FR2804685A1 - Utilisation d'une proteine de leptospire pour la prevention et/ou le diagnostic et/ou le traitement de la leptospirose animale et/ou humaine - Google Patents
Utilisation d'une proteine de leptospire pour la prevention et/ou le diagnostic et/ou le traitement de la leptospirose animale et/ou humaine Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention concerne l'identification d'une protéine de leptospire, des polypeptides et anticorps, ainsi que leurs utilisations dans les domaines prévention, diagnostique, thérapeutique ou expérimental. La présente invention décrit notamment l'isolement, le clonage et la caractérisation d'une protéine ou de fragments de celle-ci, contenant des épitopes immunogènes à l'encontre de multiples sérovars de leptospires, notamment de leptospires pathogènes. Cette protéine, des polypeptides ou peptides dérivés de celle-ci, et les anticorps correspondants sont particulièrement utiles à la prévention, au dépistage ou à la détection de la présence de leptospires dans des échantillons biologiques ou non, au diagnostic de leptospiroses, ou au traitement de ces pathologies, chez l'homme comme chez l'animal.
Description
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UTILISATION D'UNE PROTEINE DE LEPTOSPIRE POUR LA PREVENTION
ET/OU LE DIAGNOSTIC ET/OU LE TRAITEMENT DE LA LEPTOSPIROSE
ANIMALE ET/OU HUMAINE
La présente invention concerne l'identification d'une protéine de leptospire, des polypeptides et anticorps, ainsi que leurs utilisations dans les domaines diagnostique, thérapeutique, de la prévention ou expérimental. La présente invention décrit notamment l'isolement, le clonage et la caracténsation d'une protéine ou de fragments de celle-ci, contenant des épitopes immunogènes à l'encontre de multiples sérovars de leptospires, notamment de leptospires pathogènes. Cette protéine, des polypeptides ou peptides dérivés de celle-ci, et les anticorps correspondants sont particulièrement utiles au dépistage, ou à la détection de la présence de leptospires dans des échantillons (biologiques ou non), au diagnostic de leptospiroses, à la prévention ou au traitement de ces pathologies, chez l'homme comme chez l'animal.
ET/OU LE DIAGNOSTIC ET/OU LE TRAITEMENT DE LA LEPTOSPIROSE
ANIMALE ET/OU HUMAINE
La présente invention concerne l'identification d'une protéine de leptospire, des polypeptides et anticorps, ainsi que leurs utilisations dans les domaines diagnostique, thérapeutique, de la prévention ou expérimental. La présente invention décrit notamment l'isolement, le clonage et la caracténsation d'une protéine ou de fragments de celle-ci, contenant des épitopes immunogènes à l'encontre de multiples sérovars de leptospires, notamment de leptospires pathogènes. Cette protéine, des polypeptides ou peptides dérivés de celle-ci, et les anticorps correspondants sont particulièrement utiles au dépistage, ou à la détection de la présence de leptospires dans des échantillons (biologiques ou non), au diagnostic de leptospiroses, à la prévention ou au traitement de ces pathologies, chez l'homme comme chez l'animal.
Les leptospires pathogènes sont responsables de maladies infectieuses atteignant l'homme et l'animal. Les leptospiroses font partie des zoonoses surveillées par l'OMS du fait de leur répartition mondiale et de la gravité de la maladie (létale chez 2 à 20 % des malades en fonction de la précocité du diagnostic et du traitement) Chez l'animal, l'impact économique est important par les conséquences cliniques directes de la maladie responsable de troubles de la reproduction chez les animaux d'élevage (ruminants ou porc) ou de signes cliniques graves altérant la santé de l'animal de compagnie qu'est le chien, ou celle de l'animal de sport qu'est le cheval.
L'importance des leptospiroses s'illustre notamment par deux aspects : tout d'abord leur impact en santé publique (hospitalisations, incapacités de travail, parfois décès, mise en oeuvre de vaccinations dans le cadre de la protection contre les maladies professionnelles dans certains pays dont la France), d'autre part, leur impact économique (perte de production pour les animaux d'élevage et coût des vaccins employés dans de nombreux pays
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pour lutter contre cette baisse de production, perte affective de l'animal de compagnie ou/et coût des vaccins disponibles actuellement chez le chien dans la quasi totalité des pays du monde, et encore perte financière du fait de l'altération des performances sportives du cheval)
La lutte contre ces infections est particulièrement difficile, compte tenu de la complexité bactériologique de ces germes et de la diversité des réservoirs que constituent les animaux de la faune sauvage, porteurs, excréteurs et disséminateurs de ces germes par leurs urines La complexité bactériologique de ces bactéries est telle qu'actuellement coexistent deux classifications de ces germes : une classification sérologique et une classification génomique.
La lutte contre ces infections est particulièrement difficile, compte tenu de la complexité bactériologique de ces germes et de la diversité des réservoirs que constituent les animaux de la faune sauvage, porteurs, excréteurs et disséminateurs de ces germes par leurs urines La complexité bactériologique de ces bactéries est telle qu'actuellement coexistent deux classifications de ces germes : une classification sérologique et une classification génomique.
Selon la classification sérologique, toutes les souches pathogènes ont été classées dans une même espèce pathogène Leptospira interrogans par opposition aux souches saprophytes trouvées dans l'eau et classées dans Leptospira biflexa. L'espèce Leptospira interrogans est divisée en plus de 25 sérogroupes différents, chacun de ces sérogroupes étant lui-même composé de plusieurs sérovars présentant entre eux des communautés antigéniques suffisantes pour leur regroupement On dénombre ainsi quelque 220 sérovars différents. Cette classification est faite sur la base des antigènes inducteurs d'anticorps agglutinants, c'est pourquoi elle est encore la seule employée dans le cadre du diagnostic sérologique de l'infection
Selon la classification génomique, basée sur l'étude d'homologies génétiques, l'espèce pathogène Leptospira interrogans a été éclatée en espèces différentes dites genomospecies Leptospira interrogans sensu stricto, Leptospira kirshneri, L. borgpetersenii, L. weilii, L. noguchii, L. santarosai.
Selon la classification génomique, basée sur l'étude d'homologies génétiques, l'espèce pathogène Leptospira interrogans a été éclatée en espèces différentes dites genomospecies Leptospira interrogans sensu stricto, Leptospira kirshneri, L. borgpetersenii, L. weilii, L. noguchii, L. santarosai.
L'expression clinique de la leptospirose est très polymorphe en fonction des souches infectantes mais aussi des espèces
Ainsi, l'homme, sensible à la leptospirose, développe généralement des formes aiguës d'évolution rapide, avec atteinte hépatique, rénale ou
Ainsi, l'homme, sensible à la leptospirose, développe généralement des formes aiguës d'évolution rapide, avec atteinte hépatique, rénale ou
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pulmonaire. La précocité du diagnostic conditionne en général l'efficacité du traitement antibiotique
Chez le chien, espèce animale la plus sensible, une vaccination contre les deux sérogroupes considérés comme dominants dans cette espèce (Icterohaemorrhagiae et Canicola) a été mise en oeuvre. Cependant, le vaccin ne protège que contre ces deux sérogroupes et ne permet pas d'éviter l'infection par une souche sauvage appartenant à un autre sérogroupe. Ceci explique le développement de troubles chroniques, encore mal identifiés par les vétérinaires praticiens jugeant qu'un chien vacciné contre "la" leptospirose ne peut développer une forme chronique liée à une infection par une souche sauvage.
Chez le chien, espèce animale la plus sensible, une vaccination contre les deux sérogroupes considérés comme dominants dans cette espèce (Icterohaemorrhagiae et Canicola) a été mise en oeuvre. Cependant, le vaccin ne protège que contre ces deux sérogroupes et ne permet pas d'éviter l'infection par une souche sauvage appartenant à un autre sérogroupe. Ceci explique le développement de troubles chroniques, encore mal identifiés par les vétérinaires praticiens jugeant qu'un chien vacciné contre "la" leptospirose ne peut développer une forme chronique liée à une infection par une souche sauvage.
Chez le cheval, très exposé du fait de ses conditions d'entretien, de rares formes aiguës mais aussi des formes non caractéristiques telles que des baisses de forme, des contre performances sportives apparaissent Certains avortements de cette espèce sont également liés à l'infection leptospirosique. Enfin, une affection oculaire récidivante est attribuée aux suites de l'infection par les leptospires. Cette affection compromettant l'avenir de l'animal par la cécité qu'elle peut entraîner est d'ailleurs inscrite en France sur la liste des vices rédhibitoires.
Chez les ruminants et le porc, la leptospirose s'exprime essentiellement par des troubles de la reproduction, comprenant soit des avortements, soit de l'infertilité, troubles dont le poids économique peut être estimé suffisamment important pour que certains pays mettent en place des mesures de vaccination et/ou d'éradication.
Compte tenu de l'importance et de la diversité de cas pathologies, toute suspicion de leptospirose, qu'il s'agisse d'un cas clinique individuel ou d'un problème d'élevage, fait généralement l'objet de méthodes de confirmation expérimentale Deux volets du diagnostic (et dépistage) peuvent ainsi être nécessaires, en fonction de la durée d'évolution de la maladie.
Dans les cas aigus, la mise en évidence directe du germe est primordiale.
Dans les cas chroniques, la mise en évidence de façon indirecte par la
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réponse sérologique est généralement suffisante en terme de diagnostic, mais, dans un deuxième temps, la reconnaissance des animaux porteurs de germes et donc excréteurs nécessite la mise en évidence du germe.
Actuellement, la mise en évidence directe de l'agent pathogène du germe peut être effectuée essentiellement par deux méthodes . l'isolement et la PCR.
L'isolement bactériologique est une méthode très lourde. La fragilité naturelle des leptospires fait que seuls les prélèvements traités dans un délai restreint permettent l'éventuel isolement d'une souche de leptospires. Il faut noter que la probabilité d'isoler un leptospire est en général faible, vues les exigences de ces germes et que par ailleurs le délai de réponse peut demander plusieurs semaines compte tenu de la lenteur de développement des cultures.
La PCR s'est donc révélée un outil beaucoup plus intéressant en terme de diagnostic. Cependant, cette méthode n'est actuellement développée que chez l'Homme, pour lequel elle est mise en #uvre à partir d'un prélèvement sanguin prélevé sur le malade en phase aiguë La réalisation de la PCR comme méthode de diagnostic sur des produits d'avortement n'est encore qu'au stade de l'expérimentation. Quant au dépistage des animaux excréteurs de leptospires dans leurs urines, méthode qui serait utile en élevage, elle n'est pas actuellement opérationnelle.
