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BE1024361A1 - Composition immunogene - Google Patents

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BE1024361A1
BE1024361A1 BE20165783A BE201605783A BE1024361A1 BE 1024361 A1 BE1024361 A1 BE 1024361A1 BE 20165783 A BE20165783 A BE 20165783A BE 201605783 A BE201605783 A BE 201605783A BE 1024361 A1 BE1024361 A1 BE 1024361A1
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seq
pcrv
sequence
protein
amino acid
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BE20165783A
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BE1024361B1 (fr
Inventor
Christiane Marie Paule Simone Jeanne FERON
Stefan Jochen Kemmler
Michael Thomas Kowarik
Julien Laurent Quebatte
Original Assignee
Glaxosmithkline Biologicals Sa
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Publication date
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Abstract

La présente invention concerne un conjugué comprenant un antigène (par exemple un antigène saccharidique) lié de manière covalente à une protéine porteuse PcrV de Pseudomonas aeruginosa comprenant une séquence d'acides aminés présentant au moins 80 % d'identité avec la séquence des SEQ ID NO : 1 à 4, dans lequel l'antigène est lié (directement ou par l'intermédiaire d'un lieur) à un résidu acide aminé de la protéine porteuse PcrV de P. aeruginosa. L'invention concerne également des protéines PcrV de Pseudomonas aeruginosa qui contiennent des séquences consensus comprenant des sites de glycosylation.

Description

BE2016/5783
COMPOSITION IMMUNOGÈNE
Domaine technique
La présente invention concerne le domaine des compositions immunogènes et vaccins à base de conjugués, leur préparation et l'utilisation de telles compositions en médecine. Plus particulièrement, elle concerne l'utilisation d'une PcrV en tant que nouvelle protéine porteuse issue de Pseudomonas aeruginosa. Une PcrV peut être utilisée comme protéine porteuse d'autres antigènes, en particulier des antigènes saccharidiques ou d'autres antigènes ne présentant pas d'épitope associé aux lymphocytes T. La protéine porteuse PcrV peut agir à la fois comme protéine porteuse et comme antigène elle-même.
Contexte
Voilà longtemps que la conjugaison d'antigènes indépendants des lymphocytes T à des protéines porteuses est une méthode bien établie pour faire participer des lymphocytes T à une réponse immunitaire contre un antigène normalement indépendant des lymphocytes T. De cette manière, une réponse immunitaire peut être accentuée en permettant la mise en place d'une mémoire immunitaire et une réponse mieux stimulée. L'homme du métier sait que des vaccins à base de conjugués, qui ont été développés en conjuguant des saccharides capsulaires bactériens à des protéines porteuses, ont été couronnés de succès ; la protéine porteuse présente l'effet connu de changer l'antigène polysaccharide indépendant des lymphocytes T en un antigène dépendant des lymphocytes T pouvant provoquer une réponse associée à une mémoire immunitaire. En l'occurrence, le document WO 02/58737
BE2016/5783 décrit un vaccin comprenant des polysaccharides capsulaires purifiés issus des sérogroupes A, C, W135 et Y de N. meningitidis conjugués à une protéine porteuse
Plusieurs protéines porteuses sont connues dans l'art, l'anatoxine tétanique, l'anatoxine diphtérique, la CRM197 et la protéine D d'Haemophilus influenzae étant utilisées comme protéine porteuse dans des vaccins commerciaux. Des vaccins ont également employé la toxine diphtérique, et des formes mutantes comme la CRM197, comme support dépendant des lymphocytes T pour des saccharides, efficace et sûr. La CRM197 est actuellement utilisée dans des vaccins conjuguant la CRM197 avec un oligosaccharide d'Haemophilus influenzae de type b (HibTitre® ; Lederle Praxis Biologicals, Rochester, N. Y. ) .
La maladie provoquée par une infection par des souches de Pseudomonas (par exemple P. aeruginosa) constitue une menace considérable de par le monde. Bien que le développement de vaccins contre cette infection soit en cours, on manque encore cruellement de vaccins efficaces contre l'infection par Pseudomonas, et pouvant être produits de manière sûre en grandes quantités.
La présente invention concerne une nouvelle protéine porteuse. La protéine PcrV de Pseudomonas aeruginosa n'est habituellement pas utilisée comme protéine porteuse. La présente invention concerne des conjugués dans lesquels la protéine PcrV sert à la fois de protéine porteuse pour un antigène saccharidique, et agit elle-même comme un antigène, de sorte qu'une réponse immunitaire neutralisante se développe contre la PcrR, et qu'une réponse opsonique se développe contre un LPS.
BE2016/5783
Par conséquent, selon un aspect de la présente invention, celle-ci concerne un conjugué comprenant un antigène lié de manière covalente à une protéine porteuse PcrV de Pseudomonas aeruginosa comprenant une séquence d'acides aminés présentant au moins 80 % d'identité avec la séquence des SEQ ID NO : 1 à 4, l'antigène étant lié (directement ou par l'intermédiaire d'un lieur) à un résidu acide aminé de la protéine porteuse PcrV de P. aeruginosa.
Selon un second aspect de l'invention, celle-ci concerne une protéine PcrV ayant une séquence d'acides aminés présentant au moins 80 % d'identité avec l'une quelconque des SEQ ID NO : 1 à 4, ladite séquence d'acides aminés comprenant une séquence consensus D/EX-N-X-S/T, dans laquelle X représente n'importe quel acide aminé excepté la proline.
Selon un aspect supplémentaire de l'invention, celle-ci concerne une composition immunogène comprenant le conjugué ou les protéines PcrV selon l'invention et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Selon un aspect supplémentaire de l'invention, celle-ci concerne une méthode de préparation d'une composition immunogène selon l'invention, comprenant l'étape de mélange du conjugué ou d'une protéine PcrV selon 1'invention avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Selon un aspect supplémentaire de l'invention, celle-ci concerne un conjugué ou une protéine PcrV selon l'invention destinée à être utilisée dans le traitement d'une infection, et des méthodes de traitement utilisant
BE2016/5783 le conjugué ou la protéine PcrV selon l'invention sont également un aspect supplémentaire de l'invention.
Selon un aspect supplémentaire de l'invention, celle-ci concerne un polynucléotide codant pour une protéine PcrV de P. aeruginosa selon l'invention et un polynucléotide codant pour une protéine PcrV, dont la séquence de nucléotides code pour un polypeptide ayant une séquence d'acides aminés présentant au moins 80 % d'identité avec l'une quelconque des SEQ ID NO : 1 à 4.
Selon un aspect supplémentaire de l'invention, celle-ci concerne un vecteur polynucléotide selon l'invention.
Selon un aspect supplémentaire de l'invention, celle-ci concerne une cellule hôte comprenant :
i) un acide nucléique codant pour une glycosyltransférase ;
ii) un acide comprenant le pour nucléique codant oligosaccharyl-transférase ; et iii) un acide nucléique codant pour une protéine PcrV de P. aeruginosa selon l'invention.
Selon un aspect supplémentaire de l'invention, celle-ci concerne un procédé de production d'un bioconjugué comprenant une protéine PcrV de P. aeruginosa liée à un saccharide, ledit procédé comprenant la culture de la cellule hôte selon 1'invention dans des conditions adaptées à la production de protéines.
Selon un aspect supplémentaire de l'invention, celle-ci concerne un bioconjugué produit par le procédé selon l'invention, ledit bioconjugué comprenant un saccharide lié à une protéine PcrV de P. aeruginosa.
une
BE2016/5783
Description des figures
Figure 1. Transfert de Western d'extraits du périplasme de cellules hôtes modifiées produisant des bioconjugués. Les souches indiquées sont décrites dans les Exemples. « Int » désigne un composant intégré. « * » désigne une intégration par une approche d'induction par un transposon.
Figure 2. Description de l'unité de répétition de l'O-antigène de Pseudomonas aeruginosa 06. * indique des positions dont la composition chimique peut varier en fonction de l'identité du sous-sérotype. Cette variabilité est introduite par l'activité des amidases qui convertissent les fonctions acides des résidus GalNacA en C6 en amides, pour donner du GalNacAN (ou GalNFmA en GalNFmAN ; dans certains sous-sérotypes, un groupe acétyle substitue le résidu GalNAcAN* en C3). Les gènes conduisant à la polymérisation de l'unité de répétition (wzy), à l'acétylation, à la formylation et à l'amidation de l'un des résidus GalNX sont inconnus. L-Rha, L-Rhamnose ; D-GalNAcAN, acide 6-amido-2-Nacétyl-D-galactosaminuronique ; D-GalNFmAN, acide 2-Nformyl-D-galactosaminuronique ; D-QuiNAc, N-acétyl-Dquinosamine.
Figure 3. Test fonctionnel de la formyltransférase de Pseudomonas aeruginosa 06.
3A : Détection de l'unité de répétition unique de 06 formylée liée au noyau lipide A par transfert de Western. Une souche E. coli W3110 Awec a été transformée à l'aide d'un cosmide codant pour l'agrégat rfbO6 (incomplet) et d'un plasmide d'expression codant pour la 06-formyltransférase (fmt06 ; SEQ ID NO : 2) . Des
BE2016/5783 extraits cellulaires ont été récoltés après une nuit d'induction pendant la croissance à 37 °C dans un milieu LB, digérés avec de la protéinase K, séparés par SDSPAGE, et transférés électriquement sur des membranes de nitrocellulose. Un signal induit a été observé, en présence de fmt06, suite à immunodétection réalisée avec un antisérum spécifique de 06, mais pas dans le témoin contenant le vecteur vide. Ce résultat montre clairement que la formylation est un antigène pertinent pour les cellules de P. aeruginosa, ainsi qu'une condition préalable à la détection par cet antisérum.
3B : Confirmation de la formylation sur une unité de répétition unique de 06 libérée à partir d'undécaprénylpyrophosphate. Une souche E. coli W3110 Awec AwaaL a été transformée avec les mêmes plasmides que ci-dessus et mise en croissance dans des flacons d'agitation, afin de produire uniquement des unités de répétitions de l'O-antigène 06 (dans ces souches, la polymérase wzy est absente). Les glycolipides ont ensuite été analysés. En bref, les unités de répétition ont été extraites des cellules séchées, sous forme de glycolipides, purifiées par affinité sur des cartouches C18, hydrolysées (afin d'éliminer 1'undécaprénylpyrophosphate des unités de répétition de l'O-antigène 06), marquées par amination réductrice avec du 2-aminobenzamide, et analysées par CLHP en phase normale. La co-expression de la fmt06 a fait apparaître un signal supplémentaire après 61' d'élution, lequel contenait des oligosaccharides correspondant à l'unité de répétition 06 formylée et marquée, alors qu'en l'absence du gène, le signal principal apparaissait
BE2016/5783 après 58', et contenait l'unité de répétition 06 Nacétylée et marquée.
Figure 4. Test fonctionnel de la polymérase wzy candidate associée au 06 de P. aeruginosa. Des cellules E. coli W3110 Awec contenant un cosmide codant pour l'agrégat rfb (incomplet, privé des gènes fmtO6 et wzy) ont été transformées à l'aide de plasmides codant pour la fmtO6 et la wzy candidate PAK_01823 (SEQ ID NO : 3) ou à l'aide des vecteurs vides correspondants. Les extraits cellulaires ont été traités avec la protéinase K et les LPS ont été analysés par immunodétection suite à une SDS-PAGE et à un transfert électrique sur des membranes de nitrocellulose.
Figure 5. Clonage de l'agrégat d'expression de l'O-antigène artificiel de Pseudomonas aeruginosa 06. Tout d'abord, l'agrégat rfb de la souche stGVXN4017 de P. aeruginosa 06 (souche « PAK » de Pseudomonas aeruginosa 06) a été cloné à l'intérieur d'un vecteur cosmide par clonage PCR à l'aide de techniques standard. Des recherches d'homologies basées sur la bioinformatique ont permis d'identifier la formyltransférase (FT) et la polymérase de l'O-antigène (wzy), qui ont ensuite été insérées l'une après l'autre en aval de l'agrégat rfb. Les agrégats de gènes résultants permettent de réaliser la biosynthèse de l'unité de répétition complète de l'O-antigène 06 de P. aeruginosa (rfbO6 + , pas de polymère) et la biosynthèse du polysaccharide (rfbO6++, dans lequel est compris wzy), dans des dérivés de E. coli W3110.
La figure 6 décrit un transfert de Western d'extraits du périplasme de cellules hôtes modifiées
BE2016/5783 produisant des bioconjugués. Les souches indiquées sont décrites dans les Exemples.
6A : résultats obtenus pour la souche E. coli
« S17 3 4 3 » modifiée pour contenir un pglB intégré et un
agrégat rfb intégré provenant du 06 de P. aeruginosa.
6B : résultats obtenus pour la souche E. coli
« S17 2 0 9 » modifiée pour contenir un pglB porté par un
plasmide et un agrégat rfb intégré provenant du 06 de P.
aeruginosa •
6C : résultats obtenus pour la souche E. coli
« St2182 » modifiée pour contenir un pglB porté par un plasmide et un agrégat rfb porté par un plasmide provenant du 06 de P. aeruginosa.
Figure 7. Glycoconjugué EPA-O6 purifié. Le EPA-O6 a été purifié à partir d'extraits du périplasme de cellules hôtes modifiées par chromatographie d'affinité aux chélates métalliques, chromatographie d'échange d'anions et chromatographie d'exclusion stérique (SEC). L'éluat final de la SEC a été caractérisé par une SDSPAGE suivie d'une coloration au bleu de Coomassie ou d'un transfert de Western utilisant les anticorps indiqués.
Figure 8. Rétention de plasmide (PR) pour les systèmes plasmidiques 1 et 3 en présence ou en l'absence d'une pression de sélection par un antibiotique. La PR s'exprime comme le % des cellules contenant le plasmide correspondant. Les figures A et B montrent la PR du plasmide EPA (Kanamycine, noir) dans des cellules hôtes modifiées pour contenir un agrégat rfb et un pglB intégrés en présence (A) ou en l'absence (B) de kanamycine. Les figures C et D montrent la PR du plasmide
BE2016/5783
EPA (Kanamycine, noir), du plasmide pglB (Spectinomycine, blanc) et du plasmide de l'agrégat rfb (Tétracycline, pointillés) dans des cellules hôtes modifiées en présence (C) et en l'absence (D) des trois antibiotiques. Le pourcentage de cellules dans lesquelles les trois plasmides sont conservés est représenté en gris. Inoc = inoculum ; U = cellules non induites ; 14 = cellules après 6 heures d'induction ; 16 = cellules après induction pendant la nuit.
Figure 9. Activité biologique de l'antisérum anti06 induit par le vaccin.
9A : Titres médians obtenus par ELISA sur des sérums de souris rassemblés à partir des différents groupes de vaccination, suite à la troisième injection. Non ads = sans adjuvant, H/E : indique l'adjuvant utilisé, un adjuvant en émulsion d'huile dans l'eau. H/E seul désigne un groupe témoin qui ne contient pas de glycoconjugué.
9B : Les titres médians d'élimination par opsonophagocytose (induisant une réduction de 50 % des ufc par rapport au témoin) sont indiqués. Les ensembles pli et pill représentent des sérums rassemblés collectés après la deuxième ou la troisième injection.
Figure 10. Taux d'inhibition de l'hémolyse par la PcrV de sérums rassemblés au jour 14 pour pill (jour 42).
Figure 11. Titres d'IgG anti-06 obtenus par ELISA dans des sérums individuels, 14 jours après II (jour 42).
Figure 12. Titres d'opsonophagocytose anti-06 dans des sérums individuels, 14 jours après III (jour 24).
Figure 13. Titres d'IgG anti-PcrV obtenus par ELISA dans des sérums de rats 14 jours après II (jour 28) et 14 jours après III (jour 42).
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Figure 14. Titres d'IgG anti-06 obtenus par ELISA dans des sérums de rats rassemblés 14 jours après III ( j our 42) .
Description détaillée
La présente invention concerne un conjugué comprenant un antigène lié de manière covalente à une protéine porteuse PcrV de Pseudomonas aeruginosa comprenant une séquence d'acides aminés présentant au moins 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité avec la séquence des SEQ ID NO : 1 à 4, l'antigène étant lié (directement ou par l'intermédiaire d'un lieur) à un résidu acide aminé de la protéine porteuse PcrV de P. aeruginosa.
Dans un mode de réalisation, le résidu acide aminé auquel est lié l'antigène n'est pas un résidu asparagine, et dans ce cas le conjugué est typiquement produit par conjugaison chimique, dont de nombreux procédés sont bien connus dans l'art. Par exemple, l'acide aminé est choisi dans le groupe constitué par : Ala, Arg, Asp, Cys, Gly, Glu, Gin, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, et Val. L'acide aminé est éventuellement : un acide aminé comprenant un groupe terminal amino, une lysine une arginine, un acide glutamique, un acide aspartique, une cystéine, une tyrosine, une histidine, une arginine, ou un tryptophane.
Dans un mode de réalisation, l'antigène est lié de manière covalente à une protéine porteuse PcrV de Pseudomonas aeruginosa au moyen d'une liaison chimique pouvant être obtenue à l'aide d'un procédé de conjugaison chimique.
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Dans un mode de réalisation, le procédé de conjugaison chimique est choisi dans le groupe constitué par la chimie des carbodiimides, l'amination réductrice, la chimie des cyanylations (la chimie CDAP par exemple), la chimie des maléimides, la chimie des hydrazides, la chimie des esters, et la chimie des Nhydroxysuccinimides. Éventuellement, l'antigène est lié de manière covalente à un acide aminé acide aspartique, acide glutamique, lysine cystéine, tyrosine, histidine, arginine, ou tryptophane sur la protéine porteuse PcrV de P. aeruginosa.
Dans un mode de réalisation, l'antigène est lié directement à la protéine porteuse PcrV de P. aeruginosa.
Dans un mode de réalisation, l'antigène est lié à la protéine porteuse PcrV de P. aeruginosa par l'intermédiaire d'un lieur. Éventuellement, le lieur est choisi dans le groupe constitué par les lieurs contenant 4 à 12 atomes de carbone, les lieurs bifonctionnels, les lieurs contenant 1 ou 2 groupes amino réactifs à leurs extrémités, le B-propionamide, la nitrophényl-éthylamine, les halogénures d'haloacyle, l'acide 6-aminocaproïque et 1'ADH.
En général, les types de groupes chimiques présents sur une protéine porteuse suivants peuvent être utilisés pour effectuer un couplage/une conjugaison :
A) Carboxyle (par exemple ceux d'un acide aspartique ou d'un acide glutamique) . Dans un mode de réalisation, ce groupe est directement lié à des groupes amino présents sur les saccharides ou sur des groupes amino d'un lieur, grâce à la chimie des carbodiimides, par exemple avec l'EDAC.
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B) Groupe amino (par exemple celui d'une lysine) . Dans un mode de réalisation, ce groupe est directement lié à des groupes carboxyle présents sur les saccharides ou sur des groupes carboxyle d'un lieur, grâce à la chimie des carbodiimides, par exemple avec l'EDAC. Dans un autre mode de réalisation, ce groupe est directement lié à des groupes hydroxyle présents sur les saccharides, activés à l'aide de CDAP ou de CNBr ou sur ces mêmes groupes appartenant à un lieur ; à des saccharides ou des lieurs présentant un groupe aldéhyde ; à des saccharides ou des lieurs présentant un groupe ester de succinimide.
C) Sulfhydryle (par exemple celui d'une cystéine). Dans un mode de réalisation, ce groupe est lié à un saccharide ou à un lieur bromo- ou chloroacétylé grâce à la chimie des maléimides. Dans un mode de réalisation, ce groupe est activé/modifié par une bis-diazobenzidine.
D) Groupe hydroxyle (par exemple celui d ' une
tyrosine) . Dans un mode de réalisation, ce groupe est
activé/modifié par une bis-diazobenzidine.
E) Groupe imidazolyle (par exemple celui d ' une
histidine). Dans un mode de réalisation, ce groupe est
activé/modifié par une bis-diazobenzidine.
F) Groupe guanidyle (par exemple celui d ' une
arginine).
G) Groupe indolyle (par exemple celui d ' un
tryptophane) .
En général, les groupes présents sur un saccharide suivants peuvent être utilisés pour un couplage : OH, COOH ou NH2. Les groupes aldéhyde peuvent être générés par différents traitements connus dans l'art, tels que
BE2016/5783 par : le periodate, l'hydrolyse acide, le peroxyde d'hydrogène, etc.
Approches de couplage direct :
Saccharide-OH + CNBr ou CDAP ----> ester de cyanate + NEfi-Prot ----> conjugué
Aldéhyde de saccharide + NEQ-Prot ----> Base de
Schiff + NaCNBPh ----> conjugué
Saccharide-COOH + NEfi-Prot + EDAC ----> conjugué
Saccharide-NEQ + COOH-Prot + EDAC ----> conjugué
Approches de couplage indirect par l'intermédiaire d'un espaceur (lieur) :
Saccharide-OH + CNBr ou CDAP ----> ester de cyanate + NH2----NH2----> saccharide----NH2 + COOH-Prot + EDAC
----> conjugué
Saccharide-OH + CNBr ou CDAP ----> ester de cyanate + NH2----SH----> saccharide----SH + SH-Prot (protéine native dont une cystéine est exposée, ou obtenue après modification de groupes amino de la protéine par le SPDP par exemple)----> saccharideS-S-Prot
Saccharide-OH + CNBr ou CDAP ----> ester de cyanate + NH2----SH ----> saccharide----SH + maléimide-Prot (modification de groupes amino) ----> conjugué
Saccharide-COOH + EDAC + NH2----NH2---> saccharide---NH2 + EDAC + COOH-Prot----> conjugué
Saccharide-COOH + EDAC+ NH2----SH ---> saccharide---SH + SH-Prot (protéine native dont une cystéine est exposée, ou obtenue après modification de groupes amino
BE2016/5783 de la protéine par le SPDP par exemple)----> saccharideS-S-Prot
Saccharide-COOH + EDAC+ NH2----SH----> saccharide---SH + maléimide-Prot (modification de groupes amino)
----> conjugué
Aldéhyde de saccharide + NH2----NH2 ---->
saccharide---NH2 + EDAC + COOH-Prot----> conjugué
Remarque : N'importe quel carbodiimide approprié peut être utilisé à la place de 1'EDAC ci-dessus.
Dans un mode de réalisation, le conjugué selon l'invention contient un résidu acide aminé auquel est lié l'antigène, le résidu acide aminé étant un résidu asparagine.
Dans un mode de réalisation, le résidu asparagine ne fait pas partie de la séquence consensus D/E-X-N-XS/T introduite dans la séquence d'acides aminés qui présente au moins 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité avec la séquence des SEQ ID NO : 1 à 4, X représentant n'importe quel acide aminé excepté la proline.
Cependant, dans un mode de réalisation
supplémentaire, le résidu asparagine fait partie de la
séquence consensus D/E-X-N-X-S/T introduite dans la
séquence d'acides aminés qui présente au moins 50 0 O r
60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 0 θ r
98 %, 99 % ou 100 % d'identité avec la séquence des
SEQ ID NO : 1 à 4, X représentant n'importe quel acide
aminé excepté la proline, le résidu asparagine étant situé à une position correspondant aux acides aminés 23 à 166, ou aux acides aminés 281 à 317, ou à l'acide aminé
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317 de la SEQ ID NO : 3. Par exemple, 24 à 100, les acides aminés 24 à 50, 310 à 317.
les acides aminés les acides aminés
Dans un mode de réalisation, le résidu asparagine fait partie de la séquence consensus D/E-X-N-X-S/T introduite dans la séquence d'acides aminés qui présente au moins 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité avec la séquence des SEQ ID NO : 1 à 4, X représentant n'importe quel acide aminé excepté la proline, le résidu asparagine étant situé entre les acides aminés 1 et 143, ou les acides aminés 258 et 294, ou au niveau de l'acide aminé 294 de la SEQ ID NO : 4. Par exemple, au niveau des acides aminés 1 à 100, ou des acides aminés 1 à 50, ou des acides aminés 1 à 25, ou des acides aminés 290 à 294 de la SEQ ID NO : 4.
