CZ279081B6

CZ279081B6 - N,o-sulfated heparosanes, process of their preparation and pharmaceutical compositions containing said n,o-sulfated heparosanes and a strain escherichia coli (k5) sebr 3282

Info

Publication number: CZ279081B6
Application number: CS913668A
Authority: CZ
Inventors: Jean Claude Lormeau; Bruno Chevallier; Marc Louis Victor Salome; D Estais Guy Etienne Tenaille
Original assignee: Sanofi Sa
Priority date: 1990-12-03
Filing date: 1991-12-03
Publication date: 1994-12-15
Also published as: DK0489647T3; SI9111886A; FR2669932A1; IE914197A1; BR9105239A; NO300277B1; TW216396B; PL167668B1; EP0489647B1; KR920012103A; JPH051101A; FI915697A0; BG95567A; DE69125109T2; GR3023541T3; CS366891A3; AU646112B2; FI103050B; EP0489647A2; FI915697L

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nových N,O-sulfátovaných heparosanů, N,O-sulfátovaných heparosanových kompozic, obsahujících tyto nové N,O-sulfátované heparosany, způsobu jejich přípravy a farmaceutických kompozicí, které tyto nové N,O-sulfátované heparosany obsahují jako účinnou látku.

Dosavadní stav techniky

Je známé, že glykosaminoglykany jsou produkty, které mohou být získány extrakcí živočišných tkání. Některé z těchto glykosaminoglykanů mají velmi zajímavé antikoagulační a antitrombotické vlastnosti. Typickými produkty této skupiny látek jsou heparin, jeho fragmenty a jejich deriváty, jakož i heparinsulfát a dermatansulfát. Tyto produkty však mají nevýhodu, spočívající v tom, že jsou vzhledem ke způsobu jejich získání velmi drahé.

Je známo, že dermatansulfát je tvořen skupinou polymerů s proměnným stupněm polymerace, tvořených opakujícími se strukturními jednotkami, sestávajícími ze skupiny kyseliny uronové (iduronyl nebo glukuronyl) a z acetylsulfo-4-galaktosaminylové skupiny (H. W. Stuhlsatz The Methodology of Connective Tissue Research, (1976), 137-146). Přírodní dermatansulfát má molekulovou hmotnost mezi 20 000 a 40 000 Da. Tento produkt je obzvláště zajímavý jako antikoagulačně a antitromboticky účinná látka (F. Fernandez a kol., British Journal of Haematology, (1986), 64, 309-317) .

Kromě toho je známo (I. Bjork a U. Lindahl, Molecular and Cellular Biochemistry (1982), Dr. W. Junk Publishers, Holandsko) , že krevní koagulace je komplexním fysioloickým jevem, jehož mechanismus může být schematicky znázorněn následujícím způsobem:

-1CZ 279081 B6

Kontaktní aktivace

Faktor XII > Faktor Xlla

Faktor XI > Faktor

Xla

Faktor IX

Faktor IXa⁺

Tkáňový faktor Vila

Faktor X \y

Faktor Xa⁺

Faktor X

Protrombin II

Trombin⁺

Ha

Fibrinogen > Fibrin

Některé stimuly, jako kontaktní aktivace a tkáňové faktory, spouští následnou aktivaci série koagulačních faktorů, přítomných v krevní plasmě, přičemž tyto faktory jsou ve výše uvedeném schématu definovány římskými číslicemi a přítomnost indexu a symbolizuje aktivovanou formu, zatímco nepřítomnost symbolu a symbolizuje neaktivovanou formu daného koagulačního faktoru.

Ať je charakter stimulu jakýkoliv,.finální etapy jsou vždy identické: faktor Xa aktivuje faktor II (tento faktor je rovněž nazýván protrombin), jeho aktivní forma (faktor Ha, který je rovněž nazýván trombin) vyvolává parciální proteolýzu rozpustného fibrinogenu za vzniku nerozpustného fibrinu, který je základní složkou krevního koláče.

Za normálních fysiologických podmínek jsou v plasmě rovněž přítomné regulační proteiny, jakými jsou antitrombin III (ATIII) a kofaktor II heparinu (HCII).

Antitrombin III má inhibicní účinnost vůči množině koagulačních faktorů, označených ve výše uvedeném schématu křížkem. Tento inhibicní účinek·je velmi výrazně zesílen přítomností heparinu nebo syntetických oligosacharidů heparinového typu (D.H. Atha a kol., Biochemistry (1985), 24, 6723-6729).

Kofaktor II heparinu vykazuje inhibicní účinnost pouze vůči faktoru Ha (trombin), který katalyzuje poslední etapu koagulace krve. Tato inhibicní účinnost je zesílena výrazným způsobem

-2CZ 279081 B6 v přítomnosti heparinu nebo dermatansulfátu (D.M. Tollefsen, J. Biol. Chem (1983), 258, 6713-6716).

Inhibice faktoru Xa nebo faktoru Ha představuje přednostní prostředek, pomocí kterého lze dosáhnout antikoagulační a antitrombotické účinnosti, protože tyto dva faktory zasahují do posledních dvou etap systému krevní koagulace, které jsou nezávislé na charakteru stimulu, spouštějícího proces srážení krve.

Při inhibici samotného faktoru Ha spočívá zajímavá možnost ve -využití specifičnosti kofaktoru II heparinu a v zesílení jeho inhibiční účinnosti. Dermatansulfát je známým produktem, který má nejmocnější zesilující účinnost tohoto typu.

Rovněž je známo, že stavba heparinového řetězce probíhá ve dvou etapách. Nejdříve se heparin biosyntetizuje z proteoglykanového prekurzoru, jehož polysacharidová část je tvořena skupinou polymerů s různým stupněm polymerace, tvořených opakujícími se beta-D-glukuronyl-1,4-alfa-N-acetyl-D-glukosamyl- (1,4) -ovými jednotkami (disacharidové jednotky) s molekulovou hmotností 379 Da. Tato polysacharidová část je obvykle nazývána N-acetylheparosan (J. Navia, Anal. Biochem., (1983), 135, 134-140). Tato první etapa biosyntézy je jedinou etapou, kdy lze opravdu mluvit o disacharidových strukturních jednotkách, neboť druhá etapa biosyntézy výrazným způsobem modifikuje tento jednoduchý skelet (Heparin, fabrication, structure, propriétés, analyses, J. P. Duclos, (1984), str. 81-83, Masson Ed., Francie).

Ve skutečnosti je biosyntézou vytvořený přírodní heparin polysacharidem, tvořený molekulami kyseliny glukuronové a kyseliny iduronové (uronové kyseliny), případně sulfátovanými v poloze 2 a připojenými k molekulám flukosaminu, případně sulfátovaným v poloze 6 a sulfátovaným nebo acetylovaným v poloze 2.

Struktura heparinu může být statisticky znázorněna následujícím obecným vzorcem i:

coo ch₂oa · ~ i i

	OA	NHB —	n
ve	kterém
A	znamená	atom vodíku a skupinu SO₃‘	•
B	znamená	skupinu SO₃‘ a COCH₃ a
n	je celé	číslo mezi 20 a 30,
což	odpovídá	molekulové hmotnosti 12000 až 18000 Da (EP-A-0116
801	)
	Výrazy	atom vodíku a skupina	SO₃ a skupina SO₃

a COCH₃, použité ve významech obecných substituentů A a B,

-3CZ 279081 B6 * znamenají, že ve 20 až 30 výše uvedených disacharidových jednotkách A v některých případech znamená atom vodíku a v jiných případech znamená skupinu SO₃, a analogicky B ve většině případů znamená skupinu SO₃“ a v ostatních případech znamená acetylovou skupinu.

Stejně tak vínková vazba znamená, že skupina COO” ve 20 až výše uvedených disacharidových jednotkách má v některých případech konfiguraci vzorce ii:

(jedná se o kyselinu D-glukoronovou) , má konfiguraci vzorce iii:

a ve většině z n jednotek

(jedná se o kyselinu L-iduronovou).

Heparin a fragmenty heparinu, které se zejména získají různými polymeračními postupy, jsou tedy makromolekuly, obsahující jak jednotky kyseliny glukuronové, tak i jednotky kyseliny iduronové.

sulfatace, který je výchozího heparinu. popsané v patentové

Některé depolymerační metody umožňují získat fragmenty heparinu, mající molekulovou hmotnost 2000 až 9000 Da a stupeň alespoň o 20 % vyšší než stupeň sulfatace Takové supersulfátované hepariny jsou přihlášce EP-A-0 116 801 a mají v případě uronových jednotek obě výše uvedené struktury vzorců ii a iii.

Rovněž je známo, že některé bakterie rodu Escherichia coli produkují tobolkovitý polysacharid, který je obvykle označován jako antigen K5 a který je tvořen skupinou polymerů, tvořených opakujícími se strukturními beta-D-glukuronyl-1,4-alfa-N-acetyl-D -glukosamyl-(1,4)-ovými jednotkami (W.F. Vann a kol., Eur. J. Biochem (1981), 116, 359-364).

Tento polysacharid, který má stejnou chemickou povahu, jako polysacharidová část proteglykanového prekursoru heparinu, zde bude nazýván N-acetylheparosanem. Tento produkt má molekulovou hmotnost 10⁵ až 2.10⁶ Da a v úrovni jednotek kyselina uronová má velmi pravidelnou strukturu, tvořenou výlučně kyselinou D-glukuronovou (W.F. Vann a kol., Eur. J. Biochem., (1980), 116, 359-364,- patentová přihláška EP-A-0 333 243).

-4CZ 279081 B6

Patentová přihláška EP-A-0 333 243 popisuje O-sulfátovaný polysacharid K5, jakož i některé z jeho fragmentů, tvořených 4, 6 nebo 8 cukerným jednotkami, které jsou rovněž 0-sulfátované. Tyto produkty mají antiangiogenní a protinádorovou účinnost s příznivým poměrem těchto účinností vzhledem k antikoagulačním vlastnostem. Tento dokument rovněž popisuje N-acetylheparosanové fragmenty, tvořené 4, 6, 8 nebo 10 cukernými jednotkami.

Patentová přihláška EP-A-0 333 243 rovněž popisuje přípravu pentasacharidu, majícího strukturu N-acetylheparosanu, který je O-sulfátován, celkovou chemickou syntézou.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že N,O-sulfátované heparosany s proměnnou molekulovou hmotností mezi 1500 a 15000 Da mají antikoagulační účinnost vůči heparinovému kofaktoru II a velmi zvýšenou anti-Xa-účinnost.

N,O-sulfátované heparosany, které jsou předmětem vynálezu, se tedy liší od ostatních produktů, které již byly popsané v literatuře, jejich originální strukturou, zejména jejich stupněm sulfatace (sulfatace také na aminové skupině glukosaminu) a jejich farmakologickými vlastnostmi. Vedle jiných farmakologických vlastností mají antikoagulační účinnost vůči heparinovému kofaktoru II (HCII) silnější, než je stejná účinnost dermatansulfátu a jsou velmi zajímavými farmakokinetiky. Produkty podle vynálezu, které jsou produkty získanými chemickou polosyntézou, mají farmakologické účinky glykosaminoglykanů běžně terapeuticky používaných, zejména farmakologické účinky heparinu, a mohou být proto použity pro regulaci krevní koagulace, přičemž mohou najít použití zejména jako antitrombotika.

Předmětem -vynálezu jsou N,O-sulfátované heparosany, tvořené řetězci nebo směsí řetězců s molekulovou hmotností mezi 1500 a 15000 Da, charakterizovanými opakovanou disacharidovou strukturou obecného vzorce I

(I) ve kterém

E znamená v 0 až 80 % disacharidových jednotek uvedených N,O-sulfátovaných heparosanů acetylovou skupinou a ve zbývajících disacharidových jednotkách sulfátovou skupinu a případně atom vodíku, a

G znamená atom vodíku a sulfátovou skupinu, a farmaceuticky přijatelné soli uvedených N,O-sulfátovaných heparosanů .

-5CZ 279081 B6

Stupeň sulfatace N,O-sulfátovaných heparosanů, vyjádřený jako poměr sulfát/karboxyl, je s výhodou roven 1,5 až 3,0.

Předmětem vynálezu je také N, O-sulfátoheparosanová kompozice, obsahující alespoň 70 % hmotnosti N,0-sulfátováného heparosanu, který byl popsán výše, přičemž tato kompozice s výhodou obsahuje alespoň 90 % hmotnosti N,O-sulfátovaných heparosanů podle vynálezu.

N-O-Sulfátované heparosany podle vynálezu mohou být tvořeny polysacharidovými řetězci s identickou, dobře definovanou molekulovou hmotností, přičemž tato molekulová hmotnost leží v intervalu 1500 až 15000 Da. Uvedené N,0-sulfátované heparosany mohou být také tvořeny směsí řetězců s různou molekulovou hmotností, přičemž tyto molekulové hmotnosti leží v rozmezí mezi 1500 a 15000 Da. Rozptyl molekulových hmotností těchto řetězců může být větší nebo menší. Ve skutečnosti sulfátované heparosany podle vynálezu mohou být tvořeny řetězci, jejichž vzájemné molekulové hmotnosti se liší nejvíce o 13500 Da, nebo naopak řetězci, jejichž vzájemné molekulové hmotnosti se liší o asi 300 Da, což odpovídá jednotce uronové struktury (kyselina D-glukuronová nebo její deriváty) nebo glukosaminové struktury. Rovněž je zřejmé, že v závislosti na konstituci každého N,O-sulfátovaného heparosanů může molekulová hmotnost řetězců, majících buď nejnižší nebo nejvyšší molekulovou hmotnost, odpovídat libovolné hodnotě mezi 1500 a 15000 Da.

Výše uvedený vyraz G ' znamená atom vodíku a sulfátovou skupinu znamená, že G v disacharidové jednotce znamená pro některé polohy atom vodíku a pro zbývající polohy sulfátovou skupinu. Stejným způsobem E znamená v některých disacharidových jednotkách acetylovou skupinu a ve zbývajících jednotkách sulfátovou skupinu nebo případně atom vodíku. Disacharidové jednotky N,O-sulfátovaných heparosanů nejsou tedy všechny identické.

Vzorec I zahrnuje opakovanou disacharidovou strukturu, tvořenou glukosaminovou jednotkou a jednotku kyseliny D-glukuronové. Uvedené jednotky mohou být invertované, zejména bere-li se v úvahu, že disacharidové struktura obecného vzorce I se opakuje n-krát a že neredukční jednotkou řetězců může být buď glukosaminové jednotka, jakou je jednotka uvedená v obecném vzorci I s hydroxylovou skupinou v poloze 4, přičemž tato glukosaminová jednotka je nebo není sulfátována, nebo kyselina D-glukuronová, která případně obsahuje dvojnou vazbu v poloze C4-C5 a je nebo není sulfátována. Redukční jednotkou může být buď kyselina D-glukuronová, jakou je jednotka uvedená v obecném vzorci I, substituovaná vodíkem na anomerním atomu kyslíku, nebo glukosamin nebo 2,5-anhydromanno-struktura, jakou je struktura získaná dusitou depolymerací (2,5-anhydro-D-mannosa) a případnou následnou oxidací (kyselina 2,5-anhydro-D-mannonová) nebo redukcí (2,5-anhydro-D-mannitol) .

Výhodnými produkty jsou ty produkty, jejichž oba konce, redukční i neredukční, řetězců N,O-sulfátovaných heparosanů podle vynálezu jsou tvořeny sulfátovanými nebo nesulfátovanými uronovými jednotkami, sulfátovaným nebo nesulfátovaným glukosaminem, N-acetylglukosaminem, který je nebo není sulfátován, nebo jednotkami, majícími 2,5-anhydromanno-strukturu.

