FR2855528A1 - Procede de maintien ou d'amelioration d'activite de nitrile hydratase et procede de production d'un amide a partir d'un nitrile - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un procédé qui permet, non seulement de maintenir l'activité de nitrile hydratase de cellules possédant une telle activité ou d'un matériel obtenu par traitement de telles cellules, dans des conditions où ces cellules ne croissent pas, mais aussi d'améliorer l'activité de nitrile hydratase de cellules possédant une telle activité ou d'un matériel obtenu par traitement de telles cellules, chez lesquelles ou lequel cette activité a baissé. Ce procédé comporte le fait de mettre des cellules contenant une nitrile hydratase, ou un matériel obtenu par traitement de telles cellules, en contact avec un agent oxydant, dans des conditions où les cellules ne croissent pas.La présente invention concerne aussi un procédé de production d'un amide à partir d'un nitrile, dans lequel on se sert de cellules contenant une nitrile hydratase, ou d'un matériel obtenu par traitement de telles cellules, dont a maintenu ou amélioré l'activité de nitrile hydratase en les ou le mettant en contact avec un agent oxydant.
Description
Procédé de maintien ou d'amélioration d'activité de nitrile hydratase et
procédé de production d'un amide à partir d'un nitrile
La présente invention concerne un procédé de maintien ou d'amélioration de l'activité d'une nitrile hydratase utilisable dans l'in10 dustrie. Cette activité est une activité d'hydratation de nitrile, que l'on peut doser selon le procédé décrit plus loin dans les exemples L'activité d'une nitrile hydratase consistant à hydrater des nitriles est une activité instable, qui baisse facilement au fil du temps. Pour 15 empêcher une telle réduction de cette activité d'une nitrile hydratase au fil du temps et maintenir cette activité, on a proposé, par exemple dans les documents JP-B n 5-43351 (1993) et n 4-48435 (1992), un procédé qui consiste à ajouter en tant que stabilisant au moins un composé, choisi parmi un nitrile, un amide et un acide organique ou un 20 sel d'un tel acide, à une suspension ou une solution qui contient un microorganisme contenant une nitrile hydratase ou un matériel obtenu par traitement d'un tel microorganisme.
On a aussi divulgué, par exemple dans le document JP-A n 8112089 (1996), un procédé de conservation dans lequel un microorga25 nisme ou un matériel obtenu par traitement d'un microorganisme se trouve en suspension dans un milieu aqueux qui est neutre ou faiblement basique et contient un sel inorganique dissous en une concentration qui vaut de 100 mM à la concentration de saturation de ce sel.
Mais ces deux procédés ne peuvent servir qu'à maintenir une 30 activité de nitrile hydratase car dans ces divers documents, on ne parle pas d'un effet d'augmentation de l'activité de nitrile hydratase.
On a divulgué, par exemple dans le document JP-B 2-35 (1990), un procédé qui permet d'augmenter l'activité d'hydratation de nitrile en produisant par culture un microorganisme contenant une nitrile hydra- tase et en faisant ensuite subir quelque traitement au microorganisme ainsi obtenu ou à un matériau obtenu par traitement de ce microorganisme. Ledit procédé comporte le fait d'irradier avec de la lumière le microorganisme Gram-positif résultant qui possède une activité de 5 nitrile hydratase. Mais ce procédé ne peut servir qu'à augmenter l'activité de nitrile hydratase d'un microorganisme obtenu par culture, et ne permet pas d'améliorer l'activité de nitrile hydratase d'un microorganisme dont cette activité a baissé. En outre, ce procédé ne concerne pas le maintien de l'activité de nitrile hydratase.
On a aussi rapporté, par exemple dans le document JP-A 200217339, que pour cultiver un microorganisme contenant une nitrile hydratase, il faut lui fournir de l'oxygène et maintenir durant la culture la concentration d'oxygène dissous dans l'intervalle allant de 1 ppm à sa concentration de saturation, grâce à quoi l'on peut améliorer la crois15 sance dudit microorganisme, et obtenir en même temps un microorganisme doté d'une forte activité de nitrile hydratase. Mais dans ce document, on s'est purement et simplement contenté d'indiquer que, durant la culture, c'està-dire dans les conditions dans lesquelles croît le microorganisme contenant une nitrile hydratase, il existe pour l'ex20 pression d'une activité de nitrile hydratase une valeur optimale de la concentration d'oxygène dissous dans le milieu de culture, et il n'y a dans ce document aucune allusion au maintien ou à l'amélioration de l'activité de nitrile hydratase dans des conditions o le microorganisme ne croît plus, c'est-àdire une fois terminée l'opération de culture.
On n'a pas encore totalement élucidé tous les détails des mécanismes d'expression et de baisse d'une activité de nitrile hydratase, mais on a rapporté (voir par exemple l'article de M. Okada, M. Tsujishima et I. Endo, paru en 2001 dans "Riken Review", n 41, pages 5860) que, par exemple, la baisse de l'activité d'hydratation de nitrile 30 d'une nitrile hydratase à fer dérivée de Rhodococcus sp. N-771 peut être attribuée à l'oxydation en acide cystéine-sulfinique, par l'oxygène de l'air, de l'acide cystéine-sulfénique lié par coordination à un atome central de fer trivalent non-hème.
On a également indiqué (voir par exemple l'article de M. Okada, M. Tsujishima et I. Endo, paru en 2001 dans la revue japonaise intitulée "Nouvelles réactions en chimie organique", n 3, pages 17-20) que, par exemple, l'activité d'une nitrile hydratase à fer dérivée de Rhodo5 coccus sp. N-771 est perdue quand l'atome central de fer trivalent est réduit à l'état de fer divalent par du 2-cyano-2-hydroperoxy-propane pendant que l'acide cystéine-sulfénique est oxydé en acide cystéinesulfinique.
On a aussi indiqué (voir par exemple l'article de P.K. Mascha10 rak paru en 2002 dans "Coordination Chemistry Review", n 225, pages 201-214) que, sans l'avoir complètement déterminée, on pense que la structure d'une nitrile hydratase dont l'atome central est un atome de cobalt, dérivée de Rhodococcus rhodochrous J1, est semblable à celle d'une nitrile hydratase à fer.
Le but de la présente invention est de proposer un procédé qui permette non seulement de maintenir l'activité de nitrile hydratase de cellules possédant une telle activité ou d'un matériel obtenu par traitement de telles cellules dans des conditions o ces cellules ne croissent 20 pas, mais aussi d'améliorer l'activité de nitrile hydratase de cellules possédant une telle activité ou d'un matériel obtenu par traitement de telles cellules chez lesquelles ou lequel cette activité a baissé.
