HU194282B - Process for preparing novel insulin derivatives modified on c terminal of b chain and pharmaceuticals comprising the same as active substance - Google Patents

Description

A találmány tárgya új eljárás, módosított inzulinszármazékok, amelyek B-lánca C-terminálisan meg van hosszabbítva, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására.

Az inzulin-Arg“³¹-OH, inzuhn-Arg®³¹-ArgB^{3 2} OH, valamint más, a B-láncokon C-terminálisan bázison modifikált inzulin-származékokból előállított gyógyszerkészítmények speciális adalékanyagok, így például Surfén*'· vagy Protamin adalékanyagok alkalmazása nélkül is igen jó depotulajdonságokat mutatnak. Ilyen származékok előállítását, valamint a készítményeket és alkalmazásukat ismertetik például a találmányi bejelentés napja uán publikált 33 26 472, 33 26 473, 33 27 709, 33 27 928 számú nyilvánosságrahozatali iratok. Az ilyen késleltetett hatású inzulin-készítmények előnye mindenekelőtt a jó elvisehetőség, ami az inzulin-kezelések hosszú időtartama miatt mindenekelőtt a depó segédanyagok hiányzó immun hatásával magyarázható.

Az inzulin bioszintézise során egy közvetlen intermedierből, az egyláncú proinzulin, az un. ..Connecting Peptid” enzimatikus hatásával képződik a kettősláncú inzulin. A reakció nem tökéles végbemenetele során azonban ún. közbenső-inzulin (intermedier-inzulin) is kimutatható igen kis mennyiségben az izolált, nyers inzulinba. Ezen köztitermékek szerkezete ismert, túlnyomórész B31-Arg- és B31-32-Arg-Arginzulin-származékok.

Ha a szarvasmarhákból, sertésekből, vagy emberekből származó proinzulint tripszinnel kezeljük, (Change, Excerpta Medica International Congress Series 231. szám, 297. oldaltól) a megfelelő dezoktapeptidB23-30-inzulin mellett mindenekelőtt B31-Arg- és B32-Arg-Arg-inzulin keveréke képződik. Ezeknek a termékeknek az elválasztása és tisztítása igen munkaigényes, általában többszöri ioncserés kromatografálást igényel, és így nagy a veszteség. Így gyógyászati célra elegendő mennyiségű anyag kinyerése a nyers inzulinból gyakorlatilag nem megoldható. További nehézséget jelent, hogy a humáninzulinnak megfelelő termékek nem állnak rendelkezésre.

Ilyen származékok előállítására alkalmazható eljárás, ha a proinzulint vagy azok analógjait géntechnológiai úton állítjuk elő, majd enzimatikusan hasítjuk, a tisztítási folyamatnál azonban itt is igen nagyok a veszteségek.

Találmányunk célja olyan új eljárás biztosítása, amely segítségével egyszerű módon állíthatók elő az új típusú galenikus készítményekhez szükséges menynyiségben bázison modifikált inzulin-származékok.

A célkitűzésben megjelölt feladatot úgy oldottuk meg, hogy olcsó, bioszintetikus úton nert inzulinból, így humán inzulinból, sertésinzulinból vagy adott esetben ezek előve gyületeiből (prekurzorjaiból) alkalmas peptid-származékok felhasználásával, enzimakatlizált átalakítással állítottuk elő a kívánt terméket.

Az utóbbi években különböző kémiai és enzimatikus eljárások váltak ismertté, amelyek segítségével például a sertésinzulin átalakítható (Biochem. J. 211, (1983) 671-676, 3 903 068, 3 276 961 és 4 320 197 számú amerikai szabadalmi leírások, a 2 069 502 számú angol és 56 951 számú európai bejelentés közzétételi iratai, stb.), továbbá olyan eljárások, amelyekkel például a megfelelő pre-proinzulin-származékok és intermedier-inzlinok átalakításával például humán inzulin nyerhető (például P 32 09 184 számú NSZK beli nyilván «ságrahozatali irat.)

Meglepetésre azt találtuk, hogy a B29 helyzetben lizin-csoportot tartalmazó inzulin szelektív transzamidálása olyan peptidekkel, amelyek Arg- illetve Arg-Arg -csoportokat tartalmaznak, nagy kitermeléssel hajtható végre, akkor is, ha az inzulin a B22 helyen Árucsoportot tartalmaz. Ugyanez vonatkozik a proinzulinra (ahol az A-lánc O-ik helyén Lys-Arg-csoport van és analógjaira is.

