HU201097B

HU201097B - Process for producing human insulin derivatives and long-acting pharmaceutical compositions comprising same

Info

Publication number: HU201097B
Application number: HU861024A
Authority: HU
Inventors: Jan Markussen
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1985-03-12
Filing date: 1986-03-11
Publication date: 1990-09-28
Also published as: CS259536B2; DD244345A5; KR930007433B1; NO172441C; IL78103A0; MY102102A; AU612964B2; ES552879A0; FI861007A; YU34586A; EP0194864A2; ES8800276A1; DK158677B; YU46001B; EP0194864A3; PT82173A; CN86101489A; DE3685668D1; DK158677C; AU5449586A

Description

Szabadalmas:

Novo Industri A/S, Bagsvaerd, (DK, (54) ELJÁRÁS HUMÁN INZULIN SZÁRMAZÉKOK

ÉS AZ AZOKAT TARTALMAZÓ NYÚJTOTT HATÁSÚ GYÓGYSZERKÉSZÍTMÉNYEK ELŐÁLLÍTÁSÁRA (57) KIVONAT

A találmány tárgya eljárás az új (I) általános képletű humán inzulinszármazékok és az azokat tartalmazó nyújtott hatású gyógyszerkészítmények előállítására, ahol az A és B betűk, melyeket zárójelben lévő számok követnek, az A-, illetve a B-láncúak a zárójelben lévő számokkal jelzett peptidfragmenseit jelölik,

E¹ és E⁴ jelentése Glu,

E² Glu vagy Gin,

E^J Glu vagy Gin,

X Thr, Lys vagy Arg,

Y Thr, Lys vagy Arg,

Z jelentése Lys vagy Arg,

R aminocsoport, n értéke 0 vagy 1, és m értéke 1, azzal a megkötéssel, hogy E² és E³ közül legalább az egyik Glu-tól eltérő jelentésű, ha X jelentése Thr.

.4 leírás terjedelme: 13 oldal, 2 rajz, 5 ábra

111; 201097 11

A találmány tárgya eljárás humán inzulinszármazékok és az azokat tartalmazó nyújtott hatású gyógyszerkészítmények előállítására.

A diabetes mellitus kezelésében számos különböző inzulinkészítményt ajánlottak és használtak. Egyes készítmények gyorsan hatnak és más készítmények többé kevésbé hosszantartó hatásúak. Általában kívánatos, hogy a gyógyszerészeti inzulinkészítmények többé kevésbé hosszantartó hatásúak legyenek. Ilyen hosszantartó hatást elérhetünk úg.v, hogy az inzulint mint inzulin kristályok szuszpenzióját adagoljuk be. A kristályos készítményeket úgy nyerhetjük, hogy az inzulint cink jelenlétében kristályosítjuk (úgymint Lente™, lásd Schlichtkrull: Ínsulin Crytals, Chemical and Biological Studies on Insulin Crystals and Insulin Zinc Suspensions, Munskgaard, 1958), vagy az inzulint cink és protamin jelenlétében kristályosítjuk [úgymint az NPH-inzulint, lásd: Rep. Steno Mem. Hosp. 1, 601, (19-16)].

Az ismert cink inzulin kristályszuszpenziók vagy a cink protamin inzulin használatának hátránya az, hogy az ampullát össze kell rázni azért, hogy a megfelelő mennyiségű inzulint injektáljuk és hogy biztosítsuk, hogy az inzulin koncentrációja az ampullában konstans maradjon a használat folyamán. A Penfill™ töltetekben, ahol levegő nem lehet jelen, a hosszú hatású inzulin szuszpenziók szükségessé teszik, hogy a töltetben egy szilárd test legyen a keveredés elősegítésére. Az inzulin szuszpenziók és inzulin oldatok levegővel való összerázása önmagában véve nem kívánatos folyamat, mivel az inzulin hajlamos a denaturálásra rostképződés közben a víz-levegő határfelületeken. Ezért szükség van a hosszan ható inzulin oldatokra.

Hosszantartó hatású inzulinszármazékok oldatait olyan inzulinból nyerjük, mely az aminocsoportjain fenil-izocianáttal végzett reakcióval módosított túri. Izoinzulin, lásd Hallas-Moeller: Chemical and Biological Insulin Studies based upon the Reaction between Insulin and Phenylisocyanate, Copenhagen, 1945.). Hasonlóképpen közölték, hogy az Al, B29-di-Boc-szubsztituált inzulin (Boc tercier-butil-oxi-karbonil-csoportot jelent,) elhúzódó inzulin hatást mutat szubkután beadagolás után (lásd Geiger és Enzmann: Proinsulin, Insulin, C-peptide; Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-Peptide 306-310, Tokushima 1978; Amsterdam-Oxford 1979). Azt találták, hogy az Al, B29-di-Boc-szubsztituált inzulin túl kis mértékben fejt ki elhúzódó hatást ahhoz, hogy klinikailag használható legyen.

A nem módosított inzulinok oldataihoz nagymennyiségű cinkionokat (pl. 0,4-1 mg/U inzulin) kell adni ahhoz, hogy hosszantartó hatást fejtsenek ki [lásd J.Pharmacol, 55, 206, (1935)]. Ilyen nagy dózisú cinkionok injekciója általában fájdalmat okoz, és ezért ilyen oldatokat még sohasem használtak a terápiában.

Az inzulin izoelektromos pontja kb. 5,5 pH és kísérletek történtek az inzulinszármazékok oldhatóságának csökkentésére semleges pH-nál azáltal, hogy az izoelektromos pontot felfelé tolták el, pl. a B-lánc N-Lerminálisába olyan bázikus aminosavakat vittek be, mint a lizin vagy arginin (lásd pl. a 2 042 299 számú német szövetségi köztársaságbeii nyilvánosságrahozatali iratot,) vagy az arginil- arginin bázikus dipeptid bevitelével (lásd Geiger és Enzmann, a fenti idézetet). Az utóbbi vegyület, az Arg^’-Arg¹¹⁰inzulin oldhatósága azonban, az izoelektromos pontjához közel, sokkal nagyobb volt, mint az eredeti inzuliné.

Az 55-144 032 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés olyan humán inzulin analógokra vonatkozik, melyekben a B30-aminosavat helyettesítik egy, legalább öt szénatomot tartalmazó aminosavval és ennek amidjaival és észtereivel. Ezeket az inzulin analógokat olyan pacienseknél használták, akik antitesteket termeltek az emlős inzulinokkal szemben. A japán szabadalmi bejelentésben hat specifikus vegyület van leírva, ezek közül egyiknek sincs elhúzódó hatása. A japán szabadalmi bejelentésben nincsenek leírva specifikus injektálható készítmények.

A 841 084 12.9 számú nyilvánosságra hozott Európa szabadalmi bejelentés olyan inzulin analógokra vonatkozik, melyekben egy bázikus, szerves csoport kapcsolódik a B30-aminosa\ hoz, ezáltal pozitív töltést hoz létre semleges pll-nál. Ezekben az analógokban a B30-aniinosav semleges, és előnyösen treonin, mint a humán inzulinban. A 3 327 709.5 számú német szövetségi köztársaségbeli nyilvánosságrahozatali irat az olyan kristályos származékok szuszpenziójára vonatkozik, melyek a fent emlitett európai szabadalmi bejelentésben vannak leírva, valamint egy aromás hidroxivegyületre. A 3 326 473.2 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságrahozatali irat egy olyan gyógyszerre vonatkozik, mely inzulinvegyületek elegyét tartalmazza, ezek közül legalább egy ismertetve van a fent említett európai szabadalmi bejelentésben.

A találmány tárgya eljárás olyan új humán inzulin analógok előállítására, amelyek a következőkberr különböznek a humán inzulintól:

a) a B-lánc C-terminális karboxilcsoportján egy amincsoport van, és

b) legalább egy töltéssel többel rendelkeznek, mint a humán inzulin pH = 7-nél, előnyösen nem több mint 4 töltéssel többet, mint a humán inzulin pH = 7-nél.

A tőltésváJtozást úgy érhetjük el, hogy aminocsoporttal védjük a B-30 helyzetű aminosav- karboxicsoportját, és kívánt esetben, egy vagy több aminosavat szusztituálunk aminocsoporttal.

HL! 201097 Β

Közelebbről a találmány szerinti, a gyakorlat számára érdekes vegyületeket a következők jellemzik:

az A17 és B13-helyzelű glulaminsavak közül egy vagy keltő helyett, glutamin áll; és/vagy a B27-helyzetű treoriinrész L-argininnal vagy L-lizinnel helyettesített; és/vagy a B30-helyzetű treoniricsoport. helyett lizin vagy arginin lehet, és az N-terminális karboxilcsoport a B láncban aminocsoporttal védve van.