Les auteurs de la présente invention ont effectué des recherches poussées pour résoudre ce problème, et sont parvenus au résultat sui25 vant: ils ont trouvé que l'on peut maintenir l'activité de nitrile hydratase de cellules possédant une telle activité ou d'un matériel obtenu par traitement de telles cellules en mettant ces cellules ou ce matériel en contact avec un agent oxydant dans des conditions o les cellules ne croissent pas, et qu'en outre, on peut améliorer l'activité de nitrile 30 hydratase de cellules possédant une telle activité ou d'un matériel obtenu par traitement de telles cellules chez lesquelles ou lequel cette activité a baissé, en mettant ces cellules ou ce matériel en contact avec un agent oxydant, avant ou pendant une réaction d'hydratation de nitrile.
Selon la présente invention, on propose un procédé qui permet de maintenir ou d'améliorer une activité de nitrile hydratase, lequel procédé comporte le fait de mettre des cellules contenant une nitrile hydratase, ou un matériel obtenu par traitement de telles cellules, en 5 contact avec un agent oxydant, dans des conditions o ces cellules ne croissent pas.
Il est préférable que l'agent oxydant utilisé dans le procédé de l'invention soit un agent oxydant dont le potentiel standard d'électrode, par rapport à l'électrode standard à hydrogène, vaut de 0,1 à 2,1 V. Il 10 est par ailleurs avantageux de choisir pour cet agent oxydant au moins un élément de l'ensemble formé par l'oxygène, le peroxyde d'hydrogène, le ferricyanure de potassium et le persulfate d'ammonium.
Si l'on emploie de l'oxygène comme agent oxydant, il est avantageux de l'apporter sous la forme d'un gaz contenant de l'oxygène.
Dans le procédé de l'invention, il est préférable que la concentration de l'agent oxydant vaille de 1 ppm en poids à 10 % en poids. Il est également préférable de laisser lesdites cellules ou ledit matériel en contact avec l'agent oxydant, d'une part à une température de 0 à 60 C, et d'autre part dans un milieu dont le pH vaut de 5 à 10.
Le procédé de la présente invention est particulièrement intéressant dans le cas des nitrile hydratases dont les molécules contiennent du cobalt, que l'on appelle aussi "nitrile hydratases à cobalt".
Un mode avantageux de réalisation de la présente invention est celui o l'on met en contact avec l'agent oxydant, dans des conditions 25 o les cellules ne croissent pas, des cellules o est exprimée, par recombinaison génétique, une nitrile hydratase à cobalt, ou un matériel obtenu par traitement de telles cellules.
Le procédé de la présente invention peut s'appliquer en particulier à des cellules d'un microorganisme contenant une nitrile hydratase, 30 ou à un matériel obtenu par traitement de cellules d'un tel microorganisme. Il peut alors s'agir d'un microorganisme génétiquement modifié, en particulier d'une souche d'Escherichia coli génétiquement modifiée.
Dans ce dernier cas, la souche hôte d'Escherichia coli génétiquement modifiée peut être notamment la souche W3110 (ATCC 27325), la sou- che HB101 (ATCC 33694), la souche JM109 (ATCC 53223) ou la souche WA802 (ATCC 33526), lesquelles souches dérivent toutes de la souche K-12 d'Escherichia coli.
Une application intéressante du procédé de l'invention consiste 5 à se servir de cellules contenant une nitrile hydratase ou d'un matériel obtenu par traitement de telles cellules pour produire un amide à partir d'un nitrile, et l'invention a donc également pour objet un procédé de production d'un amide à partir d'un nitrile, procédé dans lequel on se sert du produit fourni par le procédé de l'invention, c'est-à-dire de cel10 lules contenant une nitrile hydratase ou d'un matériel obtenu par traitement de telles cellules dont a maintenu ou amélioré l'activité de nitrile hydratase en les ou le mettant en contact avec un agent oxydant.
Dans ce qui suit, on va décrire la présente invention de façon 15 détaillée.
La nitrile hydratase dont il est ici question est une enzyme qui peut hydrater le groupe cyano d'un nitrile de manière à former l'amide correspondant. Les cellules dont il est ici question peuvent être des microorganismes, des cellules végétales ou des cellules animales. Au20 cune restriction particulière n'est imposée au microorganisme contenant une nitrile hydratase, pourvu qu'il s'agisse d'un microorganisme capable d'hydrater le groupe cyano d'un nitrile de manière à former l'amide correspondant. Parmi les microorganismes de ce type, il y a par exemple Pseudonocardia thermophila JCM3095, Achromobacter xerosis 25 IFO12668 et Rhodococcus rhodochrous J1.
La présente invention englobe aussi le cas d'un OGM o un gène de nitrile hydratase, cloné à partir d'un microorganisme du type indiqué ci-dessus, est exprimé chez un hôte arbitrairement choisi. Cet hôte peut être une souche d'Escherichia coli, un microorganisme du genre 30 Bacillus, tel Bacillus subtilis, une levure, un actinomycète, ou encore un champignon filamenteux. Parmi les souches hôtes Escherichia coli génétiquement modifiées, on peut mentionner par exemple les souches W3110 (ATCC 27325), HB101 (ATCC 33694), JM109 (ATCC 53223) et WA802 (ATCC 33526) , toutes dérivées de la souche K-12 d'Esche- richia coli. Parmi les exemples concrets de tels OGM, on peut citer la souche MT-10822, qui a été déposée, avec le numéro FERM BP-5785, le 7 février 1996 auprès de l'Institut National des Biosciences et de la Technologie humaine (Higashi 1-1-3, Tsukuba, préfecture d'Ibaraki, 5 Japon), Agence pour la Science Industrielle et la Technologie du Ministère Japonais du Commerce International et de l'Industrie, sous couvert du Traité de Budapest sur la reconnaissance internationale du dépôt de microorganismes aux fins de la procédure en matière de brevets.
La présente invention couvre également le cas d'un OGM qui 10 exprime une nitrile hydratase mutante, dotée d'améliorations supplémentaires concernant sa résistance aux médicaments, sa thermostabilité, etc., par remplacement d'un ou de plusieurs de ses acides aminés constitutifs par un ou plusieurs autres acides aminés, ou par délétion, élimination ou insertion d'un ou plusieurs acides aminés constitutifs, 15 opérations réalisées par des techniques de recombinaison d'ADN.
