 12 000 dalton közötti molekulatömegű láncokból áll, amelyek szulfatálási foka 1,8-2,5;

vagy másként megközelítőleg 40% N-dezacetilezett,

Ν,Ο-szulfatált heparozánt tartalmaznak (ahol az acetilcsoport-tartalom megközelítőleg 60%), amelyek legalább tömeg%-a 6000 és 8000 dalton közötti molekulatömegű láncokból áll, melyek szulfatálási foka 2,0-2,8.

Még közelebbről a találmány szerinti előnyös Nszulfatált heparozánok az alábbiak:

- Megközelítőleg 80%-ban N-dezacetilezett, Ν,Οszulfatált heparozánok (ahol az acetilcsoport-tartalom megközelítőleg 20%), amelyek legalább 80 tömeg%-ban 2300 és 7200 dalton közötti molekulatömegű láncokból állnak, és szulfatálási fokuk 1,8-2,5;

- Megközelítőleg 80%-ban N-dezacetilezett, Ν,Οszulfatált heparozánok (amelyek acetilcsoport-tartalma megközelítőleg 20%), amelyek legalább 80 tömeg%-ban 3300 és 7700 dalton közötti molekulatömegű láncokból állnak, és szulfatálási fokuk 1,8-2,5;

- Megközelítőleg 80%-ban N-dezacetilezett, Ν,Οszulfatált heparozánok (amelyek acetilcsoport-tartalma megközelítőleg 20%), amelyek legalább 70 tömeg%-ban 6900 és 13 500 dalton közötti molekulatömegű láncokból állnak, és szulfatálási fokuk 1,8-2,5;

- Megközelítőleg 40%-ban N-dezacetilezett, Ν,Οszulfatált heparozánok (amelyek acetilcsoport-tartalma megközelítőleg 60%), amelyek legalább 80 tömeg%-ban 4000 és 10300 dalton közötti molekulatömegű láncokból állnak, és szulfatálási fokuk 2,0-2,8.

Az Ν,Ο-szulfatált heparozánok sóin értjük valamennyi gyógyászati szempontból elfogadható sóikat. E sókat a szokásos módszerekkel állítjuk elő, amelyeket különösen heparinsók előállítására - a 4 168 377 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetnek.

Az Ν,Ο-szulfatált heparozánok előállítására fentebb leírt eljárás és tisztítási módszerek lehetővé teszik Ν,Οszulfatált heparozánok előállítását nátriumsójuk alakjában. E sókból - a különböző heparinsók vagy sóvá nem alakított heparin előállításá alkalmazott módszerek segítségével (lásd J. P. Duclos fentebb idézett művének 81—83. oldalán) - az Ν,Ο-szulfatált heparozánok bármilyen más sóit vagy a sóvá nem alakított Ν,Ο-szulfatált heparozánokat előállíthatjuk.

A találmány szerinti Ν,Ο-szulfatált heparozánok előnyös farmakológiai és biokémiai sajátságokkal rendelkeznek, amelyek a technika jelenlegi állása szerint egészében véve meglepők.

Közelebbről: ellentétben a 333 243 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett K5 antigén szulfátéit termékeivel, amelyek antiangiogén és daganatgátló sajátságokkal rendelkeznek, és ezeknek az antikoaguláns tulajdonságokhoz viszonyított aránya kedvező, a jelen találmány szerinti Ν,Ο-szulfatált heparozánok előnyös alvadásszabályozó hatással bírnak. E hatásuk sokkal erősebb a dermatán-szulfát hatásánál az alvadás különböző paraméterei szempontjából, és a heparinéval hasonlítható össze.

HU 214 986 Β

A találmány szerinti reprezentatív vegyületek ATIII- és HCII-fiiggő Ila elleni hatását Dupoy és munkatársai módszereivel [Thrombosis and Haemostasis 60, 236 (1988)] vizsgáltuk a heparin-kofaktor II (HCII) vonatkozásában, valamint M. L. Larsen és munkatársai módszerével [Thrombosis Research, 13, 285 (1978)] az antitrombin hatás (ATIII) vonatkozásában.

A vizsgálat mindkét esetben abban áll, hogy mérjük a vizsgálandó termék in vitro gátló hatását tisztított trombinra (Ila faktor) tisztított HCII vagy tisztított ATIII jelenlétében a trombinnak kromogén szubsztrátumra kifejtett amidolitikus hatásának meghatározása útján. Mivel a legerősebb HCII-íüggő anti-IIa hatást a dermatán-szulfát mutatja - amelyet H. W. Stuhlsatz és munkatársai módszerével állítanak elő [lásd a következő helyen: „The Methodology of Connective Tissue Research” 137-146 (1976)] - azért e hatás mérése során összehasonlító (referens) anyagként a dermatán-szulfátot alkalmaztuk, és az eredményt a dermatán-szulfát (az alábbiakban rövidítve: DS) mg-ban kifejezett azon mennyiségével fejeztük ki, amelynek hatása egyenértékű a vizsgálandó termék 1 mg mennyiségének hatásával (mg DS-egyenérték/mg).

A találmány szerinti reprezentatív terméket, anti-Xa hatását (Yin-Wessler-titer) Ε, T. Yin és munkatársai módszerével mértük [J. Láb. Clin. Med. 81, 298 (1973)], teljes antikoaguláns hatásukat az APTT teszt útján határoztuk meg [R. R. Proctor és munkatársai: Am. J. Clin. Path. 36, 212(1961)].

Valamennyi vizsgált termék a dermatán-szulfát hatásánál kifejezetten erősebb HCII-függő és anti-IIa hatást mutatott. Az ATIII-fuggő anti-IIa hatás, valamint a Yin-Wessler-titer a találmány szerinti termékek esetében a heparin hatásainál gyengébbnek bizonyult ugyan, azonban a dermatán-szulfát hatásait meghaladta. A találmány szerinti termékek APTT-titere megközelítőleg 2-20-szorosa a dermatán-szulfát megfelelő értékeinek, és a heparinénak 60%-át is elérheti.

A fentiek alapján a találmány szerinti Ν,Ο-szulfatált heparozánok különösen kedvező specifikus hatást és antikoaguláns hatást fejtenek ki. További jelentős előny a találmány szerinti termékek alacsony molekulatömege, amelynek következtében farmakokinetikai sajátságaik igen kedvezőek.

A találmány szerinti Ν,Ο-szulfatált heparozánok toxicitása igen csekély; toxicitásuk teljes mértékben összeegyeztethető gyógyszerként való alkalmazásukkal.

A találmány szerinti készítmények különösen az érfalak megbetegedései - így ateroszklerózis és arterioszklerózis - továbbá túlzott véralvadékonysággal járó állapotok, így például műtét utáni állapotok, valamint baktériumok-, vírusok- előidézte vagy enzimes aktiválás következtében beálló véralvadási zavarok megelőzésére és kezelésére, valamint daganatok kifejlődésének megelőzésére alkalmazhatók.

Az adagolást a beteg korától, testtömegétől, egészségi állapotától, betegségének súlyosságától, valamint az adagolás útjától függően széles határok között változtathatjuk.

Az adagolás során a beteg számára naponta körülbelül 1 mg-1 g, előnyösen körülbelül 5-500 mg, például napi 200 mg találmány szerinti hatóanyagot adunk egy vagy több részre elosztva intravénás vagy szubkután úton, szakaszosan vagy szabályos időközökben;

így a napi adag orális úton 200 mg-1000 mg tartományban van.

A fenti adagolást természetesen minden beteg esetében a megfigyelt eredmények és a vérparaméterek elemzése alapján végezzük.

A találmányt az alábbi, nem korlátozó jellegű példákban részletesen ismertetjük.

N-Acetil-heparozánok előállítása

1. példa

Túlnyomó részben kis molekulatömegű

N-acetil-heparozán előállítása (I. eljárás)

1) Escherichia coli (K5) baktériumtörzs tenyésztése és az N-acetil-heparozánt tartalmazó szűrlet elkülönítése

400 ml „B” közeget - amelynek összetételét az alábbi I. táblázatban adjuk meg - Escherichia coli SEBR 3282 törzzsel (amelyet a párizsi Pasteur Institute intézményben 1-1013 letétszámmal helyeztünk el) oltunk, és az így kapott szuszpenziót keverés közben 37 °C hőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk.

Az így kapott előtenyészetet egy 18,5 literes fermentorba visszük át, amely 11 liter „A” közeget tartalmaz (ennek összetételét az alábbi I. táblázat tartalmazza), a szuszpenziót 4 órán át 37 °C-on, 7,4 pH-érték megtartása mellett inkubáljuk, és keverés közben az oxigén parciális nyomását levegő szabályzott bevezetésével (20 liter/perc mennyiségig) 5,4 kPa értéken tartjuk. Ezután 8 óra alatt 250 ml/óra sebességgel folyamatosan 600 g/liter glükózt tartalmazó steril oldatot adagolunk hozzá.

A tenyésztést azonos hőmérsékleten, pH-értéken, parciális oxigénnyomás mellett a glükóz beadagolása után 10 órán át folytatjuk. A tenyésztőközeg optikai sűrűségének (OD-értékének) megfigyelésével (λ = 600 nm) megállapítható, hogy a biomassza a tenyésztés utolsó 12 órája során már nem gyarapodik.

A tenyészfolyadékot (fermentlevet) 25 °C-ra hűtjük, majd 0,22 μπι pórusméretű membránon szűrjük. így körülbelül 12 liter, N-acetil-heparozánt tartalmazó szűrletet kapunk.

I. Táblázat

Az „A” és „B” közeg összetétele és előállítása

„A” közeg előállítása
Az „A” közeget az alábbi három steril oldat egyesítésével állítjuk elő:
1. oldat:
Az alábbi komponenseket az alábbi sorrendben 700 ml ultratiszta vízben oldjuk:
Komplexképzőszer: N-[trisz(hidroximetil)-metil]-glicin (a Fluka védjegyzett TricineR terméke)	360 mg

HU 214 986 Β

„A” közeg előállítása
FeSO47xH2O	280 mg
CaCl2x2H2O	6,7 mg
MgCl2x6H2O	1270 mg
K2SO4	500 mg
KC1	5000 mg
Kazein hidrolizátum (az aminosavak fő forrása)
HY CASE SFR (a Sheffield-cég védjegyzett terméke)	25000 mg
Elesztőkivonat (a Difco-cég védjegyzett terméke)	18000 mg
Nyomelemeket tartalmazó oldat (lásd az alábbi II. táblázatot)	1 ml

Az oldathoz Pasteur-pipettával néhány csepp Struktol J673^R habzásgátló szert adunk (a Schill és Seilacher cég védjegyzett terméke).

Az oldat pH-értékét kálium-hidroxid-oldattal (d = 1,38) 7,4-re állítjuk, és térfogatát ultratiszta vízzel 850 ml-re egészítjük ki, majd a közeget 45 percig 120 °C hőmérsékleten autoklávban hevítjük.

2. oldat:

g dikálium-hidrogén-foszfátot 40 ml ultratiszta vízben oldunk, és az oldat térfogatát ultratiszta vízzel 50 ml-re egészítjük ki, majd az így kapott oldatot 0,2 μπι pórusméretű szűrőn szűrjük.

3. oldat:

20,7 g glükózt megfelelő mennyiségű ultratiszta vízben oldunk, és azonos oldószerrel 100 ml-re töltjük, majd az oldatot 110 °C hőmérsékleten 30 percig autoklávozzuk.

„B ” közeg előállítása

A „B” közeget az „A” közeghez hasonlóan állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy ahabzásgátló szer hozzáadása után 20 g 7,2 pH-értékű puffért (3-morfolinopropánszulfonsavat) adunk hozzá.