A találmány a fentiek alapján (1) általános képletű új inzulin-származékok új előállítási eljárására vonat kozik, amelyek képletében R¹ jelentése hidrogénatom vagy H—Plie, és R³⁰ jelentése L- vagy D-konfigációjú és Arg-OH vagy Arg-Arg-OH, és amelyek izoelektromos pontja 5,8 feletti érték.

A találmány szerinti eljárásnál úgy járunk el, hogy

a) (I) általános képletű inzulint, amelynek képletében R¹ jelentése hidrogénatom, vagy H-Phe, R³⁰ jelentése Thr és R³¹ jelentése hidroxilcsoport vagy karboxi-védőcsport, vagy

b) sertés proinzulint (III) általános képletű H-R³⁰—R³³ peptid- vagy aminosav-származékkal, a képletben R³⁰ és R³¹ jelentése a fentt és a fenti vegyietekben az arrúnocsoportok adott esetben védve lehetnek, — reagáltatjuk, tripszin vagy tripszinnek megfelelő olyan endopeptidáz jelenlétében, amely a Lys és Arg karboxilcsportján hasít, vizes közegben, adott esetben alkalmas szerves oldószer adagolása mellett, az inzulin izoelektromos pontja alatti pH-értéken, előnyösen 5,4 alatt, és adott esetben a védőcsoportokat eltávolítjuk.

Különösen előnyösek azok a találmány szerinti eljárással előállított (I) általános képletű vegyületek, amelyekben R¹ jelentése H-Fhe és/vagy R³*³ jelentése Thre, továbbá amelyekben az A-lánc és a B2—30 láncok a humán inzulin szekvenciájának felelnek meg.

A találmány szerinti eljárással például a következő vegyületeket állítjuk elő:

Des-PheB¹-sertésinzulin-Arg®^{3 l}-OH Des-Plie®¹ -hujmáninzulin ArgB^{3 1} -OH Des-PheB¹ -sertésinzulin-Argb ¹ -ArgB^{3 2}-OH Des-PheB¹ -humáninzuhn-ArgB³¹ -ArgB^{3 2} -OH Sertésinzuiin-ArgB³¹ -OCH3 Humáninzulin-ArgB³¹ -OCÍL Szarvasmarha inzulin-ArgB³ *-0CH3 Sertésinzulin-ArgB³¹ - Arg®^{3 2}-OCH3 Humáninzulin-ArgB³¹ - ArgB^{3 2} -OCH3 Humáninzulin-D-ArgB³¹ -OH Humáninzulin-D-ArgB³¹ -ArgB^{3 2}-OH Humáninzulin-ArgB³¹ -D-Aig®³² -OH Humáninzulin-ArgjninolB³¹ Humáninzulin-Val®³¹ -ArgB^{3 2} -OH Humáninzulin-Argb³¹ -Argininolb³² Humáninzulin-ArgB³¹ 3-amino-tetrahidrofurán-2-on Humáninzulin-ArgB³¹ ArgÖ³²-3-amíno-tetrahidrofürán-2-on

Humáninzulin-ArgB³¹ NH₂

Humáninzulin-ArgB³¹ -Arg“₃₂ -NFfi

Humáninzuhn-(B30)-NH-CH₂-CH₂ -NH₂

Humáninzulin-(B30)-NH-CH₂-CH₂-NH₂

Humáninzulin-ArgB³¹ -O-CHj -CHi -NHj

Des-ThrB^{3 0} -fiúmén inzulin-ArgB³ ®-OH

Humáninzulin-ArgB³¹ -CH₂-CH₂ 9-N(CH₃)₂ Humámnzuhn(B30)-O-CH₂ -CH₂ -N(CH₃ )₃ Humáninzulin-(B30)-NH-CH₂-CH₂-N(CH₃)₃ Des-ThrB³⁰ -hu mánínzúlin-ArgB³®-ArgB³¹ -OH

194.282 különösen

Hu máninzuün-ArgB³¹ -OH

Humáninzulin-ArgB³¹-ArgB^{3 2}-OH.

