FR2831186A1 - Production d'heparine a partir de cultures de mastocytes - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne la production d'héparine à partir de cultures cellulaires de mastocytes, notamment de mastocytes de porc.
Description
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La présente invention est relative à la préparation d'héparine à partir de cultures de cellules.
L'héparine appartient à la famille des glycosaminoglycanes (GAG), qui regroupe les polysaccharides linéaires contenant une répétition d'une séquence disaccharidique se composant d'un sucre aminé (D-glucosamine ou galactosamine) et d'un acide uronique (D-glucuronique ou iduronique).
Dans le cas de l'héparine, qui appartient, avec l'héparane sulfate, à la sous-famille des glucosaminoglycanes le sucre aminé est la D-glucosamine. L'acide uronique est soit l'acide glucuronique (Glc), soit l'acide iduronique (Ido). La glucosamine peut être N-acétylée, N-sulfatée ou 0-sulfatée.
Conventionnellement, on désigne sous le terme "héparine"des polysaccharides hautement sulfatés dans lesquels plus de 80% des résidus glucosamine sont N-sulfatés et le nombre de 0-sulfate est plus important que celui des N-sulfates. Le rapport sulfate/disaccharide est généralement supérieur à 2 pour l'héparine. Cependant, la structure de l'héparine est en fait très hétérogène, et il existe des chaînes pouvant contenir des rapports très différents.
Comme tous les GAGs, l'héparine est synthétisée sous forme d'un protéoglycane. Cette synthèse a lieu dans une souspopulation de mastocytes, les mastocytes séreux ou conjonctifs (CTMC). Ces mastocytes sont abondants dans la peau, et les sous-muqueuses respiratoires. Leur durée de vie est très longue (au moins 6 mois). Outre l'héparine, ils contiennent de l'héparane sulfate, et des quantités appréciables d'histamine (environ 10 pg/cellule, selon l'espèce animale).
La première étape de la synthèse de l'héparine est la formation du noyau protéique serglycine, constitué de résidus sérine et glycine, régulièrement alternés. L'élongation de la chaîne d'héparine se fait à partir d'un tétrasaccharide, par ajouts successifs d'osamine et d'acides uroniques.
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Le protéoglycane ainsi formé subit de nombreuses transformations séquentielles : N-désacétylation, N-sulfatation, épimérisation de l'acide D-glucuronique, et 0-sulfatation.
Toutefois, cette maturation complète n'a lieu que sur une partie du protéoglycane, ce qui génère une grande variabilité structurale de l'héparine, responsable de son hétérogénéité.
Les chaînes de polysaccharides sont ensuite clivées de la serglycine par une endoglucuronidase. Ces chaînes ont alors un poids moléculaire entre 5000 et 30000 Da. Elles forment des complexes avec les protéases basiques et sont ainsi stockées dans les granules des mastocytes. L'héparine est excrétée uniquement lors de la dégranulation des mastocytes.
L'héparine joue un rôle biologique important, notamment dans l'hémostase, et est très largement utilisée en thérapeutique, en particulier en tant qu'agent anticoagulant et antithrombotique.
Actuellement, la majeure partie de l'héparine utilisée est isolée à partir de la muqueuse intestinale du porc, d'où elle est extraite par protéolyse, suivie de purification sur résine échangeuse d'anions (pour revue sur les différents procédés de préparation de l'héparine, cf.
DUCLOS, L'Héparine : fabrication, structure, propriétés, analyse ; Ed. Masson, Paris, 1984).
DUCLOS, L'Héparine : fabrication, structure, propriétés, analyse ; Ed. Masson, Paris, 1984).
A l'hétérogénéité inhérente à l'héparine, s'ajoute la diversité des lots d'animaux à partir desquels elle est obtenue. Il en résulte une variabilité très importante, se traduisant notamment au niveau de l'activité biologique. En outre, il est difficile de disposer de manière régulière d'un approvisionnement suffisant en matière première.
La présente invention propose de pallier ces inconvénients et de s'affranchir des problèmes d'approvisionnement en termes de quantité et de qualité, en utilisant une source commodément disponible de matière
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première homogène, et aux caractéristiques stables, facilitant l'obtention de préparations d'héparine de qualité constante.
Les Inventeurs ont constaté qu'il était possible de produire en quantité importante à partir de cultures de mastocytes, de l'héparine possédant des propriétés comparables à celles de l'héparine extraite du mucus intestinal porcin. L'utilisation de cultures cellulaires comme matière première permet en outre de contrôler les conditions de synthèse de l'héparine, et d'obtenir ainsi un produit possédant des caractéristiques reproductibles.