Le diagnostic sérologique du germe, consistant à mettre en évidence des anticorps témoins d'une infection, est généralement effectué par le test de Microagglutination (MAT) qui est actuellement la méthode de référence. Les inconvénients de cette méthode sont liés à l'hétérogénéité bactériologique des leptospires. La méthode requiert l'utilisation de germes vivants (dont la culture est délicate) et par ailleurs, repose sur la mise en évidence d'anticorps agglutinants induits par les antigènes de surface des leptospires, antigènes qui ont servi à leur classification et donc expriment l'hétérogénéité de ces bactéries. Ceci signifie que la mise en #uvre du diagnostic sérologique nécessite que le sérum du malade soit mis en contact avec une souche
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vivante représentative de chacun des sérogroupes différents, multipliant les manipulations pour un même sérum.
La présente invention permet à présent de résoudre les inconvévients des différentes méthodes de dépistage, de diagnostic ou de traitement, décrites dans l'art antérieur La présente invention décrit en effet l'isolement d'une protéine de leptospire, portant des motifs antigéniques communs à de multiples sérovars de leptospires, notamment de leptospires pathogènes La présente invention permet ainsi la réalisation de tests de détection ou de dépistage non restreints à des sérovars particuliers. La présente invention permet en outre la réalisation de tests de détection plus simples que les méthodes MAT décrites dans l'art antérieur, puisqu'elle ne nécessite pas la culture de germes La présente invention permet également la production de polypeptides, peptides et anticorps, utilisables dans des approches vaccinales efficaces et susceptibles d'induire une protection ou une réponse immune contre de multiples sérovars pathogènes de leptospire. La présente invention décrit en outre des acides nucléiques, vecteurs, sondes, amorces ainsi que des cellules recombinantes utilisables pour la production des polypeptides, peptides ou protéines ou pour la détection de leptospires dans tout échantillon test, biologique (par exemple fluides biologiques tels que sang, plasma, urine, tissu, organe, culture cellulaire, etc. ) ou d'autre origine (comme par exemple un échantillon souillé par des matières biologiques, tels qu'une eau de rivière, une eau stagnante, une eau de boisson, une eau provenant d'entreprise telle que des ardoisières, d'autres types de boissons, lait, etc. ).
Un premier aspect de l'invention réside plus particulièrement dans l'isolement et la caractérisation d'une protéine commune aux souches pathogènes de leptospire (ou à certaines d'entre elles) et très immunogène quelle que soit l'espèce infectée considérée. Il s'agit plus particulièrement d'une protéine de 32 kD environ, désignée PPL, isolée à partir de
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préparations d'une souche Autumnalis, dont la structure comprend la séquence interne TFLPYGSVINYYGYVK (SEQ ID NO : 1).
L'étude de cette séquence dans les bases de données (Genbank et Swiss Prot) montre que cette séquence a une identité partielle avec "haemolysis associated protein 1" décrite par KIM ML Korea University de Séoul pour le sérovar laï du groupe Icterohaemorrhagiae. Aucune autre homologie significative n'a été mise en évidence.
Un premier objet de l'invention réside dans un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID NO :1.
Le terme polypeptide désigne toute molécule dont la structure primaire est composée principalement d'un enchaînement d'acides aminés. Un polypeptide selon l'invention peut comprendre jusqu'à 1000 acides aminés par exemple. Le terme protéine, désigne au sens strict un sous-groupe de polypeptides, comprenant des molécules d'origine essentiellement naturelle.
Le terme peptide désigne plus particulièrement des polypeptides de petite taille, typiquement de 30 acides aminés ou moins
Plus particulièrement, le polypeptide selon l'invention est une protéine de leptospire, notamment une protéine membranaire de leptospire, plus préférentiellement d'une souche pathogène de leptospire. Le polypeptide ou protéine de l'invention possède avantageusement un poids moléculaire moyen compris entre environ 30 kDa et environ 35 kDa, déterminé par électrophorèse sur gel.
Plus particulièrement, le polypeptide selon l'invention est une protéine de leptospire, notamment une protéine membranaire de leptospire, plus préférentiellement d'une souche pathogène de leptospire. Le polypeptide ou protéine de l'invention possède avantageusement un poids moléculaire moyen compris entre environ 30 kDa et environ 35 kDa, déterminé par électrophorèse sur gel.
Un objet plus particulier de l'invention est constitué par la protéine PPL ayant un poids moléculaire de 32kD environ et comprenant la séquence SEQ ID NO : 1.
Il s'agit plus particulièrement d'un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID N07 (représentée sur la figure 4).
Un autre objet de la présente invention réside dans un polypeptide ou peptide comprenant la séquence d'une protéine d'un leptospire pathogène, notamment d'une protéine membranaire d'un leptospire pathogène, ou d'une région d'une telle protéine, et portant un ou plusieurs épitopes immunogènes
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à l'encontre de plusieurs souches pathogènes de leptospire La présente invention réside en effet dans la mise en évidence de polypeptides capables d'induire une protection immune efficace contre plusieurs sérovars pathogènes de leptospire. De tels polypeptides, ou des peptides immunogènes dérivés de ceux-ci (seuls ou inclus dans des molécules plus grandes ou liées à des carriers, etc. ) constituent des modes de réalisation avantageux de la présente invention.
Le terme épitope est bien connu de l'homme du métier et désigne une séquence d'acides aminés contigus ou spatialement proches, composée généralement de 3 à 15 acides aminés, reconnue soit par des anticorps, soit par des récepteurs aux antigènes des lymphocytes T en association avec des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe 1 ou Il De tels épitopes peuvent donc induire la stimulation d'une réponse immune cellulaire ou humorale.
A cet égard, un objet particulier de l'invention réside dans un fragment immunogène d'une protéine ou d'un polypeptide tels que décrits ci-avant. Les fragments selon l'invention comprennent avantageusement de 3 à 50 acides aminés, plus préférentiellement de 3 à 25 acides aminés. L'invention concerne également des dérivés de fragments, polypeptides ou protéines tels que décrits ci-avant, comportant par exemple des variations de séquence, par exemple une ou plusieurs mutation, substitution, délétion et/ou insertion de 1 ou plusieurs résidus. Préférentiellement, moins de 10% environ des résidus sont modifiés dans les variants de l'invention, encore plus préférentiellement moins de 5 % des résidus
Le caractère immunogène des polypeptides ou peptides de l'invention peut être vérifié de différentes manières connues de l'homme du métier Ainsi, les polypeptides peuvent être mis en contact avec des anticorps (ou sérum de sujets infectés), la mise en évidence de complexes antigènes-anticorps indiquant la capacité des polypeptides de l'invention de porter des épitopes ou des fragments immunogènes.
Le caractère immunogène des polypeptides ou peptides de l'invention peut être vérifié de différentes manières connues de l'homme du métier Ainsi, les polypeptides peuvent être mis en contact avec des anticorps (ou sérum de sujets infectés), la mise en évidence de complexes antigènes-anticorps indiquant la capacité des polypeptides de l'invention de porter des épitopes ou des fragments immunogènes.
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Les polypeptides, protéines et peptides de l'invention peuvent être produits selon différentes méthodes, telles que par voie recombinante, synthèse artificielle, ou des combinaisons de celles-ci. Les polypeptides, protéines et peptides de l'invention peuvent en outre être modifiés pour comporter des résidus non-naturels, des modifications chimiques, des marqueurs (fluorescents, radioactifs, enzymatiques, etc )
Un autre objet de l'invention concerne des anticorps reconnaissant une protéine, un polypeptide ou un peptide selon l'invention. Il s'agit préférentiellement d'anticorps anti-leptospire, liant un épitope présent dans une protéine, un polypeptide ou un peptide selon l'invention. Les anticorps de l'invention sont préférentiellement spécifiques des leptospires, notamment pathogènes, bien qu'une liaison plus faible (ou non-spécifique) puisse être observée expérimentalement avec d'autres antigènes
Les anticorps selon l'invention peuvent être des anticorps polyclonaux ou monoclonaux. Ils sont généralement produits par immunisation d'un animal avec une protéine, un polypeptide ou un peptide selon l'invention et récupération du sérum (pour obtenir les anticorps polyclonaux) ou de cellules du thymus ou de la rate, pour la production d'hybridomes produisant des anticorps monoclonaux.
Un autre objet de l'invention concerne des anticorps reconnaissant une protéine, un polypeptide ou un peptide selon l'invention. Il s'agit préférentiellement d'anticorps anti-leptospire, liant un épitope présent dans une protéine, un polypeptide ou un peptide selon l'invention. Les anticorps de l'invention sont préférentiellement spécifiques des leptospires, notamment pathogènes, bien qu'une liaison plus faible (ou non-spécifique) puisse être observée expérimentalement avec d'autres antigènes
Les anticorps selon l'invention peuvent être des anticorps polyclonaux ou monoclonaux. Ils sont généralement produits par immunisation d'un animal avec une protéine, un polypeptide ou un peptide selon l'invention et récupération du sérum (pour obtenir les anticorps polyclonaux) ou de cellules du thymus ou de la rate, pour la production d'hybridomes produisant des anticorps monoclonaux.
Les anticorps selon l'invention sont plus préférentiellement des anticorps reconnaissant la protéine PPL de séquence SEQ ID N07 telle que définie ci-avant ou un fragment de celle-ci.
Les anticorps de l'invention possèdent avantageusement la capacité de reconnaître au moins deux souches de leptospire pathogènes appartenant à des sérogroupes différents, plus préférentiellement au moins 3 souches pathogènes de leptospire.
Selon un mode de réalisation particulier, les anticorps selon l'invention sont des anticorps polyclonaux préparés par immunisation d'un animal avec une protéine PPL telle que définie ci-avant ou un fragment immunogène de cette protéine. L'animal peut être un rongeur (rat, souris, lapin, gerbille,
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hamster, cobaye...), un primate, un porc, un cheval, un bovin, etc. Les anticorps polyclonaux sont généralement récupérés dans le sérum des animaux immunisés, selon des protocoles connus de l'homme du métier.
Selon un autre mode de réalisation particulier, les anticorps selon l'invention sont des anticorps monoclonaux préparés à partir d'hybridomes obtenus par fusion entre une cellule immortalisée (par exemple un myélome) et une cellule productrice d'anticorps prélevée chez un animal immunisé avec une protéine PPL telle que définie ci-avant ou un fragment immunogène de cette protéine. L'animal peut être un rongeur (rat, souris, lapin, gerbille, hamster, cobaye..), un primate, un porc, un cheval, un bovin, etc.
Les anticorps de l'invention, notamment les anticorps monoclonaux, peuvent en outre être humanisés, c'est-à-dire modifiés artificiellement pour comporter des régions de chaînes lourdes ou légère d'origine humaine.
L'invention concerne également des fragments ou dérivés de tels anticorps, par exemple des fragments Fab, F (ab')2, ScFv (anticorps simple-chaîne), etc.
Comme il sera développé dans la suite du texte, les anticorps de l'invention peuvent être utilisés par exemple pour la détection de souches pathogènes de leptospires dans des échantillons tests (notamment des prélèvements sanguins), ou pour induire une protection (d'urgence) contre des infections par leptospire.
