HRP20040548A2 - A method for determining the biological activity of defibrotide - Google Patents
A method for determining the biological activity of defibrotide Download PDFInfo
- Publication number
- HRP20040548A2 HRP20040548A2 HR20040548A HRP20040548A HRP20040548A2 HR P20040548 A2 HRP20040548 A2 HR P20040548A2 HR 20040548 A HR20040548 A HR 20040548A HR P20040548 A HRP20040548 A HR P20040548A HR P20040548 A2 HRP20040548 A2 HR P20040548A2
- Authority
- HR
- Croatia
- Prior art keywords
- plasmin
- defibrotide
- substrate
- concentration
- nitroaniline
- Prior art date
Links
- JNWFIPVDEINBAI-UHFFFAOYSA-N [5-hydroxy-4-[4-(1-methylindol-5-yl)-5-oxo-1H-1,2,4-triazol-3-yl]-2-propan-2-ylphenyl] dihydrogen phosphate Chemical compound C1=C(OP(O)(O)=O)C(C(C)C)=CC(C=2N(C(=O)NN=2)C=2C=C3C=CN(C)C3=CC=2)=C1O JNWFIPVDEINBAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 87
- 229960004120 defibrotide Drugs 0.000 title claims description 86
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 60
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 title claims description 18
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 claims description 65
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 35
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 9
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 6
- JBIJLHTVPXGSAM-UHFFFAOYSA-N 2-naphthylamine Chemical compound C1=CC=CC2=CC(N)=CC=C21 JBIJLHTVPXGSAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 claims 1
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 42
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 14
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 102100040423 Transcobalamin-2 Human genes 0.000 description 3
- 101710124862 Transcobalamin-2 Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- -1 for example Chemical class 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 3-(3,4-DICHLOROPHENYL)-1,1-DIMETHYLUREA Chemical compound CN(C)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 1
- 200000000007 Arterial disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 1
- 102000005686 Serum Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010045362 Serum Globulins Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 208000012998 acute renal failure Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000012886 linear function Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 238000012958 reprocessing Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/968—Plasmin, i.e. fibrinolysin
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Ovaj izum se odnosi na postupak određivanja biološke aktivnosti defibrotida, te naročito na indirektni enzimatski postupak određivanja biološke aktivnosti defibrotida.
Tehničko područje izuma
Defibrotid (Merck Index, 1996, broj 2915) je supstancija prirodnog porijekla koja se dobiva ekstrakcijom iz životinjskih organa, te koju sačinjava natrijeva sol polideoksiribonukleotida niske molekularne mase.
Defibrotid je bio predmet brojnih farmakoloških istraživanja koja sugeriraju njegovu primjenu u terapiji kao antitrombotskog sredstva (US 3,829, 567).
Dodatno, defibrotid se također uspješno rabio u liječenju periferne arteriopatije, akutne insuficijencije bubrega (US 4,694, 134) ili akutne ishemije miokarda (US 4,693, 995).
Kao i ostale biološke supstancije koje se dobivaju ekstrakcijom, defibrotid podliježe varijabilnosti sastava što je tipično za prirodne biopolimere. Klasični primjer ove situacije predstavlja heparin čija je varijabilnost iz serije u seriju, obzirom na duljinu lanca, molekularnu masu, sastav, stupanj sulfatacije, itd dobro poznata. Posljedica ovoga je da iste količine defibrotida po masi ne moraju biti ekvivalentne s točke specifične biološke aktivnosti.
Postupak ekstrakcije, izolacije i pročišćavanja ne može sam po sebi osigurati apsolutnu reproducibilnost produkta, upravo zbog njegove intrinzične biopolimerne prirode
Međutim, ako se dobro kontrolira, moguće je smanjiti ovu varijabilnost: u tu svrhu, napravljene su studije standardiziranih industrijskih procesa za izolaciju defibrotida ekstrakcijom iz organa, kao što je na primjer, ona opisana u US patentu US 4, 985,552.
Produkt dobiven prema gore spomenutom postupku karakteriziran je određivanjem nekih specifičnih fizičko-kemijskih parametara, kao što je na primjer, elektroforetska pokretljivost, koeficijent ekstinkcije, veličina optičke rotacije, reverzibilna hiperkromnost. Međutim, ovi parametri u osnovi ovise o strukturi defibrotida i nemaju mogućnost osiguravanja informacije o njegovoj biološkoj aktivnosti.
Koliko je poznato, jedini postupci koji su objavljeni za primjenu do sada za procjenu biološke aktivnosti defibrotida su test fibrinske ploče i tromboelastografsko snimanje vremena lize euglobulina [Prino G., Mantovani M., Niada R., Coccheri S., Butti A., Indagini preliminari sull'attivita fibrinolitica, nell'animale e nell'uomo, di una nuova sostanza presente in diversi organi animali, Simposio Internazionale: La ricerca scientifica nell'industria farmaceutica in Italia, Rim, 2-4 listopad 1975-I1 Farmaco, Ed. Prat. ) (1969), 24, 552-561].
Međutim, gore spomenuti postupci karakterizirani su znatnom eksperimentalnom složenosti, nezadovoljavajućom reproducibilnosti i preciznosti, te u specifičnim slučajevima tromboelastografskog snimanja, linearnosti odgovora koji je ograničen na vrlo suženo koncentracijsko područje.
Do sada stoga nisu bile poznate, uistinu valjane, precizne i reproducibilne metode za određivanje biološke aktivnosti defibrotida.
Mi smo razvili jednostavan i pouzdan postupak za određivanje biološke aktivnosti defibrotida, koji omogućuje kontrolu uzoraka dobivenih ekstrakcijom, te stoga omogućuju standardizirane medicinske pripravke temeljene na defibrotidu.
