FR3036287A1 - Traitement et detection des trypanosomes - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne des méthodes et compositions pour prévenir, traiter et diagnostiquer une infection par les trypanosomes. Elle concerne l'utilisation d'antigènes excrétés/sécrétés (exoantigènes, sécrétome) et plus particulièrement l'identification d'une protéine excrétée/sécrétée par les trypanosomes, dont l'inhibition permet de conférer une protection efficace contre l'infection, le développement ou la dissémination des trypanosomes, principalement par vaccination. Elle concerne l'utilisation de la protéine ou de ses dérivés ou une séquence nucléotidique dérivée de celle-ci, ainsi que celle d'anticorps dirigés contre eux pour le diagnostic et le suivi des infections par les trypanosomes.
Description
1 TRAITEMENT ET DETECTION DES TRYPANOSOMOSES La présente invention concerne des méthodes et compositions pour prévenir, traiter et diagnostiquer une infection à trypanosome. Elle concerne notamment l'utilisation d'antigènes excrétés/sécrétés (exoantigènes, sécrétome) et, plus particulièrement l'identification d'une protéine excrétée/sécrétée par les trypanosomes, dont la neutralisation ou l'inhibition permet de conférer une protection efficace contre l'infection, le développement ou la dissémination des trypanosomes, principalement par vaccination. L'invention permet une action croisée contre différentes souches de trypanosomes, et offre ainsi des méthodes et compositions efficaces pour prévenir et lutter contre les infections et pathologies induites par les trypanosomes chez les mammifères, les diagnostiquer plus précisément, et suivre l'évolution de l'infection après traitement.
INTRODUCTION Les trypanosomes (Trypanosoma) sont des protozoaires parasites infectant principalement les animaux mammifères, mais également les humains. L'infection provoque chez les animaux une trypanosomose, ou trypanosomiase, qui peut conduire à la mort de l'animal. Chez l'homme, la trypanosomose humaine africaine débute par un chancre d'inoculation, puis lui succède une phase lymphatico-sanguine, avec en particulier une fièvre, des adénopathies, une hépatosplénomégalie, un prurit et des oedèmes. Une phase méningoencephalitique lui succède, lorsque le parasite rentre dans le système nerveux central, avec différents signes neurologiques et en particulier les troubles du sommeil (d'où son nom de maladie du sommeil). La maladie de Chagas (trypanosomose humaine américaine), est provoquée par Trypanosoma cruzi, transmis par les punaises. Lorsque T cruzi pénètre à travers la peau, il peut apparaître une lésion cutanée érysipeloïde ou pseodofuronculeuse (chagome), puis ensuite parfois un oedème unilatéral bi palpébral (Signe de Romalia). La phase aiguë peut passer inaperçue, et plus rarement, se manifester par une hépatosplénomégalie fébrile. La phase chronique est dominée par la gravité des formes cardiaques et l'existence de formes digestives avec méga organes. Les trypanosomes sont caractérisés par une grande diversité génétique, qui joue sur le tropisme, la virulence, la transmissibilité, et la sensibilité aux trypanocides. Parmi les différents groupes de trypanosomes, on mentionnera particulièrement le groupe stercoraria, dans lequel se placent Trypanosoma cruzi, T theileri, T lewisi et T musculi et le groupe Salivaria, qui lui-même comprend trois principaux sous-genres: Trypanozoon, Duttonella et Nannomonas. Le sous-genre Trypanozoon comporte des espèces de trypanosomes à développement extracellulaire qui infectent les animaux et l'homme, tandis que Duttonella et Nannomonas n'infectent que les mammifères non-humains. Le sous genre Trypanozoon est constitué de trypanosomes polymorphes 3036287 2 (forme longue et forme courte ou trapue), avec flagelle libre facultatif et kinétoplaste petit et en position subterminale (postérieur). Les principales espèces de ce sous-genre sont Trypanosoma (T) brucei, T evansi et T equiperdum. T brucei comprend trois sous-espèces : T b. brucei, T b. gambiense et T b. rhodesiense, qui sont très proches 5 sur les plans morphologique, antigénique et biochimique, et qui se distinguent essentiellement par leur caractère infectieux, leur pathogénicité et leur distribution géographique. T brucei et ses sous-espèces sont transmis par les glossines. T evansi est transmis au bétail, aux chevaux et aux chameaux par des mouches piqueuses autres que les glossines (Tabanidae) en Afrique, en Amérique du Sud et dans le Sud Est Asiatique.
10 T equiperdum n'a pas d'hôte invertébré (transmission sexuelle chez les chevaux). Les trypanosomes du sous-genre Duttonella ont une forme de massue ou de gourdin. Les principales espèces sont T vivax et T uniforme, qui ont un tropisme pour les ruminants sauvages et domestiques. Les trypanosomes du sous-genre Nannomonas sont petits et n'ont pas de flagelle libre. Les principales espèces sont T congolense et T simiae, qui 15 ont un tropisme important pour le bétail, le porc et le chien. En Afrique, T congolense, T vivax, T brucei et T evansi sont les agents principaux responsables des trypanosomoses, notamment chez les mammifères domestiques tels que les ruminants, les bovidés, les porcins, les ovins, les caprins, les 20 équidés et les canidés. T brucei, et notamment la sous-espèce T b. gambiense, est probablement la plus connue puisqu'elle est responsable de la forme chronique de la maladie du sommeil chez l'homme en Afrique occidentale et centrale. La sous-espèce T b. rhodesiense est l'agent responsable de la forme aigüe de la maladie du sommeil. T vivax est un parasite essentiellement des ongulés en Afrique tropicale et la transmission 25 est assurée par les taons ou les tabanidés. T equiperdum est également présent en Afrique. La sous-espèce T evansi est transmise aux bovidés, chevaux et dromadaires, et a des répercussions économiques importantes partout dans les régions d'élevage. Les cas humains provoqués par T evansi sont exceptionnels. De rares cas de trypanosomoses provoquées par d'autres espèces de trypanosomes (trypanosomes du 30 groupe lewisi, T theileri) ont été rapportés chez l'homme et l'animal. Les trypanosomes présentent un cycle de vie complexe qui inclut différentes formes morphologiques, selon les sous-espèces. D'une manière générale, lors de l'infection, la glossine (ou mouche tsé-tsé) injecte dans le derme de l'hôte à l'endroit de 35 la piqûre les formes métacycliques infectantes. Les parasites se multiplient dans le derme au point d'inoculation, donnant naissance aux formes sanguines. Ce stade peut durer de 1 à 3 semaines. Ensuite, les parasites envahissent le sang, le système lymphatique, ainsi que différents organes, tels le coeur ou les reins, où ils provoquent d'importantes lésions. Les sources d'infection des animaux domestiques sont également 40 les autres animaux domestiques infectés, ou les animaux sauvages malades ou porteurs sains.
3036287 3 A l'heure actuelle, le contrôle de la maladie repose principalement sur le contrôle des vecteurs par l'utilisation d'insecticides, utilisés en particulier pour l'imprégnation de pièges, ce qui présente un impact environnemental. Chez les mammifères infectés, la capacité des trypanosomes à échapper aux défenses 5 immunitaires de l'hôte en exprimant à leur surface des antigènes variables a empêché jusqu'à présent le développement de stratégies vaccinales efficaces. Seules quelques molécules trypanocides sont disponibles, mais elles induisent des effets secondaires importants et de nombreuses souches résistantes de parasites sont apparues. Sur le plan diagnostique, celui-ci se limite généralement à une suspicion basée sur l'observation de 10 symptômes. Mais il n'existe pas à ce jour de marqueurs fiables permettant une détection rapide et spécifique d'une infection, à des coûts raisonnables. Il existe donc un besoin dans l'art antérieur pour des approches efficaces de prévention, de traitement et de détection des infections à trypanosome.
15 RE SUME DE L'INVENTION La présente invention concerne des méthodes et compositions pour traiter et diagnostiquer une infection à trypanosome. Elle concerne l'utilisation d'antigènes 20 excrétés/sécrétés (exoantigènes, sécrétome) et, plus particulièrement l'identification d'une protéine sécrétée par les trypanosomes, dont la neutralisation (par des anticorps acquis par vaccination ou par injection) ou l'inhibition (par différentes molécules) permet de conférer une protection efficace contre l'infection, le développement ou la dissémination des trypanosomes. L'invention permet une action croisée contre 25 différentes souches de trypanosomes, et offre ainsi des méthodes et compositions efficaces pour lutter contre les infections et pathologies induites par les trypanosomes chez leurs hôtes mammifères. Elle permet également la détection de cette protéine et d'anticorps dirigés contre elle dans tout prélèvement, ainsi que le suivi de l'évolution de la trypanosomose, avec ou sans traitement. Elle permet également la confection 30 d'amorces et de sondes permettant l'utilisation de différentes techniques de biologie moléculaire, telle que la « polymerase chain reaction « (PCR) appliquées au diagnostic des trypanosomoses. Un objet de l'invention réside ainsi dans des compositions pharmaceutiques ou 35 vétérinaires comprenant (i) la protéine TbKHC1 ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide, ou un inhibiteur de la protéine TbKHC1 et (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire. Dans un mode particulier, l'invention concerne des compositions, telles que des 40 vaccins, comprenant (i) la protéine TbKHC1 ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, ou un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide, (ii) un 3036287 4 excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire, et (iii) optionnellement un adjuvant choisi avantageusement pour renforcer une réponse immunitaire. Dans un mode particulier, l'invention concerne des compositions, telles que des vaccins, comprenant (i) la protéine TbKHC1, ou un ou plusieurs peptides antigéniques 5 de celle-ci, complexé(e) à ou en association avec une ou plusieurs autres molécules de trypanosomes, (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire, et (iii) optionnellement un adjuvant choisi avantageusement pour renforcer une réponse anticorps. Dans un autre mode particulier, l'invention concerne des compositions 10 comprenant (i) un anticorps anti-TbKHC1, ou un fragment ou dérivé d'un tel anticorps, et (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire. L'invention a également pour objet une composition telle que définie ci-dessus, ou la protéine TbKHC1 ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, ou un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide, pour son utilisation pour 15 vacciner ou immuniser un mammifère contre le trypanosome et les trypanosomoses. L'invention a également pour objet une composition telle que définie ci-dessus, ou la protéine TbKHC1 ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, ou un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide pour son utilisation pour protéger un mammifère contre les trypanosomoses.
