BG60479B1 - N,о-сулфатирани хепарозани, метод за получаването им и фармацевтичните смеси, които ги съдържат - Google Patents

Abstract

Създадени са медикаменти с понижена токсичност. Изградените от вериги или смес на вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 dа n,о-сулфатирани хепарозани имат повтаряща се дизахаридна структура с формула, в която е означава ацетилна група в 0 до 80% от дизахаридните остатъци на n,о-сулфатираните хепарозани, а в останалите дизахаридни остатъци-сулфатна група и евентуалноводороден атом, g е водороден атом или сулфатна група. Описани са и фармацевтично приемливите соли на n,о-сулфатираните хепарозани.

Description

Изобретението се отнася до нови Ν,Οсулфатирани хепарозани, състави на Ν,Ο-сулфатираните хепарозани, съдържащи тези новй съединения, и фармацевтични състави, съдържащи като активен компонент Ν,Ο-сулфатирани хепарозани.

Предшестващо състояние на техниката

Известно е, че гликозаминогликоните са продукти, които могат да се получат чрез екстракция на животински тъкани. Някои от тези гликозаминогликони притежават много интересни антикоагулационни и антитромботич ни свойства. Типични представители на тази група са хепарина, негови фрагменти и техните производни, както и хепарансулфата и дерматан-сулфата, които са много скъпи.

Известно е, че дерматан-сулфатът представлява смес от полимери с променлива степен на полимеризация, образувани от повтарящи се звена съставени от групи на уроновата киселина (идуронова или глюкуронова) и 10 от ацетилсулфо-4-галактозаминил [1]. Естественият дерматан-сулфат има молекулна маса между 20 000 и 40 000 Da. Този продукт е особено интересен като антикоагулант и антитромботик [2].

Известно е [3], че коагулацията на кръвта е сложно физиологично явление, чийто механизъм може да бъде схематизиран и обобщен по следния начин:

Активиране на контакта

I

Фактор XII------► Фактор ХПа ▼

Фактор XI------► Фактор Х1а

Фактор IX-------► Фактор 1Ха* Тъканен фактор

Vila

Фактор X-----► Фактор Ха* -4----- Фактор X

Протромбин II---—-►Тромбин * Па

Фибриноген------►Фибрин

ХШа

Някои стимули като активиране на контакта и тъканните фактори предизвикват последователното активиране на серия от фактори на коагулацията, налични в кръвната плазма, като те са отбелязани с римски цифри в горната схема за индекс, означаващ активираната форма (индекс за присъствие) или неактивираната (индекс за отсъствие) за определен фактор на коагулация.

Каквато и да е природата на стимула, крайните етапи са идентични: фактор Ха активира фактор II (наречен също така протромбин), който в активирана форма (фактор Па се нарича също тромбин) предизвиква частична протеолиза на разтворимия фибриноген с отделяне на неразтворим фибрин, който е основна съставка на кръвния съсирек.

При нормални физиологични условия протеините регулатори, като антитромбин III (AT11I) и кофактор II на хепарина (НС11) също присъстват в плазмата.

Антитромбин 1П упражнява инхибираща активност върху групата фактори на коагулацията, означени със звездичка (*) в горната схема. Това инхибиране се засилва в присъствие на хепарин или синтетични олигозахариди от хепаринов тип [4].

Кофактор II на хепарина упражнява инхибиращо действие само върху фактор Па (тромбин), който катализира последния етап на коагулацията. Тази активност се усилва значително в присъствие на хепарин или дерматан-сулфат [5].

Инхибирането на фактор Ха или фактор Па се предпочита за постигане на антикоагулационна и антитромботична активност, тъй като тези фактори произлизат от двата последни етапа на коагулацията, които са независими от двигателния стимул.

За постигане на инхибиране само на фактора Па, се използва специфичността на кофактор II на хепарина и се търси възможност за усилване на инхибиторната му активност. Дерматан-сулфатът е известен продукт, притежаващ най мощното усилващо действие от този тип.

Известно е също така, че основната верига на хепарина се образува в два етапа. В първия етап се биосинтезира хепарин, като се излиза от протеогликан, чиято полизахаридна част е съставена от полимери с променлива степен на полимеризация и повтарящи се звена от р-О-глюкуронил-1,4-<х-М-ацетил-Оглюкозамил-(1,4) (дизахаридни единици) с молекулна маса 379 Da. Тази полизахаридна част се нарича N-ацетилхепарозан [6]. Този първи етап на биосинтеза е единственият момент, в който наистина може да се говори за “дизахариден мотив”, тъй като вторият етап на биосинтеза модифицира силно простия му скелет [7].

Естественият хепарин, получен в резултат на биосинтезата, представлява полизахарид, изграден от молекули на глюкуроновата и идуроновата киселина (уронови киселини), евентуално сулфатирани в положение 2, свързани с молекули на глюкозамина, евентуално заместени в положение 6 и сулфатиран или ацетилиран в аминната част в положение 2.

Структурата на хепарина може да се представи статистически чрез следната формула:

COO СН,ОА ·'-------0 _Л ф ’ ,А”_/ “

ОА ΝΗ0 — η в която А представлява Н и SO“, В представлява SO' и СОСН₃ и η е цяло число между 20 и 30, което отговаря на молекулно тегло от 12 000 до 18 000 Da [8].

Съединенията “Ни SO’” и “SO~ и СОСН₃”, използвани респективно за заместителите А и В показват, че в 20 до 30 дизахаридни остатъци по-горе А е в някои случаи водород, а в другите случаи SO“ група и аналогично В е в повечето случаи SO'₃, а в другите случаи-ацетилна група.

Също така връзката ^означава, че СОО групата в 20 до 30 дизахаридни остатъци погоре има в някои случаи конфигурация (ii):

СООН

(става въпрос за D-глюкуроновата киселина) и в повечето от случаите, когато η е единица-конфигурацията (iii):

/\---°\

СООН . \ } (»>) (става въпрос за L-идуроновата киселина).

Хепаринът и фрагментите от хепарин, получени по различни методи на деполимеризация, са макромолекули, съдържащи както остатъци от глюкуронова киселина, така също и остатъци на идуронова киселина.

Различните методи на деполимеризация позволяват да се получат хепаринови фрагменти с молекулно тегло между 2000 и 9000 Da и степен на сулфатиране с поне 20 % по-висока от тази на изходния хепарин. Такива “суперсулфатирани” хепарини са описани в (8] и притежават структура на уроновите звена (ii) и (iii), показана по-горе.

Известно е, че някои бактерии от вида Escherichia coli произвеждат капсулообразен полизахарид, наричан обикновено антиген К5, представляващ група полимери, изградени от повтарящи се звена на р-О-глюгуронил-1,4 а-Г<-ацетил-О-глюкозамил-(1,4) [91.

Този полизахарид със същата химична природа както полизахаридната част на протеогликана, от който произхожда хепаринът, ще бъде наричан по-долу N-ацетилхепарозан. Този продукт има молекулна маса между 10⁵ до 2.10⁶ Da и, на нивото на остатъци на “уроновата киселина”, много регулярна структура, изградена от d-глюкуронова киселина [9 и 10].

В [10] се описва О-сулфатиран полизахарид К5 както и някои от неговите фрагменти, съставени респективно от 4, 6 и 8 “захарни” остатъци, също О-сулфатирани. Тези продукти притежават антиангиногенна и антитуморна активност с благоприятно въздействие по отношение на антикоагулационните свойства. Същият източник описва фрагменти на Nацетилхепарозан, съставен съответно от 4, 6, 8 или 10 “захарни” остатъци.

В [10] се описва и получаването на един пентазахарид със структурата на О-сулфатиран N-ацетилхепарозан чрез пълна химична синтеза.

Установено е, че Ν,Ο-сулфатираните хепарозани с молекулно тегло между 1500 и 15000 Da притежават силно повишена антикоагулационна активност по отношение на хепарина кофактор II и активност анти-Ха.

Ν,Ο-сулфатираните хепарозани, които са обект на настоящето изобретение, се различават от продуктите, описани досега в литературата, по своята оригинална структура и поспециално по степента им на сулфатиране (сулфатиране също така на аминната група на глюкозамина) и техните фармакологични свойства. Между другите фармакологични свойства те притежават по-силна антикоагулационна активност по отношение на хепарин кофактор II (НСИ) от дерматан-сулфата и имат интересни фармакокинетични характеристики. В действителност продуктите съгласно изобретението, получени чрез химична хемисинтеза, притежават фармакологичната активност на гликозаминогликаните, използвани в терапевтиката, по-специално тези на хепарина, и могат да бъдат прилагани за регулиране на коагулацията и в частност намират приложение като антитромботици.

Техническа същност на изобретението

Настоящето изобретение има за задача получаването на N,О-сулфатирани хепарозани с молекулни вериги или смес на вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da, характеризирайки се с повтаряща се дизахаридна структура с формула I:

CHjOG COOH

в която Е представлява в 0 до 80 % от дизахаридните остатъци на въпросните Ν,Οсулфатирани хепарозани ацетилна група, а в останалите дизахаридни остатъци сулфатна група и евентуално водороден атом; G е водороден атом или сулфатна група, и фармацевтично приемливите соли на Ν,Ο-сулфатираните хепарозани.

Степента на сулфатиране на Ν,Ο-сулфатираните хепарозани, изразена като отношение сулфат/карбоксил, за предпочитане е между 1,5 и 3.

Изобретението се отнася също така до състав на Ν,Ο-сулфатирания хепарозан, съдържащ поне 70 % мас от описания по-горе Ν,О-сулфатиран хепарозан, за предпочитане съдържащ поне 90 % мас от Ν,Ο-сулфатирания хепарозан, предмет на настоящето изобретение.

Ν,Ο-сулфатираните хепарозани могат да бъдат изградени от идентични полизахаридни вериги с добре дефинирана молекулна маса между 1500 и 15000 Da, както и от смес от вериги с различна молекулна маса в интервала между 1500 и 15000 Da. Разпределението по молекулни маси на тези вериги може да бъде повече или по-малко значително. Ν,Οсулфатираните хепарозани, предмет на настоящето изобретение, могат да бъдат съставени от вериги различаващи се по молекулната си маса с максимум 13500 Da или, обратно, само от вериги, различаващи се по молекулно тегло с около 300 Da, което отговаря на едно звено от уроновата структура (D-глюкуронова киселина или нейните производни) или структурата на глюкозамина. Очевидно е също така, че в зависимост от състава на всяка молекула N,О-сулфатиран хепарозан с по-ниска или по-висока молекулна маса, тя може да има стойност между 1500 и 15000 Da.

Изразът “G представлява водороден атом или сулфатна група”, използван по-горе, означава, че G в дизахаридните остатъци представлява за някои от позициите водороден атом, а в останалите-сулфатна група. По същия начин Е представлява в някои от дизахаридните остатъци ацетилна група, а в останалите остатъци сулфатна група или евентуално водороден атом. Дизахаридните остатъци на Ν,Ο-сулфатираните хепарозани не са всички идентични.

Формула 1 представя повтарящата дизахаридна структура, образувана от едно глюкозаминово звено и едно звено на D-глюкороновата киселина. Въпросните звена могат да бъдат разместени, особено когато се счита, че дизахаридната структура с формула I се повтаря η пъти, независимо че нередуциращото звено на веригите може да бъде глюкозаминово звено, като показаното във формула I с хидроксигрупа в положение 4, като това глюкоза миново звено е сулфатирано или не, било Dглюкуронова киселина, евентуално съдържаща двойна връзка в положение С₄-С₃ и сулфатирана или не. Редуциращото звено може да бъде D-глюкуронова киселина, като показаната на формула I, заместена с водород по аномерния кислород, или 2,5-анхидромано структура, като получената след азотнокисела деполимеризация (2,5-анхидро-О-маноза), последвана евентуално от окисление (2,5-анхидро-О-манонова киселина) или редукция (2,5-анхидро-О-манитол).

Предпочитани продукти са тези, чиито два края, редуциращ и нередуциращ, на веригите на Ν,Ο-сулфатираните хепарозани, предмет на настоящето изобретение, са уронови остатъци, сулфатирани или не, на сулфатиран или несулфатиран глюкозамин, на N-ацетилглюкозамин, сулфатиран или не или остатъци,притежаващи 2,5-анхидромано структура.

Предпочитат се Ν,Ο-сулфатираните хепарозани, изградени от вериги, чиито два края, редуциращ и нередуциращ, са сулфатирани или несулфатирани уронови звена на сулфатиран или несулфатиран глюкозамин и на сулфатиран или несулфатиран N-ацетилглюкозамин.

Задача на настоящето изобретение е и да предложи метод за получаване на състав, съдържащ 70 до 100 % Ν,Ο-сулфатиран хепарозан, характеризиращ се с това, че съдържа следните етапи:

Етап а: отглеждане на вида Escherichia coli (К5) за получаване на N-ацетилхепарозан,

Етап б: изолиране и пречистване на по лучения N-ацетилхепарозан, за да се получи състав, съдържащ 70 до 100 % N-ацетилхспарозан с вериги или смес на вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da, характеризиращ се с повтаряща се дизахаридна структура с формула II:

сн₂он соон

V

NKCOCH₃ он

Етап в: частично деацетилиране на този състав на N-ацетилхепарозана до получаване на състав, съдържащ от 70 до 100 % хепарозан, съставен от вериги или смес на вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da, характеризиращ се с повтаряща се дизахаридна структура с формула III:

nhr· он в която R’ е в 0 до 80 % от дизахаридните остатъци ацетилна група, а в останалите дизахаридни остатъци водороден атом;

Етап г: частично Ν,Ο-сулфатиране на този състав на хепарозана или частично Ν,Οсулфатиране на този състав на хепарозана, последвано от етап на пълно N-сулфатиране, или пълно или частично N-сулфатиране, последвано от етап на пълно или частично О-сулфатиране.

В някои случаи следва един или няколко етапа на фракциониране по молекулна маса, осъществявано на края на етапите а, б, в или г.