Postupak na koji se ovaj izum odnosi omogućuje da se odredi specifična biološka aktivnost defibrotida u usporedbi s referentnim standardom, uz visoki stupanj preciznosti, brzine i reproducibilnosti.
Detaljan opis izuma
Ovaj izum se prema tome odnosi na postupak određivanja specifične biološke aktivnosti uzoraka defibrotida, koja obuhvaća slijedeće korake:
a) dovođenje u kontakt defibrotida, plazmina i supstrata specifičnog za plazmin koji reakcijom s plazminom, osigurava mjerljiv produkt i
b) mjerenje količine produkta koji se stvara sukcesivno tijekom vremena.
Postupak izuma je indirektna in vitro metoda za određivanje aktivnosti defibrotida, koja se temelji na funkcionalnim interakcijama između defibrotida i plazmina.
Poznato je iz literature da je plazmin proteolitički enzim u koagulacijskom nizu/fibrinolizi koji omogućava cijepanje fibrina, fibrinogena i ostalih proteina plazme.
Enzimatska aktivnost plazmina normalno se određuje različitim standardnim in vitro testovima. Jedan od najviše rabljenih postupaka je određivanje spektrofotometrijom ili fluorimetrijom kromogenih ili fluorogenih spojeva koji se oslobađaju djelovanjem plazmina na prikladnim supstratima [Haemostasis, (1978),7, 138-145]. Peptidni supstrati s formulom A1-A2-A3-X koji se općenito rabe, u kojima A1 i A2 su aminkiseline koje su većinom nepolarne, A3 je lizin ili arginin i X predstavlja mjerljiv slobodni spoj, na primjer para-nitroanilin (pNa) ili 2-naftilamin (NA) [Haemostasis, (1978),7, 146-149]. Uz gore spomenute peptidne supstrate, postignut je uspjeh uporabom drugih, jednostavnijih spojeva kao što je, na primjer, p-nitrobenzil-p-toluensulfonil-1-arginin [Haemostasis, (1978), 7, 105-108].
U ovim testovima, brzina kojom se spoj X oslobađa u inkubacijski medij proporcionalna je aktivnosti (internacionalne jedinice) plazmina prisutnog u uzorku.
Sada je otkriveno, i ovo je princip na kojem se temelji ovaj izum, da u gore opisanim testovima procjene vrijednosti plazmina, defibrotid povećava brzinu oslobađanja spoja X proporcionalno koncentraciji.
Postupak na koji se ovaj izum odnosi osigurava ponajprije dovođenje u međusobni kontakt uzorka defibrotida, plazmina i supstrata za plazmin.
Uzorak defibrotida koji se rabi za određivanje prema izumu općenito se pripravlja ekstrakcijom iz organa u skladu s poznatim postupcima, kao što je na primjer, u U.S. patentu US 4,985, 552 koji je već bio spomenut.
Serija normalno industrijski proizvedenog defibrotida izabrana je kao referentni uzorak (standard), te se rabi za izradu kalibracijske krivulje prema postupku ovog izuma.
Općenito ovaj postupak osigurava precizna i točna mjerenja defibrotida čak i u prisutnosti zagađivača, kao što je na primjer, RNA, heparin, razgrađeni defibrotid (defibrotid iz kojeg su uklonjeni purin ili pirimidin) ili etanol, što osigurava da su u koncentracijama, općenito manjim od 10% (masenih), koje ne škode sistemu.
Uz to što omogućuje određivanje defibrotida, postupak također dopušta određivanje ostalih biološki ekvivalentnih supstancija dobivenih iz defibrotida, kao što je na primjer, deaminirani defibrotid ili još jednostavnije, defibrotid denaturiran toplinom.
Ovaj postupak je dostatno osjetljiv za detekciju koncentracija defibrotida nižih od ili jednakih 0,1 μg/mL (konačna koncentracija u sistemu određivanja) i općenito, pokazuje dobru korelaciju do maksimalnih vrijednosti koncentracija većih od ili jednakih 100 μg/mL.
Uporabljeni plazmin je općenito bilo koji plazmin sisavaca, kao što je na primjer, goveđi, svinjski ili humani plazmin, s prioritetom za humani plazmin.
Međutim, iako je plazmin enzim izbora, uporaba ostalih sistema ekvivalentnih enzima, kao što je na primjer, prekurzor plazmina, kao što je plazminogen, ili enzimi plazmin-analoga koji su kemijski srodni i imaju sličnu funkcionalnost, je unutar područja ovog izuma.
U postupku ovog izuma, podrazumijeva se da je supstrat za plazmin bilo koji supstrat specifičan za plazmin koji, u uvjetima postupka, oslobađa produkt hidrolize X u količinama koje se mogu detektirati.
Ovisno o prirodi skupine X koja se može detektirati, jednako dobro se mogu prilagoditi alternativni sistemi detekcije koji su obično poznati stručnjacima. Spektrofotometrijski ili fluorimetrijski sistemi detekcije su posebice korisni, naročito spektrofotometrijski sistemi.
Supstrati koji se obično rabe su oni specifični za plazmin. Preferirano se rabe peptidi formule A1-A2-A3-X, u kojima Al i A2 su aminokiseline koje su uglavnom nepolarne, A3 je lizin ili arginin, i X je grupa koja se može detektirati. Primjeri ovih supstrata su Val-Leu-Liz-pNa, Val-Fe-Liz-pNa ili piroGlu-Fe-Liz-pNa u kojima grupa X koja se može detektirati spektrofotometrijski je para-nitroanilin (pNA). Ostali prikladni supstrati, na primjer Val-Gli-Arg-2NA, sadrži 2-naftilamin, koji se mjeri fluorimetrijski. Posebno preferirani supstrat je spoj H-D-Valil-1-Leucil-1-Lizin-p-nitroanilin (H-D-Val-Leu-Liz-pNA).
