HU192254B

HU192254B - Process for producing human leucocite and human gamma interferons in consecutive steps

Info

Publication number: HU192254B
Application number: HU834237A
Authority: HU
Inventors: Miklos Toth; Ilona Beladi; Sandor Toth; Valeria Endresz
Original assignee: Egyt Gyogyszervegyeszeti Gyar
Priority date: 1983-12-13
Filing date: 1983-12-13
Publication date: 1987-05-28
Also published as: BG50035A3; JPS60139700A; JPH0475920B2; US4696899A; CS969684A2; HUT38399A; EP0146107A3; RO93446B; DD266002A7; FI844897L; EP0146107A2; SU1713591A1; RO93446A; CS260049B2; FI844897A0

Description

Találmányunk tárgya eljárás humán leukocita és humán gamma interferon egymást követően történő előállítására.

Találmányunk egyazon sejtpopulációval két lépésben teszi lehetővé az alfa és gamma interferon előállítását, így a korlátozott mennyiségben rendelkezésre álló emberi fehérvérsejt interferon termelő képessége maximálisan kihasználható.

Ismeretes, hogy humán leukocitákban vírusokkal alfa, mitogénekkel pedig gamma típusú interferon állítható elő. A két interferon előállításának korlátja, hogy az emberi leukociták csak limitált mennyiségben állnak rendelkezésre. A humán terápiában mindkét interferonra egyformán szükség van, mivel az egyes interferonok különböző előnyös tulajdonságokkal rendelkeznek (az alfa főleg antivirális, a gamma főleg antitumor hatással), továbbá az interferonok kombinált alkalmazása egymás hatását (antivirális, antitumor, immunomoduláns) potencírozó aktivitása következtében - indokoltnak látszik. Mivel mindkét interferon előállítása a korlátozott mennyiségben rendelkezésre álló leukocitákban történik, az egyik interferon gyártása szűkíti a másik előállításának lehetőségét.

Találmányunk célkitűzése az alfa és gamma interferon egymást követő előállítása ugyanazon fehérvérsejt kultúrában. Régi törekvés, hogy ugyanazon sejtpopulációval alfa-interferont egymás után többször is elő lehessen állítani. Ezen próbálkozások kudarccal végződtek, mivel kiderült, hogy a sejtek által termelt nagy mennyiségű alfa interferon visszahat a sejtekre, azokat hiporeaktív állapotba hozza, vagyis a következő indukció során a sejtek alfa interferont termelő képessége elenyésző.

Találmányunk alapja az a felismerés, hogy a gamma interferont termelő rendszer nagy mennyiségű alfa interferonnal történő kezelést követően sem kerül hiporeaktív állapotba, sőt a tapasztalatok szerint több interferont állít elő, mint a kezeletlen. Ez érvényesül az alfa interferon termelési periódus végén is, mely nagy mennyiségű alfa interferont eredményez és a gamma interferont termelő sejtek interferon termelő képessége megtartott, sőt fokozott.

Találmányunk tárgya eljárás alfa- és gammainterferon előállítására a vér fehérvérsejt-frakciójának (buffy coat) elválasztása, a vörösvértestek eltávolítása, a leukociták megfelelő tápoldatban történő szuszpendálása, majd alfa-interferon induktorral és gamma-interferon induktorral történő kezelése útján, oly módon, hogy az alfa-interferont és gamma-interferont ugyanazon fehérvérsejt kultúrában egymás után termeljük oly módon, hogy a vér fehérvérsejt-frakciójának elválasztása, a vörösvértestek eltávolítása és a leukociták megfelelő tápoldatban történő szuszpendálása után kapott szuszpenziót alfa- vagy beta-interferonnal előkezeljük, valamely alfa-interferon inducerrel érintkezésbe hozzuk, az alfa-interferon-tartalmú folyadékot a sejtektől elválasztjuk, az alfa-interferont kívánt esetben kinyerjük, a sejteket mossuk, megfelelő tápoldatban szuszpendáljuk, valamely mitogén ágenssel kezeljük, a gamma-interferon-tartalmú folyadékot a sejtektől elválasztjuk és a gamma-interferont kívánt esetben kinyerjük és kívánt esetben alfa-interferon-mentesítjük.