За предпочитане е съгласно изобретението получаването на състав, съдържащ от 70 до 100 % Ν,Ο-сулфатиран хепарозан. По метода съгласно изобретението се предпочита използването като вид Escherichia coli (К5) видът Escherichia coli SEBR 3282. Този вид е производен на Bi 8337-41 <010:К5:Н4) АТСС 23506 [9 и 11].

Видът Escherichia coli SEBR 3282 отговаря положително на теста за типизиране чрез фаг К5 съгласно метода, описан в [12]. Става въпрос за вида Escherichia coli (К5). Този вид е получен съгласно CNCM на Institute Pasteur, Paris, France под № 1-1013. Може да бъде използванспонтанен или индуциран мутант на този вид, както и други подходящи видове от

Escherichia coli (K5), например видът Bi 62642 (012:K5:NM) ATCC 23508.

Желателно е използваната за културата среда да е богата на азотсъдържащи вещества, например на екстракт от дрожди и казеинов хидролизат, която е по-евтина и съдържа поголямо количество аминокиселини.

Отглеждането на вида Escherichia coli (К5) се продължава за предпочитане поне 2 ч след спирането на нарастването на биомасата.

Изолирането и пречистването на N-ацетилхепарозана за получаването на състав, съдържащ от 70 до 100 % N-ацетилхепарозан, състоящ се от смес на вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da, характеризиращи се с повтаряща се дизахаридна структура с формула II, се осъществява по метод, включващ поне един етап на преутаяване и един етап йонообменна хроматография. Този етап се осъществява, като се използва колона с Q-Sepharose или еквивалентна колона. Утаяването се осъществява с подходящ органичен разтворител, по-специално алкохол, за предпочитане етанол. По време на този етап N-ацетилхепарозанът може да бъде под формата на сол, за предпочитане натриева сол.

Предпочитаният метод за изолиране и пречистване може да бъде схематизиран по следния начин:

етап а₍: преутаяване с етанол;

етап б : диализа;

етап в_р утаяване с етанол, дехидриране и сушене;

етап г,: пречистване чрез анионобменна хроматография;

етап д₍: преутаяване с етанол на елуата, получен в етап г_р дехидратиране, сушене и смилане.

Редът на етапите а_р б_р В! е маловажен. Един от етапите а! или в₍ може да бъде изпуснат.

В етап д утаяването с етанол не е абсолютно наложително. Възможно е N-ацетилхепарозанът да бъде изолиран чрез други методи, например изпаряване под вакуум на елуата, получен в етап г_р

Изолирането и пречистването на N-ацетилхепарозана за получаването на състав, съдържащ 70 до 100 % N-ацетилхепарозан, изграден от смес на вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da, могат да бъдат също така осъществени по следния начин:

eTan’p диализа;

етап б’: пречистване в кисела среда, елиминиране нй неразтворимите онечиствания във воден разтвор с pH 3,5 и 1,8;

етап βϋ утаяване с етанол, дехидратиране и сушене;

етап г’ : алкална хидролиза и диализа;

етап д’ : пречистване чрез анионобменна хроматография;

етап е’ : пречистване чрез ексклузионна хроматография.

Този метод за изолиране и пречистване е предпочитан съгласно изобретението.

Алкалната хидролиза се провежда с NaOH при температура между 30 и 80°С.

Прилагайки методите за изолиране и пречистване, като изходен продукт може да се използва суспензията, получена в края на обработката, и в този случай е необходимо едно предварително филтруване, или продукт, който вече е подложен на предварително пречистване съгласно метод, който включва следните етапи:

етап а”,: центрофугиране на получената след обработката суспензия;

етап 6’γ поставяне в контакт на остатъка с алкален разтвор;

етап в” ^предварително филтруване;

етап г” : концентрация с мембрана с определена големина на порите, позволяваща разделяне по молекулна маса;

етап λΎ диализа.

Етап д’^ не е задължителен.

Като алкален разтвор може да се използва 0,1 N разтвор на NaOH.

Предпочита се провеждането на едно предварително пречистване на получения продукт в края на отглеждането съгласно описания по-горе метод.

Културата от видовете Escherichia coli (К5) и методите за изолиране и пречистване както и предварителното пречистване, посочени по-горе, позволяват получаването на състави на N-ацетилхепарозаните, съдържащи 70 до 100 % N-ацетилхепарозан, изграден от смес на вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da, характеризиращи се с повтаряща се дизахаридна структура с формула II:

Чрез методите на изолиране и пречистване, описани по-горс и на етапа на предварително пречистване е възможно получаването на N-ацстилхепарозани, съдържащи поне 80 до 100 % N-ацетилхепарозан, изграден от смес на вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da.

N-ацетилхепарозаните, съставени от смес на вериги с молекулни маси между 1500 и 15000 Da са нови продукти и също представляват обект на настоящето изобретение.

Двете крайни редуцираща и нередуцираща групи на новите N-ацетилхепарозани, получени съгласно описания по-горе метод, при използването на вида Escherichia coli SEBR 3282 или друг подходящ вид, както е отбелязано по-горе, са уронови или N-ацетилглюкозаминови остатъци.

В по-голямата част от веригите крайното нередуциращо звено е уроново звено с формула (а):

СООН

ОН

Евентуалното обогатяване на получения състав на N-ацетилхепарозан, съставен от смес на вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da с повтаряща се дизахаридна структура с формула II, може да се осъществи до различна степен и дори до изолиране на въпросния N-ацетилхепарозан. Обогатяването се осъществява с прилагане на класически техники на фракциониране по молекулна маса, като например гел-проникваща хроматография и ултрафилтрация [ 13, 14, 15]. Също така може да бъде използван методът за етанолно фракциониране [16], е особено предпочитан.

Описаните по-горе N-ацетилхепарозани се използват като междинни продукти за получаването на Ν,Ο-сулфатираните хепарозани, предмет на настоящето изобретение, но също така и за получаване на други производни.

За получаването на сулфатираните Ν,Οхепарозани, предмет на изобретението, могат да бъдат използвани също така други познати N-ацетилхепарозани, например N-ацетилхепарозаните, изградени предимно от полизахаридни вериги със същия брой дизахаридни остатъци, както описаните в [10] и по-специално, съдържащи 6, 8 или 10 “захарни” остатъци, фракции на N-ацетилхепарозани съставени от вериги, съдържащи средно 10 монозахаридни остатъци [17] или N-ацстилхспарозани с голяма молекулна маса, които след това могат да бъдат деполимеризирани съгласно методите, използвани за получаването на хепарини с ниска молекулна маса.

В действителност Ν,Ο-сулфатираните хепарозани, предмет на изобретението , могат да бъдат получени чрез други методи, като се излиза от известен полизахарид (К5) с висока молекулна маса. В този случай е необходим етап на деполимеризация.

Тази деполимеризация може да бъде осъществена преди деацетилирането на високомолекулния N-ацетилхепарозан, след деацетилирането, след N-сулфатирането или след Ν,Οсулфатирането.

Както е посочено по-горе, деполимеризацията може да се осъществи съгласно методи, описани в литературата за получаване на хепарини с ниска молекулна маса, например чрез деполимеризиране с перйодат чрез свободни радикали, чрез β-елиминиране или чрез действието на азотсъдържаща киселина [18, 19]. Тези методи са описани като примери. Може да се използва всеки друг метод за деполимеризация на гликозаминогликани.

Когато сулфатираните Ν,Ο-хепарозани се получават чрез деполимеризация, излизайки от високомолекулен N-ацетилхепарозан (предварително деацетилиран и евентуално N-сулфатиран), подлагайки го на въздействието на азотсъдържащи киселини,редуциращото звено на Ν,Ο-сулфатираните хепарозани може да притежава 2,5-анхидромано и по-специално 2,5анхидро-О-манозна структура. Деполимеризацията чрез въздействие на азотсъдържаща киселина може да се осъществи след етапа на Nдеацетилиране или N-сулфатиране. Когато този етап е последван от окисление или редукция, се получават сулфатирани Ν,Ο-хепарозани, съдържащи в редуциращото звено структура на

2,5-анхидро-0-маноновата киселина или 2,5анхидро-О-манитола.

Частичното деацетилиране на съставите, съдържащи 70 до 100 % N-ацетилхепарозан, което води до получаването на състави, съдържащи от 70 до 100 % и дори от 80 до 100 % хепарозан, представляващ смес на вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da, характеризиращи се с повтаряща се дизахаридна структура с формула III, представена по-горе, се осъ ществява чрез обработка с деацетилиращ агент.

Като деацетилиращи агенти могат да сс споменат фосфорен пентасулфид, триетилоксониев флуорборат, калиева основа или хидразин, като последните два са особено ценени. Могат да се използват също така силни минерални киселини като солна, сярна и т.н. Продължителността на реакцията зависи от подбраните условия и по-специално от температурата и концентрацията на деацетилиращия агент в реакционната среда.

Обогатяването на състава на хепарозана с хепарозан, съдържащ вериги или смес на вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da, характеризиращ се с повтаряща се дизахаридна структура с формула 111, се осъществява чрез класическите техники на фракциониране по молекулна маса, споменати по-горе (гелпроникваща хроматография, ултрафилтрация и етанолно фракциониране). В този случай се получава състав, съдържащ 90 до 100 масови % хепарозан, съставен от молекули с маса между 1500 и 15000 Da с повтаряща се дизахаридна структура с формула III.

За получаване на хепарозани, съставени от смес на вериги с молекулни маси между 1500 и 15000 Da, е възможно също така да бъдат използвани N-ацетилхепарозани с висока молекулна маса. Хепарозаните с висока молекулна маса, получени след деацетилиране, могат да бъдат деполимеризирани чрез методите, описани вече за получаването на нискомолекулни хепарини и вече споменати в настоящата заявка. Продуктите на деполимеризация могат след това да бъдат подложени на фракциониране, за да се получат предпочитаните съгласно изобретението хепарозани.

Хепарозаните, представляващи смес на вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da, характеризиращи се с повтаряща се дизахаридна структура с формула III:

сн₂он соон ъ .....

NHR* ^он в която R’ представлява в 0 до 80 % от дизахаридните остатъци ацетилна група и в останалите дизахаридни остатъци водороден атом, са нови продукти и като такива представляват също обект на изобретението.

Предпочитаните съгласно изобретението хепарозани са хепарозани, съставени от смес на вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da, характеризиращи се с повтаряща се дизахаридна структура с формула III, в която ацетилната група (R’) е в количество пониско или равно на 60 %.

Съставите на хепарозана, които съдържат поне 70 мас % от описания по-горе хепарозан, представляват също обект на настоящето изобретение.

Тези хепарозани и техните състави са междинни продукти, полезни за получаването на Ν,Ο-сулфатираните хепарозани, предмет на изобретението, но те могат да бъдат също така използвани за получаването на други продукти, например продукти, които понасят впоследствие епимеризация на нивото на киселите D-глюкуронови остатъци.

Преди етапа на частичното Ν,Ο-сулфатиране, хепарозаните могат да бъдат превърнати в сол на органична база или в квартернерна амониева сол. За получаването на квартернерна амониева сол на хепарозаните се предпочита използването на тетрабутиламоний.

Етапът на частично Ν,Ο-сулфатиране, осъществен съгласно метода, описан в [20] и аналогичен на [21], се осъществява в подходящ полярен разтворител като диметилформамид, диметилсулфоксид, хексаметилфосфорамид или ацетонитрил или смес на тези разтворители, с помощта например на серен триокис (SO₃) с органична база като триметиламин, триетиламин или пиридин. Той може също така да се проведе с хлорсулфонова киселина в разтвор на пиридин. Предпочита се използването на комплекс серен триокиспиридин.

Възможно е също така да се използват други сулфатиращи агенти, по-специално описаните в [22]. Реакцията на Ν,Ο-сулфатиране обикновено се провежда при температура между 0 и 100°С, за предпочитане между 10 и 50°С в продължение на 6 до 14 часа.

По време на получаването в края на частичното Ν,Ο-сулфатиране, съставът на Ν,Οсулфатирания хепарозан, съдържащ 70 до 100 % Ν,Ο-сулфатиран хепарозан, се утаява чрез добавяне на натриев хлорид до получаването на 0,33 М разтвор на натриев хлорид, след това с адекватно количество етанол. Получената утайка се отделя с 0,5 М разтвор на натриев хлорид. Този разтвор след това се неутрализира. След добавянето на адекватно количество етанол, образуваната утайка се изолира, отделя се с ултра чиста вода, диализира се срещу такава, лиофилизира се и се суши.

Етапът на Ν,Ο-сулфатирането, както и етапите на пречистване на състава на описания в предишния параграф сулфатиран N,0хепарозан, могат да бъдат повторени един или повече пъти. Процесът на пречистване е даден за пример и не изключва подобни методи.

Този етап на Ν,Ο-сулфатиране е за предпочитане последван от етап на пълно N-сулфатиране, който обикновено се провежда във воден разтвор, за предпочитане при алкално pH, със сулфатиращ агент като комплекс на серен триокис с органична база, например триметиламин.

В края на етапа на пълното N-сулфатиране съставът на Ν,Ο-сулфатирания хепарозан се утаява след добавянето на натриев хлорид до получаването на 0,5 М разтвор на натриев хлорид и на етанол. Образуваната утайка се разтваря в разтвор на 0,5 М натриев хлорид, преутаява се с етанол, отделя се с ултра- чиста вода, диализира се срещу същата, лиофилизира се и се суши.

Обогатяването на състава на сулфатирания Ν,Ο-хепарозан на Ν,Ο-сулфатиран хепарозан се осъществява чрез прилагане на класическите техники на фракциониране по молекулна маса, споменати по-горе.

Ν,Ο-сулфатираните хепарозани и съставите на сулфатиран Ν,Ο-хепарозан, съдържащи поне 70 % от един нов сулфатиран Ν,Οхепарозан се получават предимно по метод, включващ един последен реакционен етап на N-сулфатиране, Е представлява, следователно, за повтарящите се структури във формула I ацетилна група и сулфатна група.