Azok a csoportok, amelyeket a találmány szerinti eljárás során adott esetben a B-lánc C-terminális karboxilcsoportjának védésére alkalmazunk, mindenekelőtt észter- és amidcsoportok, előnyösen (Cj — C₆)alkoxi-, (C₃~C₆)-cik)oalkoxi-, NH₂-, (C|~C₆)-a)kil· arnino-, Di-fCi-Cej-alkil-amino- vagy bázisos csoportok, mint például anűno-(C]-C₆)-alkoxi-, (Q -C₄)aIkíl-anüno-(C₂—C₆)-alkoxi-, Di-(Cj -C₄)-alkil-amino(C₂-C₆)-alkoxi-, tri-(Ci~C₄)-aminonio- (C₂—C₆)-alkoxi-, anáno-(C₂-C₆)-alkil-ainino-, /(C_x -C₄)-alkilaniino/ -(C₂-C₆)-alkil-amino-, /di-(Ci —C₄)-alkál-anáno/ -(C₂-C₆)-alkil-amino, vagy /tri-(Cj-C₄) -alkilanunonio/ -(C₂-C₆)-allál-amino-, különösen -0(CH₂)_p-NR₂-, -0-(CH₂)p-NR₃-, -NH-(CH₂)_p-NR₃csoport, ahol p = 2-6 és R azonos vagy különböző és jelentése hidrogénatom vagy (C, —C₄)-alkil-csoport.

Inzulinként alkalmazhatunk bármely Lys (B29) tartalmú természetből izolálható, előnyösen sertésekből vagy emberekből izolált inzulint vagy proinzulint. Pre-propinzulinként mindenekelőtt a géntechnológiai úton előállítottak jönnek számításba, amelyek a preszekven«iájukban a megfelelő kódolás útján a molekula BO helyzetében egy bázikus aminosav-csoportot tartalmaznak és amelyek tripszinnel vagy ripszinnek megfelelő szabad vagy hordozófixált enzimmel lehasíthatók.

A találmány szerinti eljárásnál PheB¹ -inzulin kiindulási vegyületként alkalmazhatjuk például a 20 05 658 számú NSZK-beli szabadalmi leírásból vagy a 46 979 számú európai bejelentés közzétételi iratából ismert vegyületeket.

Géntechnológiai eljárásokkal kiindulási vegyületek céljára humán-vagy emlos-proinzulinokát nyerhetünk. Ezek mellett azonban még viszonylag egyszerű plazmidok is képződnek, amelyekből a megfelelő pre-proinzulin-származékok lehaátásával új inzulin-származékok keletkeznek, mivel ezek a természetes B31 és B32 láncon található arg/nin helyett más semleges vagy bázikus anánosavat kódolnak.

A rekombináns DNS-technológia alkalmazásával való proinzulin előállításhoz egy proinzulin-aminosavszekvenciának megfelelően kódolt DNS-szekvenda kialakítása szükséges, akár izolálás, akár konstrukdó vagy e kettő kombinációjának segítségével.

A proinzuhn-DNS-t ezután a begyűjtés fázisában alkalmas kolinizáló- vagy expresszió-hordozóva] iktatjuk be. A hordozó a megfelelő mikroorganizmus transzformálására szolgál, amelyet ezután fermentációs eljáásnak vetünk alá, amikoris a proinzulin-tartalmú vektor egy további másolata és a proinzulin, egy proinzuiin-származék vagy egy proinzulin-prekurzor (lietve pre-proinzulin-származék) expressziója képződik.

Amennyiben az expressziós termék egy proinzulinprekurzor, akkor ez a termék általában a proinzulinaminosav szekvenciát tartalmazza, amely a régállású aminocsoportján keresztül egy fehérjeszegmenshez kapcsolótok, amely normál esetben génszekvenciával van kifejezve és amelyben proinzulint vagy proinzulin-származékot alkalmaztunk.