20 L'invention a également pour objet une composition telle que définie ci-dessus, ou la protéine TbKHC1 ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, ou un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide, ou un inhibiteur de celle-ci, pour son utilisation pour traiter un mammifère ayant une trypanosomose. L'invention concerne en outre l'utilisation de la protéine TbKHC1 ou d'un ou 25 plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, ou d'un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide, pour la préparation d'un vaccin pour immuniser ou protéger un mammifère contre le trypanosome. Selon un autre aspect, l'invention concerne aussi l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine TbKHC1 pour la préparation d'un médicament pour le traitement d'un 30 mammifère ayant une trypanosomose. L'invention concerne également une méthode pour traiter un mammifère ayant une trypanosomose, comprenant l'inhibition de la protéine TbKHC1 chez ledit mammifère. L'inhibition peut être obtenue par administration d'un inhibiteur (par exemple un anticorps ou une molécule interférant avec la fixation ou la fonction de cette 35 protéine au niveau des tissus des hôtes mammifères), ou par vaccination dudit mammifère contre la protéine TbKHC1 ou un antigène de celle-ci. L'invention propose ainsi de nouvelles immunothérapies des trypanosomoses utilisant tout anticorps anti- 3036287 5 TbKHC1, notamment monoclonal, ou des dérivés de tels anticorps ou des constructions utilisant la séquence en acides aminés ou en nucléotides d'une partie de tels anticorps. L'invention a en outre pour objet tout anticorps liant spécifiquement la protéine 5 TbKHC 1. Un autre objet de l'invention concerne également une méthode de diagnostic in vitro de trypanosomose chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend l'identification et la mesure, dans un échantillon dudit mammifère, de la présence de la protéine TbKHC1 ou des peptides antigéniques de celle-ci ou d'anticorps dirigés contre 10 cette protéine. Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour suivre l'évolution d'une infection à trypanosome chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend l'identification et la mesure de la quantité de protéine TbKHC1 ou d'anticorps dirigés contre cette protéine dans des échantillons du mammifère prélevés à différents 15 intervalles de temps. Un autre objet de l'invention concerne encore une méthode pour déterminer l'efficacité d'un traitement contre le trypanosome chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend l'identification et la mesure de la quantité de protéine TbKHC1 dans des échantillons du mammifère ou d'anticorps dirigés contre cette protéine 20 prélevés à différents intervalles de temps au cours du traitement, et éventuellement après traitement. L'invention concerne par ailleurs également - des kits de mesure de trypanosome dans un échantillon test, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un anticorps tel que défini ci-dessus, un milieu approprié pour la 25 formation d'un complexe immun avec ledit anticorps, et au moins un réactif pour la détection d'une réaction immunologique. - des kits de détection des anticorps dirigés contre la protéine TbKHC1 pour le diagnostic de l'infection utilisant la protéine TbKHC1, des peptides, ou des épitopes naturels ou synthétiques dérivés de cette protéine.
30 Un autre objet de l'invention concerne également toute méthode de diagnostic utilisant la séquence nucléotidique de la protéine TbKHC1 pour le diagnostic de trypanosomose ou pour l'identification précise d'une espèce de trypanosome (par exemple, la confection d'amorces ou de sondes permettant l'utilisation de différentes techniques de biologie moléculaire telles que la PCR ou l'hybridation).
35 L'invention peut être mise en oeuvre pour prévenir, traiter, détecter ou suivre l'évolution après vaccination ou traitement de toute affection provoquée par les 3036287 6 parasites du genre Trypanosoma, chez tout mammifère, notamment chez les animaux domestiques ou d'élevages, ainsi que chez l'homme. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES 5 Figure 1 : Un inhibiteur de TbKHC1 inhibe la prolifération parasitaire in vitro. Figure 2 : Un inhibiteur de TbKHC1 diminue la charge parasitaire in vivo. Figure 3 : Stratégie de vaccination. Figure 4 : Taux de survie de souris (effet protecteur) à une infection parasitaire après 10 vaccination selon l'invention. Figure 5 : Effet du transfert passif de sérum et de cellules. Figure 6 : Détection d'une infection par mesure d'anticorps dirigés contre la protéine TbKHC1.
15 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente invention concerne des méthodes et compositions pour prévenir, traiter, diagnostiquer et suivre l'évolution d'une infection par un trypanosome basées 20 sur la neutralisation ou l'inhibition de la protéine TbKHC1 et sur sa détection ou celle d'anticorps dirigés contre celle-ci. L'invention permet de conférer une protection efficace contre l'infection, le développement ou la dissémination de différentes souches de trypanosomes, principalement par vaccination. Elle est utilisable chez tout mammifère.
25 Définitions Le terme « trypanosomose » ou « trypanosomiase » désigne, de manière générale, tous les troubles causés par un trypanosome chez des mammifères. Le terme 30 trypanosomose inclut notamment la Nagana, la Surra, la Dourine, la maladie du sommeil, la trypanosomose africaine, la trypanosomose américaine, ainsi que toutes les lésions causées aux organes (e.g., rein, coeur, foie, testicule, tube digestif, cerveau) par une infection à trypanosome.
3036287 7 Le terme « traitement » ou « traiter » désigne toute amélioration de l'état d'un sujet. Le traitement peut être curatif ou préventif. Le traitement curatif est destiné à un mammifère infecté et vise à empêcher, réduire, ralentir ou retarder le développement d'une maladie chez le mammifère infecté. Il comprend notamment, chez un sujet 5 infecté, la diminution de la charge parasitaire, la disparition du parasite, la diminution de sa prolifération ou de sa transmission, la diminution des troubles causés par le parasite et notamment des lésions aux organes, la réduction des symptômes, ou l'éradication totale de la maladie. Le traitement curatif utilise typiquement un inhibiteur du pathogène (immunothérapie ou chimiothérapie). Le traitement préventif est destiné à 10 un mammifère non-infecté par le parasite et vise à empêcher, prévenir ou réduire l'infection chez un mammifère sain. Le traitement préventif utilise généralement un antigène du pathogène, permettant de générer une réponse immunitaire protectrice.
15 Identification d'un facteur de virulence L'invention découle de l'identification de la protéine TbKHC1, sécrétée par les trypanosomes, dont la neutralisation ou le blocage permet d'inhiber la prolifération du parasite, sa transmission, et sa virulence. L'invention montre en outre qu'une 20 immunisation contre la protéine TbKHC1, produite par différents trypanosomes, est possible et induit une protection croisée contre différents types de trypanosomes. Cette protéine représente donc une cible particulièrement pertinente et attractive pour toute stratégie thérapeutique ou diagnostique du trypanosome et des trypanosomoses.
25 Un objet de l'invention réside ainsi dans la protéine TbKHC1, ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, ou un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide, ou un inhibiteur de la protéine TbKHC1, pour leur utilisation pour le traitement préventif ou curatif d'une infection à trypanosome chez un mammifère. L'invention réside également dans l'utilisation de la protéine TbKHC1, ou d'un ou 30 plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, ou d'un inhibiteur de celle-ci, pour traiter une infection à trypanosome chez un mammifère. L'invention concerne également une méthode pour traiter une infection à trypanosome chez un mammifère comprenant une inhibition (e.g., une réduction, une neutralisation ou un blocage) de la protéine TbKHC1 chez le mammifère. L'inhibition de la protéine comprend l'inhibition de la quantité ou 35 de l'activité de la protéine et peut être obtenue par exemple (i) par immunisation ou vaccination du mammifère contre la protéine TbKHC1, par exemple par administration d'une quantité immunogène de la protéine TbKHC1 ou d'un ou de plusieurs fragments antigéniques de celle-ci ; et/ou (ii) par inhibition de la protéine TbKHC1 présente chez le mammifère, par administration d'un inhibiteur ou d'un compétiteur de celle-ci.
40 Ainsi, au sens de l'invention, le terme « inhiber » ou « inhibition » d'une protéine désigne toute réduction de la quantité ou de l'activité de ladite protéine.