Dans un mode de réalisation, le résidu asparagine fait partie de la séquence consensus D/E-X-N-X-S/T, X représentant n'importe quel acide aminé excepté la proline, le résidu asparagine n'étant pas introduit par une mutation dans la séquence de la SEQ ID NO : 5, ou une séquence présentant au moins 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité avec la SEQ ID NO : 5.
Dans un mode de réalisation, un peptide comprenant la séquence consensus D/E-X-N-X-S/T est introduit dans la séquence d'acides aminés par l'élimination d'une séquence du peptide PcrV et son remplacement par le peptide comprenant une séquence consensus D/E-X-N-X-S/T. Dans un mode de réalisation, la séquence du peptide PcrV
BE2016/5783 éliminée contient de 1 à 7 acides aminés ou 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou un acide aminé.
Dans un mode de réalisation, le peptide comprenant la séquence consensus D/E-X-N-X-S/T est introduit dans la séquence d'acides aminés à une position située entre les résidus acides aminés 23 et 166 de la SEQ ID NO : 3 ou entre les résidus acides aminés 1 et 143 de la SEQ ID NO : 4 ou à une position située entre les résidus acides aminés 23 et 100 ou 23 et 50 de la SEQ ID NO : 3, ou entre les résidus acides aminés 1 et 100, 1 et 50 ou 1 et 24 de la SEQ ID NO : 4.
Dans un mode de réalisation, au moins 1, 2, 3, 4 ou 5 séquences consensus D/E-X-N-X-S/T sont introduites dans la séquence correspondant à l'une quelconque des
SEQ ID NO : 1 à 4 ou dans une séquence présentant au
moins 50 %, 60 % , 70 %, 80 %, 85 %, 90 % , 92 %, 95 O O r
96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité avec 1'une de
celles-ci.
Dans un mode de réalisation, la protéine porteuse PcrV présente une séquence comprenant au moins l'une des SEQ ID NO : 6 à 62, par exemple les SEQ ID NO : 6 à 12 et 33 .
Dans un mode de réalisation, la protéine porteuse PcrV présente une séquence comprenant au moins 1, 2, 3, 4 ou 5 des SEQ ID NO : 6 à 12 et 33. éventuellement au moins 3 des SEQ ID NO : 6 à 12 et 33.
Dans un mode de réalisation, la protéine porteuse PcrV présente une séquence comprenant la SEQ ID NO : 6 et/ou la SEQ ID NO : 9 et/ou la SEQ ID NO : 11 et/ou la SEQ ID NO : 33.
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Dans un mode de réalisation, l'antigène est un saccharide du type saccharide capsulaire bactérien, un lipopolysaccharide ou un lipooligosaccharide bactérien.
Les saccharides peuvent être choisis dans un groupe comprenant : le saccharide capsulaire du sérogroupe A de N. meningitidis (MenA), le saccharide capsulaire du sérogroupe C de N. meningitidis (MenC), le saccharide capsulaire du sérogroupe Y de N. meningitidis (MenY), le saccharide capsulaire du sérogroupe W de N. meningitidis (MenW), le saccharide capsulaire de H. influenzae de type b (Hib) , le saccharide capsulaire du groupe I du groupe B des Streptococcus, le saccharide capsulaire du groupe II du groupe B des Streptococcus, le saccharide capsulaire du groupe III du groupe B des Streptococcus, le saccharide capsulaire du groupe IV du groupe B des Streptococcus, le saccharide capsulaire du groupe V du groupe B des Streptococcus, le saccharide capsulaire de
Staphylococcus aureus de type 5, le saccharide
capsulaire de Staphylococcus aureus de type 8, le
saccharide vi de Salmonella typhi, un LPS (tel que L3
et/ou L2) de N . meningitidis, un LPS de M. catarrhalis,
un LPS de H. influenzae, des O-antigènes de Shigella, des O-antigènes de P. aeruginosa, des O-antigènes de E. coli et parmi tous les saccharides de pneumocoque comme ceux correspondant au sérotype : 1, 2, 3, 4, 5,
6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F ou 33F.
Dans un mode de réalisation, l'antigène est un lipopolysaccharide provenant de P. aeruginosa. Éventuellement, l'antigène est un O-antigène provenant de P. aeruginosa, éventuellement 01, 02, 03, 04, 05, 06,
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07, 08, 09, OIO, Oll, 012, 013, 014, 015, 016, 017, 018, 019 ou 020, par exemple 06 ou 011. Dans un mode de réalisation, celle-ci concerne un bioconjugué comprenant une protéine porteuse PcrV liée à un O-antigène de Pseudomonas aeruginosa, ledit O-antigène de Pseudomonas aeruginosa étant l'un des sérotypes décrits par Knirel et al., 2006, Journal of Endotoxin Research 12(6) : 324336, ladite publication étant incorporée ici en référence dans son intégralité. Dans des modes de réalisation spécifiques, l'O-antigène de P. aeruginosa est 06 ou 011.
Dans un aspect supplémentaire de l'invention, celle-ci concerne une protéine PcrV dont une séquence d'acides aminés présente au moins 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité avec la séquence des SEQ ID NO : 1 à 4, ladite séquence d'acides aminés comprenant une séquence consensus D/E-X-N-X-S/T, X représentant n'importe quel acide aminé excepté la proline.
Dans un mode de réalisation, la séquence consensus D/E-X-N-X-S/T dans laquelle X représente n'importe quel acide aminé excepté la proline, est à une position située entre les acides aminés 23 et 166, ou les acides aminés 281 et 317, ou au niveau de l'acide aminé 317 de la SEQ ID NO : 3.
Dans un mode de réalisation, la séquence consensus D/E-X-N-X-S/T dans laquelle X représente n'importe quel acide aminé excepté la proline, est située entre les acides aminés 1 et 143, ou les acides aminés 258 et 294, ou au niveau de l'acide aminé 294 de la SEQ ID NO : 4.
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Dans un mode de réalisation, un peptide comprenant la séquence consensus D/E-X-N-X-S/T est introduit dans la séquence d'acides aminés par l'élimination d'une séquence du peptide PcrV et son remplacement par un peptide comprenant la séquence consensus D/E-X-N-X-S/T. Dans un mode de réalisation, la séquence du peptide PcrV contient de 1 à 7 acides aminés, éventuellement 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou un acide aminé.
Dans un mode de réalisation, le peptide comprenant la séquence consensus D/E-X-N-X-S/T est introduit dans la séquence d'acides aminés à une position située entre les résidus acides aminés 23 et 166 de la SEQ ID NO : 3 ou entre les résidus acides aminés 1 et 143 de la SEQ ID NO : 4.
Dans un mode de réalisation, le peptide comprenant la séquence consensus D/E-X-N-X-S/T est introduit dans la séquence d'acides aminés à une position située entre les résidus acides aminés 23 et 100 ou 23 et 48 de la SEQ ID NO : 3, ou entre les résidus acides aminés 1 et 75 ou 1 et 24 de la SEQ ID NO : 4.
Dans un mode de réalisation, au moins 2, 3 ou 4 séquences consensus D/E-X-N-X-S/T, ou exactement 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 séquences consensus D/E-X-N-X-S/T sont introduites dans la séquence correspondant à l'une quelconque des SEQ ID NO : 1 à 4 ou dans une séquence présentant au moins 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité avec l'une de celles-ci.
Dans un mode de réalisation, la protéine PcrV présente une séquence d'acides aminés comprenant au moins l'une des SEQ ID NO : 6 à 62, éventuellement au
BE2016/5783 moins l'une des SEQ ID NO : 6 à 12 et 33, éventuellement au moins 3 des SEQ ID NO : 6 à 12 et 33.
Dans un mode de réalisation, la protéine PcrV selon 1'invention présente une séquence d'acides aminés comprenant la SEQ ID NO : 6 et/ou la SEQ ID NO : 9 et/ou la SEQ ID NO : 11 et/ou la SEQ ID NO : 33.
Dans un mode de réalisation, les protéines porteuses PcrV utilisées pour produire les bioconjugués de la présente invention comprennent un « marqueur », c'est-à-dire une séquence d'acides aminés permettant d'isoler et/ou d'identifier la protéine porteuse. Par exemple, l'ajout d'un marqueur à une protéine porteuse de la présente invention peut se révéler utile lors de la purification de cette protéine, et par conséquent lors de la purification des vaccins à base de conjugués comprenant la protéine porteuse marquée. Des exemples de marqueurs pouvant être utilisés selon l'invention comprennent, sans s'y limiter, les marqueurs à histidines (His-tag) (par exemple le marqueur hexahistidine, ou marqueur 6xHis-tag), le marqueur FLAG, et les marqueurs HA. Dans certains modes de réalisation, les marqueurs utilisés selon l'invention sont labiles, et peuvent par exemple être retirés par des agents chimiques ou par des moyens enzymatiques, lorsqu'ils ne sont plus utiles, par exemple une fois que la protéine a été purifiée.
Dans certains modes de réalisation, les protéines porteuses de la présente invention comprennent une séquence signal qui dirige la protéine porteuse vers le périplasme de la cellule hôte qui exprime la protéine porteuse. Dans un mode de réalisation spécifique, la
BE2016/5783 séquence signal provient de la DsbA d'E. coli, de la porine A de la membrane externe (OmpA) d'E. coli, de la protéine de liaison du maltose (MalE) d'E. coli, de la pectine-lyase (PelB) d'Erwinia carotovorans, de Flgl, de NikA, ou de 1'endoxylanase (XynA) des espèces de Bacillus, de l'entérotoxine thermolabile LTIIb d'E. coli, de 1'endoxylanase XynA de Bacillus, ou de la flagelline (Flgl) d'E. coli. Dans un mode de réalisation, la protéine PcrV selon l'invention comprend une séquence de tête capable de diriger la protéine PcrV vers le périplasme de la bactérie. Éventuellement, la séquence de tête est une séquence d'acides aminés présentant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité avec la SEQ ID NO : 63. Dans un mode de réalisation, un résidu alanine est ajouté entre la séquence de tête et le début de la séquence de la protéine mature. Un tel résidu alanine a pour avantage d'induire un clivage plus efficace de la séquence de tête.
Dans un mode de réalisation, la protéine PcrV selon 1'invention a une séquence d'acides aminés comprenant un marqueur peptidique pouvant servir à la purification de la protéine PcrV. Éventuellement, le marqueur peptidique est situé à l'extrémité C-terminale de la séquence d'acides aminés. Éventuellement, le marqueur peptidique comprend six résidus histidine.
Dans un aspect supplémentaire de l'invention, celle-ci concerne un procédé de préparation d'une composition immunogène selon l'invention, comprenant l'étape de mélange du conjugué ou de la protéine PcrV avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.
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Les protéines PcrV et les conjugués selon l'invention sont particulièrement appropriés comme composants de compositions immunogènes et de vaccins. Un procédé selon 1 ' invention peut par conséquent comprendre l'étape de formulation de la protéine PcrV ou du conjugué sous la forme d'une composition immunogène ou d'un vaccin Dans un aspect supplémentaire de l'invention, celle-ci concerne une composition immunogène comprenant le conjugué selon l'invention ou la protéine PcrV selon 1'invention et un excipient pharmaceutiquement acceptable. La composition immunogène selon l'invention peut en outre comprendre des antigènes supplémentaires. Voici des exemples de tels antigènes supplémentaires : un conjugué d'un O-antigène et d'une protéine porteuse, un conjugué d'un polysaccharide capsulaire bactérien et d'une protéine porteuse, un conjugué d'un LOS, d'une protéine porteuse et d'une protéine. Parmi les conjugués appropriés on peut trouver 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 des 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, OlO, 011, 012, 013, 014, 015, 016, 017, 018, 019 ou 020 de P. aeruginosa Parmi les protéines appropriées on trouve en outre les protéines de P. aeruginosa, comme par exemple 1 ' Exoprotéine A de P. aeruginosa ou l'un de ses variants, tels que ceux décrits dans le document W0 13/36 574, l'OmpI, OmpF ou PopB de P. aeruginosa (YpoB, YopD, FliC) ou des protéines hybrides OprF-OmpI (voir les documents US 5 955 090 ou US 6 300 102).
Des compositions immunogènes et des vaccins selon 1'invention comprennent typiquement des « excipients pharmaceutiquement acceptables » lesquels incluent tout excipient qui n'induit pas lui-même la production
BE2016/5783 d'anticorps nocifs pour l'individu auquel est administrée la composition. Les compositions contiennent également typiquement un diluant, par exemple de l'eau, une solution saline, du glycérol, etc. De plus, elles peuvent contenir des substances auxiliaires, telles que des agents mouillants ou émulsifiants, des tampons de pH, des polyols et équivalents.
Les compositions comprenant les conjugués ou les protéines PcrV de la présente invention peuvent inclure tout composant dont l'utilisation est appropriée à une administration pharmaceutique. Dans des modes de réalisation spécifiques, les compositions de la présente invention sont des formulations monovalentes. Dans d'autres modes de réalisation, les compositions de la présente invention sont des formulations multivalentes, par exemple des formulations bivalentes, trivalentes et tétravalentes. Par exemple, une formulation multivalente comprend plus d'un antigène, par exemple plus d'un conj ugué.
Dans certains modes de réalisation, les compositions de la présente invention comprennent en plus un conservateur, par exemple le thimérosal, un dérivé mercuriel. Dans un mode de réalisation spécifique, les compositions pharmaceutiques de la présente invention comprennent de 0,001 % à 0,01 % de thimérosal. Dans d'autres modes de réalisation, les compositions pharmaceutiques de la présente invention ne comprennent pas de conservateur.
Dans certains modes de réalisation, les compositions de la présente invention (les compositions immunogènes par exemple) comprennent, ou sont
BE2016/5783 administrées en association avec un adjuvant. Lorsqu'il est administré en association avec la composition, l'adjuvant de la présente invention peut être administré avant, au même moment, ou après l'administration de ladite composition. Dans certains modes de réalisation, le terme « adjuvant » désigne un composé qui, lorsqu'il est administré conjointement à la composition de la présente invention, ou lorsqu'il en est un des constituants, augmente, améliore et/ou stimule la réponse immunitaire envers un bioconjugué, mais qui, lorsqu'il est administré seul, ne génère aucune réponse immunitaire envers le bioconjugué. Dans certains modes de réalisation, l'adjuvant provoque une réponse immunitaire contre le conjugué ou la protéine PcrV, et ne provoque ni allergie, ni autre réaction néfaste. Les adjuvants peuvent améliorer la réponse immunitaire par le biais de plusieurs mécanismes, y compris, par exemple, le recrutement des lymphocytes, la stimulation des lymphocytes B et/ou T, et la stimulation des macrophages.
Des exemples spécifiques d'adjuvants comprennent, sans s'y limiter, les sels d'aluminium (aluns) (comme 1'hydroxyde d'aluminium, le phosphate d'aluminium, et le sulfate d'aluminium), le monophosphoryl-lipide A (MPL) 3-dé-O-acylé (voir le brevet anglais GB2220211), le MF59 (Novartis), l'AS03 (GlaxoSmithKline), l'AS04 (GlaxoSmithKline), le polysorbate 80 (Tween 80 ; ICL Americas, Inc.), les composés imidazopyridine (voir la demande de brevet international No. PCT/US 2007/064 857, publiée sous le numéro de publication international WO 2007/109 812), les composés imidazoquinoxaline (voir la demande de brevet international
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No. PCT/US 2007/064 858, publiée sous le numéro de publication international WO 2007/109 813) et les saponines, comme la QS2 (voir Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds
Plenum & Newman,
U.S. Pat. No. 5 057 540) , réalisation, l'adjuvant
Powell
1995) ; modes de de Freund
Press, NY,
Dans certains est 1'adj uvant (complet ou incomplet). Parmi les adjuvants, on compte également les émulsions d'huile dans l'eau (comprenant du squalène ou de l'huile d'arachides), éventuellement associé à d'autres stimulants du système immunitaire, tel que le monophosphoryl-lipide A (voir Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Le CpG est un autre adjuvant possible (Bioworld Today, Nov. 15, 1998).
Dans certains modes de réalisation, la formulation des compositions de la présente invention est adaptée à la voie d'administration souhaitée pour un patient. Par exemple, la formulation des compositions de la présente invention peut être adaptée à une administration par voie sous-cutanée, parentérale, orale, intradermique, transdermique, colorectale, intrapéritonéale ou rectale. Dans un mode de réalisation spécifique, la formulation des compositions pharmaceutiques peut être adaptée à une administration par voie intraveineuse, orale, intrapéritonéale, intranasale, intratrachéale, sous-cutanée, intramusculaire, topique, intradermique, transdermique ou pulmonaire.
Dans certains modes de réalisation, les compositions de la présente invention comprennent en plus un ou plusieurs tampons, par exemple un tampon phosphate et un tampon saccharose-phosphate-glutamate.
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Dans d'autres modes de réalisation, les compositions de la présente invention ne comprennent pas de tampons.
Dans certains modes de réalisation, les compositions de la présente invention comprennent en plus un ou plusieurs sels, par exemple du chlorure de sodium, du chlorure de calcium, du phosphate de sodium, du glutamate monosodique et des sels d'aluminium (par exemple 1'hydroxyde d'aluminum, le phosphate d'aluminium, l'alun (sulfate d'aluminium et de potassium), ou un mélange de ces sels d'aluminium). Dans d'autres modes de réalisation, les compositions de la présente invention ne comprennent pas de sels.
Les compositions de la présente invention peuvent être contenues dans un récipient, un emballage ou un distributeur, associées à des instructions concernant leur administration.
Les compositions de la présente invention peuvent être stockées avant utilisation : elles peuvent par exemple être stockées congelées (par exemple à environ -20 °C ou à environ -70 °C) ; stockées dans des conditions réfrigérées (par exemple à environ 4 °C) ; ou stockées à température ambiante.
Les compositions immunogènes utilisées comme vaccins comprennent une quantité immunologiquement efficace de la protéine PcrV ou du conjugué selon l'invention, ainsi que tout autre composant nécessaire. L'expression « quantité immunologiquement efficace » signifie que l'administration de cette quantité à un individu, soit en dose unique, soit faisant partie d'une série, est efficace pour le traitement ou la prévention. Cette quantité est variable, et dépend de la santé et de
BE2016/5783 la condition physique de l'individu à traiter, de son âge, du degré de protection souhaité, de la formulation du vaccin et d'autres facteurs pertinents. On s'attend à ce que cette quantité soit comprise dans un intervalle relativement large qui peut être déterminé au cours d'essais de routine.
Les vaccins de la présente invention incluent de préférence des adjuvants. Parmi les adjuvants appropriés, on compte un sel d'aluminium tel qu'un gel d'hydroxyde d'aluminium (alun) ou de phosphate d'aluminium, mais également un sel de calcium, de magnésium, de fer ou de zinc, ou également une suspension insoluble de tyrosine acylée, ou des sucres acylés, des dérivés cationiques ou anioniques de polysaccharides, ou des polyphosphazènes.
Il est préférable que le choix des adjuvants se porte sur un inducteur favorisant une réponse de type Thl ou Th2. Des niveaux élevés de cytokines de type Thl tendent à favoriser, pour un antigène donné, l'induction de réponses immunitaires s'appuyant sur des cellules, alors que des niveaux élevés de cytokines de type Th2 tendent à favoriser, pour l'antigène, l'induction de réponses immunitaires humorales.
Il est important de se rappeler que la distinction n'est pas absolue entre les réponses immunitaires de type Thl et Th2. En réalité, la réponse immunitaire développée par un individu peut être décrite comme majoritairement de type Thl ou majoritairement de type Th2. Cependant, il est souvent plus pratique de considérer les familles de cytokines en se basant sur celles décrites dans des clones de lymphocytes T CD4 +ve murins par Mosmann et Coffman (Mosmann, T.R. and Coffman,
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R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, pl45-173). Traditionnellement, les réponses se type Thl sont associées à la production par les lymphocytes T de cytokines INF-γ et IL-2. D'autres cytokines, qui ne sont pas produites par les lymphocytes T, sont souvent directement associées à l'induction de réponses immunitaires de type Thl, comme par exemple l'IL-12. Par contre, les réponses de type Th2 sont associées à la sécrétion d'IL-4, d'IL-5, d'IL-6, ou d'IL-10. Les systèmes d'adjuvants favorisant une prédominance de la réponse Thl comprennent : le monophosphoryl-lipide A ou un de ses dérivés, en particulier le monophosphoryllipide A 3-dé-O-acylé (3D-MPL) (concernant sa préparation, voir le document GB 2220211 A) ; et une combinaison d'un monophosphoryl-lipide A, de préférence le monophosphoryl-lipide A 3-dé-O-acylé, et d'un sel d'aluminium (par exemple le phosphate d'aluminium ou 1'hydroxyde d'aluminium) ou une émulsion d'huile dans l'eau. Dans de telles associations, l'antigène et le 3D-MPL sont inclus dans les mêmes structures particulaires, ce qui permet une présentation plus efficace des signaux antigéniques et immunostimulants. Des études ont montré que le 3D-MPL est capable d'améliorer encore plus le caractère immunogène d'un antigène adsorbé sur un alun [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16 : 708-14 ; EP 689 454-B1].
Un système amélioré contient un monophosphoryllipide A associé à un dérivé de saponine, en particulier la QS21 associée au 3D-MPL, tel que décrit dans le
BE2016/5783 document WO 94/00 153, ou une composition moins réactogène dans laquelle la QS21 est atténuée avec un cholestérol, tel que décrit dans le document WO 96/33 739. Le document WO 95/17 210 décrit une formulation d'adjuvant particulièrement puissante comprenant la QS21, le 3D-MPL et du tocophérol dans une émulsion d'huile dans l'eau, laquelle est une formulation préférée. De préférence, le vaccin contient en plus une saponine, de manière davantage préférée la QS21. La formulation peut également comprendre une émulsion d'huile dans l'eau et du tocophérol (WO 95/17210). La présente invention concerne également un procédé de production d'une formulation de vaccin comprenant le mélange d'une protéine de la présente invention avec un excipient pharmaceutiquement acceptable, comme par exemple le 3D-MPL. D'autres inducteurs préférés de la réponse Thl sont les CpG non méthylés contenant des oligonucléotides (WO 96/02 555), lesquels sont appropriés pour une utilisation selon la présente invention.
Les compositions selon l'invention peuvent contenir une émulsion d'huile dans l'eau. En effet, celles-ci semblent être utiles comme composants d'adjuvants (EP 399 843 ; WO 95/17 210). Il est possible d'utiliser des émulsions d'huile dans l'eau telles que celles décrites dans le document WO 95/17 210 (qui décrit des émulsions d'huile dans l'eau comprenant de 2 à 10 % de squalène, de 2 à 10 % d'alpha-tocophérol et de 0,3 à 3 % de tween 80, et leur utilisation seules ou en association avec la QS21 et/ou le 3D-MPL), le document WO 99/12 565 (qui décrit des compositions d'émulsions d'huile dans
BE2016/5783 l'eau comprenant une huile pouvant être métabolisée, une saponine et un stérol, et du MPL) ou le document WO 99/11 241. D'autres émulsions d'huile dans l'eau, décrites document également appropriées.