II. Táblázat

Az „A” közeg és „B” közeg előállításában alkalmazott nyomelemoldat előállítása

800 ml ultratiszta vízben sorrendben az alábbi komponenseket oldjuk:
H3BO3	500 mg
Na2MoO4x2H2O	1930 mg
COC12x6H2O	11850 mg
CuSO4x5H2O	25 mg
ZnSO4x7H2O	2000 mg
A1C13x6H2O	2410 mg

100 ml 1,19 sűrűségű sósavat adunk hozzá, majd az oldat térfogatát ultratiszta vízzel 1000 ml-re töltjk.

2) Túlnyomó részben kis molekulatömegű N-acetilheparozán izolálása és tisztítása

a) lépés: Etanolos kicsapás

A szűrlethez körülbelül 48 liter 95 (térf./térf.) százalékos etanolt adunk, majd kicsapódás és ülepedés céljából a keveréket 4 °C hőmérsékleten 8 órán át állni hagyjuk. A felülúszót szívatással eltávolítjuk, ezt követően centrifugáljuk, és a kapott pelletet körülbelül 1 liter ultratiszta vízben felvesszük.

b) lépés: Dialízis

Az előző lépésben kapott oldatot 24 Á pórusméretű, cellulóz-alapú membránnal ellátott NOJAX 40 zsákba helyezzük, és 24 órán át ultratiszta vízzel (1 térfogat oldat/6 térfogat víz, amelyet 2 óra, 8 óra és 16 óra után megújítunk) szemben dializáljuk. Ez a művelet lehetővé teszi a tenyésztőközegben jelenlévő kis molekulák - így sók, cukrok, aminosavak, oligonukleotidok és oligopeptidek - eltávolítását.

c) lépés: Kicsapás, dehidratálás és szárítás

A dializált oldat 1 térfogatára számítva 0,5 M nátrium-kloridot és 4 térfogat etanolt adunk hozzá, és 5 percig szobahőmérsékleten tartjuk, amíg a csapadék kiválik, majd a keveréket 20 percig 5000xg sebességgel centrifugáljuk. A pelleteket etanolban felvesszük, és az így kapott szuszpenziót 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ekkor a centrifugáló és szuszpendáló műveleteket megismételjük. A keveréket ismételten 5000xg sebességgel 20 percig centrifugáljuk, s az így kapott pelleteket vákuummedencében 40 °C hőmérsékleten 24 órán át szárítjuk.

d) lépés: Porrá alakítás őrléssel

A centrifugálásból származó, száraz pelleteket vízmentes körülmények között mozsárban porítjuk.

e) lépés: Anioncserélő kromatográfia

Az őrölt pelleteket a „D” pufferoldatban vesszük fel, amely 100 ml/g mennyiségben 20 mM Trisz-HCl-t tartalmaz, pH-értéke 7,5. Az így kapott oldatot erős, térhálósított, kvaterner ammóniumcsoportokat tartalmazó agaróz-mátrix anion-cserélő oszlopon kromatografáljuk (a Pharmacia R cég „Q Sepharose Fást Flow” terméke), amelyet előzőleg a „D” puffer-oldattal 1 g porra 50 ml gélt számítva egyensúlyozunk. A gélt elegendő mennyiségű „D” pufferoldattal mossuk, hogy az alapszintű 214 nm-es UV detektálási értéket kapjuk, majd 25 mM 3,5 pH-értékre beállított piperazinoldattal mossuk. Ezután az oszlopot olyan oldattal eluáljuk, amelynek pH-értéke 3,5, és 0,5 M nátrium-kloridot, valamint 25 mM piperazint tartalmaz. Az eluátumot 5 N nátrium-hidroxid-oldattal közömbösítjük.

f) lépés: Kicsapás, dehidratálás, szárítás és őrlés

A fentebb c) és d) lépésekben leírt műveleteket nátrium-klorid hozzáadása nélkül megismételjük.

Az f) lépés befejeztével így kapott N-acetilheparozánt A sarzsnak nevezzük.

A tisztítási eljárás egy másik változata abban áll, hogy a lépéseket a), c), b), d), e), f) sorrendben hajtjuk végre. Az ennek során kapott N-acetil-heparozánt Bsarzsnak nevezzük.

3) A különböző tisztítási lépések végrehajtása után kapott N-acetil-heparozán jellemzése

Mágneses magrezonancia (NMR) színkép

HU 214 986 Β

Az Ή-NMR és ¹³C-NMR színképeket a W. E. Vann által leírt N-acetil-heparozán [Eur. J. Biochem.

116, 59 (1981)] színképeivel hasonlítottuk össze.

A fentiek szerint kapott A sarzs és B-sarzs N-acetilheparozán színképeinek vizsgálata igazolta, hogy a termék kémiailag azonos a W. F. Vann által leírt N-acetilheparozánnal. A termék ismétlődő β-D-glükuronil(l->4)-a-N-acetil-D-glükózaminil-( l->4) egységekből felépülő polimer láncokból áll.

A molekulatömeg-megoszlás meghatározása kizárásos (méretkizárásos) kromatográfiával

A molekulatömeg-megoszlást kizárásos HPLC eljárással határoztuk meg az alábbi kísérleti körülmények között:

* 10 μπι átmérőjű, 250 Á porozitású szilikongyöngyökből álló oszlop;

* eluálószer 0,5 M vizes nátrium-szulfát oldat * áramlási sebesség: 1 ml/perc * UV detektálás = 205 nm;

* a kalibrálást heparinból származó, következő molekulatömegű oligoszacharidok sorával végezzük. 1324, 1883, 2436, 3411, 3996, 4535,4995, 5365, 6150, 6671, 7542, 8655, 10088, 11 561, 12950, 14809, 17387 és 22 674 dalton.

A standardok fenti sorozatából csak a 934 és 56703 dalton közötti molekulatömegeket vettük számításba. Elfogadott tény, hogy az észlelt optikai sűrűség az N-acetil-heparozán mennyiségével arányos; a módszer pontossága azonban nagy molekulatömegek esetén exponenciálisan csökken, különösen 20 000-et meghaladó molekulatömegek esetében.

Az A sarzs kizárásos (méretkizárásos) kromatográfiájának eluálási profilját az 1. ábra mutatja. Az 1. ábra elemzésével megfigyelhető, hogy a molekulatömeg-eloszlás polidiszperz és fő csúcsa megközelítőleg 4700 daltonnái van. Az A sarzs legalább 70 tömeg%ának molekulatömege 1700 és 8000 dalton tartományban van.

A B sarzs elemzése nagyon hasonló kromatogrammot eredményezett. A megoszlás szerinti főcsúcs megközelítőleg 5000 daltonnái van. A B sarzs legalább 70 tömeg%-ának molekulatömege 1500 és 8000 dalton tartományban van.

A molekulatömeg-megoszlás megfigyelése poliakrilamid-gélen végzett elektroforézissel

Az elemzésre szánt mintákat - a vándorlás végét jelző brómfenolkékkel együtt - elektroforézisnek vetettük alá Trisz-borát-pufferoldatban, 15%-os poliakrilamid-gélen, amelyet úgy kaptunk, hogy akrilamid és N,N’-metilén-bisz(akrilamid 29:1 arányú keverékét polimerizáltuk. Az elektroforézist megközelítőleg 4 órán át 40 mA áramerősséggel 18 cm hosszúságú gélen, a vándorlás befejeződését jelző anyag megjelenéséig végeztük. Ezt követően a gélt alkankék színezőanyaggal, majd ezüsttel festettük S. Pelkonen és munkatársai eljárásával [J. Bact. 170, 2646 (1983)]; ez a módszer savas poliszacharidokra specifikus.

Az elektroforézises elemzést mind az a) lépés befejeztével kapott, részben tisztított termékkel, mind a befejező lépés után kapott, tisztított A és B sarzzsal elvégeztük azzal a céllal, hogy igazoljuk: a tisztítás során az N-acetil-heparozán molekulatömeg-megoszlása lényegesen nem módosult.

Megfigyeltük, hogy az a) lépés befejeztével kapott, részben tisztított termék, valamint a végső lépés után kapott tisztított A és B sarzsok lényeges különbséget nem mutattak (vándorlásuk során azonos távolságokban hasonló erősségű sávok jelentek meg). Ez azt jelenti, hogy a tisztítás során az N-acetil-heparozán molekulatömeg-megoszlása lényegesen nem módosult.

Az uronsavak meghatározása

Az utolsó tisztítási lépés befejeztével kapott, tisztított A vagy B sarzs egységnyi tömegében lévő uronsav mennyiségét kolorimetriásan T. Bittér módszerével [Analytical Biochemistry 4, 330 (1962)] határoztuk meg. Ez a mérőmódszer azon alapul, hogy a glikozaminoglikánok karbazollal savas közegben melegítve reagálnak, és rózsaszín színeződés lép fel, amelynek erőssége a felszabadult uronsav mennyiségével arányos.

Az A sarzs esetében a d) lépés befejeztével kapott, részben tisztított termék és az í) (utolsó) lépésben kapott tisztított termék uronsavtartalmát 1,3, illetve 2,1 pmol/mg-nak találtuk.

A B sarzs esetében a tisztítás utolsó lépésében kapott tisztított termék uronsavtartalma 2,1 pmol/mg-nak adódott.

Spektrofotometriás vizsgálat az ibolyántúli és látható tartományban

A tisztított A sarzsból származó mintát ultratiszta vízben oldottuk, és az így kapott 1 mg/ml koncentrációjú oldatot 1 cm méretű küvettába helyeztük, majd 200 és 600 nm között felvettük az elnyelési színképet.

Az így kapott színkép alapján megállapítható, hogy - különösen a 256 nm hullámhosszon megfigyelt elnyelés szerint - az A sarzs 1%-nál kevesebb DNS-t tartalmaz.

Az összes fehérje meghatározása

A „Fehéij emeghatározó készlef’-et (a BIORAD cég védjegyzett terméke) alkalmaztuk az összes fehérjetartalom meghatározására. E mérőmódszer azon alapul, hogy a Coomassie Brilliant Blue G-250 savas oldatának maximális abszorpciójának hullámhossza 465 nm-ről 595 nm-re emelkedik, ha fehéijéket köt meg [Reisner és munkatársai: Anal. Biochem. 64, 509 (1975)].

Az A sarzs összes fehérjetartalma 1,5%-nál kevesebbnek adódott.

A szabad aminocsoportok (NH₂-csoportok) mérése

E mérést Zensaku Yisozawa és munkatársai módszerével [Biochimica et Biophys. Acta 141, 358 (1967)] végeztük.

Az NH₂-csoport-tartalom (pmol/mg-ban kifejezve) jelzi a dezacetilezett β-ϋ^1ϋ^Γοηί1-(1->4)-οο-Νacetil-D-glükóz-aminil-(l->4) egységek, valamint szabad aminocsoportot tartalmazó szennyezések mennyiségét.

Az A és B sarzs NH₂-tartalma egyaránt 0,05 pmol/mg. Az NH₂/glükuronsav arány 0,05/2,1, azaz 2,5%-nál kisebb. Ez annyit jelent, hogy 100 β-Dglükuronil-(l->4)-a-N-acetil-D-glükozaminil-(l->4)

HU 214 986 Β egységre vonatkoztatva mólmennyiségben kifejezve 2,5-nél kevesebb diszacharid-egység van dezacetilezett alakban.

2. példa

Túlnyomó részben kis molekulatömegű

N-acetil-heparozán előállítása (II. eljárás)

1. Escherichia coli (K5) baktériumtörzs tenyésztése és az N-acetil-heparozánt tartalmazó szűrlet elkülönítése

Az Escherichia coli SEBR 3282 törzs tenyésztését, valamint az N-acetil-heparozánt tartalmazó szűrlet elválasztását az 1. példában leírt módszerrel végezzük.