3036287 8 L'inhibition désigne donc notamment une baisse ou une réduction de la quantité de ladite protéine par des composés affectant sa synthèse, sa sécrétion, ou sa structure. L'inhibition désigne également toute diminution de l'activité de la protéine par des composés (anticorps ou dérivés, peptides, molécules chimiques) agissant directement 5 sur elle ou sur une ou plusieurs de ses molécules cibles chez les hôtes mammifères, afin d'interférer avec son action. Au sens de l'invention, le terme «protéine TbKHCJ » désigne une protéine comprenant la séquence en acides aminés représentée dans SEQ ID NO : 2 ou tout 10 variant naturel de cette séquence résultant de polymorphismes ou de variations entre espèces ou sous-groupes de trypanosomes, ou toute protéine de type kinésine sécrétée par un trypanosome et ayant une séquence ayant au moins 45% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 2, de préférence au moins 60%, plus préférentiellement au moins 70%. Plus préférentiellement encore, l'identité de séquence avec la séquence 15 SEQ ID NO : 2 est de 80% ou plus, de préférence au moins 85%, 90%, 95%, 96%, 97% ; 98%, 99% ou plus. La séquence SEQ ID NO : 2 est représentée ci-dessous. Elle correspond à la protéine TbKHC1 de T. brucei brucei: 20 MS DADVKEGT PRNKTDFKNG FCSALMCYGQ DNLGDLMSAT 25 P ES SRGHTAL INAS LL S LGH NSLQFGLRAM ERYNDRREDI S KEIVHL I RE 30 I LAS RANDTV RAKGVELLAE TQMVDVSEME RGPS PFDAAR VEAVE T Q LAS 35 DVLLET I ERQ MS I LRLVRES CI RLKNQMLR MLKSLNEERE ELLDCKIKMA 40 AAGD SVAVP E GFQLVTVSGN T GT GKS FTMC GRDRVDIHFD VLRIVS ES PS VVSCLSSGSR DVKVTAKQ SV DRRFEIEMAE QEHQEAKRRA RLHEHIEVLR VDRLSQLCSE TLRVTMQADL NLCSTQRKPP HGVEVPGPYV EHLLNAARSN ERKLAAQLAE CGITPCCELP RQS SVIRTVQ MEKEAGS PGV SVVKPDEGRR DIVVKDQRFY NTTPGQEGI I EQGGVELTGC DPEAGKLKGK HI PWRDSKLT HVDYQKLAQK LKRTGASEEQ EMKLAQDL I I EQVKELGGVP RLEEINRLRD DEAKAHNREL QKDGTPS PNN PPIKLGFPGS EEFHRRVI CE RDGEDGAEVE DS YNEL I ERE ERCELVEKKQ LKRFLRRLRS SRGESTGGTA KFDGAFGDEC P RSAKL I FDK S SHVLLSAQE I T FI DLAGYE RI LQDS I GGR LQSLLDERDE MLNLREVYKA AEFQKKLDNA I EEAT FP ET F ENTQYRAALE AREVEQLKFE TQNENLQRTV APVTS S ET DA LQQQMVTAQ I ALLEKKDAEL EEELNEQLMC LVTAAHLSRL N AGDTGVPKNI TQ S DI FEAVA I Q S DNARS YE FMRFYRI GND RFS KT GI THD SRTSIILTVG RINLLEVQIA EVENLQEQQD REGTNDDLVR LDVGQVEEMR NSGISLNDTD LTATAI PLTA KQLTEQLEFS REPPEDTDMD QVEDPQNAPP QMKEET I LEK QDELLARLRS AT EKS QREQ I ARCLVYCRLR VP CI THAFKG VT GQFVQI YR RRVVTATAMN NP IMKDEAKC PS SDHLHETT SRDAERHELM EEFQYREEVY VLKQLSEKDA NRL EADVQ RH DLTEFLSEKR RLRCPPCATA MRERKSLQDR VLLRVKEEEI PVDAIAMDEY AS KAQYAAKL EEEEKHRMQN LEETLRRATQ Une recherche effectuée par les inventeurs a permis d'identifier d'autres protéines TbKHC1 au sens de l'invention à partir d'autres espèce de trypanosomes, notamment à partir de T brucei gambiense (99% d'identité avec SEQ ID NO : 2) ; T brucei rhodesiense ; T evansi ; T eqmperdum ; T congolense (76% d'identité avec SEQ ID NO : 2) ; T vivax (69% d'identité avec SEQ ID NO : 2) ; T musculi (un parasite du 3036287 9 groupe lewisi (61% d'identité avec SEQ ID NO : 2), et T cruzi (61% d'identité avec SEQ ID NO : 2). La séquence des protéines TbKHC1 de ces espèces est représentée dans SEQ ID NO : 3 (Trypanosoma brucei gambiense), SEQ ID NO : 4 (Trypanosoma congolense), SEQ ID NO : 5 (Trypanosoma vivax), et SEQ ID NO : 6 (Trypanosoma 5 cruzi). Ces protéines représentent des exemples de protéines TbKHC1 au sens de l'invention. Par ailleurs, l'homme du métier peut, sur la base des informations de la présente demande et des techniques classiques, identifier d'autres TbKHC1 à partir d'autres sous-groupes de trypanosomes. Dans ce contexte, le terme «identité de séquence», appliqué à un acide nucléique ou une protéine, fait référence à la 10 quantification (généralement en pourcentage) des correspondances de résidus de nucléotides ou d'acides aminés entre deux séquences alignées en utilisant un algorithme normalisé tel que l'alignement de Smith-Waterman (Smith et Waterman (1981) J Mol Biol 147: 195-197), CLUSTALW Nucleic Acids Res 22 (Thompson et al (1994).: (Altschul et al (1997) 4673-4680), ou BLAST2 Nucleic Acids Res 25: 3389-3402 ).
15 BLAST2 peut être utilisé d'une manière standardisée et reproductible pour insérer des gaps dans l'une des séquences afin d'optimiser l'alignement et de parvenir à une comparaison plus significative. La protéine TbKHC1 peut être obtenue de différentes façons. Elle peut tout 20 d'abord être isolée sous forme de fraction éluée ou purifiée à partir d'une culture de trypanosomes. Pour cela, les parasites purifiés sont préférentiellement incubés dans un milieu de sécrétion (par exemple de type Ringer Lactate + glucose), puis les produits de sécrétion sont récupérés par centrifugation, filtrés pour stériliser, puis passés sur une colonne d'affinité comprenant un anticorps anti-TbKHC1. Après lavage, les molécules 25 retenues sur la colonne sont éluées, permettant d'obtenir un extrait ou une fraction comprenant la protéine TbKHC1 et/ou ses fragments. Une telle fraction peut en outre comprendre des protéines ou peptides de nature différente provenant de trypanosome. En particulier, la protéine TbKHC1 ayant pour propriété de lier et/ou transporter d'autres molécules du trypanosome, notamment grâce à sa structure coil-coil qui 30 favorise son interaction avec d'autres molécules, la fraction éluée peut comprendre la protéine TbKHC1, ou les peptides de celle-ci, en complexe ou association avec d'autres protéines ou peptides ou molécules de trypanosome. La protéine TbKHC1 peut par ailleurs être concentrée et/ou purifiée davantage à partir de cette fraction, pour obtenir une pureté supérieure à 90%, par exemple de 95% ou plus, notamment de 98% ou plus, 35 en particulier une protéine TbKHC1 dépourvue de toute autre protéine de trypanosome. La protéine TbKHC1 peut également être produite par voie recombinante, en exprimant dans une cellule hôte un acide nucléique codant. A cet égard, un autre objet de l'invention réside dans un procédé de production de protéine TbKHC1, comprenant 40 la culture d'une cellule recombinante comprenant un acide nucléique codant TbKHC1 dans des conditions permettant l'expression et, éventuellement la sécrétion de la protéine TbKHC1 puis, la récupération et, éventuellement, la purification de la protéine 3036287 10 TbKHC1. La cellule utilisée peut être procaryote (par exemple une bactérie telle que E. coli) ou eucaryote (par exemple une levure, une cellule de mammifère ou d'insecte). L'acide nucléique codant TbKHC1 peut être de l'ADN ou de l'ARN, et sa séquence peut être déterminée par l'homme du métier en fonction de la séquence protéique à 5 coder. A titre illustratif d'une séquence codant la protéine de SEQ ID NO : 2, on peut mentionner la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1, qui est représentée ci-dessous : AT GTCGGAT G TCGGTTGTAA 10 GCTGGGGATA CCACGGAACA GATATT GTT G ACACAAAGT G TTTTGCTCAG 15 AATACCACTC ATTCAATCAG GACAACCTTG GAACAAGGGG TTTATGCGCT 20 CCGGAGTCCA GACCCAGAGG CGTTTTAGTA ATCAACGCCT CACATTCCTT 25 AGCCGTACCT AATTCACTGC CAT GT GGATT AGAATCAATT GAGCGTTACA 30 CTGAAGAGAA GAGGTGGAAA TCAAAGGAGA GAGATGAAAT CGT GAGGGAA 35 ATATTGGCCA GAGCAAGT GA CTGGACGTTG