-6CZ 279081 B6

Výhodné jsou N,O-sulfátované heparosany tvořené řetězci, jejichž oba konce, redukční i neredukční, jsou tvořeny sulfátovánými nebo nesulfátovanými uronovými jednotkami, sulfátovaným nebo nesulfátovaným glukosaminem a sulfátovaným nebo nesulfátovaným N-acetylglukosaminem.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob přípravy kompozice, obsahující 70 až 100 % N,O-sulfátovaného heparosanu podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje sekvenci následujících stupňů:

- stupeň a: kultivace kmene Escherichia coli (K5) za účelem •vytvoření N-acetylheparosanu,

- stupeň b: izolace a čištění vytvořeného N-acetylheparosanu za účelem získání kompozice, obsahující 70 až 100 % N-acetylheparosanu tvořeného řetězci nebo směsí řetězců s molekulovou hmotností mezi 1500 a 15000 Da, charakterizovanými opakovanou disacharidovou strukturou vzorce II

NHCOCH₃ OH

- stupeň c: parciální desacetylace této kompozice N-acetylheparosanu za účelem získání kompozice, obsahující 70 až 100 % heparosanu, tvořeného řetězci nebo směsí řetězců s molekulovou hmotností mezi 1500 a 15000 Da, charakterizovanými opakovanou disacharidovou strukturou vzorce III:

COOH

OH (lil) ve kterém R' znamená v 0 až 80 % disacharidových jednotek acetylovou skupinu a ve zbývajících disacharidových jednotkách atom vodíku,

- stupeň d: - buď parciální N,O-sulfatace této heparosanové kompozice,

- nebo parciální N,O-sulfatace této heparosanové kompozice a následný stupeň celkové N-sulfatace,

- nebo celková nebo parciální N-sulfatace a následný stupeň celkové nebo parciální O-sulfatace, přičemž uvedený způsob zahrnuje případně jeden nebo několik stup

-7CZ 279081 B6 ňů frakcionace molekulových hmotností, provedených po ukončení stupňů a, b, c nebo d.

Pro přípravu kompozice, obsahující 70 až 100 % N,O-sulfátovaného heparosanu podle vynálezu způsobem podle vynálezu s jako kmen Escherichia coli(K5) s výhodou použije kmen Escherichia coli SEBR 3282. Tento kmen je odvozen od kmene Bi 8337-41 (010:K5:H4)ATCC 23506 (popsán zejména D. S. Gupta a kol., FEMS Microbiology Letters, (1982), 14, 75-78 a W. Vannem v Eur. J. Biochem., (1981), 116, 359-364).

Tento kmen Escherichia coli SEBR 3282 má pozitivní odezvu při typovém testu fágem K5, provedeném postupem, popsaným B. Kaiserem a kol. (J. Clin. Microbiol., (1984), 19,2, 264-266). Jedná se tedy opravdu o kmen Escherichia coli(K5). Tento kmen byl uložen u CNCM Pasteurova ústavu v Paříži pod číslem 1-1013. Rovněž je možné použít mutant, a to buď spontánní nebo indukovaný, tohoto kmene, stejně jako další vhodné kmeny Escherichia coli(K5), například kmen Bi 626-42 (012:K5:NM) ATCC 23508.

Použité kultivační prostředí je s výhodou bohaté na dusíkatý materiál a může být například tvořené kultivačním prostředím s podstatným obsahem kvasničného extraktu a kaseinového hydrolyzátu, což je méně nákladný prostředek, obsahující významné množství aminokyselin.

V kultivaci kmene Escherichia coli (K5) se výhodně pokračuje ještě alespoň dvě hodiny po ukončení nárůstu biomasy.

Izolace a čištění N-acetylheparosanu za účelem získání kompozice, obsahující 70 až 100 % směsí řetězců s molekulovou hmotností mezi charakterizovaných opakovanou disacharidovou IIΛ ----- ·' ' peň

N-acetylheparosanu, tvořeného

1500 a 15000 Da, strukturou vzorce se provádějí způsobem, zahrnujícím alespoň jeden srážecí stua iontoměničový chromatografický stupeň. Tento stupeň se s výhodou provede na sloupci Q-Sepharosy nebo na ekvivalentním 'za použití vhodného organického výhodně ethanolu. ve formě soli, sloupci. Srážení se provádí rozpouštědla, zejména alkoholu, způsobu může být N-acetylheparosan formě sodné soli.

Při tomto výhodně ve

Jakožto příklad je možné uvést izolačního a čisticího procesu:

následující výhodné schéma

- stupeň aj

- stupeň bj

- stupeň Cj

- stupeň dj

- stupeň ej srážení ethanolem, dialýza, srážení ethanolem, potom dehydratace a vysušení, čištění iontoměničovou chromatografií a srážení elátu, získaného ve stupni dj, ethanolem, dehydratace, vysušení a mletí.

Pokud jde o stupně aj, bj a Cj, není důležité, v jakém pořadí se tyto stupně provádějí. Jeden ze stupňů a-j nebo Cj může být vypuštěn.

-8CZ 279081 B6

Stupeň e_lz zahrnující srážení ethanolem, není nezbytný. N-Acetylheparosan může být izolován i jinými postupy, například odpařením za vakua eluátu, získaného ve stupni d-^.

Izolace a čištění N-acetylheparosanu za účelem získání kompozice, obsahující 70 až 100 % N-acetylheparosanu, tvořeného směsí řetězců s molekulovou hmotností mezi 1500 a 15000 Da, mohou být rovněž provedeny následujícím způsobem:

- stupeň a'-!.: dialýza,

- stupeň b'^: čištění v kyselém prostředí, odstranění nerozpustných nečistot ve vodných roztocích s pH 3,5 a pH 1,8,

- stupeň c ’-l

- stupeň ď 2.

- stupeň e¹ -j_

- stupeň srážení ethanolem, potom dehydratace a vysušení, alkalická hydrolýza a dialýza, čištění iontoměničovou chromatografií, a čištění exkluzní chromatografií.

Tento způsob izolace je také výhodným provedením způsobu podle vynálezu.

Alkalická hydrolýza se provádí za použití roztoku hydroxidu sodného při teplotě 30 až 80 C.

V případě použití uvedených izolačních a čisticích postupů je možné jako výchozí produkt použít suspenzi, získanou po ukončení kultivace, přičemž v tomto případě je nezbytná předběžná filtrace, nebo produkt, který se ještě podrobí předběžnému čištění, provedenému postupem, který zahrnuje následující stupně:

- stupeň a'^: odstředění suspenze, získané po kultivaci,

- stupeň b^: uvedení supernatantu do styku s alkalickým rozto- kem,

- stupeň c^: předběžná filtrace

- stupeň d-|_: koncentrace na membráně se stanoveným separačním prahem, umožňující rozdělení podle molekulových hmotností,a

- stupeň e-^: dialýza.

Stupeň e-^, zahrnující dialýzu, není nezbytný.

Jako alkalický roztok lze použít 0,1 N roztok hydroxidu sodného .

S výhodou se předběžné čištění získaného produktu provede výše popsaným postupem po ukončení kultivace.

Kultivace kmenů Escherichia coli (K5) a uvedené izolační a čisticí postupy, jakož i výše zmíněné předběžné čištění umožňu-9CZ 279081 B6 jí získat N-acetylheparosanové kompozice, obsahující 70 až 100 % N-acetylheparosanu, tvořeného směsí řetězců s molekulovou hmotností mezi 1500 a 15000 Da, charakterizovaných opakovanou disacharidovou strukturou vzorce II

Ve čištění a kompozice, tvořeného a 15000 Da.

skutečnosti je díky výše předběžného čištění možné obsahující alespoň 80 směsí řetězců s molekulovou popsaným postupům izolace, získat N-acetylheparosanové až 100 % N-acetylheparosanu, hmotností mezi 1500

N-Acetylheparosany, tvořené směsí řetězců. s molekulovou hmotností 1500 až 15000 Da, jsou novými produkty a tvoří rovněž předmět vynálezu.

Oba konce, redukční i neredukční, nových N-acetylheparosanů, získaných výše popsaným způsobem, při kterém je použit kmen Escherichia coli SEBR 3282 nebo jiný vhodný kmen, jak to již bylo zmíněno výše, jsou uronovými jednotkami nebo N-acetylglukosaminem

Ve většině řetězců je neredukční konec tvořen uronovou jednotkou vzorce a:

Případné obohacení získané kompozice N-acetylheparosanem, tvořeným směsí řetězců s molekulovou hmotností 1500 až 15000 Da, majících opakovanou disacharidovou strukturu vzorce II, může být provedeno do různých stupňů a zejména až k dosažení izolace uvedeného N-acetylheparosanu. Toto obohacení se provede použitím klasických postupů frakcionace molekulových hmotností, jakými jsou zejména permeační gelová chromatografie a ultrafiltrace (A. A. Horner, Biochem, J., (1989), 953-958; G. Pyler a kol., J. Biol. Chem. (1988), 263, 11, 5197-5201 a U. Lindahl a kol., J. Biol. Chem., (1984), 259, 20, 12368-12376). Rovněž je možné použít. metodu ethanolové frakcionace (patentová přihláška EP-A-0 287 477). Tato posledně uvedená frakcionační metoda je ze všech případně použitelných metod obzvláště výhodná.

Výše popsané N-acetylheparosany jsou použity jako meziprodukty pro přípravu N,O-sulfátováných heparosanů podle vynálezu,· ale také pro přípravu jiných derivátů. Pro přípravu

-10CZ 279081 B6

N, O-sulfátovaných heparosanů podle -vynálezu známé N-acetylheparosany, jakými

N-acetylheparosany, které všechny jsou popsané zejména tvořené 6, 8 nebo

N-acetylheparosanů tvořených monosacharidových jednotek (Gupta Letters (1983), 16, molekulovou hmotností, postupů, které molekulovou použití s nízkou lze také použít jiné N-acetylheparosany, jakými jsou například tvořené hlavně polysacharidovými řetězci, mají stejný počet disacharidových jednotek, které v patentové přihlášce EP-A-0 333 243 a které jsou tvořené 6, 8 nebo 10 cukernými jednotkami, frakce řetězci obsahujícími průměrně 10 a kol. FEMS Microbiology nebo N-acetylheparosany s -vysokou mohou být potom depolymerovány za používají pro přípravu heparinů

13-17) které se hmotností.

Ve skutečnosti mohou být N,O-sulfátované heparosany podle vynálezu připraveny dalšími postupy ze známého polysacharidu (K5), majícího vysokou molekulovou hmotnost. V tomto případě je nezbytné zařadit depolymerační stupeň.

Tato depolymerace může být provedena před deacetylací N-acetylheparosanu s vysokou molekulovou hmotností, po této deacetylací, po N-sulfataci nebo také po N,O-sulfataci.

Jak již bylo dříve zmíněno, může být depolymerace provedena postupy, které jsou v odborné literatuře popsané pro přípravu heparinů s nízkou molekulovou hmotností, například depolymerací jodistanem, volnými radikály, beta-eliminací nebo působením kyseliny dusité (patentové přihlášky nebo patenty EP-0 040 144, EP-0 037 319, EP-0 121 067). Tyto metody jsou zde uvedené pouze jako příklady použitelných metod a tento výčet tedy nemá omezující účinek. Za tímto účelem je možné použít libovolnou jinou metodu depolymerace glukosaminoglykanů.

Když se N,O-sulfátované heparosany připraví depolymerací z N-acetylheparosanu s vysokou molekulovou hmotností (předběžně deacetylovaného a případně N-sulfátováného) jeho vystavením účinku-kyseliny dusité, může mít redukční jednotka N,O-sulfátovaných heparosanů podle vynálezu 2,5-anhydromannostrukturu a zejména strukturu 2,5-anhydromannosy. Depolymerace účinkem kyseliny dusité může být provedena po stupni N-deacetylace nebo N-sulfatace. V případě, že tento stupeň je následován oxidací nebo redukcí, potom se získají N,O-sulfátované heparosany, mající redukční jednotku tvořenou strukturou kyseliny 2,5-anhydro-D-mannonové nebo 1,5-anhydro-D-mannitem.

Parciální deacetylace kompozic, obsahujících 70 až 100 % N-acetylheparosanu, která vede k získání kompozic, obsahujících 70 až 100 % a dokonce 80 až 100 % heparosanů, tvořeného směsí řetězců s molekulovou hmotností 1500 až 15000 Da, charakterizovaných opakovanou disacharidovou strukturou vzorce III, který byl uveden výše, se provádí působením deacetylačního činidla.

Jakožto deacetylační činidla lze zmínit sulfid fosforečný, triethoxyoxoniumflueboritan, hydroxid sodný nebo hydrazin, přičemž dvě posledně uvedená činidla jsou obzvláště výhodná. Rovněž je možné použít silné minerální kyseliny, jakými jsou kyselina chlorovodíková, kyselina sírová a podobně. Doba trvání této reakce bude záviset na zvolených reakčních podmínkách a zejména na teplotě a koncentraci deacetylačního činidla v reakční směsi.

-11CZ 279081 B6

Obohacení heparosanové kompozice heparosanem, tvořeným řetězci nebo směsí řetězců s molekulovou hmotností 1500 až 15000 Da, charakterizovaných opakovanou disacharidovou strukturou vzorce III, se provádí použitím klasických postupů frakcionacé molekulových hmotností, které již byly zmíněné výše (permeační gelová chromatografie, ultrafiltrace a ethanolová frakcionacé). V tomto případě se získají kompozice, obsahující 90 až 100 % hmotnosti heparosanu, tvořeného směsí molekulových hmotností mezi 1500 a 15000 Da, majících opakovanou disacharidovou strukturu vzorce III.

Pro přípravu heparosanu, tvořeného směsí řetězců s molekulovou hmotností 1500 až 15000 Da, je rovněž možné použít N-acetylheparosany s vysokou molekulovou hmotností. Získané heparosany s vysokou molekulovou hmotností mohou být po deacetylaci depolymerovány postupy, které již byly popsané pro přípravu heparinů s nízkou molekulovou hmotností a které již byly zmíněny výše. Depolymerační produkty mohou být potom podrobeny frakcionaci za účelem získání výhodných heparosanů podle vynálezu.

Heparosany, tvořené směsí řetězců s molekulovou hmotností 1500 až 15000 Da, charakterizovaných opakovanou disacharidovou strukturou vzorce III:

(lil) ve kterém R'znamená v 0 až 80 % disacharidových jednotek acetylovou skupinu a ve zbývajících disacharidových jednotkách atom vodíku, jsou novými produkty a vzhledem k tomu jsou rovněž předmětem vynálezu.

Výhodnými heparosany podle vynálezu jsou heparosany, tvořené směsí řetězců s molekulovou hmotností 1500 až 15000 Da, charakterizovaných opakovanou disacharidovou strukturou vzorce III, ve kterém je acetylová skupina (R¹) přítomna v míře nižší nebo rovné 60 %.

Heparosanové kompozice, které obsahují alespoň 70 % hmotnosti výše popsaného heparosanu, tvoří rovněž podstatu vynálezu. Tyto heparosany a heparosanové kompozice jsou rovněž meziprodukty, použitelnými pro přípravu N, 0-sulfátováných heparosanů podle vynálezu, ale mohou být rovněž použity pro přípravu jiných produktů, například produktů, které se následně epimerují v úrovni jednotky kyseliny D-glukuronové.

Před stupněm parciální N,O-sulfatace mohou být heparosany převedeny na sůl s organickou bází nebo na kvartérní amoniovou sůl. Za účelem získání kvartérní amoniové soli uvedených heparosanů se s výhodou použije tetrabutylamonium.

-12CZ 279081 B6

Stupeň parciální N,O-sulfatace, realizovaný postupem, popsaným ve francouzském patentu 2 584 728 ze dne 10. 11. 1987 (odpovídajícím patentové přihlášce FR-85.10787) , se provádí v aprotickém polárním rozpouštědle, jakým je dimethylformamid, dimethylsulfoxid, hexamethylfosforamid nebo acetonitril nebo libovolná směs těchto rozpouštědel, pomocí například komplexu oxidu sírového (S0₃) s organickou bází, jako je trimethylamin nebo pyridin. Tato parciální N,O-sulfatace muže být rovněž provedena roztokem kyseliny chlorsulfonové v pyridinu. S výhodou se používá komplex oxidu sírového s pyridinem.

Rovněž je možné použít i další sulfatační činidla, zejména ta sulfatační činidla, která jsou popsána E. E. Gilbertem v Chemical Rewiew (1962, 62, 549-589. N,O-sulfatační reakce se obecně provádí při teplotě 0 až 100 C, výhodně při teplotě 10 až 50 C, po dobu 6 až 14 hodin.

Při způsobu přípravy se po ukončení částečné N,O-sulfatační reakce, N,O-sulfátovaná heparosanová kompozice, obsahující 70 až 100 % N,O-sulfátovaného heparosanu podle vynálezu, -vysráží přidáním chloridu sodného až k dosažení 0,33M roztoku chloridu sodného a potom přidáním adekvátního množství ethanolu. Vyloučená sraženina se vyjme 0,5M roztokem chloridu sodného. Tento roztok se potom neutralizuje. Po přidání adekvátního množství ethanolu se vyloučená sraženina izoluje, vyjme ultra-čistou vodou, dialyzuje proti této vodě, lyofilizuje a vysuší.