La présente invention a pour objet un procédé de production d'héparine, caractérisé en ce qu'il comprend la culture de mastocytes séreux et la récupération de l'héparine à partir des cultures obtenues.
De manière préférée, lesdits mastocytes sont des mastocytes de porc.
Avantageusement, lesdits mastocytes sont issus de l'une des lignées de mastocytes porcins décrites dans la Demande française intitulée Cultures de mastocytes de porc et leurs utilisations déposée au nom de l'INRA, et de l'ENVA. Parmi celles-ci, des lignées préférées pour la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention sont : - la lignée de mastocytes issus de foie foetal de porc déposée par l'INRA (147 rue de l'Université, 75007 Paris, France) auprès de la CNCM le 17 octobre 2001, sous le numéro 1-2735 ; - la lignée de mastocytes issus de foie foetal de porc, et transfectés par l'antigène T du virus SV40 déposée par l'INRA auprès de la CNCM le 17 octobre 2001, sous le numéro 1-2736 ; - la lignée de mastocytes issus de moelle osseuse de foetus de porc et transfectés par l'antigène T du virus SV40, déposée par l'INRA auprès de la CNCM le 17 octobre 2001, sous le numéro 1-2734.
Ces mastocytes seront de préférence cultivés dans un milieu de culture défini (MEMa/DMEM, RPMI, IMDM,...) supplémenté en facteurs de croissance, utilisés en
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combinaison ou de façon individuelle, tels que le SCF (Stem Cell Factor) à une concentration comprise entre 1 ng/ml et 1 ug/ml, et éventuellement l'IL3 (Interleukine 3) à une
concentration comprise entre 0, 1 ng/ml et 100 ng/ml, ou la PGE2 (prostaglandine E2), à une concentration comprise entre 1 nM et 1 nM.
concentration comprise entre 0, 1 ng/ml et 100 ng/ml, ou la PGE2 (prostaglandine E2), à une concentration comprise entre 1 nM et 1 nM.
Les milieux peuvent également être supplémentés avec du sérum bovin, à une concentration comprise entre 0,5% et 20% (v/v).
L'addition de sérum bovin dans les milieux de culture peut être remplacée par l'utilisation d'un milieu de culture sans sérum tel que AIMV (INVITROGEN) de façon à réduire la concentration protéique du milieu et les risques associés à l'utilisation de composés d'origine animale (KAMBE et al., J. Immunol. Methods, 240,101-10, 200).
L'indépendance des cellules vis-à-vis de l'ajout de sérum et/ou de l'utilisation de facteurs de croissance, peut être obtenue par mutation du phénotype cellulaire par l'action d'agents transformants et/ou immortalisants (TSUJIMURA, Pathology International, 46,933-8, 1996 ; PIAO et BERNSTEIN, Blood, 87 (8), 3117-23,1996).
Les mastocytes peuvent être cultivés en utilisant les techniques développées pour la culture en masse de cellules eucaryotes, comme décrit par exemple par GRIFFITHS et al. (Animal Cell Biology, , Eds. Spier et Griffiths, Academic Press, Londres, vol. 3,179-220, 1986). On peut utiliser des bioréacteurs de capacité supérieure à plusieurs m3 comme décrit par PHILIPS et al. (Large Scale Mammalian Cell Culture, Eds. Feder et Tolbert, Academic Press, Orlando, U. S. A., 1985), ou par MIZRAHI (Process Biochem, Août, 9-12, 1983).
La culture peut également être réalisée en suspension ou sur micro-support selon la technique décrite par VAN MEZEL (Nature, 216,64-65, 1967).
On peut également utiliser des systèmes de culture en lots (batch), qui sont fréquemment utilisés pour les cultures de cellules eucaryotes, du fait de leur plus grande simplicité de mise en oeuvre à l'échelle industrielle
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(VOGEL et TODARO, Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 2nd edition, Noyes Publication, Westwood, New Jersey, U. S. A., 1997). Les densités cellulaires obtenues avec ces systèmes sont généralement comprises entre 106 et 5 x 106 cellules/ml.