2. Túlnyomó részben kis molekulatömegű N-acetilheparozán izolálása és tisztítása

a) lépés: Dialízis

375 ml szűrletet az 1. példában leírt eljárással dializálunk [2) Túlnyomó részben kis molekulatömegű N-acetil-heparozán izolálása és tisztítása, b) lépés]. Dialízis után körülbelül 1020 ml tisztított oldatot kapunk.

b) lépés: Tisztítás savas közegben

A dializált oldathoz 3,5 pH-érték beállítására megfelelő mennyiségű 5 N sósavoldatot adunk. A kivált csapadékot centrifugálással eltávolítjuk, majd az oldatot 5 N sósavoldattal 1,8 pH-ra állítjuk. Ekkor csapadék képződhet, amelyet centrifugálással eltávolítunk, majd az oldatot 5 N nátronlúgoldattal közömbösítjük.

c) lépés: Kicsapás, dehidratálás és szárítás

A közömbösített oldathoz annyi nátrium-kloridot adunk, hogy a nátrium-klorid koncentrációja 0,5 M legyen, majd az elegyhez 4-szeres térfogatú etanolt adunk, és 5 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk a csapadékképződés befejeződéséig. Ekkor a keveréket 20 percig 5000xg sebességgel centrifugáljuk, a kapott pelleteket etanolban felvesszük, és az így kapott szuszpenziót szobahőmérsékleten 1 órán át keverjük, majd a centrifügálás és szuszpendálás műveletét megismételjük. Ezután az elegyet ismételten 5000*g sebességgel 20 percig centrifugáljuk, s a kapott pelleteket szárítókemencében vákuumban 40 °C hőmérsékleten 24 órán át szárítjuk.

d) lépés: Alkálikus hidrolízis és dialízis

Az előző lépésben szárítás után kapott terméket

2,5 tömeg/térf.%-os koncentrációban 0,25 N nátronlúgoldatban oldjuk, és az így kapott oldatot 2 órán át 50 °C hőmérsékleten tartjuk, majd 5 N sósavoldattal közömbösítjk, és az így kapott, poliszacharidot tartalmazó oldatot az 1. példában leírt eljárással [2. Túlnyomó részben kis molekulatömegű N-acetil-heparozán izolálása és tisztítása, b) lépés] dializáljuk.

Dialízis után körülbelül 900 ml oldatot kapunk.

e) lépés: Anioncserélő kromatográfia

A dializált oldathoz piperazint, EDTA-t és Triton X-100 készítményt (A Prolabo-cég terméke) adunk olyan mennyiségben, hogy a piperazin koncentrációja 25 mM, az EDTA koncentrációja 2 mM és a Triton X-100 koncentrációja 0,2 térf./térf.%-ot érjen el. Ekkor a pH értékét 5 N sósavoldattal 3,5-re állítjuk, és az oldathoz 400 ml Q Sepharose Fást Flow oszlopra helyezzük, amelyet előzőleg 25 mM piperazint, 2 mM EDTAt és 0,2 mM Triton Χ-100-at tartalmazó, 3,5 pH-értékű piperazin-pufferoldattal kiegyensúlyoztunk. Az oszlopot a piperazin-pufferoldattal mossuk, majd 0,5 M nátrium-klorid-oldattal eluáljuk, a terméket 4-szeres térfogatú etanol hozzáadásával kicsapjuk, vákuumban 40 °C hőmérsékleten szárítjuk, s így körülbelül 9,85 g Nacetil-heparozánt kapunk.

f) lépés: Kizárásos kromatográfia 4 g előző lépésben kapott terméket 60 ml pufferoldatban oldunk, amely 20 mM Trisz-HCl-t (pH 7,5) és 1 M nátrium-klorid-oldatot tartalmaz, utána az oldatot 200 ml olyan Octyl-Sepharose^R oszlopra visszük át, amelyet előzőleg ugyanazzal a pufféról dattal egyensúlyba hoztunk. Az oszlop által vissza nem tartott frakcióhoz 4-szeres térfogatú etanolt adunk, a kivált csapadékot mossuk, és 40 °C hőmérsékleten vákuumban szárítjuk. így 3,90 g N-acetil-heparozánt nyerünk.

3. A különböző tisztítási lépések elvégzése után kapott N-acetil-heparozán jellemzése

Mágneses magrezonancia (NMR) színkép Az Ή-NMR és ^l3C-NMR színképek alapján az így kapott N-acetil-heparozán vizsgálata igazolta, hogy a termék a W. F. Vann (lásd a fentebb idézett közleményt) leírt N-acetil-heparozánnal azonos.

A molekulatömeg-megoszlás meghatározása kizárásos kromatográfiával

A molekulatömeg-eloszlás meghatározását kizárásos HPLC elemzéssel az N-acetil-heparozán molekulatömeg-eloszlásának meghatározására az 1. példában leírt módszerrel végeztük. A 2. példában kapott sarzs legalább 86 tömeg%-ának molekulatömege 1500 és 15 000 dalton közötti tartományban van.

Az uronsavak mérése

Az e) lépés eredményeként kapott N-acetil-heparozán uronsavtartalma 1,94 pmol/mg.

Spektrofotometriás vizsgálat az ibolyántúli és látható tartományban

A kapott színkép alapján megállapítható, hogy a 2. példában nyert N-acetil-heparozán 1%-nál kevesebb DNS-t tartalmaz.

Az összes fehérje mérése

A 2. példában kapott N-acetil-heparozán-sarzs összes fehérjetartalma 1%-nál kevesebb.

A szabad aminocsoportok (Nlf-csoportok) mérése

Az NH₂-tartalom 0,1 gmol/mg-nál kisebb

3. példa

Túlnyomó részben kis molekulatömegű

N-acetil-heparozán előállítása (III. eljárás)

1. Escherichia coli (K5) törzs tenyésztése

Az Escherichia colia SEBR 3282 törzs tenyésztését az 1. példában leírt eljárással végezzük. Körülbelül 12 liter N-acetil-heparozánt tartalmazó tenyészetet kapunk.

2. Előzetes tisztítás

a) lépés: Centrifügálás

A tenyésztés befejezése után kapott 12 liter szuszpenziót 8000 percenkénti fordulatszámmal (rpm) (ez megfelel 11000 és 14000*g közötti sebességnek) 20 percig centrifugáljuk.

HU 214 986 Β

b) lépés: A közeg érintkeztetése alkálikus oldattal

A centrifugálás után kapott pelletet eltávolítjuk, és a felülúszót körülbelül 1 órán át 0,1 N nátronlúgoldattal érintkeztetjük.

c) lépés: Előszűrés

Az előző lépésben kapott oldatot 3M^R sorozatú 300 polipropilénszűrőn előszűrésnek vetjük alá.

d) lépés: Koncentrálás specifikált (előre meghatározott küszöbértékű) membránnal

A c) lépésben kapott szűrletet Amicon^R üregrostos, 10 000 dalton küszöbértékű - vagy ezzel egyenértékű szűrőtöltet alkalmazásával koncentráljuk, s így kis molekulatömegű N-acetil-heparozánban dúsított oldatot kapunk.

e) lépés: Dialízis

A kis molekulatömegű N-acetil-heparozánban dúsított oldatot ultratiszta vízzel szemben dializáljuk; ehhez ismét az Amicon^R rendszert alkalmazzuk igen magas (10000-nél nagyobb) hígitási faktorral.

3) A túlnyomó részben kis molekulatömegű N-acetilheparozán izolálása és tisztítása

Az 1. példában leírt eljárást alkalmazzuk [2. Túlnyomó részben kis molekulatömegű N-acetil-heparozán izolálása és tisztítása, c) - f) lépések], s így olyan N-acetilheparozánt kapunk, amelynek jellemzői az 1. példában kapott A sarzs tulajdonságaihoz hasonlóak; vagy olyan N-acetil-heparozánt kapunk, amelyet fentebb a 2. példában írtunk le [2. Túlnyomó részben kis molekulatömegű N-acetil-heparozán izolálása és tisztítása, a) - f) lépések],

Ν,Ο-szulfatált heparozánok előállítása

4. példa

Az l. példában kapott, túlnyomó részben kis molekulatömegű N-acetil-heparozán kémiai módosításai

1. A B sarzson végzett kémiai módosítások

a) lépés: Részleges (parciális) dezacetilezés

500 mg B sarzsból származó terméket 10 ml 1 N nátronlúg-oldatban oldunk, 50 °C hőmérsékleten melegítjük, és ezen a hőmérsékleten keverés közben 8 órán át reagáltatjuk, majd 2 N sósavoldattal közömbösítjük, ultratiszta vízzel szemben dializáljuk és liofilizáljuk.

b) lépés: Tetrabutil-ammónium-sá képzése

A fenti liofilizátumot 20 ml ultratiszta vízzel felvesszük, az így kapott oldatot polisztirol-alapú, divinilbenzollal térhálósított ioncserélő oszlopra (Dow Chemical^R Dowex 50 W 8) helyezzük, amelyet előzőleg savas közegben kondicionálva savformára alakítottunk. Ezt követően az oldatot 0,4 ml 40%-os tetrabutilammónium-oldattal elegyítjük, majd liofilizáljuk.

c) lépés: Parciális NO-szulfatálás

421 mg előző lépésben kapott sót 35 ml dimetilformamidban oldunk, és 3,71 g kén-trioxid/piridin komplexet (az Aldrich-cég 8755-6 tételszámú, védjegyzett terméke) adunk hozzá. A reakcióelegyet 6 órán át szobahőmérsékleten keverve reagáltatjuk. Ezután a reakcióelegy 1 térfogatára számítva annyi nátrium-kloridot adunk hozzá, hogy annak koncentrációja az oldaton 0,33 M legyen, s ezután kétszeres térfogatú etanollal elegyítjük. A csapadékképződés befejeződése után az elegyet centrifugáljuk, a felülúszót eltávolítjuk, a pelletet ultratiszta vízben felvesszük, ultratiszta vízzel szemben dializáljuk és liofilizáljuk.

Ezt követően a fentebb leírt műveletek sorát megismételjük.

Az így kapott liofilizátum jellemzői az alábbiak:

* uronsavtartalma: 1,11 pmol/mg;

* szabad NH₂-tartalma: 0,01 pmol/mg;

* szulfatálási foka: 2,64 diszacharid-egységenként.

Az uronsav- és NH₂-tartalmat az 1. példában leírt módon mértük.

A szulfatálás foka - amelyet szulfát/karboxil aránnyal is jelölünk - a szulfátcsoportok átlagos száma egy karboxil-csoportra vonatkoztatva; a szulfatálás fokát konduktometriásan, a szulfátcsoportok és karboxilcsoportok meghatározásával végeztük [B. Casu és munkatársai: Carbohydrate Research 39, 168 (1975)].

2. Az A sarzson végzett módosítások

Az A sarzsot három alikvot frakciókra osztjuk, ezeket az alábbiakban A1,A2 és A3 sarzsnak nevezzük.

a) lépés: Parciális dezacetilezés és gélszűrés

Az Al, A2 és A3 sarzsokat a fenti a) lépésben a B sarzsra leírtak szerint kezeljük, azzal az eltéréssel, hogy csak az Al sarzsot dializáljuk és liofilizáljuk. Az Al, A2 és A3 sarzsokat ezután gélszűréssel frakcionáljuk [ezt gélpermeációs kromatográfiának vagy kizárásos kromatográfiának is nevezik] az alábbi körülmények között.