Jak N,O-sulfatační stupeň, tak i stupně čištění kompozice N,O-sulfátovaného heparosanu, popsané v předcházejícím odstavci, mohou být opakovány jednou nebo několikrát. Uvedený způsob čištění je pouze příkladem použitelného čisticího postupu, který nevylučuje použití ekvivalentních čisticích postupů.

Po tomto N,O-sulfatačním stupni s výhodou následuje stupeň celkové N-sulfatace, který se obecně realizuje ve vodném rozpouštědle, výhodně při alkalickém pH, působením sulfatačního činidla, jakým- je komplex oxidu sírového s organickou bází, například s trimethylaminem.

se N,O-sulfátovaná sodného až Vyloučená roztokem chloridu sodného, vysráží vodou, dialyzuje proti celkové N-sulfatace vysráží přidáním chloridu chloridu sodného a ethanolu.

0,5M ultra-čisté

Po ukončení stupně heparosanová kompozice k získání 0,5M roztoku sraženina se potom vyjme ethanolem, vyjme ultra-čistou vodě, lyofilizuje a vysuší.

Obohacení kompozice N,O-sulfátovaným heparosanem postupů frakcionace molekulových hmotností, ny výše. Je výhodné provést toto obohacení.

N, O-sulfátovaného se provádí použitím které již heparosanu klasických byly zrní něN,O-sulfátované heparosany podle vynálezu a kompozice N,O-sulfátovaného heparosanu, obsahující alespoň 70 % nového N,O-sulfátováného heparosanu podle vynálezu se -výhodně získají způsobem, zahrnujícím finální N-sulfatační reakci. E tedy v opakovaných strukturách vzorce I znamená acetylovou skupinu a sulfátovou skupinu.

-13CZ 279081 B6

Rovněž je možné získat N, O-sulfátované heparosany podle vynálezu tak, že se nejdříve provede N-sulfatace, po které následuje O-sulfatace. Tato varianta způsobu podle vynálezu představuje výhodnou variantu.

N-Sulfatace se provede pomocí komplexu oxidu sírového s organickou bází, jakou je trimethylamin, triethylamin nebo pyridin. N-sulfatace může být rovněž provedena roztokem kyseliny chlorsulfonové v pyridinu. S výhodou se použije komplex oxidu sírového s trimethylaminem a N-sulfatační reakce se provádí při teplotě 20 až 80 C ve vodném alkalickém prostředí. Po ukončení N-sulfatační reakce se takto získaný produkt vysráží přidáním adekvátního množství ethanolu. Vyloučená sraženina se vyjme ultra-čistou vodou, dialyzuje proti této vodě, lyofilizuje a vysuší. Tento čisticí postup je zde uveden pouze jako příklad použitelného čisticího postupu, který nevylučuje použití jiných ekvivalentních čisticích postupů. Čisticí stupně mohou být opakovány několikrát.

V rámci způsobu podle vynálezu se N-sulfátovaný heparosan před O-sulfatací s výhodou převede na sůl s organickou bází, nebo na kvartérní amoniovou sůl. Za účelem získání kvartérní amoniové soli se s výhodou použije tetrabutylamonium.

O-sulfatační reakce se provádí ve formaldehydu nebo v jiném chemicky ekvivalentním rozpouštědle pomocí například komplexu oxidu sírového s organickou bází, jakou je trimethylamin, triethylamin nebo pyridin. S výhodou se použije komplex oxidu sírového s pyridinem. O-Sulfatační reakce se obecně provádí při teplotě 10 až 50 C.

N, O-sulfátováný heparosan se potom vysráží tím, že se k reakční směsi přidá chlorid sodný až k získání 0,33M roztoku chloridu sodného a potom adekvátní množství ethanolu, stejně jako v případě N,O-sulfatace. Potom se provede čištění kompozice N,O-sulfátovaného heparosanu. Jednotlivé čisticí stupně již byly detailně popsány v předcházejícím textu (srážení ethanolem, dialýza atd.).

N,O-Sulfátovaný heparosan podle vynálezu s výhodou obsahuje alespoň 90 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností nižší než 11000 Da. Je zjištěno, že tento N,O-sulfátováný heparosan obsahuje méně než 0,2 mol/mg aminové skupiny (NH₂).

Acetylová skupina je výhodně přítomna v míře nižší nebo rovné 60 %, přičemž stupeň sulfatace, vyjádřený jako poměr sulfát/karboxyl leží v rozmezí od 1,5 do 3,0.

Výhodnými produkty podle vynálezu jsou N,O-sulfátované heparosany, tvořené řetězci, majícími střední molekulovou hmotnost asi 4 000 až 7 000 Da a stupeň sulfatace, vyjádřený jako poměr sulfát/karboxyl, rovný 1,7 až 3, jakož i N,O-sulfátované heparosany, N-deacetylované z asi 80 % (množství přítomné acetylové skupiny je rovno asi 20 %) a tvořené alespoň 70 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností 5 000 až 7 000 Da a mající stupeň sulfatace rovný 1,8 až 2,5, nebo také N,O-sulfátované heparosany, tvořené alespoň 70 % hmotnosti řetězců s molekulovými hmotnostmi 10 000 až 12 000 Da, N-deacetylované z asi 80 % (množství přítom

-14CZ 279081 B6 né acetylové skupiny je rovné asi 20 %) a mající stupeň sulfatace rovný 1,8 až 2,5, nebo konečně Ν,Ο-sulfátované heparosany, N-deacylované ze 40 % (množství přítomné acetylové skupiny je rovné asi 60 %) a tvořené alespoň 70 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností 6 000 až 8 000 Da a majícími stupeň sulfatace 2,0 až 2,8.

Výhodnými N,O-sulfátovanými heparosany podle vynálezu jsou zejména:

- N,O-sulfátové heparosany, N-deacetylované z asi 80 % (množství přítomné acetylové skupiny je rovno asi 20 %) , které jsou tvořené alespoň 80 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností 2 300 až 7 200 Da a které mají stupeň sulfatace 1,8 až 2,5.

- Ν,Ο-sulfátované heparosany, N-deacetylované z asi 80 % (množství přítomné acetylové skupiny je rovno asi 20 %) , které jsou tvořené alespoň 80 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností

300 až 7 700 Da a které mají stupeň sulfatace 1,8 až 2,5,

- Ν,Ο-sulfátované heparosany, N-deacetylované z asi 80 % (množství přítomné acetylové skupiny je rovno asi 20 %) , které jsou tvořené alespoň 70 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností 6 900 až 13 500 Da a které mají stupeň sulfatace 1,8 až 2,5, a

- Ν,Ο-sulfátované heparosany, N,deacetylované z asi 40 % (množství přítomné acetylové skupiny je rovno asi 60 %), které jsou tvořené alespoň 80 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností

000 až 10 300 Da a které mají stupeň sulfatace 2,0 až 2,8.

Pod pojmem soli Ν,Ο-sulfátovaných heparosanů se rozumí všechny farmaceuticky přijatelné soli. Tyto soli se získají klasickými postupy, které jsou zejména popsány pro přípravu solí heparinu (patent US 4.168.377).

Výše uvedený způsob získání Ν,Ο-sulfátovaných heparosanů, jakož i uvedené čisticí postupy umožňují získání Ν,Ο-sulfátovaných heparosanů ve formě sodné soli. Z těchto solí mohou být zase použitím metod pro přípravu různých solí heparinu nebo heparinu, který není ve formě soli (L'héparine, fabrication, structure, propriétés, analyses, J. P. Duclos, (1984), str. 81-83, Masson Ed, Francie) získány další soli Ν,Ο-sulfátovaných heparosanů nebo Ν,Ο-sulfátované heparosany, které nejsou ve formě solí.

N, Ο-Sulfátované heparosany podle -vynálezu mají zajímavé farmakologické a biochemické vlastnosti, přičemž tyto vlastnosti jsou v překvapivém rozporu s tím, co bylo dosud tvrzeno v rámci dosavadního stavu techniky.

Zejména na rozdíl od sulfátovaných produktů antigenu K5, popsaných v patentu EP-A-0 333 243, které mají antiangiogenní a protinádorovou účinnost s příznivým poměrem těchto účinností vzhledem k antikoagulačním vlastnostem, mají Ν,Ο-sulfátované heparosany podle vynálezu dobrou regulační účinnost krevní koagulace. Tato účinnost je vyšší než stejná účinnost dermatansulfátu vzhledem k různým parametrům koagulace a může být spíše srovnána s účinností heparinu.

-15CZ 279081 Ββ

Inhibiční účinnost .vůči faktoru Ha a stimulující účinnost vůči antitrombinu III (ATIII) a heparinovému kofaktoru II (HCII) representativních produktů podle vynálezu byly stanoveny metodami, popsanými D. Dupouy-em a kol. v Thrombosis a Haemostasis, (1988), 60, 2, 236-239 pro heparinový kofaktor II a M. L. Larsenem a kol. v Thrombosis Research, (1978), 13, 2, 285-288 pro antitrombin.

V obou případech test spočívá v tom, že se měří in vitro inhibiční účinek studovaného produktu na přečištěný trombin (faktor Ha) v přítomnosti HCII nebo ATIII (přečištěný), přičemž se stanovuje amidolytická účinnost trombinu vůči chromogennímu substrátu. Vzhledem k tomu, že dermatansulfát, připravený postupem, popsaným H. W. Stuhlsatzem a kol. v The Methodology of connective Tissue Research (1976) '137-146, má nej silnější stimulační účinnost na ihnibiční účinek HCII vůči faktoru Ha, je tento dermatansulfát použit jako referenční produkt při měření této účinnosti, přičemž výsledek testu je vyjádřen v mg dermatansulfátu (DS), ekvivalentních účinnosti 1 mg studovaného produktu (mg DE ekviv./mg).

Anti-Xa-účinnost (Yin-Wesslerův titr) uvedených reprezentativních produktů podle vynálezu byl měřen metodou, popsanou E. T. Yin-em a kol. v J. Lab. Clin. Med. (1973), 81, 2, 298-310, zatímco jejich globální antikoagulační účinnosti byla měřena testem APTT, popsaným R. R. Proctor a kol. v Am. J. Clint. Path (1961), 36, 212-219.

U všech testovaných produktů byla stanovena anti-IIa-HCIIdependentní účinnost vyšší než účinnost stejného typu, vykazovaná dermatansulfátem. Anti-IIa-ATIII-dependentní účinnost a Yin-Wesslerův titr testovaných produktů jsou sice nižší než odpovídající charakteristiky heparinů, avšak vyšší než stejné charakteristiky dermatansulfátu. Jejich APTT-titr je asi 2- až 20-krát vyšší než APTT-titr dermatansulfátu a může činit až 60 % APTT-titru heparinů.

N,O-Sulfátované heparosany podle vynálezu mají tedy velmi zajímavou specifičnost účinku a antikoagulační účinnost. Nízká molekulová hmotnost těchto produktů jim jinak dává také velmi zajímavé farmakokinetické vlastnosti.

N,O-sulfátované heparosany podle vynálezu jsou velmi málo toxické; jejich toxicita je dokonale slučitelná s jejich použitím ve funkci léčiv.

Předmětem vynálezu jsou tedy i farmaceutické kompozice, které jako účinnou látku obsahují N,O-sulfátované heparosany podle vynálezu, některou z jejich solí nebo kompozici N,O-sulfátovaného heparosanu, obsahující alespoň 70 % tohoto N,0-sulfátovaného heparosanu nebo některé z jeho solí v kombinaci s jedním nebo několika farmaceuticky vhodnými vehikuly.

Tyto farmaceutické kompozice jsou zejména použitelné pro preventivní nebo symptomatické léčení poruch vaskulární stěny, jakými jsou ateroskleróza a arterioskleróza, jakož i hyperkoagulační stavy, pozorovatelné například po chirurgických zákrocích, nádorového růstu nebo anomálií krevní srážlivosti, indukovanými

-16CZ 279081 B6 bakteriálními, virovými nebo enzymatickými aktivátory.

Dávkování těchto produktů se bude v široké míře měnit v závislosti na věku, hmotnosti a zdravotním stavu pacienta, na druhu a závažnosti léčeného onemocnění nebo stavu a na způsobu podání.

Toto dávkování zahrnuje mg až 1 g denně, s výhodou asi 200 mg denně, intravenózní nebo toto podání je diskontinuální nebo intervalech, nebo podání jedné denní podání jedné nebo několika dávek asi asi 5 mg až 500 mg denně, například perorální cestou.

subkutánní cestou, přičemž se provádí v pravidelných dávky asi 200 až 1 000 mg

Tyto dávky mohou být samozřejmě upraveny pro každého pacienta v závislosti na pozorovaných výsledcích a dříve provedených krevních analýzách.

V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí konkrétních příkladů jeho provedení, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, která je jednoznačně vymezen formulací patentových nároků.

Příklady provedení vynálezu

N-Acetylheparosany

Příklad 1

Příprava N-acetylheparosanu, majícího převážně nízkou molekulovou hmotnost (způsob I)

1) Kultivace bakteriálního kmene Escherichia coli (K5) a separace filtrátu, obsahujícího N-acetylheparosan

400 ml kultivačního prostředí B, jehož složení je přesně uvedeno v následující tabulce I, se naočkuje kmenem Escherichia coli SEBR 3282 (uloženého u CNCM Pasteurova ústavu v Paříži pod depozitním číslem 1-1013) a inkubuje po dobu 2 hodin při teplotě 37 C.

Získaná předkultura se potom převede do fermentoru o obsahu 18,5 litrů, obsahujícího 11 litrů kultivačního prostředí A, jehož složení je přesně uvedeno v následující tabulce I, a kultivační směs se inkubuje po dobu 4 hodin při teplotě 3 7 C a pH rovném 7,4, přičemž se udržuje parciální tlak kyslíku 5,32 kPa regulací vhánění kyslíku (až 20 1/min) a míchání. Potom se přidá glukóza kontinuálním přiváděním sterilního roztoku, obsahujícího 600 g/1 glukózy, v množství 250 ml/h po dobu 8 hodin.

Po zastavení přívodu glukózy se v kultivaci pokračuje za stejné teploty, stejné hodnoty pH a stejného parciálního tlaku kyslíku po dobu 10 hodin. Sledování DO (vlnová délka 600 nm) kultivačního prostředí umožňuje určit, že v průběhu posledních 12

-17CZ 279081 B6 hodin kultivace nedochází k nárůstu biomasy.

Kultivační břečka se ochladí na teplotu 25 C, načež se zfiltruje přes membránu s velikostí pórů 0,22 mikrometrů. Tímto způsobem se získá asi 12 1 filtrátu, obsahujícího N-acetylheparosan.

Tabulka I

Složení a příprava kultivačních prostředí A a B

Kultivační prostředí A

Kultivační prostředí A se připraví slitím tří dále uvedených sterilních roztoků:

Roztok č. 1

V 700 ml ultračisté vody se rozpustí v následujícím pořadí:

komplexotvorné činidlo: Ν'-/tris-(hydroxymethyl(methylglycin (Tricine komerčně do-

stupný u firmy Fluka) FeSO₄.7H₂O	360 280	mg mg
CaCl₂.2H₂O	6,7	mg
MgCl₂.6H₂O	1270	mg
k₂so₄	500	mg
KC1	5 000	mg
kaseinový hydrolyzát (hlavní zdroj amino-
kyselin) HY CASE SF (komerčně dostupný
u firmy Sheffield)	25 000	mg
kvasničný extrakt (komerčně dostupný
u firmy Difco)	18 000	mg
roztok oligo-prvků (viz následující
tabulka II)	1	ml

přísada proti tvorbě pěny Struktol J673 (komerčně dostupná u firmy Schil a Seilacher) v množství několika kapek, uvolněných Pasteurovou pipetou. Hodnota pH tohoto roztoku se nastaví na 7,4 roztokem hydroxidu draselného (d = 1,38) a roztok se doplní na objem 850 ml ultračistou vodou, načež se přechovává v autoklávu po dobu 45 minut při teplotě 120 C.

Roztok č. 2

V asi 40 ml ultračisté vody se rozpustí 5 g K₂HPO₄, načež se objem získaného roztoku upraví stejným rozpouštědlem na objem 50 ml. Získaný roztok se potom zfiltruje přes filtr s velikostí pórů 0,2 mikrometrů.

-18CZ 279081 B6

Roztok č. 3

V adekvátním množství ultračisté vody se rozpustí 20,7 g glukózy a objem získaného roztoku se upraví na 100 ml stejným rozpouštědlem. Roztok se potom přechovává v autoklávu po dobu 30 minut při teplotě 110 C.