Un autre objet de l'invention réside dans tout acide nucléique codant un polypeptide, peptide ou une protéine tels que définis ci-avant Les acides nucléiques peuvent être des ADN ou des ARN, notamment des ADN recombinants, génomiques, synthétiques ou semi-synthétiques ou encore des ARNm, ou des fragments ou dérivés de ceux-ci Les acides nucléiques peuvent être obtenus à partir de banques, clonés à partir de bactéries leptospires (notamment par PCR), produits par synthèse artificielle en utilisant des synthétiseurs d'acides nucléiques, ou encore préparés en utilisant des combinaisons de ces méthodes (digestions enzymatiques, ligatures, clonage,
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modifications, etc. ) Les acides nucléiques peuvent en outre être modifiés pour améliorer l'usage des codons, éliminer des promoteurs cryptiques, réduire des structures secondaires, etc.
A cet égard, la présente demande décrit le clonage du gène PPL, codant la protéine PPL telle que décrite ci-avant La séquence nucléique complète de ce gène est représentée sur la Figure 3 (SEQ ID NO :6). Tout fragment ou dérivé de ce gène ou de sa séquence peut être préparé par les techniques conventionnelles de l'homme du métier. Toute séquence hybridant avec ce gène ou son brin complémentaire, et susceptible de coder une protéine, un polypeptide ou un peptide tels que définis ci-avant constitue un autre objet particulier de l'invention. Il s'agit avantageusement d'acides nucléiques de leptospire, hybridant dans des conditions de stringence élevée avec tout ou partie de la séquence SEQ ID NO :6, notamment les conditions de stringence décrite dans les exemples.
L'invention concerne également des vecteurs comprenant un acide nucléique tel que défini ci-avant. Il peut s'agir d'un vecteur de type plasmide, cosmide, épisome, chromosome artificiel, phage, virus, etc. Il s'agit plus préférentiellement d'un plasmide, par exemple d'un plasmide réplicatif ou intégratif chez les bactéries ou cellules eucaryotes (levures, cellules mammifère, etc. ) ou d'un virus recombinant, notamment défectif (tel qu'un adénovirus, un rétrovirus, un AAV, un virus de la vaccine, HSV, etc.).
Les vecteurs plasmidiques peuvent être préparés par les techniques conventionnelles en utilisant des plasmides disponibles dans le commerce, tels que pUC, pBR, pCN, etc.
Les vecteurs viraux peuvent également être produits selon des méthodes décrites dans l'art antérieur, et notamment en utilisant des cellules d'encapsidation. Pour les adénovirus, les vecteurs sont généralement défectifs pour tout ou partie de la région E1, et peuvent être produits dans la lignée 293 ou d'autres cellules décrites dans l'art antérieur. D'autres régions peuvent bien entendu être délétées du génome, telles que E2, E4 et/ou E3 par exemple. Les rétrovirus recombinants défectifs sont quant à eux
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généralement délétés des gènes gag, pol et env, et produits dans des lignées telles PsiCRIP. Concernant les AAV, ils peuvent être fabriqués dans différentes lignées, en présence d'un adénovirus helper et d'un plasmide portant les fonctions rep et cap. Il est entendu que toute autre technique de production de virus recombinants peut être utilisée, sans départir de la présente demande.
L'invention concerne aussi toute cellule recombinante comprenant un acide nucléique ou un vecteur tels que définis ci-avant. La cellule recombinante peut être une bactérie (par exemple une souche de E.coli), ou une cellule eucaryote, notamment une levure, une cellule mammifère, etc. Les cellules recombinantes peuvent être utilisées notamment pour la production des polypeptides de l'invention, ainsi que comme modèles pour la recherche de composés susceptibles de neutraliser ou d'antagoniser l'activité de la protéine PPL.
L'invention concerne en outre tout mammifère non-humain ou tout oiseau comprenant un acide nucléique tel que défini ci-avant dans ses cellules. Avantageusement, ces mammifères sont obtenus par recombinaison homologue. De tels mammifères (rongeurs, canins, lapins, chèvre, porc, etc.) sont notamment utilisables pour la production des polypeptides de l'invention et pour l'identification de composés à visée thérapeutique ou vaccinale, par exemple.
Un autre objet de la présente invention réside dans des sondes et/ou amorces nucléotidiques, utilisables pour la détection et/ou l'amplification d'acides nucléiques de Leptospires, et notamment pour la détection de la présence d'une souche pathogène de leptospire dans un échantillon test (notamment un produit biologique ou contaminé par un produit biologique).
Les sondes nucléotidiques selon l'invention comprennent avantageusement tout ou partie d'un acide nucléique tel que défini ci-avant Elles sont préférentiellement simple-brin, et peuvent être marquées, par
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exemple par marquage radioactif, enzymatique, fluorescent, chimique, etc Une sonde selon l'invention comprend préférentiellement une séquence complémentaire de tout ou partie de la séquence nucléique SEQ ID NO : 6 (Figure 3). Les sondes de l'invention peuvent être utilisées pour détecter la présence d'une souche pathogène de leptospire dans tout échantillon, notamment un échantillon biologique. En effet, elles sont préférentiellement (i) spécifiques des souches pathogènes de leptospire et (li) réactives avec des sérovars différents de leptospires pathogènes Une sonde préférée selon l'invention comprend la séquence complète du gène PPL (figure 3), ou un fragment de celle-ci comprenant la séquence codant la SEQ ID NO :1, de préférence un fragment supérieur à 100 bases, plus préférentiellement inférieur à environ 500 bases.
Les amorces nucléotidiques selon l'invention sont des oligonucléotides, d'une taille généralement inférieure à 40 bases, comprenant la séquence d'une partie au moins d'un acide nucléique tel que défini ci-avant. Les amorces sont utilisables pour l'amplification d'acides nucléiques de Leptospires, notamment pour l'amplification du gène PPL ou d'une partie de celui-ci, par exemple par réaction PCR.
De telles amorces spécifiques (et dégénérées) sont par exemple : . Amorce 1 (SEQ ID NO :3)
5' ATAAGAATGCGGCCGCATGAAAAAACTTTCGATTTTGGC-3' . Amorce 2 (SEQ ID NO : 4)
5' CCGCTCGAGCTTAGTCGCGTCAGAAGCAGC-3'
L'invention concerne plus particulièrement tout couple d'amorces permettant l'amplification d'une région du gène PPL tel que défini ci-avant.
5' ATAAGAATGCGGCCGCATGAAAAAACTTTCGATTTTGGC-3' . Amorce 2 (SEQ ID NO : 4)
5' CCGCTCGAGCTTAGTCGCGTCAGAAGCAGC-3'
L'invention concerne plus particulièrement tout couple d'amorces permettant l'amplification d'une région du gène PPL tel que défini ci-avant.
Préférentiellement, la région amplifiée comporte au moins 50 pb, de préférence au moins 150 pb.
Les sondes, amorces ou oligonucléotides de l'invention ont préférentiellement la capacité d'hybrider spécifiquement avec tout ou une
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partie du génome de souches pathogènes de leptospires L'hybridation est dite spécifique lorsque la sonde ou l'oligonucléotide hybrident, dans des conditions de stringence élevée, avec ledit génome et pas ou peu avec le génome d'autres espèces bactériennes, notamment de leptospires nonpathogènes. En particulier, l'hybridation est donc dite spécifique lorsque le différentiel signal spécifique/bruit de fond est suffisamment grand pour pouvoir être détecté. Une hybridation en condition de stringence élevée est par exemple une hybridation en SSC1 %, 0,1 %SDS à 39 C.
Les sondes, amorces ou oligonucléotides de l'invention sont préférentiellement complémentaires d'une région au moins du gène PPL. La complémentarité est généralement parfaite, de manière à assurer une meilleure sélectivité d'hybridation. Toutefois, certains mésappariements peuvent être tolérés. Ces sondes ou oligonucléotides peuvent être synthétisés par toute technique connue de l'homme du métier, par exemple par clivage à partir des acides nucléiques décrits ci-avant, ou par synthèse artificielle, ou en combinant ces techniques. Les sondes et amorces sont particulièrement utiles pour la détection de la présence de souches pathogènes de leptospires, et/ou le diagnostic de leptospiroses, comme il sera détaillé ci-après.
Diverses équipes travaillent sur l'amélioration des antigènes de diagnostic indirect de la leptospirose, le but étant d'aboutir à des méthodes opérationnelles, facilement utilisables en particulier dans les pays non industrialisés, victimes majeures de ces pathologies. Les produits actuellement proposés sur le marché sont des extraits complexes de cultures de leptospires. Cette complexité reproduit celle des souches vivantes utilisées dans le MAT et n'apporte donc pas d'amélioration sensible en terme de reproductibilité et de practicabilité.
La mise en évidence d'anticorps dirigés contre un antigène spécifique de souches pathogènes est donc particulièrement avantageuse. La présente
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invention peut ainsi être utilisée sur le plan diagnostique, vaccinal, thérapeutique et/ou expérimental.
Sur le plan du diagnostic indirect, compte tenu de sa présence dans les souches pathogènes, les polypeptides, peptides ou la protéine PPL de l'invention peuvent être utilisés comme antigène protéique purifié capable de mettre en évidence des anticorps produits lors d'une infection par une souche pathogène, quel que soit son sérogroupe d'appartenance. Ceci permet donc que le diagnostic expérimental de la leptospirose puisse être assuré par de nombreux laboratoires disposant d'un équipement ordinaire (exemple ELISA ou dot) alors que le MAT exige en entretien de cultures vivantes et que sa standardisation, de ce fait, est très difficile.
Un objet particulier de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un polypeptide, peptide ou d'une protéine tels que définis ci-avant pour détecter la présence d'anticorps anti-leptospire dans un échantillon biologique test (notamment un échantillon biologique tel que sang, sérum, urine, tissu, etc. ou non biologique tel que eau, boisson, etc. ) Un autre objet de l'invention réside dans une méthode de détection de la présence d'anticorps antileptospire dans un échantillon test, comprenant la mise en contact de cet échantillon (ou une dilution) avec un polypeptide, peptide ou une protéine tels que définis ci-avant, et la mise en évidence de la formation de complexes antigène-anticorps.
Sur le plan du diagnostic direct, les anticorps (ou fragments ou dérivés d'anticorps) selon l'invention, notamment les anticorps monoclonaux de l'invention, permettent la mise en évidence directe de l'agent pathogène présent dans un échantillon test (tel qu'un prélèvement ou un autre type d'échantillon tel que de l'eau). La mise en évidence peut être réalisée par toute méthode immunologique connue de l'homme du métier, telle que par ELISA capture, RIA, essais directs ou sandwich, etc, ou par révélation immunologique de cette protéine dans les prélèvements pathologiques ou non.