A találmány szerinti eljárásnál az enzim-katalizált reakciónál pepiidként vagy aminosav-származékként mindenekelőtt adott esetben az oldalláncokon és a kaboxilvégcsoportjukon védett di-, tri- és tetrapeptideket alkalmazunk, amelyek N-terminálís végcsportként Gly-t, L- vagy D-aminosavat tartalmaznak. Azok között, amelyek aminosav-karboxil-végcsoportja amidéit vagy észterezett, előnyös a koiin-észter, vagy a kvatemer-aminóniumcsoportot tartalmazó amid. Az aminosavak szabad COH·, OH-, SH-, ω-ΝΗ₂·, guanido- és/vagy imidazol-csoportjai kívánt esetben a peptidkémiában ismert eljárások szerint védettek lehetnek (Bodanszky és társai-.Peptide Synthesis, 2. kiadás (1976), John Wiley és Sons).

A védőcsoportokat és a védési reakció fajtáját az aminosav fajtájától és a C-terminális, karboxücsoportot blokkoló csoporttól függően választjuk meg.

A találmány szerinti ejárásnál előnyösek azok a dipeptidek, amelyeknél az N-terminálís treonilcsoport L-(D-argininhoz kapcsolódik, és megfelelő, bázikus úton lehasíthatő védőcsoporttal védve van.

Az L-/ vagy D-Arg, irreverzibilis karboxil-védőcso portjaként báziskus diamint is köthetünk a pepiidhez. Ezek a dipeptidek különösen akkor előnyösek, amikor D-Arg aminosavat alkalmazunk, mivel ezeket a dipeptid-származékokat a sterszelektív tripszin vagy például a lizin-endopeptidáz-Lys-Ci nem ismeri fel és így az átalakítási reakciónál oldalíánc védelemre nincs szükség.

Aminokomponensként bázikus aminosavakat, így például D- és L-arginint és D- vagy L-lizint is alkalmazhatunk. A megfelelő tripeptideknél a karboxilcsoportokon kívül az egyes oldallancoknak is savas vagy bázikus úton lehasítható védőcsoportokkal védettnek kell lenni. A D-aminosavak oldalláncvédelmét azonban úgy keli megválasztani, hogy az a reakciót követő tisztítási műveletet elősegítse.

A fenti peptideket és a minosav-származékokat ismert eljárások szerint állíthatjuk elő (például „The Peptides An a lys is, Synthesis, Biology.l. kötet, Major Methods of Peptide Bond Formáljon, A rész, E. Gross

J. Meierhofer szerkesztésében, Acadenác Press N.Y. (1979)”.

A találmány szerinti eljárásnál a tripszinen kívül olyan endopeptidázokat is alkalmazhatunk, amelyek a bázikus aminosavak karboxilvégén lévő speciális peptidkötések hasítására képesek, (lásd például 17 938 számú európai bejelentés közre bocsátási iratát).

Az enzimatikus átalakításhoz az aminosavakat, illetve peptidvegyületeket az ínzulínkomponens menynyiségére számított 40—150-szeres feleslegben alkalmazzuk. Az enzimhordcjzó arány az inzulinra számolva általában 1:5 és 1:20 közötti érték, előnyösen 1:10.

Mivel a találmány s/ennti eljárásnál az aminosavak és peptidvegyületek csekély vízoldhatóságúak, oldatba vitelük érdekében a reakcióközegben vízzel elegyedő szerves oldószereket, így példáulMnetanolt, tlimetil-formamidot vagy dioxánt alkalmazunk.

A reakcióközegben azonban a víztartalom nem szabad hogy 50% alá essen, hogy az inzulin és/vagy tripSzin kitermelés-csökkentő denaturáJódása megakadályozható legyen.

Az enzimatikus reakciónál a pH érték általában 4-5 közötti érték, előnyösen 4,5. Az említett tartománynál magasabb pH értéknél a kívánt átamídálási reakciók az LysB²’ helyeztben az ArgB^{2 2}-néf bekövetkező nemkívánatos proteohtikus hasítások miatt visszaszorulnak.

Előnyösek azok a vegyületek, amelyekben R¹ jeientése Η-Phe .és/vagy az A-lánc, valamint a (B2-29) láncok a humáninzulin szekvenciájának felel-32

194.282 nek meg, és/vagy amelyekben R³ * jelentése OH-csoport.