A találmány tárgyát képezi a fent jellemzett humán inzulin analógok oldatainak előállítására is, melyek kontrollált cinkion tartalommal rendelkeznek. Az inzulin nyújtott hatása ezáltal csapadékképződés nélkül biztosítható.

Meglepő módon azt találtuk, hogy kombinált rövid és nyújtott inzulin hatású injektálható oldatokat készíthetünk úgy, hogy hatóanyagként egyetlen, ÍI) általános képletű inzulinszármazékot alkalmazunk', ahol az A és B betűk, melyeket, zárójelben lévő számok követnek, az A-, illetve a B-láncúak a zárójelben lévő számokkal jelzett peptidfragmenseit jelölik,

E^l és E⁴ jelentése Glu,

E² Glu vagy Gin,

E³ Glu vagy Gin,

X Thr, Lys vagy Arg, λ’ Thr, Lys vagy Arg,

Z jelentése Lys vagy Arg,

Az (I) általános képletű vegyületekben a B-lánc C-terminális karboxilcsoportja egy aminocsoporttal van blokkolva, ezáltal eltűnik a karboxilcsoport negatív töltése. A töltésváltozás, melyet az aminocsoport bevitele hoz létre B30-helyzetben, tovább növelhető azzal, hogy a B27-helyzetben lévő treonint argininnel vagy lizinnel szubsztituáljuk és/vagy az A17- és B13- és B21 helyzetben lévő glutaminsav bármelyikét glutaminnal helyettesítjük. Továbbá egy pozitív töltést bevihetünk egy bázikus aminosavval a B30- és/vagy a B-31- helyzetbe. Mivel az (1) általános képletű vegyületeket olyan oldatok alakjában használhatjuk fel a klinikai gyakorlatban, melyek elhúzódó hatásúak, az immunogenitás csökkenése fordulhat elő összehasonlítva a közönségesen használt sertés-, vagy humán inzulin szuszpenziókkal.

A hatás elhúzódásának mértékét növelhetjük és kontrollálhatjuk cinkionok hozzáadásával.

Jelentősebb paraméterek, melyek az inzulinhatás elhúzódásának fokát szabályozzak: a cink koncentráció és az (1) általános képletű vegyület kiválasztása. Bizonyos analógokkal, pl. Arg®²⁷, Thr®³⁰-NH2 humán inzu4 linnal erősen elnyújtott hatást érünk el csak 3 cinkatommal az inzulin analóg hexamer egységére számítva, amely 8 pg cink/ml-nek felel meg olyan készítményben, amely kb. 2-10 nmól/ml-t tartalmaz. Más analógokkal, pl. a Lys^,iJ<l-Nll2 humán inzulinnal, a hatás mérsékelt hosszabbítását érjük el inzulin analóg hexameterenként számítva 30 cinkkel, amely 80 pg cink/ml-nek felel meg olyan készítményben, mely kb. 240 nmól/ml-t tartalmaz. A kedvező cink koncentráció-tartomány 0-2 mg/ml között van, előnyösen 0-200 pg/ml cink, a B13- és/vagy B27- helyzetű szubsztitúció esetén és előnyösen 20-200 pg/ml más analógok esetén.

Az 11) általános képletű vegyületek oldatainak elhúzódó hatása cinkionok jelenlétében az ilyen vegyületek semleges pH-nál való kis oldhatóságának tulajdonítható. Csak az olyan inzulinszármazékok oldatai, melyekben a B-lánc C-terminálisa blokkolva volt, mutattak erősebben elhúzódó hatást, mint az Actrapid ^T sertés inzulin. [Protein Engineering 1 (3) 205-213 (1987)1.

A találmány szerinti injektálható oldat pll-jának előnyösen a fiziológiás pH-érték alatt és ahhoz a lehető legközelebbi értéken kell lennie, a pH felső határa ott van, ahol csapadék válik ki. Stabilis oldatokat, melyek kb. 240 nmól/ml (I) általános képletű vegyületet tartalmaznak, 5.5-pH értéknél nyerünk. A felső határ az oldat összetevőitől - úgymint izotonikum, tartósítószer és cinkkoncenlráció - és az (I) általános képletű vegyület megválasztásától függ. Nincs alsó pH-határa az oldatoknak, de mivel az inzulinok kémiai stabilitása savas oldatokban kicsiny, ami deamidációs reakciók, és dimerek képződésének tulajdonítható, a pH értéke kedvezően a lehető legnagyobb legyen az oldat fizikai stabilitását tekintetbe véve. A találmány szerinti injektálható oldatok előnyős pH-tartománya 2,5-8,5 között van, még kedvezőbben 4,5-8,0 között..

A találmány további szempontja, hogy nagyobb rugalmasságot tesz lehetővé a paciensek számára. Két vizes oldattal, melyből az egyik egy (I) általános képletű vegyületet, és a másik egy cinksót tartalmaz, a páciens a kivánt mértékű elhúzódó hatást tudja elérni, és egy kivánt profilt, megfelelően elegyítve a két oldatot, igy a paciensnek, két alapoldatoL használva, lehetősége van arra, hogy kiválasszon egy hatást és profilt a reggeli injekcióra és egy másik hatást és profilt az esti injekcióra. A cinkoldat előnyösen kb. 10 pg és 20 mg közötti mennyiségű cinket tartalmaz ml-enként. Alternatíve mindkét alapoldal, tartalmazhat cinket, akár azonos, akár különböző koncentrációkban és/vagy mindkét alapoldat tartalmazhat egy (1) általános képletű vegyületet, akár azonos, vagy különböző vegyületeket.

A találmány szerinti injektálható oldatok előnyösen kb. 60 és 6000 nmól/1 koncentrá-3HU 201097 fi cióban tartalmazzák az (I) általános képletű vegyületet. A C-tenninális helyzetben karboxamino-csoport van. Egy ilyen csoport van például a Thr^B3ö-NH2 humán inzulinban, amely intermedierként ismeretes a humán inzulin szintézisében llásd: Carlsberg Rés. Commun. 49, 463, (1984)1.

Neutrális pH-nál az -X^-l’ro^-Lys²⁹-Y»-Zn-R rész töltése +1 a Thr^B3O-Nll2 humán inzulinban, Thr⁸³⁰-OBu’ humán inzulinban, Thr⁸³⁰(Bu^t)-OBu^t humán inzulinban és Lys^B29-NH2, dez-(B30) humán inzulinban, +2 a Lys^B3u-NH2 humán inzulinban, Arg^B3U-Nll2 humán inzulinban, Orn^-Nlk humán inzulinban, Lys⁸²⁷, Thr^B3O-Nll2 humán inzulinban és Arg⁸²¹, Thr^B3u-NHz humán inzulinban, és +3 a Lys⁸²⁷, Lys^B30-NH2 humán inzulinban,

Lys⁸²¹,	Arg^B30-NH2	humán	inzulinban,	letek egy még
Arg⁸²⁷,	Lys^B3ű-NH2	humán	inzulinban.	tése egy argini
Arg⁸²⁷,	Arg^B30-NH2	humán	inzulinban, 20	Amint az
Lys⁸³⁰-Lys	^B31-Nll2	humán	inzulinban,	humán inzulinb
Arg^B30-Lys	B31-_NH2	humán	inzulinban,	elengedhetetlen
Q,._nB30_Q_rn	B3i__NHz	humán	inzulinban,	ból.

hunián inzulin, humán inzulin, inzulin, Gin*¹⁷, Arg⁸²⁷, Lys⁸²¹, Lys⁸³⁰Dab^B30-Dab^B3l-NH2 humán inzulinban és Dap⁸³⁰-NH2 humán inzulinban.

A találmány egyik kedvező kivitele szerint az Y-nal és Z-vel jelzett aminosavrészek olyan L-aminosavrészek, amelyeket nukleotid szekvencia kódol.

Az (I) általános képletű előnyös vegyületek egyik csoportjában V és/vagy Z jelentése egy bázikus aminosavrész (ni = 1).

Az (1) általános képletű, előnyös vegyületek másik csoportjában n értéke nulla és V jelentése egy bázikus aminosavrész (ni = 1).

Az (I) általános képletű, előnyös vegyületek további csoportjában mind Y mind Z jelentése bázikus amonosavrész (m = 1, n = 1).