CGTGCTAAGG CGGTTGGAGG 40 AACAGTGGCA ACTCAGATGG GATGAAGCGA TTAACCGCAA CGAGGTCCTT 45 CAAAAGGAT G AAGCAGCTTA GTTGAGGCTG CCCCCAATCA AGGGAGCCAC GAT GT GTTAT GAAGAGTTTC CAGGTGGAAG AT GTCAATTT CGCGATGGAG CAAATGAAGG TGCATTCGTC CCGAT GT GAA AACCAGAT GA CCGGTGTGCC AGACTGATTT TGAAGGATCA ATATATTT GA CGTTGATGTG CTGGCCAAGA ACAATGCGCG GT GACTT GAT GCGTAGAACT TTTACCGCAT GCCGCGGCCA CAGGTAAACT AAACTGGTAT CTCTTCTTTC GGCGTGATTC CTATTATTTT AGTTTGGTTT ACCAGAAGCT TACTCGAAGT ACGATCGCCG CTGGTGCATC ACCTCCAGGA TCGTCCACCT TGGCGCAAGA CAAAT GAT GA GCCGAGCGAA AGGAGCTCGG GCCAGGTGGA GT GT GGAATT AGATAAACCG TTTCATTGAA TGGATGTTTC AGGCGCACAA CCGCTATTCC CCCCGTTT GA GCACGCCATC CGGAGCAACT TT GAGACGCA AACTTGGTTT CGGAGGATAC TGGAAACAAT ACCGACGCGT ATCCTCAGAA TGCGTTTAGT AGGATGGCGC AGGAGACCAT TGAAGAACCA AGAGGGAACG AGGACGGCGG AAAGAATATA TAAGAACGGT ACGCTTTTAC AGCGGTGGCC CTACGGACAG AGGCATCATT GAGTTATGAA GAGTGCAACT TACCGGTTGC CGGCAATGAC TACAGCTTTA GAAGGGAAAG TACACATGAC ACTTGGTCAC GAAGCTGACG GACTGTTGGG GCGAGCAAT G GGCCCAGAAG GCAGATCGCT GGAAGACATT GGAAGAGCAG GCAGCAAGAC TATTCGCGAG TCTTATCATT TCTCGTCAGA CGACACGGT G TGGAGTGCCT GGAGATGCGG GCTTGCGGAA ACTCCGCGAC TGACACTGAT TGAGATGGAA CCGGGAGCTG ACTCACAGCC CGCCGCGCGC CCCAAACAAC GGAATTCAGC ACTTGCTTCG CCCCGGCTCT CGATATGGAT TGAACGGCAG CATTT GT GAG CGCCCCTCCT TCGGGAGTCC GGAGGTGGAG ACTCGAGAAG GATGCTGCGT GCGGCCGGCG AGCAGAGGT G GCACGGTGTC GGGTTCCAAC AAGTTT GAT G GTCCCTTGCA ACGGGTACAG CCACGGTCCG GT GACAGGAC GGAAGGGACC AGCTCCCATG CGTCGGGTT G GTTCTCCGCA ATTACATTCA AACCCCATTA GTTGTGTCGT CGGATCCTGC CCAAGTAGT G GAT GT GAAGG CTGCAATCAC TCTCGTGACG GACAGACGTT ATGCTGAACC GAGGAGTTCC CAGGAGCATC GCGGAGTTCC GTTTTGAAGC AGACTCCACG ATAGAGGAGG AACCGGCTGG GT GGATCGTC GAAAACACAC GATTTGACGG ACTCTTCGTG GCGCGGGAGG CGGCTTCGAT AACCTGTGTT ACTCAAAAT G AT GCGT GAGA CAT GGT GTT G GCACCAGT GA GTGCTGCTCC GAGCACTTGC TTGCAGCAGC CCTGTTGACG GAACGCAAGT GCCCTGTTGG GCGTCGAAGG TGTGGCATCA ATTCAGTGGC AGTCTACTGG TTGTTTATTG TAGTGACAGT GTGCTTTTGG TAACACACGC GTAAGTCTTT CCAAACTTAT AGTTTGTTCA GAGTGGATAT TTCTTCTGAG TAACTGCGAC TCGTATCAGA TCGACTTAGC T GAAGGAT GA GTTTGTCGTC AGGACTCTAT ATCACCTCCA TGACGGCCAA TCTT GGAT GA CAGAAAGACA TT GAGATT GA TGCGTGAAGT AATACAGGGA AGGAAGCGAA AAAAGAAGCT AACTGTCCGA AACATATT GA CGACGTTTCC AGGCGGATGT TTTCGCAGCT AATATCGCGC AATTCCTTTC TCACCATGCA TGGAGCAGTT GTCCGCCGTG CGACGCAGCG AAAACTTGCA GGAAGTCGCT AGGTTCCGGG CGTCATCGGA GT GTAAAAGA TCAATGCTGC AGATGGTGAC CCATTGCAAT TGGCAGCTCA AGAAGAAGGA CGCAGTATGC CACCGTGTTG CGTTCCCGAG CGGGACAGCT CAGGTTGAGG AAGCGGGAAT CGACGAAT GT ATTTAAAGGT CACTAT GT GT TTTCGACAAA GATTTACCGT TCACTTCGAC TGCCCAAGAG TGCTATGAAT GAGCCCCAGC AGGATACGAG GGCGAAGTGC AGGTAGCCGG TGGCGGAAGG CGAAACCACA ACAGTCGGTT AAGGGACGAG CGAGTTAAT G GATGGCTGAA ATACAAGGCT GGAAGTGTAT GCGACGGGCA CGACAACGCG AAAGGACGCC GGTGCTCAGG CGAAACCTTT GCAACGCCAT CTGCTCTGAG CGCATTGGAA TGAGAAGCGC GGCCGACCTT GAAGTTTGAA CGCAACTGCA TAAACCACCT AAGGACCGT G TCAGGACCGC GCCGTACGTA AACAGATGCA GGAGGAAATC GAGGTCGAAT TGCGCAAATC GGATGAGTAT ATT GGCT GAG TGCGGAACTA AGCGAAGCTC TGAGCTTCCA 3036287 11 GACTCGTATA CAAGATGAAC AT GCT GAAAT GAGCGCTGTG ACGAGTTGAT TGTTAGCCAG CACTTAAT GA AACTGGTGGA AATCCCAGAG ATTGCAAGAT TCCTCCGCCG CGAGCGCGAA GCTTCGTTCG GGAGCGCGAG AAAGAAACAA GGAGCAAATT TAAGATGGCC CCTGCGCTCC GAGGAGGAAC GAGGAGGAAG AGGCAATCCA TTGGTTACGG CTTGAGGAAA AT GGAAAAAG AACT GA TGAATGAGCA AAAAGCAT CG GCGT CATT CG CAGCCCACTT CGCTACGACG AAGCAGGTAG ACTAAT GT GC CATGCAGAAT AACTGTTCAA GT CGCGATT G TGCAACACAA CCCGGGTGTG 5 GCAACGGAAA GAATTGTTGG TTAAAGCGTT La séquence nucléique peut en outre être optimisée pour l'expression dans la 10 cellule hôte choisie. Un autre objet de l'invention réside dans un vecteur d'expression comprenant un acide nucléique codant la protéine TbKHC1, de préférence sous contrôle d'un promoteur. Un autre objet de l'invention réside dans une cellule hôte contenant un tel vecteur, ou contenant un acide nucléique codant la protéine TbKHC1 inséré dans son génome.
15 La protéine TbKHC1 peut également être obtenue par synthèse artificielle, en utilisant des synthétiseurs de protéines. Elle peut aussi être produite par une combinaison de ces méthodes.
20 Au sens de l'invention, le terme «peptide antigénique » ou «fragment antigénique » désigne un peptide dont la séquence ou une partie de la séquence correspond à une partie de la séquence de la protéine TbKHC1, et qui est capable d'induire une réponse immunitaire contre la protéine TbKHC1. Un peptide antigénique comporte donc généralement au moins un épitope spécifique de la protéine TbKHC1, 25 permettant d'induire une réponse immune dirigée spécifiquement contre TbKHC1. Un peptide désigne au sens de l'invention une molécule ayant de 4 à 500 acides aminés, par exemple de 4 à 450 acides aminés, par exemple de 4 à 300 acides aminés, ou moins, comme par exemple de 4 à 50, 40, ou 30, ou moins encore. Des exemples de peptides antigéniques au sens de l'invention sont les peptides comprenant au moins les résidus 30 1000-1111, 900-1111, 800-1111, 700-1111, 687-1111, ou 500-1111, de la séquence SEQ ID NO :2 ou de variants naturels de celle-ci. Un peptide antigénique particulier est notamment un peptide comprenant les résidus 687-111 de SEQ ID NO : 2. La protéine ou les peptides antigéniques selon l'invention peuvent comporter des 35 modifications, notamment chimiques, n'altérant pas leur spécificité immunologique. Ainsi notamment, ils peuvent être modifiés chimiquement pour améliorer leur stabilité, leur tropisme, leur solubilité, ou leur immunogénicité. Des exemples de modification sont par exemple l'addition de phosphates, sucres ou acides myristiques, de polyéthylène glycol. Dans le cas plus particulier des peptides, ils peuvent comprendre, 40 outre la séquence immunogène, un ou plusieurs résidus favorisant l'expression, la stabilité, ou l'immunogénicité. Les peptides peuvent aussi être couplés à des molécules porteuses, ou à d'autres épitopes, afin d'augmenter leur potentiel immunologique, ou complexés ou associés à d'autres protéines pour augmenter leur immunogénicité. Des 3036287 12 peptides particuliers de l'invention sont des peptides consistant en une séquence immunogène de la protéine TbKHC1. Inhibiteur de TbKHC1 5 L'invention concerne également tout inhibiteur de TbKHC1 et son utilisation pour le traitement d'infections à trypanosome. Le terme « inhibiteur de TbKHC1 » désigne tout composé capable de réduire la quantité (par exemple la production ou la sécrétion) ou l'activité de la protéine TbKHC1. Il s'agit typiquement d'un inhibiteur 10 spécifique, c'est-à-dire capable d'agir sur TbKHC1 sans effet direct sur d'autres protéines produites par le trypanosome ou par le mammifère infecté. Le composé inhibiteur peut être un ligand de la protéine TbKHC1, comme par exemple un anticorps ou un fragment ou dérivé d'anticorps, un acide nucléique codant un anticorps ou fragment ou dérivé d'anticorps, un acide nucléique inhibiteur (antisens, siARN, 15 ribozyme, etc.) inhibant la synthèse de la protéine, un peptide inhibant l'activité de TbKHC1, ou une molécule se liant spécifiquement aux molécules cibles reconnues par TbKHC1 au niveau de l'hôte, en particulier des récepteurs transmettant le signal normalement induit par la protéine TbKHC I ou ses composantes, ou une combinaison de ceux-ci.