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Un autre objet de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un anticorps (ou fragment ou dérivés d'anticorps) selon l'invention, notamment d'un ou plusieurs anticorps monoclonaux de l'invention, pour la détection de la présence d'une souche pathogène de leptospire dans un échantillon, notamment biologique. Un autre objet de l'invention réside dans une méthode de détection de la présence d'une souche pathogène de leptospire dans un échantillon, notamment biologique, comprenant la mise en contact de cet échantillon (ou une dilution) avec anticorps (ou fragment ou dérivés d'anticorps) selon l'invention, et la mise en évidence de la formation de complexes antigène-anticorps.
Pour ces utilisations, les polypeptides, peptides, protéines et anticorps peuvent être utilisés sous forme soluble, ou immobilisés sur des supports solides ou semi-solides, de type filtre, silice, verre, plaque, bille, etc.
L'utilisation sous forme immobilisée permet avantageusement de simplifier la détection ou le diagnostic expérimental de la leptospirose. Ces composés peuvent en outre être marqués, par exemple au moyen de marqueurs fluorescents, enzymatiques, biologiques ou radioactifs Comme indiqué ciavant, la révélation de complexes antigène-anticorps peut également être réalisée au moyen d'un anticorps supplémentaire marqué, ou selon les techniques immunologiques connues (ELISA, RIA, sandwich, capture, etc.)
Une autre méthode de détection (ou dépistage) selon l'invention réside dans la mise en contact d'un échantillon test avec une sonde nucléotidique de l'invention, et la mise en évidence d'une hybridation entre ladite sonde et ledit échantillon. Plus préférentiellement, l'échantillon test est traité préalablement de manière à rendre les acides nucléiques qu'il contient accessibles à une réaction d'hybridation. Le traitement peut consister à casser les membranes cellulaires, par exemple par traitement chimique (détergent) et/ou mécanique (ultra son, congélation-décongelation, etc. ). Dans un mode particulier de mise en #uvre, l'échantillon, notamment biologique, ainsi traité est soumis à une réaction d'amplification, au moyen d'amorces de l'invention, préalablement à la réaction d'hybridation avec la sonde. L'amplification peut être réalisée dans
Une autre méthode de détection (ou dépistage) selon l'invention réside dans la mise en contact d'un échantillon test avec une sonde nucléotidique de l'invention, et la mise en évidence d'une hybridation entre ladite sonde et ledit échantillon. Plus préférentiellement, l'échantillon test est traité préalablement de manière à rendre les acides nucléiques qu'il contient accessibles à une réaction d'hybridation. Le traitement peut consister à casser les membranes cellulaires, par exemple par traitement chimique (détergent) et/ou mécanique (ultra son, congélation-décongelation, etc. ). Dans un mode particulier de mise en #uvre, l'échantillon, notamment biologique, ainsi traité est soumis à une réaction d'amplification, au moyen d'amorces de l'invention, préalablement à la réaction d'hybridation avec la sonde. L'amplification peut être réalisée dans
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des conditions conventionnelles. L'hybridation peut être réalisée sur des supports, sur lesquels la sonde est immobilisée (filtres, verre, silice, etc. ). Les conditions de stringence de l'hybridation peuvent être ajustées par l'homme du métier, en adaptant la température et/ou la salinité des milieux
L'invention concerne en outre un kit pour la mise en oeuvre des procédés de l'invention, comprenant une sonde ou un oligonucléotide ou un couple d'amorces tels que décrits ci-avant Les kits de l'invention comprennent avantageusement les réactifs appropriés à une réaction d'amplification et/ou d'hybridation, et, éventuellement, un support pour de telles réactions (filtres, membranes, chips, etc.)
La présente invention est également utilisable sur le plan thérapeutique et préventif. En effet, bien que le mode d'action pathogénique de la protéine PPL ne soit pas encore défini, la présente demande montre qu'elle est capable d'induire une protection. L'administration des anticorps dirigés contre cette protéine, qu'ils soient d'origine poly ou monoclonale devrait donc permettre de neutraliser l'impact pathogénique des leptospires chez l'individu en cours d'évolution et donc d'améliorer le pronostic de cette maladie De même, l'administration d'un polypeptide, peptide ou d'une protéine de l'invention, éventuellement sous forme inactivée, ou d'un acide nucléique ou vecteur correspondant, permet d'induire une réponse immune protectrice contre ces agents infectieux.
L'invention concerne en outre un kit pour la mise en oeuvre des procédés de l'invention, comprenant une sonde ou un oligonucléotide ou un couple d'amorces tels que décrits ci-avant Les kits de l'invention comprennent avantageusement les réactifs appropriés à une réaction d'amplification et/ou d'hybridation, et, éventuellement, un support pour de telles réactions (filtres, membranes, chips, etc.)
La présente invention est également utilisable sur le plan thérapeutique et préventif. En effet, bien que le mode d'action pathogénique de la protéine PPL ne soit pas encore défini, la présente demande montre qu'elle est capable d'induire une protection. L'administration des anticorps dirigés contre cette protéine, qu'ils soient d'origine poly ou monoclonale devrait donc permettre de neutraliser l'impact pathogénique des leptospires chez l'individu en cours d'évolution et donc d'améliorer le pronostic de cette maladie De même, l'administration d'un polypeptide, peptide ou d'une protéine de l'invention, éventuellement sous forme inactivée, ou d'un acide nucléique ou vecteur correspondant, permet d'induire une réponse immune protectrice contre ces agents infectieux.
La présente invention concerne à cet égard des compositions immunogènes, ou vaccinales, comprenant un ou plusieurs polypeptide, peptide, protéine, anticorps, acide nucléique ou vecteur tels que décrits ciavant. Ces compositions sont particulièrement avantageuses puisqu'elles permettent d'induire une réponse ou une protection immune contre différentes souches pathogènes, notamment contre plusieurs sérogroupes pathogènes différents.
Sur le plan de la protection, il est considéré dans l'art antérieur que seules les bactéries entières sont susceptibles d'apporter les antigènes
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protecteurs et par ailleurs qu'il n'existe pas de protection croisée entre sérogroupes différents. Ce qui signifie qu'un vaccin doit être composé d'une suspension ou plus exactement d'une addition de suspensions de bactéries représentatives de chacun des sérogroupes nécessaires à la protection de l'espèce de destination du vaccin. Compte tenu de la grande diversité des sérogroupes, un choix s'impose en fonction de l'espèce et des conditions épidémiologiques. Ainsi, les vaccins usuels utilisés chez le chien associent une suspension de bactéries inactivées du sérogroupe Icterohaemorrhagiae et une du sérogroupe Canicola. Des vaccins utilisés chez le porc et les ruminants aux USA associent des suspensions de sérovars appartenant aux sérogroupes : Icterohaemorrhagiae, Pomona, Gnppotyphosa, Canicola et Sejroë (sérovar hardjo) par exemple. Le vaccin à usage humain commercialisé en France à l'heure actuelle comporte 2 sérovars du même sérogroupe Icterohaemorrhagiae etc...
Le problème de ces préparations vaccinales est leur défaillance en terme de protection totale contre la leptospirose Un individu vacciné dont la vaccination est entretenue selon les modalités prescrites par les producteurs de vaccin est protégé contre l'infection et/ou la maladie induite par une souche sauvage appartenant aux seuls sérogroupes présents dans le vaccin.
On ne protège donc (et encore cette protection peut-elle être imparfaite) que contre une infection par un ou plusieurs sérogroupes donnés.
Compte tenu du postulat de base qui est l'impossibilité d'induire une protection croisée entre les différents sérogroupes, l'état de l'art ne permet donc pas de conférer une protection globale contre la leptospirose, quel que soit le sérogroupe (voire quelle que soit la génomospecies) infectante à laquelle est exposé l'individu.
La présente invention montre à présent qu'il est possible d'induire une réponse immune efficace contre des leptospires pathogènes sans utiliser de bactérie entière. La présente invention montre également qu'il est possible de générer une protection croisée entre plusieurs sérogroupes de leptospirose.
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Ainsi, dans une première étape, il a été démontré que la présence de corps bactériens entiers n'était pas indispensable à l'induction d'une protection homologue On entend par réponse ou protection homologue, la protection induite par une préparation composée par les leptospires appartenant au même sérogroupe que les leptospires employés dans l'épreuve virulente réalisée sur animal de laboratoire sensible et permettant d'apprécier l'authenticité de la protection conférée Ceci a été démontré par immunisation d'animaux avec un extrait total de leptospires obtenu par éclatement des bactéries.
La deuxième étape a été de démontrer que des extraits totaux de différents sérogroupes permettaient d'induire une protection hétérologue à l'intérieur de l'espèce L. interrogans. On parle de protection hétérologue lorsque l'épreuve virulente ("challenge") est réalisée avec une souche n'appartenant pas au sérogroupe utilisé pour l'immunisation. Ceci a été démontré par des immunisations réalisées avec des extraits totaux de cultures des sérogroupes Autumnalis, Canicola ou Icterohaemorrhagiae suivies d'épreuves virulentes utilisant des souches Icterohaemorrhagiae ou Canicola dont la virulence est entretenue au laboratoire
La troisième étape a été de démontrer que l'antigène ou les antigènes responsables de cette protection croisée étaient absents de, ou très peu exprimés par, l'espèce saprophyte et éventuellement présents dans des souches de sérogroupes différents mais aussi appartenant à des espèces génomiques différentes : un extrait total de L biflexa utilisée n'a pas permis de protéger des animaux contre une épreuve virulente
La quatrième étape a été de définir la nature de l'antigène ou des antigènes responsables de cette protection croisée. Des extraits purifiés de lipopolysaccharides (LPS) ont été préparés par la méthode d'extraction à chaud phénol-eau de Westphall Ce mode de préparation permet d'obtenir la fraction lipopolyosidique (LPS) pure. L'extrait résiduel contient les protéines (simples ou complexes), mais aussi du LPS résiduel. Nous avons démontré que l'extrait pur LPS est responsable d'un puissant effet protecteur, mais
La troisième étape a été de démontrer que l'antigène ou les antigènes responsables de cette protection croisée étaient absents de, ou très peu exprimés par, l'espèce saprophyte et éventuellement présents dans des souches de sérogroupes différents mais aussi appartenant à des espèces génomiques différentes : un extrait total de L biflexa utilisée n'a pas permis de protéger des animaux contre une épreuve virulente
La quatrième étape a été de définir la nature de l'antigène ou des antigènes responsables de cette protection croisée. Des extraits purifiés de lipopolysaccharides (LPS) ont été préparés par la méthode d'extraction à chaud phénol-eau de Westphall Ce mode de préparation permet d'obtenir la fraction lipopolyosidique (LPS) pure. L'extrait résiduel contient les protéines (simples ou complexes), mais aussi du LPS résiduel. Nous avons démontré que l'extrait pur LPS est responsable d'un puissant effet protecteur, mais
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exclusivement homologue. Ceci confirme bien les données antérieures concernant l'absence de protection croisée entre sérogroupes. En effet, le LPS correspond aux structures antigéniques externes responsables de la production d'anticorps agglutinants utilisés comme base de la classification sérologique, mais aussi responsables de l'effet protecteur des préparations vaccinales. Il était donc nécessaire qu'un vaccin soit capable d'induire leur production à des taux significatifs pour protéger un animal
La cinquième étape a été de contrôler la capacité d'un extrait protéique d'une souche Autumnalis purifié de toute trace de LPS d'induire une protection homologue au même titre que le LPS purifié mais aussi d'induire une protection contre une épreuve virulente hétérologue observée lors des essais précédents. Ceci a été réalisé par une immunisation avec un extrait protéique obtenu par une extraction chloroforme méthanol effectuée sur l'interface d'une extraction phénol eau ayant permis la purification préalable du LPS et suivie d'une épreuve virulente.