Des systèmes de culture en continu de type perfusés, avec ou sans rétention cellulaire peuvent également être utilisés (VELEZ et al., J. Immunol. Methods, 102 (2), 275-278,1987 ; CHAUBARD et al., Gen. Eng. News, 20,18-48, 2000). Dans le cadre de la présente invention on peut notamment utiliser des systèmes de culture perfusés permettant la rétention des cellules à l'intérieur du réacteur, et aboutissant à une croissance et une production supérieures à celles pouvant être obtenues en batch. La rétention peut être effectuée par l'intermédiaire de systèmes de rétention de type filtre tournant (spin-filter), fibres creuses, ou matrice solide (WANG et al., Cytotechnology, 9, 41-49,1992 ; VELEZ et al., J. Immunol. Methods, 102 (2), 275- 278,1987). Les densités cellulaires obtenues sont généralement comprises entre 107 et 5 x 107 cellules/ml. La culture en bio-réacteurs permet, par l'utilisation de capteurs de mesure en ligne, un meilleur contrôle des paramètres physico-chimiques de la croissance cellulaire : pH, p02, Red/Ox, substrats de croissance tels que vitamines, acides aminés, substrats carbonés (par exemple glucose, fructose, galactose), métabolites tels que lactate ou ammoniaque, etc.
Après 3 à 14 jours de culture, de préférence après 3 à 5 jours, les cellules sont récoltées et séparées du milieu de culture, généralement par centrifugation ou filtration.
Différents systèmes de centrifugation peuvent être utilisés, on citera par exemple ceux décrits par VOGEL et TODARO (Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 2nd Edition, Noyes Publication, Westwood, New Jersey, U. S. A.).
Alternativement, ou en combinaison avec la centrifugation, on peut effectuer la séparation par
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microfiltration tangentielle, à l'aide de membranes dont la porosité est inférieure au diamètre moyen des cellules (5 à 20 j-tm) tout en permettant le passage des autres composés en solution/suspension. La vitesse du flux tangentiel et la pression appliquée sur la membrane sera choisie de façon à générer peu de force de cisaillement (nombre de Reynolds inférieur à 5000 sec-l) afin de réduire le colmatage des membranes et préserver l'intégrité des cellules pendant l'opération de séparation.
Différentes membranes peuvent être utilisées, par exemple, des membranes spirales (AMICON, MILLIPORE), des membranes planes ou des fibres creuses (AMICON, MILLIPORE, SARTORIUS, PALL, GF).
On peut aussi choisir des membranes dont la porosité, la charge ou le greffage permettent d'effectuer une séparation et une première purification vis-à-vis d'éventuels contaminants pouvant être présents dans le milieu de culture, tels que protéines cellulaires, ADN, virus, ou autres macromolécules.
L'utilisation de membranes de porosité plus réduite peut aussi être envisagée dans le cas où l'héparine a été libérée du contenu intracellulaire, par dégranulation ou lyse de tout ou partie des mastocytes, et est présente dans le milieu de culture au moment de l'étape de séparation. Dans ce cas, la séparation des cellules est combinée à une étape ultrafiltration sur une ou plusieurs membranes dont l'agencement et la porosité permet de concentrer l'héparine et de la séparer des autres espèces présentes dans le milieu, en fonction de la taille et du poids moléculaire, et éventuellement de la charge électrique, ou des propriétés biologiques.
Dans le cadre de ce mode de mise en oeuvre, le seuil de coupure des membranes est de préférence compris entre 1000 et 5 Kda. On peut utiliser des systèmes de membranes similaires à ceux employés pour la microfiltration, par exemple, membranes spirales, membranes planes, ou fibres creuses. On peut avantageusement utiliser des membranes permettant d'effectuer une séparation et une
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purification de l'héparine, du fait de leurs propriétés de charge, ou du greffage de ligands présentant une affinité pour l'héparine (par exemple anticorps, ATIII, lectine).
Toutefois, on préférera généralement utiliser des méthodes de production et de récolte des cellules permettant de conserver l'héparine dans le contenu intracellulaire.
Dans ce cas, la récupération de l'héparine à partir des mastocytes se fait après dégranulation ou lyse des cellules.
La dégranulation peut être provoquée par la fixation de ligands spécifiques sur les récepteurs présents à la surface des mastocytes, par exemple la fixation d'agents de type allergène (tels que fragment Fc des IgE ou analogues de ce fragment) sur les récepteurs IgE des mastocytes.
La lyse des mastocytes, peut être induite, par exemple, par choc osmotique en utilisant des solutions hypotoniques ou hypertoniques, par choc thermique (congélation/décongélation), par choc mécanique (par exemple sonication ou variation de pression), par action d'agents chimiques (NaOH, THESIT NP40, TWEEN 20tu, BRIJ-58, TRITON XTM-1OO,...), ou par lyse enzymatique (papaïne, trypsine,...), ou par combinaison de deux ou plusieurs de ces méthodes.