Plazmini i specifični supstrati koji se rabe za određivanje defibrotida općenito su komercijalno dostupni.
Postupak određivanja ovog izuma provodi se pripremanjem vodene otopine reagensa i uzorka defibrotida kod specifičnog pH i molarnosti.
Posebice, koncentracija plazmina može varirati, obično od 0,0016 do 0,20 i.j/mL, pogodno od 0,0064 do 0,050 i.j./mL, te čak pogodnije otprilike 0,0125 i.j./mL.
Međutim, obzirom na supstrat plazmina, koncentracija od oko 0,3 do 4 mM, pogodno od 2,5 do 3,5 mM te prikladno 3 mM, se općenito rabi u slučaju kromogenog supstrata, dok se koncentracije od 0,05 do 0,15 mM rabe u slučaju fluorogenog supstrata.
Postupak određivanja ovog izuma, kao i ostale enzimatske metode, osjetljiv je na pH medija.
Zapravo, ne može se općenito uporabiti na ekstremnim pH vrijednostima gdje se enzimatski sistemi inaktiviraju.
Također je pogodno da pH medija ne podliježe promjenama bilo kada tijekom perioda u kojem se provodi mjerenje, te je stoga otopina općenito puferirana s puferskim sistemima izabranim od onih koji se normalno rabe u testovima određivanja s plazminom. Prikladni puferski sitemi mogu biti, na primjer, fosfatni pufer, citratni pufer ili tris (hidroksimetil) aminometan hidroklorid (TRIS) pufer. Postupak se preferirano provodi u prisutnosti TRIS pufera.
U ovom postupku obično je preferirano održavati pH medija u području od otprilike 7 do 8, pogodnije na otprilike 7,4.
Dodatno, preferirano je održavati koncentraciju puferskog sistema u području od 10 do 200 mM, pogodnije na otprilike 50 mM.
Postupak izuma za određivanje defibrotida osigurava da se plazmin, supstrat za plazmin i defibrotid pomiješaju. Posebice, u svrhu omogućavanja da se mjerenja osigurana za postupak provode korektno, preferirano je dodati plazmin ili specifični supstrat, ili oboje, u puferiranu otopinu koja sadrži uzorak defibrotida prije početka koraka mjerenja. Supstrat za plazmin se preferirano dodaje posljednji.
Važan parametar u ovom postupku određivanja je temperatura. Preferirano je da se ista temperatura održava tijekom cjelokupnog trajanja mjerenja, te za sve uzorke za određivanje, i tijekom izrade referentne krivulje i tijekom koraka mjerenja. Konačno, preferirano je rabiti aparate s kontroliranom temperaturom, te također, gdje je potrebno, moguće je nastaviti s nekoliko setova mjerenja, mijenjajući odgovarajuće položaj uzoraka u svrhu osiguravanja da sistem ima maksimalnu temperaturnu stalnost.
Općenito, ovaj postupak određivanja primjenjuje se na temperaturnom području, na primjer, od 25 do 40°C, preferirano do 35 do 39°C, te čak još više preferirano na 37°C.
Prema ovom izumu, mjerenje koncentracije spoja X oslobođenog u medij djelovanjem plazmina počinje kada se dodaju svi reagensi, te se nastavlja prethodno određeno vrijeme i prethodno određenom frekvencijom kao funkcijom kemijske prirode spoja X i sistema detekcije.
Slično ostalim postupcima biološkog određivanja, postupak izuma također osigurava za kalibracijski korak i korak određivanja, preferirano provođenje u paraleli u svrhu smanjenja, pojave eksperimentalne varijabilnosti koliko je to moguće.
Korak kalibracije obuhvaća prikupljanje podataka o apsorbanciji koja se odnosi na uzorke poznate rastuće koncentracije defibrotida (standard), statističkog reprocesiranja navedenih podataka te ekstrapolacije kalibracijske krivulje, koja pokazuje korelaciju između povećanja brzine enzimatske reakcije ovog izuma i koncentracije defibrotida prisutnog u mediju.
U koraku mjerenja, uzimajući u obzir korelacije dobivene u koraku kalibracije, moguće je odrediti nepoznatu biološku aktivnost uzoraka defibrotida na temelju vrijednosti apsorbancija izmjerenih i procesiranih pod istim uvjetima.
Detaljnije, protokol eksperimenta općenito osigurava pripravljanje nekoliko uzoraka, i standarda i nepoznatog uzorka, u različitim poznatim koncentracijama defibrotida. Uzorci defibrotida se pripravljaju progresivnim razrjeđivanjem osnovne otopine prema prethodno određenom faktoru razrjeđivanja.
U ovom postupku, preferirano je pripravljanje najmanje 5 koncentracija standarda i 5 koncentracija uzorka koji se ispituje, pripravljanjem 5 replikata, ili čak pogodnije 10 replikata, za svaku koncentraciju standarda, te slično za svaku koncentraciju uzorka, općenito uzastopnim razrjeđivanjem osnovne otopine 1 : 2.
Koncentracije defibrotida u standardu i uzorku za ispitivanje općenito su od 0,1 do 100 μg/mL, pogodnije od 0,3 do 50 μg/mL, još pogodnije od 0,5 do 8 μg/mL.
Koncentracije uzorka za ispitivanje su preferirano istog raspona nivoa koncentracija kao kod standarda.