Előnyös (I) általános képletű vegyületek a következők:

Gin*¹¹, Arg⁸²¹, Thr^83U-Nll2

Gin*¹¹, Gin⁸¹³, Thr^B3u-Nllz

Gin*¹⁷, Lys⁸²⁷, Thr^B30-NH2 humán

Gin*¹⁷, Lys^B30-NH2 humán inzulin,

Thr^B3ü-NH2 humán inzulin, Gin⁸¹³,

Thr^B3ö-NH2 humán inzulin, Gin⁸¹³,

Thr^B3U-NH2 humán inzulin, Gin⁸¹³,

-Nik humán inzulin, Gin⁸¹³, Lys^B3O-NH2 humán inzulin, Gin⁸¹³, Thr⁸³⁰-NH2 humán inzulin, Arg⁸²⁷, Arg^B30-NH2 humán inzulin, Arg⁸²⁷, Lys^B30-NH2 humán inzulin, Arg⁸²⁷, Thr⁸³⁰-Nll2 humán inzulin, Lys⁸²⁷, Arg⁸³⁰-NH2 humán inzulin, Lys¹*²⁷, Lys⁸³⁰-Nfl2 humán inzulin, Lys⁸²⁷, ΤΙπ^-ΝΗς, Lys^B3°-Arg^B3l-NH2 humán inzulin, Lys⁸³⁰, L.vs⁸³¹-NH2 humán inzulin, Arg^B3ü-NH2 humán inzulin, Arg⁸³⁹, Arg⁸³¹-NH2 humán inzulin, vagy Arg^B3u-Lys^B31-NH2 humán inzulin.

A találmány egy másik előnyös kivitelét képezik az olyan készítmények, amelyek olyan (I) általános képletű vegyületet tartalmaznak, melyben E² és/vagy E³ jelentése egy glutaminrész és/vagy X Jelentése Lys vagy Arg és az (I) általános képletű vegyü10 leteli ezen alcsoportján belül, egy további előnyös kivitelt képeznek az olyan készítmények, amelyek olyan (I) általános képletű vegyületet tartalmaznak, ahol az -Υβ-Zn-R általános képletű csoport jelentése -Thr-NHí vagy Lys-NHí. Előnyös vegyületek a Gin⁸¹³, Thr^B3U-Nll2 humán inzulin, a Gin*¹¹, Thr⁸³⁰- NÜ2 humán inzulin, a Lys⁸²¹, Thr^B3u-NH2 humán inzulin, és az Arg⁸²¹, Thr^83U-NH2 humán inzulin.

Az (1) általános képletű előnyös vegyületek egyik csoportjában E³ glutaminsav csoport.

Az (1) általános képletű előnyős vegyületek másik csoportjában E² jelentése egy glutaminrész.

Az (I) általános képletű előnyős vegyüValójában a sertés inzulint és a marha inzulint, amely aminosavcsoportjaiban eltér a humán inzulintól, alkalmazzák cukorbetegek kezelésére. A fajták szerint figyelemre méltó variációk vannak az inzulinmolekulában, igy a humán inzulinmolekulában sok peptidfrag30 mens megváltoztatható anélkül, hogy túlságosan csökkenne az inzulinaktivitás, beleértve néhány olyan peptidfragmenst, amelyek fontosak a molekula izoelektromos pontja szempontjából.

Az ismert kétfázisú inzulin készítményekben általános az, hogy gyorsan ható, oldható inzulint, hosszabban ható, kristályos inzulinnal kombinálnak ugyanabban az injekcióban. A találmány szerinti (I) általános képletű vegyületeket alkalmazva, egy hasonló kombinált gyors és elnyújtott hatást érhetünk el egyetlen (1) általános képletű, vegyület oldatával. A gyors és a hosszú hatás közötti arány csökken, ahogy az oldatban lé45 vő cinkionok koncentrációja megnő.

Az (I) általános képletű vegyületeket előállíthatjuk egy transzpeptidezési reakcióval, melyben sertés inzulint vagy más (II) általános képletű bioszintetikus prekurzor vegyületeL, mely rendelkezik a korrekt inzulin-diszulfid-hidakkal.

B( 1-12 )-E^J-B( 14-20 )-E⁴-B(22-26)-X-B(28-29)-(Q_Q-ll)r-A(l-3)-E¹-A(5-16)-E²-A(18-21) (II) ahol az A és B betűk, melyeket a zárójelben lévő számok követnek, az A- illetve B-láncok megfelelő peptídfragmenseit jelölik, amint azt a zárójelben lévő számok mutatják, Q jelentése egy q számú aminosav ból álló peptid60 lánc, q jelentése egy 0-33 közötti egész szám, R jelentése Lys vagy Arg, és r értéke nulla vagy egy, és Ε¹, Ε², Ε³, E⁴ és X jelentése a fentiekben definiált - reagáltatunk egy (111) általános képletű aminovegyülettel:

H-Y»-Zn-R

11U 201097 li (111) ahol Y, Z, R, in és n jelentése a fentiekben definiált, és ahol az Y és Z oldalláncú aniinocsoportjai és hidroxicsoportjai adott esetben blokkolva vannak amino- és hidroxi-védöcsoportokkal, tripszint vagy egy tripszinhez hasonló enzimet használva katalizátorként viz és szerves oldószerek elegyében, amint az le van írva, a 4 343 898 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. Előnyös (III) általános képletü vegyületek, melyeket ebben az eljárásban használunk: Thr-NHz, Lys (Boc)-NH2, ThrlBuH-OBu⁴, Thr-OBu», Ala-NH2 és Arg (Boc)-Nll2. Az aminocsopoi— Lokból származékokat állíthatunk elő egy zsírsavval való acilezéssel. A hidroxicsoportokat. alkilezéssel védhetjük. 11a Y és Z olyan csoportokat tartalmaznak, melyeket reverzibilisen blokkolnak amino-védőesoportok, ezeket a csoportokat el lehet távolítani egy későbbi lépésben, szükség szerint, miután az amino-védett köztiterméket elválasztottuk a tripszintől, vagy a tripszinhez hasonló enzimtől. Tripszinhez hasonló enzimek közül az Achroniabacter lyticus-bö} kinyert lizil endopeptidáz alkalmas.

A (II) általános képletű vegyületet kialakíthatjuk egy gazdaszervezetben, úgymint élesztőben, a 163 529 számú európai szabadalmi bejelentésben leírtakhoz hasonlóan úgy hogy egy olyan gént alkalmazunk, amelynek a megfelelő kodonjai vannak a kérdéses aminosavakra nézve. A gént, mely az új inzulin5 származékot kódolja, ekkor egy olyan alkalmas expressziós vektorba illesztjük, amelyet ha az élesztőbe átviszünk, képes arra, hogy kialakítsa u kívánt vegyületet. Az előállított terméket ezután izoláljuk a sejtekből vagy a táptalajból, áltól függően, hogy ki van-e választva a sejtekből, vagy nem.

Egy reverzibilis amino-védöcsoportra példa a terc-but.oxi-karbonil-csoport és egy reverzibilis hidroxi-védőcsoportra a terc-bu15 tilcsoport. Az ilyen csoportokat olyan körülmények között távolítjuk el, amelyek nem okoznak nem kívánatos változást az (I) általános képletü vegyületekben, például trifluor-ecetsavval.

dl általános képletü inzulinvegyületeket előállíthatunk egy kapcsolásos reakcióval is, melyben egy olyan (IV) általános képletű vegyületet - amelyben Ε¹, Ε², Ε³, E⁴ és X a fentiekben definiált - kapcsoljuk egy, a fenti (Hl) általános képletű aminvegyülethez, tripszinnel, vagy a tripszinhez hasonló enzimmel olyan körülmények között, melyek a 17 938 számú európai szabadalmi leírásban le vannak írva.

A( 1-3 )-E'-A( ö-G )-Cys-A(8-16 )-E²-A(18-19)-Cys-Asn (A-lanc

S S

S S (IV)

B( l-6)-Cys-D(8-12)-E³-B( 14-18)-Cys (B-lánc)

L ys-P ro-X-B (26- 221- E⁴-G1 y

Ha az inzulint genetikai átalakítással állítjuk elő, a további egy vagy két pozitív töltést alkalmasan bevihetjük az inziilinmolekulán belül, vagyis az A17-, B13-, vagy B27-helyzetben, lehetőséget adva a tripszin-ka- 50 talizálta szemiszintézisnek, hogy a B-lánc C-terminális karboxilcsoportját blokkolja egy aminosav-amid vagy egy aminosav-észter.