Hordozóként 25-75 pm átmérőjű, N,N’-metilénbisz(akrilamid)-dal térhálósított allil-dextrán-alapú gyöngyöket alkalmazunk (a Pharmacia-cég védjegyzett Sephacryl S-300 HR terméke). Az eluálásra 0,5 M nátrium-klorid-oldatot alkalmazunk.

Elegyeket készítünk az Al sarzsból származó heparozánra vonatkoztatva 0,46-1 Kav-nak megfelelő, az A2 sarzsból származó heparozánra vonatkoztatva 0,43-1 Kav-nak megfelelő, és az A3 sarzsból származó heparozánra vonatkoztatva 0,43-0,64 Kav-nak megfelelő frakciókból. E frakciókat az alábbiakban „gélen szűrt heparozánoknak” nevezzük.

A „Kav” a kizárosos (exklúziós) kromatográfíában általánosan alkalmazott koefficiens, amely rámutat a reprodukálható, kizárosos kromatográfiával végezhető frakcionálásra. A Kav értékét a következő egyenlet határozza meg:

ahol: Ve jelenti a kérdéses frakció eluálási térfogatát;

Vo jelenti a kizárásos térfogatot; és

Vt jelenti az összes géltérfogatot.

Az AJ sarzsból közvetlenül a parciális dezacetilezés után kapott heparozán, valamint a gélen szűrt Λ 7, A2 és A3 sarzsokból származó heparozánok molekulatömegének eloszlását az 1. példában leírt eljárással, kizárásos kromatográfia útján határozzuk meg.

Az A1 sarzsból származó heparozán gélszűrés előtti és gélszűrés utáni eluálási profiljai a 2. ábrában, illetve a 3. ábrában láthatók. Az eluálási profilokból levezethető néhány eredményt az alábbi III. táblázatban össze12

HU 214 986 Β

Az integrálás útján számított dezacetilezési fokot (mértéket) 44%-nak találtuk. Ez az érték közel áll a szabad aminocsoport-tartalom uronsavtartalomhoz viszonyított arányából számított értékhez (41%).

geztünk, ahol MW_C jelenti a molekulatömeget olyan értelemben, hogy a termék 1 tömeg%-ot kitevő frakciójának molekulatömege nagyobb az Mw₀ értékénél; MW] jelenti a molekulatömeget olyan értelemben, hogy a termék 10 tömeg%-át kitevő frakciójának molekulatömege nagyobb az MW] értékénél; MW₃ jelenti a molekulatömeget olyan értelemben, hogy a termék 10 tömeg%-ot kitevő frakciójának molekulatömege kisebb az MW₃ értékénél; és MW₂ jelenti azt a molekulatömeget, amely az elnyelés maximumának megfelelő.

III. táblázat

Az A1 sarzsból származó (gélen nem szűrt) heparozán, és az Al, A2 ésA3 sarzsokból származó, gélen szűrt heparozánok molekulatömeg-eloszlása

	Mw0	MW,	mw2	MW3
Az Al sarzsból származó, gélen nem szűrt heparozán	41400	9600	4400	1400
AzAl sarzsból származó, gélen szűrt heparozán	10700	6900	4400	1600
AzAl sarzsból származó, gélen szűrt heparozán	12700	7000	4500	1500
Az Al sarzsból származó, gélen szűrt heparozán	10300	6900	4500	1500

A 2. és 3. ábrákból kivehető, hogy a gélszűrés lehetővé teszi a kisebb mennyiségű, magasabb molekulatömegű heparozán-frakció eltávolítását.

Ezt az eredményt világosan mutatja a III. táblázat, amelyben megfigyelhető az MW₀ jelentős csökkenése a gélszűrés művelete után. Valamennyi sarasból származó heparozán legalább 90 tömeg%-ban olyan láncokból áll, amelyek molekulatömege 7000 daltonnál kisebb.

Ezt követően az Al és A2 sarzsokból származó heparozánokat az 1. példában leírt módon kezeljük [2. Túlnyomó részben kis molekulatömegű N-acetilheparozán izolálása és tisztítása, c) lépés].

Az A 3 sarzsból származó, gélen szűrt heparozánt nem csapjuk ki, hanem ultratiszta vízzel szemben dializáljuk.

Az uronsav- és szabad aminocsoport-tartalmat az 1. példában leírt módon mérjük.

Az eredményeket az alábbi IV. táblázatban összegeztük. A megmaradó acetilcsoport-tartalmat annak figyelembevételével értékeltük ki, hogy a glükuronil- és glükózamil-csoportok száma a dezacetilezett termékben azonos.

A dezacetilezés mértékét (fokát) úgy számítottuk ki, hogy a szabad aminocsoport-tartalmat az uronsavtartalomhoz viszonyítottuk.

A mágneses magrezonancia színkép Az Ή-NMR színképből következtethető, hogy az A3 sarzsból származó, gélen szűrt heparozán a várt szerkezetű.

IV. táblázat

Az Al, A2 és A3 sarzsból származó, gélen szűrt heparozánok jellemzői

	Mért uronsav- tartalom (pmol/ mg)	Mért NH2-tar- talom (pmol/ mg)	Számított maradék acetil- tartalom (pmol/ mg)	A dezacetilezés mértéke
AzAl sarzsból származó, gélen szűrt heparozán	2,3	1,10	1,20	48%
Az A2 sarzsból származó, gélen szűrt heparozán	2,4	1,00	1,40	42%
Az A3 sarzsból származó gélen szűrt heparozán	2,6	1,05	1,55	41%

b) lépés: Parciális Ν,Ο-szulfatálás

Az Al, A2 és A3 sarzsból származó, gélen szűrt heparozánokat a fentebb B sarasra leírt eljárással [c) lépés: Parciális Ν,Ο-szulfatálás] kezeljük azzal az eltéréssel, hogy az első részben leírt műveleteket nem ismételjük.

Az A 3 sarzsból származó heparozán esetében az első kicsapás után kapott pelletet ultratiszta vízben felvéve ultratiszta vízzel szemben dializáljuk, és oldatban hagyjuk.

Az így kapott Ν,Ο-szulfatált termékek jellemzőit az alábbi V. táblázatban összegeztük.

V. táblázat

Az Al, A2 és A3 sarzsokból származó heparozánok parciális Ν,Ο-szulfatálási reakciójával kapott termékek jellemzői

	NH2-tartalom (pmol/mg)	A szulfatálás foka (szulfát/ karboxil arány)
AzAl sarzsból származó, Ν,Ο-szulfatált heparozán	0,10	1,9
Az A2 sarzsból származó, Ν,Ο-szulfatált heparozán	0,10	1,9
Az 43 sarzsból származó, Ν,Ο-szulfatált heparozán	0,10	1,8

Megjegyezzük, hogy az Ν,Ο-szulfatáló reakció után a maradék NH₂-tartalom (0,10 pmol/mg) nagyobb, mint a tisztított N-acetil-heparozáné (0,05 pmol/mg). A nitrogénatomon tehát a szulfatálás nem teljes.

HU 214 986 Β

c) lépés: Teljes (totális) N-szulfatálás tömegrész Ν,Ο-szulfatált terméket, 1 tömegrész nátrium-hidrogén-karbonátot és 1 tömegrész kéntrioxid/trimetil-amin komplexet a bevitt Ν,Ο-szulfatált termék 1 g-jára számítva 20 ml ultratiszta vízben elkeverünk, és a reakcióelegyet keverés közben 20 órán át 55 °C hőmérsékleten melegítjük, majd tízszeresére hígítjuk, és az oldat konduktivitását (fajlagos vezetőképességét) egy 0,5 M koncentrációjú nátrium-klorid oldatéval azonos értékre állítjuk be. Ezután kétszeres térfogatú etanolt adunk hozzá, a csapadékot centrifugáljuk, a pelleteket 0,5 M nátrium-klorid-oldatban felvesszük, és ismételten kétszeres térfogatú etanollal kicsapjuk. A csapadékot ultratiszta vízben felvesszük, ultratiszta vízzel szemben dializáljuk, a kapott terméket liofílizáljuk, végül 40 °C-on vákuumban megszárítjuk.

A mágneses magrezonancia színkép

Az A3 sarzsból származó Ν,Ο-szulfatált heparozán ^l3C-NMR színképe azt mutatja, hogy ebben a vegyületben a glükózaminil-csoport 6-helyzetében lévő alkoholcsoport teljes mértékben szulfát-észter-alakban van jelen.

Az alábbi VI. táblázatban összegeztük a kapott Ν,Οszulfatált heparozánok fentebb leírt módszerekkel meghatározott egyes jellemzőit.

VI. Táblázat

Az Al, A2 ésA3 sarzsokból származó, teljesen N-szulfatált termékek jellemzői

	Uronsav-t ártalom (pmol/ mg)	NH2-tar- talom (pmol/ mg)	A dezacetilezés mértéke	Szulfa- tálás foka (szulfát/ karboxil arány)
Az A1 sarzsból származó, Ν,Οszulfatált heparozán	1,20	0,02	48%	2,2
Az 42 sarzsból származó, Ν,Οszulfatált heparozán	1,30	0,02	42%	2,2
Az 43 sarzsból származó, Ν,Οszulfatált heparozán	1,35	0,02	41%	2,1

Megfigyelhető, hogy a maradék NH₂-tartalom (0,02 pmol/mg) csekély, kevesebb, mint a tisztított Nacetil-heparozáné (az 4 és ő sarzs esetére 0,05 pmol/mg), és kevesebb, mint a parciális Ν,Ο-szulfatálás után kapott Ν,Ο-szulfatált heparozáné (konkrét adatokat lásd az V. táblázatban). Ez igazolja, hogy az N-szulfatáló reakció teljes (totális jellegű).

Az N-szulfatálás után kapott termék eluálási profilját a 4. ábrában mutatjuk be. Az A2 és A3 sarzsokból származó termékek esetében igen hasonló eluálási profilokat figyeltünk meg.

Az eluálási profilokból következő néhány eredményünket a VII. táblázatban gyűjtöttük össze. E táblázatban az MW_e, MW_b MW₂ és MW₃ jelentése ugyanaz, mint a III. táblázatban.

Vll. táblázat

AzAl, A2 és A3 sarzsok totális N-szulfatálásából kapott termékek molekulatömegének eloszlása

	MW0	MWj	mw2	MW3
Al sarzs	14700	9000	5700	2600
42 sarzs	17500	10000	5800	3400
43 sarzs	11600	7 600	5000	1800

Valamennyi sarzsból származó Ν,Ο-szulfatált heparozán legalább 90 tömeg%-ban olyan láncokat tartalmaz, amelyek molekulatömege 10 000 daltonnái kisebb.

Valójában az47, illetve42, illetve A3 sarzsból származó termék 80%-ban olyan láncokat tartalmaz, amelyek molekulatömege 2600 és 9000 dalton között, illetve 3400 és 10000 dalton között, illetve 1800 és 7600 dalton között van.

5. példa

A 2. példából származó, túlnyomórészt kis molekulatömegű N-acetil-heparozán kémiai módosításai; Ν,Ο-szulfatált heparozánok előállítása; 80%-ban N-dezacetilezett származék E kísérletünkben a 2. példában leírt eljárással előállított N-acetil-heparozánt alkalmazzuk, amelynek uronsav-tartalma 2,12 μιηοΐ/mg. A molekulatömeg-eloszlás meghatározását exkluziós (méretkizárásos) kromatográfiával végeztük az 1. példában leírt módon. Legalább 87,5 tömeg% mennyiségű frakcióban a láncok molekulatömege 1500 és 15 000 dalton közötti. Az eloszlás csúcsa megközelítőleg 4900 daltonnái jelenik meg. Ezt az N-acetil-heparozán sarzsot C sarzsnak nevezzük.

a) lépés: Részleges dezacetilezés

2,5 g C sarasból származó terméket 50 ml 2 N nátronlúgoldatban oldva 50 °C-ra melegítünk, és keverés közben ugyanezen a hőmérsékleten tartjuk 8 órán át, majd a pH-értékét 2 N sósavoldattal 8-ra állítjuk be, és az oldatot ultratiszta vízzel szemben dializáljuk, majd liofílizáljuk. így 1,96 g terméket kapunk.