A találmányunk tárgyát képező eljárásnál kiindulási anyagként alvadásban gátolt, legfeljebb 48 órán át G-8 ’C-on tárolt emberi vérből származó fehérvérsejteket (buffy coat) alkalmazunk.

Alvadásgátlásra ACD-oldatot (citromsavat és dextrózt tartalmazó oldat) vagy különböző bázisokkal (pl. adeninnel vagy guaninnal) kiegészített ACD oldatot használhatunk. Az összegyűjtött fehérvérsejteket gradiens-centrifugálással (pl. Ficoll vagy Percoll segítségével) vagy előnyösen ammónium-kloriddal történő hemolízissel távolíthatjuk el. Előnyösen járhatunk el oly módon, hogy a koncentrált fehérvésejt szuszpenziót 0,5-1,0%-os, optimálisan 0,83 %-os 0-10 ’C hőmérsékletű ammónium-klorid oldattal elegyítjük 1:3-20, előnyösen 1:5 térfogat arányban. A szuszpenziót 5-20 percen át, előnyösen kb. 10 percig 0-8 ’C-on keveréssel vagy anélkül inkubáljuk. A szétesett vörösvértestektől elválasztjuk a leukocitákat (pl. centrifugálással). Előnyösen járhatunk el oly módon, hogy az aramónium-kloridos kezelést megismételjük úgy, hogy 1 térfogatrész sejtszuszpenzióra 10 térfogatrész ammónium-klorid oldatot alkalmazunk.

' A tisztított fehérvésejteket ezután valamilyen aminosavakat és vitaminokat tartalmazó szövetkultúra tápoldatban inkubáljuk (pl. Eagle-féle tápfolyadék, RPMI 1640, Dulbecco módosított MÉM, Glasgow módosított MÉM stb.). Előnyösen alkalmazható továbbá az alábbi összetételű, olcsó, autoklávozható tápoldat:

Komponens Mennyiség kalcium-klorid 175-350 mg/1 kálium-klorid 300-500 mg/1 magnézium-szulfát vagy ekvivalens magnézium klorid 175-500 mg/1 nátrium-klorid 5000-7000 mg/1 nátrium-hidrogén-karbonát 200-3500 mg/1 nátrium-dihidrogén-foszfát 30-150 mg/1 glükóz 500-5500 mg/1 ferri-nitrát 0-0,2 mg/1

A sejtszámot ÍOMO⁸, előnyösen 10⁷ sejt/ml értékre állítjuk be.

. A felhasznált tápfolyadékot, illetve tápoldatot valamely állati vagy emberi szérummal vagy gamma, globulin mentesített szérummal egészítjük ki (0,5-10%). A tápfolyadékhoz vagy tápoldathoz valamilyen antibiotikumot is adunk, célszerűen neomicint vagy gentamicint.

Ezután a sejteket alfa vagy béta interferonnal történő kezelésnek vetjük alá. E célra inducermentes nyers, vagy tisztított interferont alkalmazunk 10—500 NE/ml, előnyösen 200-300 NE/ml mennyiségben. Az előkezelés hőmérséklete 35—39 ’C, előnyösen 37 ’C, időtartama 1-6 óra, előnyösen 2 óra.

A sejteket ezután valamely alfa interferon inducerrel, előnyösen nyers vagy tisztított Sendai vírussal hozzuk érintkezésbe, előnyösen 100-800, különösen előnyösen 400 hemagglutináló egység/ml koncentrációban.

Az indukció időtartama 5-48 óra, előnyösen

15-20 óra, az alkalmazott hőmérséklet 35-39 ’C,

192 254 előnyösen 37 ‘C. Ezután a sejteket a folyékony fázistól elválasztjuk. A felülúszó (szupernatans) réteg tartalmazza a nyers alfa interferont, melyet -20 és + 4 ’C között tárolhatunk, vagy ismert módszerekkel tisztíthatunk.