U skladu s gornjom ilustracijom, mjerenja se za svaku koncentraciju preferirano provode na dvije mikroploče gdje je položaj svakog uzorka, standarda i uzorka za ispitivanje, odnosno odgovarajuće koncentracije preferirano obrnut između jedne i druge ploče. Prema ovoj shemi smještanja uzoraka, koja je detaljnije objašnjena u eksperimentalnom dijelu, za svaku koncentraciju defibrotida u standardu i uzorku za ispitivanje, izmjeri se najmanje 5 ili pogodnije 10 vrijednosti apsorbancija u svakom vremenu.
Set gore opisanih mjerenja se provede u prethodno određenim vremenima, to jest, najprije u vremenu t0, to jest, kada su sve komponente dodane, prije nego što započne enzimatska reakcija ovog izuma, te uzastopno u preciznim intervalima i u vremenskom periodu dostatnom za prikupljanje potrebnih podataka.
Pogodno je da se mjerenja apsorbancija nastave do najviše 90 minuta, s očitanjem svakih 1-10 minuta. Još pogodnije, očitanja se provedu u vremenu t0, te uzastopno u periodu od 20 do 50 minuta, svakih 5 minuta. Očitavanja fotometrijske apsorbancije provode se na valnoj duljini koji ovisi o prirodi grupe X koja se treba detektirati, oslobođene u enzimatskoj hidrolitičkoj reakciji. U specifičnom slučaju u kojem X je p-NA, apsorbancija se mjeri na 405 nm.
Očitanja apsorbancija uzoraka standarda i nepoznatog uzorka defibrotida, nazvana sirovim podacima, koji općenito potječu od istog aparata i osiguravaju operaciju očitavanja; prikazana su tablično na taj način da je vrijednost apsorbancije izražena za svako vrijeme i jažicu.
Sirovi podaci se zatim procesiraju, uporabom, na primjer, Spread Sheet-Microsoft Excel®. Ova prva operacija procesiranja vodi do izračunavanja prosječne apsorbancije i povezane standardne devijacije, u svakom vremenu i za svaki set očitanja, od kojih se svaki set sastoji od najmanje 5, te pogodnije 10 replikata za svaku koncentraciju standarda i test-uzorka defibrotida.
Daljnje statističko procesiranje podataka se provodi kompjuterskim programom tipa Sigma Plot Computer Program (SPSS, Chicago, USA) koje uzima u obzir matematički odnos koji postoji između vrijednosti apsorbancija uzoraka i vremena, za svaki set koncentracija defibrotida, da se dobije pravac čiji je nagib proporcionalan koncentraciji defibrotida.
Preciznije, u intervalu u kojem je odgovor linearan, preferirano od 20 do 50 minuta, te za svaki od 5 ili pogodnije 10 replikata iste koncentracije, program izračunava liniju regresije koja je karakterizirana koeficijentom linearne regresije «b», koeficijentom determinacije «r2» i odsječkom «a».
Pravci dobiveni prema ovom postupku općenito imaju dobru korelaciju izraženu visokom vrijednosti r2, općenito najmanje 0,97, pogodnije r2 > 0,99. Podaci dobiveni ovim programom mogu se reproducirati kao tablično prikazani digitalni podaci ili se mogu prikazati grafički, za svaki set koncentracija.
Kao što je prikazano na Slici 1, smještanjem vremena na apscisu i apsorbancije na ordinatu, dobit će se pravci čiji će nagib «b» biti proporcionalni brzini enzimatske reakcije: povećanjem koncentracije defibrotida povećat će se brzina hidrolize, te proporcionalno vrijednost «b».
Konačno, vrijednosti nagiba, izračunate kao što je gore opisano za svaki set replikata standarda defibrotida i test-uzoraka defibrotida, stavljene su u korelaciju s decimalnim logaritmom koncentracije defibrotida na koje se odnose.
Grafički, ovom korelacijom dobiva se sigmoid za standard i sigmoid za test uzorak (Slika 2); glavni dijelovi sigmoida imaju dva pravca koji su općenito paralelni i čiji razmak je funkcija razlike u biološkoj aktivnosti između test uzorka i standarda.
U ovom intervalu linearnosti jačina nepoznatog uzorka defibrotida u usporedbi s onom standarda odredi se u skladu s metodologijom biološkog određivanja paralelnih pravaca opisanom u Finney DJ, Statistical Method in Biological Assay, 2. izdanje, Ch. Griffin, London.
Ova metodologija može se primijeniti kada je, kao u ovom izumu, biološki odgovor linearna funkcija logaritma koncentracije supstancije koja se određuje, te gdje je prisutna paralelnost i linearnost između pravaca povezanih sa standardom, te odnosnih nepoznatih koncentracija.
Preferirano statističko procesiranje podataka, izračunavanje omjera jačina, te time određivanje nepoznate aktivnosti defibrotida provodi se uporabom namjenskog softwera konstruiranog na temelju gore spomenute metodologije.
Međutim, statističko procesiranje podataka, koje, u kemijskoj analizi općenito, i ovom postupku posebice, omogućuje smanjenje pojavnosti pogrešaka i eksperimentalne varijabilnosti, nije povezano s postupkom izuma i jednostavno predstavlja metodu procjene rezultata koja je dobro poznata stručnjaku, te koja se uobičajeno rabi na tom području.
Ovaj izum odnosi se također na komplete za određivanje biološke aktivnosti defibrotida prema postupku ovog izuma, koji se sastoji od najmanje:
a) odmjerene količine supstrata za plazmin kao što je gore definirano te
b) odmjerene količine plazmina.
Preferirani kompleti sadrže od 20 do 30 mg supstrata specifičnog za plazmin po jedinici plazmina, te pogodnije 25 mg supstrata po jedinici plazmina.
U skladu s ovim izumom, kompleti koji sadrže H-D-Val-Leu-Liz-pNA kao supstrat specifičan za plazmin, i humani plazmin, posebice su prikladni.