Annak az előnye, hogy beviszünk további pozitív töltéseket az inzulinmoiekula 51 55 aminosavból álló vázába, és így (I) általános képletü új vegyületeket állítunk elő, inkább mint hogy meghosszabbítjuk a B-láncot az emlős inzulinok 30 csoportján túl, az előállítás megkönnyítésében mutatkozik meg. A 60 szemiszintetikus transzpeptidációban az aminosav-amidot, vagy amidosav-észtert nagy moláris feleslegben alkalmazzuk. Ha egy dipeptid-amidot vagy észtert kell alkalmazni a transzpeptidációs reakcióban, vagy a költség, 65 6 vagy az oldhatóság, vagy mindkettő korlátozza a nagy feleslegben való alkalmazást és következésképpen a termék hozama kisebb lesz. Még ha ugyanazt az ekvimoláris feleslegét használjuk pl. a Lys(Boc)-NH2-nek és bys(Boc)-Lys(Boc)-NH2-nek a transzpeptidációs reakcióban hasonló körülmények között, az aminosav-amiddal kapott hozam lényegesen nagyobb lesz, mint a dipeptid-amiddal kapott hozam.

A találmány szerinti inzulin készítményeket úgy állítjuk elő, hogy egy (1) általános képletű vegyületet feloldunk vizes közegben, gyengén savas körülmények között, pl. 240 vagy 600 nmól/1 koncentrációban. A vizes közeget izotóniéssá tesszük, pl. nátrium-kloriddal, vagy glicerinnel. Továbbá a vizes közeg tartalmazhat cinkionokat, inzulin-aktivitás egységenként legfeljebb kb. 20 ug Zn**-koncentrációig, puffereket, úgymint

HU 201097 Β acetát- és citrátpuffert, és tartósítószereket, amilyen a m-krezol vagy fenol. Az oldat pH értékét a semlegesség felé állítjuk be, anélkül, hogy túlságosan megközelítenénk az (1) általános képletű vegyületek izoelektromos pontját, nehogy csapadék váljon ki. A végleges inzulin készítmény pH értéke függ a töltések számából, amelyet megváltoztattunk az (I) általános képletű vegyületben, a cínkionok koncentrációjától, az (I) általános képletű vegyűlet koncentrációjától és a kiválasztott (I) általános képletű vegyülettől. Az inzulin készítményt steril szűréssel sterilizáljuk.

A találmány szerinti inzulin készítményeket hasonlóképpen használjuk, mint az ismert inzulin készítményeket.

Az aminosavakra itt használt rövidítések azok, melyek a J.Biol. Chem. 243, 3558 (1968) közleményben vannak ismertetve. Az itt ismertetett aminosavak 1,-konfigurációban vannak. Az (I) általános képletben és bárhol az A(l-3) jelentése Gly-Jle-Val, A(5-6)é Gln-Cys stb., lásd: a humán inzulin aminosav sorrendje. Eltérő utalás hiányában az itt említett inzulinok fajtái humán inzulinok.

Az inzulin forrása vagy sertés inzulin vagy egy élesztőben előállított inzulin prekurzor amint azt az 582/85 számú dán nyilvánosságrahozatali iratban leírjuk.

Az inzulin prekurzorokat a fermentációs táptalajból nyerjük ki Li Chro prep™ RP-18-ra való abszorpcióval, amint a fenti dán szabadalmi leírás 7. példájában le van írva.

A prekurzorokat az oszlopról 0,2 mólos kálium-klorid dal, 33%-os (v/v) etanolban oldott 0,001 mólos sósavval eluáljuk. Az inzulin prekurzorokat kristályosítjuk az összegyűjtött frakcióba, egymásután adagolva vizet (1 v/v frakció,, szilárd trinátrium-citrátot (hogy 0,05 mólos legyen) és végül cink-acetátot (hogy 0,006 mólos legyen). A pH-1 6,8 értékre állítjuk be és az elegyet egy éjjelen ét állni hagyjuk 4 °C-on. A kristályokat centrifugálással izoláljuk, vízzel mossuk és vákuumban szárítjuk.

Védett aminosavakat és védett peptideket az enzimes szemiszintézis céljából vagy standard módszerekkel állítanak elő, vagy megvásároljuk (rendelésre készült szintézis) akár a Nova Biochem-től, akár a Bachem-töl, mindkettő svájci cég.

A TM betűk a nevek után védjegyet (trade mark) jelentenek.

1. példa

A Lys^eMI-Nil2 humán inzulin szintézise g sertés inzulint feloldunk 4 ml 7,5 mólos ecetsavban és 6,1 g Lys(Boc)-NH2, ClbCOOH-t (N epszilon-Boc-L-lizin-amid-acetát-só) feloldunk 15 ml-re Ν,Ν-dinietil-acetamiddal, az oldatokat elegyítjük és az elegyet 12 °C-ra hütjük, 0,1 g tripszint. feloldunk 2,08 ml 0,05 mólos kalcium-acetátban és az oldatot az elegyhez adjuk. 96 órai állás után 12 °C-on a proteineket kicsapjuk 200 ml aceton hozzáadásával és a csapadékot centrifugálással elválasztjuk. A csapadékot egyszer mossuk 100 ml acetonnal, centrifugálással elválasztjuk és vákuumban szárítjuk.

A csapadékot feloldjuk 50 ml 0,01 n sósavban, mely etanol/vízzel (28/72 térfogat arányban) készült, és az oldatot egy 5 x x 30 cm-es preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopra visszük (a továbbiakban HPLC), melynek töltete oktadecil-dimetil-szilillel helyettesített kovasav (átlagos részecskeméret 15 mikron, pórusméret 100 Angström). Az oszlopot egyensúlyba hozzuk 38/62 térfogat arányú etanol/0,2 mólos ammónium-szulfát-oldattal, ez utóbbi pH-ját 3,5-re állítjuk be kénsavval. A proteineket az osz20 lopról ugyanazzal a pufferrel eluáljuk, 2 liter/óru sebességgel. A Lys(Boc)^B;í0-NH2 humán inzulint.' egy olyan csúcsban találjuk meg, melyet, az oszlopról 60 és 75 perc között eluálunk, a nem reagált sertés inzulin eluciója után. Az etanolt vákuumban elpároljuk és a bepárlást folytatjuk, míg a térfogat kb. 125 inl-re csökken. A Lys(Boc)^B30-NH2 humán inzulint izoláljuk 25 ml aceton, 100 mg citromsav (monohidrát p.a.) és 9 mg cink30 -klorid (p.a.) egymásutáni adagolásával. A pll-t 6,5 értékre állítjuk be és egy óráig szobahőmérsékleten, majd 24 órán át 4 °C-on, enyhe keverés mellett kristályosítunk. A kristályokat lecentrifugáljuk, egyszer mossuk

5 ml jéghideg vizzel, centrifugáljuk és vákuumban szárítjuk. Hozam: 456 mg Lys(Boc)^B3°-NHz humán inzulin.

A l.ys(Boc)^B3e-NHz humán inzulint (456 mg) feloldjuk 15 ml trifluor-ecetsavban és 3 órán át állni hagyjuk szobahőmérsékleten. A trifluor-ecetsavat liofilizálással eltávolítjuk. A liofilizátumot feloldjuk 50 ml vízben, a pH-t 2,5 értékre állítjuk be és 10 g nátrium-kloridot adunk hozzá. A Lys^-NHz hu45 mán inzulin só-lepényt centrifugálással elkülönítjük. A só-lepényt 125 ml vízben feloldjuk és a Lys^B3u-NH2 humán inzulint kristályosítjuk, 25 ml aceton, 100 mg citromsav (iiionohidrát p.a.) és 9 mg cink-klorid (p.a.) egymásután! adagolásával és a pH-t 7,0 értékre állítjuk be. Egy óráig szobahőmérsékleten tartjuk, majd a kristályosítást 4 °C-on folytatjuk 24 órán keresztül, enyhe keverés mellett. A kristályokat lecentrifugáljuk, egy55 szer mossuk 5 ml jéghideg vízzel, ismét centrifugáljuk és szárítjuk. Hozam: 387 mg nyers Lys^B3ü-NH2 humán inzulin.