Az N-dezacetilezés mértéke

A szabad aminocsoportok (NH₂-csoportok) mérése azt mutatta, hogy az N-acetil-heparozán N-dezacetilezése 80%-ban ment végbe.

b) lépés: N-szulfatálás

A fenti liofilizátumot 70 ml vízben felvesszük, 2,5 g nátrium-karbonátot, majd 2,5 kén-trioxid/trimetil-amin komplexet adunk hozzá, és a reakcióelegyet 20 órán át 55 °C-on melegítjük.

A reakcióelegy fajlagos vezetőképességét ásványmentesített víz hozzáadásával 0,5 M nátrium-klorid-oldatéval azonos értékre állítjuk be, majd négyszeres térfogatú etanol hozzáadásával kicsapást végzünk. Az elegyet

HU 214 986 Β centrifugáljuk, a csapadékot ismét 0,5 M nátrium-kloridoldatban oldjuk, és ismételten négyszeres térfogatú etanolt adunk hozzá, majd az elegyet centrifugáljuk.

A centrifugálás után kapott pelletet ultratiszta vízben felvesszük, és az így kapott oldatot az 1. példában leírt eljárással dializáljuk, majd liofilizáljuk. így körülbelül 2 g terméket nyerünk.

c) lépés: Tetrabutil-ammónium-só előállítása

Az előző lépésben kapott liofilizátumot a 4. példában leírt eljárással [1. A B sarzs kémiai módosításai, b) lépés] alakítjuk tetrabutil-ammónium-sóvá, s így 2,7 g sóterméket kapunk.

d) lépés: O-Szulfatálás

2,680 g előző lépésben kapott sót 196 ml formamidban oldunk, 11,27 g kén-trioxid/piridin komplexet adunk hozzá, és a reakcióelegyet keverés közben 6 órán át 30 °C hőmérsékleten reagáltatjuk. Ekkor a reakcióelegy 5 térfogatára számítva 1 térfogat 2 M nátrium-klorid-oldatot adunk hozzá, és az elegy pH-értékét nátronlúggal 7-re állítjuk. Kétszeres térfogatú etanol hozzáadásával kicsapást végzünk, az elegyet centrifugáljuk, a pelletet 0,5 M nátrium-klorid-oldatban ismét oldjuk, és kétszeres térfogatú etanolt adunk hozzá. A csapadékleválás után az elegyet centrifugáljuk, a pelletet 80 ml ultratiszta vízzel felvesszük, 20 ml 2 M nátrium-klorid-oldatot és utána négyszeres térfogatú etanolt adunk hozzá. A csapadék leválása után az elegyet centrifúgáljuk.

e) lépés: Gélszűrés

A d) lépésben kapott terméket ultratiszta vízben felvesszük, és a 4. példában [2. Az A sarzs kémiai módosításai, a) lépés] leírt körülmények között gélszűrésnek vetjük alá.

Az Ν,Ο-szulfatált heparozánt felépítő láncok molekulatömegét az 1. példában leírt kizárásos kromatográfiás eljárással határoztuk meg. Egyesítettük egyrészt azokat a frakciókat, amelyek 1500 és 12 000 dalton közötti molekulatömegű láncokat tartalmaztak [C (ri) oldat], másrészt azokat a frakciókat, amelyek Ν,Οszulfatált heparozánjainak a lánca 2000-től 30000 daltonig terjedő molekulatömegű [C (M) oldat].

A C (ri) oldathoz négyszeres térfogat etanolt adunk, az elegyet a csapadék leválása után centrifúgáljuk, és a pelletet ultratiszta vízzel felvesszük. Az elegyet ultratiszta vízzel szemben dializáljuk, majd liofilizáljuk, s így 1,8 g terméket kapunk.

Az így kapott Ν,Ο-szulfatált heparozánt Cl sarzsnak nevezzük.

Ennek az Ν,Ο-szulfatált heparozánnak a fenti módszerekkel meghatározott néhány jellemzőit az alábbi VIIL táblázatban foglaltuk össze.

VIII. Táblázat

A Cl sarzs termékének jellemzői

	Uronsav- tartalom (pmol/mg)	NH2-tar- talom (pmol/mg)	A dezacetilezés mértéke	Szulfatálás foka (szulfát/ karboxil arány)
Cl sarzs	1,6	0,013	80%	1,9

A termék molekulatömeg-eloszlását az 1. példában leírt eljárással értékeltük ki. Az eluálási profilból kapott néhány eredményünket az alábbi IX. táblázatban mutatjuk be.

IX. táblázat

A Cl sarzs termékének molekulatömeg-eloszlása

	MW0	MW,	mw2	MW3
Cl sarzs	9600	7200	5621	2367

Az MWj, MWj, MW, és MW₃ jelentése ugyanaz, mint a III. táblázatban.

A Cl sarzsnak megfelelő Ν,Ο-szulfatált heparozán 95 tömeg%-ban 1500 és 15 000 dalton közötti molekulatömegű láncokat tartalmaz.

A mágneses magrezonancia (NMR) színkép

Felvettük a Cl sarzsból származó Ν,Ο-szulfatált heparozán Ή-NMR és ¹³C-NMR színképét AMX 500as műszerrel, D₂O oldószerben.

Az Ή-NMR és '³C-NMR színképek elemzése a termék várt szerkezetét igazolta; e termék valóban egy Ν,Ο-szulfatált heparozán.

A cukorrész protonjai és az acetil-protonok intenzitási aránya valószínűsíti, hogy a dezacetilezés mértéke 84%-os. Ez az érték megközelíti azt az értéket, amelyet a szabad aminocsoport-tartalom és az uronsavtartalom viszonyának (80%) számításával kaptunk.

A ¹³C-NMR színkép vizsgálata különösen alátámasztja, hogy a glükózamin-rész csaknem teljesen Nszulfatált formában van. A D-glükuronsav 2- és 3helyzetben nincsen szulfátéit formában.

j) lépés: Gélszűrés

A C (M) oldathoz 5 térfogat etanolt adunk, és a csapadék leválása után az elegyet centrifugáljuk. A pelletet ultratiszta vízzel felvesszük, dializáljuk, majd liofilizáljuk.

A liofilizált terméket 0,5 M nátrium-klorid-oldatban oldjuk, és az e) lépésben megadott körülmények megtartásával gélszűrés útján frakcionáljuk.

Egyesítjük egyrészt azokat a frakciókat, amelyekben a láncok molekulatömege 1300 és 21000 dalton között van [C (B) oldat], másrészt azokat a frakciókat, amelyekben a láncok molekulatömege 1400 és 37000 dalton között van [C (C) oldat].

Az így kapott két oldatot a fentebb C (A) oldat esetére leírt módon kezeljük, és liofílizálás után a C (B) oldatról a C2 sarzsot, a C (C) oldatból a C3 sarzsot kapjuk.

A C2, illetve C3 sarzsból kapott termékek eluálási profiljából következő néhány eredményünket az alábbi X. táblázatunkban mutatjuk be.

X. táblázat

A C2, illetve C3 sarzsok termékeinek molekulatömeg-eloszlása

	MW0	MW,	mw2	MWj
C2 sarzs	14600	9600	7597	5950
C3 sarzs	28656	17320	10512	7975

HU 214 986 Β

Az MW₀, MW_b MW₂ és MW₃ jelentése ugyanaz, mint a III. táblázatban.

A C2 sarzsnak megfelelő Ν,Ο-szulfatált heparozán körülbelül 99 tömeg%-ban olyan láncokat tartalmaz, amelyek molekulatömege 1500 és 15000 dalion közötti; a megfelelő C3 Ν,Ο-szulfatált heparozán körülbelül 73 tömeg%-ban tartalmaz olyan láncokat, amelyek molekulatömege 1500 és 15 000 dalton között van.

6. példa

A 2. példából származó, túlnyomórészt kis molekulatömegű N-acetil-heparozán kémiai módosításai: Ν,Ο-szulfatált heparozán előállítása: 40%-ban N-dezacetilezett,

2.6 szulfatálási fokú származék előállítása

E kísérletünkben kiindulási anyagként a 2. példában leírt eljárással készült N-acetil-heparozánt alkalmazzuk. E termék uronsavtartalma 1,96 pmol/mg. E sarzsot D sarzsnak nevezzük.

a) lépés: Részleges dezacetilezés

3.7 g D sarzsból származó terméket 74 ml 1 N nátronlúgoldatban oldunk, és nitrogénatmoszférában reagáltatjuk. A reakcióelegyet az 5. példa a) lépésben leírt módon kezeljük. Liofílizálás után 2,91 g terméket kapunk.

Az N-dezacetilezés mértéke

A liofílizálás után kapott termék szabad NH₂-csoport-tartalmának mérése azt mutatta, hogy az N-aceilheparozán 40%-ban N-dezacetileződött.

b) lépés: N-Szulfatálás

Az előző lépésből kapott terméket 3,7 g nátriumkarbonát jelenlétében 3,7 g kén-trioxid/trimetil-amin komplexszel kezeljük az 5. példa b) lépésében leírt eljárás szerint. így körülbelül 3 g N-szulfatált heparozánt kapunk.

c) lépés: Tetrabutil-ammónium-só előállítása

Körülbelül 2 g előző lépésben kapott N-szulfatált heparozánt az 5. példa c) lépésében leírt módon alakítunk tetrabutil-ammónium-sóvá, s így 2,99 g liofílizált terméket kapunk.

d) lépés: O-Szulfatálás

2,98 g előző lépésben kapott sót az 5. példa d) lépésében leírt úton 14 g kén-trioxid/trimetil-amin-komplexszel reagáltatunk, majd a kicsapást és tisztítást az 5. példa d) lépésében leírt eljárással végezzük, s így 2,8 g terméket kapunk.

e) lépés: Gélszűrés

Az előző lépésben kapott terméket a 4. példában leírt módszerrel és berendezéssel [2. Az A sarzs termékének kémiai módosításai, a) lépés] gélszűrés útján frakciónál tünk.

Az Ν,Ο-szulfatált heparozán-frakciók molekulatömegének eloszlását az 1. példában leírt módon, kizárásos kromatográfiával határoztuk meg. Izoláltuk azokat az Ν,Ο-szulfatált heparozánokból álló frakciókat, amelyek túlnyomó részében a láncok molekulatömege 1500 és 15 000 dalton közötti érték volt.

E frakciókat töményítjük, és ultratiszta vízzel szemben dializáljuk, majd 5 térfogat etanol hozzáadásával kicsapást végzünk, a reakcióelegyet centrifugáljuk, a csapadékot 0,5 m nátrium-klorid-oldatban oldjuk, és a kícsapást megismételjük.

Az így kapott tisztított terméket az ezen lépés kezdetére megadott módon második frakcionálásnak vetjük alá. A fentebb már leírt módon végzett kizárásos kromatográfiával meghatároztuk a molekulatömeg-eloszlást, s egyesítettük a 4000 és 8000 dalton közötti molekulatömegű termékeket.

E frakciókat dializáltuk, majd etanol hozzáadásával a terméket kicsaptuk. A csapadékot 0,5 M nátrium-klorid-oldatban oldjuk, és ultratiszta vízzel szemben dializáljuk, majd liofilizáljuk. így körülbelül 1 g Ν,Ο-szulfatált heparozánt kapunk, amelyet a továbbiakban Dl sarzsnak nevezünk.