Kompleti u skladu s ovim izumom mogu također sadržavati puferirane vodene otopine, preferirano otopinu puferiranu s TRIS.HCl 50 mM, pri pH 7,4.
Moguće je da kompleti ovog izuma također sadrže odmjerenu količinu defibrotida (standard) u svrhu omogućavanja kontrolnih mjerenja.
U preferiranom ostvarenju ovog izuma, standardne otopine i otopine uzoraka defibrotida za određivanje uvedu se u odgovarajuće jažice mikroploča. Otopina plazmina pripravi se u trenutku primjene, te se raspodijeli u jažice koje sadrže defibrotid i konačno se doda otopina koja sadrži supstrat za plazmin. Mikroploča se zatim smjesti u termostatirani čitač te se, nakon brzog mućkanja, provede očitavanje apsorbancija sistema u prethodno određenim intervalima i u prethodno određenom vremenskom periodu. Dobiveni sirovi podaci se zatim procesiraju, određujući nepoznatu aktivnost uzoraka defibrotida.
Ovi i ostali aspekti izuma bit će bolje ilustrirani u slijedećim Primjerima, koji međutim nemaju namjeru ograničavati izum.
PRIMJERI
Slijedeći materijali uporabljeni u Primjerima navedeni su ovdje:
Aparati
-Detektor za mikroploče koje imaju 96 jažica MRX TCII (Dynex Technologies, Chantilly, VA, USA), termostatiran i opremljen programom za enzimatsku kinetiku.
-Mikroploče koje imaju 96 jažica ravnog dna (Greiner L., Kremunster, Austrija, kataloški broj 655101)
-Pipete s kontinuiranim podešavanjem volumena Pipetman P200 (30-200 μL) i 8x200 (20-200 μL) te 200-μL nastavcima certificirane kvalitete (Gilson, Milano, Italija)
-pH-metar PHM85 Radiometer (Analitica De Mori, Milano, Italija)
Programi
-Microsoft Excel® (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA)
-Sigma Plot Computer Program® (SPSS, Chicago, USA)
Supstancije
-Definbrotid (Gentium)
-Humani plazmin, 1 jedinica, P-4895 (Sigma Aldrich, Milano, Italija)
-Kromogeni supstrat S-2251,820332-39 (Chromogenix Instrumentation Laboratory S. p. A., Milano, Italija)
-Tris (hidroksimetil) aminometan (TRIS), 255285-9 (Sigma-Aldrich, Milano, Italija)
-1N HCl 1090571000 (Merck)
-1N NaOH 1091411000 (Merck)
Otopine
TRIS-HCl pufer
2,42 g TRIS otopi se u destiliranoj vodi i razrijedi na volumen od 100 mL. U otopinu se doda 16 mL 1N HCl te nakon toga još destilirane vode da se dobije konačni volumen od 400 mL. pH konačne otopine je 7,40. Ako se vrijednost razlikuje od navedenog, pH se korigira da se dobije željena vrijednost dodatkom 1N HCl ili 1N NaOH.
Otopina plazmina
Jedna jedinica (1 i.j.) humanog plazmina otopi se u 4 mL TRIS-HCl pufera pri 0°C. Uz provođenje postupka stalno u ledu, otopina se podijeli u alikvote od 200 μL koji se pohrane na -20°C u plastične kivete volumena 10 mL.
Otopina kromogenog supstrata S-2251
25 mg S-2251 otopi se u 15,15 mL destilirane vode i pohrani na +4/+8°C.
Standardne otopine defibrotida
Pripravljanje standardnih otopina
(Konačnih) koncentracija od 0,1 do 100 μg/mL
60 mg defibrotida otopi se u 3 mL TRIS-HCl pufera i razrijedi 1 : 15 s TRIS-HCl puferskom otopinom. Tako dobivena otopina, koncentracije 1,333 mg/mL, podvrgne se uzastopnom razrjeđivanju 1: 2 da se dobije otopina defibrotida koncentracije 666 μg/mL, 333 μg/mL i 166 μg/mL. Ova posljednja otopina, koja se rabi kao osnovna otopina, se dalje razrjeđuje da se dobiju otopine koncentracija 83,33 μg/mL, 41,67 μg/mL, 33,33 μg/mL, 25 μg/mL, 16,66 μg/mL, 8,33 μg/mL, 5 μg/mL, 2,5 μg/mL, 1,66 μg/mL, 0,83 μg/mL, 0,5 μg/mL te konačno 0,16 μg/ml.
(Konačnih) koncentracija od 0,5 do 8 μg/mL
60 mg defibrotida otopi se u 3 mL TRIS-HCl pufera i razrijedi 1 : 1500 s TRIS-HCl pufer otopinom. Tako dobivena otopina koncentracije 13,33 μg/mL, podvrgne se uzastopnom razrjeđivanju 1: 2 da se dobiju otopine defibrotida pojedinačnih koncentracija od 6,66 μg/mL, 3,33 μg/mL, 1,66 μg/mL i 0,83 μg/mL.
Procedure
150 μL svake gore opisane standardne otopine defibrotida uzme se i unese u jažice mikroploča.
Otopina plazmina se zatim pripravi brzo dodavanjem pri 0°C, 3,8 mL TRIS-HCl pufera u kivetu koja sadrži 0,2 mL otopine humanog plazmina. Sve se oprezno mućka dok se ne otopi, te se uzme 50 μ1 i nanese u jažice mikroploče, te nakon toga 50 μL S-2251 u svaku jažicu.