Възможно е също така получаването на Ν,Ο-сулфатираните хепарозани, като се започне най-напред с N-сулфатиране, последвано от О-сулфатиране. Този вариант на метода се предпочита.

N-сулфатирането се провежда с помощта на комплекс на серния триокис с органична база като триметиламин, триетиламин или пиридин. То може да се осъществи също с хлорсулфонова киселина, разтворена в пиридин. Предпочита се комплекса на серния триокис с триметиламин и провеждане на N-сулфатирането при температура между 20 и 80°С във водна алкална среда. В края на реакцията на N-сулфатиране, така полученият продукт се утаява чрез добавяне на адекватно количество етанол. Образуваната утайка сс отделя с ултра чиста вода, диализира сс срещу същата, лиофилизира се и се суши. Процесът на пречистване е даден за пример и не изключва използването на еквивалентни методи. Етапите на пречистване могат да бъдат повторени няколко пъти.

Съгласно метода на изобретението, преди етапа на О-сулфатирането се предпочита превръщането на N-сулфатирания хепарозан в сол на органична база или в квартернерна амониева сол. За получаването на квартернерна амониева сол се предпочита използването на тетрабутиламоний.

Реакцията на О-сулфатиране се провежда във формамид или друг химически еквивалентен разтворител, с помощта например на комплекс на серния триокис с органична база като триметиламин, триетиламин или пиридин. Предпочита се използването на комплекса серен триокис-пиридин. Реакцията на О-сулфатиране обикновено се провежда при температура между 10 и 50°С.

Ν,Ο-сулфатираният хепарозан след това се утаява чрез добавяне към реакционната среда на натриев хлорид до получаване на 0,33 М разтвор на натриев хлорид, след това на адекватно количество етанол както в случая на Ν,Ο-сулфатирането. След това се провежда пречистване на състава на сулфатирания Ν,Ο-хепарозан. Отделните етапи са детайлно описани по-горе (преутаяване с етанол, диализа и т.н.).

Съгласно изобретението предпочитаният Ν,Ο-сулфатиран хепарозан съдържа поне 90 мас % вериги с молекулна маса под 11000 Da. Предпочита се този Ν,Ο-сулфатиран хепарозан да съдържа по-малко от 0,2 pmole/rng аминогрупи (NH₂).

Предпочита се количеството на ацетилната група да е по-малко или равно на 60 % и степента на сулфатиране, изразена като отношение сулфат/карбоксил, да е между 1,5 и 3.

Предпочитаните продукти съгласно изобретението са Ν,Ο-сулфатирани хепарозани, изградени със средна молекулна маса от 4000 до 7000 Da и степен на сулфатиране изразена като отношение сулфат/карбоксил между 1,7 и 3, както и Ν,Ο-сулфатирани хепарозани, ко9 ито са N-деацстилирани около 80 % (количеството на ацетилни групи е около 20 %) и съставени от поне 70 мас % вериги с молекулна маса между 5000 и 7000 Da и със степен на сулфатиране от 1,8 до 2,5 или пък N-сулфатиранитс хепарозани, съставени от поне 70 мас % вериги с молекулна маса между 10000 и 12000 Da, N-деацетилирани до 80 % (количество на ацетилни групи около 20 %) и със степен на сулфатиране от 1,8 до 2,5, или пък Ν,Ο-сулфатирани хепарозани, N-деацетилирани до около 40 % (количество на ацетилните групи около 60 %) и съставени от поне 70 мас % вериги с молекулна маса между 6000 и 8000 Da и степен на сулфатиране от 2,0 до 2,8.

По-специално се предпочитат следните сулфатирани Ν,Ο-хепарозани:

-Ν,Ο-сулфатирани хепарозани, N-деацетилирани до около 80 % (количество на наличните ацетилни групи около 20 %), изградени от поне 80 мас % вериги с молекулна маса между 2300 и 7200 Da и със степен на сулфатиране от 1,8 до 2,5,

-Ν,Ο-сулфатирани хепарозани, N-деацетилирани до около 80 % (количество на наличните ацетилни групи около 20 %), изградени от поне 80 мас % вериги с молекулна маса между 3300 и 7700 Da и със степен на сулфатиране от 1,8 до 2,5,

-Ν,Ο-сулфатирани хепарозани, N-деацетилирани до около 80 % (количество на наличните ацетилни групи около 20 %), изградени от поне 70 мас % вериги с молекулна маса между 6900 и 13500 Da и със степен на сулфатиране от 1,8 до 2,5,-Ν,Ο-сулфатирани хепарозани, N-деацетилирани до около 40 % (количество на наличните ацетилни групи около 60 %), изградени от поне 80 мас % вериги с молекулна маса между 4000 и 10300 Da и със степен на сулфатиране от 2,0 до 2,8.

Като соли на Ν,Ο-сулфатирани хепарозани се разбират всички фармацевтично приемливи соли. Тези соли се получават по класическите методи, описани за получаването на солите на хепарина [23].

Описаният по-горе метод за получаване на Ν,Ο-сулфатирани хепарозани, както и методите за пречистване позволяват получаването на Ν,Ο-сулфатирани хепарозани под формата на натриеви соли. Излизайки от тези соли и прилагайки методите, използвани за получаването на различните соли на хепарина или хепарин, който нс с под формата на сол, могат да бъдат получени други соли на N.Oсулфатираните хепарозани, или Ν,Ο-сулфатирани хепарозани в нссолева форма [24].

Ν,Ο-сулфатираните хепарозани проявяват интересни фармакологични и биохимични свойства, изненадващи по отношение на известното досега в тази област.

Обратно на сулфатираните продукти на антигена К5, описан в [10], които притежават антиангиногенна и антитуморна активност с изразена активност по отношение на антикоагулативните свойства, Ν,Ο-сулфатираните хепарозани притежават добро регулиращо действие върху коагулацията. Това действие е много по-голямо от това на дерматан сулфата върху различните параметри на коагулацията и би трябвало по-скоро да се сравнява с това на хепарина.

В частност, зависимата активност анти-Па, ATIII или НСИ, на представителните продукти съгласно изобретението е определена съгласно методите описани в [25] за кофактор II на хепарина (НСИ) и в [26] за антитромбина (ATII1).

В тези два случая изпитването се състои в измерване in vitro на инхибиторния ефект на изследвания продукт върху пречистен тромбин (фактор Па) в присъствие на пречистен НСИ или АТШ при определянето на амидолитичната активност на тромбина по отношение на хомогенен субстрат. Тъй като той притежава анти-Па НСИ най-силно зависима активност, дерматан-сулфатът, получен съгласно метода описан в [27], е използван като продукт за сравнение при тестовете за измерване на тази активност, като резултатът е изразен в мг дерматан-сулфат (DS) еквивалентни по активност на 1 мг изследван продукт (mg DS equiv/mg).

Анти-Ха активността (Yin-Wessler проба) на представителните продукти съгласно изобретението се определя съгласно метода описан в [27], докато тяхната обща антикоагулационна активност се измерва съгласно теста АРТТ, описан в [28].

Всички изпитвани продукти показват анти-Па НСП зависима активност по-висока от тази на дерматан-сулфата. Анти-Па АТШ зависимата активност и Yin Wessler пробата въпреки, че са по-ниски от тези на хепарина, са по-високи от тези на дерматан-сулфата.

Неговият титър на АРТТ е около 2 и около 20 пъти по-голям от този на дсрматан-сулфата и може да достигне до 60 % от този на хепарина.

Ν,Ο-сулфатиранитс хепарозани съгласно изобретението показват специфично действие и антикоагулационна активност. Ниската молекулна маса на тези продукти им придава значителни фармако-кинетични свойства.

Ν,Ο-сулфатираните хепарозани съгласно настоящето изобретение са много по-малко токсични; тяхната токсичност е отлично съвместима с използването им като медикаменти.

Настоящето изобретение се отнася също така до фармацевтични състави, съдържащи като активен елемент Ν,Ο-сулфатиран хепарозан, предмет на настоящето изобретение, някоя от неговите соли или състав на Ν,Οсулфатиран хепарозан, съдържащ поне 70 % от този Ν,Ο-сулфатиран хепарозан или негова сол в смес с един или повече фармацевтично подходящи носители.

Тези фармацевтични състави са удобни по-специално за превантивно или лечебно третиране на вътрешните съдове като атеросклероза и артериосклероза и състоянията на хиперкоагулативност, наблюдавана например след хирургически операции, при туморообразуване или нарушаване на коагулацията, предизвикана от бактерийни, вирусни или ензимни активатори.

Позологията може да варира в широки граници в зависимост от възрастта, теглото и здравословното състояние на пациента, от природата и степента на заболяването, както и от начина на администриране.

Тази позология включва администрирането на една или повече дози от около 1 мг до 1 г на ден, за предпочитане от около 5 до 500 мг на ден, например от 200 мг на ден интравенозно, подкожно, чрез непрекъснато администриране или през определени интервали, или дневна доза от 200 до 1000 мг орално.

Тези дози могат разбира се да бъдат уточнявани за всеки пациент в зависимост от наблюдаваните резултати и кръвните анализи.

Описание на приложените фигури Примери за изпълнение на изобретението N -ацетил хепарозани

Пример 1

Получаване на N-ацетилхепарозан в по-голямата си част с ниска молекулна маса (метод I)

1) Отглеждане на бактерийния вид

Escherichia coli (К5) и отделяне на филтрат, съдържащ N-ацетилхепарозан.

400 мл от средата В със състав, уточнен в дадената по-долу таблица I. се посява с вида Escherichia coli Sebr 3282 (получен съгласно CNCM на Institute Pasteur Paris, France под № ΙΙΟ 13) и се инкубира при разбъркване в продължение на 2 часа при 37°С.

Така получената предкултура се пренася във ферментатор от 18,5 л, съдържащ 11 л от среда А със състав, представен в таблица 1, и се инкубира в продължение на 4 часа при 37°С и pH 7,4, като парциалното налягане на кислорода се поддържа 40 mmHg чрез регулиране на вкарвания въздух (до 20 л/мин) и се разбърква. Добавя се глюкоза чрез постепенното въвеждане на стерилен разтвор, съдържащ 600 г/л глюкоза със скорост 250 мл/час в продължение на 8 часа.

Културата се оставя при същите условия на температура, pH и парциално налягане на кислорода в продължение на 10 часа след прекратяване на добавянето на глюкозата. Проследяването на DO (λ=600 нм) на средата на културата позволява да се потвърди, че не протича нарастване на биомасата през последните 12 часа на развитие.

Бульонът с културата се охлажда до 25°С и след това се филтрува през мембрана с пори с размер 0,22 pm. Така се получават около 12 л филтрат, съдържащ N-ацетилхепарозан.

Таблица I

Състав и получаване на среда А и В Среда А

Средата А се получава чрез смесването на описаните по-долу три стерилни разтвора:

Разтвор № 1

В 700 мл ултрачиста вода се разтварят в следната последователност:

Комплексообразувател	М’[трис-(хид роксиметил) метил] глицин
(tricin, търговски продукт на FlukaR) FeSO4,7H2O CaCI2, 2Н2О MgCl2, 6Н2О k2so4 KCI	360 мг 280 мг 6,7 мг 1270 мг 500 мг 5000 мг

Казеинов хидролизат (основен източник на аминокиселини) HY CASE SF (търговски продукт на Sheffield*) - 25000 мг

Дрожден екстракт (търговски продукт на Difco^R) - 18000 мг

Олиго-елементен разтвор (таблица 2 подолу) - 1 мг

Антипенител Struktol J673 (търговски продукт на Schill & Seilacher“): няколко капки с пипета на Пастьор.

Довеждане до pH 7,4 с разтвор на КОН (d=l ,38) и допълване до 850 мл с ултрачиста вода. Средата се поставя в автоклав при 120°С в продължение на 45 мин.

Разтвор №2

В около 40 мл ултрачиста вода се разтварят 5 г К₂НРО₄ и след това се довеждат със същия разтворител до 50 мл. Полученият разтвор се филтрува през филтър с порьозност 0,2 рт

Разтвор №3

20,7 г глюкоза се разтварят в адекватно количество ултрачиста вода и обемът се довежда до 100 мл със същия разтворител. Обработва се при 110°С в автоклав в продължение на 30 мин.

Среда В

Получаването на среда В е идентично с това на среда А с тази разлика, че е подходящо да се добавят допълнително 20 г буфер с pH 7,2: (3-морфолинпропансулфонова киселина) след добавянето на антипенителя.

Таблица II

Получаване на олиго-елементен разтвор, използван за получаване на среда А и среда В в 800 мл ултрачиста вода се разтварят (в следния ред):

н3во3	500 мг
Na2MoO4, 2Н2О	1930 мг
СоС12, 6Н2О	11850 мг
CuSO4, 5Н2О	25 мг
ZnSo4, 7Н2О	2000 мг
А1С1}, 6Н2О	2410 мг

Добавят се 100 мл солна киселина с плътност 1,19 и се допълва до 1000 мл с ултрачиста вода.

2) Изолиране и пречистване на N-ацетилхепарозан в по-голямата си част с ниска молекулна маса:

Етап а-Етанолно утаяване:

Към филтрата се добавят около 48 л 95 %-ен (обем/обем) етанол и сместа се оставя да сс утаи и декантира при 4°С в продължение на 8 часа. Горният слой се изпомпва, след това се центрофугира и полученият разтвор се отделя в около 1 л ултрачиста вода.

Етап б-диализа:

Полученият в предишния етап разтвор, поставен в спирала NOJAX 40, с целулозна мембрана с порьозност 24 А се диализира в продължение на 24 часа по отношение на ултрачиста вода (1 обем разтвор/6 обема вода, сменяни след 2 часа, 8 часа и 16 часа). Тази операция позволява да се елиминират малките молекули, които присъстват в средата на културата, като соли, захари, аминокиселини, олигонуклеотиди и олигопептиди.