20 Dans un mode particulier, l'inhibiteur est un composé capable de lier spécifiquement la protéine TbKHC1 et de la neutraliser. Un exemple de tel composé est un anticorps, ou un fragment ou dérivé d'anticorps ou un inhibiteur véhiculé par cet anticorps. La liaison spécifique désigne le fait que l'inhibiteur spécifique lie la protéine 25 TbKHC1 et ne lie pas spécifiquement d'autres protéines, ou avec une affinité bien inférieure (d'un facteur 10 ou plus). De manière particulièrement préférée, l'inhibiteur est un anticorps liant TbKHC1 et ne liant pas de protéines endogènes du mammifère infecté.
30 L'anticorps peut être un polyclonal, ou un monoclonal, ou un fragment ou dérivé d'anticorps tel que les fragments Fab, Fab'2, les CDRs, les anticorps simple-chaîne (par exemple les ScFv), les nanobodies, les anticorps humains ou humanisés, etc. Les anticorps peuvent être produits par des techniques bien connues de l'homme du métier, comme par exemple l'immunisation d'un animal non-humain, et la récupération du 35 sérum ou des cellules productrices d'anticorps. La production de monoclonaux peut être obtenue par obtention d'hybridomes selon des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemples, des anticorps selon la présente invention peuvent être générés en injectant la protéine TbKHC1 ou un peptide immunogène de l'invention à des animaux (par exemple un lapin ou une souris), puis en récoltant les 40 sérums ou les cellules B. La sélectivité des anticorps peut ensuite être testée et confirmée par des tests classiques de type ELISA. Des techniques de production d'anticorps poly- ou monoclonaux, de fragments ScFv, d'anticorps humains ou 3036287 13 humanisés sont décrites par exemple dans Harlow et al., Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988 ; Ward et al., Nature 341 (1989) 544 ; Bird et al., Science 242 (1988) 423 ; W094/02602 ; US5,223,409 ; US5,877,293 ; W093/01288.
5 Un objet particulier de l'invention réside dans un anticorps liant spécifiquement la protéine TbKHC1. Plus préférentiellement, l'invention réside dans un anticorps liant un épitope contenu dans la région C-terminale de la protéine TbKHC1, par exemple un épitope contenu dans les résidus 687-1111 de la protéine TbKHC1. L'anticorps de l'invention est préférentiellement un anticorps monoclonal.
10 Un autre objet de l'invention réside dans un anticorps anti-TbKHC1 susceptible d'être obtenu par immunisation d'un mammifère non-humain avec une composition immunogène comprenant un peptide comprenant un épitope compris entre les résidus 687 et 1111 de la protéine TbKHC1 (bornes incluses).
15 Un autre objet de l'invention réside dans un fragment Fab ou Fab'2 d'un anticorps tel que défini ci-dessus. Un autre objet de l'invention réside dans un anticorps simple-chaîne anti- 20 TbKHC1. Il peut s'agir de nanobodies, ScFv, anticorps Tandem, etc. Un autre inhibiteur et objet de l'invention est un acide nucléique inhibiteur de TbKHC1, notamment un antisens, un ribozyme ou un ARN interférant spécifique de TbKHC1. De tels acides nucléiques comprennent une partie (généralement de 5 à 50 25 bases consécutives) de la séquence codante de TbKHC1 ou de son brin complémentaire, par exemple une partie de la séquence SEQ ID NO : 1 ou de son brin complémentaire, et permettent d'inhiber spécifiquement l'expression (transcription ou traduction) de la protéine.
30 Un autre inhibiteur et objet particulier de l'invention est une molécule inhibant l'effet de TbKHC1 au niveau de l'hôte mammifère. Il s'agit en particulier de toute molécule se liant spécifiquement aux molécules-cibles reconnues par TbKHC1 au niveau de l'hôte, en particulier des récepteurs de l'hôte transmettant le signal normalement induit par la protéine TbKHC1 ou ses composantes. On peut citer à titre 35 d'exemple des sucres, des peptides ou d'autres molécules (small drugs) bloquant la fixation de TbKHC1 sur des récepteurs cellulaires ou humoraux de l'hôte.
3036287 14 Compositions vétérinaires et pharmaceutiques L'invention concerne toute composition pharmaceutique ou vétérinaire 5 comprenant (i) la protéine TbKHC1, un ou des peptides antigéniques de celle-ci, ou un inhibiteur de la protéine TbKHC1, et (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire. De telles compositions permettent de bloquer l'action de la protéine TbKHC1 et ainsi d'empêcher une infection par trypanosome ou de la contrôler.
10 Selon un premier mode de réalisation, les compositions de l'invention sont de type vaccin et permettent d'induire une immunité anti-parasitaire très puissante chez les mammifères. Ainsi, un objet particulier de l'invention concerne des compositions comprenant (i) la protéine TbKHC1, ou un ou des peptides antigéniques de celle-ci, (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire, et (iii) 15 optionnellement un adjuvant. De telles compositions permettent de vacciner ou immuniser des mammifères contre la protéine TbKHC1, et ainsi de protéger le mammifère contre une infection à trypanosome ou de traiter une telle infection. Les vaccins peuvent comprendre plusieurs peptides antigéniques, de façon à augmenter le pouvoir immunogène du vaccin. Ainsi, ils peuvent comprendre plusieurs 20 peptides, chevauchants ou non, comprenant de 5 à 100 acides aminés chacun et comprenant chacun une séquence d'acides aminés identique à un domaine de la protéine TbKHC1 compris de préférence entre les résidus 687 et 1111. Dans un mode particulier, le vaccin comprend un seul peptide antigénique.
25 Dans un autre mode particulier, il comprend 2, 3 4, ou 5 peptides antigéniques distincts de TbKHC1. A cet égard, un vaccin particulier de l'invention comprend des peptides antigéniques de protéines TbKHC1 provenant de souches différentes de trypanosomes, permettant d'augmenter le potentiel du vaccin. Le vaccin peut ainsi 30 comprendre un ou plusieurs peptides antigéniques d'une protéine TbKHC1 d'une ou plusieurs espèces de trypanosomes. Dans un autre mode particulier, le vaccin comprend une protéine TbKHC1 entière.
35 Dans un autre mode particulier, le vaccin comprend un acide nucléique codant ladite protéine TbKHC1 ou le(s) peptide(s) antigénique(s). Les compositions vaccinales vétérinaires de l'invention comprennent avantageusement une quantité immunologiquement efficace de la protéine TbKHC1 ou 40 de peptides antigéniques issus de celle-ci, tels que précédemment décrits, ou d'un acide 3036287 15 nucléique ou vecteur d'expression codant ou surexprimant la protéine TbKHC1 ou le(s) peptide(s) antigénique(s) de celle-ci. Les vaccins selon la présente invention peuvent comprendre un ou plusieurs 5 adjuvants afin d'augmenter leur efficacité. Les adjuvants sont bien connus dans l'état de la technique. A titres d'exemples, on peut citer notamment les sels d'aluminium, tels que l'hydroxyde d'aluminium, les sels de métaux, les immunogènes bactériens tels le LPS, la CT ou la LT les adjuvants des classes TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, ou TLR9, les saponines et leurs dérivés, les émulsions huile dans eau ou eau dans huile, les 10 polysaccharides, les liposomes cationiques, les virosomes ou les poly-électrolytes. D'autres immunomodulateurs peuvent être utilisés, tels que les protéines de salive de mouche, les cytokines ou les protéines de choc thermique. Les vaccins selon la présente invention peuvent être des vaccins monovalents 15 (c'est-à-dire induisant une réponse contre un seul type de pathogène) ou multivalents (c'est-à-dire capable d'induire une réponse protectrice contre plusieurs types de pathogènes distincts). Dans un mode particulier, l'invention vise ainsi un vaccin multivalent comprenant (i) la protéine TbKHC1, ou un ou des fragments antigéniques de celle-ci, (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire, (iii) 20 optionnellement un adjuvant et (iv) au moins un antigène d'un autre parasite. Selon un autre mode de réalisation, les compositions de l'invention comprennent un inhibiteur de la protéine TbKHC1 et permettent de traiter de manière puissante et rapide une infection à trypanosome chez les mammifères. Ainsi, un objet particulier 25 concerne une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant (i) un inhibiteur de la protéine TbKHC1 et (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire. De telles compositions permettent de bloquer l'action de la protéine TbKHC1 et ainsi d'empêcher une infection par trypanosome ou de la contrôler. Dans un mode préféré, l'inhibiteur est un anticorps anti-TbKHC1.