Ezen Ν,Ο-szulfatált heparozán jellemzőit és molekulatömeg-eloszlását az alábbi XI. és XII. táblázatban foglaltuk össze.

XI. Táblázat

A Dl sarzsnak megfelelő termékjellemzői

	Uronsav- tartalom (gmol/mg	NH2-tar- talom (gmol/mg	A dezacetilezés mértéke	Szulfatálás foka (szulfát/ karboxil arány)
Dl sarzs	1,53	0,01	40%	2,60

XII. táblázat

A Dl sarzs termékének molekulatömeg-eloszlása

	MW0	MW,	mw2	MW,
Dl sarzs	15430	10305	6850	4047

Az MW₀, MW_b MW₂ és MW₃ jelentése ugyanaz, mint a III. táblázatban.

A Dl sarzsból származó Ν,Ο-szulfatált heparozán 80% tömeg%-ban 4047 és 10305 dalton közötti molekulatömegű láncokat tartalmaz, és e láncok körülbelül 98,5 tömeg%-ának a molekulatömege 1500 és 14600 dalton között van. Az 5. ábrában mutatjuk be az ezen Ν,Ο-szulfatált heparozán esetében kapott eluálási profilt.

A mágneses magrezonancia (NMR) színkép

A Dl sarzsból származó Ν,Ο-szulfatált heparozán ’H-NMR és ’³C-NMR színképet AMX 500 műszerrel D₂O oldószerben vettük fel.

Az ’H-NMR és ’³C-NMR színképek elemzése igazolta a termék várt szerkezetét: e termék valóban Ν,Οszulfatált heparozán.

A termék ’³C-NMR színképe különösen alátámasztotta azt, hogy a glükózamin-egységben szabad NH₂ alakú aminocsoport nincsen jelen. A glükózamin-egység C6-helyzetben teljesen szulfatált formában van; ezzel szemben a glükuronsavnak nem mindegyik hidroxilcsoportja van szulfatált formában.

7. példa

Túlnyomórészt kis molekulatömegü, 2. példából származó N-acetil-heparozán kémiai módosításai:

HU 214 986 Β

Ν,Ο-szulfatált heparozán előállítása: 40%-ban dezacetilezett, 3 szulfatálási fokú származékok előállítása

E kísérletünkben kiindulási anyagként a 2. példában leírt eljárással előállított N-acetil-heparozánt alkalmaztuk. E sarzsot a továbbiakban E sarzsnak nevezzük, uronsavtartalma 2 pmol/mg.

Ezen N-acetil-heparozán molekulatömeg-eloszlását az 1. példában leírt módon értékeltük ki: e N-acetilheparozán körülbelül 75 tömeg%-ban olyan láncokat tartalmaz, amelyek molekulatömege 1500 és 15 000 dalton közötti, és e láncok átlagos molekulatömege megközelítőleg 10900 dalton. A túlnyomó mértékben jelenlévő termék molekulatömege 5135 dalton.

a) lépés: Részleges dezacetilezés

E lépést a 6. példa a) lépésében leírt módon végezve 40%-ban N-dezacetilezett N-acetil-heparozánt kapunk. Az N-dezacetilezés céljából 2,5 g kiindulási anyagot 50 ml 1 N nátronlúg-oldatban oldunk, a reakció befejezése után a reakcióelegy pH-értékét sósavoldattal 6-ra állítjuk, majd az elegyet koncentráljuk.

Az N-dezacetilezés mértéke

A szabad aminocsoport-tartalom (NH₂-tartalom) mérése azt mutatta, hogy az N-acetil-heparozán 40%ban dezacetileződött.

b) lépés: Gélszűrés

0,5 M konyhasóoldattal kiegyensúlyozott Sephacryl S-300 HR oszlopot (5 cm 100 cm) alkalmaztunk.

A különböző frakciókban jelenlévő heparozán molekulatömeg-eloszlását kizárásos kromatográfiával határozzuk meg. A 6000 és 20 000 dalton közötti molekulatömegű láncokat tartalmazó frakciókat egyesítjük, az elegyet forgóbepárló berendezésben betöményítjük, majd négyszeres térfogatú etanolt adunk hozzá, és a kivált csapadékot megszárítjuk. így mintegy 1 g terméket kapunk.

c) lépés: Tetrabutil-ammómium-sö előállítása, és részleges N, O-szulfatálás

A tetrabutil-ammónium-só képzése céljából 300 mg előző lépésben kapott terméket alkalmazunk, és a 4. példában leírt eljárást követjük [1. A β-sarzs kémiai módosításai, b) lépés]. így 490 mg sót kapunk, amelyet 30 ml formamidban oldunk, majd a parciális N,Oszulfatálást a 4. példában leírt eljárással végezzük [1. A B sarzs kémiai módosításai, c) lépés első része].

490 mg sót 2,25 g kén-trioxid/piridin komplexszel reagáltatva 406 mg Ν,Ο-szulfatált heparozánt kapunk.

d) lépés: Teljes (totális) N-szulfatálás és gélszűrés

372 mg előző lépésben kapott terméket 15 ml 5%os nátrium-klorid-oldatban oldunk, és a 4. példában leírt eljárás szerint [2. Az rí sarzs kémiai módosításai, c) lépés] 372 mg kén-trioxid/trimetil-amin komplexszel kezeljük.

A totális N-szulfatálás után kapott terméket gélszűréssel, a fentiekben leírt módon Sephacryl S300 HR oszlopon (2,5 cm* 100 cm) gélszűrésnek vetjük alá.

A 6000 és 20000 dalton közötti molekulatömegű frakciókat egyesítjük, forgóbepárló készülékben betöményítjük, kimerítően dializáljuk hideg ultratiszta vízzel szemben, majd liofílizáljuk. így 260 mg Ν,Οszulfatált heparozánt kapunk, amelyet a továbbiakban El sarzsnak nevezünk. E termék jellemzőit az alábbi XIII. táblázatban összegeztük.

A XIV. táblázat mutatja az El sarzs termékét alkotó láncok molekulatömeg-eloszlását.

Ez az Ν,Ο-szulfatált heparozán körülbelül 75 tömeg%-ban olyan láncokat tartalmaz, amelyek molekulatömege 1500 és 15 000 dalton között van; és megközelítőleg 65 tömeg%-ban olyan láncokat tartalmaz, amelyek molekulatömege 7700 és 15 000 dalton közötti.

XIII. Táblázat

Az El sarzsnak megfelelő termékjellemzői

	Uronsav- tartalom (gmol/mg)	NH2-tar- talom (μηιοΐ/mg)	A dezacetilezés mértéke	Szulfatálás foka (szulfát/ karboxil arány)
El sarzs	1,35	0,01	40%	3

XIV. táblázat

Az El sarzs termékének molekulatömeg-eloszlása

	MW0	MW,	mw2	mw3
El sarzs	31238	19671	12029	7748

Az MW₀, MW_1; MW₂ és MW₃ jelentése ugyanaz, mint a III. táblázatban.

8. példa

Két N, O-szulfatált heparozán-sarzs előállítása:

80%-ban N-dezacetilezett származékok, amelyek szulfatálási foka 2,25, illetve 2,4

Kiindulási anyagként az F sarzsot alkalmazzuk, amely a 2. példában leírt módszerrel előállított N-acetilheparozán.

Az e terméket alkotó láncok molekulatömeg-eloszlását az 1. példában leírt módon kizárosos kromatográfiával végezzük.

A profil vizsgálata alapján megállapítható, hogy az E sarzs 92 tömeg%-ban olyan láncokat tartalmaz, amelyek molekulatömege 1500 és 15 000 dalton között van. A túlnyomó részt képviselő csúcs megközelítőleg 4800 daltonnak felel meg. Az F sarzs legalább 80 tömeg%-nyi frakciójának a molekulatömege 2400 és 1000 dalton közötti.

E termék uronsavtartalma 2,4 pmol/mg.

a) lépés: Részleges dezacetilezés

Az 5. példában [a) lépés] leírt eljárást követjük, kiindulási anyagként 2,5 g F sarzsot és 50 ml 2 N nátronlúgoldatot. alkalmazunk, s így 1,6 g 80%-ban dezacetilezett terméket kapunk. Az N-dezacetilezés mértékét a szabad aminocsoportok meghatározásával kaptuk.

b) és c) lépés: N-Szulfatálás és tetrabutil-ammónium-só előállítása

E két lépést az 5. példa b) és c) lépései szerint végezzük, s így 4,7 g tetrabutil-ammónium-sót kapunk.

HU 214 986 Β

d) lépés: O-Szulfatálás

2,9 g fentiek szerint kapott sót 290 ml formamidban oldunk, 17,4 g kén-trioxid/piridin komplexet adunk hozzá, és az 5. példa d) lépésében leírt eljárást követjük.

A második centrifugálás után kapott pelletet ultratiszta vízben oldjuk, és az elegyet ultratiszta vízzel szemben dializáljuk, majd liofílizáljuk.

így 3,68 g terméket kapunk.

e) lépés: Gélszűrés

Az előző lépésben kapott terméket 0,5 M nátriumklorid-oldatban oldjuk, és 0,5 M nátrium-klorid-oldattal kiegyensúlyozott Sephacryl S-300 HR oszlopra visszük. A lecsepegő folyadékot frakciókollektorban gyűjtjük.

Az 1400 és 10 000 dalton közötti molekulatömegű frakciókat egyesítjük, forgóbepárló készülékben koncentráljuk, négyszeres térfogat etanol hozzáadásával kicsapást végzünk, a csapadékot centrifugáljuk, a csapadékot ultratiszta vízzel felvesszük, az így kapott oldatot ultratiszta vízzel szemben kimerítően dializáljuk, liofílizáljuk, és az így kapott terméket szárítjuk.

1,6 g Ν,Ο-szulfatált heparozánt kapunk, amelyet az alábbiakban FI sarzsnak nevezünk.

Az 5000 és 35 000 dalton közötti molekulatömegű frakciókat egyesítjük, forgóbepárlón koncentráljuk, az így kapott oldathoz négyszeres térfogatú etanolt adunk, az elegyet centrifugáljuk, a csapadékot vízzel felvesszük, az így kapott oldatot ultratiszta vízzel szemben dializáljuk, és liofílizáljuk. A liofílizált terméket az ezen lépés elején leírt módon tovább ffakcionáljuk.

A különböző frakciók molekulatömeg-eloszlását az

1. példában leírt módon kizárásos kromatográfíával határozzuk meg. A 2000 és 26000 dalton közötti molekulatömegű Ν,Ο-szulfatált heparozánokat tartalmazó frakciókat egyesítjük, négyszeres térfogatú etanolt adunk hozzá, az elegyet centrifugáljuk, a kapott pelletet ismét desztillált vízben oldjuk, és az elegyet dializáljuk, majd liofílizáljuk. így 0,6 g Ν,Ο-szulfatált heparozánt kapunk, amelyet az alábbiakban F2 sarzsnak nevezünk.

Az FI, illetve F2 sarzsok jellemzőit a XV. táblázatban mutatjuk be. Az eluálási profilokból következő eredményeket a XVI. táblázatban összegeztük.

XV. Táblázat

Az FI és F2 sarzsnak megfelelő Ν,Ο-szulfatált heparozánok j ellemzői

	Uronsav- tartalom (μηιοΙ/mg)	NH2-tarta- lom (μπιοΐ/ing)	A dezacetilezés mértéke	Szulfatálás foka (szulfát/ karboxil arány)
FI sarzs	1,58	<0,01	80%	2,4
F2 sarzs	1,58	<0,01	80%	2,25

XVI. táblázat

Az FI, illetve F2 sarzs termékének molekulatömeg-eloszlása

	MW0	MW,	MW2	MWj
FI sarzs	10700	7 700	5800	3300
F2 sarzs	24400	16325	8600	6900

Az MW₀, MWj, MW₂ és MW₃ jelentése ugyanaz, mint a III. táblázatban.