Pour extraire et purifier l'héparine à partir du lysat cellulaire, séparer les chaînes polysaccharidiques du noyau serglycine, et séparer les chaînes d'héparine des autres GAGs présents dans le milieu d'extraction, on pourra utiliser des méthodes similaires à celles utilisées dans le cadre de l'extraction et la purification d'héparine à partir de tissus animaux, qui sont connues en elles-mêmes, et décrites dans des ouvrages généraux, tels que le manuel de DUCLOS, cité ci-dessus).
A titre d'exemples non-limitatifs, pour séparer l'héparine des acides nucléiques et des protéines cellulaires, et la solubiliser, c'est à dire rompre les liaisons avec le noyau serglycine :
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- on peut soumettre le lysat cellulaire à une ou plusieurs digestions enzymatiques (pronase, trypsine, papaïne, etc...) ; - les liaisons héparine-protéine peuvent être hydrolysées en milieu alcalin, en présence de sulfates ou de chlorures ; - on peut également effectuer un traitement en milieu acide (par exemple par de l'acide trichloracétique à froid) pour détruire les acides nucléiques et les protéines provenant des cellules, complété par l'utilisation d'une solution ionique qui permet de dissocier les interactions GAGs-protéines ; on peut également effectuer une extraction par la guanidine, après hydrolyse enzymatique ; pour purifier l'héparine solubilisée, on peut par exemple la précipiter par l'acétate de potassium, par un ammonium quaternaire, par l'acétone, etc.
Ces étapes de purification peuvent avantageusement être complétées ou remplacées par une ou plusieurs étapes de chromatographie, notamment de chromatographie d'échange d'anions.
La présente invention a également pour objet les préparations d'héparine susceptibles d'être obtenues à partir de cultures de mastocytes en mettant en oeuvre un procédé selon l'invention.
Les préparations d'héparine conformes à l'invention, qui possèdent des propriétés biologiques comparables à celles des préparations d'héparine obtenues dans l'art antérieur à partir de tissus animaux, peuvent être utilisées dans toutes les applications usuelles de l'héparine.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation d'héparine à partir de cultures de mastocytes et de caractérisation de l'héparine obtenue.
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EXEMPLE 1 : EXTRACTION D'HEPARIN A PARTIR DE CULTURES DE MASTOCYTES Culture des mastocytes
Une lignée de mastocytes de foie foetal de porc, et une lignée de mastocytes de foie foetal de porc transfectées par l'antigène T du virus SV40 des (lignées CNCM 1-2735 et CNCM 1-2736, respectivement), ont été utilisées ;
Les cellules sont ensemencées à raison de 105 à 5 X 105 cellules/ml, dans du milieu MEMa complet en présence d'IL3 porcine (2 ng/ml) et de SCF porcin (80 ng/ml).
Une lignée de mastocytes de foie foetal de porc, et une lignée de mastocytes de foie foetal de porc transfectées par l'antigène T du virus SV40 des (lignées CNCM 1-2735 et CNCM 1-2736, respectivement), ont été utilisées ;
Les cellules sont ensemencées à raison de 105 à 5 X 105 cellules/ml, dans du milieu MEMa complet en présence d'IL3 porcine (2 ng/ml) et de SCF porcin (80 ng/ml).
Les cultures sont réalisées en boîte de culture ou en suspension en flacon de 1 litre de type spinner . La croissance cellulaire est suivie journellement pendant 4 à 12 jours. La production d'héparine est suivie en parallèle, par l'analyse des glycosaminoglycanes produits en culture.
Les résultats sont présentés dans les Figures 1 à 5.
Les Figures 1, 2 et 3 illustrent la croissance des mastocytes de foie en culture statique en boîte (Figure 1 ; ensemencement initial :. : 1 x 105 cellules ; N : 2 x 105 cellules) et en suspension en flacon (Figure 2), et la croissance des mastocytes de foie transfectés en suspension en flacon (Figure 3).
Dans ces expérimentations, les cultures en suspension en flacon présentent une densité cellulaire maximale allant d'environ 8 x 105 (pour les cellules non transfectées) à environ 1, 5 x 106 cellules/ml (pour les cellules transfectées). Le temps de doublement, calculé pendant la phase exponentielle de croissance, est compris entre 24 et 48 heures.