A kristályokat feloldjuk 50 ml 0,005 n sósavban, amely efanol/viz (20/80 térfogat60 arány (-elegyben van oldva és az oldatot preparatív HPLC oszlopra visszük, mint azt fent leírtuk, ekkor egyensúlyba visszük egy olyan oldallal, mely 35,5 térfogatrész etanolból és 64,5 térfogatrész 0,3 mólos olyan káli— uni-klorid-oldatból áll, amely 0,001 n sósavra

-611

HU 201097 Β nézve. Ugyanazzal a puffénál eluálunk 2 líter/óra sebességgel és a Lys^BM-NH2 csúcsot 55 és 90 perc között kapjuk meg. A terméket izoláljuk a frakcióból, amint azt fent leírtuk a hys(Boc)^B3u-NH2 humán inzulin esetében, azzal a különbséggel, hogy a cinket tartalmazó citrát-puffer-bán való kristályosításban a pH értéket 7-re állítjuk be, 6,5 helyett. Hozam: 262 mg tiszta l,ys^B3ü-NHz humán inzulin.

Az aminosav összetétel az elmélettel egyezik, a molekula 1 alauint és 2 lizint tartalmaz. A termék tiszta, DISC PAGE elektroforézissel vizsgálva 8,9 pll-nál, a migrációsebesség a sertés inzulinénak 55%-a, amely megfelel kb. 2 tőlLés különbségnek. A DISC PAGE elektroforézis részleteire lásd: Horni. Metab. Rés. Supplemenl Series No. 5 (1974). 134.

2. példa

Arg^B:Mt-NH2 humán inzulin és Arg^B30-Arg^BJ1-NH2 humán inzulin szintézise g sertés inzulint feloldunk 3,32 ml 8 mólos ecetsavban és 3,9 g Arg-NHz, (CH3COOH)2-at (L-arginin-amid dihidro-acetát sója) 10 ml-re oldunk Ν,Ν-dimetil-formamidban (a továbbiakban DMF), az oldatokat elegyítjük és az elegyet 12 °C-ra hütjük, 0,1 g tripszint 1,2 ml 0,05 mólos kalciuni-acetát-oldatban oldunk és a fenLi elegyhez hozzáadjuk. 144 óráig állni hagyjuk 12 °C-on, utána a proteineket 200 ml aceton hozzáadásával lecsapjuk és a csapadékot centrifugálással elválasztjuk. A csapadékot egyszer mossuk 100 ml acetonnal, centrifugálással izoláljuk és vákuumban szárítjuk.

A csapadékot feloldjuk 50 ml, (27/73 térfogat arányú) etanol/vízzel készült. 0,01 n sósavban és a proteineket preparatív kromatográfiás oszlopra visszük, amint azt az 1. példában leírtuk. Először egy olyan eluenst, mely 35 térfogatrész etanolból és 65 rész 0,3 mólos olyan kálium-klórid-oldatból áll, amely 0,001 n sósavra nézve pumpálunk át 2 liter/óra sebességgel, 4 óra alatt. Három, felbontatlan csúcs mutatkozik, kb. 60-tól 120 percig, 120-Lól 150, és 150-től 180 percig. A három frakció proteinjeit úgy izoláljuk, amint az az 1. példában Lys^B3u-NH2 esetén le van írva. Hozamok: 414 mg, 142 mg és 107 mg az I, II. és III. frakcióra vonatkoztatva.

Aminosav analízis DISC PAGE elektroforézissel kombinálva azt mutatja, hogy az I. frakció inzulin molekulái 2-Lói néhány argininnel kapcsolódnak. A II. frakció nagyobb része egy-egy arginin-aniid-csoporthoz kapcsolódó inzulin vagyis Arg^BJU-NHz humán inzulin. A III. frakció egy olyan elegy, mely sertés Inzulint, des(B30) humán inzulint, Arg^B3° humán inzulint és Arg^BÍU-NlÍ2 humán inzulint tartalmaz.

Arg^BM-NI{2 humán inzulin

A II. frakció proteinjeit feloldjuk 10 ml, 3/2 térfogatarányú etanol/viz elegyében, 2 pll-értéknél. Miután 12 mg EDTA-t hozzáadunk, a pll-L 10-es értékre növeljük 0,1 n nátrium-hidroxiddal. Az oldatot egy 2,5 x x 25 cm QAE-Sephadex A-25 oszlopra viszszük, ezt egy olyan pufferral hozzuk egyensúlyba, amely 0,5 m ammóniából, 0,05 n sósavból és 0,04 mólos nátrium-kloridból készült 60% (v/v) etanolban. Az oszlopot ml/óra sebességgel eluáljuk, lineáris graádienssel 0,04 ni-0,1 m nátrium-kloridban: összesen 1 liter eluenst használva fel, miközben a pll-t konstansan kb. 10,0 értéken tartjuk.

ml-es frakciókat gyűjtünk. Arg^B3U-NH2 humán inzulin az oszlopról az 58-74 frakciókban jön le. A terméket az összegyűjtött frakciókból Lepárlással izoláljuk, majd kristályosítjuk pH = 7 értéknél egy cinket tartalmazó citrát pufferben, mely 15% (v/v) acetont tartalmaz, amint azt az 1. példában bys^B3u-NH2 esetére leírtuk. Hozam: 53 mg. A termék homogénnek mutatkozik DISC PAGE elektroforézissel pH = 8,9-nél, a migráció sebessége az inzulinének 55%-a. Az aminosav-összetélel megegyezik az Arg^B3O-NH2 humán inzulinra vonatkozó elmélettel, amely szerint 2 arginint és 1 aianint tartalmaz inzulin molekulánként.

Arg^B30-Arg^u31-Nll2 humán inzulin

Az I. frakció proteinjeit feloldjuk és ioncserélő kromatográfiának vetjük alá, QAE-Sephadex™ Α-25-oszlopon, amint azt a II. frakció proteinjeire leírtuk. Arg^B30-Arg^B31-Ntlz humán inzulin az oszlopi’ól a 34-47 számú frakciókban jön le. A terméket izoláljuk amint azt az 1. példában a Lys^B30-NH2 humán inzulinra leírtuk. Hozam: 10 mg.

A termék homogénnek mutatkozik DISC PAGE elektroforézissel 8,92 pH értéknél, a migráció értéke az inzulinénak 35%-a. Az aminosav összetétel 3 arginincsoportot és 1 alaníncsoportot mutat egy inzulin molekulára számítva.

3. példa

Thv^B30-NH2 humán inzulin szintézisre (referencia példa) g sertés inzulin feloldunk 5 ml 10 mólos ecetsavban és 2,365 g Thr-NH2-t (L-treonih-amid, szabad bázis) N,N-dimetil-acetamidban szuszpendálunk úgy, hogy a szuszpenzió térfogata 13 ml legyen. Az inzulinoldatot és a szuszpenziót elegyítjük. Öszszekeverés után a Thr-NH2 feloldódik. Az elegyet 12 °C-ra hütjük és hozzáadjuk 0,1 g tripszinnek 2 ml 0,05 mólos kalcium-acetáttal

-713

HU 201097 Β készített oldatát. 72 órai állás után 12 °C-on a proteinek kicsapódnak 200 ml aceton- hozzáadására és a csapadékot centrifugálással izoláljuk. A csapadékot egyszer mossuk 100 ml acetonnal, centrifugálással izoláljuk és vákuumban szárítjuk.

A Thr^B30-Nll2 humán inzulint a tripszintöl és a nem reagált, sertés inzulintól megtisztítjuk úgy, amint az a humán inzulin észtereire le van Írva llásd Markussen: Methods in Diabetes Resarch, Vol. 1. Edit.ors: Larner and Pohl (1984), 408] Hozam: 599 mg.

A termék homogénnek mutatkozik DISC PAGE elektroforézissel 8,9. pH értéknél, a migráció sebessége 75%-a az inzulinénak. Az aminosav összetétel megegyezett az elmélettel, vagyis 3 treonincsoporl és 1 alanincsoport volt inzulin molekulánként.

A 4-10. példákban lévő kiindulási anyagokban az (II) általános képlet szerinti (Qq-R)r általános képletü csoportjaként AlaAla-Lys-et választottuk és úgy állítottuk elő, amint az le van írva a pMT610 élesztő plazmádra az 582/85 dán nyilvánosságrahozatali iraL 10. példájában. Gin¹¹¹³, Gin*¹⁷, Arg^B27 és Lys^B27 jelű nukleotidokat helyettesítettünk a pMT610-ban hely-specifikus mutagénézissel a Nuel.Acids.Res. ll, (1983), 5103-5112 idézetben leírt eljárást alkalmazva.