Különösen előnyösek azok az inzulin-származékok amelyekben a B30 helyen Arg álL

Mindezekre az inzulin-származékokra jellemző, hogy a molekulák felületén lévő pozitív töltéseknek köszönhetően izoelektromos pontjuk a semleges tartonrány felé tolódott el. Az egyes származékoktól függően az izoelektromos pont értékei 5,8 és 8,5, előnyösen 6,2 és 8,2 között vannak. Ezáltal ezek a származékok semleges közegben kevésbé oldhatók, mint a természetes inzulin vagy a proínzulin, amelyek izoelektromos pontja és így a maximális oldhatatlansági tartománya pH = 5,4-nél van és így semleges tartományban jobban oldódnak.

Az inzulin és proinzulin oldhatósági tulajdonságait az izoelektromos pont feletti, azaz a terápiás szempontból leginkább érdekes semleges tartományban dnkionok adagolásával befolyásolhatjuk. ank, mint depo-hatású (késleltető hatású) anyag oly módon hat, hogy az inzulin hexámos alakját, valamint annak kristályosodási hajlamát stabilizálja. Szubkután adagolásnál ezekaz aggregétumokismét oldódnak.

Egy másik ismert depó-módszer szerint az inzulint vagy pro-inzulint valamely bázikus proteinnel, így például globinnal vagy protaminnal képzett komplexe alakjában kristályosítják.

A proinzulin oldatban vagy valamely, a fenti elvek szerint képzett vegyülete formájában történő felhasználása esetén gondoskodni kell arról, hogy egy további proteolitikus lebomlási folyamat révén a természetes, hatékony inzulint felszabadítsuk. Az intakt proinzulin biológiai hatása kb. csak 1/8 része az inzulinénak, mivel a feltételezések szerint a biológiailag aktív felületek egy része, az úgynevezett receptor kötési területek a proinzulinban jelnlévő C-peptidkötések révén blokkolva vannak. Proinzulinként a diabetes kezelésében csak homológok, azaz olyanok, amelyeknek humán-szekvenicája van (lásd pL a 32 32 036 számú NSZK-beli közzétételi iratot), jöhetnek számításba. A heterológ proinzulinok jellegzetes immunogenitással bírnak. Ez azért is említésreméltó, mert a humán proinzulin variánsok is fellelhetők a C-peptidrészben.

Meglepetésre azt találtuk, hogy inzulin-ArgB³⁰-OH és más inzulin-szármzék, amelynek B-lánca a C-terminális végén bázikus karakterű szerves csoportot hordoz, szemben a proinzulinnal, a természetes inzulinhoz hasonló biológiai aktivitást mutat.

A találmány oltalmi körébe tartozik még az (I) általános képletű inzulin-származékokat és gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagot tartalmazó, elsősorban diabetes mellitus kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítási eljárása is.

A találmány szerinti eljárással előállított készítményeknek teljesen új késleltetési mechanizmusuk van és depo-segedanyag, így például cink vagy protaminszulfát adagolás nélkül is hatékonyan alkalmazhatók. A depohatás ezen készítmények esetében egy belső, proteinkémiai és fizikai okokra, az inzulin-származékok izoelektromos pontján mutatott nehéz oldhatatlanságra vezethető vissza. A fiziológiai körülmények között végbemenő újraoldódás feltehetően az utólagosan felvitt bázikus csoportok lehasadásával magyarázható, amely a tripszín és/vagy tripszin-jellegű vegyület és/vagy a karboxi-peptidáz B és/vagy karboxipeptidáz B-jellegű és/vagy észteráz-aktivltásnak köszönhető. A lehasadó csoportok vagy tisztán fiziológiás metabolitok, így aminosavak, vagy könnyen mettabolizálható, fiziológiásán elfogadható anyagok.

A találmány szerinti eljárással előállított új inzulinszármazékok, a szakirodalomban leírt intermedierekkel ellentétben, amelyek heterológ C-peptid részeket tartalmaznak, általában nem erősebb immunogén hatásúak, mint a megfelelő inzulin maga.

A találmány szerinti eljárással előállított készítmények egy vagy több új inzulin-származékot tartalmaznak.

A készítmények pH tartománya 2,5 és 8,5 között van, alkalmas izotonizáló szert, konzerváló szert és adott esetben valamely alkalmas pufferanyagot tártál· maznak, amely utóbbit az 5,0-8,5 közötti pH tartomány beállítására szolgál.