La cinquième étape a été de contrôler la capacité d'un extrait protéique d'une souche Autumnalis purifié de toute trace de LPS d'induire une protection homologue au même titre que le LPS purifié mais aussi d'induire une protection contre une épreuve virulente hétérologue observée lors des essais précédents. Ceci a été réalisé par une immunisation avec un extrait protéique obtenu par une extraction chloroforme méthanol effectuée sur l'interface d'une extraction phénol eau ayant permis la purification préalable du LPS et suivie d'une épreuve virulente.
La sixième étape a été de définir la zone de poids moléculaire des protéines efficaces dans la protection hétérologue Ce point a été démontré par l'induction d'une protection significative induite après immunisation d'animaux à l'aide de bande de gel d'électrophorèse comprenant les protéines ségrégeant vers 32-34 kD d'un extrait protéique extrait d'Autumnalis. Un autre élément décisif était obtenu au cours de cet essai, à savoir que la protection n'était pas liée à la structure tertiaire des protéines étudiées puisque leur dénaturation est importante dans les gels d'électrophorèse
Lors de la septième étape, il a été possible par l'utilisation du Prep-cell de Biorad de séparer différentes protéines ségrégeant dans cette zone afin de réaliser leur séquençage. Trois bandes ont fait l'objet de l'étude en séquençage, une protéine de 32 kD et deux protéines de 34 kD. Les séquences NH2 terminales ont été définies ainsi qu'une séquence interne d'une douzaine d'acides aminés correspondant au pic majeur (pic 14) obtenu en HPLC. La séquence interne de la protéine de 32 kD a été définie comme étant la séquence SEQ ID NO :1. Cette protéine a été désignée PPL.
Lors de la septième étape, il a été possible par l'utilisation du Prep-cell de Biorad de séparer différentes protéines ségrégeant dans cette zone afin de réaliser leur séquençage. Trois bandes ont fait l'objet de l'étude en séquençage, une protéine de 32 kD et deux protéines de 34 kD. Les séquences NH2 terminales ont été définies ainsi qu'une séquence interne d'une douzaine d'acides aminés correspondant au pic majeur (pic 14) obtenu en HPLC. La séquence interne de la protéine de 32 kD a été définie comme étant la séquence SEQ ID NO :1. Cette protéine a été désignée PPL.
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Dans une huitième étape, des sondes nucléotidiques dégénérées ont été construites, le gène de PPL a été cloné, et la production de protéine PPL recombinante a été effectuée et a permis la production d'anticorps monoclonaux Le gène PPL a été inséré dans un adénovirus humain non réplicatif et une protection efficace, homologue et hétérologue contre des épreuves virulentes, a été observée après administration de ces virus recombinants en particulier comme vaccins.
Ces résultats démontrent que si les antigènes lipopolyosidiques sont bien le support d'une protection efficace vis-à-vis d'une infection homologue, point de départ de la constitution des préparations vaccinales employées actuellement tant chez l'homme que chez l'animal, la protéine PPL, employée seule, est capable d'induire une protection croisée entre sérogroupes différents de l'espèce Leptospira interrogans ss (Icterohaemorrhagiae, Canicola, Autumnalis). La protection hétérologue peut également être induite entre espèces génomiques différentes de l'ancienne espèce Leptospira interrogans si (ici L borgpetersenii et interrogans si), alors qu'elle est absente de l'ancienne espèce saprophyte Leptospira biflexa
La présente invention concerne donc l'utilisation de la protéine PPL, de ses fragments de synthèse ou naturels, de ses dérivés quels qu'ils soient utilisés seuls ou associés à d'autres protéines ou fractions lipopolyosidiques dérivées de leptospires ou à des adjuvants de l'immunité quelles que soient leur nature, en tant que préparation vaccinale à usage vétérinaire ou humain, notamment pour la préparation d'une composition destinée à induire une réponse immune contre des sérovars différents de leptospires pathogènes.
La présente invention concerne donc l'utilisation de la protéine PPL, de ses fragments de synthèse ou naturels, de ses dérivés quels qu'ils soient utilisés seuls ou associés à d'autres protéines ou fractions lipopolyosidiques dérivées de leptospires ou à des adjuvants de l'immunité quelles que soient leur nature, en tant que préparation vaccinale à usage vétérinaire ou humain, notamment pour la préparation d'une composition destinée à induire une réponse immune contre des sérovars différents de leptospires pathogènes.
L'invention a également pour objet un vaccin comprenant un polypeptide ou un acide nucléique tels que définis ci-avant
L'invention a encore pour objet une composition comprenant un ou plusieurs anticorps tels que décrits ci-avant, notamment pour induire une protection.
L'invention a encore pour objet une composition comprenant un ou plusieurs anticorps tels que décrits ci-avant, notamment pour induire une protection.
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Les compositions immunogènes ou vaccins de l'invention peuvent être utilisés sous forme injectable ou per os ou transcutanée, par exemple en association avec des véhicules acceptables sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire, ou avec des adjuvants. Les quantités d'immunogène administrées, et la fréquence ou le nombre des administrations peuvent être adaptées par l'homme du métier en fonction du sujet, du stade d'évolution de l'injection, etc. Typiquement, une ou deux injections, à 1 mois d'intervalle, sont réalisées, avec 104 à 109 pfu de virus recombinant selon l'invention, ou avec 50 à 1000 g de protéine, polypeptide, peptide ou anticorps au moins.
Des injections supplémentaires peuvent être envisagées, ou des quantités supérieures peuvent être administrées, notamment dans le cas d'administrations orales. Des protocoles spécifiques d'immunisation comprennent par exemple deux injections intramusculaires à trois semaines d'intervalle d'une préparation d'adénovirus recombinant comprenant 109 particules d'adénovirus (DECP50) exprimant un polypeptide PPL. Il est entendu que l'adénovirus (ou le virus) utilisé peut exprimer d'autres polypeptides en plus des polypeptides PPL, ou être utilisé en combinaison avec d'autres adénovirus (ou virus) exprimant d'autres polypeptides (immunomodulateurs, peptides immunogènes, etc )
Les compositions immunogènes ou des vaccins de l'invention présentent notamment les avantages suivants .
Les compositions immunogènes ou des vaccins de l'invention présentent notamment les avantages suivants .
Efficacité :Induction d'une protection croisée évitant l'accumulation de préparations antigéniques différentes afin de prévenir l'infection par les différentes souches infectantes présentes dans un pays donné pour une espèce donnée.
Innocuité : L'utilisation de cette protéine purifiée (ou des polypeptides, anticorps et acides nucléiques) évite d'introduire chez l'individu vacciné de nombreux antigènes non nécessaires à la protection, donc pour le moins inutiles, voire dangereux lors d'utilisations répétées. On pense ainsi que l'uvéite récidivante du cheval (pouvant aboutir à la cécité de l'animal) serait
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induite par une réponse immunitaire post infectieuse due à des protéines de leptospires ayant une composition proche de certaines protéines structurales de l'oeil du cheval. Par ailleurs, il semble que chez l'Homme les vaccinations répétées sont de moins en moins bien tolérées au cours du temps
Compatibilité avec les mesures de prophylaxie sanitaire : actuellement, il est impossible de différencier les anticorps post vaccinaux des anticorps post infectieux, la production d'anticorps agglutinants étant obtenue dans les deux cas. Ce vaccin employé dans les grandes espèces de production (il n'en existe pas actuellement en France et ceux existant à l'étranger ont une efficacité difficile à démontrer) permettrait de mettre en #uvre une prophylaxie médicale permettant malgré tout le dépistage de l'infection sauvage et donc les qualifications de cheptels indemnes, qualifications valorisantes à l'exportation.
Compatibilité avec les mesures de prophylaxie sanitaire : actuellement, il est impossible de différencier les anticorps post vaccinaux des anticorps post infectieux, la production d'anticorps agglutinants étant obtenue dans les deux cas. Ce vaccin employé dans les grandes espèces de production (il n'en existe pas actuellement en France et ceux existant à l'étranger ont une efficacité difficile à démontrer) permettrait de mettre en #uvre une prophylaxie médicale permettant malgré tout le dépistage de l'infection sauvage et donc les qualifications de cheptels indemnes, qualifications valorisantes à l'exportation.
Limitation de l'usage des antibiotiques en élevage : l'absence de possibilités d'éradication des leptospires (entretenus dans l'environnement par de nombreuses espèces d'animaux réservoirs de la faune sauvage) oblige actuellement à mettre en #uvre un traitement antibiotique élargi à l'ensemble du troupeau quand des troubles cliniques sont reconnus liés à l'infection leptospirosique Ceci contribue donc à l'utilisation intensive des antibiotiques en élevage, usage discuté en terme de retombées pour la santé publique.
La production industrielle d'un tel vaccin devrait enfin permettre de simplifier la production de vaccin par l'absence d'adaptation de la composition antigénique de la préparation vaccinale d'une part à l'espèce, d'autre part aux conditions épidémiologiques spécifiques des zones géographiques où elle serait appliquée.
L'invention concerne aussi les polypeptides, protéines et peptides tels que définis ci-avant, sous forme atténuée, c'est-à-dire conservant les propriétés immunogènes et essentiellement dépourvus d'autre activité biologique.
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L'invention concerne également l'utilisation des acides nucléiques ou vecteurs tels que décrits ci-avant pour la production in vitro ou ex vivo des polypeptides, protéines et peptides de l'invention, quelles que soient les méthodes de recombinaison génétique employées animaux transgéniques, bactéries, cellules eucaryotes, végétales, plasmides, virus, etc. Les techniques de production de protéines recombinantes sont bien connues de l'homme du métier, et peuvent être appliquées à la présente invention (promoteurs forts, inductibles, signaux de terminaison, techniques de transfection, etc.).
La présente invention sera décrite en détail à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des Figures
Figure 1 : Carte de restriction du plasmide pET-29b-PPL.
Figure 1 : Carte de restriction du plasmide pET-29b-PPL.
Figure 2 : Séquence nucléique du Fragment PCR PPL de 841 pb (SEQ ID NO :5).