Purification des glycosaminoglycanes
Les cellules subissent une hydrolyse en milieu alcalin en présence de sel afin de rompre les protéoglycanes et éviter les interactions GAGs/protéines de types ioniques.
Les cellules subissent une hydrolyse en milieu alcalin en présence de sel afin de rompre les protéoglycanes et éviter les interactions GAGs/protéines de types ioniques.
Ce traitement comprend les étapes suivantes :
1. Traitement par la soude en milieu salin : cette étape vise à détruire les cellules et à couper les liaisons entre l'héparine et sa protéine mère.
1. Traitement par la soude en milieu salin : cette étape vise à détruire les cellules et à couper les liaisons entre l'héparine et sa protéine mère.
<Desc/Clms Page number 10>
L'étape comprend l'ajout de 100 l de NaOH 1 M et de 800 fJLl de NaCl 0,5 M à un culot de 106 cellules. Le mélange ainsi obtenu est chauffé au bain-marie à 800C pendant 30 minutes puis soniqué pendant 5 minutes avant d'être neutralisé avec du HCl 1 N.
2. Extraction : l'échantillon hydrolyse est déposé sur une colonne de résine échangeuse d'anions (SAX, Varian), qui retient l'héparine. La colonne est lavée trois fois en tampon Tris/HCl pH 7,4, NaCl 0,5 M afin d'éliminer les protéines et les autres GAGs, notamment le dermatane.
Puis l'héparine est éluée par 1 ml de tampon Tris/HCl pH 7,4, NaCl 3 M.
3. Dessalage/Lyophilisation : l'élimination du chlorure de sodium (nécessaire pour pouvoir appliquer certaines des méthodes d'analyse qui sont décrites ci-après) s'effectue par chromatographie d'exclusion stérique sur gel SEPHADEX G10, suivie par conductimétrie. Les fractions d'héparine collectées sont ensuite lyophilisées pour concentrer au maximum l'échantillon.
Analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide
Cette technique permet de séparer les GAGs selon leur taille et leur charge, et constitue un test permettant de vérifier rapidement la présence ou l'absence d'héparine.
Cette technique permet de séparer les GAGs selon leur taille et leur charge, et constitue un test permettant de vérifier rapidement la présence ou l'absence d'héparine.
La préparation purifiée obtenue comme décrit ci-dessus est déposée sur gel de polyacrylamide Tris/tricine (gradient de 10 à 20%) permettant de séparer des molécules de 30 à 1 kD, à raison de 20 j. Ll de préparation par dépôt. On dépose sur le même gel 25 ng de dermatane, 25 ng d'héparine porcine standard SPIM (4eme étalon international d'héparine porcine, mucus intestinal), et de l'héparine extraite de mucus porcin et purifiée par traitement par la soude et purification sur résine échangeuse d'anions dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus.
Une double coloration avec une solution de bleu alcian puis du nitrate d'argent comme décrit dans AL-HAKIM et LINHARDT (Applied and Theoretical Electrophoresis 1, 305-12,
<Desc/Clms Page number 11>
1991) permet de révéler les glycosaminoglycanes (le nitrate d'argent seul ne révèle que les protéines).
Les gels sont ensuite analysés par un scanner (BIO-RAD) pour quantifier les différents GAGs. La limite de quantification de l'héparine est de 10 ng par bande.
Les résultats d'une expérimentation sont résumés dans le Tableau 1 ci-dessous, dans lequel la quantité d'héparine produite par les cellules est exprimée en jug/10 cellules.