A találmány szennti eljárással előállított készítmények egy jellegzetes formájánál a hatóanyagot az izoelektromos pont alatt, egy fiziológiásán elfogadható hordozóanyagban oldjuk. Ennél a pH értékét 5,0 körüli értéken tarthatjuk, ami lényegesen magasabb, mint egy savas Altinsulin készítmény pH értéke (pH3). Egy semleges injekcióoldat az elviselhetőség szempontjából is igen előnyös.

A találmány szerinti eljárással előállított készítmények egy másik előnyös formája a szuszpenzió, amelyeknél az amorf vagy kristályos formájú hatóanyagot valamely semleges pH-jú fiziológiásán elfogadható hordozóanyagban szuszpendáljuk.

Lehetséges azonban, hogy a találmány szerinti vegyületek nehéz oldhatóságát a fiziológiás pH tartó mányban depoanyagokkal, így például cink vagy protamin-szulfát adagolásával még tovább fokozzuk. A pótlólagosan bevitt cink mennyisége 100 Mg Zn² */100 inzulinegység, általában 50Mg Zn^í+/100 inzulinegység. A protamin mennyisége 0,28 mg — 0,6 mg/100 inzulinegység (protanun szulfátra számolva). Ily módon a jövőben különösen hosszú ideig ható készítmények állíthatók elő, amelyek szélesebb körben lesznek felhasználhatók, mivel az inzulinból így egy terápiás alapmennyiség elegendő lesz. Ez már most egy lényeges felismerés az inzulinadagolás számára.

Fiziológiásán elfogadható és az mzulinnal is kom patibihs hordozóanyagként olyan steril vizes oldatokat alkalmazhatunk, amelyeket a vérrel a szokásos anyagokkal, így például glicerinnel, konyhasóval, glukózzal izotóniásra alakítottunk, és amelyekhez még további segédanyagokat, így például konzerválószereket, mint például fenolt, mkrezolt vagy p-hidroxibenzoesavat is adagolhatunk. A hordozó tartalmazhat még pl. pufferanyagokat, így például nátrium-acetátot nátrium-citrátot vagy nátriumfoszfátot. A pH beállítására híg savakat (pl. sósavat) vagy híg lúgokat (pl. nátrium-hidroxidot) használunk.

A találmány szerinti eljárással előállított készítményekben az inzulin-származékokat felhasználhatjuk alkáli- vagy ammóniumsóik formájában is. A készítményekben egy vagy több (I) általános képletű inzulin-származékot alkalmazunk tetszőleges mennyiség ben akár oldott, akár amorf vagy kristályos formában.

Gyakran előnyös, ha a találmány szerinti eljárással előállított készítményekben megfelelő mennyiségben alkalmas stabilizátorokat is alkalmazunk, amelyek megakadályoznák, hogy különböző anyagokkal érintkezve termő-mechanikus hatásokra a protein kicsapódjon. Ilyen anyagokat írnak le pL a 18 609 számú európai és a 32 40 177 számú NSZK-beli bejelentések közzétételi iratában, vagy a 83/00288 számú PCT be-42

194.282 jelentésben.

A találnrinv szerinti eljárással előállított készítményeknél, amelyek valamely ismert késleltetőanyagot, így pl. proiamin szulfátot, globint vagy cinket tartalmaznak megfelelő mennyiségben a késleltetőanyagot a hatóanyaggal vagy annak egy részévéi elkeverve alkalmazzuk, de a hatóanyagokat több különböző késle hetöanyagi>t U.talmazó keverékkel is kombinálhatjuk.

A fentiek alapj m a találmány szerinti eljárással előállított készítményekkel igen sokrétű és igen finoman beállítható hatást érhetünk el, így felhasználásukkal jelentős haladas mutatkozik elsősorban a diabetes kezelésénél felépe utóhatásokkal kapcsolatosan.

A találmány sz ;rinti eljárási a következő példákkal illusztráljuk, anélkül, hogy azokra korlátoznánk. A példákban Adoc jelentése adamantil oxi-karboxil-, Ilac jelentése ecetsav, DMF jelentése dimetil-formamid és Hl jelentése humáninzulin,

1. pél da b g sertésinzulint és 37 g H-Thr-Arg (Adoc)₂-OButHa c-ot 20 ml vízben es 5 ml jégecetben oldunk és a pH értekét jégeceitel 4 6-re beállítjuk. Ezután az oldatot 0°C-ra hűtjük, es hozzáadunk 2 ntl vízben oldott 0,6 g tripszint. A reakciókeveréket 4—10°Con 24 órán át állni hagyjuk, majd a humáninzulin-B31 -Arg (Adoc)j-OBut reakciót érmékét 200 ml metanollal vagy acetonnal kicapjuk és lecentrifiigáljuk. A tiszta oldalból a dipeptid-száimazékokat visszanyerhetjük.