Етап в:-Утаяване, дехидратиране и сушене:

Към 1 обем от диализирания разтвор се добавя 0,5 М NaCI и 4 обема етанол. Оставя се да се образува утайка в продължение на 5 мин при стайна температура. Центрофугира се до 5000 г в продължение на 20 мин. Утайката от центрофугирането се поставя в етанол, получената суспензия се разбърква и се оставя да се утаи в продължение на 1 час при стайна температура. Центрофугирането и суспендирането се повтарят. Отново се центрофугира до 5000 г в продължение на 20 мин. Утайката от центрофугирането се суши във вакуум-сушилня при 40°С в продължение на 24 ч.

Етап г: -Смилане на прах:

Сухият остатък от центрофугирането се стрива в хаван в отсъствие на влага.

Етап д:-Анион-обменна хроматография:

Стритият остатък от центрофугирането се поставя в буфер, наречен буфер D, със състав трис-HCI 20mM pH 7,5 в количество 100 мл/г. Полученият разтвор се хроматографира през анион-обменна колона, съдържаща матрица от агароза, омрежена с квартернерни амониеви групи (“Q-Sepharose fast flow “ на Pharmacia ^R), предварително доведена до равновесно състояние с буфер D с количество 50 мл от гела на 1 г прах. Гелът се промива с достатъчно количество от буфера D за възвръщане на базовата линия за UV детекция при 214 nm, след това с разтвор на пиперазин 25 mM с pH 3,5. Елуира се с разтвор с pH 3,5 със състав: NaCI 0,5 М и пиперазин 25 тМ. Елуатът се неутрализира с 0,5 N разтвор на NaOH.

Етап е:-Утаяване, дехидратиране, сушене и смилане:

Повтарят се операциите, описани в ета12 пи “в” и “г” по-горе, без да се добавя натриев хлорид.

Полученият в етап “е” N-ацстилхепарозан се нарича партида А.

Един вариант на метода за пречистване се състои в последователното осъществяване на етапите “а”, “б”, “в”, “г”, “д” и “е”.

Така полученият N-ацетилхепарозан се нарича партида В.

3) Охарактеризиране на получения в различните етапи на пречистване N-ацетилхепарозан:

Спектър от ядреномагнитния резонанс (ЯМР)

Протонният и ¹³С ЯМР спектрите са сравнени с тези на N-ацетилхепарозана, описан в W. Е. Vann, Eur. J.Biochem., (1981),116, 59-364.

Изучаването на получените спектри на N-ацетилхепарозана от партида А и В потвърждават химическата идентичност на продукта с N-ацетилхепарозана, описан от W. F. Vann. Става въпрос за полимерни вериги, изградени от повтарящи се структури на β-Dглюкуронил-1,4-а-М-ацетил-О-глюкозаминил(1,4).

Определяне на разпределението по молекулна маса чрез ексклузионна хроматография

Разпределянето по молекулна маса се определя чрез ексклузионна високо ефективна течна хроматография при следните условия:

* колона, запълнена със сферички от силициев двуокис с диаметър 10 pm и порьозност 250 А.

* елуент: 0,5 М воден разтвор на натриев сулфат.

* дебит: 1 мл/мин.

* UV детекция при λ=205 nm.

* еталонирането се провежда с олигозахаридни стандарти, производни на хепарина със следните молекулни маси: 1324, 1883, 2436, 3411, 3996, 4535, 4995, 5365, 6150, 6670, 7542, 8655, 10088, 11561, 12950, 14809, 17387 и 22674 Da.

Имайки предвид стойностите на тези стандарти, интерес представляват само молекулните маси между 934 и 56703 Da. Приема се, че определената оптична плътност е пропорционална на количеството на N-ацетилхепарозана. Все пак точността на метода намалява експоненциално за високите молекул ни маси и по-специално за по-високите от 20000 Da. Ексклузионната хроматограма на партида А е представена на фигура 1. От фигура 1 се установява, че разпределението е полидисперсно и включва един плавен пик при около 4700 Da. Една тегловна фракция, равна на поне 70 % от партида А, притежава молекулна маса между 1700 и 8000 Da.

Подобна хроматограма се получава при анализа на партида В. Основният пик на разпределението е около 5000 Da. Тегловна фракция, равна на поне 70 % от партида В, е с молекулна маса между 1500 и 8000 Da.

Проследяване на разпределението по молекулна маса чрез електрофореза върху гел на полиакриламид

Тези проби, както и маркер за края на миграцията, съдържащ бромфенол синьо, се подлагат на електрофореза в трисборатен буфер в 15 %-ен полиакриламиден гел, получен чрез полимеризация на смес на акриламид и Ν,Ν’-метилен-бис-акриламид в съотношение 29:1. Миграцията се осъществява при 400 мА в продължение на около 4 часа върху гел с дължина 18 см до излизането на маркера на края на миграцията. След това гелът се оцветява с алциансиньо, после със сребро, съгласно S. Pelkonen et al., J. Bact (1983), 170, 6, 26, 46, което е характерно за полизахаридните киселини.

Този анализ се провежда с частично пречистения продукт, получен в етап “а” и пречистения продукт партида А или В на крайния етап, за да се установи отсъствието на значително изменение на разпределението по молекулна маса на N-ацетилхепарозана в процеса на пречистване.

Сравнението на хроматограмите, получени за частично пречистения продукт, произлизащ от етап “а” и пречистения продукт от крайния етап (партида А или В) не доказва значителни различия (наличие на сравними интензитетни линии при същите разстояния на миграция). Следователно няма значителни изменения в разпределението по молекулна маса на N-ацетилхепарозана в процеса на пречистване.

Определяне на уроновите киселини

Количеството уронова киселина на единица маса от пречистения продукт (партида А или В) получен в крайния етап се определя чрез колориметрия съгласно метод описан от

T. Bitter, Analytical Biochemistry, (1962), 4, 330334. Този метод се базира на реакцията на гликозаминогликаните с карбазола в кисела среда на горещо, което предизвиква розово оцветяване пропорционално на количеството освободена уронова киселина.

За партида А, частично пречистеният продукт, получен в края на етап “г” и пречистеният продукт, получен в края на последния етап, се съдържат респективно уронова киселина 1,3 и 2,1 pmole/mg.

За партида В пречистеният продукт в края на последния етап има съдържание на уронова киселина 2,1 pmol/mg.

Спектрофотометричен анализ в ултравиолетовата и видимата област

Пречистеният продукт (партида А) се разтваря в ултрачиста вода и полученият разтвор (С=1 мг/мл) се поставя в кювета с оптичен път 1 см. Абсорбционният спектър се регистрира в областа между 200 и 600 нм.

Полученият спектър позволява да се твърди на базата на абсорбцията при 256 нм, че партидата А съдържа по-малко от 1 % ADN.

Определяне на общото съдържание на протеини.

Комплектът “protein assay” (протеинов тест) търговски продукт на “Biorad” се използва за определяне на общото съдържание на протеини. Методът на определяне се базира на факта, че дължината на вълната на максималната абсорбция на киселия разтвор на брилянтно синьо на Coomassie g-250 се премества от 465 нм на 595 нм, когато протеините са се фиксирали (Reisner et al., Anal., Biochem, (1975), 64, 509).

Общото количество протеини в партида А е по-ниско от 1,5 %.

Определяне на свободните аминогрупи. (NH₂)

Това определяне се провежда съгласно метод, описан от Zenasku Yosizawa et al., Biochemica et Biophysica Acta, (1967), 141, 358365).

Параметърът количество NH₂ (изразен в pmol/mg) е индикатор на количеството на деацетилираните Р-Ц-глюкуронил-1,4-a-N-apeтил-О-глюкозаминил-(1,4) звена и на замърсителите, които съдържат свободна аминогрупа.

Всяка от партидите А и В съдържат 0,05 pmol/mg NH_r Отношението между NH₂ и глюкуронова киселина е 0,05:2,1 и е по-ниско от 2,5 %. На 100 остатъка Р-Ц-глюкуронил1,4-а-М-ацетИл-О-глюкозаминил-(1,4) се падат по-малко от 2,5 дизахаридни остатъка от този деацетилиран тип (в молове).

Пример 2

Получаване на N-ацетилхепарозан в поголямата си част с ниска молекулна маса (метод II).

1) Отглеждане на бактериен вид Escherichia coli (К5) и отделяне на филтрат, съдържащ N-ацетилхепарозан.

Отглеждането на вида Escherichia coli SEBR 3282 и отделянето на филтрат, съдържащ N-ацетилхепарозан, се провеждат съгласно метода, описан в пример 1.

2) Изолиране и пречистване на N-ацетилхепарозан в по-голямата си част с ниска молекулна маса.

Етап а-Диализа

375 мл от филтрата се подлагат на диализа съгласно метод, описан в пример 1, [2) изолиране и пречистване на N-ацетилхепарозан в по-голямата си част с ниска молекулна маса, Етап б]. След диализата се получават около 1020 мл пречистен разтвор.

Етап б-Пречистване в кисела среда.

Към диализирания разтвор се добавя адекватно количество 5N разтвор на HCI така, че да се получи рН 3,5. Образуваната утайка се отделя чрез центрофугиране, след това разтворът се подкиселява със същата киселина (5N HCI), така че да се получи рН 1,8. Възможно е образуването на утайка, която се отделя чрез центрофугиране. След това разтворът се неутрализира с 5N разтвор на NaOH.

Етап в-Утаяване, дехидратиране и сушене.

Към неутрализирания разтвор се добавя адекватно количество натриев хлорид така, че да се получи 0,5 М разтвор на NaCl и след това се добавят 4 обема етанол. След това се оставя в продължение на 5 мин при стайна температура така, че да се образува утайка. Центрофугира се до 5000 г в продължение на 20 мин. Утайката от центрофугирането се поставя в етанол, получената суспензия се разбърква и се оставя в продължение на 1 час при стайна температура, за да се утаи. Центрофугирането и суспендирането се повтарят. Отново се центрофугира до 5000 г в продължение на 20 мин. Утайката от центрофугирането се суши във вакуум-сушилня при 40°С в продължение на 24 часа.

Етап г - Алкална хидролиза и диализа. Полученият в предишния етап продукт след сушене се превръща в 2,5%-ен (тегло/ обем) разтвор в 0,25 N разтвор на NaOH. Така полученият разтвор се държи в продължение на 2 часа при 50°С. След това се неутрализира с 5N разтвор на HCI и разтворът, съдържащ полизахариди, се подлага на диализа съгласно метода, описан в пример 1, [2) изолиране и пречистване на N-ацетилхепарозан в по-голямата си част с ниска молекулна маса , Етап б]. След диализата се получават около 990 мл разтвор.

Етап д - Анионобменна хроматография.

Към диализирания разтвор се добавят адекватни количества пиперазин, EDTA u triton Х-100 (Prolabo^R) така, че да се получат респективно концентрации 25 мМ пиперазин, EDTA и 0,2 % (обем/обем/) triton Х-100. След това pH се довежда до 3,5 с помощта на 5N HCL. Този разтвор се отлага във високоскоростна хроматографска колона с Q-Sepherose от 400 мл, доведена до равновесие с буфер на пиперазин със съдържание 25 mM пиперазин, 2 mM EDTA и 0,2 mM triton Х-100 (рН=3,5). Промива се с пиперазинов буфер и се елуира с разтвор на 0,5 М NaCI, утаява се с 4 обема етанол. Суши се под вакуум при 40°С. Така се получават около 9,58 г N-ацетилхепарозан.

Етап е - Ексклузионна хроматография.

г от получения в предишния етап продукт се разтварят в 60 мл буферен разтвор, съдържащ 20 mM HCI с pH 7,5 и 1 М NaCI, след това се прекарва през колона с 200 мл Sepharose* предварително доведена в равновесие със същия буфер. Към незадържаната фракция се добавят 4 обема етанол. Образуваната утайка се промива и се суши при 40°С под вакуум.

Така се получават 3,90 г N-ацетилхепарозан.

3) Характеризиране на N-ацетилхепарозана, получен след отделните етапи на пречистване.

Спектър от ядреномагнитния резонанс (ЯМР).

Изучаването на протонния и ^|3С ЯМР спектрите на получения N-ацетилхепарозан потвърждават химическата идентичност на продукта с N-ацетилхепарозана, описан в W. Е. Vann, Eur. J. Biochem., (1981), 116, 59-364.

Определяне на разпределението по молекулна маса чрез ексклузионна хроматография.

Разпределянето по молекулна маса се определя чрез ексклузионна високо ефективна течна хроматография съгласно метода, използван при определяне на разпределението по молекулна маса на N-ацетилхепарозаните, описани в пример 1. Тегловната фракция, равна на поне 86 % от веригите, която съставя утайката след центрофугиране при пример 2, притежава молекулна маса между 1500 и 15000 Da.

Определяне на уроновите киселини.

N-ацетилхепарозанът, получен след етап “е”, има съдържание на уронова киселина

1,94 μπιοΐ/mg.

Спектрофотометричен анализ в ултравиолетовата и видимата област.

Полученият спектър позволява да се докаже, че полученият N-ацетилхепарозан съдържа по-малко от 1 % ADN.

Определяне на общото съдържание на протеини.

Общото съдържание на протеини в тази утайка на N-ацетилхепарозан е по-малка от 1 %.

Определяне на свободни аминогрупи (NH₂).

Количеството на свободни NH₂ групи е по-малко от 0,1 pmol/mg.

Пример 3.

Получаване на N-ацетилхепарозан в поголямата си част с ниска молекулна маса (метод III).

1) Отглеждане на бактериен вид Escherichia coli (К5).

Отглеждането на вида Esdherichia coli 3282 се провежда съгласно метода, описан в пример 1.

2) Предварително пречистване.

Етап а - Центрофугиране.

В края на отглеждането получената суспензия се центрофугира (12л) при 8000 об/ мин (или между 11000 и 14000 г) в продължение на 20 мин.

Етап б - Поставяне в контакт с алкален разтвор.След центрофугирането утайката се отделя и останалото се поставя в контакт с 0,1 N разтвор на NaOH за около 1 час.