Mikroploča, smještena u MRX TCII čitač namješten na 37°C, mućka se otprilike 10 sekundi; očitanje apsorbancija provede se na 405 nm, na početnom vremenu t0 te uzastopno svake dvije minute u intervalu od 10 do 20 minuta, prema programu enzimatske kinetike.
Eksperimentalni podaci dobiveni mjerenjem koncentracija defibrotida od 0,1 do 100 μg /mL se zatim procesiraju (Excel i Sigma Plot programi) i prikažu na grafu (linije regresije) kao što je prikazano primjerom na slijedećim Slikama 1 i 2.
Vrijednosti kutnog koeficijenta b (nagib) pravaca koji se odnose na standard i test uzorak defibrotida (Slika 1) nanesu se uzimajući u obzir koncentracije defibrotida (logaritamska skala) (Slika 2).
Kao što je vidljivo iz grafa, linearni odgovor koji omogućava identifikaciju pravaca dobiva se u centralnom dijelu krivulje. U tom intervalu linearnosti, jačina nepoznatih uzoraka defibrotida odredi se u usporedbi sa standardom, prema već spomenutoj metodologiji bioloških određivanja paralelnih pravaca opisanoj u Finney DJ, Statistical Method in Biological Assay, 2. izdanje, Ch. Griffin, London. Da bi ova metodologija bila uporabljiva, važno je da postoji, uz linearnost, paralelnost između pravaca koji se odnose na standard te na defibrotid za ispitivanje.
Test za određivanje biološke aktivnosti nepoznatih uzorka defibrotida, usporedbom sa standardom defibrotida, provodi se pogodno uporabom koncentracija koje povećavaju pravocrtni dio gore određenog sigmoida. Posebice su preferirane koncentracije standarda i nepoznatog defibrotida u području od 0,5 do 8 μg/mL.
Raspored u jažicama ploče, replikata različitih koncentracija defibrotida za standard i za uzorak za ispitivanje je dalje prikazan.
[image]
Standardne otopine defibrotida smjeste se u kolone 2-6 dok se uzorci defibrotida za određivanje smjeste u kolone 7-11, u navedenim koncentracijama. Na drugoj ploči, preferirano je da je položaj uzoraka obrnut.
Vanjske kolone i redovi mikroploče ne rabe se za postupak određivanja, već se pune vodom u svrhu osiguravanja maksimalne temperaturne homogenosti u cijelom sistemu.
Mikroploča, smještena u MRX TCII čitač namješten na 37°C, mućka se otprilike 10 sekundi; apsorbancije očitaju na 405 nm, na početnom vremenu t0 te uzastopno svakih 5 minuta tijekom perioda od 20. do 50. minute, prema programu enzimatske kinetike.
Izmjerene vrijednosti apsorbancije se zatim procesiraju (Excel i Sigma Plot programi), prikažu tablično i grafički (linije regresije).
Tada je moguće izračunati omjer jačinu, te odrediti aktivnost nepoznatog uzorka defibrotida usporedbom sa standardom, uporabom istog sistema izračunavanja kao što je gore opisano.
Dalje su dane primjerom Tablice (1, 2 i 3) i grafovi (Slike 3, 4 i 5) koje se odnose na uzorke defibrotida, ispitane u koncentraciji od 0,5 μg/mL, 2,0 μg/mL i 8,0 μg/mL.
Claims (17)
1. Postupak za određivanje biološke aktivnosti defibrotida, naznačen time, da obuhvaća slijedeće korake:
a) dovođenje u kontakt defibrotida, plazmina i supstrata specifičnog za plazmin koji reakcijom s plazminom osigurava mjerljivi produkt i
b) mjerenje količine produkta stvorenog u uzastopnim vremenima.
2. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time, da plazmin je plazmin sisavaca, preferirano humani plazmin.
3. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time, da supstrat specifičan za plazmin je spoj formule
A1-A2-A3-X
u kojem Al i A2 su nepolarne aminokiseline, A3 je lizin ili arginin i X je mjerljivi produkt.
4. Postupak prema zahtjevu 3, naznačen time, da je mjerljivi produkt X izabran između para-nitroanilina i 2-naftilamina.
5. Postupak prema zahtjevu 3, naznačen time, da supstrat za plazmin je H-D-Valil-1-Leucil-1-Lizin-p-nitroanilin.
6. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time, da plazmin ima koncentraciju od 0,0064 do 0,050 i.j./mL i supstrat za plazmin ima koncentraciju od 2,5 do 3,5 mM.
7. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time, da je koncentracija plazmina 0,0125 i.j./mL i koncentracija supstrata za plazmin 3 mM.
8. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time, da se mjerljivi produkt X mjeri spektrofotometrijski.
9. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time, da je reakcijski medij vodena otopina puferirana na pH od 7 do 8, preferirano na pH 7,4.
10. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time, da se temperatura sistema održava na 35 do 39°C, preferirano na 37°C.
11. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time, da je koncentracija supstrata za plazmin od 0,3 do 4 mM, pogodno od 2,5 do 3,5 mM, još pogodnije 3 mM.
12. Postupak za određivanje biološke aktivnosti defibrotida prema zahtjevu 1, naznačen time, da postupak obuhvaća
a) određivanje brzine oslobađanja mjerljivog produkta X tijekom trajanja enzimatske reakcije, za svaki uzorak defibrotida, standarda i test uzorka
b) dovođenje u korelaciju, matematički i/ili grafički, gore spomenute brzine oslobađanja s odgovarajućim koncentracijama defibrotida
c) dobivanje biološke aktivnosti test uzoraka defibrotida.
13. Komplet za određivanje biološke aktivnosti defibrotida prema prethodnim zahtjevima, naznačen time, da sadrži najmanje:
a) odmjerenu količinu supstrata za plazmin i
b) odmjerenu količinu plazmina,
navedeni komplet sadrži 20 do 30 mg supstrata specifičnog za plazmin po jedinici plazmina.