Tableau 1
<tb>
<tb> Jours <SEP> de <SEP> récolte <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 14
<tb> Cellules <SEP> foie, <SEP> boîte <SEP> 2, <SEP> 6 <SEP> 3, <SEP> 5 <SEP> 4, <SEP> 4 <SEP> 6,5 <SEP> 3,7 <SEP> 4, <SEP> 2-8, <SEP> 1
<tb> Cellules <SEP> foie <SEP> transfectées, <SEP> boîte <SEP> 2, <SEP> 6 <SEP> 6, <SEP> 9 <SEP> 9,0 <SEP> 11,7 <SEP> 10,8 <SEP> 8,5 <SEP> 5,4 <SEP> 7,1
<tb> Cellules <SEP> foie, <SEP> flacon <SEP> 1,2
<tb> Cellules <SEP> foie <SEP> transfectées, <SEP> flacon-2, <SEP> 1-
<tb>
<tb> Jours <SEP> de <SEP> récolte <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 14
<tb> Cellules <SEP> foie, <SEP> boîte <SEP> 2, <SEP> 6 <SEP> 3, <SEP> 5 <SEP> 4, <SEP> 4 <SEP> 6,5 <SEP> 3,7 <SEP> 4, <SEP> 2-8, <SEP> 1
<tb> Cellules <SEP> foie <SEP> transfectées, <SEP> boîte <SEP> 2, <SEP> 6 <SEP> 6, <SEP> 9 <SEP> 9,0 <SEP> 11,7 <SEP> 10,8 <SEP> 8,5 <SEP> 5,4 <SEP> 7,1
<tb> Cellules <SEP> foie, <SEP> flacon <SEP> 1,2
<tb> Cellules <SEP> foie <SEP> transfectées, <SEP> flacon-2, <SEP> 1-
<tb>
Ces résultats sont également illustrés par la Figure 4 (courbe = population cellulaire ; barres = production d'héparine).
La Figure 4 illustre la production d'héparine au cours de la croissance des mastocytes de foie en culture statique en boîte.
Les concentrations en héparine généralement observées sont comprises entre 2 et 14 jj. g pour 106 cellules, en culture statique et en suspension.
EXEMPLE 2 : CARACTERISATION DE LA PREPARATION D'HEPARIN OBTENUE A PARTIR DE CULTURES DE MASTOCYTES Profil disaccharidique par CLHP
La composition en disaccharides permet de différencier l'héparine des autres glycosaminoglycanes.
La composition en disaccharides permet de différencier l'héparine des autres glycosaminoglycanes.
Le profil disaccharidique des glycosaminoglycanes produits par les mastocytes en culture a été déterminé selon la méthode décrite par LINHARDT et al. (Biomethods, 9,183- 97,1997).
La préparation de GAGs obtenue comme décrit à l'Exemple 1 ci-dessus a été dépolymérisée par un mélange d'héparinases de Flavobacterium heparinium (héparinases I, II, et III, GRAMPIAN ENZYMES). Les conditions utilisées sont décrites dans la publication de LINHARDT et al., citée cidessus.
<Desc/Clms Page number 12>
A titre de témoin, l'héparine standard SPIM a été dépolymérisée dans les mêmes conditions.
Dans ces conditions, la dépolymérisation est complète, et produit des disaccharides.
Les disaccharides principaux, au nombre de huit, qui sont soit N-sulfatés, soit N-acétylés sont représentés sur la Figure 5.
Détection par UV
Ces disaccharides sont séparés et identifiés par CLHP, sur colonne échangeuse d'anions comme décrit par LINHARDT et al., (cité ci-dessus).
Ces disaccharides sont séparés et identifiés par CLHP, sur colonne échangeuse d'anions comme décrit par LINHARDT et al., (cité ci-dessus).
Les résultats sont illustrés par la Figure 6, représentant le profil disaccharidique de la préparation d'héparine produite par une culture en flacon de mastocytes de foie transfectés (N), par rapport au profil disaccharidique de l'héparine standard (ex).
Ces résultats montrent que tous les disaccharides présents dans l'héparine porcine de référence SPIM sont également présents dans l'héparine de mastocyte, bien que dans des proportions différentes. Le rapport IS/IIS est de 3,7.
Détection par fluorescence
Une méthode similaire avec une détection fluorimétrique permet de quantifier uniquement les disaccharides IS et IIS, caractéristiques de l'héparine, et d'en faire le rapport.
Une méthode similaire avec une détection fluorimétrique permet de quantifier uniquement les disaccharides IS et IIS, caractéristiques de l'héparine, et d'en faire le rapport.
La dépolymérisation enzymatique et la séparation CLHP sont conduites de la même manière que celle décrite cidessus.
La séparation est suivie d'une dérivatisation post-colonne, pour former un complexe fluorescent avec la guanidine.
Le disaccharide trisulfaté IS qui possède le facteur de réponse le plus fort par cette technique, est détecté et quantifié par rapport à une solution d'héparine standard de concentration connue.
<Desc/Clms Page number 13>
La limite de détection de la méthode est de l'ordre de 5 ng/ml d'héparine dans les échantillons de culture cellulaire.