Pour le propos de la présente invention, on prépare habituellement un microorganisme en opérant selon les techniques connues dans les domaines de la biologie moléculaire, du génie biologique et du génie génétique. Il est par exemple habituel d'inoculer le microorganisme 20 dans un milieu liquide comme du milieu LB ou du milieu M9 et de le laisser croître à une température appropriée pour la culture, qui vaut en général de 20 à 50 C, mais peut valoir 50 C ou plus dans le cas d'une bactérie thermophile, et de séparer ensuite, par exemple par centrifugation, le microorganisme d'avec le milieu liquide de culture, ce 25 qui donne un microorganisme auquel on peut faire subir le procédé de la présente invention.
Dans le cadre de la présente invention, l'expression "matériel obtenu par traitement de cellules" désigne un extrait de cellules du microorganisme, un matériel obtenu par trituration de cellules du micro30 organisme, un matériel "séparé", c'est-à-dire obtenu par séparation et purification d'une fraction à activité de nitrile hydratase à partir d'un extrait de cellules du microorganisme ou d'un matériel obtenu par trituration de cellules du microorganisme, ou un matériel "immobilisé", c'est-à-dire obtenu par immobilisation, sur un support approprié, de cellules du microorganisme, d'un extrait de cellules du microorganisme, d'un matériel obtenu par trituration de cellules du microorganisme, ou d'un matériel séparé. Pour le propos de la présente invention, tous ces matériels obtenus par traitement de cellules sont équivalents 5 aux cellules de microorganisme, dans la mesure o ils manifestent une activité de nitrile hydratase. On peut utiliser un seul de ces matériels, ou deux d'entre eux ou plus, simultanément ou alternativement.
Dans le cadre de la présente invention, l'expression "conditions o des cellules ne croissent pas" désigne par exemple des conditions 10 dans lesquelles des cellules ou un matériel obtenu par traitement de cellules se trouvent en suspension ou en solution dans de l'eau, dans de la solution physiologique salée ou dans une solution aqueuse contenant, dissous en une concentration appropriée, un agent tampon comme un phosphate, un sel inorganique comme un sulfate ou un carbonate, 15 un hydroxyde de métal alcalin, ou un amide. Par "solution aqueuse", on entend aussi une solution servant de milieu de réaction pour la production, par des cellules ou un matériel obtenu par traitement de cellules, d'un amide à partir d'un nitrile. L'expression "solution aqueuse" désigne aussi une solution de culture, o le microorganisme est en 20 cours de culture, ou une solution de culture après la phase stationnaire de croissance du microorganisme ou après l'arrêt de la culture. L'expression "solution aqueuse" englobe encore une solution de culture stérilisée par chauffage ou au moyen d'un agent chimique.
L'agent oxydant dont on se sert dans la présente invention est 25 une substance organique ou inorganique dont le potentiel standard d'électrode vaut de 0,1 à 2,1 V par rapport à l'électrode standard à hydrogène. Une substance pour laquelle ce potentiel est inférieur à 0,1 V est un agent oxydant faible, dont l'effet de maintien ou d'augmentation d'une activité de nitrile hydratase ne peut donc être que médiocre. Par 30 contre, une substance pour laquelle ce potentiel est supérieur à 2,1 V est un oxydant trop puissant, qui provoque une dégradation significative de la nitrile hydratase et donc, contrairement au but de cette invention, une réduction de l'activité de nitrile hydratase. Dans l'ouvrage "Kagaku Binran" (Chemical Handbook) publié par la Société Chimique du Japon, on trouve une liste d'exemples d'agents oxydants. On peut utiliser une seule des substances figurant dans cette liste, ou en utiliser deux ou plus, en même temps ou en alternance. Parmi ces substances, il y a par exemple l'oxygène, le peroxyde d'hydrogène, le ferricyanure 5 de potassium, les persulfates, les permanganates, les periodates, l'acide perchlorique, les perchlorates, l'acide nitrique, les nitrates, les sels de cérium-IV, etc. On préfère employer, comme agent oxydant, de l'oxygène, du peroxyde d'hydrogène, du ferricyanure de potassium ou du persulfate d'ammonium. On préfère encore davantage utiliser de l'oxy10 gène pur ou se servir de l'oxygène de l'air.
L'agent oxydant utilisé dans la présente invention peut être mis tout d'un coup, ou progressivement, en contact avec les cellules ou le matériel obtenu par traitement de cellules.
Dans le cas o l'on emploie de l'oxygène comme agent oxydant, 15 c'est en fait un gaz contenant de l'oxygène qu'on met en contact avec les cellules ou le matériel obtenu par traitement de cellules. Ce gaz peut être de l'air, de l'oxygène pur, un mélange en proportions prédéfinies d'air et d'azote ou d'un autre gaz, ou un mélange en proportions prédéfinies d'oxygène, d'azote et d'un autre gaz. L'autre gaz dont il est 20 ici question peut être un gaz unique, comme de l'azote, de l'argon ou de l'hélium, ou un mélange de deux gaz ou plus, et il n'est soumis à aucune restriction particulière, pourvu qu'il n'inhibe pas la réaction.
Par exemple, si des cellules ou du matériel obtenu par traitement de cellules se trouve en suspension dans un milieu aqueux, dans un réci25 pient muni d'un dispositif d'agitation, on peut dissoudre de l'oxygène dans ce milieu, tout en brassant ce dernier, en envoyant le gaz contenant de l'oxygène dans la phase gazeuse présente dans le récipient tout en évacuant celle-ci. Autrement, on peut disperser et faire diffuser le gaz à l'aide d'un tuyau perforé, de manière à amener l'oxygène en 30 contact avec le liquide sur une plus grande surface, tout en brassant le milieu. Il est préférable d'introduire ce gaz après l'avoir débarrassé, au moyen d'un filtre approprié, des divers germes qu'il peut contenir, ceci afin d'empêcher toute dégradation de la suspension qui pourrait découler d'une contamination par ces germes.
Dans le procédé de la présente invention, on peut mettre les cellules telles quelles, ou le matériel obtenu par traitement de cellules tel quel, en contact avec l'agent oxydant, mais c'est d'habitude à l'état de suspension dans un milieu aqueux qu'on le ou les met en contact 5 avec l'agent d'oxydant. Au sens o l'on s'en sert ici, l'expression "milieu aqueux" désigne tout milieu contenant de l'eau, c'est-à-dire, notamment, de la solution physiologique salée, une solution aqueuse contenant, dissous en une concentration appropriée, un agent tampon comme un phosphate, un sel inorganique comme un sulfate ou un carbonate, 10 un hydroxyde de métal alcalin ou un amide, une solution servant de milieu de réaction pour la production d'un amide à partir d'un nitrile, ou une solution de culture après la phase stationnaire de croissance du microorganisme.