30 Dans les compositions de l'invention, tout type d'excipient acceptable peut être utilisé. A cet égard, on peut citer des solutions isotoniques, tampons phosphates ou autres solution salines et milieux de culture (par exemple eau physiologique, PBS, Ringer lactate, milieu 199, milieu Ham) et des excipients stabilisateurs et conservateurs 35 (tels que acides, sucres, phénoxy-éthanol, milieu 199, albumine, acides aminés et dérivés, par exemple). Par ailleurs, les compositions de l'invention peuvent être sous forme liquide, ou solide (poudre). Elles peuvent être conditionnées dans tout conteneur adapté (ampoule, seringue, fiole, flacons, etc.).
40 Comme indiqué, les compositions comprennent avantageusement une quantité efficace de protéine TbKHC1 ou de peptide antigénique. Cette quantité peut être aisément adaptée par l'homme du métier. D'une manière générale, une quantité efficace 3036287 16 de protéine TbKHC1 ou de peptide désigne une quantité permettant d'induire une réponse anticorps anti-TbKHC1 chez le mammifère traité. Une telle quantité est généralement comprise entre 0,11.1g et lmg/dose, par exemple entre liag et 5001.1g/dose, notamment entre 101.1g et 100 µg/dose.
5 Dans le cas d'un inhibiteur de TbKHC1, la quantité efficace désigne une quantité permettant d'inhiber par au moins 10%, de préférence au moins 20%, 30%, 40%, 50% ou plus la production ou l'activité de TbKHC1 in vitro ou in vivo, chez le mammifère traité. Une telle quantité est généralement comprise entre 0,11.1g et lmg 10 d'inhibiteur/dose, de préférence entre liag et 5001.1g/dose. Les compositions de l'invention peuvent être utilisées seules, ou en combinaison avec d'autres traitements, comme par exemple des trypanocides tels que notamment Pentamidine, Eflornithine, Nifurtimox, fNECT, Suramine, Melarsoprol, Fexinidazole, 15 Oxaborole Diminazène, Isometamidium, Homidium. L'invention peut être utilisée pour traiter tout mammifère susceptible d'être infecté par un trypanosome, tel que par exemple les bovidés, les ovidés, les félidés, les camélidés, les canidés, ou les humains. Les compositions selon la présente invention 20 sont particulièrement utiles pour traiter les pathologies induites par les trypanosomes comme notamment l'anémie, l'amaigrissement, et/ou une immunosuppression. Production d'agents anti-trypanosomes 25 La présente invention concerne également une méthode d'identification, de production ou d'optimisation de composés anti-trypanosomes, comprenant une étape d'évaluation de la capacité d'un composé test à inhiber l'activité ou la production (ou sécrétion) de la protéine TbKHC1. Les composés doués d'une telle activité possèdent une action importante anti-trypanosome.
30 L'invention concerne également tout composé identifié, produit ou optimisé selon la méthode précédente, pour son utilisation pour le traitement d'une infection à trypanosome.
35 Diagnostic d'une infection à trypanosomes La protéine TbKHC1 constitue en outre une cible d'intérêt pour la détection, chez un mammifère, de la présence de trypanosome. Cette protéine étant sécrétée, elle peut être détectée, ou tout anticorps contre celle-ci (recherche d'antigène et/ou 40 d'anticorps) ou tout acide nucléique codant TbKHC1, dans tout fluide du mammifère, en particulier dans le sang. Par ailleurs, la protéine comme les anticorps peuvent 3036287 17 permettre non seulement de détecter la présence du parasite, mais également de suivre l'évolution d'une infection et/ou l'efficacité d'un traitement. Ainsi, un objet de l'invention réside également dans une méthode de diagnostic 5 in vitro de trypanosomose ou de la présence de trypanosome chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure, dans un échantillon dudit mammifère, de la présence de la protéine TbKHC1 ou d'un acide nucléique codant la protéine TbKHC1 ou d'anticorps dirigés contre TbKHC1.
10 Un objet de l'invention réside également dans une méthode pour suivre l'évolution d'une infection à trypanosome chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure de la quantité de protéine TbKHC1 ou d'un acide nucléique codant la protéine TbKHC1 ou d'anticorps dirigés contre TbKHC1 dans des échantillons du mammifère prélevés à différents intervalles de temps.
15 L'invention concerne aussi une méthode pour déterminer l'efficacité d'un traitement contre le trypanosome chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure de la quantité de protéine TbKHC1 ou d'un acide nucléique codant la protéine TbKHC1 ou d'anticorps dirigés contre TbKHC1 dans des échantillons du mammifère prélevés à différents intervalles de temps au cours du traitement.
20 La détermination de la présence ou de la quantité (relative) de protéine TbKHC1 ou d'anticorps peut être réalisée par toute technique connue en soi, comme notamment au moyen d'un ligand spécifique, par exemple un anticorps ou un fragment ou dérivé d'anticorps, ou la protéine ou un de ses fragment ou un épitope ou un mimotope. De préférence, le ligand est un anticorps spécifique du polypeptide, ou un fragment d'un tel 25 anticorps (par exemple un Fab, Fab', CDR, etc.), ou un dérivé d'un tel anticorps (par exemple un anticorps simple-chaîne, ScFv), ou la protéine ou un de ses fragment ou un épitope ou un mimotope. Le ligand est typiquement immobilisé sur un support, tel qu'une lame, bille, colonne, plaque, etc. La présence ou la quantité de protéine d'intérêt ou de ses fragments ou d'anticorps dans l'échantillon peut être détectée par la mise en 30 évidence d'un complexe entre la cible et le ligand, par exemple en utilisant un ligand marqué, en utilisant un deuxième ligand de révélation marqué, etc. Des techniques immunologiques utilisables et bien connues sont les techniques ELISA, RIA, etc. Si nécessaire, la quantité de polypeptide détectée peut être comparée à une valeur de référence, par exemple une valeur médiane ou moyenne observée chez des patients 35 humains ou des mammifères non-humains qui ne sont pas infectés, ou à une valeur mesurée en parallèle dans un échantillon témoin. Toutes les techniques immunologiques basées sur les réactions antigènes-anticorps peuvent être utilisées, utilisant soit la protéine TbKHC1 ou ses fragments ou des composés dérivés naturels ou synthétiques ou un épitope, un mimotope comme 40 antigène, ou des molécules reconnaissant spécifiquement la protéine TbKHC1 ou ses 3036287 18 fragments ou des composés dérivés naturels ou synthétiques (par exemple, anticorps, fragments Fab, Fab', CDR, ou des dérivés d'un anticorps ou un nanobody). Les techniques immunologiques de base, par exemple, agglutination, précipitation, technique immunoenzymatique, immunoempreinte, western blot sont adaptées.
5 Dans une autre variante, l'invention détecte la présence d'acide nucléique codant TbKHC1. Cette détection peut être effectuée par des techniques connues en soi de l'homme du métier, comme notamment par Northern Blot, hybridation sélective, utilisation de supports revêtus d'oligonucléotides sondes, amplification sélective d'acide nucléique comme par exemple par RT-PCR, PCR quantitative ou ligation-PCR, etc. Ces 10 méthodes peuvent comprendre l'utilisation d'une sonde nucléique (par exemple un oligonucléotide) capable de détecter sélectivement ou spécifiquement l'acide nucléique cible dans l'échantillon. L'amplification peut être réalisée selon différentes méthodes connues en soi de l'homme du métier, telles que la PCR, la LCR, l'amplification médiée par transcription (TMA), l'amplification par déplacement de brin (SDA), NASBA, 15 l'emploi d'oligonucléotides spécifiques d'allèles (ASO), l'amplification spécifique d'allèle, le Southern blot, l'analyse conformationnelle SSCA, l'hybridation in situ (e.g., FISH), la migration sur gel, l'analyse d'hétéroduplexes, etc. Selon un mode préféré de mise en oeuvre, la méthode comprend la détection de la présence ou de l'absence (ou de la quantité (relative)) d'un acide nucléique codant 20 TbKHC1 par hybridation sélective ou amplification sélective. L'hybridation sélective est typiquement réalisée en utilisant des sondes nucléiques, de préférence immobilisées sur un support, tel qu'un support solide ou semi-solide présentant au moins une surface, plane ou non, permettant l'immobilisation de sondes nucléiques. De tels supports sont par exemple une lame, bille, membrane, filtre, 25 colonne, plaque, etc. Ils peuvent être réalisés en tout matériau compatible, comme notamment du verre, silice, plastique, fibre, métal, polymère, etc. Les sondes nucléiques peuvent être tout acide nucléique (ADN, ARN, PNA, etc.), de préférence simple-brin, comprenant une séquence spécifique d'un acide nucléique codant TbKHC1. Les sondes comprennent typiquement de 5 à 400 bases, de préférence de 8 à 200, plus 30 préférentiellement moins de 100, et encore plus préférentiellement moins de 75, 60, 50, 40 ou même 30 bases. Les sondes peuvent être des oligonucléotides synthétiques, produits sur la base de la séquence SEQ ID NO : 1 selon des techniques de synthèse classique. De tels oligonucléotides sondes comportent typiquement de 10 à 50 bases, de préférence de 20 à 40, par exemple 25 bases environ. Les sondes peuvent être 35 synthétisées préalablement puis déposées sur le support, ou synthétisées directement in situ, sur le support, selon des méthodes connues en soi de l'homme du métier. Les sondes peuvent également être fabriquées par des techniques génétiques, par exemple par amplification, recombinaison, ligation, etc.