Les préparations de vaccins selon la présente invention peuvent être utilisées pour protéger ou en ou telles que WO 09/127 676 celles et le dans le document WO 09/127 677, sont traiter un mammifère sujet une infection, administrant ledit vaccin par voie systémique mucosale. Ces administrations peuvent comprendre l'injection par voie intramusculaire, intrapéritonéale, intradermique ou sous-cutanée ; ou par voie mucosale, via le tractus oral/alimentaire, respiratoire ou urogénital. Pour le traitement de pneumonie ou d'otite, l'administration intranasale de vaccin est préférée (car le transport rhinopharyngé des pneumocoques peut alors être efficacement limité, ce qui atténue l'infection à un stade précoce). Bien que le vaccin selon l'invention puisse être administré en dose unique, ses composants peuvent également être administrés conjointement en même temps ou à des moments différents (par exemple, les polysaccharides de pneumocoque pourraient être administrés séparément, en même temps ou 1 à 2 semaines après l'administration d'une protéine bactérienne de la composition, pour coordonner de manière optimale les réponses immunitaires l'une par rapport à l'autre). En cas de co-administration, l'adjuvant Thl éventuel peut être présent dans tout ou partie des différentes administrations, cependant, il est préférable qu'il soit présent en association avec une protéine bactérienne de
BE2016/5783 la composition de vaccin. Outre une voie d'administration unique, il est possible d'utiliser 2 voies d'administration différentes. Par exemple, les polysaccharides peuvent être administrés par voie IM (ou ID) et les protéines bactériennes peuvent être administrées par voie IN (ou ID) . De plus, les vaccins selon l'invention peuvent être administrés par voie IM pour les doses de sensibilisation et par voie IN pour les doses de rappel.
La quantité d'antigène conjugué dans chaque dose de vaccin est choisie pour être suffisante pour induire une réponse immunitaire protectrice sans induire d'effets secondaires indésirables typiques des vaccins. Cette quantité sera différente selon l'immunogène spécifique utilisé et selon la manière dont il est présenté. De manière générale, chaque dose devrait contenir de 0,1 à 100 pg de polysaccharide, de préférence de 0,1 à 50 pg pour les conjugués de polysaccharides, de préférence de 0,1 à 10 pg, de manière davantage préférée de 1 à 10 pg, l'intervalle de 1 à 5 pg étant d'autant plus préféré.
La teneur en antigènes protéiques dans le vaccin sera typiquement dans l'intervalle de 1 à 100 pg, de préférence de 5 à 50 pg, de manière préférée entre toutes dans l'intervalle de 5 à 25 pg. Suite à une vaccination initiale, les patients peuvent recevoir une ou plusieurs immunisations de rappel à intervalles de temps appropriés.
La préparation des vaccins est décrite de manière générale dans le document Vaccine Design (The subunit and adjuvant approach (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). L'encapsulation à
BE2016/5783 l'intérieur de liposomes est décrite par Fullerton, publication de brevet US 4 235 877.
Les vaccins selon la présente invention peuvent être stockés en solution ou lyophilisés. De préférence, la solution est lyophilisée en présence d'un sucre tel que le saccharose, le tréhalose ou le lactose. Il est d'autant plus préférable qu'ils soient lyophilisés et reconstitués immédiatement avant utilisation.
Dans un mode de réalisation, le conjugué ou la protéine PcrV selon 1'invention sont destinés à être utilisés dans le traitement d'une infection, en particulier dans le traitement d'une infection par P. aeruginosa, par exemple pour un patient humain qui en aurait besoin.
Dans un aspect supplémentaire de l'invention, celle-ci concerne un polynucléotide codant pour la protéine PcrV selon l'invention. Par exemple, un polynucléotide codant pour une protéine PcrV, dont la séquence de nucléotides code pour un polypeptide dont la
séquence d'acides aminés présente au moins 50 o θ r 60 %,
70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 o θ r 98 %,
99 % ou 100 % d'identité avec la séquence de 1 ' une
quelconque des SEQ ID NO : 1 à 4. Dans un aspect
supplémentaire de l'invention, celle-ci concerne un vecteur comprenant un tel polynucléotide.
Dans un aspect supplémentaire de l'invention,
celle-ci concerne une cellule hôte comprenant :
i) un acide nucléique codant pour une
glycosyltransférase ;
ii) un acide nucléique codant pour une
oligosaccharyl-transférase ; et
BE2016/5783 iii) un acide nucléique codant pour une protéine PcrV de P. aeruginosa selon l'invention.
Une cellule hôte procaryote ainsi modifiée comprend des acides nucléiques codant pour des enzymes capables de produire un bioconjugué comprenant un antigène, par exemple un antigène saccharide attaché à la protéine PcrV. De telles cellules hôtes peuvent exprimer naturellement des acides nucléiques spécifiques à la production d'un antigène saccharide, ou les cellules hôtes peuvent être conçues pour exprimer de tels acides nucléiques. Autrement dit, dans certains modes de réalisation, lesdits acides nucléiques sont hétérologues par rapport aux cellules hôtes. Dans certains modes de réalisation, au moins un desdits acides nucléiques spécifiques à la production d'un antigène saccharide est hétérologue par rapport à la cellule hôte et intégré dans le génome de la cellule hôte. Dans certains modes de réalisation, les cellules hôtes selon la présente invention comprennent des acides nucléiques codant pour des enzymes supplémentaires, dont l'activité est la N-glycosylation de protéines, les cellules hôtes selon 1'invention comprenant par exemple en outre un acide nucléique codant pour une oligosaccharyl-transférase et/ou pour au moins un acide nucléique codant pour d'autres glycosyltransférases. Dans certains modes de réalisation, les cellules hôtes selon la présente invention comprennent un acide nucléique codant pour une protéine porteuse, par exemple une protéine à laquelle des oligosaccharides et/ou des polysaccharides peuvent être liés pour former un bioconjugué. Dans un mode de réalisation spécifique, la cellule hôte est E. coli.
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Les séquences d'acide nucléique comprenant les agrégats de gènes rfb pouvant être insérés dans les cellules hôtes de la présente invention sont connues dans l'art. Dans un mode de réalisation spécifique, l'agrégat de gène rfb inséré dans une cellule hôte de la présente invention est un agrégat de gène rfb provenant de E. coli, par exemple un agrégat de gène rfb d'E. coli provenant de n'importe quel sérogroupe O/O-antigène connu dans l'art, par exemple 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, OlO, 011, 012, 013, 014, 015, 016, 017, 018, 019, 020, 021, 022, 023, 024, 025, 026, 027, 028, 029, 030, 032, 033, 034, 035, 036, 037, 038, 039, 040, 041, 042, 043, 044, 045, 046, 048, 049, 050, 051, 052, 053, 054, 055, 056, 057, 058, 059, 060, 061, 062, 063, 064, 065, 066, 068, 069, 070, 071, 073, 074, 075, 076, 077, 078, 079, 080, 081, 082, 083, 084, 085, 086, 087, 088, 089, 090, 091, 092, 093, 095, 096, 097, 098, 099, OlOO, O101, 0102, 0103, 0104, 0105, 0106, 0107, 0108, 0109, OllO, OUI, 0112, 0113, 0114, 0115, 0116, 0117, 0118, 0119, 0120, 0121, 0123, 0124, 0125, 0126, 0127, 0128, 0129, 0130, 0131, 0132, 0133, 0134, 0135, 0136, 0137, 0138, 0139, 0140, 0141, 0142, 0143, 0144, 0145, 0146, 0147, 0148, 0149, 0150, 0151, 0152, 0153, 0154, 0155, 0156, 0157, 0158, 0159, 0160, 0161, 0162, 0163, 0164, 0165, 0166, 0167, 0168, 0169, 0170, 0171, 0172, 0173, 0174, 0175, 0176, 0177, 0178, 0179, 0180, 0181, 0182, 0183, 0184, 0185, 0186, ou 0187, et les sous-sérotypes associés. Dans un autre mode de réalisation spécifique, l'agrégat de gène rfb inséré dans une cellule hôte de la présente invention est un agrégat de gène rfb provenant d'une souche de Pseudomonas (par exemple une souche de
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P. aeruginosa), d'une souche de Salmonella (par exemple une souche de S. enterica), d'une souche de Yersinia, d'une souche de Klebsiella pneumoniae, d'une souche de Francisella (par exemple F. tularensis), d'une souche d'Acinetobacter baumannii, d'une souche de Burkholderia, ou d'une souche de Shigella.
Les séquences d'acide nucléique comprenant les agrégats de gènes de polysaccharide capsulaire pouvant être insérés dans les cellules hôtes de la présente invention sont connues dans l'art. Dans un mode de réalisation spécifique, l'agrégat de gène de polysaccharide capsulaire inséré dans une cellule hôte de la présente invention est un agrégat de gène de polysaccharide capsulaire provenant d'une souche d'E. coli, d'une souche de Streptococcus (par exemple
S. pneumoniae, S. pyrogenes, S. agalacticae), d'une souche de Staphylococcus (par exemple S. aureus) , ou d'une souche de Burkholderia (par exemple B. mallei, B. pseudomallei, B. thailandensis). Des méthodes permettant de fabriquer de telles cellules hôtes, capables de produire des conjugués, sont décrites dans les documents WO 06/119 987, WO 09/104 074, WO 11/62 615, WO 11/138 361, WO 14/57 109, WO 14/72 405.
Dans un mode de réalisation spécifique, la présente invention concerne une cellule hôte procaryote modifiée comprenant des acides nucléiques codant pour des enzymes capables de produire un bioconjugué comprenant un antigène saccharide, ladite cellule hôte comprenant un agrégat rfb provenant de Pseudomonas ou une glycosyltransférase dérivée d'un agrégat rfb provenant de Pseudomonas. Dans un mode de réalisation spécifique,
BE2016/5783 ledit agrégat rfb provenant de Pseudomonas, ou une glycosyltranférase dérivée d'un agrégat rfb provenant de Pseudomonas, est intégré dans le génome de ladite cellule hôte. Dans un autre mode de réalisation spécifique, ledit agrégat rfb provenant de Pseudomonas, ou une glycosyltranférase dérivée d'un agrégat rfb provenant de Pseudomonas, est un agrégat rfb provenant de Pseudomonas aeruginosa .
Dans un autre mode de réalisation spécifique, ladite cellule hôte comprend un acide nucléique codant pour une oligosaccharyl-transférase (par exemple la pglB de Camphylobacter jejuni}. Dans un autre mode de réalisation spécifique, ledit acide nucléique codant pour une oligosaccharyl-transférase (par exemple la pglB de Camphylobacter jejuni} est intégré dans le génome de la cellule hôte. Dans un mode de réalisation spécifique, ladite cellule hôte comprend un acide nucléique codant pour une protéine porteuse. Dans un autre mode de réalisation spécifique, la cellule hôte est E. coli.
Dans un autre mode de réalisation spécifique, la présente invention concerne une cellule hôte procaryote modifiée comprenant (i) un agrégat rfb provenant de Pseudomonas, ledit agrégat rfb étant intégré dans le génome de ladite cellule hôte ; (ii) un acide nucléique codant pour une oligosaccharyl-transférase (par exemple la pglB de Camphylobacter jejuni}, ledit acide nucléique codant pour une oligosaccharyl-transférase étant intégré dans le génome de la cellule hôte ; et (iii) une protéine porteuse, ladite protéine porteuse étant soit portée par un plasmide, soit intégrée dans le génome de ladite cellule hôte. Dans un autre mode de réalisation
BE2016/5783 spécifique, ledit agrégat rfb provenant de Pseudomonas est un agrégat rfb provenant de Pseudomonas aeruginosa. Dans un autre mode de réalisation spécifique, la cellule hôte est E. coli.
Dans un autre mode de réalisation spécifique, la présente invention concerne une cellule hôte procaryote modifiée comprenant (i) une glycosyltranférase dérivée d'un agrégat rfb provenant de Pseudomonas, ladite glycosyltransférase étant intégré dans le génome de ladite cellule hôte ; (ii) un acide nucléique codant pour une oligosaccharyl-transférase (par exemple la pglB de Camphylobacter jejuni}, ledit acide nucléique codant pour une oligosaccharyl-transférase étant intégré dans le génome de la cellule hôte ; et (iii) une protéine porteuse, ladite protéine porteuse étant soit portée par un plasmide, soit intégrée dans le génome de ladite cellule hôte. Dans un autre mode de réalisation spécifique, ladite glycosyltranférase dérivée d'un agrégat rfb provenant de Pseudomonas est un agrégat rfb provenant de Pseudomonas aeruginosa. Dans un autre mode de réalisation spécifique, la cellule hôte est E. coli.
Dans un mode de réalisation spécifique, l'agrégat rfb provenant de Pseudomonas, ou une glycosyltranférase dérivée d'un agrégat rfb provenant de Pseudomonas, est un agrégat rfb ou une glycosyltransférase provenant de Pseudomonas aeruginosa. Dans un autre mode de réalisation spécifique, ledit agrégat rfb provenant de Pseudomonas, ou une glycosyltranférase dérivée d'un agrégat rfb provenant de Pseudomonas, est un agrégat rfb ou une glycosyltransférase provenant des sérotypes 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 010, 011, 012, 013, 014,
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015, 016, 017, 018, 019, ou 020 de Pseudomonas aeruginosa Dans un autre mode de réalisation spécifique, ledit agrégat rfb provenant de Pseudomonas aeruginosa est l'agrégat rfb de l'un quelconque des sérotypes décrits par Knirel et al., 2006, Journal of Endotoxin Research 12(6) : 324-336, ladite publication étant incorporée ici en référence dans son intégralité. Dans un mode de réalisation spécifique, ledit agrégat rfb provenant de Pseudomonas, ou une glycosyltranférase dérivée d'un agrégat rfb provenant de Pseudomonas, est un agrégat rfb ou une glycosyltransférase provenant de la souche de sérotype 06 PAK de Pseudomonas aeruginosa. Dans un mode de réalisation spécifique, ledit agrégat rfb provenant de Pseudomonas, ou une glycosyltranférase dérivée d'un agrégat rfb provenant de Pseudomonas, est un agrégat rfb ou une glycosyltransférase provenant du sérotype 011 de Pseudomonas aeruginosa, par exemple de la souche PA103 de Pseudomonas aeruginosa (voir par exemple Genbank Accession No. KF364633.1) . Dans un mode de réalisation spécifique, les gènes codant pour une enzyme formyltransférase (GenBank : EOT23134.1 ; NCBI protein ID : PAK_01412 ; SEQ ID NO : 2) et une polymérase wzy (GenBank : EOT19368.1 ; NCBI protein ID : PAK_01823 ; SEQ ID NO : 3) sont introduits (par le biais d'un plasmide ou par intégration par exemple) en plus dudit agrégat rfb provenant de la souche de sérotype 06 PAK de Pseudomonas aeruginosa afin d'y introduire une extension fonctionnelle.
Dans un mode de réalisation spécifique, une cellule hôte procaryote modifiée selon la présente invention comprend un acide nucléique codant pour une
BE2016/5783 formyltransférase. Dans un autre mode de réalisation spécifique, ladite formyltransférase est la f ormyltransf érase présentée dans la SEQ ID NO : 65, ou une homologue de celle-ci. Dans un autre mode de réalisation spécifique, ladite formyltransférase est incorporée (insérée par exemple dans le génome ou exprimée par le biais d'un plasmide) dans ladite cellule hôte en tant que partie d'un agrégat rfb de Pseudomonas, ledit agrégat rfb de Pseudomonas ayant été modifié pour comprendre la formyltransférase. Dans un autre mode de réalisation spécifique, ledit agrégat rfb de Pseudomonas est un agrégat rfb du sérotype 06 de Pseudomonas aeruginosa .
Dans un autre mode de réalisation spécifique, une cellule hôte procaryote modifiée selon la présente invention comprend un acide nucléique codant pour une polymérase wzy. Dans un autre mode de réalisation spécifique, ladite polymérase wzy est la polymérase wzy présentée dans la SEQ ID NO : 66, ou une homologue de celle-ci. Dans un autre mode de réalisation spécifique, ladite polymérase wzy est incorporée (insérée par exemple dans le génome ou exprimée par le biais d'un plasmide) dans ladite cellule hôte en tant que partie d'un agrégat rfb de Pseudomonas, ledit agrégat rfb de Pseudomonas ayant été modifié pour comprendre la polymérase wzy. Dans un autre mode de réalisation spécifique, ledit agrégat rfb de Pseudomonas est un agrégat rfb du sérotype 06 de Pseudomonas aeruginosa.
Dans un autre mode de réalisation spécifique, une cellule hôte procaryote modifiée selon la présente invention comprend (i) un acide nucléique codant pour
BE2016/5783 une formyltransférase et (ii) un acide nucléique codant pour une polymérase wzy. Dans un mode de réalisation spécifique, ladite formyltransférase est la f ormyltransférase présentée dans la SEQ ID NO : 65, ou une homologue de celle-ci présentant au moins 85 %, 90 % ou 95 % d'identité avec la SEQ ID NO : 65. Dans un autre mode de réalisation spécifique, ladite polymérase wzy est la polymérase wzy présentée dans la SEQ ID NO : 66, ou une homologue de celle-ci présentant au moins 85 %, 90 % ou 95 % d'identité avec la SEQ ID NO : 66. Dans un mode de réalisation spécifique, ladite formyltransférase et ladite polymérase wzy sont incorporées (insérée par exemple dans le génome ou exprimée par le biais d'un plasmide) dans ladite cellule hôte en tant que partie d'un agrégat rfb de Pseudomonas, ledit agrégat rfb de Pseudomonas ayant été modifié pour comprendre la f ormyltransférase et la polymérase wzy. Dans un autre mode de réalisation spécifique, ledit agrégat rfb de Pseudomonas est un agrégat rfb du sérotype 06 de Pseudomonas aeruginosa.
Les acides nucléiques codant pour les formyltransférases et les acides nucléiques codant pour les polymérases wzy qui sont utilisés pour générer les agrégats rfb de Pseudomonas modifiées, comme par exemple les agrégats rfb du sérotype 06 de Pseudomonas aeruginosa modifié, peuvent être insérés dans les agrégats rfb à de multiples positions et dans de multiples orientations.
Dans un mode de réalisation spécifique, le gène codant pour ladite formyltransférase et/ou le gène codant pour ladite polymérase wzy est/sont inséré (s) en aval des gènes de l'agrégat rfb de Pseudomonas, par
BE2016/5783 exemple l'agrégat rfb du sérotype 06 de Pseudomonas aeruginosa. Dans un mode de réalisation spécifique, le gène codant pour ladite formyltransférase et/ou le gène codant pour ladite polymérase wzy est/sont inséré (s) en aval du gène wbpM de l'agrégat rfb du sérotype 06 de Pseudomonas aeruginosa.
Dans un mode de réalisation spécifique, le gène codant pour ladite formyltransférase et/ou le gène codant pour ladite polymérase wzy est/sont inséré (s) en amont des gènes de l'agrégat rfb de Pseudomonas, par exemple l'agrégat rfb du sérotype 06 de Pseudomonas aeruginosa. Dans un mode de réalisation spécifique, le gène codant pour ladite formyltransférase et/ou le gène codant pour ladite polymérase wzy est/sont inséré (s) en aval du gène wzz de l'agrégat rfb du sérotype 06 de Pseudomonas aeruginosa.
Dans un mode de réalisation spécifique, le gène codant pour ladite formyltransférase et/ou le gène codant pour ladite polymérase wzy est/sont inséré (s) dans le sens des aiguilles d'une montre par rapport aux gènes de l'agrégat rfb de Pseudomonas, par exemple l'agrégat rfb du sérotype 06 de Pseudomonas aeruginosa.
Dans un mode de réalisation spécifique, le gène codant pour ladite formyltransférase et/ou le gène codant pour ladite polymérase wzy est/sont inséré (s) dans le sens inverse des aiguilles d'une montre par rapport aux gènes de l'agrégat rfb de Pseudomonas, par exemple l'agrégat rfb du sérotype 06 de Pseudomonas aeruginosa .
Dans un mode de réalisation spécifique, la présente invention concerne une cellule hôte procaryote modifiée
BE2016/5783 comprenant des acides nucléiques codant pour des enzymes capables de produire un bioconjugué comprenant un antigène 06 de Pseudomonas. Dans un mode de réalisation spécifique, ladite cellule hôte comprend l'agrégat rfb du sérotype 06 de Pseudomonas aeruginosa, un acide nucléique codant pour une polymérase wzy, et une formyltransférase. Dans un mode de réalisation spécifique, la polymérase wzy est la polymérase wzy de P. aeruginosa (SEQ ID NO : 66), ou une homologue de celle-ci (la polymérase wzy de la souche PAK ou LESB58 de Pseudomonas aeruginosa par exemple) . Dans un autre mode de réalisation spécifique, la formyltransférase est la formyltransférase de P. aeruginosa 06 (SEQ ID NO : 65), ou une homologue de celle-ci (la formyltransférase de la souche PAK ou LESB58 de Pseudomonas aeruginosa par exemple). Dans certains modes de réalisation, au moins un acide nucléique codant pour l'agrégat rfb, la polymérase wzy, et/ou la formyltransférase est intégré dans le génome de la cellule hôte, par exemple à l'aide d' un procédé de la présente invention. Dans un mode de réalisation spécifique, chacun des acides nucléiques codant pour l'agrégat rfb, la polymérase wzy et la formyltransférase, est intégré dans le génome de la cellule hôte, par exemple à l'aide d' un procédé de la présente invention. Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte comprend en outre un acide nucléique codant pour une oligosaccharyl-transférase (par exemple la pglB de Camphylobacter jejuni}, ledit acide nucléique codant pour une oligosaccharyl-transférase étant soit porté par un plasmide, soit intégré dans le génome de la cellule
BE2016/5783 hôte ; et un acide nucléique codant pour une protéine porteuse, ledit acide nucléique codant pour ladite protéine porteuse étant soit porté par un plasmide, soit intégré dans le génome de la cellule hôte. Dans un mode de réalisation spécifique, ledit acide nucléique codant pour ladite oligosaccharyl-transférase est intégré dans le génome de la cellule hôte.
Contexte Génétique
Des exemples de cellules hôtes qui peuvent être employées pour générer les cellules hôtes modifiées selon la présente invention comprennent, sans s'y limiter, les espèces d'Escherichia, les espèces de Shigella, les espèces de Klebsiella, les espèces de Xhantomonas, les espèces de Salmonella, les espèces de Yersinia, les espèces de Lactococcus, les espèces de Lactobacillus, les espèces de Pseudomonas, les espèces de Corynebacterium, les espèces de Streptomyces, les espèces de Streptococcus, les espèces de Staphylococcus, les espèces de Bacillus, et les espèces de Clostridium. Dans un mode de réalisation spécifique, la cellule hôte selon l'invention est E. coli.
Dans certains modes de réalisation, le contexte génétique de la cellule hôte est par exemple modifié par une délétion d'au moins un gène. Des exemples de gènes dont la délétion peut être effectuée dans les cellules hôtes (et dans certains cas, qui peuvent être remplacés par d'autres séquences d'acide nucléique souhaitées) comprennent les gènes des cellules hôtes impliqués dans la biosynthèse des glycolipides, tels que waaL (voir par exemple Feldman et al., 2005, PNAS USA 102 : 3016-3021),
BE2016/5783 l'agrégat de l'O-antigène (rfb ou wb), des agrégats d'antigènes communs chez les entérobactéries (wec), l'agrégat permettant la synthèse du noyau du lipide A (waa), et les agrégats permettant la modification de l'O-antigène prophage, tels que l'agrégat gtrABS. Dans un mode de réalisation spécifique, les cellules hôtes selon la présente invention sont modifiées de telle sorte qu'elles ne produisent aucun autre antigène que ceux souhaités, parmi les O-antigènes de Pseudomonas par exemple. Dans un mode de réalisation spécifique, on effectue la délétion ou la désactivation fonctionnelle d'au moins un gène parmi le gène waaL, le gène gtrA, le gène gtrB, le gène gtrS, ou d'au moins un des gènes de l'agrégat wec, ou d'au moins un des gènes de l'agrégat de gènes rfb présents dans le génome d'une cellule hôte procaryote selon l'invention. Dans un mode de réalisation, une cellule hôte utilisée selon l'invention est E. coli, dans laquelle on effectue la délétion ou l'inactivation fonctionnelle du gène waaL, du gène gtrA, du gène gtrB, du gène gtrS présents dans le génome de la cellule hôte. Dans un autre mode de réalisation, une cellule hôte utilisée selon l'invention est E. coli, dans laquelle on effectue la délétion ou l'inactivation fonctionnelle du gène waaL et du gène gtrS présents dans le génome de la cellule hôte. Dans un autre mode de réalisation, une cellule hôte utilisée selon l'invention est E. coli, dans laquelle on effectue la délétion ou l'inactivation fonctionnelle du gène waaL et de gènes de l'agrégat wec présent dans le génome de la cellule hôte.