Le Tableau 2 ci-dessous illustre le rapport IS/IIS de cultures cellulaires au cours du temps. tableau2
<tb>
<tb> Jours <SEP> de <SEP> récolte <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 14
<tb> Cellules <SEP> foie, <SEP> boîte <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> 1,6 <SEP> 1,6 <SEP> 1,4 <SEP> 1, <SEP> 4 <SEP> 1, <SEP> 3-1, <SEP> 4
<tb> Cellules <SEP> foie <SEP> transfectées, <SEP> boîte <SEP> 4,1 <SEP> 5 <SEP> 4,6 <SEP> 6, <SEP> 6 <SEP> 3, <SEP> 7 <SEP> 4, <SEP> 9 <SEP> 5,6 <SEP> 5,7
<tb> Cellules <SEP> foie, <SEP> flacon <SEP> 2, <SEP> 3
<tb> Cellules <SEP> foie <SEP> transfectées, <SEP> flacon <SEP> 9-----
<tb>
EXEMPLE 3 : CARACTERISATION BIOLOGIQUE DE L'HEPARINE PAR DETERMINATION DES ACTIVITES ANTI-XA ET ANTI-IIA Activités biologiques
L'inactivation des facteurs Xa et IIa est caractéristique de l'héparine, et permet de la différencier de l'héparane sulfate et du dermatane.
<tb> Jours <SEP> de <SEP> récolte <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 14
<tb> Cellules <SEP> foie, <SEP> boîte <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> 1,6 <SEP> 1,6 <SEP> 1,4 <SEP> 1, <SEP> 4 <SEP> 1, <SEP> 3-1, <SEP> 4
<tb> Cellules <SEP> foie <SEP> transfectées, <SEP> boîte <SEP> 4,1 <SEP> 5 <SEP> 4,6 <SEP> 6, <SEP> 6 <SEP> 3, <SEP> 7 <SEP> 4, <SEP> 9 <SEP> 5,6 <SEP> 5,7
<tb> Cellules <SEP> foie, <SEP> flacon <SEP> 2, <SEP> 3
<tb> Cellules <SEP> foie <SEP> transfectées, <SEP> flacon <SEP> 9-----
<tb>
EXEMPLE 3 : CARACTERISATION BIOLOGIQUE DE L'HEPARINE PAR DETERMINATION DES ACTIVITES ANTI-XA ET ANTI-IIA Activités biologiques
L'inactivation des facteurs Xa et IIa est caractéristique de l'héparine, et permet de la différencier de l'héparane sulfate et du dermatane.
La méthode utilisée est celle décrite dans la monographie des héparines de basse masse moléculaire de la Pharmacopée Européenne 3ème édition (1997).
La réaction se déroule en trois étapes : 1. ATIII + Héparine- [ATIII-Héparine]
2. [ATIII-Héparine] + Facteur (excès)- > [ATIII- Héparine-Facteur] + Facteurésiduel)
3. Facteur (résiduel) + substrat chromophore-pNA
La quantité de paranitroaniline (pNA) libérée est mesurée à 405 nm. Elle est inversement proportionnelle à la quantité d'héparine.
2. [ATIII-Héparine] + Facteur (excès)- > [ATIII- Héparine-Facteur] + Facteurésiduel)
3. Facteur (résiduel) + substrat chromophore-pNA
La quantité de paranitroaniline (pNA) libérée est mesurée à 405 nm. Elle est inversement proportionnelle à la quantité d'héparine.
L'activité anti-Xa ou anti-IIa est évaluée par rapport à une droite d'étalonnage établie avec le standard SPIM.
La sensibilité de la méthode est de 0,006 UI/ml.
Les résultats obtenus sont représentés sur le Tableau 3 ci-dessous.