A sejteket ezután mossuk, egy alkalommal valamilyen fiziológiás sóoldattal, előnyösen a fent leírt összetételű tápoldattal. A mosás után a sejtkoncentrációt 5 x 10®-10⁸, előnyösen 2,5 x 10⁷ értékre állítjuk be, tápfolyadékban vagy tápoldatban, előnyösen az előzőek során ismertetett összetételű tápoldatban. A tápoldat valamilyen emberi vagy állati szérumot, illetve globulin-mentes szérumot, előnyösen humán globulin-mentes szérumot tartalmaz 0,5-5 mg/ml, előnyösen 1-2 mg/ml koncentrációban (3-6%).

A sejteket ezután valamilyen gamma interferon inducerrel hozzuk össze. E célra előnyösen Concanavalin A, Phytohemagglutinin vagy Staphylococcus enterotoxin alkalmazható. Eljárásunk előnyös foganatosítást módja szerint inducerként Concanavalin A-t alkalmazunk, előnyösen 2,5-30 pg/ml, különösen előnyösen 15 pg/ml koncentrációban.

Az indukció időtartama 8-48 óra, előnyösen 12-16 óra, az alkalmazott hőmérséklet 35-39 ’C, előnyösen 37 ’C. Az inducert bizonyos idő (kb. 1 óra) elteltével kívánt esetben mosással eltávolíthatjuk, ez a művelet azonban el is hagyható, mivel az inducer jelenléte a gamma interferon termelését nem zavarja. Az inducert általában nem távolítjuk el. Ezután a sejteket a folyékony fázistól elválasztjuk. A felülúszó tartalmazza a nyers gamma interferont, amely azonban alfa interferonnal fertőzött, mivel a második, vagyis a gamma interferon termelés periódusában az alfa interferont termelő sejtek még többé-kevésbé képeznek interferont.

Az interferonok egymás antivirális hatását potencírozzák, így csak kalibrációs görbe segítségével számolható ki a gamma-alfa interferon keverékek valóságos gamma interferon tartalma (lásd 1. ábra). A gamma interferon mennyiségének kiszámításához ismerni kell a keverék potencírozott szintű titerét, valamint a keverék alfa interferon tartalmát. Ezen utóbbit a keverék pH2 kezelését követő titrálásával határozhatjuk meg, mivel a gamma interferon szelektíven elbontható ezzel a behatással. A pH2 kezelés során az interferon mintát KC1 oldattal szemben dializáljuk, melynek pH értéke 2 (időtartam: 24 óra), eközben a gamma interferon elbomlik, az alfa interferon stabil marad.

A tiszta gamma interferont a nyers gamma interferon alfa interferon mentesítése után nyerjük. A nyers gamma interferon részleges tisztítása és koncentrálása (pl. CPG-350 porózus üvegszemcséken, Electro-Nucleonics, N. J. USA) után végezzük el előnyösen az alfa interferon mentesítést. Egyik lehetséges módszer a két interferon eltérő molekulasúlyán (alfa; 18-21 000, gamma: 40-45 000 dalton) alapuló gélszűrési eljárás (pl. Sephacryl S-200 kromatográfia), míg a másik módszernél Sepharose gélhez kötött anti-alfa interferon ellenanyagokkal kötjük meg a gamma interferont szennyező alfa interferont.

A találmányunk tárgyát képező eljárás előnye, hogy az alfa és gamma interferont egyazon leukocita kultúrában állíthatjuk elő két lépésben. Az egy interferonra eső előállítási költség jelentősen csökken, mivel az interferon előállításával kapcsolatos kiadások nagyobbik hányada esik a vérminták begyűjtésére, a „buffy coat”-ok elkészítésére és a fehérvérsejtek tisztítására. Eljárásunkkal a korlátozott mennyiségben rendelkezésre álló fehérvérsejtek interferon termelését lényegesen növeljük.

Eljárásunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük, anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk.