Kultivační prostředí B

Příprava kultivačního prostředí B je stejná jako příprava kultivačního prostředí A s výjimkou, spočívající v tom, že se po přidání přísady proti tvorbě pěny navíc přidá pufr pH =7,2 (kyselina 3-morfolinopropansulfonová) v množství 20 g.

Tabulka II

Příprava roztoku oligo-prvků, použitého při přípravě kultivačních prostředí A a B

V 800 ml ultračisté vody se rozpustí v následujícím pořadí:

H3BO3	500 mg
Na₂Mo0₄.2H₂O	1 930 mg
CoC1₂.6H₂O	11 850 mg
CuSO₄.5H₂O	25 mg
ZnSO₄.7H₂O	2 000 mg
Aici₃.6H₂O	2 410 mg.
Potom se přidá 100 ml kyseliny chlorovodíkové,	mající hustotu

1,19 a- objem roztoku se doplní ultračistou vodou na finální objem 1 000 ml.

2) Izolace a čištění N-acetylheparosanu, majícího převážně nízkou molekulovou hmotnost

Stupeň a - Etanolové srážení

K filtrátu se přidá asi 48 1 ethanolu (95 % hmot./hmot.) , směs se ponechá vysrážet a sraženina usadit při teplotě 4 C po dobu 8 hodin. Supernatant se oddělí nejdříve odsátím a potom odstředěním, načež se centrifugační koláč vyjme asi 1 1 ultračisté vody.

Stupeň b - Dialýza

Roztok, získaný v předcházejícím stupni, zavedený do trubice NOJAX 40, obsahující membránu na bázi celulózy s velikostí pórů 2,4 nm, se dialyzuje po dobu 24 hodin proti ultračisté vodě (1 objem roztoku/6 objemů vody, obnovovaných po 2 hodinách, 8 hodi

-19CZ 279081 B6 nách a 16 hodinách). Tato operace umožňuje odstranit malé molekuly, přítomné v kultivačním prostředí, jakými jsou soli, cukry, aminokyseliny, oligonukleotidy a oligopeptidy.

Stupeň c - Srážení, dehydratace a sušení

K 1 objemu dialyzovaného roztoku se přidá 0,5 M chloridu sodného a 4 objemy ethanolu. Sraženina se ponechá vyloučit po dobu 5 minut při okolní teplotě. Směs se potom odstřeďuje při 5 000 g po dobu 20 minut. Centrifugační koláč se vyjme ethanolem, získaná suspenze se rozmíchá, načež se ponechá usadit v průběhu jedné hodiny při okolní teplotě. Odstředění a resuspendování centrifugačního koláče se zopakuje. Potom se směs odstřeďuje při 5 000 g po dobu 20 minut. Centrifugační koláč se vysuší za vakua v sušárně při teplotě 40 C po dobu 24 hodin.

Stupeň d - Rozemletí na prášek

Vysušené centrifugační koláče se rozetřou na prášek v třecí misce za bezvodých podmínek.

Stupeň e - Aniontoměničová chromatografie

Rozetřené centrifugační koláče se jako pufr D (Tris-HCl 20mM, pH 100 ml/g. Získaný roztok se potom silného antiontoměniče, zahrnujícího nou kvartérními amoniovými skupinami firmy Pharmacia) , stavu s pufrem D, v promyje dostatečným množstvím pufru D základní linii 25 nM roztokem piperazinu, jehož pH bylo eluční činidlo se použije roztok NaCl a 25 mM piperazinu. Eluát chloridu sodného.

vyjmou v pufru, označeném 75), použitém v množství chromatografuje na sloupci agarovou matrici, zesíúova(Q-Sepharose fast flow od který byl předběžně uveden do rovnovážného množství 50 ml gelu na 1 g prášku. Gel se za účelem návratu na detekce ultrafialovým světlem při 214 nm a potom piperazinu, jehož pH bylo nastaveno na 3,5. Jako s pH 3,5, mající složení: 0,5 M se potom neutralizuje 5N roztokem

Stupeň f - Srážení, dehydratace, sušení, rozdrcení

Opakuje se postup, který byl popsán výše pro stupně c a d, avšak bez přidání chloridu sodného.

N-Acetylheparosan, získaný na výstupu ze stupně f, je označen jako šarže A.

Alternativní varianta čisticího procesu spočívá v tom, že se postupně provedou stupně a, c, b, d, e a f. Takto získaný N-acetylheparosan je označen jako šarže B.

3) Charakterizace N-acetylheparosanu, získaného na výstupu z různých stupňů čištění

Nukleární magnetickorezonanční spektrum (NMR)

Ί O

Protonové a C-nukleární magnetickorezonanční spektrum jsou srovnána s odpovídajícími spektry N-acetylheparosanu, popsanými

-20CZ 279081 B6

W.E. Vann-em (Eur. J. Biochem., (1981), 116, 59-364).

Studium spekter, získaných pro šarži A a šarži B N-acetylheparosanu, potvrzuje chemickou totožnost získaného produktu s N-acetylheparosanem, popsaným W. F. Vann-em. Jedná se o polymerní řetězce, tvořené opakovanými beta-D-glukuronyl-1,4-alfa-N-acetyl-D-glukosaminyl-(1,4)-ovými strukturami .

Stanovení rozdělení molekulových hmotností distribuční chromatografií

Rozdělení molekulových hmotností se stanoví vysokotlakou distribuční kapalinovou chromatografií za následujících podmínek:

- sloupec, tvořený kuličkami silikagelu s průměrem 10 m a pórozitou 25 nm,

- eluční činidlo: 0,5M vodný roztok síranu sodného,

- průtok: 1 ml/min,

- detekce ultrafialovým světlem o vlnové délce 205 nm,

- kalibrace se provádí pomocí řady oligosacharidů, odvozených od heparinu, majících následující molekulové hmotnosti: 1324, 1883, 2436, 3411, 3996, 4535, 4995, 5365, 6150, 6671, 7542,

8655, 10088, 11561, 12950, 14809, 17387 a 22674 Da.

Vzhledem k této kalibrační řadě jsou vzaty v úvahu pouze molekulové hmotnosti mezi 934 Da a 56 703 Da. Připouští se, že detekovaná optická hustota je úměrná množství N-acetylheparosanu. Nicméně přesnost metody exponenciálně klesá směrem k vysokým molekulovým hmotnostem, zejména v případě molekulových hmotností vyšších než 20000 Da.

Eluční profil distribuční chromatografie šarže A je znázorněn na připojeném obrázku 1. Z obrázku 1 je zřejmé, že jde o polydisperzní distribuci, přičemž maximální pík se nachází v blízkosti molekulové hmotnosti 4 700 Da. Hmotnostní frakce alespoň rovná 70 % šarže A má molekulovou hmotnost v rozmezí od 1 700 do 8 000 Da.

Velmi obdobný chromatogram se získá při distribuční chromatograf ii šarže B. Majoritní pík se v tomto případě nachází v blízkosti molekulové hmotnosti 5 000 Da. Hmotností frakce alespoň rovná 70 % šarže B má molekulovou hmotnost v rozmezí od 1 500 do 8 000 Da.

Studium rozdělení molekulových hmotností elektroforézou na polyakrylamidovém gelu

Analyzované vzorky a činidlo, značkující koncovou linii migrace, obsahující bromfenolovou modř, se podrobí elektroforéze v Tris-boritanovém pufru na 15% polyakrylamidovém gelu, získaném polymerací směsi akrylamidu a N,Ν'-methylen-bis-akrylamidu v poměru 29/1. Migrace se provádí při 40 mA po dobu asi 4 hodin na gelu dlouhém 18 cm, kdy se činidlo, značkující koncovou linii migrace, dostane na konec gelu. Gel se potom vybarví alcianovou modří a potom stříbrem technikou popsanou S. Pelkonen-em a kol. v J. Bact. , (1983), 170, 6, 2646, a specifickou pro kyselé polysacharidy.

-21CZ 279081 Ββ

Této elektroforéze byl podroben částečně přečištěný produkt, získaný na výstupu stupně a vyčištěný produkt, tvořený šarží A nebo šarží B a získaný na výstupu z finálního čisticího stupně, za účelem zjištění, zda v průběhu čištění nedochází k výrazné modifikaci rozdělení molekulových hmotností N-acetylheparosanu.

Porovnáním profilů, získaných pro částečně vyčištěný produkt a na produkt z finálního čisticího stupně (šarže A nebo šarže B), lze dospět k závěru, že v průběhu čištění nedochází k výrazným změnám v rozdělení molekulových hmotností (ve stejných migračních vzdálenostech jsou přítomny pásy srovnatelné intenzity) N-acetylheparosanu.

Stanovení uronovvch kyselin

Množství uronové kyseliny v jednotce hmotnosti vyčištěného produktu (šarže A nebo šarže B), získaného na výstupu z finálního stupně, bylo stanoveno kilorimetricky metodou, popsanou T.Bitter-em v Analytical Biochemistry (1962), 4, 330-334. Tento způsob stanovení je založen na reakci glykosaminoglykanů s karbazolem v kyselém prostředí za tepla, při které dochází k růžovému zbarvení, které je přímo úměrné množství uvolněné kyseliny uronové.

Pokud jde o šarži A, byla pro částečně vyčištěný produkt, získaný na výstupu stupně d, a pro vyčištěný produkt, získaný na výstupu z finálního stupně f, stanovena množství kyseliny uronové 1,3, resp. 2,1 mol/mg.

Pokud jde o šarži B, bylo pro vyčištěný produkt, získaný na výstupu z finálního stupně, stanoveno množství kyseliny uronové 2,1 mol/mg.

Spektrofotometrie v ultrafialové oblasti a ve viditelné oblasti světla

Vyčištěný produkt (šarže A) se rozpustí v ultračisté vodě a získaný roztok (c = 1 mg/ml) se nalije do kyvety s 1 cm optickou dráhou. Zaznamená se absorpční spektrum roztoku v rozmezí vlnových délek 200 až 600 nm.

Ze získaného spektra lze učinit závěr, a to zejména na bázi absorpce v oblasti vlnové délky 256 nm, že šarže A obsahuje méně než 1 % ADN.

Stanovení celkového množství proteinů

Za účelem stanovení celkového množství proteinů se použije souprava protein assay, která je komerčně dostupná u firmy Biorad. Tento způsob stanovení je založen na skutečnosti, spočívající v tom, že vlnová délka. maximální absorbance kyselého roztoku brilantní modři Coomassige g-250 se posune z 465 nm na 595 nm v případě, kdy se na ní váží proteiny (Reisner a kol., Anal Biochem, (1975), 64, 509).

Celkový obsah proteinů v šarži A je nižší než 1,5 %.

-22CZ 279081 B6

Stanovení volných aminových skupin

Toto stanovení bylo provedeno metodou, popsanou autory Zensaku Yosizawa a kol. v Biochemica et Biophysica Acta (1967), 141, 358-365.

Obsah aminových skupin (vyjádřený v mol/mg) je ukazatelem množství deacetylovaných beta-D-glukuronyl-l,4-alfa-N-acetyl-Dglukosaminyl-(1,4)ových jednotek a nečistot, které obsahují volnou aminovou skupinu.

Jak šarže A, tak i šarže B obsahuje aminové skupiny v množství 0,05 mol/mg. Poměr NH₂/kyselina glukuronová (0,05/2,1) je nižší než 2,5%. Připadá tedy (v molech) na 100 beta-D-glukuronyl-1,4-alfa-N-acetyl-glukosaminyl-(1,4)-ových jednotek méně než 2,5 deacetylované jednotky tohoto typu.

Příklad 2

Příprava N-acetylheparosanu, majícího převážně nízkou molekulovou hmotnost (způsob II)

Kultivace kmene Escherichia coli SEBR 3282 a separace filtrátu obsahujícího N-acetylheparosan byly provedeny způsobem popsaným v příkladu 1.

Stupeň a - Dialýza

375 ml filtrátu se podrobí dialýze, provedené způsobem, popsaným v příkladu 1/2) Izolace a čištění N-acetylheparosanu, majícího převážně nízkou molekulovou hmotnost, Stupeň b/. Po dialýze se získá asi 1 020 ml vyčištěného roztoku.

Stupeň b - Čištění v kyselém prostředí

K dialyzovanému roztoku se přidá adekvátní množství 5N roztoku kyseliny chlorovodíkové za účelem nastavení hodnoty pH 3,5. Vyloučená sraženina se oddělí odstředěním, načež se supernatant okyselí stejnou kyselinou (5N HC1) za účelem nastavení pH na hodnotu 1,8. Může se vytvořit sraženina, která se odstraní odstředěním. Supernatant se potom zneutralizuje 5N roztokem hydroxidu sodného.

Stupeň c - Srážení, dehydratace a sušení

K neutralizovanému roztoku se přidá adekvátní množství chlo

-23CZ 279081 B6 ridu sodného za účelem získání 0,5M roztoku chloridu sodného, načež se přidají 4 objemy ethanolu. Po dobu 5 minut se ponechá vyloučit sraženina při okolní teplotě. Směs se potom odstřeďuje při 5 000 g po dobu 20 minut. Centrifugační koláč se vyjme ethanolem a získaná směs se rozmíchá za vzniku homogenní suspenze, která se potom nechá v průběhu jedné hodiny při okolní teplotě usadit. Odstředění a suspendování se zopakuje. Směs se potom znovu odstřeďuje při 5 000 g po dobu 20 minut. Získaný centrifugační koláč se vysuší v sušárně za vakua při teplotě 40 C po dobu 24 hodin.

Stupeň d - Alkalická hydrolýza a dialýza

Produkt, získaný v předcházejícím stupni po' vysušení, se rozpustí v 0,25N roztoku hydroxidu sodného v takovém množství, aby byl získán 2,5 % (hmot./obj.) roztok. Takto získaný roztok se potom udržuje na teplotě 50 C po donu 2 hodin. Roztok se potom neutralizuje použitím 5N roztoku kyseliny chlorovodíkové a roztok, obsahující polysacharid, se potom dialyzuje postupem, popsaným v příklad 1/2) Izolace a čištění N-acetylheparosanu, majícího převážně nízkou molekulovou hmotnost, Stupeň b/.

Po dialýze se získá asi 990 ml roztoku.

Stupeň e - Chromatografie na aniontměniči

K dialyzovanému roztoku se přidají adekvátní množství piperazinu, EDTA a tritonu X-100 (Prolabo) za účelem získání těchto koncentrací uvedených látek: 25 mM piperazinu, 2 nM EDTA a 0,2 % (obj./obj.) tritonu X-100. pH se potom nastaví na hodnotu 3,5 pomocí 5N roztoku kyseliny chlorovodíkové. Tento roztok se potom zavede na sloupec iontoměničové pryskyřice Q-Sepharose Fast Flow (400 ml) , který byl uveden do rovnováhy s piperazinovým pufrem, obsahujícím 25 mM piperazinu, 2 mM EDTA a 0,2 mM tritonu X-100 (pH = 3,5). Sloupec se promyje piperazinovým pufrem a eluuje 0,5M roztokem hydroxidu sodného, načež se provede vysrážení 4 objemy ethanolu. Po vysušení za vakua při teplotě 40 C se získá asi 9,85 g N-acetylheparosanu.

Stupeň f - Distribuční chromatografie gramy produktu, získaného v předcházejícím stupni, se rozpustí v 60 ml pufrového roztoku, obsahujícího 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 a 1 M NaCl a získaný roztok se nechá protéci sloupcem 200 ml oktyl-Sepharosy, který byl předtím uveden do rovnovážného stavu se stejným pufrem. K nezadržené frakci se přidají 4 objemy ethanolu. Vyloučená sraženina se promyje a vysuší za vakua při teplotě 40 C.

Tímto způsobem se získá 3,90 g N-acetylheparosanu.

3) Charakterizace N-acetylheparosanu, získaného na výstupu z různých čisticích stupňů

-24CZ 279081 B6

Nukleární magnetickorezonanční spektrum (NMR) o _v

Studium protonového a C-nuklearniho magnetickorezonancniho spektra potvrzuje chemickou identitu získaného produktu s N-acetylheparosanem, popsaným W. F. Vann-em (Eur. J. Biochem. (1981), 116, 59-364).

Stanovení rozdělení molekulových hmot distribuční chromatografií

Rozdělení molekulových hmotností se stanoví vysokotlakou kapalinou distribuční chromatografií, provedenou postupem pro stanovení rozdělení molekulových hmotností N-acetylheparosanů, popsaným v příkladu 1. Hmotnostní frakce alespoň rovná 86 % řetězců, které tvoří šarži na výstupu příkladu 2, má molekulovou hmotnost v rozmezí od 1 500 do 15 000 Da.