Aucune restriction particulière n'est imposée à la concentration 15 des cellules, ou du matériel obtenu par traitement de cellules, en suspension dans le milieu aqueux, mais cette concentration vaut d'habitude, en poids de cellules sèches, de 0,1 à 30 % en poids.
Quand on met, selon la présente invention, des cellules ou un matériel obtenu par traitement de cellules en contact avec un agent oxy20 dant, la concentration de ce dernier n'est soumise à aucune restriction particulière, pourvu que ce soit une concentration à laquelle l'activité de nitrile hydratase puisse être effectivement maintenue ou améliorée.
Il est toutefois préférable que l'agent oxydant se trouve dans le milieu aqueux en une concentration de 1 ppm à 10 % en poids.
Quand on met, selon la présente invention, des cellules ou un matériel obtenu par traitement de cellules en contact avec un agent oxydant, on opère d'habitude à une température qui vaut de 0 à 60 C, de préférence de 0 à 50 C et mieux encore de 5 à 40 C, et dans un milieu dont le pH vaut de 5 à 10, de préférence de 5 à 9 et mieux en30 core de 6 à 8.
Selon la présente invention, on peut, dans des conditions o les cellules ne croissent pas, maintenir l'activité de nitrile hydratase de cellules contenant une nitrile hydratase ou d'un matériel obtenu par traitement de telles cellules, en mettant ces cellules ou ce matériel en contact avec un agent oxydant. On peut en outre améliorer l'activité de nitrile hydratase de cellules dont l'activité de nitrile hydratase a baissé ou d'un matériel obtenu par traitement de telles cellules, en mettant ces cellules ou ce matériel en contact avec un agent oxydant, avant ou pen5 dant la réaction. On peut donc mettre les cellules ou le matériel obtenu par traitement de cellules en contact avec l'agent oxydant à tout moment choisi arbitrairement avant la fin de la réaction d'hydratation de nitrile.
Ceci revient à dire qu'on peut soit mettre les microorganismes 10 ou le matériel obtenu par traitement de microorganismes en contact avec l'agent oxydant avant cette réaction d'hydratation, soit commencer à faire réagir les microorganismes ou le matériel obtenu par traitement de microorganismes, puis faire réagir l'agent oxydant en le mettant en contact avec les microorganismes ou le matériel obtenu par 15 traitement de microorganismes. Mais quand l'agent oxydant est mis à réagir, des réactions secondaires, autres que l'hydratation d'un nitrile, peuvent se produire. Par exemple, si le nitrile en question est de l'acrylonitrile ou du méthacrylonitrile, ce nitrile lui-même ou le produit qu'il donne, à savoir de l'acrylamide ou du méthacrylamide, peut poly20 mériser. C'est donc avant d'effectuer la réaction d'hydratation de nitrile qu'il est préférable de mettre les microorganismes, ou le matériel obtenu par traitement de microorganismes, en contact avec l'agent oxydant.
Après culture, on met les microorganismes eux-mêmes, ou le 25 matériel microbien obtenu par traitement de ces microorganismes, en contact avec l'agent oxydant pour améliorer l'activité d'hydratation de nitrile reposant sur la nitrile hydratase, et l'on peut alors soit faire réagir ces microorganismes tels quels ou ce matériel tel quel, soit, si nécessaire, les ou le laver avant de les ou le faire réagir. Par exemple, 30 quand on met les microorganismes, ou le matériel microbien obtenu par traitement de ces microorganismes, à l'état de suspension dans un milieu aqueux, en contact avec de l'oxygène utilisé comme agent oxydant, on vérifie que l'activité d'hydratation de nitrile s'améliore, et par la suite, on peut maintenir cette activité d'hydratation de nitrile, même si l'on élimine l'oxygène dissous dans le milieu aqueux en y faisant passer de l'azote, et l'on peut faire réagir dans cet état les microorganismes ou le matériel microbien.
Le nitrile dont il est question dans la présente invention est un 5 nitrile dont la molécule comporte à peu près de 2 à 20 atomes de carbone, ce qui englobe, mais sans s'y limiter, des nitriles aliphatiques et des nitriles aromatiques. Parmi les nitriles aliphatiques, il y a les nitriles saturés ou insaturés en C2.6, par exemple des mononitriles aliphatiques saturés comme l'acétonitrile, le propionitrile, le butyronitrile, 10 l'isobutyronitrile, le valéronitrile, l'isovaléronitrile et le capronitrile, des dinitriles aliphatiques saturés comme le malononitrile, le succinonitrile et l'adiponitrile, et des nitriles aliphatiques insaturés comme l'acrylonitrile, le méthacrylonitrile et le crotononitrile. Parmi les nitriles aromatiques, il y a le benzonitrile, les isomères ortho, méta et para 15 des chlorobenzonitrile, fluorobenzonitrile, nitrobenzonitrile et tolunitrile, le cyanure de benzyle, etc. On peut mentionner en particulier, à titre d'exemples préférés, l'acrylonitrile, le méthacrylonitrile et le crotononitrile.
Exemples
On décrit ci-après la présente invention de façon plus détaillée à l'aide d'exemples, mais il doit être bien entendu que la présente invention ne se limite aucunement à ces exemples.
Dans les exemples, on mentionne des analyses par HPLC de solutions réactionnelles, que l'on a réalisées à l'aide de colonnes Ultron 80HG de 50 mm de long sur 8 mm de diamètre et d'une solution de développement qui est une solution aqueuse à 10 mM de phosphate. On a détecté l'acrylamide et l'acrylonitrile grâce à leur absorption à 220 nm, 30 et pour déterminer leurs concentrations, on a mesuré leur absorbance à cette longueur d'onde. On a mesuré la concentration de l'oxygène dissous au moyen d'une électrode à oxygène (InPro 6800/12/320, fabriquée par Mettler- Toledo K.K) et d'un indicateur de concentration d'oxygène dissous (modèle 4050e, fabriqué par Mettler-Toledo K.K.), après l'avoir étalonné de telle façon qu'il indiquait 0 dans le cas d'une solution aqueuse à 5 % de sulfite de sodium et 10,92 ppm pour la concentration d'oxygène à saturation, à 10 C, dans le cas d'une eau pure préalablement saturée d'air.