1. példa

ACD oldatba (nátrium citrát: 13,2 g/1, citromsav: 4,8 g/1, glulóz: 25 g/1) vett vért 3 órán át +4 ’C-on tároljuk. Egy térfogatrész ily módon kapott fehérvérsejt koncentrátumot 5 térfogatrész 0,83%os jéghideg vizes ammónium-klorid oldattal elegyítjük. A szuszpenziót a vörösvértestek lizálásáig (5—10 perc) jég között tartjuk, majd a leukocitákat az alábbi összetételű tápfolyadékban szuszpendáljuk:

Komponens Mennyiség kalcium-klorid 175-350. mg/1 kálium-klorid 300-500 mg/1 magnézium-szulfát vagy ekvivalens magnézium-klorid 175-500 mg/1 nátrium-klorid 5000-7000 mg/1 nátrium-hidrogén-karbonát 200-3500 mg/1 nátrium-dihidrogén-foszfát 30-150 mg/1 glükóz 500-5500 mg/1 ferri-nitrát 0-0,2 mg/1

Ezután a vörösvértestek lizálását a fenti módszerrel megismételjük, azzal a változtatással, hogy 1 térfogatrész fehérvérsejt szuszpenzióra 10 térfogatrész 0,83 %-os vizes ammónium-klorid oldatot alkalmazunk. A leukocitákat az előzőekben ismertetett összetételű tápoldatban szuszpendáljuk és a sejtszámot 1 χ 10⁷ sejt/ml értékre állítjuk be. A tápoldat 2 mg/ml humán globulin-mentes szérumot tartalmaz (kb. 6%). A sejteket 37 ’C-on állandó keverés mellett 200 NE/ml mennyiségű inducer mentes koncentrált humán alfa interferonnal kezeljük. Két óra múlva a sejteket 400 hemagglutináló egységnyi Sendai vírussal indukáljuk. Az inkubálást az indukciót követő 18. órában fejezzük be. A felülúszó, azaz a nyers alfa interferon antivirális titere 54 200 NE/ml. Az alfa interferon termelésére használt sejteket egyszer a fent említett tápoldattal mossuk, majd a leukocitákat a tápoldatban

2,5 x 10⁷ sejt/ml koncentrációban szuszpendáljuk. A tápoldat 1 mg/ml mennyiségű globulin-mentesített humán szérumot (kb. 3%) tartalmaz. Ezután a sejteket 15 gg/ml mennyiségű Concanavalin A-val stimuláljuk. Az inducert nem távolítjuk el a rendszerből. Az inkubációt állandó keverés mellett 37 ’C-on folytatjuk és az indukciót követő 16. órában a felülúszót centrifugálással elválasztjuk a sejtektől. A gamma interferont tartalmazó szupernatans antivirális titerének meghatározása WISH humán amniális sejten történik, és a titereket humán alfa

192 254 interferon standarddal történő összehasonlítást követően egység/ml E/ml-ben fejezzük ki (jelenleg még nincs humán gamma nemzetközi standard interferon preparátum). A felülúszó titere 10 600 E/ ml, mely azonban potencírozott szintű, mivel az előállított gamma interferon preparátumok alfa interferont is tartalmaznak. A mellékelt ábrán látható kalibrációs görbe segítségével az eredeti és a pH2 kezelt anyag titerének ismeretében a valóságos gamma interferon tartalom 1840 E/ml.

összehasonlítás céljából a fenti eljárást azzal a változtatással végezzük el, hogy a gamma interferon termelés előtt a sejteket Sendai vírus nélkül inkubáljuk egy napig, így a Concanavalin A hatására termelődött gamma interferon titere: 340 E/ml.

Szintén az összehasonlítás céljából az izolált leukocitákat az első, vagyis alfa interferon termelési periódust kihagyva rögtön Concanavalin A-val indukáljuk. A termelt gamma interferon titere: 450 E/ml.

Ha a leukocitákat az alfa interferon termelési periódust kihagyva 1500 NE/ml humán alfa vagy béta interferonnal az indukciót megelőzően 4 óráig kezeljük (priming), a termelt gamma interferon titere: 2300 E/ml.

Tehát az alfa interferon kinyerése a fehérvérsejteknek az interferon tartalmú oldatból történő ki. centrifugálásából áll, így a felülúszó, mely az alfa interferont tartalmazza további feldolgozásra alkalmas, az üledék pedig, mely a fehérvérsejteket tartalmazza, friss tápfolyadékban szuszpendálva alkalmassá válik gamma interferon előállítására. A gamma interferon kinyerése hasonló módon történik. Az alfa interferontól történő mentesítés a gamma interferont tartalmazó anyag oszlopkromatográfiás módszerrel (pl. Sephacryl 5-200, Pharmacia) történhet, mely az interferonok közötti molekulasúly-különbség alapján választja szét a komponenseket.