Stanovení uronových kyselin

N-Acetylheparosan, získaný ve stupni e, má obsah kyseliny uronové 1,94 mol/mg.

Spektrofotometrie v oblasti ultrafialového a viditelného světla

Získané spektrum potvrzuje, že N-acetylheparosan, který byl získán v tomto příkladu, obsahuje méně než 1 % ADN.

Stanovení celkového obsahu proteinů

Celkový obsah proteinů v této šarži N-acetylheparosanu je nižší než 1 %.

Stanovení volných aminových skupin (NHn)

Obsah aminových skupin v této šarži N-acetylheparosanu je nižší než 0,1 mol/mg.

Příklad 3

Příprava N-acetylheparosanu, majícího převážně nízkou molekulovou hmotnost (způsob III)

1) Kultivace kmene Escherichia coli (K5)

Kultivace kmene Escherichia coli SEBR 3282 byla provedena postupem, popsaným v příkladu 1. Získá se asi 12 litrů kultivační břečky, obsahující N-acetylheparosan.

2) Předběžné čištění

Stupeň a·· - Odstředění

Po ukončení kultivace se získaná kultivační břečka (12 1) odstřeďuje při 8 000 otáčkách za minutu (tj . 11 000 až 14 000 g) po dobu 20 minut.

-25CZ 279081 B6

Stupeň b - Uvedení do styku s alkalickým roztokem

Po odstředění se centrifugační koláč oddělí a supernatant se uvede do styku po dobu jedné hodiny s O,1N roztokem hydroxidu sodného.

Stupeň c - Předběžná filtrace

Roztok, získaný v předcházejícím stupni, se předběžně zfiltruje přes filtr 3M (z polypropylenu, série 300).

Stupeň d - Koncentrace na membráně se stanoveným separačním prahem

Filtrát, získaný ve stupni c, se koncentruje v patroně s náplní dutých vláken Amicon se separačním prahem 10 000 Da nebo i v jiném ekvivalentním prostředku. Tímto způsobem se získá roztok, obohacený N-acetylheparosanem s nízkou molekulovou hmotností.

Stupeň e - Dialýza

Roztok, obohacený N-acetylheparosanem s nízkou molekulovou hmotností, se dialyzuje proti ultračisté vodě opět za použití systému Amicon při velmi vysokém zřeďovacím faktoru (vyšší než 10 000)

3) Izolace a čištění N-acetylheparosanu, majícího převážně nízkou molekulovou hmotnost

Postupuje se stejně, jako je uvedeno v příklad 1/2) izolace a čištění N-acetylheparosanu, majícího převážně nízkou molekulovou hmotnost, Stupeň c - Stupeň f/, přičemž se získá N-acetylheparosan, mající stejné charakteristiky jako šarže A, a jak je uvedeno v příkladu 2/2) Izolace a čištění N-acetylheparosanu, majícího převážně nízkou molekulovou hmotnost, Stupeň a-Stupeň F/.

N,O-Sulfátováné heparosanv

Příklad 4

Chemické modifikace N-acetylheparosanu, majícího převážně nízkou molekulovou hmotnost a získaného v příkladu 1

1) Chemická modifikace šarže B

Stupeň a - Parciální deacetylace

500 mg šarže B se rozpustí v 10 ml 1N roztoku chloridu sodného. Získaný roztok se zahřeje na teplotu 50 C a při této teplotě se nechá za míchání reagovat po dobu 8 hodin. Roztok se potom neutralizuje 2n roztokem kyseliny chlorovodíkové, načež se dialyzuje proti ultračisté vodě a potom lyofilizuje.

-26CZ 279081 BS

Stupeň b - Tvorba tetrabutylamoniové soli

Lyofilizát, získaný v předcházejícím stupni, se vyjme 20 ml ultračisté vody. Získaný roztok se zavede na iontoměničovou kolonu, jejíž náplň je tvořena polystyrenem, zesilovaným divinylbenzenem (Dowex 50 W 8 komerčně dostupný u firmy Dow Chemical) , který byl předběžně kondicionován v kyselém prostředí, za účelem regenerace kyselé formy produktu. Získaný roztok se potom smísí s 0,4 ml 40 % roztoku tetrabutylamonia, načež se provede lyofilizace.

Stupeň c - Parciální N,O-sulfatace

421 mg soli, získané v předcházejícím stupni, se rozpustí ve 35 ml dimethylformamidu a k získanému roztoku se přidá 3,71 g komplexu oxidu sírového a pyridinu (komerčně dostupného u firmy Aldrich pod označením S755-6). Směs se nechá reagovat za míchání při okolní teplotě po dobu 6 hodin. K jednomu objemu reakční směsi se přidává chlorid sodný až do okamžiku, kdy se získá 0,33M roztok chloridu sodného, načež se přidají dva objemy ethanolu. Počká se, až se vytvoří sraženina, načež se směs odstředí a supernatant se oddělí. Centrifugační koláč se potom vyjme 0,5M roztokem chloridu sodného, který se neutralizuje. Potom se přidají dva objemy ethanolu. Opět se ponechá vyloučit sraženina, směs se odstředí a centrifugační koláč se vyjme ultračistou vodou, načež se provede dialýza proti ultračisté vodě a lyofilizace.

Zopakuje se soubor operací, popsaných ve výše uvedeném odstavci.

Získaný lyofilizát má následující vlastnosti:

- obsah kyseliny uronové: 1,11 mol/mg,

- obsah volných amino-skupin.· 0,01 mol/mg,

- stupeň sulfatace: 2,64 na disacharidovou jednotku.

Obsah uronové kyseliny a amino-skupin se stanoví stejně jako v příkladu 1.

Stupeň sulfatace, který je rovněž označován jako poměr sulfát/karboxyl, vyjadřuje střední počet sulfátových skupin, připadajících na jednu karboxylovou skupinu; tento stupeň sulfatace je měřen konduktometrickým stanovením sulfátové skupiny a karboxylové skupiny, popsaným B. Casu-em a kol. v Carbohydrate Research (1975), 39, 168-176.

2) Chemické modifikace šarže A

Šarže A se rozdělí na tři alikvotní frakce, označené jako šarže Al, šarže A2 a šarže A3.

Stupeň a - Parciální deacetylace a gelová filtrace

Uvedené šarže Al, A2 a A3 se zpracují postupem, popsaným ve stupni a pro výše uvedenou šarži B s tím rozdílem, že pouze šarže Al se dialyzuje a lyofilizuje. Šarže Al, A2 a A3 se potom

-27CZ 279081 B6 frakcionují gelovou filtrací (která je rovněž označována jako permeační gelová chromatografie nebo exkluzní chromatografie) za následujících podmínek:

- náplň: kuličky o průměru 27 až 75 m na bázi allydextranu, zesilovaného N,Ν'-methylen-bis-akrylamidem (Sephacryl s 300 HR, komerčně dostupný u firmy Pharmacia);

- eluční činidlo: 0,5M roztok chloridu sodného.

Připraví se směsi frakcí, odpovídajících Kav 0,46 až 1 pro heparosan šarže Al, 0,43 až 1 pro heparosan šarže A2 a 0,43 až 0,64 pro heparosan šarže A3. Tyto frakce jsou dále označované jako gelově filtrované heparosany.

Kav je koeficient, který se obvykle používá v exkluzní chromatograf ii a který umožňuje reprodukovat frakcionaci exkluzní chromatografií. Tento koeficient je definován vzorcem:

Ve - Vt

Kav = -----------Vo - Vt ve kterém:

Ve znamená eluční objem uvažované frakce,

Vo znamená exkluzní objem a

Vt znamená celkový objem gelu.

Rozdělení molekulových hmotností heparosanu z šarže Al bezprostředně pro parciální deacetylaci, jakož i gelově filtrovaných heparosanu z šarží Al, A2 a A3, se stanoví exkluzní chromátografií, provedenou technikou, popsanou v příkladu 1.

Eluční profily před a po gelové filtraci pro heparosan ze šarže Al jsou znázorněny na obrázcích 2 a 3. Některé výsledky uvedených elučních profilů jsou uvedeny v následující tabulce III, ve které PMo znamená takovou molekulovou hmotnost, že pouze 1 % hmotnostní frakce produktu má molekulovou hmotnost vyšší, než je molekulová hmotnost PMo, PMq. znamená takovou molekulovou hmotnost, že pouze 10 % hmotností frakce produktu má vyšší molekulovou hmotnost, než je molekulová hmotnost PM-p PM₃ znamená takovou molekulovou hmotnost, že pouze 10 % hmotností frakce produktu má molekulovou hmotnost menší, než je molekulová hmotnost PM₃ a PM₂je molekulová hmotnost, odpovídající maximální absorpci.

-28CZ 279081 B6

Tabulka III

Rozdělení molekulových hmotností heparosanu ze šarže Al (gelově nefiltrovaný) a heparosanů gelově filtrovaných ze šarží Al, A2 a A3

PMo PMj PM₂ PM₃

Gelově nefiltrovaný

heparosan ze šarže Al	41	400	9	600	4	400	1	400
Gelově filtrovaný heparosan ze šarže Al	10	700	6	900	4	400	1	600
Gelově filtrovaný heparosan ze šarže A2	12	700	7	000	4	500	1	500
Gelově filtrovaný heparosan ze šarže A3	10	300	6	900	4	500	1	500

Z uvedených výsledků a ze srovnání obrázků 2 a 3 vyplývá, že gelová filtrace umožňuje eliminovat minoritní frakci heparosanu s vysokou molekulovou hmotností. V tabulce III je tato skutečnost zřejmá z toho, že po gelově filtraci došlo k výraznému poklesu molekulové hmotnosti PMo. Heparosan z každé šarže obsahuje alespoň 90 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností nižší než 7 000 Da.

Gelově filtrované heparosany ze šarží Al a A2 se potom zpracují postupem, uvedeným v příkladu 1 / 2) Izolace a čištění N-acetylheparosanu, majícího převážně nízkou molekulovou hmotnost, Stupeň c/.

Gelově filtrovaný heperosan ze šarže A3 není srážen, nýbrž dialyzován proti ultračisté vodě.

Obsahy kyseliny uronové a volných aminových skupin se měří postupy, uvedenými v příkladu 1.

Získané výsledky jsou shrnuty v dále zařazené tabulce IV. Obsah zbylých acetylových skupin byl vyhodnocen za předpokladu, že existuje stejný počet glukuronylových a glukosaminlových skupin .

Stupeň deacetylace je rovný poměru obsahu volných aminových skupin k obsahu kyseliny uronové.

Nukleární maqnetickorezonanční spektrum

Studium protonového nukleárního magnetickorezonančního spektra gelově filtrovaného heparosanu ze šarže A3 vede k závěru, že získaný produkt má požadovanou strukturu.

-29CZ 279081 B6

Stupeň deacetylace, vypočtený integrací, je roven 44 %. Tato hodnota je blízké hodnotě stupně deacetylace, vypočtené za použití uvedeného poměru obsahu volných aminových skupin k obsahu kyseliny uronové (41 %).

Tabulka IV

Charakteristiky gelově filtrovaných heparosanů z šarží Al, A2 a A3

	Stanovený obsah kyseliny uronové (μιηοΐ/mg)	Stanovený obsah NH₂(μιηοΐ/mg)	Vypočtený obsah zbylých acetylových ^mol(mg)	Stupeň deacetylace (%)
Gelově filtrovaný heparosan ze šarže Al Gelově filtrovaný he-	2,3	1,10	1,20	48
parosan ze šarže A2 Gelově filtrovaný he-	2,4	1,00	1,40	42
parosan ze šarže A3	2,6	1,05	1,55	41

Stupeň b - Parciální N,O-sulfatace

Gelově filtrované heparosany z deacetylovaných šarží Al, A2 a A3 se zpracují způsobem, který byl popsán výše pro šarži B (Stupeň c - parciální N,O-sulfatace), s tím rozdílem, že se neopakují operace, popsané v prvním odstavci.

V případě heparosanů ze šarže A3 se koláč po prvním srážení vyjme ultračistou vodou, dialyzuje proti ultračisté vodě a ponechá v roztoku.

Charakteristiky N,O-sulfátovaných produktů jsou shrnuty v následující tabulce V.

Tabulka V

Charakteristiky N,O-sulfátovaných heparosanů ze šarží Al, A2 a A3 po provedení parciální N,O-sulfatace

-30CZ 279081 B6

Obsah NH₂ Stupeň sulfatace (p-mol/mg) (poměr sulfát/karboxyl)

Ν,Ο-sulfátovaný heparosan ze šarže AI	0,10	1,9
Ν,Ο-sulfátovaný hepa-
rosan ze šarže A2	0,1	1,9
Ν,Ο-sulfátovaný hepa-
rosan ze šarže A3	0,10	1,8

Z uvedených výsledků je zřejmé, že po Ν,Ο-sulfatační reakci je obsah zbylých skupin NH₂ (0,10 μιηοΐ/mg) vyšší než obsah skupin NH₂ přečištěných N-acetylheparosanů (0,05 μιηοΐ/mg). Sulfatace tedy není na atomu dusíku úplná.

Stupeň c - Celková N-sulfatace

V objemu 20 ml ultračisté vody na gram použitého Ν,Ο-sulfátovaného produktu se smísí 1 hmotností díl Ν,Ο-sulfátovaného produktu, 1 hmotnostní díl hydrogenuhličitanu sodného, 1 hmotností díl komplexu oxidu sírového a trimethylaminu a získaná směs se míchá při teplotě 55 °C po dobu 20 hodin. Reakční směs se potom zředí (zředovací faktor 10), načež se vodivost získaného roztoku nastaví na vodivost 0,5M roztoku chloridu sodného. Potom se provede vysrážení přidáním 2 objemů ethanolu, odstředění a vyjmutí centrifugačního koláče 0,5M roztokem chloridu sodného a následné vysrážení 2 objemy ethanolu. Po vyjmutí ultračistou vodou a dialýze proti ultračisté vodě se produkty lyofilizují a vysuší za vakua při teplotě 40 °C.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum

Studium ¹³C-nukleárního magnetickorezonančního spektra Ν,Ο-sulfátovaného heparosanů ze šarže A3 ukazuje, že v případě této sloučeniny je alkoholová funkce v poloze 6 glukosaminylové skupiny zcela ve formě esteru kyseliny sírové.

Některé charakteristiky získaných N,O-sulfátovaných heparosanů, stanovené výše popsanými metodami, jsou shrnuty v následující tabulce VI.

Tabulka VI

Charakteristiky produktů, získaných po celkové N-sulfataci pro šarže AI, A2 a IR

-31CZ 279081 B6

Obsah	Obsah	Stupeň	Stupeň
kyseliny	nh₂	deacety-	sulfatace
uronové	^mol/mg)	láce	(poměr sul-
(μιηοΐ/mg)		(%)	fát/karboxyl

Ν,Ο-sulfátovaný heparosan ze

šarže Al	1,20	0,02	48	2,2
Ν,O-sulfátovaný heparosan ze šarže A2	1,30	0,02	42	2,2
Ν,O-sulfátovaný heparosan ze šarže A3	1,35	0,02	41	2,1

Z uvedených výsledků je zřejmé, že obsah zbylých skupin NH₂(0,02 μιηοΐ/mg) je nízký a nižší než stejný obsah vyčištěného N-acetylheparosanu (0,05 μηοΐ/ιτφ pro šarži A a šarži B) a než stejný obsah Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu, získaného po parciální Ν,Ο-sulfataci (uveden v tabulce V). To prokazuje úplný průběh N-sulfatační reakce.

Rozdělení molekulových hmotností produktů, získaných po N-sulfataci, je stanoveno postupem, popsaným v příkladu 1.

Eluční profil, získaný pro produkt ze šarže Al, je znázorněn na obrázku 4. Velmi podobné eluční profily se získají pro produkty z šarží A2 a A3.

Některé výsledky uvedených elučních profilů jsou uvedeny v následující tabulce VII. Definice symbolů PMo, PM_1Z PM₂ a PM₃jsou stejné jako v případě tabulky III.

