AT391482B - Verfahren zur industriellen herstellung von hochreinem menschlichem leukozyteninterferon - Google Patents

Description

Nr. 391482

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von menschlichem Leukozyteninterferon durch Abtrennen der weißen Blutkörperchen, Entfernen der roten Blutkörperchen, Suspendieren der Leukozyten in entsprechender Nährlösung, Vorbehandeln mit Interferon, Induzieren mit einem geeigneten Inducer, Abtrennen der interferonhaltigen Lösung von den Zellen und Reinigen des rohen Interferons.

Das menschliche Leukozyteninterferon (IFN) ist eine Gruppe von antiviral wirkenden Eiweißen. Außer der antiviralen Wirkung hat Interferon noch zahlreiche andere biologische Wirkungen: es hemmt die Zellproliferation, aktiviert die natürlichen Killerzellen und beeinflußt auch auf andere Weise die Funktion des Immunsystems. Aus diesen Gründen ist Interferon therapeutisch einsetzbar.

Therapeutisch verwendbares Interferon beziehungsweise Verfahren zur Herstellung von therapeutisch verwendbarem Interferon müssen verschiedenen speziellen Anforderungen gerecht werden. Interferon darf bakterielle Endotoxine nur in streng limitierter Menge enthalten, das Verfahren muß von vornherein virenfrei sein, das Produkt soll ein möglichst breites Spektrum der biologisch aktiven Untertypen enthalten und auch die Ausbeute muß entsprechend sein.

Zur Herstellung von IFN entsprechender Reinheit sind zahlreiche Verfahren in Gebrauch, zum Beispiel Chromatographie an Sephadex G-100 oder G-150 (Bodo, G.: Methods Enzymol. 28.. 69 /1981/) beziehungsweise an Ultragel AcA 54 (Withman, J. E. et al.: J. Interferon Res. I, 305 /1981/), Chromatographie an Sulfopropyl-Sephadex (Bridgen, P. J. et al.: J. Biol. Chem. 252. 6585 /1977/), Chromatographie an Phenyl-Sepharose (Whitman, J. E. et al.: J. Interferon Res. 1, 305 /1981/), Cu-Chelat-Chromatographie (Berg, K.: Scand. J. Immunol. H, 489 /1980/), CPG-Chromatographie (Chanda, K. C., 10 I. Interferon Res. 2, 229 /1982/).

Durch Kombination dieser Verfahren kann zwar homogenes IFN hergestellt werden, jedoch sind die Ausbeuten gering, und nicht jedes Verfahren ist zur Maßstabsvergrößerung bis zur industriellen Dimension geeignet.

Zur Herstellung größerer Mengen therapeutisch verwendbaren Interferons sind bisher die folgenden Methoden ausgearbeitet worden. Das Verfahren von Cantell et al. zur Reinigung von Interferon besteht aus einer Reihe pH-kontrollierter Fällungsschritte, durch die man in 50 %iger Ausbeute IFN mit einer spezifischen Aktivität von 2.10^ IE/mg erhält. Das rohe Leukozyten-IFN wird bei pH 3,5 mit Kaliumrhodanid ausgefällt, dann in saurem Äthanol gelöst, und die begleitenden Verunreinigungen werden durch stufenweises Anheben des pH-Wertes (5,3, dann 5,8) selektiv ausgefällt. Aus der äthanolischen Lösung wird das IFN durch Erhöhen des pH-Wertes auf 8,0 ausgefällt und dann in 0,1 M Phosphatpuffer erneut gelöst. Der Puffer enthält auch 0/5 M Kaliumrhodanid. Die Verunreinigungen werden durch Senken des pH-Wertes auf 5,2 ausgefällt. Das bei diesem pH noch in Lösung befindliche IFN wird bei pH 3,0 ausgefällt, der Niederschlag in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0) gelöst und gegen physiologische Kochsalzlösung dialysiert (Cantell et al., Methods Enzymol. 2&, 499 /1981/).