4. példa

Gin*¹', 7’hr^B3u-A7/2 humán inzulin szintézise

3,12 g Gin·’¹⁷, B(l-29)-Ala-Ala-I.ys-A(l-21) inzulin prekurzort 15 ml ecetsav /DMF/ víz (11,4 ml ecetsav 65,1 ml DMF, vízzel 100 ml-re kiegészítve) elegyében szuszpendálunk, ehhez hozzáadunk 30 ml 1 mólos, DMl-’-ben oldott Thr-Nlh-L. Az elegyet lehűtjük 12 °C-ra és 7,5 ml 0,05 mólos kalcium-acetátban feloldott 0,3 g sertés tripszint adunk hozzá. A keverést addig folytatjuk, mig az inzulin prekurzor feloldódik. 48 óra múlva 12 °C-on a proteinek kicsapódnak 400 ml aceton hozzáadása következtében. A proteineket centrifugálással választjuk el, egyszer mossuk 100 ml acetonban és vákuumban szárítjuk.

A csapadékot feloldjuk 70 ml 0,04 n sósavban, a pH-t 2,5 értékre beállítjuk és a származékot HPLC-vel tisztítjuk, amin azt az 1. példában leírtuk, azzal a különbséggel, hogy olyan eluenst használunk, mely 35 rész etanolból és 65 rész 0,3 mólos káliuDÍ-kloridból, 0,001 n sósavból áll. A származék az oszlopról kb. 3 oszloptérfogat után jön le, és úgy izoláljuk, hogy egymásután adunk hozzá 1 térlogat vizet, szilárd Lrinátrium-citrátoL, hogy erre nézve 0,05 mólos legyen és szilárd cink-acetátot, hogy erre nézve 0,006 mólos legyen. Ezután beállítjuk a pH-t 6,5 értékre, egy éjjelen át keverjük 4 “C-on, majd a kristályokat centrifugálással összegyűjtjük, vízzel mossuk és szárítjuk. A hozam 1,64 g = 53%. További tisztítást anion-cserélö kromatográfiával végzünk, amint az a humán inzulin-észterekre le van írva (lásd Markus5 sen, ibid. 410). Végső hozam: 1,15 g = 37%. A termék közel homogén DISC PLATE elektroforézissel pH = 8,9 értéknél, a migráció sebessége 55%-a az inzulinénak. Analitikai fordított fázisú HI’LC-ben (lásd Markussen ibid,

410), a termék kb. ugyanolyan sebességgel eluálódik, mint a sertés inzulin. A tisztasága kb. 95%-os. Aminosav összetétel analízis a feltételezett formulával azonosságot mutatott.

5. példa

Gin*¹¹, Lys^b>u-NHi humán inzulin szintézise

3,15 g Gin*¹⁷, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A( 1-21) inzulin prekurzort 15 ml ecetsav /DMF/ víz (4,57 ml ecetsav, 71,9 ml DMF vízzel 100 ml-re kiegészítve) elegyében szuszpendálunk, ehhez hozzáadunk 30 ml, DMF-ben oldott, 0,4 mólos Lys(Boc)-NH2-t. Az elegyet 12 °C-ra hűtjük és hozzáadunk 0,3 g tripszínt melyet 7,5 ml 0,05 mólos kalcium-acetátban oldottunk. A keverést folytatjuk, míg az inzulin prekurzor feloldódik. 12 °C-on tartva, 48 óra múlva a proteineket izoláljuk, amint azt a 4. példában leirtuk.

A csapadékot 70 ml 0,04 n sósavban feloldjuk, a pH-t 2,5 értékre állítjuk be és a Gin’¹⁷, Lys(Boc)^B30-NH2 humán inzulint HPLC-vel tisztítjuk, amint az 1. példában leírtuk azzal a különbséggel, hogy az eluciót először 2,3 1 olyan eluenssel végezzük, mely 37 rész etanolt és 63 rész 0,3 mólos kálium-kloridot tartalmaz 0,001 n sósavban, ezután egy olyan eluenssel, mely 39 rész etanolt és 61 rész 0,3 mólos kálium-kloridot tartalmaz 0,001 n sósavban. A származék 25 perc múlva jön le az eluens változtatása után és úgy izoláljuk, amint azt a Gin’¹⁷, Thr^B30-NH2 humán inzulin esetén leirtuk a 4. példában. A hozam Gin*¹⁷, Lys(Boc)^B30-NH2 humán inzulinra 906 mg = 29%.

Gin’¹⁷, Lys(Boc)^B3ű-NH2 humán inzulint (1,55 g) feloldunk 30 ml trifluor-ecetsav bán (TFA) és szobahőmérsékleten 2 órán keresztül állni hagyjuk. A TFA-t liofilizálással eltávolítjuk. A maradékot feloldjuk 15 ml vízben, a pH-t 3-as értékre állítjuk be 1 n nátrium-hidroxiddal és 22 ml etanolt adunk hozzá. Az oldatot egy 2,5 x 20 cm SP-Sephadex^TflC-25 oszlopja visszük, melyet 3 : 2 térfogat arányú etanol-víz elegyböl álló pufferral hozunk egyensúlyba, mely 0,01 m citromsavból, 0,03 m nátrium-kloridból áll és a pH-t 4,5 értékre állítjuk be nátrium-hidroxiddal. Az oszlopot ugyanazzal a pufferral eluáljuk, 0,03-0,4 mólos nátrium-klorid lineáris gradienst, összesen 1,6 1 eluenst használva. A származék 440 ml-ben eluálódik, amikor a gradiens 0,2 m nátrium-kloridot ér el. A

-8Ilii 201097 Β származékot úgy kristályosítjuk, hogy hozzáadunk 1100 ml vizet, annyi szilárd trinátrium-citrátot, hogy arra nézve 0,05 mólos legyen és annyi szilárd cink-acetátot, hogy erre nézve 0,006 mólos legyen. Végül a pH-1 6,8 értékre állítjuk be. Miután egy éjjelen át keverjük 4 “C-on, a kristályokat centrifugálással izoláljuk, vizzel egyszer mossuk és vákuumban szárítjuk. A hozam: 1,00 g, amely 65%-nak felel meg az utolsó lépésben és 19% a Gin*¹⁷, B( l-29)-Ala-Ala-Lys-A( 1-2) inzulin prekurzorból számítva. A termék közel homogén DISC PAGE elektroforézissel 8,9-es pH— -nál, a migráció sebessége 35%-a az inzulinénak. Analitikai HPLC-ben a termék a sertés inzulin előtt jön le, a tiszLaság kb. 97%. Aminosav összetétel analízis 2 lizincsoportot mutat molekulánként és különben azonosságot a humán inzulinnal.

d. példa

Arg*²·', Thi*^M-NH2 humán inzulin szintézise

3,8 g Arg®²⁷, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) inzulin prekurzort 18 ml ecetsav /viz/ DMF (11,4 ml ecetsav, 35 ml viz, DMF-el 100 ml-re kiegészítve) elegyében szuszpendálunk, hozzáadunk 36 ml, DMF-ben oldott 1 mólos Thr-Nih oldatot. Az elegyet 12 “C-ra hútjük és 0,38 g sertés tripszint adunk hozzá, melyet 6,84 ml 0,05 mólos kalcium-acélaiban oldottunk. 48 órán át állni hagyjuk 12 “C-on majd a proteineket acetonnal kicsapjuk, amint a 4. példában leírtuk.

A származékot HPLC-vel tisztítjuk, amint az 1. példában leírtuk, először 1800 ml eluenst használunk, amely 35 rész etanolból és 65 rész vizes 0,3 mólos, kalium-kloridból, mely sósavra nézve 0,001 n áll, ezután olyan eluenssel, mely 37 rész etanolból és 63 rész vizes oldatból áll. A származék 10 perccel az eluens váltása után jön le és úgy izoláljuk, mint azt a 4. példában leírtuk a Gin*¹⁷, Thr^B3ü-NH2 inzulinnál. Végül SP-Sephedex™ C-25 oszlopon tisztítjuk, amint az az 5. példában le van írva a Gin*¹', Lys^B30-NH2 humán inzulin esetében.

Az Arg®²⁷, Thr^B3U-NHz humán inzulin hozam 1,63 g, ez 43%-nak felel meg. Lényegében egy sávot lehet látni a DISC PAGE elektroforézissel, a migráció sebessége 55%-a az inzulinénak. Analitikai HPLC-ben a termék a sertés inzulin előtt jön le, tisztasága kb. 96%. Aminosav összetélel analízis 2 argínincsoportot mutat molekulánként és különben azonosságot a humán inzulinnal.