Figure 3 : Séquence nucléique du gène PPL (843 pb, SEQ ID NO : 6)
Figure 4 : Séquence de la protéine recombinante PPL (280aa, SEQ ID NO :7)
EXEMPLES
1. Matériels et Méthodes
Epreuve virulente sur gerbilles :
L'épreuve virulente est réalisée par une injection par voie intra péritonéale de 0.5ml d'un inoculum d'une subculture de moins de 3 semaines
Figure 4 : Séquence de la protéine recombinante PPL (280aa, SEQ ID NO :7)
EXEMPLES
1. Matériels et Méthodes
Epreuve virulente sur gerbilles :
L'épreuve virulente est réalisée par une injection par voie intra péritonéale de 0.5ml d'un inoculum d'une subculture de moins de 3 semaines
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de la souche pathogène canicola. Cette subculture (effectuée en milieu EMJH base+ enrichissement spécifique 10% + sérum de lapin 1 %) est obtenue par repiquage d'un réisolement obtenu après passage sur une gerbille (cf procédure d'entretien de la virulence). La subculture titrant 82 UT (turbidimétrie) après filtration à 0.8pm est diluée à 10-5 en milieu tamponné stérile (EMJH base).
Contrôle de virulence des souches B2ML
Le contrôle du pouvoir pathogène des souches de leptospires de pouvoir pathogène connu ( Icterohaemorrhagiae et Canicola ) est effectué une à deux fois par an sur gerbilles. Les animaux reçoivent une culture repiquée dans les trois semaines précédentes à partir d'un isolement effectué à partir d'un broyat de foie et de rein de gerbille morte lors de l'épreuve virulente précédente.
Le contrôle du pouvoir pathogène des souches de leptospires de pouvoir pathogène connu ( Icterohaemorrhagiae et Canicola ) est effectué une à deux fois par an sur gerbilles. Les animaux reçoivent une culture repiquée dans les trois semaines précédentes à partir d'un isolement effectué à partir d'un broyat de foie et de rein de gerbille morte lors de l'épreuve virulente précédente.
Une dose de 0,5 ml à 10 à 20 UT injectée par voie intra péritonéale induit la mort des animaux dans un délai de 3 à 7 jours. Souche pathogène : Canicola canicola (ongine Institut Pasteur).
Matériels .
Les enzymes de restnction ainsi que les autres enzymes nécessaires aux différentes modifications d'ADN ont été fournies par Roche diagnostics et new England Biolaps Inc, la Taq polymérase (high fidelity) pour les réactions d'amplification en chaîne a été fournies par Gibco-BRL.
Toutes ces enzymes ont été utilisées selon les recommandations des fournisseurs.
Les souches Escherichia Coli suivantes ont été utilisées : - Cellules compétentes DH5[alpha]TM (18265-017, Life TechnologiesTM): F# 80/acZAM15 A(/acZYA-argF)U169 cfeoR recA1 endA1 hsdR17(rk-,mk+) phoA supE44 ' thi-1 gyrA996 re/A1
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- Cellules compétentes BL21(DE3) (200131, stratagene) : E Coli BF- dcm ompT hcdS (rB-mB-)gal(DE3) -BJ5183 (Hanahan D J. Mol. Biol. 1983 1666 557-580)
2 Identification et Isolement d'une Protéine Membranaire immunogène de Leptospire
Des fractions protéiques ont été préparées à partir d'un extrait total de leptospires, par extraction chloroforme/phénol/eau, selon la méthode d'Auran (AURAN N. E., JOHNSON, R. C. et RITZI; D. M Isolation of the outer sheath of Leptospira and its immunogenic properties in hamsters, Infect. Immun 1972, 5,968 - 975). Ces fractions ont été séparées en fonction de leur masse moléculaire par électrophorèse en gel de polyacrylamide
Un premier essai de protection expérimentale à partir des fractions protéiques obtenues a montré qu'il était possible d'obtenir une protection imparfaite mais réelle après immunisation des gerbilles avec des bandes de gel d'électrophorèse excisées en isolant les différentes bandes protéiques en fonction de leurs différentes masses moléculaires exemple zone 41-43 kDa etc. Mais l'extrait employé contenait du "LPS", y compris dans les zones d'électrophorèse où il n'est pas directement détectable, mais sa présence contaminante est observée sur les animaux immunisés Or, le LPS est déjà connu comme étant le support (indispensable sinon unique) de l'immunité contre les leptospires.
2 Identification et Isolement d'une Protéine Membranaire immunogène de Leptospire
Des fractions protéiques ont été préparées à partir d'un extrait total de leptospires, par extraction chloroforme/phénol/eau, selon la méthode d'Auran (AURAN N. E., JOHNSON, R. C. et RITZI; D. M Isolation of the outer sheath of Leptospira and its immunogenic properties in hamsters, Infect. Immun 1972, 5,968 - 975). Ces fractions ont été séparées en fonction de leur masse moléculaire par électrophorèse en gel de polyacrylamide
Un premier essai de protection expérimentale à partir des fractions protéiques obtenues a montré qu'il était possible d'obtenir une protection imparfaite mais réelle après immunisation des gerbilles avec des bandes de gel d'électrophorèse excisées en isolant les différentes bandes protéiques en fonction de leurs différentes masses moléculaires exemple zone 41-43 kDa etc. Mais l'extrait employé contenait du "LPS", y compris dans les zones d'électrophorèse où il n'est pas directement détectable, mais sa présence contaminante est observée sur les animaux immunisés Or, le LPS est déjà connu comme étant le support (indispensable sinon unique) de l'immunité contre les leptospires.
Par ailleurs, les caractéristiques antigéniques différentiant L. interrogans de L biflexa étaient étudiées ces différences tiennent essentiellement dans les bandes 21,32, 34,38, 41,100 et 110 kDa.
Dans une deuxième étape, le pouvoir protecteur des bandes 26-31 et 31-34 de 2 sérovars de leptospires de l'espèce pathogène (souches Canicola et souche Autumnalis 32) a donc été testé, et comparé à l'éventuelle protection induite par une souche de l'espèce non pathogène L. biflexa souche Buenos Aires
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Cette expérience nous a permis de conclure que
L'antigène protecteur n'est pas présent dans l'espèce saprophyte L biflexa (aucune survie des gerbilles ayant été immunisées par cet antigène préparé en extrait total comme précédemment dès le 10ème jour, les témoins étant tous morts au 8ème jour), ce qui signifie qu'aucun des antigènes communs entre interrogans et biflexa n'est protecteur (ou existe en trop faible représentation dans biflexa).
L'antigène protecteur n'est pas présent dans l'espèce saprophyte L biflexa (aucune survie des gerbilles ayant été immunisées par cet antigène préparé en extrait total comme précédemment dès le 10ème jour, les témoins étant tous morts au 8ème jour), ce qui signifie qu'aucun des antigènes communs entre interrogans et biflexa n'est protecteur (ou existe en trop faible représentation dans biflexa).
La protection homologue (canicola) effectuée par les deux bandes 26/31 et 31/34 est totale
La protection hétérologue existe pour les gerbilles vaccinées
Autumnalis 32 :au 21 ème jour : 2/10 survivent pour la bande 26/31
4/10 survivent pour la bande 31/34.
La protection hétérologue existe pour les gerbilles vaccinées
Autumnalis 32 :au 21 ème jour : 2/10 survivent pour la bande 26/31
4/10 survivent pour la bande 31/34.
Mais les contrôles sérologiques effectués sur les animaux avant épreuve virulente ont montré que ceux qui avaient reçu les bandes supposées exclusivement protéiques comme la bande 31-34 avaient en fait été immunisés partiellement par du LPS. En effet, et des expériences ultérieures nous l'ont montré, le LPS, très immunogène, diffuse d'autant plus vers les hauts poids moléculaires en électrophorèse que la charge quantitative de l'extrait mis en migration est importante, cas de l'électrophorèse préparative employée pour les immunisations des gerbilles.
Des procédés de séparation du LPS et des protéines ont donc été affinés pour s'abstraire des risques rencontrés lors de l'expérimentation précédente. Ainsi il est possible d'avoir des extraits (phénol eau 9/1 v/v puis extraction chloroforme méthanol 2/1 v/v menée sur la phase phénol de l'extraction précédente) ne contenant aucune trace des fractions lipopolysaccharidiques
De nouvelles immunisations ont ensuite été réalisées avant épreuve virulente, ayant pour but de tester le pouvoir protecteur des fractions protéiques versus celui des fractions LPS maintenant correctement séparées.
De nouvelles immunisations ont ensuite été réalisées avant épreuve virulente, ayant pour but de tester le pouvoir protecteur des fractions protéiques versus celui des fractions LPS maintenant correctement séparées.
Pour cela, des gerbilles ont reçu : - extrait protéique de icterohaemorrhagiae
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- LPS de icterohaemorrhagiae - extrait protéique de canicola - LPS de canicola
Chaque lot a été divisé en deux et de ce fait a reçu soit une épreuve virulente homologue soit une épreuve virulente hétérologue
Cette expérience nous a permis de conclure que :
La protection par le LPS est strictement homologue (aucune survie des animaux immunisés par le LPS hétérologue).
Chaque lot a été divisé en deux et de ce fait a reçu soit une épreuve virulente homologue soit une épreuve virulente hétérologue
Cette expérience nous a permis de conclure que :
La protection par le LPS est strictement homologue (aucune survie des animaux immunisés par le LPS hétérologue).
La protection hétérologue portée par les protéines purifiées existe : 6/6 des gerbilles ayant reçu les protéines de icterohaemorrhagiae sont toujours vivantes un mois après l'épreuve par canicola.
Un autre lot de gerbilles a reçu un extrait protéique de canicola avant épreuve virulente par icterohaemorrhagiae. Au 5ème jour de l'épreuve, les 20 témoins sont morts, 12/17 vaccinés sont vivants, 9 le sont un mois plus tard.
Ceci nous permet de compléter l'expérimentation précédente sur la protection protéique hétérologue, malgré les difficultés de maîtriser une épreuve virulente effectuée par icterohaemorrhagiae.
Donc, la protection significative obtenue avec l'extrait 31/34 ne peut être le fait des traces de LPS, celui-ci ayant montré son pouvoir protecteur strictement homologue dans les expériences suivantes
Les protéines comprises dans la zone 31/34 ont donc été séparées par utilisation du Prepcell (Biorad), ce qui a permis de mettre en évidence la présence de deux protéines au moins, de 32 kD et 34 kD. Les études ultérieures ont montré que la protéine de 32 kD (désignée PPL) est, à elle seule, responsable des protections observées
Une fraction protéique de Leptospira interrogans autumnalis de 32 Kda été isolée et purifiée par électrophorèse. Le séquençage de la protéine PPL nous a permis d'obtenir une mini séquence peptidique PPL de 16aa TFLPYGSVINYYGYVK ( SEQ ID NO 1). Un alignement de cette mini séquence avec la banque de données de Genbank a donné 93% d'homologie
Les protéines comprises dans la zone 31/34 ont donc été séparées par utilisation du Prepcell (Biorad), ce qui a permis de mettre en évidence la présence de deux protéines au moins, de 32 kD et 34 kD. Les études ultérieures ont montré que la protéine de 32 kD (désignée PPL) est, à elle seule, responsable des protections observées
Une fraction protéique de Leptospira interrogans autumnalis de 32 Kda été isolée et purifiée par électrophorèse. Le séquençage de la protéine PPL nous a permis d'obtenir une mini séquence peptidique PPL de 16aa TFLPYGSVINYYGYVK ( SEQ ID NO 1). Un alignement de cette mini séquence avec la banque de données de Genbank a donné 93% d'homologie
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avec une protéine Hap1 de 29,613 Kda dont le gène est constitué de 819 pb (origine Leptospira interrogans lai).