14. Komplet prema zahtjevu 13, naznačen time, da supstrat za plazmin je H-D-Val-Leu-Liz-pNA i plazmin je humani plazmin.
15. Komplet prema zahtjevu 13, naznačen time, da sadrži 25 mg specifičnog supstrata po jedinici plazmina.
16. Defibrotid, naznačen time, da kada se podvrgne postupku iz zahtjeva 1-12, u koncentracijama 0,5, 2,0 i 8,0 μg/mL, pokazuje kinetiku oslobađanja para-nitroanilina kao što je pojedinačno prikazano na slikama 3,4 i 5, navedena kinetika oslobađanja odredi se pod slijedećim eksperimentalnim uvjetima:
koncentracija humanog plazmina: 0,0125 i.j./mL;
supstrat: H-D-Valil-1-Leucil-1-Lizin-p-nitroanilin;
koncentracija supstrata: 3 mM;
pufer: tris(hidroksimetil)amino metan hidroklorid, pH 7,4;
temperatura reakcije: 37°C;
spektrofotometrijska valna duljina: 405 nm.
17. Defibrotid, naznačen time, da kada se podvrgne postupku iz zahtjeva 1 do 12 pod slijedećim eksperimentalnim uvjetima:
koncentracija humanog plazmina: 0,0125 i.j./mL;
supstrat: H-D-Valil-1-Leucil-1-Lizin-p-nitroanilin;
koncentracija supstrata: 3 mM;
pufer: tris(hidroksimetil)amino metan hidroklorid, pH 7,4;
temperatura reakcije: 37°C;
spektrofotometrijska valna duljina: 405 nm,
uzrokuje kinetiku oslobađanja para-nitroanilina (p-NA) prema jednadžbi
pNA (μM/min)=a + b log X u kojoj
a = 0,6908 ± 0,0291
b = 0,31490 ± 0,0437
X = koncentracija defibrotida (μg/mL).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP01830770A EP1325962A1 (en) | 2001-12-17 | 2001-12-17 | A method for determining the biological activity of defibrotide |
| PCT/EP2002/001337 WO2002064404A1 (de) | 2001-02-12 | 2002-02-08 | Vorrichtung und verfahren zur abdeckung eines airbags |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HRP20040548A2 true HRP20040548A2 (en) | 2004-10-31 |
Family
ID=8184814
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HR20040548A HRP20040548A2 (en) | 2001-12-17 | 2004-06-16 | A method for determining the biological activity of defibrotide |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7338777B2 (hr) |
| EP (2) | EP1325962A1 (hr) |
| JP (1) | JP4348192B2 (hr) |
| KR (1) | KR100912424B1 (hr) |
| CN (1) | CN100408690C (hr) |
| AR (1) | AR037870A1 (hr) |
| AT (1) | ATE480637T1 (hr) |
| AU (1) | AU2002360945B2 (hr) |
| CA (1) | CA2468877C (hr) |
| DE (1) | DE60237639D1 (hr) |
| DK (1) | DK1456404T3 (hr) |
| ES (1) | ES2349509T3 (hr) |
| HK (1) | HK1077332A1 (hr) |
| HR (1) | HRP20040548A2 (hr) |
| HU (1) | HUP0402231A3 (hr) |
| IL (2) | IL162511A0 (hr) |
| IS (1) | IS7312A (hr) |
| MX (1) | MXPA04005958A (hr) |
| NO (1) | NO20042972L (hr) |
| NZ (1) | NZ533594A (hr) |
| PL (1) | PL373243A1 (hr) |
| PT (1) | PT1456404E (hr) |
| RS (1) | RS63104A (hr) |
| RU (1) | RU2323979C2 (hr) |
| UA (1) | UA80104C2 (hr) |
| WO (1) | WO2003052130A2 (hr) |
| ZA (1) | ZA200404656B (hr) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1325962A1 (en) | 2001-12-17 | 2003-07-09 | Gentium S.p.A. | A method for determining the biological activity of defibrotide |
| EP1872787A1 (en) * | 2006-06-27 | 2008-01-02 | Gentium S.p.A. | Use of defibrotide for the inhibition of heparanase |
| EP1982722A1 (en) * | 2007-04-16 | 2008-10-22 | Gentium S.p.A. | Use of oligotide for the treatment of renal diseases |
| EP2103689A1 (en) * | 2008-03-19 | 2009-09-23 | Gentium S.p.A. | Synthetic phosphodiester oligonucleotides and therapeutical uses thereof |
| ES2694239T3 (es) | 2010-11-12 | 2018-12-19 | Gentium S.R.L. | Defibrótido para su uso en profilaxis y/o tratamiento de la enfermedad de Injerto contra huésped (GVHD) |
| JP6198821B2 (ja) * | 2012-06-22 | 2017-09-20 | ゲンチウム エス．アール．エル． | デフィブロチドの生物学的活性を決定する為の、ユーグロブリンに基づく方法 |
| US9655761B2 (en) | 2012-11-12 | 2017-05-23 | Djo, Llc | Orthopedic back brace |
| TWI615473B (zh) * | 2013-11-26 | 2018-02-21 | 金提恩責任有限公司 | 用於測定去纖維蛋白多核苷酸的生物活性之基於優球蛋白的方法 |
| EP3026122A1 (en) | 2014-11-27 | 2016-06-01 | Gentium S.p.A. | Cellular-based method for determining the potency of defibrotide |
| RU2766143C2 (ru) * | 2017-07-26 | 2022-02-08 | Джентиум С.Р.Л. | Жидкая композиция дефибротида для лечения и профилактики веноокклюзионной болезни |
| AR112403A1 (es) | 2017-08-03 | 2019-10-23 | Jazz Pharmaceuticals Ireland Ltd | Formulaciones de ácidos nucleicos altamente concentradas |
| US11571440B2 (en) | 2018-04-12 | 2023-02-07 | Jazz Pharmaceuticals Ireland Limited | Defibrotide for the prevention and treatment of cytokine release syndrome and neurotoxicity associated with immunodepletion |
| US20220023533A1 (en) | 2018-12-07 | 2022-01-27 | Jazz Phrmaceticals Ireland Limited | Subcutaneous delivery of high concentration formulations |