Protéines porteuses
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Toute protéine porteuse appropriée pour une utilisation dans la production de vaccins conjugués (par exemple des bioconjugués pouvant être utilisés dans les vaccins) peut être utilisée selon l'invention : des acides nucléiques codant pour la protéine porteuse peuvent par exemple être introduits chez un hôte selon l'invention, afin de produire un bioconjugué comprenant une protéine porteuse liée à un antigène de Pseudomonas. Des exemples de protéines porteuses comprennent, sans s'y limiter, 1'Exotoxine A détoxifiée de P. aeruginosa (EPA ; voir par exemple Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61), la CRM197, la protéine de liaison du maltose (MBP), l'anatoxine diphtérique, l'anatoxine tétanique, 1'hémolysine A détoxifiée de S. aureus, le facteur d'agglutination A, le facteur d'agglutination B, la FimH d'E. coli, la FimC d'E. coli, l'entérotoxine thermolabile d'E. coli, les variants détoxifiés de l'entérotoxine thermolabile d'E. coli, la toxine cholérique B (CTB), la toxine cholérique, les variants détoxifiés de la toxine cholérique, la protéine Sat d'E. coli, le domaine clone d'ADN de la protéine Sat d'E. coli, la pneumolysine de Streptococcus pneumoniae et ses variants détoxifiés, l'AcrA de C. jejuni, la protéine PcrV de Pseudomonas, et les glycoprotéines naturelles de C. jejuni. La protéine PcrV est utilisée dans de nombreux modes de réalisation de l'invention.
Dans des modes de réalisation spécifiques, les protéines porteuses exprimées par les cellules hôtes modifiées selon l'invention sont exprimées à partir d'un acide nucléique qui a été intégré dans le génome de la cellule hôte modifiée. Cela signifie qu'un acide
BE2016/5783 nucléique codant pour une protéine porteuse a été intégré dans le génome de la cellule hôte. Dans certains modes de réalisation, les protéines porteuses exprimées par les cellules hôtes modifiées selon l'invention sont exprimées à partir d'un plasmide qui a été introduit dans la cellule hôte modifiée.
Dans certains modes de réalisation, les protéines porteuses pour produire les bioconjugués de la présente invention sont modifiées, par exemple modifiées de telle sorte que la protéine est moins toxique et/ou moins sujette à des glycosylations. Dans un mode de réalisation spécifique, les protéines porteuses utilisées pour produire les bioconjugués selon l'invention sont modifiées de sorte à maximiser le nombre de sites de glycosylation sur les protéines porteuses afin de permettre l'administration de concentrations inférieures de la protéine, par exemple dans une composition immunogène, sous sa forme de bioconjugué.
Dans certains modes de réalisation, les protéines porteuses selon l'invention sont modifiées pour comprendre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus de sites de glycosylation supplémentaires par rapport à ceux normalement associés à la protéine porteuse (par rapport au nombre de sites de glycosylation associés à la protéine porteuse dans son état natif/naturel par exemple, ou son état « de type sauvage ») . Dans des modes de réalisation spécifiques, l'introduction des sites de glycosylation est effectuée par le biais de l'insertion de séquences consensus de glycosylation (comme par exemple Asn-X-Ser(Thr), X représentant n'importe quel acide aminé excepté Pro ; ou Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr),
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X et Z étant choisis indépendamment parmi tous les acides aminés naturels, excepté Pro (voir le document WO 2006/119987)) à n'importe quel emplacement de la structure primaire de la protéine. L'introduction de tels sites de glycosylation peut être effectuée en ajoutant par exemple de nouveaux acides aminés à la structure primaire de la protéine (ce qui revient à ajouter tout ou partie des sites de glycosylation), ou en faisant muter les acides aminés existant dans la protéine, afin de générer les sites de glycosylation (autrement dit, les acides aminés ne sont pas ajoutés à la protéine, mais des acides aminés choisis parmi ceux de la protéine subissent une mutation, afin de former des sites de glycosylation). L'homme du métier reconnaîtra que la séquence d'acides aminés d'une protéine peut être aisément modifiée par des approches connues dans l'art, comme par exemple des approches par recombinaison qui comprennent la modification de la séquence d'acides nucléiques codant pour la protéine. Dans des modes de réalisation spécifiques, les séquences consensus de glycosylation sont introduites dans des régions spécifiques de la protéine porteuse, comme par exemple les structures de surface de la protéine, aux extrémités C-terminale ou N-terminale de la protéine, et/ou dans les boucles qui sont stabilisées par des ponts disulfure à la base des protéines. Dans certains modes de réalisation, la séquence consensus classique de glycosylation comprenant 5 acides aminés peut être étendue à l'aide de résidus lysine, pour rendre la glycosylation plus efficace, la séquence consensus insérée pouvant alors coder pour 5, 6 ou 7 acides aminés
BE2016/5783 qui peuvent être insérés ou qui remplacent les acides aminés de la protéine accepteur.
Dans certains modes de réalisation, les protéines porteuses utilisées pour produire les bioconjugués de la présente invention comprennent un « marqueur », c'està-dire une séquence d'acides aminés permettant d'isoler et/ou d'identifier la protéine porteuse. Par exemple, l'ajout d'un marqueur à une protéine porteuse de la présente invention peut se révéler utile lors de la purification de cette protéine, et, par conséquent, lors de la purification des vaccins à base de conjugués comprenant la protéine porteuse marquée. Des exemples de marqueurs pouvant être utilisés selon l'invention comprennent, sans s'y limiter, les marqueurs à histidines (His-tag) (par exemple le marqueur hexahistidine, ou marqueur 6xHis-tag), le marqueur FLAG, et les marqueurs HA. Dans certains modes de réalisation, les marqueurs utilisés selon l'invention sont labiles, et peuvent par exemple être retirés par des agents chimiques ou par des moyens enzymatiques, lorsqu'ils ne sont plus utiles, par exemple une fois que la protéine a été purifiée.
Dans certains modes de réalisation, les protéines porteuses de la présente invention comprennent une séquence signal qui dirige la protéine porteuse vers le périplasme de la cellule hôte qui exprime la protéine porteuse. Dans un mode de réalisation spécifique, la séquence signal provient de la DsbA d'E. coli, de la porine A de la membrane externe (OmpA) d' E. coli, de la protéine de liaison du maltose (MalE) d' E. coli, de la pectine-lyase (PelB) d'Erwinia carotovorans, de Flgl, de
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NikA, ou de 1'endoxylanase (XynA) des espèces de Bacillus, de l'entérotoxine thermolabile LTIIb d' E. coli, de 1'endoxylanase XynA de Bacillus, ou de la flagelline (Figl) d' E. coli.
Machinerie de glycosylation
Oligosaccharyl-transférases
Les oligosaccharyl-transférases transfèrent des oligosaccharides liés par des lipides sur les résidus asparagine de chaînes polypeptidiques naissantes qui comprennent un motif consensus de N-glycoxylation, comme par exemple Asn-X-Ser(Thr), X représentant n'importe quel acide aminé excepté Pro ; ou Asp(Glu)-X-Asn-ZSer(Thr), X et Z étant choisis indépendamment parmi tous les acides aminés naturels, excepté Pro (voir le document WO 2006/119 987) . Voir par exemple les documents WO 2003/074 687 et WO 2006/119 987, lesdites publications étant incorporées ici en référence dans leur intégralité.
Dans certains modes de réalisation, les cellules hôtes selon la présente invention comprennent un acide nucléique codant pour une oligosaccharyl-transférase. L'acide nucléique codant pour une oligosaccharyltransférase peut être natif dans la cellule hôte, ou peut être introduit dans la cellule hôte par des approches utilisant la génétique, comme décrit ci-dessus. L'oligosaccharyl-transférase peut provenir de n'importe quelle source connue dans l'art. Dans un mode de réalisation spécifique, 1'oligosaccharyl-transférase est une oligosaccharyl-transférase provenant de Campylobacter. Dans un autre mode de réalisation
BE2016/5783 spécifique, 1'oligosaccharyl-transférase est une oligosaccharyl-transférase provenant de Campylobacter jejuni, (c'est-à-dire la pglB, voir par exemple Wacker et al., 2002, Science 298 : 1790-1793 ; voir également NCBI Gene ID : 3 231 775, UniProt Accession No. 086154) . Dans un autre mode de réalisation spécifique, 1'oligosaccharyl-transférase est une oligosaccharyltransférase provenant de Campylobacter lari, (voir par exemple NCBI Gene ID : 7 410 986).
Dans un mode de réalisation spécifique, les cellules hôtes modifiées selon la présente invention comprennent une séquence d'acide nucléique codant pour une oligosaccharyl-transférase, ladite séquence d'acide nucléique codant pour une oligosaccharyl-transférase étant intégrée dans le génome de la cellule hôte.
Enzymes auxiliaires
Dans certains modes de réalisation, on introduit dans les cellules hôtes modifiées selon l'invention des acides nucléiques codant pour au moins une enzyme auxiliaire. De tels acides nucléiques codant pour au moins une enzyme auxiliaire peuvent être soit portés par un plasmide, soit intégrés dans le génome de la cellule hôte. Des exemples d'enzymes auxiliaires comprennent, sans s'y limiter, les épimérases, les enzymes de ramification, modification, amidation, régulation de la longueur de chaîne, acétylation, formylation, polymérisation.
Les séquences d'acide nucléique codant pour des épimérases pouvant être insérés dans les cellules hôtes de la présente invention sont connues dans l'art. Dans
BE2016/5783 certains modes de réalisation, l'épimérase insérée dans la cellule hôte selon l'invention est une épimérase décrite dans la publication de brevet international No. WO 2011/062 615, ladite publication étant incorporée ici en référence dans son intégralité. Dans un mode de réalisation spécifique, l'épimérase est l'épimérase pour laquelle code le gène Z3206 de la souche 0157 d'E. coli. Voir par exemple le document WO 2011/062 615 et Rush et al., 2009, The Journal of Biological Chemistry 285 : 1671-1680, lequel est incorporé ici en référence dans son intégralité. Dans un mode de réalisation spécifique, les cellules hôtes modifiées selon la présente invention comprennent une séquence d'acide nucléique codant pour une épimérase, ladite séquence d'acide nucléique codant pour une épimérase étant intégrée dans le génome de la cellule hôte.
Dans certains modes de réalisation, une séquence d'acide nucléique codant pour une formyltransférase est insérée dans une cellule hôte selon l'invention ou exprimée par celle-ci. Les formyltransférases sont des enzymes catalysant le transfert des groupes formyle à une molécule accepteur. Dans un mode de réalisation spécifique, une séquence d'acide nucléique codant pour la formyltransférase de Pseudomonas aeruginosa 06 (fmtO6) (SEQ ID NO : 65) , ou une homologue de celle-ci, est insérée dans une cellule hôte selon l'invention ou exprimée par celle-ci. Dans un autre mode de réalisation spécifique, une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine présentant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % d'identité ou d'homologie avec
BE2016/5783 la SEQ ID NO : 65, est insérée dans les cellules hôtes selon l'invention ou exprimée par celles-ci.
Certaines formyltransférases impliquées dans la biosynthèse de polysaccharides sont connues, et peuvent être insérées dans les cellules hôtes selon l'invention ou exprimée par celles-ci. Par exemple, vioF est une enzyme provenant du sérotype 030 de P. alcalifaciens, laquelle est identique à 48 % avec la formyltransférase provenant de Francisella tularensis (Nagaraja et al. 2005) . Elle convertit le dTDP-D-Qui4N en dTDP-D-Qui4NFo, et est impliquée dans la biosynthèse de l'O-antigène (Liu et al. 2012, Glycobiology 22(9) : 1236-1244). Une autre formyltransférase impliquée dans la biosynthèse de polysaccharides est 1'arnA (provenant par exemple d'E. coli), une enzyme bifonctionnelle dans laquelle le domaine N-terminal convertit l'UDP-Ara4N en UDP-AraNFo, alors que le domaine C-terminal est impliqué dans la décarboxylation oxydative de l'acide UDP-glucuronique. Les deux activités enzymatiques sont nécessaires pour la modification L-Ara4N du lipide A et la résistance à la polymyxine (Breazeale et al., 2005, The Journal of Biological Chemistry 280(14) : 14154-14167). Une autre formyltransférase impliquée dans la biosynthèse de polysaccharides est la wekD, une enzyme provenant du sérotype 0119 d'E. coli, impliquée dans la biosynthèse du TDP-DRhaNAc3NFo (Anderson et al., 1992, Carbohydr Res 237 : 249-62) .
En outre, les domaines liés à l'activité de formyltransférase ont été caractérisés. Le domaine appelé FMT_core est présent dans la majorité des formyltransférases.
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On peut citer par exemple la méthionyl-tRNAformyltransférase, formyltransférase la phosphoribosylglycinamide1, l'UDP-acide glucuroniquedécarboxy1ase/UDP-4-amino-4-désoxy-L-arabinoseformyltransférase, la vioF provenant de Providencia alcalifaciens 030, et 1'arnA provenant d'E. coli. Les formyltransférases mentionnées ci-dessus utilisent le FTHF (N-10-formyltétrahydrofolate) comme donneur de formyle. Les enzymes produisant du formate utilisant le FTHF (10-formyltétrahydrofolate) comme substrat contiennent également ce domaine. De plus, AICARFT est présent dans la phosphoribosylaminoimidazolecarboxamideformyltransférase/IMP-cyclohydrolase et FDH_GDH est présente dans la phosphoribosylglycinamideformyltransférase 2.
Dans certains modes de réalisation, une séquence d'acide nucléique codant pour une polymérase d'O-antigène (gène wzy) est insérée dans des cellules hôtes selon l'invention ou exprimée par celles-ci. Les polymérases d'O-antigène sont des protéines transmembranaires à chevauchements multiples. Elles utilisent des unités de répétition d'O-antigène lié à 1'undécaprénylpyrophosphate comme substrats pour générer un polymère linéaire composé des unités de répétition. Les polymérases d'O-antigène (wzy) sont présentes dans les bactéries Gram-négatives qui synthétisent les polymères d'O-antigène par le biais d'un mécanisme impliquant la wzy.
Dans un mode de réalisation spécifique, une séquence d'acide nucléique codant pour la polymérase wzy
BE2016/5783 de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO : 66), ou une homologue de celle-ci (la polymérase wzy de la souche PAK ou LESB58 de Pseudomonas aeruginosa par exemple), est insérée dans les cellules hôtes selon l'invention ou exprimée par celles-ci. Parmi les bactéries connues pour contenir des polymérases wzy, on compte par exemple Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Shigella flexneri et Salmonella typhimurium. Dans un autre mode de réalisation spécifique, une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine présentant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % d'identité ou d'homologie avec la SEQ ID NO : 66, est insérée dans les cellules hôtes selon 1'invention ou exprimée par celles-ci.
Nombre de copies d'un gène
Dans certains modes de réalisation, le nombre de copies d'un ou plusieurs gène (s) intégré dans une cellule hôte modifiée selon l'invention est 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10. Dans un mode de réalisation spécifique, le nombre de copies d'un ou plusieurs gène(s) intégré dans une cellule hôte modifiée selon l'invention est 1 ou 2.
Bénéfices
Les cellules hôtes modifiées selon la présente invention sont particulières en termes d'importance commerciale d'effectuer car elles à grande permettent échelle de comme par et d'intérêt, la fermentation bioconjugués, y compris de saccharides, exemple des antigènes de Pseudomonas qui peuvent être utilisés comme composés thérapeutiques (par exemple dans
BE2016/5783 des compositions immunogènes, des vaccins), dont les risques sont réduits du fait de la plus grande stabilité de 1'ADN inséré dans le chromosome et par conséquent de l'expression de l'ADN intéressant au cours de la fermentation. Les cellules hôtes modifiées selon 1'invention présentent des avantages par rapport à des cellules hôtes qui reposent sur l'expression via un plasmide des acides nucléiques nécessaires à la production des bioconjugués de l'invention, car, entre autres, la sélection par antibiotique au cours de la fermentation n'est plus nécessaire une fois que l'ADN hétérologue est inséré dans le génome de la cellule hôte. Cela signifie, que lorsque l'ADN inséré est inséré dans le chromosome, il n'a pas besoin d'être sélectionné, car il se propage au cours de la réplication du génome de l'hôte. En outre, un inconvénient connu des systèmes portés par un plasmide est le risque, à chaque génération (c'est-à-dire à chaque cycle de réplication de la cellule hôte), de perdre le plasmide. Cette perte du plasmide est due à la distribution parfois inappropriée des plasmides dans les cellules filles lors de l'étape de séparation des cellules au cours de la division cellulaire. À plus grande échelle, les cultures de cellules bactériennes nécessitent de plus nombreuses duplications pour atteindre des densités cellulaires élevées que pour les fermentations à petite échelle. Ainsi, l'augmentation de la stabilité cellulaire et de l'expression de l'ADN inséré conduit à de meilleurs rendements en produits, ce qui est clairement avantageux De plus, la stabilité cellulaire est un critère d'acceptabilité du procédé lorsqu'il est évalué par les
BE2016/5783 autorités de régulation, alors que, pour diverses raisons, la sélection par antibiotique n'est généralement pas souhaitée au moment de la fermentation, par exemple, les antibiotiques résiduels dans les composés thérapeutiques finaux présentent le risque de causer des réactions allergiques, et les antibiotiques peuvent favoriser l'antibiorésistance (par exemple par un transfert de gène ou par la sélection de pathogènes résistants).
La présente invention concerne des cellules hôtes modifiées pouvant être utilisées pour fabriquer des bioconjugués, comprenant des antigènes saccharidiques qui peuvent être utilisés comme composés thérapeutiques (par exemple dans des compositions immunogènes, des vaccins), dans lesquels certains éléments génétiques nécessaires pour entraîner la production de bioconjugués sont intégrés de manière stable sans le génome de la cellule hôte.
Par conséquent, la cellule hôte peut contenir un nombre réduit de plasmides, un unique plasmide ou aucun plasmide. Dans certains modes de réalisation, la présence d'un unique plasmide peut permettre une plus grande flexibilité de la souche productive et permettre de modifier la nature de la conjugaison (s'entend le saccharide ou la protéine porteuse contenus), ce qui augmente facilement la flexibilité de la souche productive.
En général, le fait de réduire l'utilisation de plasmides conduit à une souche productive plus adaptée à une utilisation pour produire des produits médicinaux. Un inconvénient lié à la présence de matériel génétique
BE2016/5783 essentiel sur les plasmides est qu'il impose à la pression de sélection de maintenir les éléments épisomiques dans la cellule hôte. La pression de sélection nécessite d'utiliser des antibiotiques, ce qui n'est pas souhaitable pour la production de produits médicinaux, du fait du risque de réaction allergique contre les antibiotiques par exemple, et des coûts de fabrication plus élevés. En outre, la pression de sélection n'est souvent pas complète, ce qui conduit à des cultures bactériennes non homogènes dans lesquelles certains clones ont perdu le plasmide, et ne produisent donc pas le bioconjugué. Les cellules hôtes selon la présente invention sont par conséquent capables de produire un produit plus sûr, qui peut être obtenu avec des rendements élevés.
Bioconj ugués
Les cellules hôtes modifiées selon la présente invention peuvent être utilisées pour produire des bioconjugués comprenant un antigène saccharidique, par exemple un antigène de Pseudomonas lié à une protéine porteuse. Les méthodes de production de bioconjugués à l'aide de cellules hôtes sont connues dans l'art, voir par exemple les documents WO 2003/074 687 et WO 2006/119 987. Les bioconjugués selon la présente invention ont des propriétés avantageuses par rapport à des conjugués chimiques antigène-protéine porteuse, en ce que moins de produits chimiques sont nécessaires à leur fabrication et en ce que la production du produit final est plus homogène.
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Dans un mode de réalisation spécifique, la présente invention concerne un bioconjugué comprenant une protéine porteuse liée à un antigène de Pseudomonas. Dans un mode de réalisation spécifique, ledit antigène de Pseudomonas est un O-antigène de Pseudomonas aeruginosa. Dans un mode de réalisation spécifique, la présente invention concerne un bioconjugué comprenant un O-antigène de P. aeruginosa et une protéine porteuse, ladite protéine porteuse étant 1ΈΡΑ, la PcrV (connue également sous le nom de LcrV, EspA, SseB), la PopB (YopB, YopD, FliC), ou l'OprF, l'Oprl. Les protéines porteuses utilisées dans les modes de réalisation donnés en exemple utilisent 1ΈΡΑ et la PcrV.
Dans un mode de réalisation spécifique, la présente invention concerne un bioconjugué comprenant une protéine porteuse liée à un O-antigène de Pseudomonas aeruginosa, ledit O-antigène de Pseudomonas aeruginosa étant un O-antigène provenant des sérotypes 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 010, 011, 012, 013, 014, 015,
016, 017, 018, 019, ou 020 de Pseudomonas aeruginosa.
Dans un mode de réalisation spécifique, la présente invention concerne un bioconjugué comprenant une protéine porteuse liée à un O-antigène de Pseudomonas aeruginosa, ledit O-antigène de Pseudomonas aeruginosa étant l'un des sérotypes décrits par Knirel et al., 2006, Journal of Endotoxin Research 12(6) : 324-336, ladite publication étant incorporée ici en référence dans son intégralité.
Dans un mode de réalisation spécifique, la présente invention concerne un bioconjugué comprenant une protéine porteuse liée à un O-antigène de Pseudomonas
BE2016/5783 aeruginosa, ledit O-antigène de Pseudomonas aeruginosa étant un O-antigène provenant du sérotype 06 de Pseudomonas aeruginosa.
Dans un mode de réalisation spécifique, la présente invention concerne un bioconjugué comprenant une protéine porteuse liée à un O-antigène de Pseudomonas aeruginosa, ledit O-antigène de Pseudomonas aeruginosa étant un O-antigène provenant du sérotype 011 de Pseudomonas aeruginosa. Dans un mode de réalisation spécifique, ledit O-antigène provenant du sérotype 011 de Pseudomonas aeruginosa provenant de la souche PA103 de Pseudomonas aeruginosa (voir par exemple Genbank Accession No. KF364633.1).
Les bioconjugués selon l'invention peuvent être purifiés par n'importe quelle méthode connue dans l'art destinée à la purification d'une protéine, par chromatographie par exemple (comme par exemple les chromatographies d'échange d'ions, d'échange d'anions, d'affinité et d'exclusion stérique), ou par centrifugation, solubilité différentielle, ou par toute autre technique standard de purification de protéines. Voir par exemple Saraswat et al., 2013, Biomed. Res. Int. ID# 312 709 (p. 1-18) ; voir également les méthodes décrites dans le document WO 2009/104 074. En outre, les bioconjugués peuvent être fusionnés à des séquences de polypeptides hétérologues selon l'invention, ou connues par ailleurs dans l'art, afin de faciliter leur purification. Les conditions effectivement utilisées pour purifier un bioconjugué particulier dépendront en partie de la stratégie de synthèse, et de facteurs tels que la charge nette, le caractère hydrophobe, et/ou le
BE2016/5783 caractère hydrophile du bioconjugué, et seront évidentes pour l'homme du métier.