Die Wellcome Research Laboratories arbeiteten ein Verfahren zur Reinigung von aus Namalva-Zellen stammenden Interferon aus (Reuveny, S. et al.: Ann. Virol. 133. 191 /1982/), mit dem eine durchschnittliche spezifische Aktivität von 6.10^ IE/mg Eiweiß erreichbar ist. Das rohe Lymphoblastoid-INF wird mit 2,5 %iger Trichloressigsäure ausgefällt und der Niederschlag bei pH 3,5 mit 94 %igem Äthanol extrahiert. Der äthanolische Extrakt wird durch stufenweises Erhöhen des pH-Wertes gereinigt. Das auf diese Weise gereinigte Interferon wird durch Affinitätschiomatographie mit polyklonalen Antikörpern gereinigt.

Die Forscher des New York Blood Center arbeiteten ein zweistufiges chromatographisches Verfahren zur Herstellung von hochreinem IFN aus (Horowitz, B.: Methods Enzymol. 112,39, /1986/). Das rohe IFN wird an einer Füllung aus CPG-10775 adsorbiert und dann mit einem 50 % Äthylenglycol enthaltenden Puffer eluiert Das Eluat wird durch Affinitätschromatographie mit monoklonalen Antikörpern weiter gereinigt (NK2-Sepharose, Celltech). Die erhaltene Substanz hat eine spezifische Aktivität von 3,6.10** IE/mg Eiweiß, und die Ausbeute beträgt 50 %.

Gefunden wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von menschlichem Leukozyteninterferon, bei dem die Reinigung durch eine Kombination von controlled pore glass Chromatographie und alkoholischer Fraktionierung vorgenommen wird. Mit diesem Verfahren kann ein Produkt erzeugt werden, das den eingangs angegebenen Bedingungen völlig gerecht wird. Das Präparat ist hochrein, enthält sehr wenig Endotoxin, infolge gewisser Schritte der Technologie werden eventuell in das Präparat gelangte Viren inaktiviert, das Präparat enthält ein breites Spektrum der IFN-Untertypen, unter anderem einen bedeutenden Anteil der säurelabilen Komponenten. Die Ausbeute ist sehr gut, d. h. das Verfahren ist wirtschaftlich.

Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung von IFN mit hoher spezifischer Aktivität und dessen Reinigung, zu der erfindungsgemäß eine Kombination von controlled pore glass Chromatographie, alkoholischer Fraktionierung und Membrantechnik angewendet wird. Die vorteilhaften Eigenschaften des Produktes werden durch die einzelnen Schritte des Verfahrens gewährleistet.

Im Laufe des Verfahrens werden aus menschlichem Blut stammende weiße Blutkörperchen durch Hämolyse mit Ammoniumchlorid von den anhaftenden roten Blutkörperchen befreit Dabei ist es bevorzugt, die Hämolyse bei 0 - 5 °C mit einer 0,83 %igen, auf pH 7,2 - 7,4 gepufferten Ammoniumchloridlösung in zwei Schritten vorzunehmen. Im ersten Schritt ist das Verhältnis von Zellsuspension zu Ammoniumchlorid 1: 3, im zweiten -2-

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Schritt 1: 9. Aus dem Hämolysemedium werden die Leukozyten mit einer Beschleunigung von 1000 - 2000 g abzentrifugiert. Die erhaltene Leukozytensuspension wird in einer geeigneten Nährlösung suspendiert (Eagle MEM, RPMI, MSKD usw,), wobei die Konzentration etwa 1 - 1,3.10^ Zellen/ml beträgt Die Nährlösung enthält in einer Menge von 0,5 - 2,5 mg/ml auch menschliches gammaglobulinfreies Serum.