Exemple 1
Dans cet exemple, on emploie, à titre de cellules contenant une nitrile hydratase, la souche MT-10822 (FERM BP-5785, voir le document JP-A n 11253168 (1999)) comportant un gène de nitrile hydra10 tase introduit chez Escherichia coli HB101 (cette souche a été déposée par Mitsui Chemicals Inc.).
Pour cultiver cette souche microbienne, on place, dans un fermenteur de 30 L, 15,0 L d'un milieu dont la composition est indiquée ci-dessous, et on le stérilise pendant 20 minutes avec de la vapeur 15 d'eau chauffée à 121 C sous haute pression. On ajoute de l'ampicilline à ce milieu, en une concentration finale de 50 tg/mL, puis on inocule la souche microbienne à l'aide d'une boucle de platine et on la cultive pendant 20 heures à 37 C et 700 t/min. A peu près 15 heures après le début de la culture, on ajoute de l'isopropyl-13-D-thiogalactopyranoside 20 (IPTG) en une concentration finale de 100 tmol/L et l'on poursuit la culture.
Composition du milieu: 5,0 g/L d'extrait de levure, 10,0 g/L de polypeptone, 5,0 g/L de chlorure de sodium, 10,0 g/L de chlorure de cobalt hexahydraté, 40,0 mg/L de sulfate ferrique heptahydraté, pH 7,5 Une fois la culture terminée, on transfère 500 mL de suspension microbienne, o la croissance microbienne s'est arrêtée, dans une fiole de 1 L munie d'une électrode à oxygène et d'un thermomètre. Tout en maintenant cette suspension à 10 C et en l'agitant, on fait passer de l'air, avec un débit de 400 N-mL/min, dans l'espace occupé par la 30 phase gazeuse dans la fiole. On prélève un échantillon de suspension microbienne 0 heure et 24 heures après ce transfert en réserve. Au cours de la garde en réserve, la concentration d'oxygène dissous dans la suspension microbienne vaut de 10,0 à 10,9 ppm.
Dans un flacon en verre de 100 mL, qui peut être fermé de manière étanche et que l'on a au préalable suffisamment purgé avec de l'azote, on met 23, 0 mg de la suspension microbienne en suspension dans 10,0 g de tampon à 50 mM de Tris-HCI préalablement désoxygéné 5 (pH 8,1), on ajoute à cette suspension de l'acrylonitrile préalablement désoxygéné, en une concentration finale de 19 % en poids, et l'on fait réagir le tout à 20 C pendant 2 heures, tout en agitant le mélange. On met fin à la réaction en ajoutant 80 g d'une solution aqueuse à 10 mM d'acide phosphorique, puis on détermine par analyse par HPLC la con10 centration d'acrylamide dans la solution réactionnelle. On détermine ensuite la concentration de la suspension microbienne, en poids de cellules sèches, et l'on peut alors calculer la quantité d'acrylamide formée par unité de poids de cellules sèches. Si l'on prend 1 pour valeur de la quantité d'acrylamide formée avec l'échantillon de suspension prélevé 15 après 0 heure de garde en réserve, on trouve que la quantité d'acrylamide formée avec l'échantillon de suspension prélevé après 24 heures de garde en réserve vaut 1,1. Ceci indique que l'activité d'hydratation de nitrile de la nitrile hydratase est maintenue à une valeur stable pendant la garde en réserve.
Exemple 2
On transfère 500 mL de suspension microbienne o la croissance microbiennes'est arrêtée, obtenue de la même façon que dans l'exemple 1, dans une fiole de 1 L munie d'une électrode à oxygène et 25 d'un thermomètre. Tout en maintenant cette suspension à 10 C et en l'agitant, on fait passer un mélange d'air et d'azote, avec des débits respectifs de 400 N-mL/min et de 4000N-mL/min, dans l'espace occupé par la phase gazeuse dans la fiole. On prélève un échantillon de suspension microbienne 0 heure et 24 heures après ce transfert en réserve. 30 Au cours de la garde en réserve, la concentration d'oxygène dissous dans la suspension microbienne vaut de 1,0 à 1,5 ppm. De la même manière que dans l'exemple 1, on détermine la quantité d'acrylamide formée dans la suspension microbienne par unité de poids de cellules sèches. Si l'on prend 1 pour valeur de la quantité d'acrylamide formée avec l'échantillon de suspension prélevé après 0 heure de garde en réserve, on trouve que la quantité d'acrylamide formée avec l'échantillon de suspension prélevé après 24 heures de garde en réserve vaut 1,0. Ceci indique que l'activité d'hydratation de nitrile de la nitrile hy5 dratase est maintenue à une valeur stable pendant la garde en réserve.
Exemple comparatif 1
On transfère 500 mL de suspension microbienne o la croissance microbienne s'est arrêtée, obtenue de la même façon que dans 10 l'exemple 1, dans une fiole de 1 L munie d'une électrode à oxygène et d'un thermomètre. Tout en maintenant cette suspension à 10 C et en l'agitant, on fait passer de l'azote, avec un débit de 400 N-mL/min, dans l'espace occupé par la phase gazeuse dans la fiole, pour désoxygéner la suspension microbienne. On prélève un échantillon de sus15 pension microbienne 0 heure, 1 heure et 3 heures après ce transfert en réserve. Au cours de la garde en réserve, la concentration d'oxygène dissous dans la suspension microbienne vaut 0,0 ppm. De la même manière que dans l'exemple 1, on détermine la quantité d'acrylamide formée dans la suspension microbienne par unité de poids de cellules 20 sèches. Si l'on prend 1 pour valeur de la quantité d'acrylamide formée avec l'échantillon de suspension prélevé après 0 heure de garde en réserve, on trouve que la quantité d'acrylamide formée vaut 0,45 avec l'échantillon de suspension prélevé après 1 heure de garde en réserve et 0,20 avec l'échantillon de suspension prélevé après 3 heures de garde 25 en réserve. Ceci indique que l'activité d'hydratation de nitrile de la nitrile hydratase a baissé au fil du temps pendant la garde en réserve.
Exemple comparatif 2
On transfère 500 mL de suspension microbienne o la crois30 sance microbienne s'est arrêtée, obtenue de la même façon que dans l'exemple 1, dans une fiole de 1 L munie d'une électrode à oxygène et d'un thermomètre. Tout en maintenant cette suspension à 10 C et en l'agitant, on fait passer de l'azote, avec un débit de 400 N-mL/min, dans l'espace occupé par la phase gazeuse dans la fiole. De la même manière que dans l'exemple 1, on détermine la quantité d'acrylamide formée dans la suspension microbienne par unité de poids de cellules sèches, après 0 heure de garde en réserve. Une heure après le transfert en réserve, on prélève un échantillon de la suspension microbienne que 5 l'on centrifuge à 15 000 x g pendant 15 minutes sous atmosphère d'azote, pour séparer les cellules de la suspension et obtenir des cellules humides de microorganisme.