7. példa .4rg®²⁷, L,vs^lliu-.\7Í2 humán inzulin szintézise

A vegyületet 3,61 g Arg®²⁷, Bll-29)-Ala-Ala-Lys-Al 1-21) inzulin prekurzorból szintetizáljuk, az 5. példában leírt módszerek szerint. Az Arg®²⁷, Lys^B3u-NH2 humán inzulin hozam 0,78 g = 22%. DISC PAGE elektroforézissel egy nagyobb sáv migrációja 35%-kal tér el az inzulin migrációjától. Két kisebb sáv látható. Analitikai HPLC-ben a tisztaság 92%; a termék a sertés inzulin előtt jön le. Aminosav összetétel analízis 2 arginin- és 2 lizincsoportot mutat ki molekulánként és különben azonosságot mutat a humán inzulinnal.

ti. példa

l.ys^im, 1Ίιι^Μ - NI iz humán inzulin szintézise

A vegyületet 7,0 g Lys®²⁷, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A( 1-211 inzulin prekurzorból szintetizáljuk, a 6. példában leírt módszereket alkalmazva. A Lys®²⁷-, Thr^B30-NH2 humán inzulin hozam 3,15 g, ez 45%-nak felel meg. DISC PAGE elektroforézis egy nagyobb sávot és két kisebb sávot mutat., a nagyobb sáv migrációja 55%-kal tér el az inzulin vonatkozási sávjától. Analitikai HPLC-vel a tiszLaság 96%-os. A vegyűlet előbb jön le mint a serLés inzulin a fordított fázisú HPLC-ben. Aminosav összetétel analízis 2 lizincsoportot mutat molekulánként, különben azonosságot mutat a humán inzulinnal.

5. példa

Lrs®²⁷ - humán inzulin szintézisé

A vegyületet 7,0 g Lys®²⁷, B(l-29)Ala-Ala-Lys-A(1-21) inzulin prekurzorból szintetizáljuk, az 5. példában leirt módszerek szerint. A l.ys®²⁷, Lys^B30-NH2 humán inzulin hozam 1,57 g, ez 22%-nak felel meg. DISC PAGE eletroforézis egy nagyobb sávot mutat, melynek migrációja 35%-kal tér el a sertés inzulinétól. Kis szennyeződés látható. Analitikai HPLC-vel a tisztaság 94%-os, a vegyűlet jól eluálódik, előbb mint a sertés inzulin. Aminosav összetétel analízis 3 lizincsoportot mutat ki molekulánként különben azonosságot mutat a humán inzulinnal.

10. példa

Gln^bíA, Thi*^M-NH2 humán inzulin szintézise

A vegyúleteL 3,05 g Gin®¹³, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A( 1-21) inzulin prekurzorból szintetizáljuk, a 6. példában leírt módszereket

-917

HU 201097 Β használva. A végső termék hozam 0,88 g, ez 29%-nak felel meg. DISC PAGE elektroforézis egy nagyobb sávot mutat, melynek migrációja 5ő%-kal tér el a sertés inzulin migrációitól. HPLC-vel kimutatott tisztaság 95%-os, a vegyület, később eluálódik, mint a sertés inzulin. Az aminosav összetétel analízis azonosságot mutat a humán inzulinéval.

11. példa

Az (1) általános képletü vegyületek injektálható oldatainak előállítása

Az (I) általános képletü vegyületek steril injektálható oldatait, a hosszú hatás fokának vizsgálata céljából, úgy készítjük, hogy izolonikumként 0,9% (súly/t.érfogat) nátrium-klorid és tartósítószerként 0,15% (térfo- 20 gat/térfogat) m-krezolt alkalmazunk. Injektálható oldatokat készíthetünk még izotonikumként 1,6% (súly/térfogal) glicerint, tartósítószerként 0,3% (súly/térfogat) m-krezolt alkalmazva és ezt 0,01 mólos nátrium-acetát- 25 tál pufferoljuk. A cinkion koncentrációját 0-160 pg/ml határ között változtatjuk. Az oldatok pH-értékét az (I) általános képletü vegyületek izoelektromos pontjától eltérő értékre állítjuk be úgy, hogy az oldatok átlát- 30 szók legyenek 4 °C-on való tárolásnál. Az oldatok 2-10 nmól/ml (1) álLalános képletü \együletet tartalmaznak. A 240 nmól/ml koncentrációt úgy állapítjuk meg, hogy 276 nin-nél mérjük egy m-krezol mentes, koncent- 35 ráltabb lőrzsoldat abszorpcióját, felhasználva ezen származékokra a sertés inzulinnak

6100-as moláris extrlnkciós koefficiensét (lásd: Handbuch dér Inneren Medizin, Vol 7/Part 2A, Editor: Oberdisse, 1975, 113) és felhasználva a monokomponens sertés inzu5 linra megállapított hatást, mely 28,5 U/mg szárazanyagra vonatkozik, [lásd: Diabetes Cár, Vol. 6/Supplement 1(1983).41). 1 U 5,95 nmólnak felel meg.

Injektálható oldatokat készítettünk, 10 amelynek az (1) általános képletű vegyületek 240 nmól/ml mennyiségét tartalmazzák: ezeket és a pH értékeket és cinktartalmat az 1. táblázatban mutatjuk be.

Az inzulinhatás hosszabbítására vonatkozó vizsgalat

A hipoglikémiás hatás meghosszabbítását, melyet az inzulin injektálható oldatai idéznek elő, éheztetett tengerinyulakon vizsgáljuk a British Pharmacopoela 1980, A 142 szerint. Mindegyik tesztoldatot szubkután adagoljuk 15,5 nmól/nyúl dózisban 6 vagy 12 állatba, melyek súlya 3-4 kg és a hipoglikémia lefolyását 6 órán keresztül követjük. Összehasonlításként gyorsan ható készítményt, Actrapid™ sertés inzulin alkalmazunk a vizsgálatokban. A vizsgálatok eredményeit az 1. és 2. táblázat mutatja.

Egyes vegyületek hosszú hatására vonatkozó, nyulakon végzett kísérletek eredményeit, az 1. táblázat mutatja be. A glükóz érték 6 nyúlból számított átlagérték, a kezdeti érLékek %-ában. Az oldatokat 0,9% NaCl-dal tettük izotóniássá, tartósítószerként 0,15% (v/v) m-krezolt használtunk.

]. táblázat

Az (1) általános képletü vegyületek injektálható oldatainak vizsgálata

(I) általános képletű vegyület	Zn pg/ml	PH	Kezdeti glükóz %
l/2h	lh	2h	4h	6h
Lys^B30-NH2 inzulin	0	4,5	53	54	49	79	100
Lys^B3<J-NH2 inzulin	80	4,5	63	62	63	73	80
Lys^B3U-NH2 inzulin	160	4,5	87	80	68	90	93
Arg^B3ü-NH2 inzulin	0	4,5	57	53	51	65	81
Arg^B30-NH2 inzulin	80	4,5	76	68	63	73	78
Thr^B30-NH2 inzulin	0	4,2	46	46	39	64	91
Thr^B3U-NH2 inzulin	160	4,2	64	58	50	70	69
Thr^-OBu* inzulin	0	4,0	59	65	59	79	100
Thr^B30-OBu‘ inzulin	160	4,0	81	75	62	66	88
Thr^B30-(Bu‘)-OBut inzulin	0	4,0	64	60	54	71	82
Arg^B30-Arg^M1-NH2 inzulin	0	4,5	72	70	68	67	68
Arg^B30-Arg^B31-NH2 inzulin	160	4.5	91	87	78	73	68
Actrapid™ sertés inzulin	15	7	53	48	42	70	98

-1019

Hl> 201097 Β

Néhány vegyület hosszú hatására vonatkozó, nyulakon végzett kísérletek eredményeit a 2. táblázat mutatja be. A glükóz értékek, 12 riyúlból számítva, átlagos értékei a kezdeti %-os glukóz értékeknek. A tesztoldatokat 1,6% (w/v) glicerinnel tettük izotóniássá, tartósítószerként 0,3% (w/v) ni-krezolt használtunk és 0,01 mólos nátrium-acetáttal pufferoltuk.