3. Etude et expression du gène PPL
L'ADN génomique de Leptospira interrogans sérovar autumnalis a été préparé par un protocole standard. Cet ADN a été digéré successivement par 4 enzymes de restriction : Bglll, Dral, EcoRI, Hindlll Elles ont été choisies en fonction de la carte de restriction du gène hap1 Une électrophorèse a été réalisée sur cet ADN digéré puis il a été transféré sur une membrane Hybond TM -N+ (Amersham). L'hybridation a été effectuée avec une sonde nucléique dégénérée synthétisée à partir de la mini séquence peptidique Sonde PPL (SEQ ID NO 2) : 5'-GTNATHAAYTAYTAYGGNTAYGTNAAAR -3'
Cette sonde a été radio marquée par du [[gamma]-32P]dATP. L'Hybridation a été réalisée à 39 C durant toute la nuit dans du tampon d'hybridation La membrane de nylon a été ensuite lavée par du SSC (sodium chloride sodium citrate pH 7) 1 % avec 0 1 % de SDS à 39 C La membrane avec la sonde hybridée a été exposée sur un film KodaK à -80
A partir des séquences nucléotidiques PPL, deux amorces nucléotidiques adéquates ont été choisies afin de réaliser des PCR sur l'ADN génomique de Leptospira interrogans sérogroupe Autumnalis La séquence des amorces est donnée ci-dessous :
Amorce 1
5'-ATAAGAATGCGGCCGCATGAAAAAACTTTCGATTTTGGC-3' (SEQ ID No :3) Cette amorce possède une séquence de 16pb (souligné) en 5' pour permettre la création d'un site de restnction Notl utile pour l'insertion du produit d'amplification dans un vecteur d'expression
L'ADN génomique de Leptospira interrogans sérovar autumnalis a été préparé par un protocole standard. Cet ADN a été digéré successivement par 4 enzymes de restriction : Bglll, Dral, EcoRI, Hindlll Elles ont été choisies en fonction de la carte de restriction du gène hap1 Une électrophorèse a été réalisée sur cet ADN digéré puis il a été transféré sur une membrane Hybond TM -N+ (Amersham). L'hybridation a été effectuée avec une sonde nucléique dégénérée synthétisée à partir de la mini séquence peptidique Sonde PPL (SEQ ID NO 2) : 5'-GTNATHAAYTAYTAYGGNTAYGTNAAAR -3'
Cette sonde a été radio marquée par du [[gamma]-32P]dATP. L'Hybridation a été réalisée à 39 C durant toute la nuit dans du tampon d'hybridation La membrane de nylon a été ensuite lavée par du SSC (sodium chloride sodium citrate pH 7) 1 % avec 0 1 % de SDS à 39 C La membrane avec la sonde hybridée a été exposée sur un film KodaK à -80
A partir des séquences nucléotidiques PPL, deux amorces nucléotidiques adéquates ont été choisies afin de réaliser des PCR sur l'ADN génomique de Leptospira interrogans sérogroupe Autumnalis La séquence des amorces est donnée ci-dessous :
Amorce 1
5'-ATAAGAATGCGGCCGCATGAAAAAACTTTCGATTTTGGC-3' (SEQ ID No :3) Cette amorce possède une séquence de 16pb (souligné) en 5' pour permettre la création d'un site de restnction Notl utile pour l'insertion du produit d'amplification dans un vecteur d'expression
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Amorce 2
5'-CCGCTCGAGCTTAGTCGCGTCAGAAGCAGC-3' (SEQ ID No 4) Ce primer possède une séquence de 9 pb (souligné) en 5' qui permet la création d'un site Xhol utile pour l'insertion du fragment PCR dans un vecteur.
5'-CCGCTCGAGCTTAGTCGCGTCAGAAGCAGC-3' (SEQ ID No 4) Ce primer possède une séquence de 9 pb (souligné) en 5' qui permet la création d'un site Xhol utile pour l'insertion du fragment PCR dans un vecteur.
La PCR a été réalisée sur un thermocycleur Perkin Elmer Cetus dans des conditions standards avec les amorces citées ci-dessus 30 cycles ont été effectués, chaque cycle étant constitué du programme suivant : dénaturation (15 sec à 94 C), hybridation (30 sec à 61 C) et élongation (90 sec à 72 C).
L'ADN génomique de Leptospira autumnalis a servi de matrice.
La PCR a permis d'obtenir un produit d'amplification de 841 pb (SEQ ID NO 5, Figure 2). Le produit d'amplification de 841 pb a été purifié par le QIAquick PCR purification Kit (Qiagen) puis digéré par Notl et Xhol Ce fragment a été ligaturé avec le plasmide pET-29b (Novagen, lnc.,Madison,Wis) préalablement digéré par Notl et Xhol pour générer le plasmide identifié pET-29b-PPL (figure 1). Le séquençage complet a été réalisé et une recherche d'homologie a été effectuée sur EXPASY. Les résultats obtenus montrent que le gène PPL (avec Histag) comporte 843 pb et la protéine PPL, de 30,678 Kda, est constituée de 280 acides aminés (SEQ ID NO :6 et 7, Figures 3 et 4)
Un acide nucléique codant la protéine PPL a ensuite été incorporé dans des vecteurs (plasmidiques ou viraux), de manière à permettre la production des polypeptides de l'invention in vitro ou in vivo
Vecteur d'expression procaryote et production de la protéine In vitro
Notre choix s'est porté sur le vecteur plasmidique Pet 29b, qui permet le clonage dans un multisite et l'expression de protéines recombinantes dans
Un acide nucléique codant la protéine PPL a ensuite été incorporé dans des vecteurs (plasmidiques ou viraux), de manière à permettre la production des polypeptides de l'invention in vitro ou in vivo
Vecteur d'expression procaryote et production de la protéine In vitro
Notre choix s'est porté sur le vecteur plasmidique Pet 29b, qui permet le clonage dans un multisite et l'expression de protéines recombinantes dans
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Escherichia coli (souche BL21 DE3). Le gène cible a été cloné dans le plasmide sous le contrôle d'un promoteur procaryote inductible par l'isopropyl- P-thiogalactopyranoside (IPTG). La présence d'une séquence poly-histidine ("Histag") en amont du multisite a permis la détection et la purification de la protéine recombinante
Le vecteur Pet 29b-PPL a été amplifié dans la souche Escherichia coli BL21(DE3) (Novagen,Inc ,Madison,Wis).
Le vecteur Pet 29b-PPL a été amplifié dans la souche Escherichia coli BL21(DE3) (Novagen,Inc ,Madison,Wis).
La protéine recombinante produite peut être mise en évidence par deux types d'anticorps .
- un anticorps anti-histidine dirigé contre l'''His-tag" de la protéine en Cterminal - un anticorps anti-leptospire provenant d'un lapin immunisé par des leptospires vivantes du sérogroupe Autumnalis
Nous avons cherché à produire en quantité importante la protéine recombinante. La protéine recombinante PPL a été produite dans des conditions standards avec un temps d'induction de 180 minutes. Les résultats obtenus montrent la production d'une protéine recombinante de masse moléculaire 32 kD, dont la purification a été réalisée comme suit.
Nous avons cherché à produire en quantité importante la protéine recombinante. La protéine recombinante PPL a été produite dans des conditions standards avec un temps d'induction de 180 minutes. Les résultats obtenus montrent la production d'une protéine recombinante de masse moléculaire 32 kD, dont la purification a été réalisée comme suit.
Le principe de purification des protéines utilisé est basé sur l'interaction spécifique des résidus histidine (His-tag) avec des ions Cobalt.
Les cations divalents Cobalt sont immobilisés sur de la résine. Les rendements étant restés faibles avec ce système de colonne d'affinité, un système similaire utilisant les ions nickel (Ni-NTA spin Kit) a été mis au point, et s'est révélé plus efficace.
La purification, mise au point sur les colonnes polyhistidines (nickel HiTrapTM Chelating Amersham Pharmacia Biotech) a ensuite été réalisée grâce au système FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) pour augmenter le rendement et améliorer la pureté de la protéine recombinante produite.
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Vecteur viral et production de la protéine In vivo
Dans le but d'induire une réponse immune et une protection, l'invention permet l'utilisation d'anticorps ou de polypeptides produits In vitro. Cet exemple montre par ailleurs qu'une réponse immune peut être obtenue par expression in vivo d'un acide nucléique de l'invention, par exemple dans un vecteur viral.
Dans le but d'induire une réponse immune et une protection, l'invention permet l'utilisation d'anticorps ou de polypeptides produits In vitro. Cet exemple montre par ailleurs qu'une réponse immune peut être obtenue par expression in vivo d'un acide nucléique de l'invention, par exemple dans un vecteur viral.
Un acide nucléique codant un polypeptide PPL de l'invention a été inséré dans un adénovirus humain non réplicatif (dans cet exemple un adénovirus de type Ad5 défectif pour la région E1 ) et un essai de protection par ces virus recombinants contre une épreuve virulente a été réalisé.
Préparation des adénovirus
Le plasmide pET-29b-PPL a été digéré par Sali et Nael et le fragment de 1133 pb a été isolé après électrophorèse en gel d'agarose Ce fragment a ensuite été ligaturé avec le plasmide pAd5CMV-linkintron qui a été digéré en premier par Notl et traité ensuite par l'ADN polymérase T4 (pour le rendre bout franc) puis digéré par Sa)). Le plasmide obtenu a ensuite été digéré par Nhel et Hindlll, puis traité par l'ADN polymérase T4 et enfin religaturé sur luimême. Cette construction permet d'apporter au gène PPL, le promoteur CMV (cytomégalovirus), un intron chimérique et le site de polyadénylation du SV40.
Le plasmide pET-29b-PPL a été digéré par Sali et Nael et le fragment de 1133 pb a été isolé après électrophorèse en gel d'agarose Ce fragment a ensuite été ligaturé avec le plasmide pAd5CMV-linkintron qui a été digéré en premier par Notl et traité ensuite par l'ADN polymérase T4 (pour le rendre bout franc) puis digéré par Sa)). Le plasmide obtenu a ensuite été digéré par Nhel et Hindlll, puis traité par l'ADN polymérase T4 et enfin religaturé sur luimême. Cette construction permet d'apporter au gène PPL, le promoteur CMV (cytomégalovirus), un intron chimérique et le site de polyadénylation du SV40.