A gamma interferon mintákból az alfa-interferon eltávolítása anti-alfa interferon oszlopon történik, mely után a gamma interferon titere 1600 E/ ml.

Az interferon meghatározásának elve, hogy a sejtekhez adott interferon megakadályozza a. fertőzésre használt vírus szaporodását. A meghatározást biológiai tesztben az interferon hígításaival végezzük, így ismert standard segítségével meghatározható az ismeretlen anyag antivirális titere.

2. példa

Az 1. példában ismertetett eljárást azzal a változtatással végezzük el, hogy tápoldatként Eagle-féle tápfolyadékot alkalmazunk (Virology 14, 359, 1961). Az ilyen módon kapott alfa interferon titere 56 000 NE/ml. A termelés második szakaszában a szintén ebben a tápfolyadékban előállított gamma interferon titere 1680 E/ml.

Amennyiben a jelen eljárásnál az alfa interferon termelését elhagyjuk, a termelt gamma interferon titere: 280 E/ml.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás alfa- és gamma-interferon előállítására a vér fehérvérsejt-frakciójának (buffy coat) elválasztása, a vörösvértestek eltávolítása, a leukociták megfelelő tápoldatban történő szuszpendálása, majd alfa-interferon induktorral és gamma-interferon induktorral történő kezelése útján, azzal jellemezve, hogy az alfa-interferont és gamma-interferont ugyanazon fehérvérsejt kultúrában egymás után termeljük oly módon, hogy a vér fehérvérsejtfrakciójának elválasztása, a vörösvértestek eltávolítása és a leukociták megfelelő tápoldatban történő szuszpendálása után kapott szuszpenziót alfavagy beta-interferonnal előkezeljük, valamely alfainterferon inducerrel érintkezésbe hozzuk, az alfainterferon-tartalmú folyadékot a sejtektől elválasztjuk, az alfa-interferont kívánt esetben kinyerjük, a sejteket mossuk, megfelelő tápoldatban szuszpendáljuk, valamely mitogén ágenssel kezeljük, a gamma-interferon-tartalmú folyadékot a sejtektől elválasztjuk és a gamma-interferont kívánt esetben kinyerjük és kívánt esetben alfa-interferontól mentesítjük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az előkezelést 10-500 NE/ml - előnyösen 200-300 NE/ml - alfa- vagy beta-interferonnal végezzük el.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az előkezelést 1-6 órán át - előnyösen 2 órán keresztül - végezzük el.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az előkezelést 35-39 ’Con - előnyösen 37 ’C-on - végezzük el.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alfa-interferon inducerként nyers vagy tisztított Sendai-vírust alkalmazunk.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Sendai-vírust 100-800 - előnyösen 400 - hemagglutináló egység/ml koncentrációban alkalmazzuk.
7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alfa-interferon indukciót 5-48 -órán át - előnyösen 15—20 órán keresztül - végezzük el.
8. Az 5-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alfa-interferon indukciót 35-39 ’C-on - előnyösen 37 ’C-on - végezzük el.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gamma-interferon indukciót 8-48 órán át - előnyösen 12-26 órán keresztül - végezzük el.
10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kapott nyers gammainterferont részlegesen tisztítjuk és koncentráljuk, majd a benne levő alfa-interferont gélszüréssel vagy anti-alfa-interferon ellenanyagokkal történő megkötéssel eltávolítjuk.
11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tápoldatként 175-350 mg/1 kalcium-kloridot, 300-500 mg/1 kálium-kloridot, 175-500 mg/1 magnézium-szulfátot vagy azzal ekvivalens magnézium-kloridot, 5000-7000 mg/1

192 254 nátrium-kloridot, 200-3500 mg/1 nátrium-hidrogén-karbonátot, 30-150 mg/1 nátrium-dihidrogénfoszfátot, 500-5500 mg/1 glükózt és adott esetben

0,0-0,2 mg/1 ferrinitrátot és 0,5-10% szérumot vagy szérumfehérjét (0,5-5 mg/ml) tartalmazó vizes tápoldatot alkalmazunk.