Dans un flacon en verre de 100 mL, qui peut être fermé de manière étanche et que l'on a au préalable suffisamment purgé avec de 10 l'azote, on met 0,20 g des cellules ainsi obtenues en suspension dans de l'eau pure préalablement désoxygénée, en quantité suffisante pour obtenir 20,00 g de suspension, et l'on garde cette suspension microbienne pendant 15 minutes à 20 C, tout en l'agitant.
Dans un flacon en verre de 100 mL, qui peut être fermé de ma15 nière étanche et que l'on a au préalable suffisamment purgé avec de l'azote, on met 66,0 mg de cette suspension microbienne en suspension dans 10,0 g de tampon à 50 mM de Tris-HCI préalablement désoxygéné (pH 8,1), on ajoute à cette suspension de l'acrylonitrile préalablement désoxygéné, en une concentration finale de 19 % en poids, et l'on fait 20 réagir le tout à 20 C pendant 4 heures, tout en agitant le mélange. On met fin à la réaction en ajoutant 80 g d'une solution aqueuse à 10 mM d'acide phosphorique, puis on détermine par analyse par HPLC la concentration d'acrylamide dans la solution réactionnelle. On détermine ensuite la concentration de la suspension microbienne, en poids de cel25 lules sèches, et l'on peut alors calculer la quantité d'acrylamide formée par unité de poids de cellules sèches. Si l'on prend 1 pour valeur de la quantité d'acrylamide formée, après 1 heure de garde en réserve, par les cellules humides obtenues par centrifugation, on trouve que la quantité d'acrylamide formée par ces cellules vaut 2,9 après 0 heure de 30 garde en réserve. Ceci indique que l'activité de nitrile hydratase des cellules humides obtenues dans cet exemple comparatif 2 est réduite.
Exemples 3 à 9
On centrifuge à 15 000 x g pendant 15 minutes une suspension microbienne o la croissance microbienne s'est arrêtée, obtenue de la même façon que dans l'exemple 1, pour séparer les cellules de la sus5 pension et obtenir des cellules humides de microorganisme. Dans un flacon en verre de 100 mL, qui peut être fermé de manière étanche et que l'on a au préalable suffisamment purgé avec de l'azote, on remet 0,20 g de ces cellules en suspension dans de l'eau pure préalablement désoxygénée, et l'on y ajoute et met en suspension du ferricyanure de 10 potassium, en guise d'agent oxydant, en la concentration finale indiquée dans le tableau 1, tout cela de manière à obtenir 20,00 g de suspension. D'autre part, on prépare de la même manière une suspension ne contenant pas d'agent oxydant. On garde chaque suspension microbienne pendant 15 minutes à 20 C, tout en l'agitant.
Dans un flacon en verre de 100 mL, qui peut être fermé de manière étanche et que l'on a au préalable suffisamment purgé avec de l'azote, on met 66, 0 mg de la suspension microbienne en suspension dans 10,0 g de tampon à 50 mM de Tris-HCI préalablement désoxygéné (pH 8,1), on ajoute à cette suspension de l'acrylonitrile préalablement 20 désoxygéné, en une concentration finale de 19 % en poids, et l'on fait réagir le tout à 20 C pendant 4 heures, tout en agitant le mélange. On met fin à la réaction en ajoutant 80 g d'une solution aqueuse à 10 mM d'acide phosphorique, puis on détermine par analyse par HPLC la concentration d'acrylamide dans la solution réactionnelle. On détermine 25 ensuite la concentration de la suspension microbienne, en poids de cellules sèches, et l'on peut alors calculer la quantité d'acrylamide formée par unité de poids de cellules sèches. Si l'on prend 1 pour valeur de la quantité d'acrylamide formée par unité de poids de cellules sèches en l'absence d'agent oxydant, on trouve pour les quantités d'acrylamide 30 formées dans les exemples 3 à 9 les valeurs relatives indiquées dans le
tableau 1.
Exemples 10 et 11
En opérant de la même façon que dans l'exemple 3, sauf qu'au lieu du ferricyanure de potassium, c'est du persulfate d'ammonium que l'on ajoute et met en suspension en la concentration indiquée dans le 5 tableau 1, en guise d'agent oxydant, on détermine la quantité d'acrylamide formée par unité de poids de cellules sèches. Si l'on prend 1 pour valeur de la quantité d'acrylamide formée par unité de poids de cellules sèches en l'absence d'agent oxydant, on trouve pour les quantités d'acrylamide formées dans les exemples 10 et 11 les valeurs relatives 10 indiquées dans le tableau 1.
Exemple 12
En opérant de la même façon que dans l'exemple 3, sauf qu'au lieu du ferricyanure de potassium, c'est du peroxyde d'hydrogène en 15 solution aqueuse à 30 % en poids que l'on ajoute et met en suspension en la concentration indiquée dans le tableau 1, en guise d'agent oxydant, on détermine la quantité d'acrylamide formée par unité de poids de cellules sèches. Si l'on prend 1 pour valeur de la quantité d'acrylamide formée par unité de poids de cellules sèches en l'absence d'agent 20 oxydant, on trouve pour la quantité d'acrylamide formée dans l'exemple 12 la valeur relative indiquée dans le tableau 1.
Tableau 1
Concen- Quantité d'acrylamide Ex. n Réactif tration formée (valeur (% pds) relative) -_ - _ 0 1,0 3 Ferricyanure de potassium 0,20 1,4 4 Ferricyanure de potassium 0,39 1,7 Ferricyanure de potassium 0,81 2,0 6 Ferricyanure de potassium 1,9 2,4 7 Ferricyanure de potassium 1,6 2,6 8 Ferricyanure de potassium 2,0 2,9 9 Ferricyanure de potassium 10,0 2,9 Persulfate d'ammonium 1,3 1,6 1il Persulfate d'ammonium 2,7 1,6 12 Peroxyde d'hydrogène _0,21 2,4 Les résultats exposés ci-dessus montrent que, lorsqu'on met des 5 cellules du microorganisme en contact avec un agent oxydant comme du ferricyanure de potassium, du persulfate d'ammonium ou du peroxyde d'hydrogène, on améliore l'activité d'hydratation de nitrile de la nitrile hydratase.