Етап в - Предварително филтриране.

Полученият в предишния етап разтвор се подлага на предварително пречистване през филтър ЗМ* серия 300 от полипропилен.

Етап г - Концентриране през мембрана с дефинирани пори.

Полученият в етап “в” филтрат се пречиства през филтърен патрон от стъклени нишки (шотов) Amicon^R, е големина на порите 10000 Da или еквивалентен. Така се получава разтвор, обогатен на N-ацетилхепарозан с ниска молекулна маса.

Етап д - Диализа.

Обогатеният разтвор на N-ацетилхепарозан с ниска молекулна маса се диализира срещу ултрачиста вода също през системата Amicon” при много повишен фактор на разреждане (>10000).

3) Изолиране и пречистване на N-ацетилхепарозан в по-голямата си част с ниска молекулна маса.

Работи се, както в пример 1 [2) Изолиране и пречистване на N-ацетилхепарозан в по-голямата си част с ниска молекулна маса , Етап “в”-Етап “е”], като се получава N-ацетилхепарозан с характеристики, подобни на партида А или както е казано в пример 2 [2) Изолиране и пречистване на N-ацетилхепарозан в по-голямата си част с ниска молекулна маса, Етап “а”-Етап “е”].

Ν,Ο-сулфатирани хепарозани.

Пример 4.

Химична модификация на N-ацетилхепарозан в по-голямата си част с ниска молекулна маса, получен в пример 1.

1) Химична модификация на партида В. Етап а. Частично деацетилиране.

500 мг от партида В се разтварят в 10 мл IN NaOH. Разтворът се нагрява до 50°С и при тази температура и при разбъркване в продължение на 8 часа се провежда реакцията. Разтворът се неутрализира с 2N разтвор на HCI, диализира се срещу ултрачиста вода и след това се лиофилизира.

Етап б. Получаване на тетрабутиламониевата сол.

Лиофилизатът се поставя в 200 мл ултрачиста вода. Полученият разтвор се прекарва през йонообменна колона на базата на омрежен с дивинилбензол полистирол (Dowex 50 W 8, Dow Chemical^R), предварително кондиционирана в кисела среда така, че да се регенерира киселата форма на продукта. След това разтворът се смесва с 0,4 мл 40 %-ен разтвор на тетрабутиламоний и се лиофилизира.

Етап в. Частично Ν,Ο-сулфатиране.

421 мг от получената в предишния етап сол се разтварят в 35 мл диметилформамид и се добавят 3,71 г комплекс серен триокис-пиридин (търговски продукт на Aldrich* № S755-

6). Взаимодействието протича в продължение на 6 часа при стайна температура. Към един обем от реакционната среда се добавя NaCl до получаването на разтвор с концентрация 0,33 М NaCl и след това-два обема етанол. Образува се утайка. Центрофугира се и се отделя горният слой. Утайката от центрофугирането се поставя в 0,5 М NaCl и се неутрализира. След това се добавят два обема етанол. Оставя се да се образува утайка, центрофугира се и утайката от центрофугирането се поставя в ултрачиста вода. Диализира се срещу ултрачиста вода и се лиофилизира.

Описаните в по-горния параграф операции се повтарят.

Полученият лиофилизат притежава следните характеристики:

* количество на уронова киселина: 1,11 pmol/ mg * количество на свободни NH₂: 0,01 pmol/ mg * степен на сулфатиране : 2,64 на захариден остатък

Количеството на уроновата киселина и NH₂ са определени, както е описано в пример 1.

Степента на сулфатиране (отношението сулфат/карбоксил) представлява средна стойност на сулфатните групи на една карбоксилна група. Тя е определена чрез кондуктометричен метод за определяне на сулфатни и карбоксилни групи, описан от В. Casu et al., dans Carbohydrate Research, (1975), 39, 168-176.

2) Химични модификации на партида A. Партида А се разделя на три аликвотни фракции, наречени А_р А₂ и А₃.

Етап а. Частично деацетилиране и гелфилтриране.

Партиди А , А₂ и А₃ се обработват, както е описано в етап А за партида В по-горе, с тази разлика, че само партида А! се диализира и лиофилизира. След това партиди А_р А₂ и А₃ се фракционират чрез гелфилтрация (наречена също така гелпроникваща хроматография или ексклузионна хроматография) при следните условия:

Носител от сфери с диаметър 25 до 75 pm на базата на алилдекстран омрежен с Ν,Ν'-метилен-бис-акриламид (Sephacryl S 300

HR търговски продукт на Pharmacia^R). Елуент: 0,5 М разтвор на натриев хлорид.

Приготвят се смеси на съответните фракции, отговарящи на един Kav от 0,46 до 1 за хепарозана от партида А_р 0,43 до 1 за хепарозана от А₂ и 0,43 до 0,64 за хепарозана от А₃. Тези фракции се наричат по-нататък “гелфилтрувани хепарозани.

Kav е коефициент, който обикновено се използва при ексклузионната хроматография и позволява да се възпроизведе фракционирането чрез ексклузионна хроматография. Той се дефинира с формулата:

Ve - Vt Kav -------Vo-Vt в която Ve означава обем на елуиране на съответната фракция; Vo-ексклузионен обем и Vt-общ обем на гела.

Разпределението по молекулна маса на хепарозана от партида Aj веднага след частичното деацетилиране, както и гелфилтруваните хепарозани от партиди А_р А₂ и А, е оп5 ределено чрез ексклузионна хроматография съгласно техниката, описана в пример 1.

Получените профили на елуиране преди и след гелфилтрирането за хепарозана от партида А, са представени съответно на фиг.2 10 и 3. Някои от резултатите на тези профили са представени в таблица 3 по-долу, в която РМо представлява молекулната маса, например 1 тегл. % от продукта с молекулна маса повисока от РМо, PMj представлява молекулна15 та маса, например тегловна фракция от 10 % от продукта с молекулна маса по-голяма от РМ_р РМ₃ е молекулната маса, например тегловна фракция от 10 % с молекулна маса пониска от РМ₃, РМ₂ е молекулната маса, отговаряща на максимална абсорбция.

Таблица 3

Разпределение по молекулна маса на хепарозана от партида Aj (нефилтрувани през гел) и гелфилтруваните хепарозани от партиди А_р А₂ и А₃

	РМ0	РМ,	РМ2	рм3
Нефилтруван през гел хепарозан А]	41400	9600	4400	1400
Гелфилтруван хепарозан А(	10700	6900	4400	1600
Гелфилтруван хепарозан А2	12700	7000	4500	1500
Гелфилтруван хепарозан А3	10300	6900	4500	1500

При сравнение на фигури 2 и 3 се установява, че гелфилтруването позволява елиминирането на малката фракция от хепарозан с висока молекулна маса.

Резултатите от таблица 3 ясно показват силно понижение на РМо в резултат на гелфилтруването. Хепарозанът от всяка партида съдържа поне 90 % мас.вериги с молекулна маса по-ниска от 7000 Da.

Гелфилтруваните хепарозани от партидите А, и А₂ след това се обработват, както е описано в пример 1 [2) изолиране и пречистване на N-ацетилхепарозан в по-голямата си част с ниска молекулна маса, Етап в].

Гелфилтруваният хепарозан от партида

А₃ не се утаява, но се диализира срещу ултрачиста вода.

Количеството на уроновата киселина и свободните аминогрупи се определят, както е описано в пример 1.

Получените резултати са представени в следващата по-долу таблица 4. Изчислено е, че количеството на остатъчните ацетилни групи включва както глюкуронилни, така и глюкозаминилови групи.

Степента на деацетилиране, изчислена като отношение на количеството на свободните аминогрупи към количеството на уроновата киселина.

Спектър от ядрен магнитен резонанс.

Анализът на ЯМР протонния спектър, получен за гслфилтрувания хепарозан от партида АЗ, позволява да се установи, че продуктът притежава очакваната структура.

Степента на деацетилиране, изчислена чрез интегриране, е 44 %. Тази стойност с близка до изчислената, когато се използва отношението на количеството на свободните аминогрупи към количеството на уроновата кисели 5 на (41 %).

Таблица 4

Характеристики на гелфилтруваните хепарозани от партиди А₍, А₂ и А₃

	Уронова киселина (pmol/mg)	NH2rpynH (pmol/mg)	Изчислени ацетилни гр. (pmol/mg)	Степен на деацетилиране
Г елфилтруван хепарозан А!	2,3	1,10	1,20	48 %
Гелфилтруван хепарозан А2	2,4	1,00	1,40	42 %
Гелфилтруван хепарозан А3	2,6	1,05	1,55	41 %

Етап б - Частично Ν,Ο-сулфатиране.

Гелфилтруваните деацетилирани хепарозани от партиди Al, А2 и АЗ се обработват по същия начин, както е описано за партида В ^0 (етап в частично Ν,Ο-сулфатиране) с тази разлика, че операциите,описани в първия параграф, не се повтарят.

Хепарозанът от партида АЗ, след предварително утаяване, се поставя в ултрачиста вода, диализира се срещу ултрачиста вода и се оставя в разтвор.

Характеристиките на Ν,Ο-сулфатираните продукти са представени в таблица 5 подолу:

Таблица 5

Характеристики на Ν,Ο-сулфатираните хепарозани от партиди А_р А₂ и А₃ след частичното Ν,Ο-сулфатиране

	NH2 групи ( μ mol/mg)	Степен на сулфатиране отн. сулфат/карбоксил
Ν,Ο-сулфатиран хепарозан от партида А!	0,10	1,9
Ν,Ο-сулфатиран хепарозан от партида А2	0,1	1,9
Ν,Ο-сулфатиран хепарозан от партида А3	0,10	1,8

След реакцията на Ν,Ο-сулфатирането, количеството на остатъчните NH, групи (0,10 pmol/mg) е по-високо от това в пречистените N-ацетилхспарозани (0,05pmol/mg). Сулфатирането по азотен атом е непълно.

Етап в - Пълно N-сулфатиране.

В 20 мл ултрачиста вода се смесват на грам Ν,Ο-сулфатиран продукт, 1 тегл.ч. N,0сулфатиран продукт, 1 тегл.ч. натриев бикарбонат, 1 тегл.ч. комплекс на серен триокис-триметиламин и се оставя да взаимодейства при 55°С при разбъркване в продължение на 20 часа. След това реакционната смес се разрежда (степен на разреждане 10) и се довежда до проводимост на получения разтвор, равна на тази на 0,5 М разтвор на натриев хлорид. Следва ута10 яване чрез добавяне на 2 обема етанол, центрофугиране, въвеждане в 0,5 М разтвор на натриев хлорид и второ утаяване чрез добавяне на 2 обема етанол. След поставяне в ултрачиста вода 5 и диализа срещу ултрачиста вода продуктите се лиофилизират и сушат под вакуум при 40°С.

ЯМР - спектър.

Изучаването на ^|3С ЯМР на Ν,Ο-сулфатирания хепарозан от партида АЗ показва, че алкохолът в положение 6 на глюкозаминиловата група е изцяло под формата на сернокисел естер.

Някои от характеристиките на получените Ν,Ο-сулфатирани хепарозани, определени съгласно методите описани по-горе, са представени в табл.6 по-долу:

Таблица 6

Характеристики на продуктите, получени след пълното N-сулфатиране на А_р А₂ и А₃

	Уронова киселина (pmol/mg)	NH2 rp. (μπαοί / mg)	Степен на деацетилиране	Степен на сулфатиране сулф/карб
Ν,Ο-сулфатиран хепарозан А,	1,20	0,02	48 %	2,2
Ν,Ο-сулфатиран хепарозан А2	1,30	0,02	42 %	2,2
Ν,Ο-сулфатиран хепарозан А3	1,35	0,02	41 %	2,1

Количеството на остатъчните NH₂ групи (0,02 цто1/mg) е малко и по-ниско от това в пречистения N-ацетилхепарозан (0,05 pmol/mg за партида А и партида В) както и от това в получения след частична Ν,Ο-сулфатация Ν,Ο-сулфатиран хепарозан (показано в табл.5). Това показва пълното протичане на N-сулфатирането.

Разпределението по молекулна маса на получените след N-сулфатирането продукти е анализирано по начина, описан в пример 1.

Полученият профил на елуиране за продукта от партида А1 е представен на фиг.4. Много подобни профили на елуиране са получени за продуктите А2 и АЗ.

Някои от резултатите, отчетени от профилите на елуиране, са представени в таблица 7. Дефинициите за РМо, РМ1, РМ2 и РМЗ са идентични с посочените за табл. 3.

Таблица 7

Разпределение по молекулни маси на продуктите, получени след пълното N-сулфатиране за А , А и А₃

	РМ„	РМ,	РМ2	РМ3
Партида At	14 700	9 000	5 700	2 600
Партида А2	17 500	10000	5 800	3 400
Партида А3	11 600	7 600	5 000	1 800

Ν,Ο-сулфатираните хепарозани от всяка партида съдържат поне 90 % мас. вериги с молекулна маса по-ниска от 10000 Da.

Партидите Al, А2 и АЗ съдържат 80 % вериги с молекулна маса, респективно между 2600 и 9000 Da, 3400 и 10000 Da и 1800 и 7600 Da.

Пример 5.

Химични модификации на N-ацетилхепарозан в по-голямата си част с ниска молекулна маса, получен в пример 2. Получаване на Ν,Ο-сулфатирани хепарозани, N-деацетилирани до 80 % производни.

Използваният N-ацетилхепарозан се получава съгласно метода, описан в пример 2. Количеството на уронова киселина в този продукт е 2,12 pmol/mg. Определянето на разпределението по молекулна маса се извършва с ексклузионна хроматография съгласно метода, описан в пример 1. Тегловна фракция, равна на поне 87,5 % притежава вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da. Главният пик на разпределението е около 4900 Da. Тази партида N-ацетилхепарозан се нарича партида С.

Етап а - Частично деацетилиране.