3036287 19 Les sondes ainsi définies constituent un autre objet de la présente demande, ainsi que leurs utilisations (essentiellement in vitro) pour la détection d'une infection par trypnanosome chez un sujet. L'hybridation peut être réalisée dans des conditions classiques, connues de l'homme du 5 métier et ajustables par celui-ci (Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press). En particulier, l'hybridation peut être réalisée dans des conditions de stringence élevée, moyenne ou faible, selon le niveau de sensibilité recherché, la quantité de matériel disponible, etc. Par exemple, des conditions appropriées d'hybridation incluent une température comprise entre 55 et 63°C pendant 2 10 à 18 heures. D'autres conditions d'hybridation, adaptées à des supports de haute densité, sont par exemple une température d'hybridation entre 45 et 55°C. Après l'hybridation, différents lavages peuvent être réalisés pour éliminer les molécules non-hybridées, typiquement dans des tampons SSC comprenant du SDS, tels que un tampon comprenant 0,1 à 10 X SSC et 0,5-0,01% SDS. D'autres tampons de lavage contenant 15 du SSPE, du MES, du NaC1 ou du EDTA peuvent également être utilisés. Un objet particulier de l'invention réside ainsi dans une méthode pour détecter la présence d'un trypanosome chez un mammifère, ou pour évaluer la réponse à un traitement contre le trypanosome, comprenant la mise en contact, dans des conditions permettant une hybridation entre séquences complémentaires, des acides nucléiques 20 issus d'un échantillon du mammifère et d'une sonde nucléique spécifique de TbKHC1, la formation d'un hybride étant indicative de la présence de trypanosome. L'amplification sélective est de préférence réalisée en utilisant une amorce ou une paire d'amorces permettant l'amplification de tout ou partie d'un acide nucléique codant 25 TbKHC1. L'amorce peut être spécifique d'une séquence codante (par exemple SEQ ID NO : 1), ou d'une région flanquant la séquence codante. L'amorce comprend typiquement un acide nucléique simple-brin, d'une longueur comprise avantageusement entre 5 et 50 bases, de préférence entre 5 et 30. Une telle amorce constitue un autre objet de la présente demande, ainsi que son utilisation (essentiellement in vitro) pour la 30 détection de la présence de trypanosome chez un sujet. A cet égard, un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'une amorce nucléotidique ou d'un ensemble d'amorces nucléotidiques permettant l'amplification de tout ou partie d'un du gène TbKHC1 pour détecter la présence de trypanosome chez un mammifère.
35 Un autre objet particulier de l'invention réside dans une méthode pour détecter la présence de trypanosome chez un mammifère, comprenant la mise en contact, dans des conditions permettant une amplification, des acides nucléiques issus d'un échantillon du 3036287 20 mammifère et d'une d'amorce spécifique de TbKHC1, l'existence d'un produit d'amplification étant caractéristique de la présence de trypanosome chez ce mammifère. La méthode de détection est applicable à tout échantillon biologique du 5 mammifère testé, en particulier tout échantillon comportant des acides nucléiques ou des polypeptides. On peut citer avantageusement un échantillon de sang, plasma, plaquette, ganglion, salive, urine, selles, etc., plus généralement tout tissu, organe ou, avantageusement, fluide biologique comportant des acides nucléiques ou des polypeptides ou des anticorps. Dans un mode de mise en oeuvre préféré et 10 particulièrement avantageux, l'échantillon est un échantillon dérivé du sang, par exemple un échantillon de sang, de sérum ou de plasma. L'échantillon peut être obtenu par toute technique connue en soi, par exemple par prélèvement, par des techniques non invasives, à partir de collections ou banques d'échantillons, etc. L'échantillon peut par ailleurs être pré-traité pour faciliter l'accessibilité de la protéine ou de son acide 15 nucléique, par exemple par lyse (mécanique, chimique, enzymatique, etc.), purification, centrifugation, séparation, etc. L'échantillon peut également être marqué, pour faciliter la détermination de la présence des molécules cibles (marquage fluorescent, radioactif, luminescent, chimique, enzymatique, etc.). Les acides nucléiques de l'échantillon peuvent par ailleurs être séparés, traités, enrichis, purifiés, rétro-transcrits, amplifiés, 20 fragmentés, etc. Dans un mode particulier, les acides nucléiques de l'échantillon sont les ou des ARN, notamment les ou des ARNm de l'échantillon. Dans un mode tout particulier, les acides nucléiques sont le produit d'amplification des ARN, notamment des ARNm ; ou les/des ADNc préparés à partir des ARN, notamment des ARNm de l'échantillon.
25 La présence de la protéine (ou d'un acide nucléique codant la protéine) TbKHC1 dans l'échantillon est indicative de la présence de trypanosome chez le mammifère considéré. Kits 30 Un autre objet de l'invention concerne un kit de détection ou mesure de trypanosomes dans un échantillon test, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un ligand spécifique de la protéine TbKHC1, et au moins un réactif pour la détection d'une réaction entre le ligand et la protéine TbKHC1. De manière avantageuse, le ligand est un anticorps anti-TbKHC1 et le réactif permet la détection d'un complexe immun. Le 35 kit peut comprendre un support adapté (par exemple une plaque, colonne, puce, etc.) sur lequel le ligand est immobilisé, permettant une détection aisée de la formation d'un complexe. Le réactif de détection peut être un second ligand (e.g, anticorps) liant la protéine TbKHC1 ou liant le premier ligand. Il peut s'agir de tout autre réactif permettant de révéler la formation d'un complexe (enzyme, colorant, etc.).
3036287 21 Un autre objet de l'invention concerne un kit de détection ou mesure de trypanosomes dans un échantillon test, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un ligand spécifique d'un anticorps anti-TbKHC1, et au moins un réactif pour la détection 5 d'une réaction entre le ligand et l'anticorps. De manière avantageuse, le ligand est une protéine TbKHC1 ou un peptide antigénique de TbKHC1, et le réactif permet la détection d'un complexe immun. Le kit peut comprendre un support adapté (par exemple une plaque, colonne, puce, etc.) sur lequel le ligand est immobilisé, permettant une détection aisée de la formation d'un complexe. Le réactif de détection peut être un 10 second ligand (e.g, anticorps) liant les anticorps. Il peut s'agir de tout autre réactif permettant de révéler la formation d'un complexe (enzyme, colorant, etc.). Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un ligand spécifique de la protéine 15 TbKHC1. De préférence, le ligand est un anticorps ou un fragment ou dérivé d'anticorps anti-TbKHC1. Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel est immobilisée au moins une protéine TbKHC1 ou un peptide antigénique de celle-ci.
20 Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel est immobilisée au moins une sonde nucléique spécifique de TbKHC1. De préférence, la sonde nucléique est une molécule d'ADN simple-brin, de 10 à 200 nucléotides de longueur, ayant une séquence complémentaire du gène codant la protéine TbKHC1.
25 Le support peut être tout support solide ou semi-solide présentant au moins une surface, plane ou non (c'est-à-dire en 2 ou 3 dimensions), permettant l'immobilisation d'acides nucléiques ou de polypeptides. De tels supports sont par exemple une lame, bille, membrane, filtre, colonne, plaque, etc. Ils peuvent être réalisés en tout matériau compatible, comme notamment du verre, silice, plastique, fibre, métal, polymère, 30 polystyrène, téflon, etc. Les réactifs peuvent être immobilisés sur la surface du support par des techniques connues, ou, dans le cas des acides nucléiques, synthétisés directement in situ sur le support. Des techniques d'immobilisation incluent l'adsorption passive (Inouye et al., J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 1469), la liaison covalente. Des techniques sont décrites par exemple dans W090/03382, W099/46403. Les réactifs 35 immobilisés sur le support peuvent être ordonnés selon un schéma préétabli, pour faciliter la détection et l'identification des complexes formés, et selon une densité variable et adaptable. Les produits de l'invention comprennent typiquement des molécules contrôle, permettant d'étalonner et/ou normaliser les résultats.