Tabulka VII

Rozdělení molekulových hmotností produktů, získaných po celkové N-sulfataci pro šarže Al, A2 a A3

	PM₀	PM-]-	pm₂	pm₃
Šarže Al	14 700	9 000	5 700	2 600
Šarže A2	17 500	10 000	5 800	3 400
Šarže A3	11 600	7 600	5 000	1 800

-32CZ 279081 B6

N,O-sulfátovaný heparosan každé z šarží obsahuje alespoň 90 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností nižší, než 10 000 Da. Ve skutečnosti šarže Al, A2 a A3 obsahují 80 % řetězců v rozmezí 2 600 až 9 000 Da, 3 400 až 10 000 Da a 1 800 až 7 600 Da.

Příklad 5

Chemické modifikace N-acetylheparosanu, majícího převážně nízkou molekulovou hmotnost z příkladu 2. Příprava 80% N-deacetylovaných derivátů N,O-sulfátovaných heparosanů

Použitý N-acetylheparosan byl připraven postupem, popsaným v přikladu 2. Obsah kyseliny uronové v tomto produktu je roven 2,12 μιηοΐ/mg. Stanovení rozdělení molekulových hmotností bylo provedeno exkluzní chromatografií, provedenou metodou, popsanou v příkladu 1. Hmotnostní frakce alespoň rovná 87,5 % má řetězce s molekulovou hmotností v rozmezí 1 500 až 15 000 Da. Majoritní pík rozdělení molekulových hmotností se nachází v oblasti 4 900 Da. Tato šarže N-acetylheparosanu je označena jako šarže C.

Stupeň a - Parciální deacetylace

2,5 g šarže C se rozpustí v 50 ml 2N roztoku hydroxidu sodného. Roztok se zahřeje na teplotu 50 °C a ponechá se reagovat při této teplotě za míchání po dobu 8 hodin. pH roztoku se nastaví na hodnotu 8 pomocí 2N roztoku kyseliny chlorovodíkové, načež se roztok dialyzuje proti ultračisté vodě a potom lyofilizuje.

Tímto způsobem se získá 1,96 g produktu.

Stupeň N-deacetylace

Výsledek stanovení obsahu volných aminových skupin (NH₂) ukazuje, že N-acetylheparosan byl N-deacetylován z 80 %.

Stupeň b - N-sulfatace

Lyofilizát, získaný v předcházejícím stupni, se vyjme 70 ml vody a po přidání 2,5 g uhličitanu sodného a 2,5 g komplexu oxidu sírového a trimethylaminu se směs ponechá reagovat při teplotě 55 °C po dobu 20 hodin.

Vodivost reakčního roztoku se upraví na vodivost 0,5M roztoku chloridu sodného přidáním demineralizované vody. Vysrážení se provede přidáním 4 objemů ethanolu. Sraženina se odstředí a znovu rozpustí v 0,5M roztoku chloridu sodného. Po vysrážení 4 objemy ethanolu se sraženina odstředí a centrifugační koláč se vyjme ultračistou vodou, načež se získaný roztok dialyzuje postupem, který byl již popsán v příkladu 1, a lyofilizuje. Tímto způsobem se získají 2 g produktu.

-33CZ 279081 B6

Stupeň c - Tvorba tetrabutylamoniové soli

Lyofilizát, získaný v předcházejícím stupni, se převede na tetrabutylamoniovou sůl postupem, popsaným v příkladu 4 / 1) Chemické modifikace šarže B, Stupeň b/. Získá se 2,7 g soli.

Stupeň d - O-sulfatace

2,680 g soli, získané v předcházejícím stupni, se rozpustí ve 196 ml formamidu, načež se k získanému roztoku přidá 11,27 g komplexu oxidu sírového a pyridinu. Směs se nechá reagovat za míchání při teplotě 30 °C po dobu 6 hodin. Potom se na 5 objemů reakčního roztoku přidá 1 objem 2M roztoku chloridu sodného a pH roztoku se nastaví na hodnotu 7 pomocí roztoku hydroxidu sodného. Roztok se opětovně vysráží 2 objemy ethanolu, sraženina se oddělí odstředěním a centrifugační koláč se opětovně rozpustí v 0,5M roztoku chloridu sodného. Potom se přidají 2 objemy ethanolu. Ponechá se vyloučit sraženina, která se odstředí a opětovně vyjme 80 ml ultračisté vody. Přidá se 20 ml 2M roztoku chloridu sodného a 4 objemy ethanolu. Ponechá se vyloučit sraženina, která se oddělí odstředěním.

Stupeň e - Gelová filtrace

Produkt, získaný ve stupni d, se vyjme ultračistou vodou a potom frakcionuje gelovou filtrací za podmínek, popsaných v příkladu 4/2) Chemické modifikace šarže A, Stupeň a/: Molekulové hmotnosti řetězců, které tvoří Ν,Ο-sulfátovaný heparosan, se stanoví exkluzní chromatografií, provedenou postupem, popsaným v příkladu 1. Sloučí se jednak frakce obsahující řetězce, mající molekulovou hmotnost mezi 1 500 a 12 000 Da (roztok C(A)/ a jednak frakce, obsahující Ν,Ο-sulfátované heparosany, tvořené řetězci s molekulovými hmotnostmi mezi 2 000 a 30 000 Da /roztok C(M)/.

K roztoku C(A) se přidají 4 objemy ethanolu. Nechá se vyloučit sraženina, která se odstředí a vyjme ultračistou vodou, načež se provede dialýza proti ultračisté vodě a lyofilizace. Tímto způsobem se získá 1,8 g produktu.

Takto získaný Ν,Ο-sulfátovaný heparosan je označen jako šarže Cl.

Některé charakteristiky tohoto Ν,Ο-sulfátovaného heparosanů, stanovené výše uvedenými postupy, jsou shrnuty v následující tabulce VIII.

-34CZ 279081 B6

Tabulka VIII

Charakteristiky produktu, odpovídajícího šarži Cl

	Obsah kyseliny uronové (μιηοΐ/mg)	Obsah nh₂ (μιηοΐ/mg)	Stupeň deacety- lace (%)	Stupeň sulfatace (poměr sulfát/karboxyl)
Šarže Cl	1,6	0,013	80	1,9

Rozdělení molekulových hmotností bylo stanoveno metodou, popsanou v příkladu 1. Některé výsledky, odvozené z elučního profilu, jsou shrnuty v tabulce IX.

Tabulka IX

Rozdělení molekulových hmotností produktu, odpovídajícího šarži Cl

	PM₀	PM-j-	pm₂	pm₃
Šarže Cl	9 600	7 200	5 621	2 367 ,

Definice symbolů ΡΜθ, PM^, PM₂ a PM₃ jsou stejné jako v případě tabulky III.

N,O-sulfátovaný heparosan šarže Cl obsahuje 95 % hmotnosti řetězců s molekulovými hmotnostmi v rozmezí od 1 500 do 15 000 Da.

Nukleární maqnetickorezonanční spektrum (NMR)

Protonové a ¹³C-nukleární magnetickorezonanční spektrum Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu se získají za použití spektroskopu AMX 500 a D₂O jako rozpouštědla. Studium takto získaného protonoΊ 'X vého a C-nukleárniho magnetickorezonančniho spektra potvrzuje, že získaný produkt má požadovanou strukturu. Jedná se tedy o N,O-sulfátovaný heparosan.

Studium poměru intenzit protonů cukrů a protonů acetylových skupin v protonovém spektru vede ke stupni deacetylace, rovnému 84 %- Tato hodnota je velmi blízká hodnotě stupně deacetylace, vypočtené za použití poměru obsahu volných aminových skupin k obsahu kyseliny uronové (80 %).

-35CZ 279081 B6 ¹³C-nukleární magnetickorezonanční spektrum zejména potvrzuje, že glukosamin je téměř úplně N-sulfátován. Kyselina glukuronová není sulfátována v poloze 2 a 3.

Stupeň f - Gelová filtrace

K roztoku C(M) se přidají 4 objemy ethanolu. Ponechá se vyloučit sraženina, která se odstředí, vyjme ultračistou vodou, dialyzuje a lyofilizuje.

Získaný lyofilizat se potom rozpustí v 0,5M roztoku chloridu sodného a frakcionuje gelovou ve stupni e.

Sloučí se jednak frakce, lové hmotnosti mezi 1 300 a frakce, obsahující řetězce s a 37 000 Da /roztok C(C)/.

filtrací za podmínek, definovaných obsahující řetězce, mající moleku21 000 Da /roztok C(B)/ a jednak molekulovou hmotností mezi 14 000

Oba tyto roztoky se zpracují postupem uvedeným výše pro roztok C(A) , přičemž se po lyofilizaci v případě roztoku C(B) získá šarže C2, zatímco po lyofilizaci v případě roztoku C(C) se získá šarže C3.

V následující tabulce X jsou uvedeny některé výsledky, odvozené z elučních profilů, získaných pro produkty šarže C2 a šarže C3.

Tabulka X

Rozdělení molekulových hmotností produktů, odpovídajících šaržím

C2 a C3

	PM₀	ΡΜ_χ	pm₂	pm₃
Šarže C2	14 600	9 600	7 597	5 950
Šarže C3	28 656	17 320	10 512	7 975

Definice symbolů ΡΜθ, PM^, PM₂, PM₃ jsou stejné jako v případě tabulky III.

Ν,Ο-sulfátovaný heparoan, odpovídající šarži C2, obsahuje asi 99 % hmotnosti řetězců, jejichž molekulová hmotnost leží v rozmezí od 1 500 až 15 000 Da, zatímco Ν,Ο-sulfátovaný heparosan, odpovídající šarži C3, obsahuje asi 73 % hmotnosti řetězců, jejichž molekulová hmotnost leží v rozmezí od 1 500 do 15 000 Da.

Příklad 6

Chemické modifikace N-acetylheparosanu, majícího převážně nízkou molekulovou hmotnost z příkladu 2. Příprava 40% deacetylovaného

-36CZ 279081 B6 derivátu Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu, majícího stupeň sulfatace

2,6

N-Acetylheparosan, použitý jako výchozí produkt, byl připraven postupem, popsaným v příkladu 2. Obsah kyseliny uronové v tomto produktu je roven 1,96 ^mol/mg. Tato šarže se nazývá šarže D.

Stupeň a - Parciální deacetylace

3,7 g šarže D se rozpustí v 74 ml IN roztoku hydroxidu sodného a získaný roztok se zpracuje postupem, popsaným v příkladu 5 (stupeň a). Deacetylace se provede pod atmosférou dusíku. Po lyofilizaci se získá 2,91 produktu.

Stupeň N-deacetylace

Stanovení obsahu volných aminových skupin (NH₂) v produktu, získaném po lyofilizaci, ukazuje, že N-acetylheparosan byl deacetylován ze 40 %.

Stupeň b - N-sulfatace

Produkt, získaný v předcházejícím stupni, byl zpracován po přidání 3,7 g komplexu oxidu sírového a trimethylaminu v přítomnosti 3,7 g uhličitanu sodného postupem, popsaným v příkladu 5 (stupeň b). Tímto způsobem se získají 3 g N-sulfátovaného heparosanu.

Stupeň c - Tvorba tetrabutylamoniové soli

Asi 2 gramy N-sulfátovaného heparosanu, získaného v předcházejícím stupni, se převedou postupem, popsaným v příkladu 5 (stupeň c), na tetrabutylamoniovou sůl. Získá se 2,99 g lyofilitázu.

Stupeň d - O-sulfatace

2,98 g soli, získané v předcházejícím stupni, se uvede v reakci se 14 g komplexu oxidu sírového a trimethylaminu postupem, popsaným v příkladu 5 (stupeň d), načež se provedou vysrážení a čištění, popsaná v témže příkladu 5 (stupeň d). Získá se

2,8 g produktu.

Stupeň e - Gelová filtrace

Produkt, získaný v předcházejícím stupni, se frakcionuje gelovou filtrací za použití metody a materiálu, popsaných v příkladu 4/2) Chemické modifikace šarže A, stupeň a/.

Rozdělení molekulových hmotností frakcí Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu se stanoví exkluzní chromatografii, provedenou postupem, popsaným v příkladu 1. Izolují se frakce, tvořené Ν,Ο-sulfátovanými heparosany, jejichž převážná většina řetězců má molekulovou hmotnost v rozmezí od 1 500 do 15 000 Da.

Tyto frakce se potom zahustí a podrobí dialýze proti ultračisté vodě. Provede se následné vysrážení přidáním 5 objemů etha

-37CZ 279081 B6 nolu, vyloučená sraženina se odstředí, rozpustí v 0,5 M roztoku chloridu sodného, načež se zopakuje srážecí operace.

Takto přečištěný produkt se podrobí drahé frakcionaci za použití metodiky, zmíněné na začátku tohoto stupně. Rozdělení molekulových hmotností frakcí se stanoví exkluzní chromagrafií postupem, který byl již popsán výše. Izolují se frakce, obsahující produkty, mající molekulové hmotnosti v rozmezí od 4 000 do 8 000 Da.

Získané frakce se podrobí dialýze a vysrážením přidáním alkoholu. Sraženina se izoluje a rozpustí v 0,5 M roztoku chloridu sodného. Takto získaný roztok se dialyzuje proti ultračisté vodě a potom lyofilizuje. Tímto způsobem se získá asi 1 gram N,O-sulfátovaného heparosanu, označeného jako šarže Dl.

Některé charakteristiky a rozdělení molekulových hmotností tohoto N,O-sulfátovaného heparosanu jsou uvedeny v následujících tabulkách XI a XII.

Tabulka XI

Charakteristiky produktu, odpovídajícího šarži Dl

	Obsah kyseliny uronové (μιηοΐ/mg)	Obsah nh₂(μπιοί/ηφ)	Stupeň deacetylace (%)	Stupeň sulfatace (poměr sulfát/karboxyl )
Šarže Dl	1,53	0,01	40	2,60

Tabulka XII

Rozdělení molekulových hmotností produktu, odpovídajícího šarži Dl

	PM₀	ΡΜ_χ	pm₂	pm₃
Šarže Dl	15 430	10 305	6 850	4 047
Definice	symbolů PM₀, PM₁ ,	pm₂, pm₃,	jsou stejné,	jako v případě

tabulky III.

N,O-sulfátovaný heparosan šarže Dl obsahuje 80 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností v rozmezí od 4 047 do 10 305 Da a asi 98,5 % hmotnosti řetězců má molekulovou hmotnost v rozmezí od 1 500 do 14 600 Da. Obrázek 5 představuje eluční profil, získaný pro N,O-sulfátovaný heparosan.

-38CZ 279081 B6

Nukleární maqnetickorezonanční spektrum (NMR)

Ί 3

Protonové a C-nuklearni magnetickorezonancni spektrum Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu šarže Dl se získají za použití spektrometru AMX 500, přičemž se jako rozpouštědlo použije D₂O.

Studium protonového a C-nuklearniho magnetickorezonancniho spektra potvrzuje požadovanou strukturu produktu. Jedná se tedy skutečně o Ν,Ο-sulfátovaný heparosan.

l³C-nukleární magnetickorezonanční spektrum zejména potvrzuje,. že žádná aminová skupina glukosaminové jednotky není ve formě volné aminové skupiny (NH₂). Glukosamin je v poloze C6 zcela sulfátován a naopak všechny hydroxy-skupiny kyseliny glukuronové nejsou sulfátované.

Příklad 7

Chemické modifikace N-acetylheparosanu, majícího převážně nízkou molekulovou hmotnost, z příkladu 2. Příprava 40% N-deacylovaného derivátu, Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu, majícího stupeň sulfatace rovný 3

Jako výchozí produkt se v tomto příkladu použije šarže N-acetylheparosanu, připravená postupem, popsaným v příkladu 2. Tato šarže je označena jako šarže E a její obsah kyseliny uronové činí 2 μιηοΐ/mg.

Rozdělení molekulových hmotností tohoto N-acetylheparosanu bylo stanoveno technikou, popsanou v příkladu 1. Tento N-acetylheparosan obsahuje asi 75 % hmotnosti řetězců, majících molekulovou hmotnost v rozmezí od 1 500 do 15 000 Da, přičemž střední molekulová hmotnost těchto řetězců je asi 10 900 Da. Molekulová'hmotnost majoritního heparosanu je 5 135 Da.

Stupeň a - parciální deacetylace

N-Acetylheparosan byl ze 40 % deacetylován za použití metodiky, popsané v příkladu 6 (stupeň a). Za účelem provedení této N-deacetylace se použije 2,5 g výchozího produktu, který se rozpustí v 50 ml IN roztoku hydroxidu sodného. Po ukončení reakce se pH reakční směsi nastaví na hodnotu 6 pomocí kyseliny chlorovodíkové, načež se směs zahustí.