Az FI sarzsnak megfelelő Ν,Ο-szulfatált heparozán megközelítőleg 99 tömeg%-ban olyan láncokat tartalmaz, amelyek molekulatömege 1500 és 15 000 dalton között van; az F2 sarzs körülbelül 84,6 tömeg%-ban olyan láncokból áll, amelyek molekulatömege 1500 és 15000 dalton között van, és közel 70 tömeg%-ban olyan láncokból épül fel, amelyek molekulatömege 6900 és 13 500 dalton közötti.

A mágneses magrezonancia (NMR) színkép

Az FI sarzsnak megfelelő Ν,Ο-szulfatált heparozin Ή-NMR és ¹³C-NMR színképét AMX 500 műszerrel, D₂O oldószerben vettük fel.

Az Ή-NMR színkép vizsgálata és különösen a cukorrész protonintenzitásának a dezacetilezett aminocsoport proton-intenzitásához viszonyított aránya valószínűvé teszi, hogy a glükózamin-egységek 20%-a N-acetilezett formában van.

A ¹³C-NMR színkép vizsgálata alapján a glükózaminegység valóban N-szulfatált formában van. A diszacharidegységek túlnyomó részében a glükuronsav 2- és 3-helyzetben nincsen O-szulfatált alakban.

Készítmények (termékek) előállítása „A ” készítmény (termék)

Túlnyomó részben nagy molekulatömegű N-acetil-heparozán előállítása (I. eljárás)

1. Escherichia coli (K5) törzstenyésztés és az N-acetilheparozánt tartalmazó szűrlet elkülönítése 400 ml „D” közeget (összetételét lásd az alábbi

XVII. táblázatban) Escherichia coli SEBR 3282 törzzsel oltunk, és a szuszpenziót keverés közben 37 °C hőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk.

Az így kapott előtenyészetet 18,5 liter térfogatú fermentorba visszük át, amely 11 liter „C” közeget tartalmaz (összetételét lásd az alábbi XVII. táblázatban), és az így kapott szuszpenziót 6,5 órán át 37 °C hőmérsékleten 7,2 pH-értéken inkubáljuk, miközben az oxigén parciális nyomását 5 kPa nyomáson tartjuk levegő befüvatásával (legfeljebb 20 liter/perc sebességgel) keverés közben. Ezután folyamatos adagolással 16-17 órán át 18 g/óra sebességgel 500 g/liter koncentrációjú steril glicerinoldatot adagolunk be.

A tenyésztést azonos körülmények között, tehát azonos hőmérsékleten, pH-érték mellett és parciális oxigénnyomáson addig folytatjuk, amíg a glicerin lényegében teljesen el nem fogy. A tenyészet szuszpenziójának OD (λ = 600 nm) értékének megfigyelése a glicerin adagolásának befejezése után azt mutatja, hogy a

HU 214 986 Β fermentorban 28-30 órás tenyésztés után stacionér állapot áll be, vagy enyhe lízis figyelhető meg.

Ekkor a fermentlevet 25 °C-ra hűtjük, majd 0,22 μπι pórusméretű membránon szüljük. így körülbelül 12 liter olyan szűrletet kapunk, amely főként nagy molekulatömegű N-acetil-heparozánt tartalmaz.

XVII. táblázat

A „C” közeg és „D” közeg összetétele és előállítása „C” közeg:

Az alábbi komponenseket sorrendben 900 ml ultratiszta vízben oldjuk:
NTA (nitrilo-triecetsav)	1000 mg
K2HPO4	790 mg
Glutaminsav	11000 mg
MgCl26H2O	500 mg
K2SO4	450 mg
FeSO4x7H2O	18 mg
CaCl2x2H2O	2 mg
NaCl	500 mg
KC1	5000 mg
Nyomelemoldat (lásd a II. táblázatot az 1. példában)	1 ml
Glicerin	10000 mg

A pH értékét tömény 1,38 sűrűségű kálilúgoldattal 7,2-re állítjuk, és a térfogatot ultratiszta vízzel 1000 mire egészítjük ki. Az oldatot 0,2 pm pórusméretű membránon sterilező szűrésnek vetjük alá.

Glicerinoldat készítése g glicerint megfelelő mennyiségű ultratiszta vízben oldunk, és az oldat térfogatát ultratiszta vízzel 1000 ml-re egészítjük ki, majd 0,2 pm pórusméretű membránon sterilező szűrésnek vetjük alá.

A fermentálás során habzásgátló anyagként Struktol^RJ 673 szert alkalmazunk (Schill és Sellacher cég terméke).

„D közeg:

A „D” közeget a „C” közeg előállításához hasonlóan készítjük, azzal az eltéréssel, hogy a habzásgátló szer hozzáadása után 7,2 pH-értékű 3-morfolino-propánszulfonsav puffért adunk hozzá.

2. A túlnyomó részben nagy molekulatömegű Nacetil-heparozán izolálása és tisztítása

A túlnyomó részben magas molekulatömegű Nacetil-heparozánt a 2. példában leírt eljárás szerint izoláljuk és tisztítjuk [2. Túlnyomó részben kis molekulatömegű N-acetil-heparozán izolálása és tisztítása, a) - f) lépések],

3. A kapott N-acetil-heparozán jellemzése

A molekulatömeg-eloszlás meghatározása kizárásos kromatográfíával

A jelenleg használatban lévő standardokra tekintettel a molekulatömeg-eloszlást megközelítőleg értékeltük ki.

A kapott N-acetil-heparozán 200 000 és 50 000 dalton közötti molekulatömegű láncokból áll, amelyek átlagos molekulatömege körülbelül 100000-200000 dalton.

Az uronsavak meghatározása

A tiszttott termék uronsavtartalma az utolsó lépés után 2,2 pmol/mg.

Spektrofotometriás vizsgálat az ibolyántúli és látható tartományban

A színkép alapján megállapítható, hogy ez a sarzs 0,5%-nál kevesebb DNS-t tartalmaz.

Az összes fehérjetartalom meghatározása

Az összes fehérjetartalom 0,5%-nál kevesebb.

A szabad aminocsoport-tartalom (NHfi meghatározása

Az NH₂-tartalom 0,1 pmol/mg-nál kevesebb.

„B” Készítmény (termék)

Túlnyomó részben nagy molekulatömegű N-acetilheparozán előállítása (II. eljárás)

1. Escherichia coli (K5) törzs tenyésztése

Az Escherichia coli SEB 3282 törzs tenyésztését az „A” készítmény esetére leírt módon végezzük. Megközelítőleg 12 liter, túlnyomó részben nagy molekulatömegű N-acetil-heparozánt tartalmazó szűrletet kapunk.

2. Előzetes tisztítás

A 3. példában leírt eljárást követjük [3. Túlnyomó részben kis molekulatömegű N-acetil-heparozán izolálása és tisztítása].

„ C” Készítmény (termék)

Az „A ’’ készítményből származó, túlnyomó részben nagy molekulatömegű N-acetil-heparozán kémiai módosításai

A különböző kémiai módosítások céljára kiindulási anyagként egy „A” készítményre leírt eljárással előállított N-acetil-heparozánt alkalmaztunk, amelyet az alábbiakban GI sarzsnak nevezünk.

E termék uronsavtartalma 2,41 pmol/mg.

a) lépés: Részleges dezacetilezés

1,9 g GI sarzsból származó terméket 38,5 ml 2 N nátronlúgoldatban oldunk, az oldatot 50 °C-ra melegítjük, és ezen a hőmérsékleten nitrogénatmoszférában 8 órán át reagáltatjuk, majd a pH értékét 2 N sósavoldat hozzáadásával 8,25-re állítjuk, az elegyet ultratiszta vízzel szemben dializáljuk, és utána liofilizáljuk.

így 1,6 g terméket kapunk.

Az N-dezacetilezés mértéke

A szabad aminocsoport-tartalom (NH₂) meghatározása azt mutatja, hogy az N-acetil-heparozán 80%-ban N-dezacetileződött.

b) lépés: N-Szulfatálás

1,3 g előző lépésben kapott terméket 57 ml ultratiszta vízben oldunk, 1,9 g nátrium-karbonátot és 1,9 g kéntrioxid/trimetil-amin komplexet adunk hozzá, és a reakcióelegyet 20 órán át 55 °C-on melegítjük. Ekkor az oldat fajlagos vezetőképességét ionmentes víz hozzáadásával 0,5 M nátrium-klorid-oldatéval azonos értékre állítjuk be, és négyszeres térfogatú etanol hozzáadásával kicsapást végzünk. Az elegyet centrifúgáljuk, a pelletet 0,5 M nátrium-klorid-oldattal felvesszük, négyszeres térfogatú etanol hozzáadásával kicsapjuk és centrifúgáljuk.

HU 214 986 Β

A pelletet ultratiszta vízben feloldjuk, és az elegyet az 1. példában leírt eljárás szerint ultratiszta vízzel szemben dializáljuk, majd liofilizáljuk.

így 1,809 g N-szulfatált heparozánt kapunk.

c) lépés: Tetrabutil-ammémium-só előállítása

800 mg előző lépésben kapott terméket 100 ml vízben oldunk, az így kapott oldatot Dowex 50 W 8 ioncserélő oszlopra visszük, majd a 4. példában leírt eljárást követjük [1. A B sarzs kémiai módosításai, b) lépés].

Liofílizálás után körülbelül 1,3 g sóterméket kapunk.

d) lépés: O-Szulfatálás

Az előbbi lépésben kapott sóterméket 80 ml formamidban feloldjuk, 5,6 g kén-trioxid/piridin komplexet adunk hozzá, a reakcióelegyet 6 órán át 30 °C hőmérsékleten reagáltatjuk, majd 16 ml 2 M nátriumklorid-oldatot adunk hozzá, pH-értékét 7-re szabályozzuk, és kétszeres térfogat etanol hozzáadásával kicsapást végzünk. A csapadékot 0,5 M nátrium-klorid-oldattal felvesszük, ismét kicsapjuk kétszeres etanol hozzáadásával, az elegyet ultratiszta vízzel szemben dializáljuk, és forgóbepárló készüléken betöményítjük.

e) lépés: Gélszűrés

Az előző lépésben kapott tömény oldatot gélszűréssel frakcionáljuk: ehhez Sephacryl S-300 HR oszlopot és eluálószerként 0,5 M konyhasóoldatot alkalmazunk.

A 10000 és 500000 dalton közötti molekulatömegnek megfelelő frakciókat elkülönítjük, kétszeres térfogatú etanolt adunk hozzá, és az elegyet betöményítjük. A tömény oldat fajlagos vezetőképességét víz hozzáadásával 0,5 M nátrium-klorid-oldat megfelelő értékével azonosra állítjuk be.

A gélszűrő frakcionálást megismételjük, és a 10000-200000 dalton átlagos molekulatömegű láncokból álló Ν,Ο-szulfatált heparozánt tartalmazó frakciókat összegyűjtjük; továbbá a megközelítőleg 50000 és a megközelítőleg 12000 dalton átlagos molekulatömegű láncokból álló Ν,Ο-szulfatált heparozánt tartalmazó frakciókat is összegyűjtjük.