3036287 22 D'autres aspects et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
5 EXEMPLES Matériels & Méthodes 10 Animaux Souris Swiss femelles 25-30 gr (Charles River, Domaine des Oncins, 69592 L'arbresle cedex) entretenues au laboratoire selon les règlements sur la protection des animaux. Parasites 15 Les souches de parasites suivantes ont été utilisées : Trypanosoma brucei brucei (Antat 1.1 E) Trypanosoma brucei gambiense "Féo" (ITMAP 1893) Trypanosoma brucei gambiense «Biyamina» (MHOM/SD 82), Trypanosoma brucei gambiense EATRO 1125 20 Trypanosoma musculi « Partinico II » Production d'un anticorps anti-TbKHC1 25 Des souris BALB/c ont été immunisées avec une préparation contenant la protéine TbKHC1 pour réaliser des hybridomes par fusion. Les anticorps monoclonaux résultants ont été utilisés pour cribler une banque d'expression de T b. gambiense. Les clones reconnus ont ensuite été utilisés pour la production de recombinants. L'anticorps monoclonal sélectionné, Mab 1, fixe la région C-terminale de la kinésine, région qui est 30 prédite pour être une région enroulée. Préparation d'une fraction enrichie en protéine TbKHC1 Les parasites sont purifiés par chromatographie échangeuse d'ions (DEAE cellulose) à 35 partir du sang de souris infectées, et incubés pendant 2 heures dans un milieu de sécrétion (Ringer Lactate + glucose 50mM) à 37°C. Les produits de sécrétion sont récupérés par centrifugation (1200 g, 10 minutes 4°C). Ce surnageant est filtré sur filtre 0,221.1m, aliquote et conservé à -80°C. La quantité de protéines présentes est mesurée par la technique de Bradford.
3036287 23 L'anticorps monoclonal Mab 1 en solution tamponnée (carbonate 0 ,1M/NaC1 5M, pH 8,3) est greffé sur une colonne de chromatographie (Sephadex CNBr). Après 48 heures à 4°C, et 5 lavages en tampon carbonate, les produits de sécrétion sont déposés sur cette colonne. Après passage et lavages successifs en milieu de sécrétion, les molécules 5 accrochées par l'anticorps sont éluées par additions successives de tampon glycine 1M/HC1 pH3 et de tampon glycine 1M/NaOH, pH11. Le pH de la fraction éluée est ajusté à pH8. Après dialyse en PBS 0,015M, la fraction enrichie est aliquotée dans des tubes conservés à -80°C. La quantité obtenue est mesurée selon la technique de Bradford. Le contenu de la fraction enrichie est analysé par électrophorèse sur gel et par 10 Western blot. Exemple 1 : Inhibition de la croissance des parasites par un anticorps monoclonal dirigé contre la Kinésine 15 In vitro, l'anticorps monoclonal Mabl a été ajouté à des parasites en co-culture avec des cellules nourricières (feeder layers) (concentration en Mabl dans la culture 41.1g/mL). Comparé au contrôle, il inhibe la croissance parasitaire tandis que l'isotype contrôle IgG2b (concentration 41.1g/mL) n'a pas d'effet (Figure 1). In vivo, l'injection de Mabl (200 lag dans 2001.1L de PBS par voie intrapéritonéale) à 20 des souris parasitées depuis 2 jours inhibe le développement de la parasitémie (exprimée en log10 du nombre de parasites par mL de sang), l'isotype contrôle IgG2b (200 lag dans 200 !IL de PBS par voie intrapéritonéale) est sans effet (Figure 2). Exemple 2 : Protection in vivo contre les parasites par vaccination 25 La fraction enrichie en protéine TbKHC1 est injectée (10-20 µg/souris) deux fois, à 30 jours d'intervalle (JO et J30), par voie sous cutanée à la souris, avec ou sans adjuvant (saponine, 251.1g par souris). Les souris contrôles reçoivent le milieu seul avec ou sans adjuvant. Les souris sont infectées 1, 2, ou 3 mois après la dernière injection (voir Figure 3).
30 La parasitémie des souris vaccinées et des contrôles (milieu seul + adjuvant) est évaluée quotidiennement pendant les 25 jours suivant l'infection, puis une fois par semaine ensuite. Les résultats sont présentés sur la figure 4. Les souris contrôles ayant reçu le milieu avec ou sans adjuvant meurent vers le 7-8ème jour post infection. De manière remarquable, 22 souris sur 26 (84,6%) ayant reçu 2 35 injections de protéine TbKHC1 + adjuvant survivent. L'addition de l'adjuvant à la protéine TbKHC1 augmente le taux de survie des souris vaccinées et la durée d'efficacité du vaccin.
3036287 24 Exemple 3 : L'effet protecteur est médié par une réponse humorale Une protection modérée est obtenue chez les souris recevant du sérum immun (150 !IL 5 par voie intrapéritonéale), provenant de souris ayant reçu 2 injections de protéine TbKHC1 espacées de 30 jours, et prélevées 4 jours après la seconde injection. L'injection de cellules (5 x 106 cellules spléniques) de ces même souris immunisées n'a pas d'effet (Figure 5). L'injection de mêmes quantités de sérum ou de cellules provenant d'animaux sains n'a pas d'effet. Ceci souligne l'importance des anticorps 10 dans la protection. Exemple 4 : La vaccination avec TbKHC1 induit une protection croisée Les souris sont immunisées avec la protéine TbKHC1, puis infectées deux mois après 15 soit avec le même trypanosome soit avec un trypanosome d'une autre espèce. Lots Origine de TbKHC1 pour immunisation Nombre d'injections sous cutanées + saponine Infection 2 mois après la dernière injection + adjuvant Etude parasitémie et survie Lot 1 (6 souris) T brucei gambiense 2 T b. gambiense Aucun parasite détecté dans les souris, toutes survivent à 50 jours Lot 2 (6 souris) T brucei gambiense 2 T b. brucei Aucun parasite détecté dans les souris, toutes survivent à 50 jours Ces résultats montrent une protection croisée, la protéine TbKHC1 de T brucei gambiense étant capable d'induire une protection contre une infection par T brucei brucei.
20 3036287 25 Exemple 5 : Diagnostic de patients infectés Présence d'anticorps anti-TbKHC1 dans le sérum des malades atteints de trypanosomose humaine africaine et leur absence dans le sérum des sujets contrôles de la même région endémique.
5 Les résultats sont présentés sur la figure 6. Ils montrent que des anticorps anti-kinésine TbKHC1 ont été détectés chez tous les patients testés atteints de trypanosomose humaine africaine. Ces résultats illustrent ainsi la possibilité de discriminer les patients infectés par mesure d'anticorps dirigés contre TbKHC1. 10
Claims (17)
- REVENDICATIONS1. Composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant (i) la protéine TbKHC1 ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci ; un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide ; ou un inhibiteur de la protéine TbKHC1, et (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire.
- 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend (i) la protéine TbKHC1 ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, ou un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide, (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire, et (iii) optionnellement un adjuvant.
- 3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend la protéine de séquence SEQ ID NO : 2 ou un variant naturel de celle-ci, ou un acide nucléique codant ladite protéine.
- 4. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend un peptide comprenant les résidus 1000 à 1111 de la séquence SEQ ID NO : 2 ou d'un variant naturel de celle-ci, un variant de celui-ci ayant au moins 90% d'identité de séquence, ou une séquence nucléotidique codant ledit peptide.
- 5. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la protéine ou le(s) peptide(s) antigénique(s) ou la séquence nucléotidique sont sous forme pure ou d'extrait, recombinante, ou synthétique.
- 6. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'inhibiteur est un anticorps anti-TbKHC1, ou un fragment ou dérivé d'un tel anticorps.
- 7. Composition selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, pour son utilisation pour vacciner ou immuniser un mammifère contre le trypanosome.
- 8. Composition selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, pour son utilisation pour protéger un mammifère contre une trypanosomose.
- 9. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour son utilisation pour traiter un mammifère ayant une trypanosomose.
- 10. Utilisation de la protéine TbKHC1, d'un ou plusieurs peptides antigéniques de celle- ci, ou d'un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide, pour la préparation d'un vaccin pour immuniser ou protéger un mammifère contre le trypanosome.
- 11. Utilisation d'un inhibiteur de la protéine TbKHC1 pour la préparation d'un médicament pour traiter un mammifère ayant une trypanosomose.
- 12. Anticorps liant spécifiquement la protéine TbKHC1. 3036287 27
- 13. Méthode de diagnostic in vitro de trypanosomose chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure, dans un échantillon dudit mammifère, de la présence de la protéine TbKHC1, d'un fragment de celle-ci, d'une séquence nucléotidique codant TbKHC1, ou d'anticorps dirigés contre TbKHC1. 5
- 14. Méthode pour suivre l'évolution d'une infection à trypanosome chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure de la quantité de protéine TbKHC1, d'un fragment de celle-ci, d'une séquence nucléotidique codant TbKHC1, ou d'anticorps dirigés contre TbKHC1, dans des échantillons du mammifère prélevés à différents intervalles de temps. 10
- 15. Méthode pour déterminer l'efficacité d'un traitement contre le trypanosome chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure de la quantité de protéine TbKHC1, d'un fragment de celle-ci, d'une séquence nucléotidique codant TbKHC1, ou d'anticorps dirigés contre TbKHC1, dans des échantillons du mammifère prélevés à différents intervalles de temps au cours du traitement. 15
- 16. Kit de détection ou mesure de trypanosome dans un échantillon test, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps selon la revendication 12 ou la protéine TbKHC1 ou un peptide de celle-ci, un milieu approprié pour la formation d'un complexe immun, et au moins un réactif pour la détection d'une réaction immunologique. 20
- 17. Kit de détection ou mesure de trypanosome dans un échantillon test, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde nucléique spécifique de TbKHC1, un milieu approprié pour la formation d'une hybridation, et au moins un réactif pour la détection d'une réaction d'hybridation. 25
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