Stupeň N-deacetylace

Výsledky stanovení obsahu volných aminových skupin (NH₂) ukazují, že N-acetylheparosan byl N-deacetylován ze 40 %.

Stupeň b - Gelová filtrace

Použije se sloupec Sephadecrylu S 300 HR (5 cm x 100 cm), který byl uveden do rovnovážného stavu s 0,5M roztokem chloridu sodného. Rozdělení molekulových hmotností heparosanu, obsaženého v různých frakcích, byl stanoven exkluzní chromatografií. Sloučí

-39CZ 279081 B6 se frakce, obsahující řetězce, mající molekulovou hmotnost 6 000 až 20 000 Da, zahustí se v zařízení Rotavapor (rotační odparka) a vysráží 4 objemy ethanolu, načež se vyloučená sraženina izoluje a vysuší. Tímto způsobem se získá asi 1 g produktu.

Stupeň c - Tvorba tetrabutylamoniové soli a parciální N,O-sulfatace

Za účelem vytvoření tetrabutylamoniové soli se použije 300 mg produktu, získaného v předcházejícím stupni, a provede se postup, popsaný v příkladu 4 /1) Chemická modifikace šarže B, stupeň b). Získá se 490 mg soli, která se rozpustí ve 30 ml formamidu. Potom se provede parciální N,O-sulfatace postupem, popsaným v příkladu 4/1) Chemické modifikace šarže B, stupeň c, první odstavec/.

Ze 490 mg soli, která se uvede v reakci s 2,25 g komplexu oxidu sírového a pyridinu, se získá 406 mg N,O-sulfátovaného heparosanu.

Stupeň d - Celková N-sulfatace a gelová filtrace

372 mg produktu, získaného ve výše uvedeném stupni, se rozpustí v 15 ml roztoku uhličitanu sodného (5 %) a získaný roztok se po přidání 372 mg komplexu oxidu sírového a trimethylaminu zpracuje postupem, popsaným v příkladu 4 /2) Chemické modifikace šarže A, stupeň c/.

Produkt, získaný po celkové N-sulfataci, se potom frakcionuje gelovou filtrací za použití sloupce Sephacrylu S 300 HR (2,5 cm x 100 cm) a již popsané metodiky. Frakce, mající molekulovou hmotnost v rozmezí od 6 000 do 20 000 Da, se sloučí, zahustí v rotační odparce Rotavapor, extenzivně dialyzují proti ultračisté studené vodě a lyofilizují. Tímto způsobem se získá 260 mg N,O-sulfátovaného heparosanu, označeného jako šarže El. Charakteristiky tohoto produktu jsou uvedeny v následující tabulce XIII.

Tabulka XIV uvádí rozdělení molekulových hmotností řetězců, které tvoří šarži El.

Tento N,O-sulfátovaný heparosan obsahuje asi 75 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností od 1 500 do 15 000 Da a asi 65 % hmotnosti řetězců, majících molekulové hmotnosti v rozmezí od 7 700 do 15 000 Da.

Tabulka XIII

Charakteristiky produktu, odpovídajícího šarži El

	Obsah kyseliny uronové (μιηοΐ/mg)	Obsah nh₂(μιηοΐ/mg)	Stupeň deacety- lace (%)	Stupeň sulfatace (poměr sulfát/karboxyl)
Šarže El	1,35	0,01	40	3

-40CZ 279081 B6

Tabulka XIV

Rozdělení molekulových hmotností produktu, odpovídajícího šarži El

	PM₀	pm-l	pm₂	pm₃
Šarže El	31 238	19 671	12 029	7 748

Definice symbolů PM₀, PM·^, PM₂, PM₃ jsou stejné, jako v případě tabulky III.

Příklad 8

Příprava dvou šarží 80% N-deacetylovaných derivátů N,O-sulfátovaného heparosanu, majících stupeň sulfatace 2,25 a 2,4

Použitou výchozí látkou (šarže F) je šarže N-acetylheparosanu, připraveného postupem, popsaným v příkladu 2.

Stanovení rozdělení molekulových hmotností řetězců, které tvoří tuto sloučeninu, bylo provedeno exkluzní chromatografií postupem, popsaným v příkladu 1.

Studium elučního profilu vede k závěru, že šarže F obsahuje 92 % hmotnosti řetězců, jejichž molekulová hmotnost leží v rozmezí od 1 500 do 15 000 Da. Majoritní pík se nachází v oblasti 4 800 Da. Hmotnostní frakce šarže F alespoň rovná 80 %, má molekulovou hmotnost v rozmezí od 2 400 do 10 000 Da.

Obsah kyseliny uronové v tomto produktu je roven 2,4μιηο1/πΒ2.

Stupeň a Parciální deacetylace

Postupuje se stejně jako v příkladu 5 (stupeň a), přičemž se použije 2,5 g šarže F a 50 ml 2N roztoku NaOH. Tímto způsobem se získá 1,6 g produktu, který je z 80% N-deacetylován. Stupeň deacetylace byl vypočten na základě stanovení obsahu volných aminových skupin.

Stupně bac - N-sulfatace a tvorba tetrabutylamoniové soli

Tyto dva stupně jsou stejné jako stupně ba c, popsané v příkladu 5. Získá se 4,7 g tetrabutylamoniové soli.

Stupeň d - O-sulfatace

2,9 g soli, získané v předcházejícím stupni, se rozpustí ve 290 ml formamidu a k získání roztoku se přidá 17,4 g komplexu oxidu sírového a pyridinu. Použije se postup, který byl popsán ve stupni d příkladu 5. Centrifugační koláč, získaný po druhém odstředění, se rozpustí v ultračisté vodě, získaný roztok se dialyzuje proti ultračisté vodě a lyofilizuje. Získá se 3,68 g produktu .

-41CZ 279081 B6

Stupeň e - gelová filtrace

Produkt, získaný v předcházejícím stupni, se rozpustí v 0,5M roztoku chloridu sodného a získaný roztok se zavede na sloupec Sephacrylu S 300 HR, který byl uveden do rovnováhy s 0,5M roztokem chloridu sodného. Eluát, opouštějící kolonu, se jímá do automatického sběrače frakcí.

Frakce, mající molekulovou hmotnost v rozmezí od 1 400 Da do 10 000 Da, se sloučí a zahustí v rotační odparce Rotavapor. přidají se 4 objemy ethanolu, vyloučená sraženina se odstředí, vyjme ultračistou vodou a získaný roztok se dialyzuje extenzivně proti_; ultračisté vodě, lyofilizuje a vysuší. Získá se 1,6 g N,O-sulfátovaného heparosanu, označeného jako šarže Fl.

Frakce, odpovídající molekulových hmotnostem v rozmezí od 5 000 do 35 000 Da, se sloučí, zahustí v rotační odparce Rotavapor a k takto získanému roztoku se přidají 4 objemy ethanolu. Vyloučená sraženina se odstředí, vyjme vodou, dialyzuje proti ultračisté vodě a lyofilizuje. Získaný lyofilizát se potom podrobí nové frakcionaci za použití postupu, uvedeného na začátku tohoto stupně.

Rozdělení molekulových hmotností jednotlivých frakcí se stanoví exkluzní chromatografií za použití postupu, který byl popsán v příkladu 1. Sloučí se frakce, tvořící N,O-sulfátované heparosany a mající molekulovou hmotnost v rozmezí od 2 000 do 26 000 Da. Vysrážení se provede přidáním 4 objemů ethanolu. Vyloučená sraženina se odstředí a opětovně rozpustí v destilované vodě, načež se získaný roztok dialyzuje a lyofilizuje. Tímto způsobem se získá 0,6 g N,O-sulfátovaného heparosanu, označeného jako šarže F2.

Charakteristiky šarží Fl a F2 jsou uvedené v následující tabulce XV. Výsledky, odvozené z elučních profilů, jsou shrnuty v tabulce XVI.

Tabulka XV

Charakteristiky N,O-sulfátovaných heparosanů, odpovídajících šaržím Fl a F2

	Obsah kyseliny uronové (μιηοΐ/mg)	Obsah nh₂(μιηοΐ/mg)	Stupeň deacetyla- ce (%)	Stupeň sulfatace (poměr sulfát/karboxyl)
Šarže Fl	1,58	menší než 0,01	80	2,4
Šarže F2	1,58	menší než 0,01	80	2,25

-42CZ 279081 B6

Tabulka XVI

Rozdělení molekulových hmotností produktů, odpovídajících šaržím

F1 a F2

	PM₀	ΡΜ_τ	pm₂	pm₃
Šarže F1	10 700	7 700	5 800	3 300
Šarže F2	24 400	16 325	8 600	6 900

Definice ΡΜθ, PM_1; PM₂, PM₃ jsou stejné jako v případě tabulky III.

N,O-sulfátovaný heparosan šarže F1 obsahuje asi 99 % hmotnosti řetězců, majících molekulové hmotnosti v rozmezí od 1 500 do 15 000 Da, zatímco N,O-sulfátovaný heparosan šarže F2 obsahuje asi 84,6 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností v rozmezí od 1 500 do 15 000 Da a asi 70 % hmotnosti řetězců má molekulovou hmotnost v rozmezí od 6 900 do 13 500 Da.

Nukleární maqnetickorezozanční spektrum (NMR)

Protonové a C-nukleární magnetickorezonanční spektrum

N,O-sulfátovaného heparosanu šarže F1 se získá za použití spektrometru AMX 500, přičemž se jako rozpouštědlo použije D₂O. Studium protonového spektra a zejména poměru intenzit protonů cukrů k protonům deacetylovaných jednotek vede k závěru, že asi 20 % glukosaminových jednotek je N-acetylováno.

Studium ¹³C-nukleárního magnetickorezonančního spektra potvrzuje, že glukosaminová jednotka je skutečně N,O-sulfátována. Kyselina glukuronová není ve většině strukturních disacharidových jednotek O-sulfátována v polohách 2 a 3.

Preparáty

Preparát A

Příprava N-acetylheparosanu, majícího převážně vysokou molekulovou hmotnost (způsob I)

1) Kultivace kmene Escherichia coli (K5) a separace filtrátu, obsahujícího N-acetylheparosan

400 ml kultivačního prostředí D, jehož přesné složení je uvedeno v dále uvedené tabulce XVII, se naočkuje kmenem Escherichia coli SEBR 3282 a naočkované kultivační prostředí se potom inkubuje za míchání při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin.

-43CZ 279081 B6

Získaná předkultura se potom převede do fermentoru o obsahu 18,5 1, obsahujícího 11 litrů kultivačního prostředí C, jehož přesné složení je uvedeno v následující tabulce XVII, a toto kultivační prostředí se potom inkubuje po dobu 6 hodin a 30 minut při pH rovném 7,2 a za míchání, přičemž se udržuje parciální tlak kyslíku 5,32 kPa regulováním přítoku vzduchu (až 20 1/min). Potom se přidá glycerol tak, že se kontinuálně přivádí sterilní roztok, obsahující 500 g/1 glycerolu v množství 18 g/h po dobu 16 až 17 hodin.

V kultivaci se pokračuje za stejné teploty, hodnoty pH a parciálního tlaku kyslíku až do okamžiku, kdy je téměř spotřebováno veškeré množství glycerolu. Sledování DO (vlnová délka 600 nm) kultivační suspenze po ukončení přidáváni glycerolu ukazuje stacionární stav nebo mírnou lyži až do přerušení kultivace po 28 až 30 hodinovém prodlení ve fermentoru.

Kultivační břečka se potom ochladí na teplotu 25 “Ca potom zfiltruje přes membránu s velikostí pórů 0,22 μιη. Tímto způsobem se získá asi 12 litrů filtrátu, obsahujícího N-acetylheparosan, mající převážně vysokou molekulovou hmotnost.

Tabulka XVII

Složení a příprava kultivačního prostředí C a D

Kultivační prostředí C

V 900 ml ultračisté vody se rozpustí v následujícím pořadí:

NTA (kyselina nitrilotrioctová	1 000 mg
k₂hpo₄	700 mg
kyselina glutamová	11 000 mg
MgCl₂.6H₂O	500 mg
k₂s°₄	450 mg
FeSO₄.7H₂O	18 mg
CaCl₂* 2H₂O	2 mg
NaCl	500 mg
KC1	5 000 mg
roztok oligo-prvků (viz tabulka II, př.	1) 1 ml
glycerol	10 000 mg.
Hodnota pH získané směsi se nastaví na	7,2 koncentrovaným rozto-

kem hydroxidu draselného (hustota 1,38), směs se doplní na objem 1 000 ml ultračistou vodou a sterilizačně zfiltruje přes membránu s velikostí pórů 0,2 μιη.

Roztok glycerolu g glycerolu se rozpustí v adekvátním množství ultračisté vody, načež se objem získaného roztoku nastaví stejným rozpouštědlem na 1 000 ml. Roztok se sterilizačně zfiltruje přes membrá

-44CZ 279081 B6 nu s velikostí pórů 0,2 μτη. Přísadou proti tvorbě pěny, která byla použita v průběhu fermentace, je Strktol J 673 (komerčně dostupná u firmy Achill a Seilacher).

Kultivační prostředí D

Příprava kultivačního prostředí D je stejné jako příprava kultivačního prostředí C s tím rozdílem, že je vhodné po přidání přísady proti tvorbě pěny navíc přidat ještě pufr (pH 7,2), tvořený kyselinou 3-morfolinopropansulfonovou.

2) Izolace a čištění N-acetylheparosanu, majícího převážně vysokou molekulovou hmotnost

N-Acetylheparosan, mající převážně vysokou molekulovou hmotnost, byl izolován a vyčištěn postupem, popsaným v příkladu 2 / 2) Izolace a čištění N-acetylheparosanu, majícího převážně nízkou molekulovou hmotnost, stupeň a-stupeň f/.

3) Charakterizace získaného N-acetylheparosanu

Stanovení rozdělení molekulových hmotností exkluzní chromatografií

Vzhledem k současně používaným ethanolům bylo stanovení rozdělení molekulových hmotností provedeno aproximativně.

Získaný N-acetylheparosan je tvořen řetězci s molekulovou hmotností mezi 20 000 a 50 000 Da, přičemž střední molekulová hmotnost se nachází v oblasti 100 000 až 200 000 Da.

Stanovení uronových kyselin

Obsah kyseliny uronové vyčištěného produktu, získaného na výstupu z finální stupně, činí 2,2 μιηοΐ/mg.

Spektrofotometrie v ultrafialové a viditelné oblasti světla

Na základě získaného spektra lze tvrdit, že tato šarže obsahuje alespoň 0,5 % ADN.

Stanovení celkového obsahu proteinů

Celkový obsah proteinů v uvedeném produktu je nižší než 0,5 %.

Stanovení volných aminových skupin (NH₂)

Obsah volných aminových skupin v uvedeném produktu je nižší než 0,1 μτηοΐ/πκ}.

-45CZ 279081 B6

Preparát B

Příprava N-acetylheparosanu, majícího převážně vysokou molekulovou hmotnost (způsob II)

1) Kultivace kmene Escherichia coli (K5)

Kultivace kmene Escherichia coli SEBR 3282 byla provedena postupem, popsaným v rámci preparátu A. Získá se asi 12 1 kultivačního prostředí, obsahujícího N-acetylheparosan, mající převážně vysokou molekulovou hmotnost.

2) Předběžné čistění

Postupuje se stejně jako v příkladu 3 /2) Předběžné čištění/ a ve stupni d se použije patrona s dutými vlákny Amicon se separačním prahem 30 000 Da, nebo jiný ekvivalentní prostředek.

3) Izolace a čištění N-acetylheparosanu, majícího převážně vysokou molekulovou hmotnost

Postupuje se stejně jako v příkladu 3 /3) Izolace a čištění N-acetylheparosanu, majícího převážně nízkou molekulovou hmotnost/.

Preparát C

Chemické modifikace N-acetylheparosanu, majícího převážně vysokou molekulovou hmotnost, získaného v rámci preparátu A

Jako výchozí produkt pro různé chemické modifikace se použije N-acetylheparosan, označený jako šarže G1 a připravený způsobem, popsaným v rámci preparátu A.

Obsah uronové kyseliny v tomto produktu činí 2,41 μιηοΐ/mg.

Stupeň a - Parciální deacetylace

1,9 g šarže G1 se rozpustí ve 38,5 ml 2N roztoku hydroxidu sodného. Roztok se zahřeje na teplotu 50 °C a při této teplotě se ponechá reagovat pod atmosférou dusíku po dobu 8 hodin. Potom se pH roztoku nastaví na hodnotu 8,25 přídavkem nezbytného množství 2N roztoku kyseliny chlorovodíkové, načež se roztok dialyzuje proti ultračisté vodě a potom lyofilizuje. Získá se 1,60 g produktu.