Méthodes analytiques
Diverses méthodes peuvent être utilisées pour analyser les compositions structurales et les longueurs des chaînes de saccharides des bioconjugués de la présente invention.
Dans un mode de réalisation, les glycanes peuvent être analysés par hydrazinolyse. Tout d'abord, les polysaccharides sont libérés de leurs protéines porteuses lors d'une incubation avec de 1'hydrazine, selon les instructions du fabricant (Ludger Liberate Hydrazinolysis Glycan Release Kit, Oxfordshire, UK) . L'hydrazine nucléophile attaque la liaison glycosidique entre le polysaccharide et la protéine porteuse, et permet la libération des glycanes qui y sont liés. Les groupes N-acétyle sont perdus au cours de ce traitement, et doivent être remis en place par une nouvelle N-acétylation. Les glycanes libres sont purifiés sur des colonnes de carbon, et marqués ensuite à leur extrémité réductrice à l'aide du fluorophore 2-amino-benzamide. Voir Bigge JC, Patel TP, Bruce JA, Goulding PN, Charles SM, Parekh RB : Nonselective and efficient fluorescent labeling of glycans using 2-amino benzamide and anthranilic acid. Anal Biochem 1995, 230(2) : 229-238. Les polysaccharides marqués sont séparés sur une colonne GlycoSep-N (GL Sciences) selon le protocole de CLHP publié par Royle et al.. Voir Royle L, Mattu TS, Hart E, Langridge JI, Merry AH, Murphy N, Harvey DJ, Dwek RA, Rudd PM : An analytical and structural database provides
BE2016/5783 a strategy for sequencing O-glycans from microgram quantities of glycoproteins. Anal Biochem 2002, 304(1) : 70-90. Le chromatogramme par fluorescence obtenu indique la longueur des polysaccharides et le nombre d'unités de répétition. Les informations structurales peuvent être rassemblées en collectant individuellement chacun des pics et en effectuant ensuite une analyse par SM/SM. La composition en monosaccharides et la séquence de l'unité de répétition peuvent ainsi être confirmées, et il est également possible d'identifier une homogénéité de la composition des polysaccharides.
Dans un autre mode de réalisation, les glycanes et les bioconjugués sont analysés par SDS-PAGE ou électrophorèse capillaire sur gel. La longueur des polymères constituant les glycanes de l'O-antigène est définie par le nombre d'unités de répétition assemblées de manière linéaire. Cela signifie que le motif typique en échelle est la conséquence des nombres différents d'unités de répétition composant le glycane. Ainsi, deux bandes l'une à côté de l'autre, obtenues par SDS-PAGE ou par d'autres techniques de séparation en fonction de la taille, diffèrent de seulement une unité de répétition. Ce sont ces différences distinctes qui sont exploitées lors de l'analyse de la taille des glycanes dans les glycoprotéines : La protéine porteuse non glycosylée et le bioconjugué portant différentes longueurs de chaîne polymère se séparent en fonction de leurs mobilités électrophorétiques respectives. On mesure le premier nombre d'unités de répétition détectables (ni) et le nombre moyen d'unités de répétition (nmoyen) présentes
BE2016/5783 sur un bioconjugué. Ces paramètres peuvent être utilisés pour démontrer l'homogénéité ou la stabilité des polysaccharides d'un lot à l'autre.
Dans un autre mode de réalisation, la taille des bioconjugués complets est mesurée par SM à masse élevée et CLHP d'exclusion stérique.
Dans un autre mode de réalisation, un dosage à 1' anthrone-acide sulfurique peut être utilisé pour mesurer les rendements en polysaccharides. Voir Leyva A, Quintana A, Sanchez M, Rodriguez EN, Cremata J, Sanchez JC : Rapid and sensitive anthrone-sulfuric acid assay in microplate format to quantify carbohydrate in biopharmaceutical products : method development and validation. Biologicals : journal of the International Association of Biological Standardization 2008, 36(2) : 134-141. Dans un autre mode de réalisation, un dosage à 1'α-méthylpentose peut être utilisé pour mesurer les rendements en polysaccharides. Voir par exemple Dische et al., J Biol Chem. 1948 Sep ; 175(2) : 595-603.
Modification de l'utilisation du site de glycosylation
Afin de montrer que l'utilisation d'un site d'une protéine particulière est modifiée dans un système à plasmides multiples contrairement à ce qui est observé dans un système inséré, l'utilisation du site de glycosylation doit être quantifiée. Cela peut se faire par les méthodes ci-dessous.
CL-SM/SM de glycopeptides : les bioconjugués sont digérés par une/des protéase(s), et les peptides sont séparés par une méthode de chromatographie appropriée
BE2016/5783 (C18, CLHP d'interaction hydrophile HILIC, colonnes GlycoSepN, CLHP-ES, CLHP-EA), et les différents peptides sont identifiés par SM/SM. Cette méthode peut être utilisée avec ou sans raccourcissement préalable de la chaîne de saccharides par des méthodes chimiques (dégradation de Smith) ou enzymatiques. La quantification des pics de glycopeptides par détection UV à 215 et 280 nm permet la détermination de l'utilisation relative des sites de glycosylation.
CLHP d'exclusion stérique : l'utilisation plus importante des sites de glycosylation est reflétée par un temps d'élution plus court sur une colonne de CLHP-ES.
Homogénéité
L'homogénéité des bioconjugués (autrement dit, l'homogénéité des résidus de saccharides qui y sont liés) peut être analysée à l'aide de méthodes qui mesurent la longueur des glycanes et le rayon hydrodynamique.
Autres Applications Cliniques/Pratiques Potentielles
Les souches intégrées peuvent conduire à un meilleur rendement en bioconjugués, les inconvénients liés à la sélection par antibiotique étant réduits par rapport à aux systèmes à trois plasmides. De plus, on observe moins de dégradation protéolytique, les cellules subissant moins de charge métabolique.
Les souches intégrées fabriquent des bioconjugués dont les distributions de polysaccharides sont plus courtes et moins étalées. Ainsi, les bioconjugués sont plus faciles à caractériser et sont mieux définis. De plus, l'insertion peut réduire l'étendue du stress
BE2016/5783 périplasmique subi par les cellules, ce qui peut se traduire par une moindre protéolyse du produit au cours du processus de fermentation, les inconvénients liés à la sélection par antibiotique étant réduits par rapport à aux systèmes à trois plasmides.
Les systèmes de glycosylation des protéines nécessitent la présence de trois éléments de recombinaison dans l'hôte productif : un ADN exprimant une protéine porteuse, un ADN exprimant une oligosaccharyl-transférase, et un ADN exprimant un polysaccharide. Dans l'art antérieur, ces trois éléments des systèmes de production bactériens sont contenus dans des plasmides. Ainsi, la fabrication risque de devenir instable à cause de la perte de plasmides, en particulier parce que les antibiotiques utilisés pour maintenir la présence des plasmides ne doivent pas être présents au cours de la fermentation de produits labellisés BPF. Les souches insérées contenant un plasmide de moins, elles se révèlent plus stables après de nombreuses générations, Cela signifie que les fermentations peuvent être réalisées à plus grande échelle, et avec des temps d'incubation plus longs (nombre de générations plus élevé). De plus, l'absence d'utilisation d'antibiotiques pour la sélection rend le produit plus sûr, du fait de l'absence d'antibiotiques résiduels qui peuvent provoquer des réactions allergiques chez des patients sensibles. Voir COMMITTEE WE, BIOLOGICAL O,
STANDARDIZATION : WHO Technical Report Sériés 941. In : Fifty-sixth Report. Edited by Organization WH. Geneva : World Health Organization ; 2007.
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Les souches insérées sont génétiquement plus stables, l'insertion dans les chromosomes étant fixe, ce qui conduit à une plus grande reproductibilité des produits protéiques désirés pendant le processus de production, par exemple pendant la culture de cellules hôtes comprenant un ADN hétérologue inséré.
Méthodes analytiques permettant d'estimer le bénéfice
Rendement. Le rendement se mesure comme la quantité de glucides bactériens dérivés d'un litre de milieu de culture bactérien productif mis en croissance dans un bioréacteur dans des conditions contrôlées et optimisées Suite à la purification du bioconjugué, les rendements en glucides peuvent être mesurés directement, soit par un dosage à 1'anthrone, soit par un dosage ELISA utilisant des antisérums spécifiques des glucides. Des mesures indirectes sont possibles en utilisant la quantité de protéines (mesurée par les dosages BCA, Lowry ou Bradford bien connus) et la longueur et la structure des glycanes afin de calculer une quantité théorique de glucide par gramme de protéines. De plus, le rendement peut également être mesuré en séchant la préparation de glycoprotéine à partir d'un tampon volatile, et mesurant la masse à l'aide d'une balance.
Homogénéité. Le terme homogénéité désigne la variabilité de la longueur des glycanes et éventuellement le nombre de sites de glycosylation. Les méthodes énumérées ci-dessus peuvent être utilisées à cet effet. La CLHP-ES permet de mesurer le rayon hydrodynamique. Un nombre plus élevé de sites de
BE2016/5783 glycosylation sur le support se traduit par de glus fortes variations du rayon hydrodynamique par rapport à un support présentant moins de sites de glycosylation. Cependant, l'homogénéité peut être plus importante lorsque des chaînes uniques de glycanes sont analysées, leur longueur étant mieux contrôlée. La longueur des glycanes est mesurée par hydrazinolyse, SDS-PAGE et ECG. De plus, le terme homogénéité peut également signifier que certains motifs d'utilisation des sites de glycosylation peuvent varier dans une gamme plus ou moins étendue. Ces facteurs peuvent être mesurés par CL-SM/SM de glycopeptides.
Stabilité et reproductibilité de la souche. On mesure la stabilité de la souche, au cours de la fermentation bactérienne en l'absence de pression sélective, par des méthodes directes et indirectes qui confirment la présence ou l'absence d'ADN recombinant dans les cellules en culture productive. L'influence du volume de culture peut être simulée par des temps de cultures rallongés, correspondant à des temps de génération plus importants. Plus il y a de générations en fermentation, plus il est probable qu'un élément recombinant soit perdu. La perte d'un élément recombinant est considérée comme de l'instabilité. Des méthodes indirectes reposent sur l'association de cassettes à l'ADN recombinant, comme par exemple les cassettes de résistance aux antibiotiques dans un plasmide. Les cellules en culture productive sont déposées sur des plaques enduites de milieux sélectifs, comme par exemple des plaques LB supplémentées avec des antibiotiques ou d'autres substances chimiques
BE2016/5783 apparentées à un système de sélection, et on considère que les colonies résistantes sont positives à 1'ADN recombinant respectivement associé aux substances chimiques de sélection. Dans le cas d'un système à plasmides multiples, on compte les colonies résistantes à de multiples antibiotiques, et la proportion de cellules contenant l'ensemble des trois résistances est considérée comme une population stable. Il est également possible d'utiliser à la place une PCR quantitative pour mesurer la quantité d'ADN recombinant correspondant aux trois éléments en présence ou en l'absence de sélection, et à différents moments de la fermentation. Ainsi, les quantités relative et absolue d'ADN recombinant sont mesurées et comparées. On mesure la reproductibilité du processus de production par l'analyse complète de lots uniformes grâce aux méthodes exposées dans la présente invention.
Dans un mode de réalisation, celle-ci concerne une cellule hôte dans laquelle l'acide nucléique qui code pour une glycosyltransférase est dérivé d'un agrégat rfb de Pseudomonas, ladite séquence d'acide nucléique étant éventuellement intégrée de manière stable dans le génome de la cellule hôte. L'agrégat rfb provient éventuellement de Pseudomonas aeruginosa, éventuellement du sérotype 06 ou 011.
Dans un mode de réalisation, la cellule hôte comprend une oligosaccharyl-transférase dérivée de Campylobacter, 1'oligosaccharyl-transférase étant par exemple la PglB de C. jejuni.
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Dans un mode de réalisation, la cellule hôte comprend l'acide nucléique codant pour une protéine PcrV de P. aeruginosa dans un plasmide de la cellule hôte.
Dans un mode de réalisation, la cellule hôte comprend en outre une enzyme formyltransférase, l'acide nucléique codant pour une protéine présentant environ, ou au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % d'identité ou d'homologie avec la SEQ ID NO : 65, ou ledit acide nucléique codant pour la SEQ ID NO : 65.
Dans un mode de réalisation, la cellule hôte selon l'invention, comprend en outre un acide nucléique codant pour une polymérase wzy, l'acide nucléique codant pour une protéine présentant environ, ou au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % d'identité ou d'homologie avec la SEQ ID NO : 66, ou ledit acide nucléique codant pour la SEQ ID NO : 66.
Dans un mode de réalisation, la cellule hôte comprend un acide nucléique codant pour une enzyme formyltransférase et/ou l'acide nucléique codant pour une polymérase wzy lesquels sont intégrés de manière stable dans le génome de la cellule hôte. Éventuellement, un gène codant pour une enzyme formyltransférase et/ou un gène codant pour une polymérase wzy est présent dans un plasmide de la cellule hôte.
Dans un mode de réalisation, la cellule hôte est E. coli.
Dans un aspect supplémentaire de l'invention, celle-ci concerne un procédé de production d'un bioconjugué comprenant une protéine PcrV de P. aeruginosa liée à un saccharide, ledit procédé comprenant la culture de la cellule hôte selon
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1'invention dans des conditions adaptées à la production de protéines.
Dans un aspect supplémentaire de l'invention, celle-ci concerne un bioconjugué produit par le procédé selon l'invention, ledit bioconjugué comprenant un saccharide lié à une protéine PcrV de P. aeruginosa.
Les termes « comprenant », « comprend » et « comprennent » utilisés ici peuvent éventuellement être remplacés par les termes « consistant en », « consiste en » et « consistent en », respectivement, dans tous les cas.
L'expression « le résidu asparagine étant situé à une position se trouvant entre les acides aminés ... de la SEQ ID NO : ...» se comprend comme l'introduction du résidu asparagine dans une séquence d'acides aminés à une position qui correspondrait à la position définie, si la séquence de référence et la séquence ayant subi une mutation étaient alignées de manière à maximiser l'identité de séquence entre les deux séquences. L'addition ou délétion d'acides aminés d'une séquence ayant subi une mutation pourrait impliquer une différence dans la position effective du résidu asparagine parmi les acides aminés de la séquence ayant subi une mutation, toutefois, en alignant la séquence ayant subi une mutation avec la séquence de référence, la position d'insertion appropriée pour l'acide aminé asparagine peut être établie.
L'expression « le peptide comprenant la séquence consensus D/E-X-N-X-S/T est situé à une position comprise entre les acides aminés ... de la SEQ ID NO : ...» se comprend comme l'introduction de la
BE2016/5783 séquence consensus dans une séquence d'acides aminés à une position qui correspondrait à la position définie, si la séquence de référence et la séquence ayant subi une mutation étaient alignées de manière à maximiser l'identité de séquence entre les deux séquences. L'addition ou délétion d'acides aminés d'une séquence ayant subi une mutation pourrait impliquer une différence dans la position effective de la séquence consensus parmi les acides aminés de la séquence ayant subi une mutation, toutefois, en alignant la séquence ayant subi une mutation avec la séquence de référence, la position d'insertion appropriée pour la séquence consensus peut être établie.
Les O-antigènes de P. aeruginosa (01 à 020) sont définis en fonction de la classification des sérotypes correpondant à la nomenclature IATS.
Toutes les références ou publications de brevets citées dans la présente description sont incorporées ici en référence.
Les exemples présentés ci-dessous ont pour objectif de rendre la présente invention plus compréhensible. Ces exemples ne sont proposés qu'à des fins d'illustration, et ne doivent en aucun cas être interprétés comme limitant la portée de la présente invention.
Séquences des protéines et des acides nucléiques
SEQ ID NO : 1 - Séquence de la protéine PcrV de type sauvage
MEVRNLNAARELFLDELLAASAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPL
SEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSL
HGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQ
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GIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSP
KQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYN
SAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAI
SEQ ID NO : 2 - PcrV
AKDQNATKVRNLNAARELFKDQNATKDELLAASKDQNATKAPASAEQEEL LALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQ PGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAEL KVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSN LDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLN DKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQ KYDSVLRDILSAI
SEQ ID NO : 3
MSFKKIIKAFVIMAALVSVQAHAAEVRNLNAARELFLDELLAASAAPASA EQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVL QARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKA LTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEY ALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDR SRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNR FIQKYDSVLRDILSAI
SEQ ID NO : 4 - mature
AEVRNLNAARELFLDELLAASAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPL
SEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSL
HGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQ
GIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSP
KQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYN
SAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAI
SEQ ID NO : 5 - Séquence de l'épitope
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VYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYA
LLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRS
RPLNDKVNE
SEQ ID NO : 6 AKDQNATKVRNLNAARELF
SEQ ID NO : 7 VRNKDQNATKNAARELF
SEQ ID NO : 8 VRNLNAAKDQNATKELF
SEQ ID NO : 9 ELFKDQNATKDELLAAS
SEQ ID NO : 10 DELKDQNATKAAS
SEQ ID NO : 11 DELLAASKDQNATKAP
SEQ ID NO : 12 APKDQNATKSAEQEEL
SEQ ID NO : 13 ALLRSEKDQNATKI
SEQ ID NO : 14 ALLRSERIKDQNATKLAH
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SEQ ID NO : 15 LAHKDQNATKGQPL
SEQ ID NO : 16 GQPLKDQNATKEAQVLKA
SEQ ID NO : 17 EAKDQNATKVLKALA
SEQ ID NO : 18 VLKALAKDQNATKLLAA
SEQ ID NO : 19 VLKALAWKDQNATKLAA
SEQ ID NO : 20 LAAKDQNATKPSA
SEQ ID NO : 21 PSAKDQNATKPGQG
SEQ ID NO : 22 PSAPPKDQNATKQG
SEQ ID NO : 23 QGKDQNATKEVLR
SEQ ID NO : 24 QGLEKDQNATKLR
SEQ ID NO : 25
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LRKDQNATKVLQAR
SEQ ID NO : 26
VLGARKDQNATKQ
SEQ ID NO : 27
VLGARRQKDQNATKGAQW
SEQ ID NO : 28
VLQARRQPGKDQNATKQW
SEQ ID NO : 29
QWKDQNATKLREFLVSAYF
SEQ ID NO : 30
LREFLVSAYFSLKDQNATKG
SEQ ID NO : 31
GKDQNATKLDEDVIGVYKD
SEQ ID NO : 32
KDVLQTKDQNATKDGKRKAL
SEQ ID NO : 33
KYDSVLRDILSAKDQNATK
SEQ ID NO : 34
MSFKKIIKAFVIMAALVSVQAHA
SEQ ID NO : 35
AXD/EXNXS/TXVRNLNAARELF
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SEQ ID NO : 36
VRNX D/EXNX S/TXNAARE L F
SEQ ID NO : 37
VRNLNAAXD/EXNXS/TXELF
SEQ ID NO : 38
ELFXD/EXNXS/TXDELLAAS
SEQ ID NO : 39
DELXD/EXNXS/TXAAS
SEQ ID NO : 40
DELLAASXD/EXNXS/TXAP
SEQ ID NO : 41
APXD/EXNXS/TXSAEQEEL
SEQ ID NO : 42
ALLRSEXD/EXNXS/TXI
SEQ ID NO : 43
ALLRSERIXD/EXNXS/TXLAH
SEQ ID NO : 44
LAHXD/EXNXS/TXGQPL
SEQ ID NO : 45
GQPLXD/EXNXS/TXEAQVLKA
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SEQ ID NO : 46 EAXD/EXNXS/TXVLKALA
SEQ ID NO : 47 VLKALAXD/EXNXS/TXLLAA
SEQ ID NO : 48 VLKALAWXD/EXNXS/TXLAA
SEQ ID NO : 49 LAAXD/EXNXS/TXPSA
SEQ ID NO : 50 PSAXD/EXNXS/TXPGQG
SEQ ID NO : 51 PSAPPXD/EXNXS/TXQG
SEQ ID NO : 52 QGXD/EXNXS/TXEVLR
SEQ ID NO : 53 QGLEXD/EXNXS/TXLR
SEQ ID NO : 54 LRXD/EXNXS/TXVLQAR
SEQ ID NO : 55 VLGARXD/EXNXS/TXQ
SEQ ID NO : 56
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VLGARRQXD/EXNXS/TXGAQW
SEQ ID NO : 57
VLQARRQPGXD/EXNXS/TXQW
SEQ ID NO : 58
QWXD/EXNXS/TXLREFLVSAYF
SEQ ID NO : 59
LREFLVSAYFSLXD/EXNXS/TXG
SEQ ID NO : 60
GXD/EXNXS/TXLDEDVIGVYKD
SEQ ID NO : 61
KDVLQTXD/EXNXS/TXDGKRKAL
SEQ ID NO : 62
KYDSVLRDILSAKDQNATK
SEQ ID NO : 63
MSFKKIIKAFVIMAALVSVQAHA
SEQ ID NO : 64
D/E-X-N-X-S/T
SEQ ID NO : 65 - formyltransférase
Met Ser Trp Gin Leu Phe Ser Glu Lys Cys Arg Phe Leu
Gly Ala Val Glu lie Ser Gin His Phe Trp Gly Phe lie Val
Leu Glu Ala Ser Phe Gly Met Lys lie Lys Ala Ala Leu lie
Val Asp Asp Leu Ser Leu Ser Glu Trp Gin Lys Arg Ala lie
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Glu Asp Ser Ser Glu Tyr Leu Asp Ile Gin Leu Val Leu Ser
Cys Arg Asn Ser Ala Thr Lys Lys Ser Val Ile Lys His Cys
Gly Tyr Tyr Phe Leu Asn Ile Leu Ser Leu Lys Asn Asp Met
Thr Arg Arg Val Gin Leu Asp Ser Arg Gly Ser Glu Val Ile
His Phe Asp Ser Asp Tyr Glu Gly Ala Trp Gin Arg Ile Pro
Glu Asp Val Cys Ala Arg Ile Leu Asp Lys Gly Ile Lys Leu
Val Ile Lys Phe Gly Met Ser Leu Leu Arg Ile Asp Gly Gly
Leu Gin Arg Leu Asp Ile Leu Ser Tyr His His Gly Asp Pro
Glu Tyr Tyr Arg Gly Arg Pro Ala Gly Phe Tyr Glu Ile Tyr
Glu Asn Ala Asp Ser Val Gly Ile Ile Val Gin Lys Leu Ser
Asn Lys Leu Asp Ala Gly Glu Val Leu Val Arg Gly Tyr Ser
Lys Val His His His Ser Tyr Lys Lys Thr Ser Arg Asn Phe
Tyr Leu Asn Ser Val Val Leu Leu Arg Lys Ala Leu Val Asn
Tyr Ser Arg Gly Glu Gin Val Val Leu Glu Lys Leu Gly Lys
Asn Tyr Arg Leu Pro Ser Asn Phe Thr Val Phe Lys Phe Phe
Cys Lys Thr Ile Phe Arg Gly Leu Ala Arg Leu Ser Tyr Gly
Ala Phe Phe Glu Lys Lys Trp Asn Val Val Ala Leu Pro Tyr
Asn Asp Ile Pro Ser Leu Gin Glu Leu Ser Val Ser Ala Gly
Lys Ile Pro Lys Val Glu Lys Gly Tyr Thr Phe Tyr Ala Asp
Pro Phe Phe Ser Ala Asp Gly Lys Leu Ile Arg Leu Glu Ala
Leu Asn Ala Ser Asn Gly Leu Gly Glu Ile Ile Glu Leu Lys
Ala Gin Ser Leu Asp Phe Ser Arg Val Ile Leu Lys Gly Asn
His Phe Ser Tyr Pro Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Gly Val Glu
Tyr Leu Ile Pro Glu Val Ala Ser His Ser Ala Pro Cys Leu
Leu Pro Pro Pro Phe Ala Leu Glu Ser Lys Lys Leu Phe Gin
Gly Met Glu Gly Glu Arg Ile Leu Asp Gly Thr Leu Phe Glu
His Gly Gly Arg Tyr Tyr Leu Phe Cys Gly Gin Ala Val Ser
Gly Ser Asp Asn Leu Tyr Leu Tyr Val Gly Glu Ser Leu Glu
Gly Pro Tyr Thr Ser His Pro Cys Asn Pro Val Val Met Asn
Pro Gly Ser Ala Arg Met Gly Gly Arg Ile Phe Lys Glu Gly
Gly Lys Leu Tyr Arg Phe Gly Gin Asn Asn Ser Tyr Gly Tyr
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Gly Ser Ser Leu Ala Val Asn Glu lie Glu Val Leu Asp Pro
Glu His Tyr Ser Glu Lys Arg Val Ala Asn Leu Ala Phe Gin
Asp Ala Arg Gly Pro His Thr lie Asp lie His Gly Gin Thr
Met lie Leu Asp Phe Tyr Gin Asp Arg Phe Ser Leu Leu Ala
Gly Tyr Arg Arg Leu Val Ala Arg Leu Leu Ser Arg Gly
SEQ ID NO : 66 - polymérase : wzy
Met . Tyr Ala Met Leu Thr Gly Ala Thr Leu Leu lie Phe
Ala Val Ala Ala Arg Leu Leu Ala Arg Ser Ala lie His Pro
Ser Val Ala Met Pro lie Thr Trp Gly Leu Gly Leu lie Gly
Val Ser Leu Ala Ser Leu lie Gly Phe Tyr Arg Val Glu Ser
Asp Ala Leu Leu lie Phe Leu Phe Gly Val Met Ser Phe Ser
Leu Ser Ala Gly Cys Phe Ser Phe Leu Tyr Asn Gly Tyr Phe
Arg Ala Pro Ser Ser Asn Phe Leu Phe Asp Ser Glu Leu Arg
Thr Arg Ala Leu Val lie Phe Phe Cys Leu Ala His lie Val
Phe Leu Thr Val lie Tyr Arg Asp Leu Ser Ser lie Ala Pro
Thr Leu Arg Glu Ala Ala Tyr Met Ala Arg Ala Gin Ser Val
Ser Gly Glu Pro Val Leu Ser Ser Leu Ser Met Asn Tyr Leu
Gin Leu Gly Gin Thr Val lie Pro Leu Val Val Leu Leu Tyr
Leu Arg Gly Lys Cys Gly Val Leu Gly Phe Leu Ala lie Ser
Val Pro Trp Met Gly Val lie Leu Leu Ala Ser Gly Arg Ala
Ser Leu Met Gin Met Leu Val Gly Leu Phe Phe lie Tyr lie
Leu Val Lys Gly Ser Pro Ser Leu Lys Ser Leu Leu Val lie
Gly Leu Ala Met Phe Leu Val lie Ala Val Gly Ala Val Ala
Thr Ser Lys lie Gin Phe His Glu Gly Asp Gly lie Ser Thr
Leu Phe lie Glu Leu Tyr Arg His Val Ala Gly Tyr Ala Leu
Gin Gly Pro Val Leu Phe Asp Arg Tyr Tyr Gin Gly Ser lie
His Leu Glu Pro Tyr Trp Ser Pro Leu Asn Gly Phe Cys Ser
lie Leu Ala Thr Val Gly Leu Cys Gin Lys Pro Pro Leu His
Leu Asp Phe Tyr Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Leu Gly Asn Val
Tyr Ser Met Phe Phe Ser Met Tyr Pro His Tyr Gly Ala Leu
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Gly Val Ile Gly Val Met Ala Leu Tyr Gly Met Leu Cys Ser
Tyr Ala Tyr Cys Lys Ala Lys Lys Gly Ser Leu Tyr Phe Thr
Val Leu Ser Ser Tyr Leu Phe Ser Ala Ile Val Phe Ser Leu
Phe Ser Asp Gin Ile Ser Thr Ser Trp Trp Phe Tyr Val Lys
Met Thr Ile Ile Leu Gly Ile Leu Cys Phe Val Phe Arg Arg
Asp Arg Met Phe Val Ile Arg Leu Pro Gin Ala Gly
SEQ ID NO : 67 - séquence nucléotidique de la PcrV ATGGAAGTCAGAAACCTTAATGCCGCTCGCGAGCTGTTCCTGGACGAGCT
CCTGGCCGCGTCGGCGGCGCCTGCCAGTGCCGAGCAGGAGGAACTGCTGGCCCTG
TTGCGCAGCGAGCGGATCGTGCTGGCCCACGCCGGCCAGCCGCTGAGCGAGGCGC
AAGTGCTCAAGGCGCTCGCCTGGTTGCTCGCGGCCAATCCGTCCGCGCCTCCGGG
GCAGGGCCTCGAGGTACTCCGCGAAGTCCTGCAGGCACGTCGGCAGCCCGGTGCG
CAGTGGGATCTGCGCGAGTTCCTGGTGTCGGCCTATTTCAGCCTGCACGGGCGTC
TCGACGAGGATGTCATCGGTGTCTACAAGGATGTCCTGCAGACCCAGGACGGCAA
GCGCAAGGCGCTGCTCGACGAGCTCAAGGCGCTGACCGCGGAGTTGAAGGTCTAC
AGCGTGATCCAGTCGCAGATCAACGCCGCGCTGTCGGCCAAGCAGGGCATCAGGA
TCGACGCTGGCGGTATCGATCTGGTCGACCCCACGCTATATGGCTATGCCGTCGG
CGATCCCAGGTGGAAGGACAGCCCCGAGTATGCGCTGCTGAGCAATCTGGATACC
TTCAGCGGCAAGCTGTCGATCAAGGATTTTCTCAGCGGCTCGCCGAAGCAGAGCG
GGGAACTCAAGGGCCTCAGCGATGAGTACCCCTTCGAGAAGGACAACAACCCGGT
CGGCAATTTCGCCACCACGGTGAGCGACCGCTCGCGTCCGCTGAACGACAAGGTC
AACGAGAAGACCACCCTGCTCAACGACACCAGCTCCCGCTACAACTCGGCGGTCG
AGGCGCTCAACCGCTTCATTCAGAAATACGACAGCGTCCTGCGCGACATTCTCAG
CGCGATCTAG
SEQ ID NO : 68 X-S/T-X-N-X-D/E
Exemples
BE2016/5783
Exemple 1 : Les souches bactériennes dans lesquelles sont insérés une oligosaccharyl-transférase et un agrégat rfb sont stables et produisent des bioconjugués
Cet exemple démontre qu'il est possible de réussir à produire des bioconjugués à l'aide d'une souche bactérienne hôte qui a été modifiée génétiquement par l'insertion de (i) un acide nucléique codant pour une oligosaccharyl-transférase et (ii) un acide nucléique codant pour un agrégat rfb.