2,5 г от партида “С” се разтварят в 50 мл 2N разтвор на NaOH. Разтворът се довежда до 50°С и реакцията протича при тази температура в продължение на 8 часа при разбъркване. pH се довежда до 8 с помощта на 2N разтвор на HCI, диализира се срещу ултрачиста вода и се лиофилизира.

Така се получават 1,96 г от продукта. Степен на N-деацетилиране.

Определянето на свободните аминогрупи (NH₂) показва, че N-ацетилхепарозанът е N-деацетилиран 80 %.

Етап б - N-сулфатиране.

Предишният лиофилизат се поставя в 70 мл вода и се добавят 2,5 г Na₂CO₃ и 2,5 г комплекс на серен триокис-триметиламин.

Оставя се да реагира в продължение на 20 часа при 55°С.

Проводимостта на този разтвор се довежда до тази на 0,5 М разтвор на NaCl чрез добавяне на деминерализирана вода. Утаява се 25 с 4 обема етанол. Центрофугира се. Утайката отново се разтваря в 0,5 М разтвор на NaCl, утаява се с 4 обема етанол и се центрофугира.

Утайката от центрофугирането се поставя в ултрачиста вода, разтворът се диализира, 30 както е описано по-горе (пример 1) и се лиофилизира. Получават се 2 г от продукта.

Етап в. Получаване на тетрабутиламониева сол.

Полученият в предишния етап лиофилизат се превръща в тетрабутиламониева сол съгласно метода, описан в пример 4 [1) химични модификации на партида “В”, Етап “б”]. Получават се 2,7 г от солта.

Етап г. О-сулфатиране.

2,680 г от получената в предишния етап сол се разтварят в 196 мл формамид и се добавят 13,27 г комплекс серен триокис-пиридин. Оставя се реакцията да протече в продължение на 6 часа при 30°С. Добавя се 1 обем 2М разтвор на NaCl на 5 обема реакционен разтвор и pH се довежда до 7 с разтвор на NaOH. Преутаява се с два обема етанол, центрофугира се и утайката от центрофугирането отново се разтваря в 0,5 М разтвор на NaCl. След това се добавят 2 обема етанол. Оставя се да се образува утайка, центрофугира се и утайката от центрофугирането се отделя с 80 мл ултра20 чиста вода. Добавят сс 20 мл 2М разтвор на NaCl, след това 4 обема етанол. Оставя се да се образува утайка и сс центрофугира.

Етап д. Гелфилтруване.

Полученият в етап “г” продукт се поставя в ултрачиста вода и след това се фракционира чрез гелфилтруване, съгласно условията, описани в пример 4 [2) химични модификации на партида А, етап а]. Определя се молекулната маса на веригите, които изграждат N,0сулфатирания хепарозан чрез ексклузионна хроматография съгласно метода, описан в пример 1. Събират се в групи от една страна фракциите, съдържащи вериги с молекулни маси между 1500 и 12000 Da [Разтвор С(А)] и от друга страна фракциите, съдържащи Ν,Οсулфатирани хепарозани с вериги с молекулна маса от 2000 до 30000 Da [Разтвор С (М) J.

Към разтвор С (А) сс добавят 4 обема етанол. Оставя се да се утаи, центрофугира се и остатъкът от центрофугирането се поставя в ултрачиста вода. Диализира се срещу ултрачиста вода и се лиофилизира. Получава се 1,8 г от продукта.

Така полученият Ν,Ο-сулфатиран хепарозан е наречен партида С.

Някои характеристики на този Ν,Ο-сулфатиран хепарозан, определени съгласно методите, описани по-горе, са представени в таблица 8

Таблица 8

Характеристики на продуктите, отговарящи на партида С₁

	Уронова киселина (pmol/mg)	NH2 гр. (pmol/mg)	Степен на деацетилиране	Степен на сулфатиране сулф/карб
Партида Cj	1,6	0,013	80 %	1,9
Партида С	1,6	0,013	80 %	1,9

Разпределението по молекулна маса на продукта е определено съгласно техниката, описана в пример 1. Някои от резултатите, произхождащи от профила на елуирането, са представени в таблица 9.

Таблица 9

Разпределение по молекулни маси на продуктите, отговарящи на партида С,

	РМв	РМ,	РМ2	РМ3
Партида С,	9600	7200	5621	2367

Дефинициите за РМ₀, РМ_р РМ₂ и РМ₃ са идентични с тези, дадени за таблица 3.

Ν,Ο-сулфатираните хепарозани от партида С1 съдържа 95 % мас.вериги между 1500 ³⁵ и 15000 Da.

ЯМР спектър.

Протонният и ¹³С ЯМР спектри са получени за Ν,Ο-сулфатиран хепарозан от партида С1 (спектър, реализиран с АМН 500, раз4θ творител D₂O).

Анализът на протонния и ^|3С ЯМР спектрите потвърждава очакваната структура на продукта. Той се отнася за Ν,Ο-сулфатиран хепарозан.

Изучаването на отношението на интензивностите на протоните в захарните остатъци и на протоните в ацетилните групи в протонния спектър водят до предполагаемата степен на деацетилиране 84 %. Тази стойност е 5θ близка до изчислената чрез използване на отношението на количеството на свободните аминогрупи и количеството на уроновата кисели21 на (80 %).

^|3С ЯМР спектърът потвърждава, че глюкозаминът е почти напълно N-сулфатиран. Dглюкуроновата киселина не е сулфатирана в положение 2 и 3.

Етап е. Гелфилтруване.

Към разтвор на С(М) се добавят 4 обема етанол. Оставя се да се образува утайка, центрофугира се и остатъкът от центрофугирането се поставя в ултрачиста вода, диализира се и се лиофилизира.

След това лиофилизатът се разтваря в 0,5 М разтвор на NaCl и се фракционира чрез гелфилтруване съгласно условията, дефинирани в етап “д”.

В една група се поставят фракциите, съдържащи вериги с молекулна маса между 1300 5 и 21000 Da [разтвор С(В> J и в друга група тези с 14000 до 37000 Da [разтвор С(С) J.

Тези два разтвора се обработват, както е описано по-горе за разтвор С(А) и чрез лиофилизация от разтвор С(В) се получава пар10 тида С2. а от разтвор С(С) партида СЗ.

Таблица 10 показва някои резултати за продуктите от партиди С2 и СЗ.

Таблица 10

Разпределение по молекулни маси на продуктите, отговарящи на партиди С, и С₃

	PMfl	РМ,	РМ2	РМ3
Партида С2	14 600	9 600	7 597	5 950
Партида С3	28 656	17 320	10 512	7 975

Дефинициите за ΡΜθ, РМ_р РМ₂ и РМ₃ са идентични с тези, дадени за таблица 3.

Ν,Ο-сулфатираният хепарозан от партида С2 съдържа около 99 % мас. вериги между 1500 и 15000 Da, а Ν,Ο-сулфатираният хепарозан от партида СЗ съдържа около 73 % мас. вериги между 1500 и 15000 Da.

Пример 6.

Химични модификации на N-ацетилхепарозан в по-голямата си част с ниска молекулна маса, получен в пример 2. Получаване на Ν,Ο-сулфатиран хепарозан; 40 % N-деацетилирано производно със степен на сулфатиране 2,6.

Изходният N-ацетилхепарозан се получава съгласно метода, описан в пример 2. Количеството уронова киселина в този продукт е 1,96 pmol/mg. Тази партида се нарича партида D.

Етап а. Частично деацетилиране.

3,7 г от партида D се разтваря в 74 мл IN NaOH и се обработва съгласно метода, описан в пример 5 (етап “а”). Деацетилирането се провежда под азот.

След лиофилизиране се получават 2,91 г ₃₀ продукт.

Степен на N-деацетилиране.

Определянето на свободните аминогрупи (NH₂) на получения след лиофилизацията продукт показва, че N-ацетилхепарозанът е N-деацетилиран 40 %.

Етап б. N-сулфатиране.

Полученият в предишния етап продукт се обработва с 3,7 г комплекс серен триокис триметиламин в присъствие на 3,7 г Na₂CO₃ и съгласно метода, описан в пример 5 (етап б).

Така се получават около 3 г N-сулфатиран хепарозан.

Етап в. Получаване на тетрабутиламониева сол.

Около 2 г от получения N-сулфатиран хепарозан в предишния етап се превръщат съгласно метода, описан в пример 5, (етап в) в тетрабутиламониева сол. Получава се 2,99 г лиофилизат.

Етап г. О-сулфатиране.

2,98 г от получената в предишния етап сол взаимодействат с 14 г комплекс серен три22 окис-тримстиламин, съгласно метода, описан в пример 5 ( етап “г”). След това сс утаява и пречиства, както е описано в пример 5 (етап “г”). Получава сс 2,8 г продукт.

Етап д. Гелфилтруване.

Полученият в предишния етап продукт се фракционира чрез гелфилтруване, като се използва метод описан в пример 4 (2) Химични модификации на партида А, етап а].

Разпределението по молекулна маса на фракциите на Ν,Ο-сулфатирания хепарозан се определя чрез ексклузионна хроматография съгласно метода, описан в пример 1. Фрак-циите, съставени от Ν,Ο-сулфатирани хепаро-зани, чиито вериги в по-голямата си част са с молекулна маса между 1500 и 15000 Da, се отделят.

Тези фракции след това се концентрират и се подлагат на диализа срещу ултрачиста вода. След това се провежда утаяване чрез добавяне на 5 обема етанол, центрофугира се, утайката се разтваря в 0,5 М разтвор на NaCl и операцията по утаяването се повтаря.

Така полученият пречистен продукт сс подлага на повторно фракциониране по същия начин, както е описано по-горе. Разпреде5 лението по молекулна маса на фракциите е определено чрез ексклузионна хроматография съгласно описания по-горе метод. Отделят се фракциите, съдържащи продукти с молекулна маса между 4000 и 8000 Da.

Фракциите се подлагат на диализа, след това продуктите се утаяват чрез добавяне на етанол. Утайката се отделя и се разтваря в 0,5 М разтвор на NaCl. Така полученият разтвор се диализира срещу ултрачиста вода и се 15 лиофилизира.

Получава се около 1 г Ν,Ο-сулфатиран хепарозан, наречен партида D1.

Характеристиките и разпределението по молекулна маса на този Ν,Ο-сулфатиран хепа20 розан са представени съответно в таблици 11 и

12.

Таблица 11

Характеристики на продуктите, отговарящи на партида D_t

	Уронова киселина (gmol/mg)	NH2rp. (pmol/mg)	Степен на деацетилиране	Степен на сулфатиране сулф/карб
Партида D1	1,53	0,01	40 %	2,60

Таблица 12

Разпределение по молекулни маси на продуктите, отговарящи на партида D,

	РМ0	РМ,	РМ2	РМ3
Партида D,	15 430	10 350	6 850	4 047

Дефинициите за РМ₀, РМ_р РМ₂ и РМ₃ са идентични с тези, дадени за таблица 3.

Ν,Ο-сулфатираният хепарозан от партида D1 съдържа около 80 % мас.вериги меж50 ду 4047 и 10350 Da, и около 98,5 % мас. от тях имат молекулна маса между 1500 и 14600 Da. На фиг.5 са представени профилите на елуиране за този Ν,Ο-сулфатиран хепарозан.

ЯМР спектър.

Протоннпят и ¹³С ЯМР спектри са получени за Ν,Ο-сулфатиран хепарозан от партида D1 (спектър реализиран с АМХ 500, разтворител D₂O).

Анализът на протонния и ¹³С ЯМР спектрите потвърждава очакваната структура на продукта. Той се отнася за Ν,Ο-сулфатиран хепарозан.

^|3С ЯМР спектърът потвърждава, че нито една аминогрупа от глюкозаминовото звено не е под формата на свободна аминогрупа (NH₂). Глюкозаминът е напълно сулфатиран в положение С6 и обратно- всички хидроксигрупи на глюкуроновата киселина не са сулфатирани.

Пример 7.

Химични модификации на N-ацетилхепарозан в по-голямата си част с ниска молекулна маса, получен в пример 2-Получаване на Ν,Ο-сулфатиран хепарозан; 40 % N-деацетилирано производно със степен на сулфатиране 3.

Изходният N-ацетилхепарозан се получава съгласно метода, описан в пример 2. Количеството уронова киселина в този продукт е 2 pmol/mg. Тази партида се нарича партида Е.

Разпределението по молекулна маса на този N-ацетилхепарозан е изчислено по начина, описан в пример 1. Този N-ацетилхепарозан съдържа около 75 % мас.вериги между 1500 и 15000 Da и средната молекулна маса на тези вериги е около 10000 Da. По-голямата част от продукта е с молекулна маса 5135 Da.

Етап а. Частично деацетилиране.

N-ацетилхепарозанът се N-деацетилира 40 % по начина, описан в пример 6 (етап а). За осъществяване на това N-деацетилиране се използват 2,5 г от първичното вещество, които се разтварят в 50 мл IN NaOH. В края на реакцията рН на реакционната среда се довежда до 6 с помощта на HCI и след това се концентрира.

Степен на N-деацетилиране.

Определянето на свободните аминогрупи (NH₂) показва, че N-ацетилхепарозанът е N-деацетилиран 40 %.

Етап б. Гелфил груване.

Използва са колона със Sephacryl S 300 HR (5 cm х 100 cm), обработена c 0,5 M NaCl.

Разпределението по молекулна маса на хепарозана, съдържащ се в отделните фракции, се определя чрез ексклузионна хроматография.

Групират се фракциите, съдържащи вериги с молекулна маса между 6000 и 20000 Da, концентрира се с Rotavapor, утаява се с 4 обема етанол и получената утайка се суши. Така се получава около 1 г продукт.

Етап в. Получаване на тетрабутиламониевата сол и частично Ν,Ο-сулфатиране.

За получаване на тетрабутиламониевата сол се използва 300 мг от продукта, получен в предишния етап, и се прилага методът, описан в пример 4 (1) Химични модификации на партида В, Етап б]. Получават се 490 мг от солта, която се разтваря в 30 мл формамид. След това се провежда частично Ν,Οсулфатиране, описано в пример 4 [1) Химични модификации на партида В, Етап в-първи параграф] .