Stupeň N-deacetylace

Stanovený obsah volných aminových kyselin (NH₂) ukazuje, že N-acetylheparosan byl N-deacetylován z 80 %.

-46CZ 279081 B6

Stupeň b - N-Sulfatace

1,3 g produktu, získaného v předcházejícím stupni, se rozpustí v 57 ml ultračisté vody, načež se k získanému roztoku přidá 1,9 g uhličitanu sodného a 1,9 g komplexu oxidu sírového a trimethylaminu a směs se potom zahřívá na teplotu 55 °C po dobu 20 hodin. Vodivost roztoku se potom nastaví na vodivost 0,5M roztoku chloridu sodného přidáním nezbytného množství demineralizované vody a roztok se vysráží přidáním 4 objemů ethanolu. Vyloučená sraženina se odstředí, opětovně vyjme 0,5M roztokem chloridu sodného, znovu vysráží přidáním 4 objemů ethanolu a odstředí.

Centrifugační koláč se rozpustí v ultračisté vodě a získaný roztok se dialyzuje proti ultračisté vodě postupem, popsaným v příkladu 1 a potom lyofilizuje. Tímto způsobem se získá 1,809 g N-sulfátovaného heparosanu.

Stupeň c - Tvorba tetrabutylamoniové soli

800 mg produktu, připraveného v předcházejícím stupni, se rozpustí ve 100 ml vody. Tento roztok se zavede na sloupec iontoměničové pryskyřice Dowex 50 W 8 a dále se postupuje stejně jako v příkladu 4 / 1) Chemické modifikace šarže B, stupeň b/. Po lyofilizaci se získá asi 1,3 g požadované soli.

Stupeň d - O-Sulfatace

Výše uvedeným způsobem získaná sůl se rozpustí v 80 ml formamidu a k získanému roztoku se potom přidá 5,6 g komplexu oxidu sírového a pyridinu. Směs se ponechá reagovat po dobu 6 hodin při teplotě 30 °C, načež se k ní přidá 16 ml 2M roztoku chloridu sodného. pH směsi se upraví na hodnotu 7 a přidají se 2 objemy ethanolu. Vyloučená sraženina se vyjme 0,5M roztokem chloridu sodného, opětovně vysráží 2 objemy ethanolu, dialyzuje proti ultračisté vodě a zahustí v rotační odparce Rotavar.

Stupeň e - Gelová filtrace

Koncentrovaný roztok, získaný v předcházejícím stupni, se frakcionuje gelovou filtrací na sloupci Sephacrylu S 300 HR, přičemž se jako eluční roztok použije 0,5M roztok chloridu sodného .

Izolují se frakce, které odpovídají molekulovým hmotnostem v rozmezí od 10 000 do 500 000 Da. Přidají se 2 objemy ethanolu a provede se zahuštění. Vodivost roztoku se potom nastaví na vodivost 0,5M roztoku chloridu sodného přidáním potřebného množství vody.

Zopakuje se frakcionace gelovou filtrací a jímají se frakce, obsahující Ν,Ο-sulfátovaný heparosan, tvořený řetězci, majícími střední molekulové hmotnosti v rozmezí od 100 000 do 200 000 Da, jakož i frakce¹, obsahující Ν,Ο-sulfátovaný heparosan, tvořený řetězci, majícími střední molekulové hmotnosti asi 50 000 až asi 12 000 Da.

-47CZ 279081 B6

Ke každé z těchto tří frakcí se přidá 5 objemů ethanolu, podrobí se dialýze proti ultračisté vodě a roztoky, získané po dialýze, se lyofilizují.

Tímto způsobem se získají 3 šarže N,O-sulfátovaného heparosanu:

- šarže G1 je N,O-sulfátovaným heparosanem, tvořeným řetězci, majícími střední molekulovou hmotnost od 100 000 do 200 000 Da; izoluje se 0,140 g této šarže;

- šarže G2 je N,O-sulfátovaným heparosanem, tvořeným řetězci, majícími střední molekulovou hmotnost asi 50 000 Da; izoluje se 0,350 g tohoto N,O-sulfátovaného heparosanů;

- šarže G3 je N,O-sulfátovaným heparosanem, tvořeným řetězci, majícími střední molekulovou hmotnost 12 000 Da; izoluje se asi 0,100 g této poslední šarže.

Charakteristiky těchto tří šarží N,O-sulfátovaného heparosanu, popsaných v tomto příkladu, jsou shrnuty v tabulce XVIII.

Tabulka XVIII

Charakteristiky N,O-sulfátovaných heparosanů, odpovídajících šaržím G1, G2 a G3

	Obsah kyseliny uronové (μιηοΐ/mg)	Obsah nh₂^mol/mg)	Stupeň deacetylace (%)	Stupeň sulfatace (poměr sulfát/karboxyl)
Šarže	G1	1,48	menší než 0,01	80	2,6
Šarže	G2	1,45	menší než 0,01	80	2,6
Šarže	G3	1,45	menší než 0,01	80	2,6

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. N,Ο-Sulfátované heparosany, tvořené řetězci nebo směsí řetězců s molekulovou hmotností mezi 1 500 a 15 000 Da, majícími opakovanou disacharidovou strukturu obecného vzorce I ve kterém

E znamená v 0 až 80 % disacharidových jednotek uvedených N,O-sulfátovaných heparosanů acetylovou skupinu a ve zbývajících disacharidových jednotkách sulfátovou skupinu a případně atom vodíku a

G znamená atom vodíku a sulfátovou skupinu, a farmaceuticky přijatelné soli uvedených N,O-sulfátovaných heparosanů.
2. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podle nároku 1, ve kterých E znamená acetylovou skupinu a sulfátovou skupinu.
3. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podle některého z nároků 1 a 2, mající stupeň sulfatace, vyjádřený jako poměr sulfát/karboxyl, 1,5 až 3,0.
4. N,Ο-Sulfátované heparosany podle nároku 1, tvořené řetězci nebo směsí řetězců s molekulovou hmotností mezi 1 500 a 15 000 Da, majícími opakovanou disacharidovou strukturu obecného vzorce I ve kterém

E znamená v 0 až 80 % disacharidových jednotek uvedených N,O-sulfátovaných heparosanů acetylovou skupinu a ve zbývajících disacharidových jednotkách sulfátovou skupinu a případné atom vodíku, a

G znamená atom vodíku a sulfátovou skupinu,

-49CZ 279081 B6 přičemž jejich stupeň sulfatace, vyjádřený jako poměr sulfát/karboxyl, je roven 1,5 až 3,0 a oba konce, redukční a neredukční, řetězců uvedených N,O-sulfátovaných heparosanů jsou sulfátovanými nebo nesulfátovanými uronovými jednotkami, sulfátovaným nebo nesulfátovaným glukosaminem nebo sulfátovaným nebo nesulfátovaným N-acetylglukosaminem, a farmaceuticky přijatelné soli uvedených N,O-sulfátovaných heparosanů.
5. N,O-Sulfátované heparosany podle některého z nároků 1 až 4, ve kterých je acetylová skupina přítomna v míře nižší nebo rovné 60 %.
6. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podle některého z nároků 1 až 5, které obsahují alespoň 90 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotnosti nižší než 11 000 Da.
7. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podle nároku 1, které obsahují méně než 0,2 μιηοΐ/mg aminových skupin (NH₂).
8. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podle některého z nároků 1 až 5, tvořené řetězci se střední molekulovou hmotností asi 4 000 až 7 000 Da a mající stupeň sulfatace, vyjádřený jako poměr sulfát/karboxyl, rovný 1,7 až 3.
9. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podle nároku 1, tvořené alespoň 70 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností mezi 5 000 a 7 000 Da a mající stupeň sulfatace, vyjádřený jako poměr sulfát/karboxyl, rovný 1,8 až 2,5, přičemž acetylová skupina je přítomna v míře nižší nebo rovné 20 %.
10. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podle nároku 1, tvořené alespoň 70 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností mezi 10 000 a 12 000 Da a majícími stupeň sulfatace, vyjádřený jako poměr sulfát/karboxyl, rovný 1,8 až 2,5, přičemž acetylová skupina je přítomna v míře nižší nebo rovné 20 %.
11. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podle nároku 1, tvořené alespoň 70 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností mezi 6 000 a 8 000 Da a majícími stupeň sulfatace, vyjádřený jako poměr sulfát/karboxyl, rovný 2,0 až 2,8, přičemž acetylová skupina je přítomna v míře nižší nebo rovné 60 %.
12. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podle nároku 1, tvořené alespoň 80 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností mezi 2 300 a 7 200 Da a majícími stupeň sulfatace, vyjádřený jako poměr sulfát/karboxyl, rovný 1,8 až 2,5, přičemž acetylová skupina je přítomna v míře menší nebo rovné 20 %.
13. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podle nároku 1, tvořené alespoň 80 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností mezi 3 3 00 a 7 700 Da a majícími stupeň sulfatace, vyjádřený jako poměr sulfát/karboxyl, rovný 1,8 až 2,5, přičemž acetylová skupina je přítomna v míře nižší nebo rovné 20 %.
14. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podle nároku 1, tvořené alespoň 70 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností mezi 6 900 a 13 500 Da a majícími stupeň sulfatace, vyjádřený jako poměr sulfát/karboxyl, rovný 1,8 až 2,5, přičemž acetylová skupina

-50CZ 279081 B6 je přítomna v míře menší nebo rovné 20 %.
15. N,Ο-Sulfátované heparosany podle nároku 1, tvořené alespoň 80 % hmotnosti řetězců s molekulovou hmotností mezi 4 000 a 10 300 Da a majícími stupeň sulfatace, vyjádřený jako poměr sulfát/karboxyl, rovný 2,0 až 2,8, přičemž acetylová skupina je přítomna v míře nižší nebo rovné 60 %.
16. Kompozice Ν,Ο-sulfátovaného heparosanů, vyznačená tím, že obsahuje alespoň 70 % hmotnosti Ν,Ο-sulfátovaného heparosanů podle některého z nároků 1 až 15.
17. Způsob přípravy kompozice, obsahující 70 až 100 % Ν,Ο-sulfátovaného heparosanů podle nároku 1, vyznačený tím, že zahrnuje sled následujících stupňů:

- stupeň a: kultivace kmene Escherichia coli (K5),

- stupeň b: izolace a čištění,kterému případně předchází předběžné čištění, vytvořeného N-acetylheparosanu za účelem získání kompozice, obsahující 70 až 100 % N-acetylheparosanu, tvořeného řetězci nebo směsí řetězců s molekulovou hmotností mezi 1 500 a 15 000 Da, majících opakovanou disacharidovou strukturu vzorce II:

- stupeň c: parciální deacetylace této kompozice N-acetylheparosanu za účelem získání kompozice, obsahující 70 až 100% heparosanů, tvořeného řetězci nebo směsí s molekulovou hmotností mezi 1 500 a 15 000 Da, majících opakovanou disacharidovou strukturu vzorce III ve kterém R' znamená v 0 až 80 % disacharidových jednotek acetylovou skupinu a ve zbývajících disacharidových jednotkách atom vodíku,

- stupeň d: - buď parciální N,O-sulftace kompozice,

- nebo paricální sulfatace kompozice, následovaná N-sulfatace, této heparosanové této heparosanové stupněm celkové

-51CZ 279081 B6

- nebo celková N-sulfatace nebo parciální N-sulfatace, následovaná stupněm celkové nebo parciální 0-sulfatace, a zahrnuje případně jeden nebo několik stupňů frakcionace molekulových hmotností provedeného, popřípadě provedených po ukončení stupňů a, b, c nebo d.
18. Způsob podle nároku 17, vyznačený tím, že kmenem Escherichia coli (K5) je kmen SEBR 3282, uložený u CNCM Pasteurova ústavu v Paříži pod číslem 1-1013, nebo jeho spontánní nebo indukovaný mutant.
19. Způsob podle nároku 17, vyznačený tím, že v kultivaci kmene Escherichia coli se pokračuje ještě alespoň dvě hodiny po zastavení růstu biomasy.
20. Způsob podle nároku 17, vyznačený tím, že izolace a čištění N-acetylheparosanu zahrnují alespoň jeden stupeň srážení alkoholem a alespoň jeden stupeň iontoměničové chromatografie.
21. Způsob podle nároku 17, vyznačený tím, že izolace a čištění N-acetylheparosanu se provádí způsobem, zahrnujícím sled následujících stupňů:

- stupeň a^: srážení ethanolem,

- stupeň bg: dialýza,

- stupeň Cg: srážení ethanolem, potom dehydratace a vysušení,

- stupeň dg: čištění aniontoměničovou chromatografií,

- stupeň eg: srážení eluátu, získaného ve stupni dg, ethano- lem, dehydratace, sušení a drcení, přičemž stupně ag nebo Cg mohou být vypuštěny.
22. Způsob podle nároku 17, vyznačený tím, že izolace a čištění N-acetylheparosanu se provádí způsobem, zahrnujícím sled následujících stupňů:

- stupeň a'g: dialýza,

- stupeň b'g·. čištění v kyselém prostředí, odstranění neroz- pustných nečistot ve vodných roztocích s pH 3,5 a pH 1,8,

- stupeň c'g: srážení ethanolem, potom dehydratace a sušení,

- stupeň d'g: alkalická hydrolýza a dialýza,

- stupeň e'g: čištění aniontoměničovou chromatografií,

- stupeň f'g: čištění exkluzní chromatografií.
23. Způsob podle nároku 17, vyznačený tím, že se N-acetylheparosan, získaný kultivací kmene Escherichia coli (K5) ještě před izolací a čištěním podrobí předběžnému čištění, které se provádí způsobem, zahrnujícím sled následujících stupňů:

-52CZ 279081 B6

- stupeň odstředění suspenze, získané po ukončení kulti- vace ,

- stupeň b'^: uvedení do styku supernatantu s alkalickým roz- tokem,

- stupeň c'^: předběžná filtrace,

- stupeň d·^: koncentrace na membráně se stanoveným separačním prahem,

- stupeň e^: dialýza, přičemž stupeň e'^ může být vypuštěn.
24. Způsob podle nároku 17, vyznačený tím, že po stupni parciální Ν,Ο-sulfatace se provede celková N-sulfatace působením komplexu oxidu sírového a organické báze ve vodném rozpouštědle s alkalickou hodnotou pH.
25. Způsob podle nároku 17, vyznačený tím, že po stupni N-sulfatace se provede frakcionace molekulových hmotností .
26. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že jako účinnou látku obsahuje Ν,Ο-Sulfátovaný heparosan podle některého z nároků 1 až 15 ve spojení nebo ve směsi s farmaceuticky přijatelnou inertní pomocnou látkou.
27. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že jako účinnou látku obsahuje kompozici Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu podle nároku 16 ve spojení nebo ve směsi s farmaceuticky přijatelnou inertní pomocnou látkou.
28. Farmaceutická kompozice podle nároku 26 nebo 27, použitelná pro regulaci krevní koagulace.
29. Kmen Escherichia coli (K5) SEBR 3282, uložený u CNCM Pasteurova ústavu v Paříži pod číslem 1-1013.
30. N-Acetylheparosany, tvořené směsí řetězců s molekulovou hmotností mezi 1 500 a 15 000 Da, majících opakovanou disacharidovou strukturu vzorce II přičemž oba konce, redukční a neredukční, uvedeného N-acetylheparosanu jsou uronovými jednotkami nebo N-acetylglukosaminem.
31.N-Acetylheparosan podle nároku 30, ve kterém ve většině řetězců je neredukční konec uronovou jednotkou vzorce (a):

-53CZ 279081 B6
32.Kompozice N-acetylheparosanu, vyznačená tím, že obsahuje alespoň 70 % hmotnosti N-acetylheparosanu podle nároku 30.
33.Héparosany, tvořené směsí řetězců s molekulovou hmotností mezi

1 500 a 15 000 Da, majícími opakovanou disacharidovou strukturu obecného vzorce III ve kterém R' znamená v 0 až 80 % disacharidových jednotek acetylovou skupinu a ve zbývajících disacharidových jednotkách znamená atom vodíku.
34. Héparosany podle nároku 33, ve kterých je acetylová skupina přítomna v míře nižší nebo rovné 60 %.
35. Kompozice heparosanu, vyznačená tím, že obsahuje alespoň 70 % hmotnosti heparosanu podle některého z nároků 33 a 34.