Exemple 13
Dans un flacon en verre de 100 mL, qui peut être fermé de manière étanche et que l'on a au préalable suffisamment purgé avec de l'azote, on met 0, 20 g de cellules humides de microorganisme, obtenues de la même façon que dans l'exemple 3, en suspension dans de l'eau 15 pure préalablement désoxygénée, et l'on y ajoute et met en suspension du ferricyanure de potassium, en guise d'agent oxydant, en une concentration finale de 0,77 % en poids, tout cela de manière à obtenir 20,00 g de suspension. On garde cette suspension microbienne à 20 C, tout en l'agitant. On prélève un petit échantillon de cette suspension 20 microbienne aux instants correspondant à 0 minute, 10 minutes, 2 heu- res et 24 heures de contact avec l'agent oxydant et d'agitation, et l'on détermine, de la même façon que dans l'exemple 3, la quantité d'acrylamide formée par unité de poids de cellules sèches de microorganisme dans ces échantillons. Si l'on prend 1 pour valeur de la quantité d'acry5 lamide formée avec l'échantillon prélevé après 0 minute de contact et d'agitation, on trouve, pour les quantités d'acrylamide formées avec les échantillons prélevés après 10 minutes, 2 heures et 24 heures de contact et d'agitation, les valeurs relatives indiquées dans le tableau 2.
Tableau 2
Temps de contact Quantité d'acrylamide formée et d'agitation (valeur relative) O minute 1,0 minutes 1,7 2 heures 2,5 24 heures 2,4 Les résultats exposés ci-dessus montrent que, lorsqu'on met des cellules du microorganisme en contact avec un agent oxydant comme 15 du ferricyanure de potassium, l'activité d'hydratation de nitrile de la nitrile hydratase commence par augmenter avec la durée de contact, et que cette amélioration se maintient dans le temps.
Exemple 14
De la même façon que dans l'exemple 3, on prépare des cellules humides de microorganisme, et l'on en met 1,5 g en suspension dans 48,5 g d'eau pure, dans une fiole de 100 mL munie d'une électrode à oxygène et d'un thermomètre. Tout en maintenant cette suspension à 10 C et en l'agitant, on fait passer de l'air, avec un débit de 40 N25 mL/min, dans l'espace occupé par la phase gazeuse dans la fiole. On prélève un échantillon de suspension microbienne 0, 1, 2, 3, 7 et 19 jours après ce transfert en réserve. Au cours de la garde en réserve, la concentration d'oxygène dissous dans la suspension microbienne vaut de 10,0 à 10,9 ppm. De la même façon que dans l'exemple 3, on détermine la quantité d'acrylamide formée, par unité de poids de cellules sèches, dans chacun des échantillons de suspension microbienne prélevés. Si l'on prend 1 pour valeur de la quantité d'acrylamide formée, 5 par unité de poids de cellules sèches, avec l'échantillon de suspension prélevé après 0 jour de garde en réserve, on trouve, pour les quantités d'acrylamide formées avec les échantillons de suspension prélevés après 1, 2, 3, 7 et 19 jours de garde en réserve, les valeurs relatives indiquées
dans le tableau 3.
Exemple 15
De la même façon que dans l'exemple 3, on prépare des cellules humides de microorganisme, et l'on en met 1,5 g en suspension dans 48,5 g d'eau pure, dans une fiole de 100 mL munie d'une électrode à 15 oxygène et d'un thermomètre. Tout en maintenant cette suspension à C et en l'agitant, on fait passer un mélange d'air et d'azote, avec des débits respectifs de 40 N-mL/min et de 400N-mL/min, dans l'espace occupé par la phase gazeuse dans la fiole. On prélève un échantillon de suspension microbienne 0, 1, 2, 3, 7 et 19 jours après ce transfert 20 en réserve. Au cours de la garde en réserve, la concentration d'oxygène dissous dans la suspension microbienne vaut de 1,0 à 1,5 ppm. De la même façon que dans l'exemple 3, on détermine la quantité d'acrylamide formée, par unité de poids de cellules sèches, dans chacun des échantillons de suspension microbienne prélevés. Si l'on prend 1 pour 25 valeur de la quantité d'acrylamide formée, par unité de poids de cellules sèches, avec l'échantillon de suspension prélevé après 0 jour de garde en réserve, on trouve, pour les quantités d'acrylamide formées avec les échantillons de suspension prélevés après 1, 2, 3, 7 et 19 jours de garde en réserve, les valeurs relatives indiquées dans le tableau 3.
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Tableau 3
Nombre de jours 2 19 de garde en réserve Exemple 14 1,0 2,4 2,3 2,4 2,5 2, 5 Exemple 15 1,0 1,6 2,3 2,4 2,5 2,4 Les résultats exposés ci-dessus montrent que, lorsqu'on met des 5 cellules du microorganisme en contact avec de l'oxygène comme agent oxydant, l'activité d'hydratation de nitrile de la nitrile hydratase commence par augmenter avec la durée de contact, et qu'au bout d'un certain temps, cette activité se maintient à une valeur élevée et stable.
Exemples 16 à 18
Dans un flacon en verre de 100 mL, qui peut être fermé de manière étanche et que l'on a au préalable suffisamment purgé avec de l'azote, on met 0, 20 g de cellules humides de microorganisme, obtenues de la même façon que dans l'exemple 3, en suspension dans de l'eau 15 pure préalablement désoxygénée, et l'on y ajoute et met en suspension du ferricyanure de potassium, en guise d'agent oxydant, en une concentration finale de 2,0 % en poids, puis on ajuste le pH de la suspension, avec une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium ou de l'acide sulfurique, à la valeur indiquée dans le tableau 4, tout cela de manière 20 à obtenir 20,00 g de suspension. D'autre part, on prépare également de la même manière une suspension microbienne à laquelle on n'ajoute pas d'agent oxydant et dont on ne modifie pas le pH. On garde la suspension microbienne à 20 C pendant 15 minutes, tout en l'agitant. On détermine, de la même façon que dans l'exemple 3, la quantité d'acryla25 mide formée par unité de poids de cellules sèches de microorganisme.
Si l'on prend 1 pour valeur de la quantité d'acrylamide formée par unité de poids de cellules sèches dans le cas o l'on n'ajoute pas d'agent oxydant à la suspension et o l'on ne modifie pas le pH de celle-ci, on trouve, pour les quantités d'acrylamide formées dans les exemples 16 à 30 18, les valeurs relatives indiquées dans le tableau 4.