Zum Zwecke der Vorbehandlung (priming) wird die Zellkultur bei 37 °C in Gegenwart von 100 - 200 IE/ml menschlichen Interferons 1,5 - 3 Stunden lang inkubiert. Anschließend wird die IFN-Produktion durch Zusatz von 100 - 200 HA-Einheiten/ml Sendai-Virus induziert. 1 - 3 Stunden nach der Induktion werden die Bedingungen der Inkubation (pH, Salzkonzentration, Temperatur, Zusatz von H2O2) in geeigneter Weise geändert Nach weiteren 15 - 25 Stunden Inkubation werden die Leukozyten durch Zentrifugieren von der das rohe IFN darstellenden Nährlösung abgetrennt. Das Roh-IFN wird durch Filtrieren von Schwebestoffen und Zelltrümmern befreit und dann durch eine CPG (Porengröße: 75 mm) enthaltende Säule gedrückt, die vorher mit PBS durchgewaschen worden war. Das Interferon wird mit einem Puffergradienten (0,05 - 0,1 M Tris HCl + 1,5 M NaCl, pH 8,0) eluiert. PBS = phosphate buffer saline Zusammensetzung: mg/1 NaCl 8 800 KCl 220 Na2HP04.12H20 3 500 NaH2P04.H20 224 pH : 7,2 - 7,4

Der Tris-Puffer enthält tris(Hydroxymethyl)-aminomethan, welches das IFN nicht inaktiviert, jedoch die Trennung verbessert Es können auch andere Amine verwendet werden.

Das IFN-Eluat wird bei -20 °C mit 55 - 75 %igem Äthanol behandelt Die ausgefällten Eiweiße werden durch Zentrifugieren entfernt. Der das IFN enthaltende äthanolische Überstand wird mittels eines Ultrafilters auf das 10 - 20-fache aufkonzentriert, dann wird das Äthanol durch Diafiltration oder Dialyse gegen einen geeigneten Puffer ausgetauscht Es ist auch möglich, das Interferon aus der alkoholischen Lösung erneut zu adsorbieren. Die nach der Diafiltration beziehungsweise Dialyse erhaltene IFN-Lösung ist hochrein und kann sofort lyophilisiert werden.

Die Virenfreiheit ist sowohl durch die Chromatographie wie auch durch die Behandlung mit 55 - 75 %-igem Alkohol gewährleistet. Eventuell enthaltene Endotoxine werden ebenfalls durch die alkoholische Behandlung eliminiert, weil sie in den Niederschlag eingehen.

Da das Verfahren keine bei niedrigem pH-Wert vorgenommenen Schritte enthält, verlieren auch die säurelabilen IFN-Untertypen nichts von ihrer Aktivität.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Ausfuhrungsbeispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Aus menschlichem Blut stammendes buffy coat (eine leukozytenreiche Blutfraküon) wird unter Eiskühlung mit dem dreifachen Volumen einer auf 0...+4 °C gekühlten, 0,83 %igen Ammoniumchloridlösung 10 Minuten lang behandelt. Danach wird bei +4 °C mit einer Beschleunigung von 1500 g zentrifugiert, wobei sich die Leukozyten absetzen. Die Leukozyten werden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und erneut mit 0...+4 °C warmer, 0,83 %iger Ammoniumchloridlösung behandelt, dieses Mal jedoch mit dem neunfachen Volumen. Nach 10 Minuten wird unter den beschriebenen Bedingungen erneut zentrifugiert. Danach werden die Leukozyten in einer Konzentration von 1,0.10^ Zellen/ml in Nährlösung Eagle MEM suspendiert. Der Nährlösung wird in einer Menge von 1 mg/ml gammaglobulinfreies menschliches Serum zugesetzt. Das Zellkultur wird mit 150 IE/ml menschlichen Interferons versetzt und in einem Thermostaten bei 37 °C 2 Stunden lang gerührt. Anschließend wird mit 100 HA-Einheiten Sendai-Viren pro ml die Interferonproduktion induziert, und die Zellen werden weitere 15-20 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Dann werden die Zellen von da das rohe IFN darstellenden IFN-haltigen Nährlösung durch Zentrifugieren abgetrennt

Das Rohinterferon hat eine spezifische Aktivität von 200 000 IE/mg Protein.