A fenti három frakció mindegyikéhez ötszörös térfogat etanolt adunk, és a frakciókat ultratiszta vízzel szemben dializáljuk, majd a dialízis után kapott oldatokat liofilizáljuk. így három Ν,Ο-szulfatált heparozán sarzsot kapunk:

- A G1 sarzs átlag 10000-200000 dalton átlagos molekulatömegű láncokból álló Ν,Ο-szulfatált heparozán; ebből a sarzsból 0,140 g mennyiséget izolálhatunk;

- A G2 sarzs megközelítőleg 50 000 dalton átlagos molekulatömegű láncokból álló Ν,Ο-szulfatált heparozán; ezt a sarzsot 0,350 g hozammal izolálhatjuk;

- A G3 sarzs 12000 átlagos molekulatömegű láncokból álló Ν,Ο-szulfatált heparozán; ezt a sarzsot 0,100 g hozammal izolálhatjuk.

A fenti három Ν,Ο-szulfatált heparozán sarzs jellemzőit az alábbi XVIII. táblázatban összegezzük.

XVI11. táblázat

A Gl és G2 és G3 Ν,Ο-szulfatált heparozán sarzsok jellemző értékei

	Uronsav- tartalom (gmol/mg)	NH2-tar- talom (gmol/mg)	A dezacetilezés mértéke	Szulfatálás foka (szulfát/ karboxil arány)
Gl sarzs	1,48	<0,01	80%	2,6
G2 sarzs	1,45	<0,01	80%	2,6
G3 sarzs	1,45	<0,01	80%	2,6

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (23)

1. Eljárás 70-100% 1500 és 15000 dalton közötti molekulatömegű láncokból vagy láncok keverékéből álló, (I) általános képletű ismétlődő diszacharid-egységet tartalmazó Ν,Ο-szulfatált heparozánt, ahol E jelentése az Ν,Ο-szulfatált heparozánok diszacharid-egységeinek 0-80%-ában acetilcsoport, a többi diszacharid-egységben pedig szulfátcsoport, vagy adott esetben hidrogénatom, és

G jelentése hidrogénatom vagy szulfátcsoport, és amelynek szulfát/karboxil arányban kifejezett szulfatálási foka 1,5 és 3,0 közötti érték, valamint ezeknek az Ν,Ο-szulfatált heparozánoknak a gyógyászati szempontból elfogadható sóit tartalmazó készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéssorozatot végezzük:

a) lépés: Escherichia coli (K5) törzset tenyésztünk;

b) lépés: az így keletkezett N-acetil-heparozánt - adott esetben előzetesen tisztítva - izoláljuk és tisztítjuk, s így 70-100% mennyiségben olyan Nacetil-heparozánt tartalmazó terméket kapunk, amely 1500 és 15000 dalton közötti molekulatömegű láncokból vagy láncok keverékéből áll, és amely a (II) képletű ismétlődő diszacharid-egységet tartalmazza;

c) lépés: az így kapott N-acetil-heparozán terméket részlegesen dezacetilezzük, s így olyan heparozán terméket kapunk, amely 70-100% mennyiségben 1500 és 15000 dalton közötti molekulatömegű láncokból vagy láncok keverékéből áll, és amely a (III) általános képletű, ismétlődő diszacharid-egységet tartalmazza, amelyben R’ a diszacharid-egységek 0-80%ában acetilcsoportot jelent, és a diszacharidegységek többi részében hidrogénatomot jelent;

d) lépés: az így kapott heparozán-terméket részlegesen

Ν,Ο-szulfatáljuk; vagy az így kapott heparozán-terméket részlegesen Ν,Ο-szulfatáljuk, majd teljesen (totálisan) Nszulfatáljuk; vagy az így kapott heparozán-terméket teljesen vagy részlegesen N-szulfatáljuk, és ezt követően teljesen vagy részlegesen O-szulfatáljuk,

HU 214 986 Β és adott esetben — az a), b), c) vagy d) lépés végén - egy vagy több molekulatömeg-frakcionálási lépést végzünk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy E helyén acetilcsoportot vagy szulfátcsoportot tartalmazó Ν,Ο-szulfatált heparozánt állítunk elő.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 1500 és 15 000 dalton közötti molekulatömegű láncokból vagy láncok keverékéből álló, (I) általános képletű ismétlődő diszacharid-egységet tartalmazó Ν,Ο-szulfatált heparozánt, ahol

E jelentése az Ν,Ο-szulfatált heparozánok diszacharid-egységeinek 0-80%-ában acetilcsoport, a többi diszacharid-egységben pedig szulfátcsoport, vagy adott esetben hidrogénatom, és

G jelentése hidrogénatom vagy szulfátcsoport, és szulfát/karboxil arányban kifejezett szulfatálási fokuk 1,5 és 3,0 közötti érték;

és az Ν,Ο-szulfatált heparozánok két - redukáló és nem redukáló - láncvége uronsav szulfatált vagy nemszulfatált formában, glükózamin-egység szulfatált vagy nem-szulfatált formában, vagy N-acetil-glükózaminegység szulfatált vagy nem-szulfatált formában; valamint ezeknek az Ν,Ο-szulfatált heparozánoknak a gyógyászati szempontból elfogadható sóit állítjuk elő.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan Ν,Ο-szulfatált heparozánt állítunk elő, ahol E jelentése a diszacharid-egységek 0-60%-ában acetilcsoport.

5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan Ν,Ο-szulfatált heparozánt állítunk elő, amely legalább 90 tömeg% mennyiségben 11000 daltonnál kisebb molekulatömegű láncokat tartalmaz.

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan Ν,Ο-szulfatált heparozánt állítunk elő, amely legfeljebb 0,2 pmol/mg amino (NHj-csoportot tartalmaz.

7. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan Ν,Ο-szulfatált heparozánt állítunk elő, amely 4000 dalton és 7000 dalton közötti átlagos molekulatömegű láncokból áll, és szulfatálási foka a szulfát/karboxil arányban kifejezve 1,7 és 3 közötti érték.

8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan Ν,Ο-szulfatált heparozánt állítunk elő, amely legalább 70 tömeg%-ban 5000 és 7000 dalton közötti molekulatömegű láncokból áll, szulfatálási foka

- szulfát/karboxil arányban kifejezve - 1,8 és 2,5 közötti érték, E jelentése a diszacharid-egységek 0-20%ában acetilcsoport.

9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan Ν,Ο-szulfatált heparozánt állítunk elő, amely legalább 70 tömeg%-ban 10000 és 12000 dalton közötti molekulatömegű láncokból áll, szulfatálási foka

- szulfát/karboxil arányban kifejezve - 1,8 és 2,5 közötti érték, és E jelentése a diszacharid egységek 0-20%-ában acetilcsoport.

10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan Ν,Ο-szulfatált heparozánt állítunk elő, amely legalább 70 tömeg%-ban 6000 és 8000 dalton közötti molekulatömegű láncokból áll, szulfatálási foka

- szulfát/karboxil arányban kifejezve - 2,0 és 2,8 közötti érték, és E jelentése a diszacharid-egységek 0-60%-ában acetilcsoport.

11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan Ν,Ο-szulfatált heparozánt állítunk elő, amely legalább 80 tömeg%-ban 2300 és 7200 dalton közötti molekulatömegű láncokból áll, szulfatálási foka - szulfát/karboxil arányban kifejezve - 1,8 és 2,5 közötti érték, E jelentése az egységek 0-20%-ában acetilcsoport.

12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan Ν,Ο-szulfatált heparozánt állítunk elő, amely legalább 80 tömeg%-ban 3300 és 7700 dalton közötti molekulatömegű láncokból áll, szulfatálási foka

- szulfát/karboxil arányban kifejezve - 1,8 és 2,5 közötti érték, és E jelentése a diszacharid-egységek 0-20%-ában acetilcsoport.

13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan Ν,Ο-szulfatált heparozánt állítunk elő, amely legalább 70 tömeg%-ban 6900 és 13 500 dalton közötti molekulatömegű láncokból áll, szulfatálási foka

- szulfát/karboxil arányban kifejezve - 1,8 és 2,5 közötti érték, és E jelentése a diszacharid-egységek 0-20%-ában acetilcsoport.

14. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan Ν,Ο-szulfatált heparozánt állítunk elő, amely legalább 80 tömeg%-ban 4000 és 10300 dalton közötti molekulatömegű láncokból áll, szulfatálási foka

- szulfát/karboxil arányban kifejezve - 2,0 és 2,8 közötti érték, és E jelentése a diszacharid-egységek 0-60%-ában acetilcsoport.

15. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Escherichia coli (K5) törzsként a SEBR 3282 törzset [Pasteur Institute intézményben (Párizs, Franciaország) a CNCM-nél 1-1013 letétszámmal deponált] vagy e törzs valamilyen - akár spontán, akár indukált - mutánsát alkalmazzuk.

16. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az Escherichia coli (K5) törzs tenyésztését a biomassza gyarapodásának megszűnése után legalább két órán át folytatjuk.

17. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az N-acetil-heparozán izolálása és tisztítása legalább egy alkoholos kicsapási lépést, és legalább egy ioncserélő kromatográfiás lépést foglal magában.

18. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az N-acetil-heparozán izolálását és tisztítását az alábbi lépéssoroztot magában foglaló eljárással végezzük:

aj lépés: etanollal kicsapást végzünk;

b j lépés: a kapott terméket dializáljuk;

ej lépés: etanolos kicsapást végzünk, majd a kapott terméket dehidratáljuk és szárítjuk; d j lépés: a kapott terméket anioncserélő kromatográfiával tisztítjuk; és ej lépés: a d j lépésben kapott eluátumhoz etanolt adva kicsapást végzünk, a kapott terméket dehidratáljuk, szárítjuk, és őröljük, az aj vagy ej lépések egyike mellőzhető.

HU 214 986 Β

19. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az N-acetil-heparozán izolálását és tisztítását az alábbi lépéssorozatot magában foglaló eljárással végezzük:

a’ j lépés: dialízist végzünk;

b j) lépés: a kapott terméket savas közegben tisztítjuk, és a 3,5 és 1,8 pH-értékű vizes oldatban oldhatatlan szennyezéseket eltávolítjuk;

c’!) lépés: etanollal kicsapást végzünk, a kapott terméket dehidratáljuk és szárítjuk;

dj) lépés: a kapott terméket alkálikus hidrolízisnek, majd dialízisnek vetjük alá;

ej) lépés: a kapott terméket anioncserélő kromatográfiával tisztítjuk; és fj) lépés: a kapott terméket kizárásos (exklúziós) kromatográfiával tisztítjuk.

20. Az 1, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az Escherichia coli (K5) törzs tenyésztéséből kapott N-acetil-heparozánt az izolálás és tisztítás előtt előzetes tisztításnak vetjük alá, amelyet az alábbi lépéssorozatot magában foglaló eljárás alkalmazásával hajtunk végre:

a’j) lépés: a tenyésztés befejezése után kapott szuszpenziót centrifugáljuk;

b’j) lépés: a felülúszót alkálikus oldattal érintkezésbe hozzuk;

c’j) lépés: az így kapott termékkel előszűrést végzünk;

d’j) lépés: meghatározott küszöbértékű membránszűrő alkalmazásával töményítjük a kapott terméket; és e’j) lépés: az így kapott terméket dializáljuk, ahol az e’j) lépés mellőzhető.

21. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a részleges Ν,Ο-szulfatálási lépés után teljes N-szulfatálást végzünk kénsavanhidrid és valamilyen szerves bázis komplexével, vizes oldószerben, bázisos pH-érték mellett.

22. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a teljes N-szulfatálási lépés után molekulatömeg-frakcionálást végzünk.

23. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nagy molekulatömegű K5 poliszacharidot alkalmazunk kiindulási anyagként és a nagy molekulatömegű N-acetil-heparozán dezacetilezése előtt, dezacetilezése után, N-szulfatálása után vagy N,O-szulfatálása után depolimerizálást végzünk.