| US20230190783A1 (en) | 2020-02-28 | 2023-06-22 | Jazz Pharmaceuticals Ireland Limited | Delivery of low viscosity formulations |
| TW202308659A (zh) | 2021-05-06 | 2023-03-01 | 愛爾蘭商爵士製藥愛爾蘭有限責任公司 | 用於急性呼吸窘迫症候群之治療及預防的去纖維蛋白多核苷酸 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2154279A1 (de) * | 1970-11-03 | 1972-05-25 | Crinos Industria Farmaco | Medikamente für das fibrinolytische System |
| DE2812943C3 (de) * | 1978-03-23 | 1981-05-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und Reagens zur Bestimmung der biologischen Aktivität von Heparin im Plasma |
| IT1170215B (it) * | 1983-09-12 | 1987-06-03 | Crinos Industria Farmaco | Composizione farmaceutica per il trattamento di stati di insufficienza renale acuta |
| IT1206341B (it) * | 1984-02-16 | 1989-04-14 | Crinos Industria Farmaco | Composizione farmaceutica per il trattamento dell'ischemia acuta del miocardio. |
| US5231006A (en) * | 1986-10-16 | 1993-07-27 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Method for the determination of plasminogen |
| US5321006A (en) * | 1992-12-09 | 1994-06-14 | International Flavors & Fragrances Inc. | Flavor and fragrance compositions produced using process for quantitatively and qualitatively substantially continuously analyzing the aroma emitted from a living fruit |
| CN1187201A (zh) * | 1995-05-05 | 1998-07-08 | 生物药物研究与发展有限公司 | 血纤维蛋白交联和/或转谷氨酰胺酶的抑制剂 |
| GB9719161D0 (en) * | 1997-09-09 | 1997-11-12 | Glaxo Group Ltd | New therapeutic method |
| EP1325962A1 (en) | 2001-12-17 | 2003-07-09 | Gentium S.p.A. | A method for determining the biological activity of defibrotide |
-
2001
- 2001-12-17 EP EP01830770A patent/EP1325962A1/en not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-11-27 CN CNB028269799A patent/CN100408690C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-27 CA CA2468877A patent/CA2468877C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-27 DE DE60237639T patent/DE60237639D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-27 AT AT02795074T patent/ATE480637T1/de active
- 2002-11-27 RU RU2004121962/13A patent/RU2323979C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-11-27 WO PCT/EP2002/013371 patent/WO2003052130A2/en active Application Filing
- 2002-11-27 KR KR1020047009476A patent/KR100912424B1/ko active IP Right Grant
- 2002-11-27 RS YU63104A patent/RS63104A/sr unknown
- 2002-11-27 HU HU0402231A patent/HUP0402231A3/hu unknown
- 2002-11-27 MX MXPA04005958A patent/MXPA04005958A/es unknown
- 2002-11-27 JP JP2003552997A patent/JP4348192B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-27 NZ NZ533594A patent/NZ533594A/xx unknown
- 2002-11-27 AU AU2002360945A patent/AU2002360945B2/en not_active Expired
- 2002-11-27 UA UA20040705856A patent/UA80104C2/uk unknown
- 2002-11-27 PL PL02373243A patent/PL373243A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2002-11-27 IL IL16251102A patent/IL162511A0/xx unknown
- 2002-11-27 DK DK02795074.0T patent/DK1456404T3/da active
- 2002-11-27 ES ES02795074T patent/ES2349509T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-27 EP EP02795074A patent/EP1456404B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-27 PT PT02795074T patent/PT1456404E/pt unknown
- 2002-12-17 AR ARP020104901A patent/AR037870A1/es not_active Application Discontinuation
-
2004
- 2004-06-11 ZA ZA200404656A patent/ZA200404656B/en unknown
- 2004-06-14 IL IL162511A patent/IL162511A/en active IP Right Grant
- 2004-06-14 IS IS7312A patent/IS7312A/is unknown
- 2004-06-16 HR HR20040548A patent/HRP20040548A2/hr not_active Application Discontinuation
- 2004-06-17 US US10/868,798 patent/US7338777B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-07-14 NO NO20042972A patent/NO20042972L/no not_active Application Discontinuation
-
2005
- 2005-10-20 HK HK05109348.5A patent/HK1077332A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230357762A1 (en) | Euglobulin-based method for determining the biological activity of defibrotide | |
| HRP20040548A2 (en) | A method for determining the biological activity of defibrotide | |
| AU2002360945A2 (en) | A method for determining the biological activity of defibrotide | |
| RU2766143C2 (ru) | Жидкая композиция дефибротида для лечения и профилактики веноокклюзионной болезни | |
| TW201520339A (zh) | 用於測定去纖維蛋白多核苷酸的生物活性之基於優球蛋白的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1OB | Publication of a patent application | ||
| AIPI | Request for the grant of a patent on the basis of a substantive examination of a patent application | ||
| ODRP | Renewal fee for the maintenance of a patent |
Payment date: 20081126 Year of fee payment: 7 |
|
| OBST | Application withdrawn |