Les cellules hôtes d'E. coli modifiées ont été produites en insérant les éléments suivants directement dans le génome des cellules hôte : (i) un acide nucléique codant pour 1'oligosaccharyl-transférase de C. jejuni (PglB) et (ii) un acide nucléique codant pour l'agrégat rfb delà souche PA103 de Pseudomonas aeruginosa. Ledit agrégat rfb contient les gènes nécessaires à la synthèse de l'O-antigène du sérogroupe 011 de Pseudomonas aeruginosa. Les insertions ont été effectuées à l'aide d'une nouvelle méthode d'insertion décrite dans le document PCT/EP 2013/071 328 (voir section 5.2 ci-dessus) ou du système pUT-mini (Biomedal Lifescience) . La méthode d'insertion décrite dans le document PCT/EP 2013/071 328 est régiospécifique et utilise une recombinaison homologue, alors que le système pUT-mini s'appuie sur une approche aléatoire par le biais d'un transposon, dont le résultat est l'insertion aléatoire d'une séquence d'acide nucléique intéressante dans le génome d'une cellule hôte. Les cellules d'E. coli ont en outre été modifiées par l'introduction d'un plasmide exprimant, comme protéine porteuse, 1'exoprotéine A (EPA) de Pseudomonas détoxifiée dans les cellules hôtes. Ainsi,
BE2016/5783 les cellules hôtes d'E. coli modifiées décrites dans le présent exemple expriment (i) 1'oligosaccharyltransférase de C. jejuni (PglB), à la suite de l'intégration d'un acide nucléique codant pour ladite oligosaccharyl-transférase dans le génome de la cellule hôte ; (ii) les gènes d'un agrégat rfb de Pseudomonas aeruginosa qui produisent 1'O-antigène, à la suite de l'intégration d'un acide nucléique codant pour ledit agrégat rfb provenant de la souche PA103 de Pseudomonas aeruginosa dans le génome de la cellule hôte ; et (iii) la protéine porteuse EPA, à la suite de la transformation de la cellule hôte à l'aide d'un plasmide comprenant un acide nucléique codant pour la protéine porteuse.
Des cellules hôtes d'E. coli supplémentaires ont été produites pour pouvoir comparer la capacité des cellules hôtes modifiées comprenant des intégrations doubles (intégration d'une oligosaccharyl-transférase et intégration d'un agrégat rfb) à produire des bioconjugués (EPA-O11) avec la production de bioconjugués par des cellules hôtes contenant (i) une unique intégration seulement, soit de 1'oligosaccharyltransférase, soit de l'agrégat rfb, les constituants restant (protéine porteuse et oligosaccharyl-transférase ou agrégat rfb) exprimés par le biais d'un plasmide de la cellule hôte ; ou (ii) aucun composant intégré, tous les composants (protéine porteuse, oligosaccharyltransférase et agrégat rfb) étant exprimés par le biais d'un plasmide.
Trois souches de base différentes d'E. coli ont été utilisées pour l'analyse : (i) St4167 (W3110 OwaaL, OrfbOl6 : :rfbP.a.011), qui comprend une délétion du gène
BE2016/5783 waaL d'E. coli, une délétion de l'agrégat rfb 016 d'E. coli, et une insertion de l'agrégat rfb 011 de P. aeruginosa (PCT/EP 2013/071 328) ; (il) Stll28 (W3110 OwaaL), qui comprend une délétion du gène waaL d'E. coli : et (iii) Stl935 (W3110 OwaaL, OwzzE-wecG,
OwbbIJK), qui comprend une délétion des gènes indiqués. Pour permettre l'insertion de l'agrégat rfb 011 de P. aeruginosa dans la souche st4167, l'agrégat rfb 011 a été cloné dans un plasmide pDOC puis la méthode employée a été celle décrite dans le document PCT/EP 2013/071 328. Les souches St4167 représentent les souches à intégrations doubles.
Les plasmides spécifiques utilisés pour introduire l'EPA dans les souches de cellules hôtes sont appelés « pl077 » et « pl50 ». Ce dernier est décrit par Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61, et les plasmides sont les mêmes, à l'exception que pour le pl077, la cassette Amp de pl50 est remplacée par une cassette Kan.
Les variants suivants de St4167 ont été produits : (i) St4167 où le pglB est inséré à la place du gène yahL de la cellule hôte (à l'aide de la méthode du document PCT/EP 2013/071 328) et l'EPA est exprimé par le plasmide P1077 ; (ii) St4167 où le pglB est inséré à la place du gène ompT de la cellule hôte (à l'aide du système pUT-mini) et l'EPA est exprimé par le plasmide P150 ; (iii) Stl467 où le pglB est exprimé par le plasmide pl769 (pglB dans pDOC) et l'EPA est exprimé par le plasmide P1077 ; (iv) Stl467 où le pglB est exprimé par le plasmide p939 (plasmide d'expression basé sur le pEXT21, pour le pglB muni d'un marqueur HA, après
BE2016/5783 optimisation des codons) et 1ΈΡΑ est exprimé par le plasmide P1077 ; et (v) Stl467 où le pglB est exprimé par le plasmide pl762 (pglB dans pDOC) et 1ΈΡΑ est exprimé par le plasmide P1077.
Les variants suivants de Stll28 ont été produits : (i) Stll28 où le pglB est exprimé par le plasmide p939, l'agrégat rfb du 011 de P. aeruginosa est exprimé par le plasmide pl64 (plasmide pLAFR conçu pour contenir l'agrégat rfb du 011 de P. aeruginosa), et l'EPA est exprimé par le plasmide P1077 ; et (ii) Stll28 où le pglB est inséré à la place du gène yahL de la cellule hôte (à l'aide de la méthode du document PCT/EP 2013/071 328), l'agrégat rfb du 011 de P. aeruginosa est exprimé par le plasmide pl64, et l'EPA est exprimé par le plasmide P1077.
Les variants suivants de Stl935 ont été produits : (i) Stl935 où le pglB est inséré à la place du gène ompT de la cellule hôte (à l'aide de la méthode du document PCT/EP 2013/071 328), l'agrégat rfb du 011 de P. aeruginosa est exprimé par le plasmide pl64, et l'EPA est exprimé par le plasmide P1077 ; (ii) Stl935 où le
pglB est inséré à la place du gène yahL de la cellule
hôte (à l'aide de la méthode du document
PCT/EP 2013/071 328) , 1'agrégat rfb du 011 de
P. aeruginosa est exprimé par le plasmide pl64, et l'EPA est exprimé par le plasmide P1077 ; et Stl935 où le pglB est exprimé par le plasmide p939, l'agrégat rfb du 011 de P. aeruginosa est exprimé par le plasmide pl64, et l'EPA est exprimé par le plasmide P1077.
Comme le montre la figure 1, toutes les souches exprimant une oligosaccharyl-transférase, une protéine
BE2016/5783 porteuse, et un agrégat rfb produisent des bioconjugués. Cela peut s'observer sur les buvardages décrits entre les marqueurs à 100 et 130 kDa, correspondant à l'EPA011. Il est important de noter que cette observation inclut des souches comprenant l'intégration double d'une oligosaccharyl-transférase et d'un agrégat rfb. Voir, en particulier, les résultats présentés pour St4167. Ainsi, cet exemple démontre non seulement que des cellules hôtes stables peuvent être produites suite à une double insertion de gènes/agrégats de gènes dans le génome des cellules hôtes, mais également que ces gènes conservent leur fonction. En particulier, 1 ' oligosaccharyltransférase insérée et l'agrégat rfb inséré ont conservé leur fonction, avec pour résultat la production de bioconj ugués.
Exemple 2 : Identification d ' un gène de
formyltransférase qui contribue à la synthèse de
1 ' oligo/polysaccharide de l'O- antigène natif de
P. aeruginosa 06
Cet exemple décrit l'identification de la formyltransférase de Pseudomonas aeruginosa 06.
Les données concernant le protéome de la souche de Pseudomonas aeruginosa 06 « LESB58 », dont le génome est connu, ont été étudiées à la recherche d'homologies avec des domaines correspondant à une requête sur des prototypes de domaines « Formyltransférase » et « Similaire au domaine C-terminal d'une FMT » en utilisant l'algorithme fourni sur le site www.supfam.org/SUPERFAMILY/. La recherche a identifié
BE2016/5783 séquences protéiques présentant des domaines pouvant être apparentés.
Afin de déterminer les l'un ou l'autre des 9 candidats identifiés était spécifique du 06 (et donc d'une unité de répétition d'O-antigène formylé), il a été décidé d'attester de leur absence dans le protéome d'un autre sérotype de Pseudomonas aeruginosa (05, souche PAO1) en effectuant une recherche par BLAST (site web du NCBI) La structure de l'O-antigène de Pseudomonas aeruginosa 05 n'est pas apparentée à celle de Pseudomonas aeruginosa 06. En particulier, il n'y a pas de groupe formyle dans la structure du 05. 8 des 9 candidats avaient des homologues dans le sérotype 05 de Pseudomonas aeruginosa, indiquant par là que ces protéines n'étaient pas spécifiques de la souche de Pseudomonas aeruginosa
06 LESB58. Le candidat restant (locus tag=PLES 12061,
GenBank : CAW25933 .1 ; SEQ ID NO : 2) n'avait aucun
homologue évident dans le sérotype 05 de Pseudomonas
aeruginosa , et a par conséquent été classé comme
de
Pseudomonas formyltransférase du aeruginosa (SEQ ID NO spécifique de LESB58/sérotype aeruginosa.
Afin de confirmer la spécificité du 06, il a été décidé de vérifier la présence de la formyltransférase du sérotype 06 de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO : 2) découverte dans d'autres souches de sérotype 06 de Pseudomonas aeruginosa. Des protéines équivalentes à la sérotype 06 de Pseudomonas 2) ont été identifiées dans quatre autres souches de sérotype 06 de Pseudomonas aeruginosa, comprenant le marqueur de locus PAK 01412
BE2016/5783 dans la souche « PAK » et le marqueur de locus PAM18_1171 dans la souche M18.
Des formyltransférases présentant une faible identité de séquence avec la formyltransférase du sérotype 06 de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO : 2) ont également été identifiées dans des espèces de
Methylob acterium WP 020093860)
ACCESSION d'identité, (33 % d'identité, _ dans Thiothrix nivea (30
ACCESSION WP_002707142), Anaerophaga thermohalophila (28 % d'identité, ACCESSION WP_010422313), Halorubrum californiense (27 % d'identité, ACCESSION WP_008445073), Azorhizobium caulinodans (25 % d'identité, ACCESSION WP_012170036) et Burkholderia glathei (24 % d'identité, ACCESSION KDR39707). Considérées ensemble, ces analyses d'homologie indiquent que les gènes apparentés codent pour une activité spécifique du 06 liée à la formylation.
Le gène de la SEQ ID NO : 2 a été cloné afin de tester l'activité de la formyltransférase du sérotype 06 de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO : 2) sur la structure d'unités de répétition de 06 non formylée. Le codon d'amorce TTG, rare, a été remplacé par ATG. La figure 5 propose une représentation schématique du clonage de la formyltransférase du sérotype 06 de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO : 2) dans l'agrégat rfb de Pseudomonas aeruginosa 06, et l'organisation relative des gènes.
Une fois identifiée, la fonction de la formyltransférase de Pseudomonas aeruginosa 06 a été analysée. La fonctionnalité de la formyltransférase du sérotype 06 de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO : 2) a été testée en effectuant une co-expression des gènes de
BE2016/5783 fonctionnel l'agrégat rfb de Pseudomonas aeruginosa 06 dans des souches d'E. coli ne possédant pas d'agrégat ECA Pour mettre en évidence (wec;
la formylation, on a analysé des unités de répétition uniques de l'antigène liées au noyau du lipide A (dans une souche waaL positive). L'unité de répétition de l'Oantigène de 06 formylée a été identifiée par immunodétection à l'aide d'un anticorps spécifique à 06 (Figure 3A) , indiquant que le groupe formyle est un épitope pertinent de la structure de 1'O-antigène de Pseudomonas aeruginosa 06.
Afin de mettre en évidence la formylation au niveau moléculaire, les unités de répétition de 06 ont été analysées par MALDI-SM/SM. Les unités de répétition purifiées et marquées au 2-AB ont montré que la coexpression de la formyltransférase du sérotype 06 de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO : 2) avec les gènes de l'agrégat rfb de Pseudomonas aeruginosa 06 conduisaient à un pic principal dont le signal de fluorescence était décalé de 2 à 3 minutes (de 58 à 61', Fig. 3B).
L'anlyse par MALDI-SM/SM de la substance contenue dans le pic à 58' est le résultat d'une fragmentation en ions de la série Y en accord avec l'unité de répétition de 06 non formylée, N-acétylée, marquée au 2-AB. L'ion précurseur protoné de m/z = 905 est fragmenté suivant la série d'ions 905->759->543->326, correspondant à la perte d'unités de masse 146 (désoxyhexose), 216 (acide N-acétylhexosaminuronique amidé), 217 (acide N-acétylhexosaminuronique). La substance collectée après 61' obtenue à partir de cellules exprimant le gène de la formyltransférase du sérotype 06 de Pseudomonas
BE2016/5783 aeruginosa contient un ion précurseur majoritaire de masse 891, qui se fragmente suivant la série 891->745->529->326, correspondant à la perte d'unités de masse 146 (comme ci-dessus), 216 (comme ci-dessus) et 203 (acide N-formylhexosaminuronique amidé). Ces données démontrent que le formylation dépend de l'expression de la formyltransférase du sérotype 06 de Pseudomonas aeruginosa, et que le gène respectif code pour la formyltransférase. Le gène codant pour la formyltransférase du sérotype 06 de Pseudomonas aeruginosa a par conséquent été nommé fmtO6. Le remplacement d'un groupe acétyle de l'acide N-acétylhexosaminuronique amidé par un groupe formyle suggère un mécanisme en deux étapes au cours duquel le
groupe acétyle est d'abord éliminé avant 1'aj out du
groupe formyle . Ce modèle implique qu'un groupe amine
libre présent en position C2 joue le rôle d'un
intermédiaire avant la liaison du groupe formyle au
monosaccharide par le domaine formyltransférase. L'O-antigène déacétylé et non formylé peut par conséquent être une forme polysaccharidique importante et immunologiquement pertinente, présente en quantités sous-stœchiométriques, du sérotype 06 de P. aeruginosa.
Exemple 3 : Identification et analyse du gène wzy permettant la polymérisation de 1'O-antigène de P. aeruginosa 06.
Cet exemple décrit l'identification de la polymérase wzy de Pseudomonas aeruginosa 06.
Les polysaccharides de 1'O-antigène sont des constituants de la surface extérieure de nombreuses
BE2016/5783 bactéries Gram-négatives. La machinerie enzymatigue responsable de la biosynthèse de l'O-antigène est souvent codée par un unigue agrégat de gènes appelé agrégat rfb. Les souches de sérotype 06 de Pseudomonas aeruginosa expriment un O-antigène polymèrisé (Figure 2) Cependant, dans l'agrégat correpondant codant pour l'O-antigène, aucun gène codant pour une polymérase d'O-antigène (wzy) n'est présent. Cela signifie gue, pour exprimer de manière recombinante l'O-antigène 06 de P. aeruginosa chez E. coli, il s'avère nécessaire d'identifier le gène wzy. Les polymérases d'O-antigène (wzy) sont intégralement des protéines de la membrane interne gui catalysent la polymérisation des unités de répétition de l'O-antigène dans l'espace périplasmigue avant leur liaison en bloc à l'oligosaccharide du noyau du lipide A, formant ainsi un LPS. Les polymérases wzy sont extrêmement spécifigues de leur unité de répétition oligomère, et il y a peu d'homologie parmi les gènes wzy.
La structure de l'O-antigène de Pseudomonas aeruginosa 019 présente des similitudes structurales avec celle de Pseudomonas aeruginosa 06. Il a donc été supposé gue les protéines wzy reconnaissant les deux structures pourraient également avoir des propriétés similaires, par exemple concernant leur structure, séguence ou nombre de domaines transmembranaires. La séguence de la protéine wzy 019 de Pseudomonas aeruginosa 019 (ACCESSION AAM27560) est connue et a été utilisée dans une première reguête d'analyse par BLAST, en utilisant le protéome de la souche 06 PAK de Pseudomonas aeruginosa comme base pour la recherche d'homologie.