Излизайки от 490 мг от солта, която взаимодейства с 2,25 г комплекс серен триокиспиридин, се получават 406 мг Ν,Ο-сулфатиран хепарозан.

Етап г. Пълно N-сулфатиране и гелфилтруване.

372 мг от получения в предишния етап продукт се разтварят в 15 мл 5 %-ен разтвор на Na₂CO₃ и се обработва с 372 мг комплекс серен триокис-триметиламин, съгласно метода, описан в пример 4 (2) Химични модификации на партида А, етап в].

Продуктът, получен след пълното Nсулфатиране, след това се фракционира чрез гелфилтруване, като се използва колона със Sephacryl S 300 HR (2,5 cm х 100 cm), работейки както е описано по-горе.

Фракциите с молекулна маса между 6000 и 20000 Da се отделят, концентрират се с Rotavapor, диализират се екстензивно срещу студена ултрачиста вода и се лиофилизират.

Така се получават 260 мг Ν,Ο-сулфатиран хепарозан, наречен партида Е1.

Характеристиките на този продукт са представени в таблица 13.

Таблица 14 показва разпределението по молекулна маса на веригите, които съставят партида Е1.

Този Ν,Ο-сулфатиран хепарозан съдържа около 75 % мас.вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da и около 65 % мас. вериги с молекулна маса между 7700 и 15000 Da.

Таблица 13

Характеристики на продукта, отговарящ на партида Е,

	Уронова киселина ( mol/mg)	NH2 rp. ( mol/mg)	Степен на деацетилиране	Степен на сулфатиране сулф/карб
Партида Е,	1,35	0,01	40 %	3,00

Таблица 14

Разпределение по молекулни маси на продукта, отговарящ на партида Е,

	РМ0	РМ,	РМ2	рм3
Партида Е!	31 238	19 671	12 029	7 748

Дефинициите за РМ₀, РМ_р РМ₂ и РМ₃ са идентични с тези, дадени за таблица 3.

Пример 8. Получаване на две партиди Ν,Ο-сулфатиран хепарозан; N-деацетилирани производни 80 %, със степен на сулфатиране

2,25 и 2,24.

Използваното изходно вещество, партида F, е партида от N-ацетилхепарозан, получен съгласно метода, описан в пример 2.

Определянето на разпределението по молекулна маса на веригите, които изграждат това съединение, се провежда чрез ексклузионна хроматография съгласно метода, описан в пример 1.

Анализът на профила позволява да се установи, че партида F съдържа 92 % мас. вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da.

Главният пик е разположен около 4800 Da. Тегловна фракция от партида F, равна на поне 80 %, притежава молекулна маса между 2400 и 10000 Da.

Количеството уронова киселина в този продукт е 2,4 pmol/mg.

Етап а. Частично деацетилиране.

Работи се, както е описано в пример 5 (етап а), като се използват 2,5 г от партида F и 50 мл 2N NaOH. Получават се 1,6 г продукт N-деацетилиран 80 %.

Степента на N-деацелиране се определя по количеството на свободните аминогрупи.

Етапи б и в. N-сулфатиране и получаване на тетрабутиламониевата сол.

Тези два етапа са идентични на етапи “б и в”, описани в пример 5.

Получават се 4,7 г от тетрабутиламониевата сол.

Етап г. О-Сулфатиране.

2,9 г от получената по-горе сол се разтварят в 290 мл формамид и се добавя 17,4 г комплекс серен триокис-пиридин.

Работи се, както е описано в етап “г” на пример 5.

Получената след второто центрофугиране утайка се разтваря в ултрапречистена вода, диализира се срещу ултрапречистена вода и се лиофилизира. Така се получава 3,8 г продукт.

Етап д. Гелфилтруване.

Полученият в предишния етап продукт се разтваря в 0,5 М разтвор на NaCl, след това се пропуска през колона със Sephacryl S 300 HR, обработена е 0,5 М NaCl. Елуентът се събира е фракционен колектор.

Фракциите е молекулна маса между 1400 и 10000 Da се отделят и концентрират е Rotavapor. Утаява се е 4 обема етанол, центрофугира се, утайката се поставя в ултрачиста вода и полученият разтвор се диализира екстензивно срещу ултрачиста вода, лиофилизира се и се суши.

Така се получават 1,6 г Ν,Ο-сулфатиран хепарозан, наречен партида F1.

Фракциите с молекулна маса между 5000 и 35000 Da се събират, концентрират се с Rotavapor и към получения разтвор се добавят 4 обема етанол, центрофугира се, утайката се поставя във вода, разтворът се диализира сре15 щу ултрачиста вода и се лиофилизира. Лиофилизатът се подлага на ново фракциониране по същия начин, както и в началото на този етап. Разпределението по молекулна маса на 5 отделните фракции се определя чрез ексклузионна хроматография съгласно метода, описан в пример 1. Фракциите, които съдържат Ν,Ο-сулфатиран хепарозан с молекулна маса между 2000 и 26000 Da, се отделят. Утаява се с 4 обема 10 етанол, центрофугира се и утайката се разтваря отново в дестилирана вода, диализира се и се лиофилизира. Така се получават 0,6 г Ν,Οсулфатиран хепарозан, наречен партида F2.

Характеристиките на партиди Fl u F2 са представени в таблица 15. Резултатите от профилите на елуиране са представени в таблица 16.

Таблица 15

Характеристики на продуктите, отговарящи на партиди F₍ u F₂

	Уронова киселина (pmol/mg)	NH2 rp. (pmol/mg)	Степен на деацетилиране	Степен на сулфатиране сулф/карб
Партида F,	1,58	<0,01	80 %	2,40
Партида F2	1,58	<0,01	80 %	2,25

Таблица 16

Разпределение по молекулни маси на продуктите от партиди F₁ u F₂

	рм0	РМ,	РМ2	РМ3
Партида F]	10 700	7 700	5 800	3 300
Партида F2	24 400	16 325	8 600	6 900

Дефинициите за РМ₀, РМ_р РМ₂ и РМ₃ са идентични с тези, дадени за таблица 3.

Ν,Ο-сулфатираният хепарозан от партида F1 съдържа около 99 % мас. вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da, а този от партида F2 съдържа около 84,6 % мас. вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da и около 70 % мас. вериги с молекулна маса между 6900 и 13500 Da.

ЯМР спектър. Протонният и ^|3С ЯМР спектри са получени за Ν,Ο-сулфатиран хепарозан от партида F1 (спектър реализиран с АМХ 500, разтворител D₂O).

Анализът на протонния спектър и поспециално на отношението на интензитетите на протоните в захарните звена към протоните на деацетилираните амини позволява да се предположи, че съдържанието на N-ацетили раните г.иокозаминови мотиви е около 20 %.

Анализът на ¹⁵С ЯМР спектъра потвърждава, че глюкозаминовия мотив е също N-сулфатиран. Глюкуроновата киселина в по-голямата си част от дизахаридните структури не е О-сулфатирана в положение 2 и 3.

Състави

Състав А

Получаване на N-ацетилхепарозан в по-голямата си част с високомолекулна маса (метод 1)

I) Отглеждане на вида Escherichia coli (К5) и отделяне на филтрат, съдържащ N-ацетилхепарозан

400 мл от среда D със състав, представен в таблица 12 по-долу, се посяват с вида Escherichia coli SEBR 3282 и се инкубира при разбъркване в продължение на 2 часа при 37°С.

Тази предварителна култура се прехвърля във ферментатор от 18,5 л, съдържащ 11 л среда със състав, представен подробно в таблица 12 по-долу, и се инкубира в продълже20 ние на 6,30 часа при 37°С и pH 7,2, като парциалното налягане на кислорода се поддържа 40 MMHg чрез регулиране на внасяния въздух (до 20 л/мин) и при разбъркване. Добавя се 5 глицерол, като се въвежда постепенно стерилен разтвор, съдържащ 500 г/л глицерол с дебит 18 г/ч в продължение на 16-17 часа.

Културата се оставя при същата температура, pH и парциално налягане на кислоро10 да до квази пълното изконсумиране на глицерола. Проследяването на DO (λ=600 нм) на суспензията на културата след завършването на добавянето на глицерола показва стационарно състояние или слабо лизиране до прекъсва15 не на растежа след 28-30 часа във ферментатора.

Бульонът с културата се охлажда до 25°С, след това се филтрува през мембрана с порьозност 0,22 pm. Така се получават около 12 л филтрат, съдържащ N-ацетилхепарозан предимно с висока молекулна маса.

Таблица 17

Състав и получаване на среда С и D

Среда С

В 900 мл ултрачиста вода последователно се разтварят:

NTA (нитрилтриоцетна киселина)	1000 мг
к2нро4	790 мг
Глутаминова киселина	11000 мг
MgCI2 6Н2О	500 мг
K2SO4	450 мг
FeSO4 7Н2О	18 мг
СаС12 2Н2О	2 мг
NaCl	500 мг
KCI	5000 мг
Олиго-елементен разтвор
(таблица II, пример 1)	1 мл
Глицерол	10000 мг

pH се довежда до 7,2 с калиева основа с плътност 1,38 и се допълва до 1000 мл с ултрачиста вода. Провежда се стерилно филтруване през мембрана с 0,2 pm.

Разтвор на глицерол г глицерол се разтварят в адекватно количество ултрачиста вода и обемът се довежда до 1000 мл със същия разтворител. Провежда се стерилно филтруване през мембрана 0,2 pm. Антипенителят, използван по време на ферментацията, е Struktol J 673 (Schill&Seilacher^R).

Среда D

Получаването на среда D е идентично на това за среда С, с тази разлика, че е добре да се добави буферът (рН=7,2>: 3-морфолинпропансулфонова киселина след добавяне на антипенителя.

2) Изолиране и пречистване на N-ацетилхепарозан, в по-голямата си част с висока молекулна маса.

N-ацетилхепарозанът, в по-голямата си част с висока молекулна маса, се изолира и пречиства съгласно метода, описан в пример 2 [2) Изолиране и пречистване на N-ацетилхепарозан, в по-голямата си част с ниска молекулна маса, етап “а”-етап “е”).

3) Охарактеризиране на получения Nацетилхепарозан.

Определяне на разпределението по молекулна маса чрез ексклузионна хроматография

Имайки пред вид реално използваните еталони, разпределението по молекулна маса е изчислено приблизително.

Полученият за този състав N-ацетилхепарозан е изграден от вериги с молекулни маси между 20000 и 500000 Da и средна молекулна маса между 100000 и 200000 Da.

Определяне на уроновите киселини

Количеството на уроновата киселина в пречистения продукт в крайния етап е 2,2 pmol/mg.

Спектрофотометрия във видимата и ултравиолетовата област

Полученият спектър позволява да се установи, че тази партида съдържа по-малко от 0,5 % ADN.

Определяне на общото съдържание на протеини

Общото съдържание на протеини е пониско от 0,5 %.

Определяне на свободни аминогрупи NH₂ Количеството на NH₂ е по-малко от 0,1 pmol/mg.

Състав Б

Получаване на N-ацетилхепарозан в поголямата си част с висока молекулна маса (метод 11)

1) Отглеждане на вида Escherichia coli SEBR 3282 се осъществява съгласно метода, описан в състав А. Получават се около 12 л от културата, съдържащи N-ацетилхепарозан с висока молекулна маса.

2) Предварително пречистване.

Работи се, както в пример 3 (2) Предварително пречистване ], като в етап “г” се използва филтрационен патрон от стъклени влакна Amicon^R с процепи 30000 Da или еквивалентен.

3) Изолиране и пречистване на N-ацстилхепарозан в по-голямата си част с висока молекулна маса.

Работи се, както е описано в пример 3 [3) Изолиране и пречистване на N-ацетилхепарозан в по-голямата си част с ниска молекулна маса].

Състав В.

Химични модификации на N-ацетилхепарозан в по-голямата си част с висока молекулна маса от състав А.

Като изходно вещество за различните химични модификации се използва N-ацетилхепарозан, наречен партида G1, получен съгласно метода, описан в състав А.

Количеството на уроновата киселина в този продукт е 2,41 mol/mg.

Етап а. Частично деацетилиране.

1,9 г от партида G1 се разтварят в 38,5 мл 2N NaOH. Разтворът се довежда до 50°С и се оставя да реагира при тази температура в продължение на 8 часа под азот.

След това рН се довежда до 8,25 чрез добавяне на 2N HCI. Диализира се срещу ултрачиста вода и се лиофилизира. Така се получават 1,6 г от продукта.

Степен на N-деацетилиране.

Определяне на свободните аминогрупи (NH*) показва, че N-ацетилхепарозан е Nдеацетилиран 80 %.

Етап б. N-сулфатиране.

1,3 г от продукта, получен в предишния етап, се разтварят в 57 мл ултрачиста вода, добавят се 1,9 г Na₂CO₃ и 1,9 г комплекс серен триокис-триметиламин и се оставя при 55°С в продължение на 20 часа. Проводимостта на разтвора се довежда до тази на 0,5 М NaCl чрез добавяне на деминерализирана вода и се утаява с 4 обема етанол. Центрофугира се, утайката се отделя с 0,5 М разтвор на NaCI, утаява се с 4 обема етанол и се центрофугира.

Утайката се разтваря в ултрачиста вода и се диализира с ултрачиста вода съгласно метода, описан в пример 1, и след това се лиофилизира.

Така се получават 1,809 г N-сулфатиран хепарозан.

Етап в. Получаване на тетрабутиламониевата сол.

800 мг от продукта, получен в предишния етап, се разтварят в 100 мл вода. Този разтвор се пропуска през йонообменна коло на от Dowex 50 W 8 и се работи, както е описано в пример 4 (4) Химични модификации на партида В, етап б]. След лиофилизация се получават около 1,3 г от солта.

Етап г. О-сулфатиране.