A csapadékot mégegyszer metanol/éter eleggyel mossuk, vákuumban szárítjuk. HPLC (nagynyomású rétegkromatográfia) segítségével meghatározzuk, hogy a nyers keverék 47% HI-ArgB³¹ (Adoc)₂-OBut terméket tartalmaz. Az elválasztást és a tisztítást szilikagélen a 82 359 számú európai bejelentés közzétételi iratában leírtak szerint végezzük.

A Hl ArgB³¹ OH előállítását a fenti termékből egy órás trifluor-e cetsavas kezeléssel, majd éteres kicsapással végezzük.

példa

600 mg sertésinzulint és 12,6 g Hac-Thr-Arg (Adoc)₂-Arg-(Adoc)₂-OButot együtt 2 ml víz, 0^8 ml DMF és 0,5 ml ecetsav elegyében oldunk és 0 C-ra hűtjük, majd hozzáadunk 0,2 ml vízben oldott 60 mg tripszint. 24 óra elteltével HPLC segítségével 40% HI-ArgB³¹-(Adoc)2-ArgB³¹ (Adoc)2-OBut mutatható ki.

példa mg sertésjnzulint és 676 mg Hac-2- HCl+Thr (But>D-Arg-Arg (Adoc)₂-OBut-ot 0,5 ml víz, 0,2 ml dímetilformamid és 0,1 ml ecetsav elegyében oldunk, majd az oldat pH-ját ríetíl-aminnal 5 értékre beállítjuk. Ezután hozzáadunk 0,1 ml vízben oldott tripszint. 24 óra elteltével HPLÍ segítségével 34% HI-(B30)-(But)D-ArgB”-ArgB³² -(Adoc)₂-OBut mutatható ki.

4. példa g humáninzulint és 48 g HCl.Hac.Thre (Bút).Arg (Adoc)₂OBut-ot 20 ml víz és 5 ml ecetsav elegyében oldunk és az 1. példában leírtak szerint 0,6 g tripszinnel reagáhatjuk. 16 óra után az átalakulása 35%-os.

5. példa mg sertés-proinzulint és 483 mg Hac.HCl.Thre (Bút)-Arg (A doc)₂-OBut-ot 0,5 ml víz és 0 3 ml ecetsav elegyében oldunk, a pH-t 5,0 értékre beállítjuk, és 0,1 ml vízben oldott 8 mg tripszinnel reagáhatjuk. Az átalakulás mértéke 24 óra után 37%.

6. példa mg sertés-proinzulint és 1,2 g Hac.Thre-Arg (Adoc)₂-Arg (Adoc)₂ OBut-ot az 5. példában leírtak szerint reagáltatunk. Az átalakulás HPLC meghatározás alapján 3 3/Los.

7. példa

600 mg Dez-PheB' sertésinzulint és 12,6 g Hac. Thr Arg (Adoc)₂-Arg (Adoc)₂-OBut-ot 2 ml víz, 0,8 ml DMF és 0,5 ml e> etsav jelenlétében oldunk ésO°Cra lehűtjük Ezután hozzáadunk 60 mg tnpszint 0,2 ml vízben oldva. 24 óra elteltével HPLC segítségével 45% Dez PheB’-HI-ArgB³¹ -(Adoc )2-ArgB^{3 2}-(Adoc )2 -OBut mutatható ki.

8. példa

Az 1. példában leírtak szerint járunk el azzal a különbséggel, hogy 6 g humáninzulint és 48 g 1+Cl.Hac. Thr (Bút) Arg(Adoc)₂-OBut-ot 0,6 g lizil-endopeptidáz jelenlétében reagáltatunk Az 1. példa szerinti terméket 34%-os kitetmeléssel nyerjük.