2. táblázat (1) általános képletű vegyület

Zn

Mg/ml pH

Kezdeti glükóz %

6h

lh

2h

4h

Gln^A17,Thr^B30-Nll2 inzulin

4,5

Gln^A17,Lys^B3O-NH2 inzulin

4,5

Gln^B13,Thr^B30-NH2 inzulin

6,7 4,5

Claims

Arg^B27,Thr^B30-NH2 inzulin

4,5

Arg^B27,Thr^B30-NH₂ inzulin

8,5 4,5

Arg^B27,Lys^B3O-NH2 inzulin

4,5

Arg^B27,Lys^B30-NH2 inzulin

10,9 4,5

Lys^B27,Thr^B30-NH2 inzulin

7,4 4,5

Lys^B27,Lys^B30-NH2 inzulin

9,5 4,5

Lys^B3ü-NH2 inzulin

4,5

Vonatkozási inzulin

Actrapid™ sertés inzulin

7

100

Az inzulin vegyületek . . 30 hatoképessegét ség vizsgálatok hoz cink hozzáadása nélkül egérben vércukor csók kéné s-tesztlel állapikészítettünk inzu inoldatokat. Olyan oldatokat tottuk meg (British Pharaiuacopoeia 1980, készítettünk amelyek 240 nmól/ml-t tártálA141-A142). Abból a célból, hogy minimálisra maztak 276 nm-es abszorpció mellett.

Az olcsökkentsük a hatóképesség megállapításának problémáját olyan inzulinok esetén, melyek időzítése a standardtól eltérő, a hatóképes₃₅ datok cinktartalma 8-10 pg/ml, amely a kristályos származékokból adódott. Néhány inzulinvegyület becsült hatását a 3. táblázatban mutatjuk be.

3. táblázat

Hatóképesség inzulinhoz viszonyítva %

Megbízhatóság határok

Ρ = 0,05, %

Gln^A17,Thr^B3e-NH2 inzulin

58-75

Gln^A17,Lys^a30-NH2 inzulin

51-72

Arg^B27,Thr^B30-NH2 inzulin

122

102-145

Arg^B27,Lys^B3B—NH2 inzulin

74-94

A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek fizikai állandóit 4. táblázat tártál- 55 mázzá:

-1121

HU 201097 D táblázat

HPLC analízis

Példa - Töltés tisztaság k’/k'pi (%)

Lys^-NHz

Arg^B3u-NH2

Hl

Hl

0,62

0,67 +2 +2

Arg^B3U-Arg^B31-NH2

Hl

0,52 +3

Gln^A1’-Thr^B30-NH2

Hl

0,86 +2

Gln^A17-Lys^B30-NH2

Hl

0,58 +3

Arg^B27-Thr^B3°-NH2

Hl (i

0,66 +2

Arg^h27-Lys^B3ö-NH2

Hl

0,50 +3

Lys^B27-Thr^B30-NH2

Hl

0,61 +2

Lys^B27-Lys^B30-NH2

Hl

0,45 +3

Gln^B13-Thr^B30-NH2

III

0,87 +2

Gln^A17-Gln^B13-Thr^B3O-NH2

Hl

0,76 +3

Gln^A17-Arg^B27-Thr^B30-NHz

Hl

0,60 +3

Gln^^-Arg^’-Thr^-Nib

Hl

0,61 +3

Lys^B30-Lys^B31-NH2

Hl

0,48 +3

MEGJEGYZÉS: k’ jelentése a kapacitás-fak

SZABADALMI

IGÉNYPONTOK

tor = (te-tí.)/L., ahol

te a kötött vegyület, tu a

1. Eljárás az (1) általános képletű hunem kötött vegyület

mán inzulinszármazék előállítására, ahol az A elúciós ideje, k'pi a sertés in és B betűk, melyeket zárójelben lévő számok zuiin kapacitás-faktora.

követnek, az A-, illetve a B-láncúak a záró

jelben lévő számokkal jelzett peptidfragmenseit jelölik.

E¹ és E⁴ jelentése Glu,

E² Ülu vagy Gin,

E³ Glu vagy Gin,

X Thr, Lys vagy Arg,

Y Thr, Lys vagy Arg,

Z jelentése Lys vagy Arg, li aminocsoport, n értéke 0 vagy 1, és m értéke 1, azzal a megkötéssel, hogy E² és E³ közül legalább az egyik Glu-tól eltérő jelentésű, ha X jelentése Thr, azzal jellemezve, hogy

a) sertés inzulint vagy egy (II) általános képletű bioszintetikus prekurzor vegyületet, ahol az A és B betűk, melyeket zárójelben lévő számok követnek, az A-, illetve a B-láncnak a zárójelben lévő számokkal jelzett peptidfragmenseit jelölik, Q jelentése egy q számú aminosavból álló peptidlánc, ahol q értéke O-tól 33-ig terjedő egész szám, R jelentése Lys vagy Arg, és r értéke nulla vagy egy, és E¹, E², E³, E⁴ és X jelentése a fenti, valamely (111) általános képletű arainovegyülettel - melyben Y, Z, R, m és n jelentése a fenti, és melyben az Y és Z csoportok oldalláncai amino- és hidroxicsoportjai kivánt esetben védve vannak egy amino- és hidr60 oxi-védöcsoportlal - transzpeptidezünk tripszin vagy AchiOmobaeter lyticus lizil-endopeptidáz jelenlétében;

majd az enzim eltávolítása után adott esetben a jelenlévő amino-védőcsoportokat eltávolítjuk; vagy

-1223

HU 201097 Β

h) egy (IV) általános képletű vegyületet, ahol A és B, valamint Ε*, Ε², Ε³, E⁴ és X jelentése a fenti, valamely (111, általános képletü vegyülettel - melyben Y, Z, R, m és n jelentése a fenti, Y és Z csoportok oldalláncai kívánt esetben védve vannak - kondenzálunk tripszin vagy Achromobacter lyticus lizil-endopeptidáz enzim jelenlétében, majd az enzim eltávolítása után adott esetben a jelenlévő amino-védőcsoportokat eltávolítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás az olyan (1) általános képletü vegyületek előállítására, ahol Ε¹, E³ és E⁴ jelentése Glu és A, Β, Ε², X, Y, Z, m és n és lí jelentése az 1. igénypontban megadott, azzal jellemezve, hogy megfelelően szubsztituált anyagokból indulunk ki.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletü vegyületek előállítására, ahol E² jelentése Glu és A, li, E^J, Ε³, Ε⁴, X, Y, Z, m, n és li jelentése az 1. igénypontban megadott., azzal jellemezve, hogy megfelelően szubsztituált anyagokból indulunk ki.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás az olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, ahol Y és Z jelentése Lys vagy Arg, és Ε¹, Ε², Ε³, Ε⁴, A, Β, X, ni, n és R jelentése az 1-3. igénypontok bármelyikében megadott, azzal jellemezve, hogy megfelelően szubsztituált anyagokból indulunk ki.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás az olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, ahol n értéke nulla, Y jelentése egy Lys vagy Arg és A, Β, E¹, Ε², Ε³, Ε⁴, X, Z és R jelentése az 1-4.

igénypontok bármelyikében megadott, azzal jellemezve, hogy megfelelően szubsztituált anyagokból indulunk ki.
6. Eljárás nyújtott inzulin-hatású injektálható oldatok előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-5. igénypontok bármelyike szerint előállított (I) általános képletü humán inzulinszármazékot, ahol A, Β, Ε¹, Ε², Ε³, Ε⁴, X, Y, Z, n, m és R jelentése az 1. igénypontban megadott, legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal keverve, valamint kívánt esetben cinkionok jelenlétében szokásos oldat-formává alakítunk.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a készítményt cinkionok hozzáadásával - előnyösen 2 pg - 2 mg cinkion/ml, legelőnyösebben 5 pg - 200 pg cinkion/ml koncentrációban - állítjuk elő.
8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a készítményt 10 pg/ml és 20 mg/ml cinkiont tartalmazó oldatként állítjuk elő.

Kiadja az Országos Találmányi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: dr. Szvoboda Gabriella osztályvezető R-4960 - KJK

90.3346.66-13-2 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Szabó Viktor vezérigazgató 14

-13HU 201097 B Int Cü C 07 K. 7/40

A 61 K 37/26

A(i-3)-E -A(5-6)-Cy5-A(e-16)-E-A(t8-19)-Cys-Asn (A-tanc) tJ

C

-o co cQ rO¹

LL) tű

OO

CŰ

I m

o

I tO

CŰ

3>

O»-) o

<rl

UJ ru ru to ^ru^

CŰ

I

X

I o

ία.

i <r>

3)

X <r

N

I cú

-14HU 201097 β int. UH C 07 K 7/40

A 61 E 3U/26

E (Λ cn

T co

Ul

I <0

I oo <n t>-lD

O tf)

B (l-6)-Cys-B(8-u)-E-B(u-18)-Cy5