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Tableau 4
Ex. n0 Agent oxydant pH de la Quantité d'acrylamide suspension formée (valeur relative) Aucun 7,1 1,0 (non modifié) 16 Ferricyanure 5,0 1,8 de potassium 17 Ferricyanure 6,7 2,9 de potassium 18 Ferricyanure ___18 de10,0 2,0 de potassium
Exemples 19 à 21
Dans un flacon en verre de 100 mL, qui peut être fermé de manière étanche et que l'on a au préalable suffisamment purgé avec de l'azote, on met 0, 20 g de cellules humides de microorganisme, obtenues de la même façon que dans l'exemple 3, en suspension dans de l'eau pure préalablement désoxygénée, et l'on y ajoute et met en suspension 10 du ferricyanure de potassium, en guise d'agent oxydant, en une concentration finale de 2,0 % en poids, tout cela de manière à obtenir 20,00 g de suspension. D'autre part, on prépare également de la même manière une suspension microbienne à laquelle on n'ajoute pas d'agent oxydant. On garde la suspension microbienne pendant 15 minutes, tout 15 en l'agitant, à la température indiquée dans le tableau 5. On détermine, de la même manière que dans l'exemple 3, la quantité d'acrylamide formée par unité de poids de cellules sèches de microorganisme. Si l'on prend 1 pour valeur de la quantité d'acrylamide formée par unité de poids de cellules sèches dans le cas o l'on agite la suspension à 20 C 20 en l'absence d'agent oxydant, on trouve, pour les quantités d'acrylamide formées dans les exemples 19 à 21, les valeurs relatives indiquées dans
le tableau 5.
Tableau 5
Ex. n0 Agent oxydant Température de la Quantité d'acrylamide suspension ( C) formée (valeur relative) Aucun 20 1,0 19 Ferricyanure 0 3,2 de potassium Ferricyanure 20 2,9 de potassium 21 Ferricyanure 60 1,4 de potassium Grâce à la présente invention, on peut aisément non seulement maintenir, dans des conditions o les cellules ne croissent pas, l'activité de nitrile hydratase de cellules possédant une telle activité ou d'un matériel obtenu par traitement de telles cellules, mais encore améliorer 10 l'activité de nitrile hydratase de cellules possédant une telle activité ou d'un matériel obtenu par traitement de telles cellules chez lesquelles ou lequel cette activité a baissé. Cette invention présente donc un grand intérêt pour l'industrie.
Claims (15)
1. Procédé permettant de maintenir ou d'améliorer une activité de nitrile hydratase, caractérisé en ce qu'il comporte le fait de mettre 5 des cellules contenant une nitrile hydratase, ou un matériel obtenu par traitement de telles cellules, en contact avec un agent oxydant, dans des conditions o les cellules ne croissent pas.
2. Procédé permettant de maintenir ou d'améliorer une activité de nitrile hydratase, conforme à la revendication 1, caractérisé en ce 10 que l'agent oxydant est un agent oxydant dont le potentiel standard d'électrode, par rapport à l'électrode standard à hydrogène, vaut de 0,1 à 2,1 V.
3. Procédé permettant de maintenir ou d'améliorer une activité de nitrile hydratase, conforme à la revendication 1, caractérisé en ce 15 que l'agent oxydant est au moins un élément de l'ensemble formé par l'oxygène, le peroxyde d'hydrogène, le ferricyanure de potassium et le persulfate d'ammonium.
4. Procédé permettant de maintenir ou d'améliorer une activité de nitrile hydratase, conforme à la revendication 3, caractérisé en ce 20 que l'on emploie, comme agent oxydant, de l'oxygène apporté sous la forme d'un gaz contenant de l'oxygène.
5. Procédé permettant de maintenir ou d'améliorer une activité de nitrile hydratase, conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration de l'agent oxydant vaut de 1 ppm en poids à 10 % 25 en poids.
6. Procédé permettant de maintenir ou d'améliorer une activité de nitrile hydratase, conforme à la revendication 1, caractérisé en ce qu'on laisse lesdites cellules ou ledit matériel en contact avec l'agent oxydant à une température de 0 à 60 C.
7. Procédé permettant de maintenir ou d'améliorer une activité de nitrile hydratase, conforme à la revendication 1, caractérisé en ce qu'on laisse lesdites cellules ou ledit matériel en contact avec l'agent oxydant dans un milieu dont le pH vaut de 5 à 10.
8. Procédé permettant de maintenir ou d'améliorer une activité de nitrile hydratase, conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que la nitrile hydratase est une nitrile hydratase dont la molécule contient du cobalt.
9. Procédé permettant de maintenir ou d'améliorer une activité de nitrile hydratase, conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que l'on met en contact avec l'agent oxydant, dans des conditions o les cellules ne croissent pas, des cellules o est exprimée, par recombinaison génétique, une nitrile hydratase dont la molécule contient du 10 cobalt, ou un matériel obtenu par traitement de telles cellules.
10. Procédé permettant de maintenir ou d'améliorer une activité de nitrile hydratase, conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites cellules sont des cellules d'un microorganisme contenant une nitrile hydratase, ou à un matériel obtenu par traitement de 15 cellules d'un tel microorganisme.
11. Procédé permettant de maintenir ou d'améliorer une activité de nitrile hydratase, conforme à la revendication 10, caractérisé en ce que ledit microorganisme est un microorganisme génétiquement modifié.
12. Procédé permettant de maintenir ou d'améliorer une activité de nitrile hydratase, conforme à la revendication 11, caractérisé en ce que ledit microorganisme génétiquement modifié, est une souche d'Escherichia coli génétiquement modifiée.
13. Procédé permettant de maintenir ou d'améliorer une acti25 vité de nitrile hydratase, conforme à la revendication 12, caractérisé en ce que la souche hôte d'Escherichia coli génétiquement modifiée est la souche W3110 (ATCC 27325), la souche HB101 (ATCC 33694), la souche JM109 (ATCC 53223) ou la souche WA802 (ATCC 33526), lesquelles souches dérivent toutes de la souche K-12 d'Escherichia coli. 30
14. Procédé permettant de maintenir ou d'améliorer une activité de nitrile hydratase, conforme à la revendication 1, caractérisé en ce qu'on se sert de cellules contenant une nitrile hydratase, ou d'un matériel obtenu par traitement de telles cellules, pour produire un amide à partir d'un nitrile.
15. Procédé de production d'un amide à partir d'un nitrile, caractérisé en que l'on se sert de cellules contenant une nitrile hydratase, ou d'un matériel obtenu par traitement de telles cellules, qui sont fournies ou qui est fourni par un procédé conforme à l'une des reven5 dications 1 à 14.
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