Ce dernier plasmide a été digéré par Kpstl et Nsil ; le fragment de 4 kb a été isolé après électrophorèse en gel d'agarose puis cotransformé dans des bactéries compétentes BJ5183 avec un plasmide contenant le génome de l'adénovirus humain sérotype 5 défectif.
Cette cotransformation a permis de générer, par recombinaison homologue dans Escherichia. Coli un plasmide contenant le génome de l'adénovirus humain sérotype 5 défectif et le gène PPL Ce plasmide a été désigné pAd5-PPL.
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Les cellules 293 sont transfectées en plaque 6 puits à une densité de confluence de 60 à 80% avec 2 g de pAd5-PPL digéré préalablement par Pacl, dilué en présence de 10 l de lipofectAMINE
Après transfection, les cellules sont laissées en culture pendant quelques jours jusqu'à l'apparition d'un effet cytopathique (ECP) viral. Un nouveau passage en culture de cellules est alors réalisé pour amplifier le virus recombiné obtenu. Celui-ci est alors cloné.
Après transfection, les cellules sont laissées en culture pendant quelques jours jusqu'à l'apparition d'un effet cytopathique (ECP) viral. Un nouveau passage en culture de cellules est alors réalisé pour amplifier le virus recombiné obtenu. Celui-ci est alors cloné.
Le virus recombiné obtenu est cultivé et amplifié en culture de cellules 293. Lorsque l'ECP est complet, les cellules sont récoltées, lysées par 3 cycles de congélation décongélation, puis la suspension virale est clarifiée par centrifugation à basse vitesse. Le virus Ad5-PPL est alors purifié sur gradient de césium (1.34 g/ml) et la bande virale est récoltée.
Un déssalage est effectué sur des colonnes PD10 (Pharmacia 51- 1308-00) ; le virus est récupéré dans du PBS, aliquoté et conservé à - 80 C (avec du glycérol à 10%). Le virus est alors titré et subit un test RCA implication compétent adenovirus).
Essai de protection
L'essai de protection par ces virus recombinants contre une épreuve virulente a été réalisé dans les conditions suivantes
Un protocole de vaccination / épreuve a été mis en #uvre pour évaluer la protection que peut apporter une suspension du virus recombiné Ad5-PPL qui exprime la protéine recombinante PPL (également désignée P32). Deux injections de 109 DECP50 de Ad-PPL sous un volume de 50 l ont été réalisées à trois semaines d'intervalles par voie intramusculaire. Le challenge est réalisé deux semaines plus tard.
L'essai de protection par ces virus recombinants contre une épreuve virulente a été réalisé dans les conditions suivantes
Un protocole de vaccination / épreuve a été mis en #uvre pour évaluer la protection que peut apporter une suspension du virus recombiné Ad5-PPL qui exprime la protéine recombinante PPL (également désignée P32). Deux injections de 109 DECP50 de Ad-PPL sous un volume de 50 l ont été réalisées à trois semaines d'intervalles par voie intramusculaire. Le challenge est réalisé deux semaines plus tard.
Lot PPL : 15 animaux
Témoins absolus : 17 animaux
Témoins absolus : 17 animaux
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Au terme de 21 jours pour l'épreuve virulente (souche canicola virulente), les survies sont les suivantes :
Lot PPL : 13/15 animaux
Témoins absolus : 8/17 animaux.
Lot PPL : 13/15 animaux
Témoins absolus : 8/17 animaux.
Ces résultats montrent clairement que la protéine PPL induit une protection significative Elle a été identifiée à partir d'une souche du sérogroupe Autumnalis, et son gène a permis d'induire une protection contre une épreuve virulente réalisée avec une souche appartenant au sérogroupe Canicola.
Un protocole de vaccination /épreuve a également été mis en oeuvre pour évaluer la protection que peut apporter la protéine recombinante PPL Celle ci est administrée par voie sous cutanée avec un adjuvant Trois injections contenant chacune 20 de protéine recombinante PPL sous un volume de 500 l ont été administrées à deux semaines d'intervalles. Le challenge a été réalisé deux semaines après la dernière injection. Les résultats obtenus confirment l'immunogénicté des polypeptides de l'invention
Ces résultats démontrent que si les antigènes lipopolyosidiques sont bien le support d'une protection efficace vis-à-vis d'une infection hétérologue, point de départ de la constitution des préparations vaccinales employées actuellement tant chez l'homme que chez l'animal, la protéine PPL, employée seule, est capable d'induire une protection croisée entre sérogroupes différents de l'espèce Leptospira interrogans si (Icterohaemorrhagiae, Canicola, Autumnalis). La protection hétérologue peut également être induite entre espèces génomiques différentes de l'ancienne espèce Leptospira interrogans s/ (ici L. borgpetersenii et interrogans ss), alors qu'elle est absente de l'ancienne espèce saprophyte Leptospira biflexa.
Ces résultats démontrent que si les antigènes lipopolyosidiques sont bien le support d'une protection efficace vis-à-vis d'une infection hétérologue, point de départ de la constitution des préparations vaccinales employées actuellement tant chez l'homme que chez l'animal, la protéine PPL, employée seule, est capable d'induire une protection croisée entre sérogroupes différents de l'espèce Leptospira interrogans si (Icterohaemorrhagiae, Canicola, Autumnalis). La protection hétérologue peut également être induite entre espèces génomiques différentes de l'ancienne espèce Leptospira interrogans s/ (ici L. borgpetersenii et interrogans ss), alors qu'elle est absente de l'ancienne espèce saprophyte Leptospira biflexa.
Claims (31)
- REVENDICATIONS 1. Polypeptide comprenant la séquence SEQ ID NO 1
- 2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une protéine de leptospire, notamment d'une protéine membranaire de leptospire, plus préférentiellement d'une souche pathogène de leptospire
- 3. Protéine PPL, ayant un poids moléculaire de 32kD environ et comprenant la séquence SEQ ID NO : 7.
- 4. Polypeptide ou peptide, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'une protéine d'un leptospire pathogène, notamment d'une protéine membranaire d'un leptospire pathogène, ou d'une région d'une telle protéine, et en ce qu'il porte un ou plusieurs épitopes immunogènes à l'encontre de plusieurs souches pathogènes de leptospire.
- 5. Fragment immunogène d'une protéine ou d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4.
- 6. Anticorps reconnaissant une protéine, un polypeptide ou un peptide selon l'une des revendications 1 à 5.
- 7. Anticorps selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est spécifique des leptospires pathogènes.
- 8. Anticorps selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps polyclonal, préparé par immunisation d'un animal avec une protéine, un polypeptide ou un peptide selon l'une des revendications 1 à5
- 9. Anticorps selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps monoclonal.
- 10. Anticorps selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisé en ce qu'il reconnaît la protéine PPL selon la revendication 3 ou un fragment de celle-ci.
- 11. Anticorps selon l'une des revendications 6 à 10, caractérisé en ce qu'il reconnaît au moins deux souches de leptospires pathogènes.
- 12. Fragment ou dérivé d'un anticorps selon l'une des revendications 6 à 11.<Desc/Clms Page number 35>
- 13. Acide nucléique codant un polypeptide, peptide ou une protéine selon l'une des revendications 1 à 5.
- 14. Vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 13.
- 15. Vecteur selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide ou d'un virus recombinant.
- 16. Sonde et/ou amorce nucléotidique, utilisable pour la détection et/ou l'amplification d'acides nucléiques de Leptospires, et notamment pour la détection de la présence d'une souche pathogène de leptospire dans un échantillon test, comprenant tout ou partie d'un acide nucléique selon la revendication 13.
- 17. Sonde selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle est simple- brin et en ce qu'elle est marquée.
- 18. Sonde selon la revendication 16 ou 17, caractérisée en ce qu'elle est spécifique des souches pathogènes de leptospire et réactive avec des sérovars différents de leptospires pathogènes
- 19. Amorce nucléotidique selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle a une longueur inférieure à 40 bases, et en ce qu'elle comprend la séquence d'une partie au moins d'un acide nucléique selon la revendication 13
- 20. Couple d'amorces permettant l'amplification d'une région du gène codant pour la protéine PPL selon la revendication 3.
- 21. Utilisation d'un polypeptide, peptide ou d'une protéine selon l'une des revendications 1 à 5 pour détecter la présence d'anticorps anti-leptospire dans un échantillon test.
- 22. Méthode de détection de la présence d'anticorps anti-leptospire dans un échantillon test, comprenant la mise en contact de cet échantillon (ou une dilution) avec un polypeptide, peptide ou une protéine selon l'une des revendications 1 à 5, et la mise en évidence de la formation de complexes antigène-anticorps.<Desc/Clms Page number 36>
- 23 Utilisation d'un anticorps (ou fragment ou dérivé d'anticorps) selon l'une des revendications 6 à 12 pour la détection de la présence d'une souche pathogène de leptospire dans un échantillon test.
- 24. Méthode de détection de la présence d'une souche pathogène de leptospire dans un échantillon test, comprenant la mise en contact de cet échantillon (ou une dilution) avec un anticorps (ou fragment ou dérivé d'anticorps) selon l'une des revendications 6 à 12, et la mise en évidence de la formation de complexes antigène-anticorps
- 25. Méthode de détection (ou dépistage) de la présence d'une souche pathogène ou d'un fragment d'ADN de leptospire dans un échantillon test comprenant la mise en contact de l'échantillon avec une sonde nucléotidique selon l'une des revendications 16 à 18, et la mise en évidence d'une hybridation entre ladite sonde et ledit échantillon
- 26. Méthode selon la revendication 25, caractérisée en ce que l'échantillon est traité préalablement de manière à rendre les acides nucléiques qu'il contient accessibles à une réaction d'hybridation
- 27. Composition immunogène comprenant un ou plusieurs polypeptide, peptide, protéine, anticorps, acide nucléique ou vecteur selon l'une des revendications 1 à 15
- 28. Utilisation d'un ou plusieurs polypeptide, peptide, protéine, anticorps, acide nucléique ou vecteur selon l'une des revendications 1 à 15 pour la préparation d'une composition immunogène destinée à induire une réponse immune contre plusieurs sérovars de leptospires.
- 29. Composition immunogène ou vaccinale comprenant un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5 ou un acide nucléique selon la revendication 13
- 30. Composition comprenant un anticorps selon l'une des revendications 6 à12.
- 31. Procédé de production d'un polypeptide, peptide ou d'une protéine selon l'une des revendications 1 à 5, comprenant l'expression d'un acide<Desc/Clms Page number 37>nucléique selon la revendication 13 dans une cellule ou un organisme, et la récupération des polypeptide, peptide ou protéine produits.
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