Das Roh-IFN wird auf eine mit PBS vorbehandelte, mit CPG 10/75 gefüllte Säule aufgegeben, wobei man 1 Volumenteil CPG auf 100 Volumenteile Lösung rechnet. Nach der Adsorption werden die restlichen Eiweiße mit physiologischer Kochsalzlösung von der Säule gewaschen. Dann wird das Interferon mit 1,5 M NaCl enthaltendem Tris-Puffer eluiert Das Eluat hat eine spezifische Aktivität von 10 000 000 IE/mg Protein. Das -3-

Claims (8)

1. Nr. 391482 Eluat wird bei -20°C mit auf -20°C abgekühltem Äthanol vermischt, bis eine Alkoholendkonzentration von 75 % eingestellt ist. Das äthanolische Gemisch wird 24 Stunden lang bei -20 °C gelagert und dann zentrifugiert Der Niederschlag wird verworfen, der Überstand wird bei -20 °C mittels eines Ultrafilters aufkonzentriert. Der Alkohol wird in einem anschließenden Diafiltrationsschritt gegen einen beliebigen Puffer ausgewechselt. Die erhaltene Flüssigkeit wird in Ampullen gefüllt und lyophilisiert. Beispiel 2 Die Herstellung des rohen IFN und seine CPG-chromatographische Reinigung erfolgen auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise. Aus der resultierenden 75 %igen alkoholischen Lösung kann das Interferon jedoch auch durch Ausfüllen abgetrennt werden. Dazu wird die alkoholische Lösung gegen einen 30 % Alkohol enthaltenden 0,05 M Citratpuffer (-10 °C, pH 5) dialysiert. Das ausgefallene Eiweiß wird abzentrifugiert und in der entsprechenden Menge physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Die erhaltene Lösung wird unmittelbar filtriert. Beispiel 3 Man arbeitet auf die im Beispiel 2 beschriebene Weise, konzentriert jedoch die 75 %ige alkoholische Lösung mit einem Ultrafilter und dialysiert mit nur 20 % Alkohol enthaltendem Citratpuffer. Anschließend wird wie gemäß Beispiel 2 gearbeitet. PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von menschlichem Leukozyteninterferon durch Abtrennen der Leukozyten, Entfernen der Erythrozyten, Suspendieren der Leukozyten in entsprechender Nährlösung, Vorbehandeln mit Interferon, Induzieren mit einem geeigneten Inducer, Abtrennen der interferonhaltigen Lösung und Reinigung des rohen Interferons, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Entfernung der Erythrozyten Ammoniumchloridlösung verwendet, die Nährlösung mit einem Zusatz von menschlichem Serum versieht, zum Induzieren die Leukozyten in einer Konzentration von 0,5 bis 1,5.10^ Zellen/ml in der Nährlösung suspendiert und die Reinigung mittels einer Kombination von controlled pore glass (CPG) Chromatographie und alkoholischer Fraktionierung vomimmt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Reinigung als Füllung controlled pore glass 10/75 verwendet
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man auf 1 ml Füllung 50 bis 200 ml rohes Interferon aufbringt
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Eluieren 0,1 bis 1,5 M eines primären, sekundären, tertiären oder quaternären Amins enthaltende Lösungen verwendet
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man zur alkoholischen Fraktionierung das Eluat mit Äthanol bis zu einer Konzentration von 55 bis 75 Vol.- % versetzt.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die alkoholische Behandlung bei Temperaturen zwischen 0°C und -40 °C durchführt
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Entfernung der Erythrozyten eine 0,83 Gew.- %ige, auf pH 6 bis 7,5 gepufferte Ammoniumchloridlösung verwendet wird.
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man der Nährlösung in einer Menge von 0,5 bis 2,5 mg/ml über controlled pore glass gereinigtes menschliches, gammaglobulinfreies Serum zusetzt. -4-