Получената по-горе сол се разтваря в 80 мл формамид, добавят се 5,6 г комплекс серен триокис-пиридин. Оставя се да взаимодейства 6 часа при 30°С и след това се добавят 16 мл 2М NaCI. pH се довежда до 7 и се утаява с 2 обема етанол. Утайката се поставя в 0,5 М NaCI, преутаява се с 2 обема етанол, диализира се срещу ултрачиста вода и се концентрира в Rotavapor.

Етап д. Гелфилтруване.

Полученият концентриран разтвор в предишния етап се фракционира чрез гелфилтруване, през колона със Sephacryl S 300 HR, като за елуент се използва 0,5 М разтвор на NaCI.

Изолират се фракциите, които отговарят на молекулни маси между 10000 и 500000 Da.

Добавят се 2 обема етанол и след това се концентрира. След това проводимостта се довежда до тази на 0,5 М разтвор на NaCI чрез добавяне на вода.

Фракционирането чрез гелфилтруване се повтаря и се отделят фракциите, съдържащи

N. О-сулфатиран хепарозан, изграден от вериги със средна молекулна маса от 100000 до 200000 Da, както и фракциите, съдържащи Ν,Οсулфатиран хепарозан, изграден от вериги със средна молекулна маса около 50000 Da и около 12000 Da.

Към всяка от тези фракции се добавят 5 обема етанол, подлагат се на диализа срещу ултрачиста вода и след диализа получените 10 разтвори се подлагат на лиофилизация.

Така се получават три партиди Ν,Ο-сулфатирани хепарозани:

-партида G1 представлява N,О-сулфатиран хепарозан, изграден от вериги със сред15 на молекулна маса между 100000 и 200000 Da.

O, 140 г от тази партида се изолират.

-партида G2 представлява N,О-сулфатиран хепарозан, изграден от вериги със средна молекулна маса около 50000 Da. 0,350 г от този N,О-сулфатиран хепарозан се изолират.

-партида G3 представлява N,О-сулфатиран хепарозан, изграден от вериги със средна молекулна маса 12000 Da. 0,100 г от тази последна партида се изолират.

Характеристиките на трите партиди N,О-сулфатирани хепарозани са представени в таблица 18 по-долу.

Таблица 18

Характеристики на Ν,Ο-сулфатираните хепарозани, отговарящи на партиди G_p G₂ u G₃

	Уронова киселина (pmol/mg)	NH2 rp. (pmol/mg)	Степен на деацетилиране	Степен на сулфатиране сулф/карб
Партида G,	1,48	<0,01	80 %	2,60
Партида С2	1,45	<0,01	80 %	2,60
Партида G3	1,45	<0,01	80 %	2,60

Патентни претенции

1. N,О-сулфатирани хепарозани, съставени от вериги или смес от вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da, характеризиращи се с това, че притежават повтаряща се дизахаридна структура съгласно формула I

Claims (35)

1. N,О-сулфатирани хепарозани, съставени от вериги или смес от вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da, характеризиращи се с това, че притежават повтаряща се дизахаридна структура съгласно формула I

СООН

I

II)

CHjOG

NHE в която Е представлява в 0 до 80 % от дизахаридните остатъци на Ν,Ο-хепарозани ацетилна група и в оставащите остатъци сул29 фатна група и евентуално водороден атом, G представлява водороден атом и сулфатна група, и фармацевтично приемливи соли на Ν,Ο-сулфатираните хепарозани.

2. Ν,Ο-сулфатирани хепарозани съгласно претенция 1, характеризиращи се с това, че Е представлява ацетилна група и сулфатна група.

3. Ν,Ο-сулфатирани хепарозани съгласно една от претенциите 1 и 2, характеризиращи се с това, че степента на сулфатиране, изразена като отношение сулфат/карбоксил, е между 1,5 и 3,0.

4. Ν,Ο-сулфатирани хепарозани съгласно претенция 1, съставени от вериги или смес от вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da, характеризиращи се с това, че притежават повтаряща се дизахаридна структура с формула I ch₂og соон

NHE °C в която Е представлява в 0 до 80 % от дизахаридните остатъци на въпросните Ν,Οсулфатирани хепарозани ацетилна група и в останалите дизахаридни остатъци сулфатна група и евентуално водороден атом, G означава водороден атом и сулфатна група, като степента на сулфатиране, изразена като отношение сулфат/карбоксил, е между 1,5 и 3,0, двата края, редуциращ и нередуциращ на веригите на въпросните Ν,Ο-сулфатирани хепарозани или несулфатирани уронови звена, сулфатиран или несулфатиран глюкозамин, сулфатиран или несулфатиран N-ацетил глюкозамин и фармацевтично приемливите соли на въпросните Ν,Ο-сулфатирани хепарозани.

5. Ν,Ο-сулфатирани хепарозани съгласно една от претенциите от 1 до 4, характеризиращи се с това, че ацетилната група е представена с процентно съдържание под или равно на 60 %.

6. Ν,Ο-сулфатирани хепарозани съгласно една от претенциите от I до 5, характеризиращи се с това, че съдържат най-малко 90 % мас. вериги с молекулна маса под 11000 Da.

7. Ν,Ο-сулфатирани хепарозани съгласно претенция 1, характеризиращи се с това, че съдържат по-малко от 0,2 pmol/mg от аминогрупата (NH₂).

8. Ν,Ο-сулфатирани хепарозани съгласно една от претенциите от 1 до 5, характеризи ращи се с това, че са съставени от вериги с молекулна маса средно около 4000 до 7000 Da и притежават степен на сулфатиране изразена като отношение сулфат/карбоксил между 1,7 и 3.

9. Ν,Ο-сулфатирани хепарозани съгласно претенция 1, характеризиращи се с това, че са съставени от поне 70 % мас. вериги с молекулна маса между 5000 и 7000 Da и степента на сулфатиране, изразена като отношение сулфат/карбоксил, е между 1,8 и 2,5 и ацетилната група е представена в процентно съдържание под или равно на 20 %.

10. Ν,Ο-сулфатирани хепарозани съгласно претенция 1, характеризиращи се с това, че са съставени от поне 70 % мас. вериги с молекулна маса между 10000 и 12000 Da, степента на сулфатиране, изразена като отношение сулфат/карбоксил, е между 1,8 и 2,5 и ацетилната група е представена в процентно съдържание под или равно на 20 %.

11. Ν,Ο-сулфатирани хепарозани съгласно претенция 1, характеризиращи се с това, че са съставени от поне 70 % мас. вериги с молекулна маса между 6000 и 8000 Da, степента на сулфатиране, изразена като отношение сулфат/карбоксил, е между 2,0 и 2,8 и ацетилната група е представена в процентно съдържание под или равно на 60 %.

12. Ν,Ο-сулфатирани хепарозани съгласно претенция 1, характеризиращи се с това, че са съставени от поне 70 % мас. вериги с молекулна маса между 2300 и 7200 Da, степента на сулфатиране, изразена като отношение сулфат/карбоксил, е между 1,8 и 2,5 и ацетилната група е представена в процентно съдържание под или равно на 20 %.

13. Ν,Ο-сулфатирани хепарозани съгласно претенция 1, характеризиращи се с това, че са съставени от поне 80 % мас. вериги с молекулна маса между 3300 и 7700 Da, степента на сулфатиране, изразена като отношение сулфат/карбоксил, е между 1,8 и 2,5 и ацетилна групата е представена в процентно съдържание под или равно на 20 %.

14. Ν,Ο-сулфатирани хепарозани съгласно претенция 1, характеризиращи се с това, че са съставени от поне 70 % мас. вериги с молекулна маса между 6900 и 13500 Da, степента на сулфатиране, изразена като отношение сулфат/карбоксил, е между 1,8 и 2,5 и ацетилната група е представена в процентно съдържание под или равно на 20 %.

15. Ν,Ο-сулфатирани хепарозани съгласно претенция 1, характеризиращи се с това, че са съставени от поне 80 % мас. вериги с молекулна маса между 4000 и 10300 Da, степента на сулфатиране, изразена като отношение сулфат/карбоксил, е между 2,0 и 2,8 и ацетилната група е представена в процентно съдържание под или равно на 60 %.

16. Състав от Ν,Ο-сулфатиран хепарозан, характеризиращ се с това, че съдържа най-малко 70 % от Ν,Ο-сулфатиран хепарозан съгласно една от претенциите 1 до 15.

17. Метод за получаване на състав, съдържащ 70 до 100 % Ν,Ο-сулфатиран хепарозан съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че включва следната последователност от етапи:

-етап а: отглеждане на вида Escherichia coli (К5);

-етап б: изолиране и пречистване, предшествано или не от предварително пречистване на получения N-ацетилхепарозан, за да се получи състав, съдържащ 70 до 100 % N-ацетилхепарозан, съставен от вериги или смес от вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da с повтаряща се дизахаридна структура съгласно формула II

-етап в: частично деацетилиране на този състав на N-ацетилхепарозана, за да се получи състав, съдържащ 70 до 100 % хепарозан, изграден от вериги или смес от вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da, характеризиращ се с дизахаридна повтаряща се структура с формула 111 сн₂он СООН

NHR' OH в която R’ е в 0 до 80 % от дизахаридните остатъци ацетилна група, а в останалите дизахаридни остатъци-с водороден атом;

-етап г: частично Ν,Ο-сулфатиране на този състав на хепарозан, или частично Ν,Οсулфатиране на този състав на хепарозана, пос ледвано от етап на пълно N-сулфатиране, или пълно или частично N-сулфатиране, последвано от етап на пълно или частично Осулфатиране, и съдържа евентуално един или повече етапи на фракциониране по молекулната маса, осъществен на края на етапите а, б, в и г.

18. Метод съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че видът Escherichia coli (К5) е SEBR 3282 (получен съгласно CNCM на Institut Pasteur, Paris, France под номер 1-1013) или мутант от този вид, спонтанен или индуциран.

19. Метод съгласно претенция 18, характеризиращ се с това, че културата от вида Escherichia coli (К5) е продължена най-малко 2 часа след прекъсване нарастването на биомасата.

20. Метод съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че изолирането и пречистването на N-ацетилхепарозана включват поне един етап на алкохолно утаяване и поне един етап на йонообменна хроматография.

21. Метод съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че изолирането и пречистването на N-ацетилхепарозана се осъществяват с помощта на метод, включващ следната последователност на етапи:

-етап а^ утаяване с етанол;

-етап б₍: диализа;

-етап Вр утаяване с етанол и след това дехидратиране и сушене;

-етап г₍: пречистване чрез анионообменна хроматография;

-етап д₍: утаяване с етанола на елуата, получен в етап г₍, дехидратиране, сушене и смилане, в която етапите а₍ и в₍ могат да бъдат пропуснати.

22. Метод съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че изолирането и пречистването на N-ацетилхепарозана се осъществява с помощта на метод, включващ следната последователност от етапи:

-етап a’p диализа;

-етап б’₍: пречистване в кисела среда, елиминиране на неразтворимите онечиствания във воден разтвор с pH 3,5 и pH 1,8;

-етап в”: утаяване с етанол, след това дехидратиране и сушене;

-етап г’,: алкална хидролиза и диализа;

-етап д^: пречистване чрез анионообменна хроматография;

-етап е' ·. пречистване чрез ексклузион на хроматография.

23. Метод съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че полученият N-ацстилхепарозан от културата от вида Escherichia coli (К5) се подлага преди изолирането и пречистването на предварително пречистване, което се осъществява с метод, включващ следната последователност от етапи:

-етап а”₍: центрофугиране на получената след отглеждането суспензия;

-етап б”₍: поставяне на остатъка в контакт с алкален разтвор;

-етап в’^: предварително филтруване;

-етап г”,: концентрация върху мембрана с определена стойност на отворите;

-етап д”^ диализа, в която етап д’^ може да бъде пропуснат.

24. Метод съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че етапът на частично Ν,Ο-сулфатиране е последван от пълно N,0сулфатиране, осъществено от анхидросулфатен комплекс с органична база във воден разтвор с алкално pH.

25. Метод съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че етапът на пълно Nсулфатиране е последван от фракциониране на молекулната маса.

26. Фармацевтичен състав, съдържащ като активен компонент Ν,Ο-сулфатиран хепарозан съгласно една от претенциите от 1 до 15 в комбинация или смесен с инертен ексципиент, фармацевтично приемлив.

27. Фармацевтичен състав, съдържащ като активен компонент състав от Ν,Ο-сулфатиран хепарозан съгласно претенция 16 в комбинация или в смес с инертен ексципиент, фармацевтично приемлив.

28. Фармацевтичен състав съгласно една от претенциите 28 и 29, използващ се за регулиране на коагулацията.

29. Escherichia coli (К5) SEBR 3282, утаен съгласно CNCM на Institut Pasteur, Paris, France под номер 1-1031.

30. N-ацетилхепарозани съставени от смес от вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da, характеризиращи се с повтаряща се дизахаридна структура с формула II

NHCOCHj он двете крайни редуциращи и нередуциращи групи на въпросния N-ацетилхепарозан са уронови или N-ацетилглюкозаминови звена.

31. N-ацетилхепарозан съгласно претенция 30, характеризиращ се с това, че болшинството от веригите, крайното нередуциращо звено е уроново звено с формула (а) соон

J °\ Г.

^Н ^\.°Н ^{0 (а|} он

32. Състав от N-ацетилхепарозан, характеризиращ се с това, че съдържа най-малко 70 % N-ацетилхепарозан съгласно претенция 30.

33. Хепарозани, съставени от смес от вериги с молекулна маса между 1500 и 15000 Da, характеризиращи се с повтаряща се дизахаридна структура с формула III дизахаридните единици ацетилна група и в оставащите дизахаридни единици-водороден атом.

34. Хепарозани съгласно претенция 33, характеризиращи се с това, че ацетилната група е представена с процентно съдържание под или равно на 60 %.

35. Състав от хепарозан, характеризиращ се с това, че съдържа най-малко 70 % хепарозан съгласно една от претенциите 33 и 34.

Приложение: 5 фигури