A fenti példák szerint előállított vegyületeknél az alábbi izoelektromos pont-értékeket:

Hl ArgB³¹ OH: 6,5

HI-ArgB³¹ ArgB^{3 2}-OH: 7,0 valamint az alábbi retenciós időket (HPLC) határoztuk meg:

Sertésinzulin: t= 23 perc

HI-ArgB³1 -OH: t - 26 perc

HI-ArgB³» ArgB^{3 2} -OH: t = 28 perc

Dez PheB¹-Arg31-Arg³²-OH: t- 20 perc

HI-ArgB³¹ -oh tartalmú, késleltetett hatású készítmény 10 ml össztérfogatú vizes készítmény az alábbi komponenseket tartalmazza:

Hl-ArgB³¹ OH (27,5 NE/rng) 14,5 mg

Protamm-szulfát 1 3 mg

Nátriumdihidrogén-foszfát-dihidrát 21,0 mg m-Krezol 15,0 mg

Fenol 6,0 mg

Glicerin 160,0 mg

A készítmény pH értékét In HCJ111. In NaOH adagolásával 7,3-as értékre állítjuk be.

A knstálycs zuszpenziókészítmény 0,4 NE/kg dózisban nyuíaknak adagolva jelentős késleltető hatás mutatható ki.

Claims (8)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1 Eljárás új (1) általános képletű inzulin-származékok — a képletben

   R* jelentése hidogénatom vagy H-L-Phe,

   R³⁰ jelentése L-Thr,

   R³¹ jelentése L- vagy D-konfigurációjú Arg-OH vagy Arg-Arg-OH és amelyek izoelektiomos pontja 5,8 feletti érték - előállítására, azzal jellemezve, hogy

   a) (I) általános képletű inzulint amelynek képlettben R^l és R³⁰ jelentése a fenti, R^{3 f} jelentése hidroxilcsoort vagy karboxi védöcsoport, vagy ) seriésproinzulint valamely (III) általános képletű

   H-R³⁰-R -OH pepiiddel — a képletben R'° és R³¹ jelentése a tárgyi korszerinti — és az anunpsavak adott esetben védettek lehetnek — reagáltatunk tripszin vagy endopeptidáz jelenlétében, adott esetben alkalmas szerves oldószer adagolása mellett az inzulin izoelektromos pontja alatti pH-értéken, előnyösen 5,4 altt és adott «setben a védőcsopor tokát eltávolítjuk.
2. 2 Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a humáninzulin szekvenciájának megfelelő (I) általános képletű vegyülelet reagál tatunk (III) általános képletű - a képletekben R¹, R³⁰, R³¹ Zés Y jelentése a fenti - vegyillettel.
3. 3. Eljárás gyógysezrkásJtmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 1 — 2. igénypontok szerinti eljárással előállított (I) általános képletű in.-ulin-száiiua/ékot a képletben R¹, R³⁰ és R³¹ jelentése az 1. igénypont szerinti — gyógyászatilag elg fogadható hordozó anyaggal és adott esetben egy vagy több késlelteti) hatású és/vagy depo-segédanyaggal és/vagy egyéb segédanyaggal összekeverve óidat vagy szuszpenzió formájú gyógyszerkészítménnyé alakítunk.
4. 4. A 3. igénypont szennti eljárás, azzal j e 11 e 10 m e z v e, hogy az oldat vagy szuszpenzió pH értékét

   2.5 és 8,5 közötti értékre állítjuk be, alkalmas izotonizálószer, valamint konzeiváloszei jelenlétében.
5. 5. A 3. vagy 4. igénypontok bánuelyíke szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oldat vagy szusz- penzió pH értékét alkalmas pufféi segítségével 4,0 és

   8.5 közötti értékre állítjuk be
6. 6. A 3—5. igénypontok bármelyike szennti eljárás azzal jellemezve, hogy a készítményhez depó segédanyagként 0- 100 pg cinktt alkalmazunk 100 iiizulinegység mennyiségben.

   20
7. 7. A 3-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, a'zal jellemezve, hogy a késlebető hatású segédanyagot a teljes hatóanyagmeunyiséggel vagy annak egy részével elkeverve alkalmazzuk.
8. 8. A 3-7. igénypontok bármelyike szerinti eljáiás, azzal jellemezve hogy az I igénypont szerinti

   25 eljárással előállított (l) általános képletű inzulin-származékot több, különböző késleltető hatású segédanyaggal keverjük el.