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Afin d'évaluer si l'un des candidats identifiés était spécifique de Pseudomonas aeruginosa 06, il a été décidé d'attester de leur présence dans le protéome d'un autre sérotype de Pseudomonas aeruginosa (05, souche PAO1) . La structure de l'O-antigène de 05 n'est pas apparentée à celle de 06 et 019. Les 100 premiers résultats ont été analysés individuellement par BLAST afin de déterminer s'ils étaient présents dans le protéome de Pseudomonas aeruginosa 05. 97 des 100 candidats issus du protéome de PAK avaient des homologues chez le sérotype 05 de Pseudomonas aeruginosa, indiquant que ces protéines étaient généralement présentes parmi les souches de Pseudomonas aeruginosa, et probablement non liées à la biosynthèse de 1'O-antigène 06. Trois des 100 candidats n'avaient pas d'homologue évident dans le protéome du sérotype 05 de Pseudomonas aeruginosa, et ont donc été considérés comme spécifiques de Pseudomonas aeruginosa 06.
Afin de tester si l'une des trois protéines candidates identifiées était la wzy de Pseudomonas aeruginosa 06, les trois protéines ont été choisies comme requêtes pour une analyse par BLAST. L'une des trois candidates, PAK_01823 (06wzy PAK_01823 ; SEQ ID NO : 3) , présentait de l'identité avec les séquences d'acides aminés d'autres polymérases d'unités de répétition oligosaccharides connues, comme par exemple 25 % d'identité avec les polymérases d'unités de répétition oligosaccharides de Streptococcus sanguinis (ACCESSION WP_004192559) et 22 % d'identité avec les polymérases d'unités de répétition oligosaccharides d'Escherichia coli 0139 (ACCESSION AAZ85718). La PAK_01823 (06wzy
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PAK_01823 ; SEQ ID NO : 3) a donc été identifiée comme étant une wzy de Pseudomonas aeruginosa 06.
Pour confirmer que la SEQ ID NO : 3 correspond bien à la protéine codée par le wzy de Pseudomonas aeruginosa 06, la localisation dans la cellule de la protéine a été prédite par une méthode bioinformatique utilisant PSORTb (www.psort.org/psortb/). Les prédictions ont indiqué que la protéine se trouvait dans la membrane cytoplasmique et comprenait 11 domaines transmembranaires, une caractéristique habituelle parmi les polymérases d'O-antigène.
Des protéines équivalentes à la PAK_01823 (06wzy PAK_01823 ; SEQ ID NO : 3) ont été repérées dans d'autres souches de P. aeruginosa 06-positives, y compris la souche LESB58 (dont la protéine wzy de Pseudomonas aeruginosa 06 ne présente qu'une différence dans la séquence d'aa par rapport à la souche PAK et à une souche testée en interne).
L'analyse fonctionnelle de la wzy de Pseudomonas aeruginosa 06 a ensuite été effectuée. L'agrégat rfb de Pseudomonas aeruginosa 06, le gène fmt06 (autrement dit le gène codant pour la SEQ ID NO : 2, voir l'exemple 2 ci-dessus), et le gène codant pour la wzy de Pseudomonas aeruginosa 06 (autrement dit le gène codant pour la SEQ ID NO : 3) ont été co-exprimés dans ces cellules d'E coli Awec, et le lipopolysaccharide formé a été analysé par immunobuvardage (Fig. 4). Un signal en forme d'échelle a été détecté par l'antisérum anti-06 uniquement dans l'échantillon provenant des cellules contenant l'ensemble des trois transgènes, indiquant que la PAK_01823 (06wzy PAK_01823 ; SEQ ID NO : 3) est
BE2016/5783 effectivement la polymérase de P. aeruginosa 06. Le gène codant pour la PAK_01823 a par conséquent été nommé O6wzy
Afin de générer un agrégat de gènes unique contenant l'ensemble des éléments génétiques nécessaires pour permettre à E. coli d'exprimer par recombinaison l'O-antigène de P. aeruginosa 06, les gènes fmtO6 et 06wzy (autrement dit, les gènes codant respectivement pour les SEQ ID NO : 2 et 3) ont été clonés en aval de l'agrégat rfb de P. aeruginosa 06. La figure 5 propose une représentation schématique du clonage de la polymérase 06wzy de l'O-antigène de Pseudomonas aeruginosa 06 optimisant l'utilisation des codons dans l'agrégat rfb de Pseudomonas aeruginosa 06 cloné en association avec la formyltransférase de 06, et l'organisation relative des gènes. En outre, il a été déterminé que les gènes fmt06 et 06wzy (autrement dit, les gènes codant respectivement pour les SEQ ID NO : 2 et 3) pouvaient être insérés à de multiples positions dans l'agrégat rfb de P. aeruginosa 06. En particulier, le gène fmt06 a pu être inséré dans le sens des aiguilles d'une montre par rapport à l'agrégat rfb en aval de l'agrégat rfb, ou en amont de l'agrégat rfb sous le contrôle d'un promoteur séparé. De plus, le gène fmt06 a pu être inséré dans le sens inverse des aiguilles d'une montre par rapport à 1'agrégat rfb en amont de 1'agrégat rfb, ou en aval de l'agrégat rfb. Le gène 06wzy a pu être inséré dans le sens des aiguilles d'une montre par rapport à 1'agrégat rfb en amont ou en aval de 1'agrégat rfb ou en amont de l'agrégat rfb sous le contrôle d'un promoteur séparé. Toutes les constructions décrites ci94
BE2016/5783 dessus étaient actives considérant la biosynthèse de 1'O-antigène de P. aeruginosa 06 (données non montrées).
Exemple 4 : Les souches bactériennes dans lesquelles sont insérés une oligosaccharyl-transférase et un agrégat rfbO6 complet sont stables et produisent des bioconj ugués
L'exemple 1 démontre que les bioconjugués peuvent être produits avec succès par une souche bactérienne hôte qui a été génétiquement modifiée par l'insertion de (i) un acide nucléique codant pour une oligosaccharyltransférase et (ii) un acide nucléique codant pour un agrégat rfb. Dans cet exemple, des expériences similaires à celles décrites dans l'exemple 1 ont été réalisées, en utilisant la protéine PcrV de Pseudomonas comme protéine porteuse.
À l'état naturel, la séquence primaire d'acides aminés de la PcrV (voir par exemple UniProt 030527) ne contient pas de séquence consensus de N-glycosylation (« glycosite »). À l'aide des méthodes décrites dans le document WO 2006/119 987 ont été conçus des variants recombinants de la PcrV comprenant un, deux, trois, quatre ou cinq glycosites. En particulier, la manipulation de la séquence d'acide nucléique codant pour la PcrV a conduit à des variants de la PcrV exprimant une, deux, trois, quatre ou cinq des séquences consensus de N-glycosylation optimisées Asp(Glu)-X-AsnZ-Ser(Thr), X et Z étant choisis indépendamment parmi tous les acides aminés naturels, excepté Pro.
Les cellules hôtes d'E. coli modifiées ont été produites en insérant les éléments suivants directement
BE2016/5783 dans le génome des cellules hôte : (i) un acide nucléique codant pour 1'oligosaccharyl-transférase de C. jejuni (PglB) et (ii) un acide nucléique codant pour l'agrégat rfb de la souche de sérotype O6_PAK de Pseudomonas aeruginosa. Ledit agrégat rfb contient les gènes nécessaires à la synthèse de l'O-antigène du sérogroupe 06 de Pseudomonas aeruginosa. Les insertions ont été effectuées à l'aide d'une nouvelle méthode d'insertion décrite dans le document PCT/EP 2013/071 328 (voir section 5.2 ci-dessus) ou du système pUT-mini (Biomedal Lifescience) . Les cellules hôtes d'E. coli ont été modifiées plus avant par l'introduction d'un plasmide exprimant la PcrV comprenant de un à cinq glycosites, comme décrit ci-dessus. Ainsi, les cellules hôtes d'E. coli modifiées décrites dans le présent exemple expriment (i) 1'oligosaccharyl-transférase de C. jejuni (PglB), à la suite de l'intégration d'un acide nucléique codant pour ladite oligosaccharyl-transférase dans le génome de la cellule hôte ; (ii) les gènes d'un agrégat rfb de Pseudomonas aeruginosa qui produisent l'antigène 06, à la suite de l'intégration d'un acide nucléique codant pour ledit agrégat rfb provenant de la souche PAK de Pseudomonas aeruginosa dans le génome de la cellule hôte ; et (iii) la protéine porteuse PcrV modifiée, à la suite de la transformation de la cellule hôte à l'aide d'un plasmide comprenant un acide nucléique modifié codant pour la protéine porteuse (l'acide nucléique ayant été modifié pour coder pour un à cinq glycosites, comme décrit ci-dessus).
Des cellules hôtes d'E. coli modifiées supplémentaires ont été produites pour pouvoir comparer
BE2016/5783 la capacité des cellules hôtes modifiées comprenant des intégrations doubles (intégration d'une oligosaccharyltransférase et intégration d'un agrégat rfb) à produire des bioconjugués (PcrV-06) avec la production de bioconjugués par des cellules hôtes contenant (i) une unique intégration seulement, soit de 1'oligosaccharyltransférase, soit de l'agrégat rfb, les constituants restant (protéine porteuse et oligosaccharyl-transférase ou agrégat rfb) étant exprimés par le biais d'un plasmide de la cellule hôte ; ou (ii) aucun composant intégré, tous les composants (protéine porteuse, oligosaccharyltransférase et agrégat rfb) étant exprimés par le biais d'un plasmide.
Trois souches différentes d'E. coli ont été utilisées et comparées au cours de l'analyse : (i) la St7343, qui comprend à la fois la pglB et l'agrégat rfb de 06 complet insérés dans le génome de la cellule hôte (autrement dit une souche à double intégration), et un plasmide codant pour une protéine PcrV (avec un, deux, trois, quatre ou cinq glycosites) ; (ii) la St7209, qui comprend une pglB exprimée par un plasmide, l'agrégat rfb de 06 inséré dans le génome de la cellule hôte, et un plasmide codant pour une protéine PcrV (avec un, deux, trois, quatre ou cinq glycosites) ; et (iii) la St2182, qui comprend une pglB exprimée par un plasmide, un agrégat rfb de 06 exprimé par un plasmide, et un plasmide codant pour une protéine PcrV (avec un, deux, trois, quatre ou cinq glycosites). La figure 6 présente les caractéristiques de chaque souche ( 6A : St7343 ; 6B : St7209 ; 6C : St2182).
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Comme le montre la figure 6, toutes les souches exprimant une oligosaccharyl-transférase, une protéine porteuse, et un agrégat rfb produisent des bioconjugués. Cela peut s'observer sur les buvardages décrits entre
les marqueurs entre 40 et 70 kDa (aux alentours du
marqueur à 55 kDa) , correspondant à la PcrV-06. Il est
important de noter que, comme il est montré dans
1'exemple 1, cette observation inclut des souches
comprenant l'intégration double d'une oligosaccharyltransférase et d'un agrégat rfb. Voir en particulier les résultats présentés dans la figure 6A. Ainsi, à l'image de l'exemple 1, cet exemple démontre non seulement que des cellules hôtes stables peuvent être produites suite à une double insertion de gènes/agrégats de gènes dans le génome des cellules hôtes, mais également que ces gènes conservent leur fonction. En particulier, 1'oligosaccharyl-transférase insérée et l'agrégat rfb inséré ont conservé leur fonction, avec pour résultat la production de bioconjugués.
Exemple 5 : Production et purification de bioconjugués EPA-O6
Cet exemple décrit la production de bioconjugués comprenant l'antigène de Pseudomonas aeruginosa 06.
E. coli W3110 AwaaL Awec Arfb a été transformé à l'aide de plasmides comprenant l'agrégat rfb de Pseudomonas aeruginosa 06, 1'oligosaccharyl-transférase pglB provenant de C. jejuni, le gène codant pour la protéine porteuse EPA détoxifiée, et les gènes wbpVLM de la transférase associée à la biosynthèse de QuiNAc (provenant d'une souche de Pseudomonas aeruginosa 06) .
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Les résultats de l'analyse de rétention de plasmide sont présentés dans la figure 8. Des cellules hôtes contenant l'ensemble des quatre plasmides ont été inoculées à un milieu (bouillon LB) supplémenté avec de la Tétracycline, de la Spectinomycine, de la Kanamycine et de l'Ampicilline. La préculture a été mise en croissance pendant la nuit à 37 °C. Le lendemain, la préculture a été inoculée par dilution jusqu'à une D0600 de 0,1 dans un milieu (TB) supplémenté avec du MgC12, de la Tétracycline, de la Spectinomycine, de la Kanamycine et de l'Ampicilline. Les cellules ont été mises en croissance à 37 °C jusqu'à atteindre une D0600 de 0,8 à 1,0, puis l'expression du pglb, de 1 ' epa et du wbpVLM ont été induites par l'addition de 1 mM d'IPTG et de 0,1 % d'arabinose. Les cellules ont été récoltées par centrifugation après une nuit d'induction.
Les bioconjugués EPA-O6 ont été purifiés à partir d'extraits du périplasme de cellules hôtes modifiées par chromatographie d'affinité aux chélates métalliques (IMAC), chromatographie d'échange d'anions (Source Q) et chromatographie d'exclusion stérique (SEC). Les fractions éluées contenant des glycoconjugués ont été rassemblées puis introduites dans l'étape de chromatographie suivante. Les éluats finaux de la SEC ont été caractérisés par SDS-PAGE suivie d'une coloration au bleu de Coomassie ou d'un transfert de Western utilisant les anticorps indiqués dans la figure 7.
Le bioconjugué EPA-O6 a été caractérisé à l'aide d'une série de méthodes analytiques. Le niveau d'endotoxine a été mesuré par dosage LAL (13 EU/ml). La
BE2016/5783 pureté a été déterminée par SDS-PAGE et électrophorèse capillaire sur gel (ECG, pureté de 86 %). La quantité de protéine a été mesurée à l'aide d'un dosage BCA (1,75 mg/ml). La quantité de polysaccharide a été mesurée à l'aide d'un dosage à 1 'anthrone (Dubois et al., 1956 ; 311,6 pg/ml). La taille moyenne du polymère 06 a été déterminée à l'aide d'une SDS-PAGE haute résolution du « degré de glycosylation » (DOG) (moyenne de 7,9 unités de répétition par polymère). La détermination des isoformes électriques du bioconjugué a été réalisée par électrofocalisation (EF). Finalement, l'identité du bioconjugué a été confirmée par immunobuvardage en utilisant des anticorps dirigés contre la protéine (EPA) ou le polysaccharide (06).
Exemple 6 : Études d'immunisation
Cet exemple démontre que le bioconjugué O6-EPA de
P. aeruginosa est immunogène.
Des souris BALB/c OlaHsd femelles âgées de 6 semaines (par groupes de 20) ont été immunisées par voie intramusculaire aux jours 0, 14 et 28 avec 0,2 pg ou pg de conjugué O6-EPA (voir l'exemple 5) dans une formulation contenant ou non un adjuvant (avec un adjuvant en émulsion d'huile dans l'eau). Un groupe témoin de 10 souris a été vacciné avec l'adjuvant (H/E) seul. Des dosages ELISA anti-06 ont été effectués dans les sérums individuels collectés au jour 42 (14 après
III) et les titres opsoniques ont été déterminés sur des sérums rassemblés post-II et post-III. Les résultats sont montrés sur la figure 9 et décrits en détail cidessous .
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La figure 9A présente la réponse ELISA anti-06. Le LPS-O6 purifié de 06 (PaO6a,6c) a été déposé, en solution physiologique avec tampon phosphate (PBS) à 8 pg/ml, sur des plaques de micro-titration haute affinité (Nunc Maxisorp), à 4 °C pendant une nuit. Les plaques ont été bloquées avec du PBS-BSA à 1 % pendant 30 min sous agitation à TA. Les antisérums polyvalents de souris ont été pré-dilués au 1/100 ou au 1/10, puis de nouvelles dilutions par deux ont été effectuées dans les microplaques, avant incubation sous agitation à température ambiante pendant 30 minutes. Après lavage, l'anticorps murin lié a été dosé à l'aide d'IgG anti-souris de chèvre AffiniPure (H+L) conjuguée à une peroxydase, fournie par Jackson ImmunoLaboratories Inc. (réf : 115-035-003) diluée au 1/5 000 avec du PBS-0,05 % de tween-0,2 % de BSA. Les anticorps de détection ont été incubés sous agitation pendant 30 minutes à température ambiante. La couleur a été développée en utilisant 4 mg d'OPD + 5 pL d'H2O2 pour 10 mL de tampon citrate 0,1 M à pH 4,5 pendant 15 minutes en l'absence de lumière à température ambiante. La réaction a été stoppée avec 50 μΐ d'HCl, et la densité optique (DO) a été déterminée à 490 nm par rapport à 620 nm.
Le taux d'anticorps anti-06 présents dans le sérum est exprimé par des titres médians. Un TMG des sérums individuels a été calculé pour les 20 échantillons de chacun des groupes traités (10 pour le groupe témoin).
Une réponse immunitaire a été observée chez les souris après injection du bioconjugué formulé avec l'adjuvant. Aucune différence n'a été observée entre les doses. Des observations similaires ont été faites
101
BE2016/5783 concernant le pourcentage de séroconversion. Des réponses très faibles ou indétectables ont été observées avec la formulation ne contenant pas d'adjuvant.
LA figure 9B présente les titres opsoniques dans les cellules HL60 provenant de souris immunisées avec le bioconjugué O6-EPA formulé avec ou sans adjuvant.
Le dosage d'opsonophagocytose (OPA) a été réalisé dans des microplaques à fond rond avec 15 μΐ de cellules phagocytiques HL-60 (suspension ajustée à 5.106 cellules/mL), 15 pL de bactéries P. aeruginosa (cultivées en milieu TSA en boîtes de Petri), 15 μΐ des dilutions du sérum test, et 15 pL de complément porcin. Les sérums test inactivés rassemblés ont été dilués une première fois (pour une dilution finale au 1/16 ou au 1/50) dans du HBSS-BSA à 1 % et ajoutés à une souche de P. aeruginosa 06 (souche d'ID : HNCMB 170009, obtenue auprès de la Hungarian National Collection of Medical Bacteria) diluée pour arriver à un décompte de 200 à 250 UFC/puits à la fin du test.
Les cellules HL-60 (suspension ajustée à 5.106 cellules/mL) et le complément porcin (12,5 % dans le milieu final) ont été ajoutés dans chaque puits. À chaque échantillon testé correspondait un témoin contenant du complément inactivé.
Le mélange réactionnel a été incubé à 37 °C pendant 90 minutes sous agitation. Après une dilution au 1/200, 50 pL du volume obtenu a été transféré dans une microplaque à fond plat. 50 pL d'agar MH a été ajouté, suivi de PBS-0,9 % d'agar. Un comptage automatique des colonies a été effectué après une nuit d'incubation à 30 °C.
102
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L'activité opsonophagocytique est exprimée comme l'inverse de la dilution de sérum donnant au moins 50 % d'élimination.
Les données démontrent la fonctionnalité des anticorps induite sur après injection des formulations du groupe contenant un adjuvant.
En conclusion, cet exemple démontre que le bioconjugué O6-EPA de P. aeruginosa est à la fois immunogène et fonctionnel (autrement dit, induit la présence d'anticorps qui éliminent P. aeruginosa 06 in vivo) .
Exemple 7
Cet exemple démontre que les bioconjugués 06-PcrV de P. aeruginosa sont immunogènes.
Immunisation
Des groupes de 20 souris BALB/c âgées de 6 semaines et des groupes de 20 rats OFA-SD femelles âgés de 6 semaines ont été immunisés par voie IM aux jours 0, 14 et 28 avec 0,2 pg de bioconjugué 06-PcrV dans une formulation sans adjuvant ou contenant un adjuvant à base d'émulsion d'huile dans l'eau.
La réponse immunitaire des IgG a été déterminée par un dosage ELISA (avec un ELISA anti-06 et anti-PcrV). La fonctionnalité des anticorps a été évaluée, pour 06, par un dosage opsonophagocytique, et pour la PcrV, par un dosage hémolytique. La réponse immunitaire a été évaluée dans les sérums individuels collectés au jour 42 (postIII) et sur des sérums rassemblés post-II et post-III.
Conjugués testés
103
BE2016/5783
Trois conjugués 06-PcrV de P. aeruginosa ont été testés. Dans chaque cas, trois sites de glycosylation ont été introduits dans la PcrV et les chaînes 06 courtes, moyennes et longues ont été ajoutées aux sites de glycosylation.
long 06-PcrV moyen 06-PcrV court 06-PcrV Conj ugué
GO GO GO H- 3
3 I—1 Ο
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o\° o\° θ'
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BE2016/5783
ELISA anti-06 (sur des sérums de rats)
Le 06-LPS purifié a été déposé, en solution physiologique avec tampon phosphate (PBS) à 8 pg/ml, sur des plaques de micro-titration haute affinité (Nunc Maxisorp), à 4 °C pendant une nuit. Les plaques ont été bloquées avec du PBS-BSA à 1 % pendant 30 minutes sous agitation à TA. Les antisérums de rats ont été pré-dilués au 1/100 ou au 1/10, puis de nouvelles dilutions par deux ont été effectuées dans les micro-plaques, avant incubation sous agitation à TA pendant 30 minutes. Après lavage, les anticorps de rat liés ont été dosés à l'aide d'IgG anti-rat de chèvre AffiniPure (H+L) conjuguée à une peroxydase, fournie par Jackson ImmunoLaboratories Inc. (ref : 112-035-003) diluée au 1/2 500 avec du PBS0,05 % de tween. Les anticorps de détection ont été incubés sous agitation pendant 30 minutes à température ambiante. La couleur a été développée en utilisant 4 mg d'OPD + 5 pL d'PhCh pour 10 mL de tampon citrate 0,1 M à pH 4,5 pendant 15 minutes en l'absence de lumière à température ambiante. La réaction a été stoppée avec 50 μΐ d'HCl, et la densité optique (DO) a été déterminée à 490 nm par rapport à 620 nm. Le taux d'anticorps anti06 présents dans le sérum est exprimé par des titres médians. Un TMG a été calculé pour les 20 échantillons individuels de chacun des groupes traités.
ELISA anti-PcrV (sur des sérums de rats)
La PcrV purifiée marquée par une histidine a été déposée, en solution physiologique avec tampon phosphate (PBS) à 1 pg/mL, sur des plaques de micro-titration haute affinité (Nunc Maxisorp), à 4 °C pendant une nuit. Les
106
BE2016/5783 plaques ont été bloquées avec du PBS-BSA à 1 % pendant 30 minutes sous agitation à TA. Les antisérums de rats ont été pré-dilués au 1/400, puis de nouvelles dilutions par deux ont été effectuées dans les micro-plaques, avant incubation sous agitation à TA pendant 30 minutes. Après lavage, les anticorps de rat liés ont été dosés à l'aide d'IgG anti-rat de chèvre AffiniPure (H+L) conjuguée à une peroxydase, fournie par Jackson ImmunoLaboratories Inc. (réf : 112-035-003) diluée au 1/5 000 avec du PBS0,05 % de tween. Les anticorps de détection ont été incubés sous agitation pendant 30 minutes à température ambiante. La couleur a été développée en utilisant 4 mg d'OPD + 5 pL d'EJCg pour 10 mL de tampon citrate 0,1 M à pH 4,5 pendant 15 minutes en l'absence de lumière à température ambiante. La réaction a été stoppée avec 50 pL d'HCl, et la densité optique (DO) a été déterminée à 490 nm par rapport à 620 nm.
Le taux d'anticorps anti-PcrV présents dans le sérum est exprimé par des titres médians. Un TMG a été calculé pour les 20 échantillons de chacun des groupes traités.
ELISA anti-06 (sur des sérums de souris)
Le O6-LPS purifié a été déposé, en solution physiologique avec tampon phosphate (PBS) à 8 pg/mL, sur des plaques de micro-titration haute affinité (Nunc Maxisorp), à 4 °C pendant une nuit. Les plaques ont été bloquées avec du PBS-BSA à 1 % pendant 30 minutes sous agitation à TA. Les antisérums polyvalents de souris ont été pré-dilués au 1/100 ou au 1/10, puis de nouvelles dilutions par deux ont été effectuées dans les micro107
BE2016/5783 plaques, avant incubation sous agitation à TA pendant 30 minutes. Après lavage, les anticorps de souris liés ont été dosés à l'aide d'IgG anti-souris de chèvre AffiniPure (H+L) conjuguée à une peroxydase, fournie par Jackson ImmunoLaboratories Inc. (réf : 115-035-003) diluée au 1/2 500 avec du PBS-0,05 % de tween. Les anticorps de détection ont été incubés sous agitation pendant 30 minutes à température ambiante. La couleur a été développée en utilisant 4 mg d'OPD + 5 pL d'PhCh pour 10 mL de tampon citrate 0,1 M à pH 4,5 pendant 15 minutes en l'absence de lumière à température ambiante. La réaction a été stoppée avec 50 pL d'HCl, et la densité optique (DO) a été déterminée à 490 nm par rapport à 620 nm. Le taux d'anticorps anti-06 présents dans le sérum est exprimé par des titres médians. Un TMG a été calculé pour les 20 échantillons individuels de chacun des groupes traités.
ELISA anti-PcrV (sur des sérums de souris)
La PcrV purifiée marquée par une histidine a été déposée, en solution physiologique avec tampon phosphate (PBS) à 1 pg/mL, sur des plaques de micro-titration haute affinité (Nunc Maxisorp), à 4 °C pendant une nuit. Les plaques ont été bloquées avec du PBS-BSA à 1 % pendant 30 minutes sous agitation à TA. Les antisérums de souris ont été pré-dilués au 1/400, puis de nouvelles dilutions par deux ont été effectuées dans les micro-plaques, avant incubation sous agitation à TA pendant 30 minutes. Après lavage, les anticorps de souris liés ont été dosés à l'aide d'IgG anti-souris de chèvre AffiniPure (H+L) conjuguée à une peroxydase, fournie par Jackson
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BE2016/5783
ImmunoLaboratories Inc. (réf : 115-035-003) diluée au 1/5 000 avec du PBS-0,05 % de tween. Les anticorps de détection ont été incubés sous agitation pendant 30 minutes à température ambiante. La couleur a été développée en utilisant 4 mg d'OPD + 5 pL d'PhCb pour 10 mL de tampon citrate 0,1 M à pH 4,5 pendant 15 minutes en l'absence de lumière à température ambiante. La réaction a été stoppée avec 50 pL d'HCl, et la densité optique (DO) a été déterminée à 490 nm par rapport à 620 nm.
Le taux d'anticorps anti-PcrV présents dans le sérum est exprimé par des titres médians. Un TMG a été calculé pour les 20 échantillons de chacun des groupes traités.
Réponse à un dosage d'opsonophagocytose (OPA) anti-06
Le dosage d'opsonophagocytose (OPA) a été réalisé dans des microplaques à fond rond avec 15 pL de cellules phagocytiques HL-60 (suspension ajustée à 5.106 cellules/mL), 15 pL de bactéries P. aeruginosa (cultivées en milieu TSA en boîtes de Petri), 15 pL des dilutions du sérum test et 15 pL de complément porcin.
Les sérums test inactivés ont été dilués une première fois (1/4) dans du HBSS-BSA à 1 % et ajoutés à une souche de P. aeruginosa (GVXN 5871 diluée pour arriver à un décompte de 200 à 250 UFC/puits à la fin du test) .
Les cellules HL-60 (suspension ajustée à 5.106 cellules/mL) et le complément porcin (12,5 % dans le milieu final) ont été ajoutés dans chaque puits. À chaque
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BE2016/5783 échantillon testé correspondait un témoin contenant du complément inactivé.
Le mélange réactionnel a été incubé à 37 °C pendant 90 minutes sous agitation. Après une dilution au 1/200, 50 pL du volume obtenu a été transféré dans une microplaque à fond plat. 50 pL d'agar MH a été ajouté, suivi de PBS-0,9 % d'agar (et 50 pL supplémentaires pour des raisons d'innocuité). Un comptage automatique des colonies a été effectué après une nuit d'incubation à 30 °C.
L'activité opsonophagocytique a été exprimée comme l'inverse de la dilution de sérum donnant au moins 50 % d'élimination.
Réponse d'inhibition de l'hémolyse anti-PcrV
ATCC 29260 (PCRV+) a été cultivée pendant une nuit à 37 °C avec 5 % de CCg, en milieu Agar TSA en boîtes de Petri et récoltée avec 5 mL de milieu liquide MinS. Quelques pL ont été inoculés dans une fiole de Wyame et mis en croissance pendant 4 heures.
Des dilutions par deux des sérums test ont été effectuées avec 80 pL d'une solution saline de tampon phosphate (DPBS) dans des microplaques à fond en U à 96 puits.
pL d'ATCC 29260 diluée 3 fois ont été ajoutés (dilution permettant d'effectuer la lyse de 100 % des érythrocytes de lapin). 80 pL d'érythrocytes purifiés et dilués de lapin ont ensuite été ajoutés dans chaque puits La dilution des érythrocytes de lapin a été déterminée pour chaque dosage afin d'obtenir une inhibition identique et standard de l'hémolyse. Les plaques ont été
110
BE2016/5783 centrifugées à 1 000 tpm, à 4 °C pendant 10 min et incubées à 37 °C pendant 2 heures.
Les plaques ont ensuite été centrifugées à
I 000 tpm pendant 10 minutes à 4 °C. 150 pL (surnageant) de chaque puits ont ensuite été transférés dans une microplaque à fond plat et la densité optique a été déterminée à 405 nm avec un lecteur de plaques de microtitration.
L'activité d'inhibition de l'hémolyse a été exprimée par les titres médians (50 % d'inhibition) des sérums rassemblés.
ELISA d'IgG anti-06 ensembles de sérums post III individuels et post II de 4 rats ont été évalués par ELISA sur l'ensemble des groupes de l'expérience. Les résultats sont montrés sur la figure 14.
Un effet de stimulation est observé pour les sérums rassemblés post II à post III. Le bioconjugué 06 sans adjuvant présente une faible immunogénicité par comparaison avec l'ensemble des bioconjugués 06 formulés dans une émulsion d'huile dans l'eau contenant un adjuvant, qui sont plus immunogènes.
Réponse immunitaire anti-PcrV ensembles de sérums post III individuels et post
II de 4 rats ont été évalués par ELISA sur l'ensemble des groupes PcrV de l'expérience (G5 à G9).
Les moyennes géométriques des titres médians obtenus à la fois pour les sérums de rats post II et post III sont présentées sur la figure 13.
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Un effet de stimulation a été observé entre les sérums rassemblés post II et post III. Une très faible réponse immunitaire anti-PcrV ou aucune réponse immunitaire anti-PcrV n'a été observée avec le bioconjugué 06-PcrV sans adjuvant. Par opposition, une bonne réponse immunitaire a été observée contre la protéine PcrV support pour les trois bioconjugués 06 formulés dans un adjuvant d'huile dans l'eau.
La réponse en anticorps la plus élevée a été observée avec le bioconjugué 06-PcrV du groupe 5 comprenant rapport à 20 % de sucres/protéines (la concentration la plus élevée en protéines).
Dosage d'inhibition de l'hémolyse par la PcrV :
Les résultats des dosages d'inhibition de l'hémolyse par la PcrV sont présentés sur la figure 10. Chez les souris immunisées avec les conjugués 06-PcrV, de bons taux d'inhibition de l'hémolyse par la PcrV ont été obtenus pour l'ensemble des conjugués testés. La PcrV a permis de générer des anticorps fonctionnels avec des bons taux d'inhibition de l'hémolyse par la PcrV pour l'ensemble des bioconjugués 06-PcrV testés sur les souris Bien que des chaînes plus courtes de saccharides présentant un rapport saccharides/protéines de 20 % ont révélé une tendance vers de meilleurs taux que les autres conjugués, l'amélioration ne s'est pas avérée statistiquement significative.
Chez à la fois les souris et les rats, la présence d'une émulsion d'huile dans l'eau a permis d'améliorer la réponse immunitaire contre la PcrV.
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Résultats de 1'opsonophagocytose
Les résultats des dosages de 1'opsonophagocytose sont présentés sur la figure 12. Une bonne réponse d ' opsonophagocytose a été obtenue dans des échantillons pour lesquels la formulation de conjugué contenait un adjuvant dans une émulsion d'huile dans l'eau. Celle-ci n'a pas été testée dans des échantillons ne contenant pas d'adjuvants. Des études ultérieures ont révélé de très faibles réponses opsoniques dans les sérums provenant de souris immunisées avec des conjugués ne contenant pas d'adjuvants.
La portée de la présente invention ne doit en aucun cas être limitée par les modes de réalisation spécifiques décrits dans la présente description. En effet, diverses modifications du sujet fourni dans la présente description, en plus de celles décrites, deviendront évidentes pour l'homme du métier après la lecture de la description précédente et des figures connexes. De telles modifications sont destinées à s'inscrire dans la portée des revendications jointes.
Diverses publications, divers brevets et applications de brevets sont cités dans la présente description, dont les descriptions sont incorporées ici en référence dans leur intégralité.
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Claims (58)

  1. REVENDICATIONS
    1. Conjugué comprenant un antigène lié de manière covalente à une protéine porteuse PcrV de Pseudomonas aeruginosa comprenant une séquence d'acides aminés présentant au moins 70 % ou 80 % d'identité avec la séquence des SEQ ID NO : 1 à 4, dans lequel l'antigène est lié (directement ou par l'intermédiaire d'un lieur) à un résidu acide aminé asparagine de la protéine porteuse PcrV de P. aeruginosa dans lequel le résidu asparagine fait partie de la séquence consensus D/E-XN-X-S/T introduite dans la séquence d'acides aminés présentant au moins 70 % ou 80 % d'identité avec la séquence des SEQ ID NO : 1 à 4, dans laquelle X représente n'importe quel acide aminé excepté la proline, le résidu asparagine étant situé à une position correspondant aux acides aminés entre les acides aminés 24 à 166 ou entre les acides aminés 281 à 317, ou au niveau de l'acide aminé 317 de la SEQ ID NO : 3 ou à une position correspondant aux acides aminés entre les acides aminés 1 à 143 ou entre les acides aminés 258 à 2 94, ou au niveau de l'acide aminé 2 94 de la
    SEQ ID NO : 4.
  2. 2. Conjugué selon la revendication 1, dans lequel le résidu asparagine fait partie de la séquence consensus D/E-X-N-X-S/T, dans laquelle X représente n'importe quel acide aminé excepté la proline, le résidu asparagine n'étant pas introduit par une mutation dans la séquence de la SEQ ID NO : 5, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec la séquence de la SEQ ID NO : 5.
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  3. 3. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel un peptide comprenant la séquence consensus D/E-X-N-X-S/T est introduit dans la séquence d'acides aminés par l'élimination d'une séquence du peptide PcrV et son remplacement par le peptide comprenant la séquence consensus D/E-X-N-X-S/T.
  4. 4. Conjugué selon la revendication 3, dans lequel la séquence du peptide PcrV contient de 1 à 7 acides aminés.
  5. 5. Conjugué selon la revendication 3, dans lequel la séquence du peptide PcrV contient un acide aminé.
  6. 6. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel le peptide comprenant la séquence consensus D/E-X-N-X-S/T est introduit dans la séquence d’acides aminés à une position située entre les résidus acides aminés 24 et 143 de la SEQ ID NO : 3 ou entre les résidus acides aminés 1 et 120 de la SEQ ID NO : 4.
  7. 7. Conjugué selon la revendication 6, dans lequel le peptide comprenant la séquence consensus D/E-X-N-XS/T est introduit dans la séquence d’acides aminés à une position située entre les résidus acides aminés 24 et 48
    de la SEQ ID NO : 3 ou entre les résidus acides aminés 1 et 24 de la SEQ ID NO : 4. 8 . Conj ugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel au moins 2, 3 ou 4
    séquences consensus D/E-X-N-X-S/T sont introduites dans la séquence correspondant à l'une quelconque des SEQ ID NO : 1 à 4 ou une séquence présentant au moins 70 % ou 80 % d'identité avec celles-ci.
    115
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  8. 9. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel la protéine porteuse PcrV présente une séquence comprenant au moins l'une des
    SEQ ID NO : 6 à 62.
  9. 10. Conjugué selon la revendication 9, dans lequel la protéine porteuse PcrV présente comprenant au moins l'une des SEQ ID NO une sequence
    6 à 12 et 33.
  10. 11. Conjugué selon la revendication 10, dans lequel la protéine porteuse PcrV présente une séquence comprenant au moins 3 des SEQ ID NO : 6 à 12 et 33.
  11. 12. Conjugué selon la revendication 10 ou 11, dans lequel la protéine porteuse PcrV présente une séquence comprenant la SEQ ID NO : 6 et/ou la SEQ ID NO : 9 et/ou la SEQ ID NO : 11 et/ou la SEQ ID NO : 33.
  12. 13. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel l'antigène est un saccharide.
  13. 14. Conjugué selon la revendication 13, dans lequel l'antigène est un saccharide capsulaire bactérien.
  14. 15. Conjugué selon la revendication 13, dans lequel l'antigène est un lipopolysaccharide ou un lipooligosaccharide bactérien.
  15. 16. Conjugué selon la revendication 15, dans lequel l'antigène est un lipopolysaccharide provenant de P. aeruginosa.
  16. 17. Conjugué selon la revendication 16, dans lequel l'antigène est un O-antigène provenant de P. aeruginosa, éventuellement 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, OlO, 011, 012, 013, 014, 015, 016, 017, 018, 019 ou 020, par exemple 06 ou 011.
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  17. 18. Protéine PcrV comprenant une séquence d'acides aminés présentant au moins 70 % ou 80 % d'identité avec la séquence des SEQ ID NO : 1 à 4, ladite séquence d'acides aminés comprenant une séquence consensus D/EX-N-X-S/T, dans laquelle X représente n'importe quel acide aminé excepté la proline.
  18. 19. Protéine PcrV selon la revendication 18, dans laquelle la séquence consensus D/E-X-N-X-S/T, dans laquelle X représente n'importe quel acide aminé excepté la proline, est située à une position comprise entre les acides aminés 23 et 166 ou entre les acides aminés 281 et 317 ou au niveau de l'acide aminé 317 de la SEQ ID NO : 3.
  19. 20. Protéine PcrV selon la revendication 18, dans laquelle la séquence consensus D/E-X-N-X-S/T, dans laquelle X représente n'importe quel acide aminé excepté la proline, est située entre les acides aminés 1 et 143 ou entre les acides aminés 258 et 294 ou au niveau de l'acide aminé 294 de la SEQ ID NO : 4.
  20. 21. Protéine PcrV selon l'une quelconque des revendications 18 à 20, dans laquelle un peptide comprenant la séquence consensus D/E-X-N-X-S/T est introduit dans la séquence d’acides aminés par l'élimination d'une séquence du peptide PcrV et son remplacement par un peptide comprenant la séquence consensus D/E-X-N-X-S/T.
  21. 22. Protéine PcrV selon la revendication 21, dans laquelle la séquence du peptide PcrV contient de 1 à 7 acides aminés.
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  22. 23. Protéine PcrV selon la revendication 21, dans laquelle la séquence du peptide PcrV contient un acide aminé.
  23. 24. Protéine PcrV selon l'une quelconque des revendications 18 à 23, dans laquelle le peptide comprenant la séquence consensus D/E-X-N-X-S/T est introduit dans la séquence d’acides aminés à une position située entre les résidus acides aminés 24 et 143 de la SEQ ID NO : 3 ou entre les résidus acides aminés 1 et 120 de la SEQ ID NO : 4.
  24. 25. Protéine PcrV selon la revendication 24, dans laquelle le peptide comprenant la séquence consensus D/E-X-N-X-S/T est introduit dans la séquence d’acides aminés à une position située entre les résidus acides aminés 24 et 48 de la SEQ ID NO : 3 ou entre les résidus acides aminés 1 et 24 de la SEQ ID NO : 4.
  25. 26. Protéine PcrV selon l'une quelconque des revendications 18 à 25, dans laquelle au moins 2, 3 ou 4 séquences consensus D/E-X-N-X-S/T sont introduites dans la séquence correspondant à l'une quelconque des SEQ ID NO : 1 à 4 ou dans une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec celles-ci.
  26. 27. Protéine PcrV selon l'une quelconque des revendications 18 à 26, qui a une séquence d'acides aminés qui comprend au moins une séquence parmi les SEQ ID NO : 6 à 62.
  27. 28. Protéine PcrV selon la revendication 27, qui a une séquence d'acides aminés qui comprend au moins une séquence parmi les SEQ ID NO : 6 à 12 et 33.
    118
    BE2016/5783
  28. 29. Protéine PcrV selon la revendication 28, qui a une séquence d'acides aminés qui comprend au moins 3 séquences parmi les SEQ ID NO : 6 à 12 et 33.
  29. 30. Protéine PcrV selon la revendication 28 ou 29,
    qui a une séquence d'acides aminés qui comprend la SEQ ID NO : 6 et/ou la SEQ ID NO : 9 et/ou la SEQ ID NO : 11 et/ou la SEQ ID NO : 33.
  30. 31. Protéine PcrV selon l'une quelconque des revendications 18 à 30, dans laquelle la séquence d’acides aminés comprend un marqueur peptidique pouvant servir à la purification de la protéine PcrV.
  31. 32. Protéine PcrV selon la revendication 31, dans laquelle le marqueur peptidique est situé à l'extrémité C-terminale de la séquence d’acides aminés.
  32. 33. Protéine PcrV selon l'une quelconque des revendications 18 à 32, dans laquelle le marqueur peptidique comprend six résidus histidine.
  33. 34. Protéine PcrV selon l'une quelconque des revendications 18 à 33, dans laquelle la séquence d’acides aminés comprend une séquence de tête qui est capable de diriger la protéine PcrV vers le périplasme d'une bactérie.
  34. 35. Protéine PcrV selon la revendication 34, dans laquelle la séquence de tête a une séquence d'acides aminés présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 63.
  35. 36. Composition immunogène comprenant le conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, ou les protéines PcrV selon l'une quelconque des revendications 18 à 35, et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
    119
    BE2016/5783 selon la les antigènes
  36. 37. Composition immunogène selon la revendication 36 comprenant en outre des antigènes supplémentaires.
  37. 38. Composition immunogène revendication 37 dans laquelle supplémentaires sont choisis dans le groupe constitué par un conjugué d'un O-antigène et d'une protéine porteuse, un conjugué d'un polysaccharide capsulaire bactérien et d'une protéine porteuse, un conjugué d'un LOS, d'une protéine porteuse et d'une protéine.
  38. 39. Procédé de préparation de la composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 36 à 38 comprenant l’étape de mélange du conjugué ou de la protéine PcrV avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.
  39. 40. Conjugué ou protéine PcrV selon l'une quelconque des revendications 1 à 35 destiné(e) à être utilisé (e) dans le traitement d'une infection.
  40. 41. Conjugué ou protéine PcrV selon l'une quelconque des revendications 1 à 35 destiné(e) à être utilisé (e) dans le traitement d'une infection par P. aeruginosa.
  41. 42. Conjugué de PcrV destiné à être utilisé selon la revendication 40 ou la revendication 41, ledit traitement étant celui pour un sujet humain qui en a besoin.
  42. 43. Conjugué, protéine PcrV ou composition immnuogène selon l'une quelconque des revendications précédentes 1 à 42, utilisé dans le traitement ou la prévention d'une infection par Pseudomonas.
    120
    BE2016/5783
  43. 44. conjugué, proteine PcrV ou composition immunogène selon l'une quelconque des revendicayions précédentes 1 à 42, utilisé dans le traitement ou la prévention
    Pseudomonas par
    P.
    aerugrnosa, d'une infection
  44. 45. Polynucléotide codant pour la protéine PcrV selon l'une quelconque des revendications 18 à 35,
  45. 46. Polynucléotide codant pour une protéine PcrV, dont la séquence de nucléotides code pour un polypeptide ayant une séquence d'acides aminés présentant au moins 70 % ou 80 % d'identité avec l'une quelconque des SEQ ID NO : 1 à 4.
  46. 47. Vecteur comprenant le polynucléotide selon la revendication 43 ou la revendication 46.
  47. 48. Cellule hôte comprenant : nucléique
    i) Un acide glycosyltransférase ;
    ii) Un acide codant codant pour pour une une nucléique oligosaccharyl-transférase ; et iii) Un acide nucléique codant pour une protéine PcrV de P. aeruginosa selon l’une quelconque des revendications 18 à 35.
  48. 49. Cellule hôte selon la revendication 48 dans laquelle l'acide nucléique qui code pour une glycosyltransférase est dérivé d'un agrégat rfb de Pseudomonas, dans lequel ladite séquence d'acide nucléique est éventuellement intégrée de manière stable dans le génome de la cellule hôte.
  49. 50. Cellule hôte selon la revendication 49 dans laquelle ladite Pseudomonas est Pseudomonas aeruginosa, éventuellement du sérotype 06 ou 011.
    121
    BE2016/5783
  50. 51. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 48 à 50, dans laquelle 1 ' oligosaccharyltransférase est dérivée de Campylobacter.
  51. 52. Cellule hôte selon la revendication 51 dans laquelle 1'oligosaccharyl-transférase est la PglB de C. jejuni.
  52. 53. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 48 à 50, dans laquelle l'acide nucléique codant pour une protéine PcrV de P. aeruginosa se trouve dans un plasmide de la cellule hôte.
  53. 54. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 48 à 53, comprenant en outre une enzyme formyltransférase, dans laquelle ledit acide nucléique code pour une protéine présentant environ ou au moins ou 99
    80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, d'identité ou d'homologie avec la SEQ ID NO : 65, ou dans laquelle ledit acide nucléique code pour la
    SEQ ID NO : 65.
  54. 55. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 48 à 54, comprenant en outre un acide nucléique codant pour une polymérase wzy, dans laquelle ledit acide nucléique code pour une protéine présentant environ ou au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % d'identité ou d'homologie avec la SEQ ID NO : 66, ou dans laquelle ledit acide nucléique code pour la SEQ ID NO : 66.
  55. 56. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 54 et 55, dans laquelle l'acide nucléique codant pour une enzyme formyltransférase et/ou l'acide nucléique codant pour une polymérase wzy ont été intégrés de manière stable dans le génome de la cellule hôte.
    122
    BE2016/5783
  56. 57. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 54 et 55, dans laquelle un gène codant pour une enzyme formyltransférase et/ou un gène codant pour une polymérase wzy est présent dans un plasmide de
    5 la cellule hôte.
  57. 58. Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 48 à 57, ladite cellule hôte étant E. coli.
  58. 59. Procédé de production d'un bioconjugué 10 comprenant une protéine PcrV de P. aeruginosa liée à un saccharide, ledit procédé comprenant la culture de la cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 48 à 58, dans des conditions adaptées à la production de protéines .
    15 60. Bioconjugué produit par le procédé de la revendication 59, ledit bioconjugué comprenant un saccharide lié à une protéine PcrV de P. aeruginosa.
    139
    BE2016/5783
    ABRÉGÉ
    COMPOSITION IMMUNOGÈNE
    La présente invention concerne un conjugué comprenant un 5 antigène (par exemple un antigène saccharidique) lié de manière covalente à une protéine porteuse PcrV de Pseudomonas aeruginosa comprenant une séquence d'acides aminés présentant au moins 80 % d'identité avec la séquence des SEQ ID NO : 1 à 4, dans lequel l'antigène est lié (directement ou par l'intermédiaire d'un
    10 lieur) à un résidu acide aminé de la protéine porteuse PcrV de P. aeruginosa. L'invention concerne également des protéines PcrV de Pseudomonas aeruginosa qui contiennent des séquences consensus comprenant des sites de glycosylation.
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