<Desc/Clms Page number 14>
Tableau 3
<tb>
<tb> Jours <SEP> de <SEP> récolte <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 14
<tb> Cellules <SEP> foie, <SEP> boîte <SEP> :
<tb> Anti-Xa <SEP> 2,1 <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP> 5, <SEP> 7 <SEP> 4,0 <SEP> 2,4 <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP> - <SEP> 0,0
<tb> Ante-lia
<tb> Ratio <SEP> anti-Xa/anti-lla
<tb> Cellules <SEP> foie <SEP> transfectées, <SEP> boîte <SEP> :
<tb> Anti-Xa <SEP> 44 <SEP> 11,5 <SEP> 11,7 <SEP> 12, <SEP> 3 <SEP> 11,4 <SEP> 13, <SEP> 0 <SEP> 11,6 <SEP> 12, <SEP> 9
<tb> Anti-lla
<tb> Ratio <SEP> anti-Xa/anti-Ha
<tb> Cellules <SEP> foie, <SEP> flacon
<tb> Anti-Xa <SEP> 0, <SEP> 7
<tb> Anti-lla <SEP> 1,4
<tb> Ratio <SEP> anti-Xa/anti-tla <SEP> 0, <SEP> 6---Cellules <SEP> foie <SEP> transfectées, <SEP> flacon
<tb> Anti-Xa-3, <SEP> 1--Anti-lia-14--Ratio <SEP> anti-Xa/anti-lla <SEP> - <SEP> 0,2
<tb>
<tb> Jours <SEP> de <SEP> récolte <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 14
<tb> Cellules <SEP> foie, <SEP> boîte <SEP> :
<tb> Anti-Xa <SEP> 2,1 <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP> 5, <SEP> 7 <SEP> 4,0 <SEP> 2,4 <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP> - <SEP> 0,0
<tb> Ante-lia
<tb> Ratio <SEP> anti-Xa/anti-lla
<tb> Cellules <SEP> foie <SEP> transfectées, <SEP> boîte <SEP> :
<tb> Anti-Xa <SEP> 44 <SEP> 11,5 <SEP> 11,7 <SEP> 12, <SEP> 3 <SEP> 11,4 <SEP> 13, <SEP> 0 <SEP> 11,6 <SEP> 12, <SEP> 9
<tb> Anti-lla
<tb> Ratio <SEP> anti-Xa/anti-Ha
<tb> Cellules <SEP> foie, <SEP> flacon
<tb> Anti-Xa <SEP> 0, <SEP> 7
<tb> Anti-lla <SEP> 1,4
<tb> Ratio <SEP> anti-Xa/anti-tla <SEP> 0, <SEP> 6---Cellules <SEP> foie <SEP> transfectées, <SEP> flacon
<tb> Anti-Xa-3, <SEP> 1--Anti-lia-14--Ratio <SEP> anti-Xa/anti-lla <SEP> - <SEP> 0,2
<tb>
L'activité anti-Xa ou anti-IIa de l'héparine obtenue à partir de mastocytes en culture a été comparée à l'activité anti-Xa ou anti-IIa, respectivement, de l'héparine obtenue à partir de mucus porcin ou de l'héparine standard.
Les résultats sont illustrés dans le Tableau 4 ci-dessous.
Tableau 4
<tb>
<tb> Anti-Xa <SEP> Anti-lla <SEP> Xa/lla
<tb> (Ul/mg) <SEP> (Ul/mg) <SEP> (Ul/mg)
<tb> Héparine <SEP> de <SEP> mastocytes18 <SEP> à <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 14 <SEP> à <SEP> 30, <SEP> 2à1
<tb> Héparine <SEP> de <SEP> mucus80811
<tb> Héparine <SEP> standard <SEP> 180 <SEP> 180
<tb>
Caractérisation de la liaison à l'ATIII
La liaison spécifique entre l'héparine et l'ATIII est mise en évidence par un retard de migration par des techniques d'électrophorèse comme décrit dans LEE et LANDER (Proc. Natl. Acad. Sci., 88,2768-72, 1991).
<tb> Anti-Xa <SEP> Anti-lla <SEP> Xa/lla
<tb> (Ul/mg) <SEP> (Ul/mg) <SEP> (Ul/mg)
<tb> Héparine <SEP> de <SEP> mastocytes18 <SEP> à <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 14 <SEP> à <SEP> 30, <SEP> 2à1
<tb> Héparine <SEP> de <SEP> mucus80811
<tb> Héparine <SEP> standard <SEP> 180 <SEP> 180
<tb>
Caractérisation de la liaison à l'ATIII
La liaison spécifique entre l'héparine et l'ATIII est mise en évidence par un retard de migration par des techniques d'électrophorèse comme décrit dans LEE et LANDER (Proc. Natl. Acad. Sci., 88,2768-72, 1991).
L'électrophorèse est réalisée sur gel d'agarose à 0,8% dans une solution à pH 3 (acide acétique/hydroxyde de lithium).
A 100 jj. l d'échantillon à tester, on ajoute 100 p. l de solution de concentration croissantes de 584 à 183 g/ml d'ATIII (origine humaine ; BIOGENIC).
Des dépôts de 100 l d'échantillon sont faits. La migration est de 30 minutes à 100 volts.
Les gels sont fixés par une solution de bromure d'hexadécyltriméthyl ammonium (CETAVLON-SIGMA) à 0,1%.
<Desc/Clms Page number 15>
La révélation est effectuée par l'Azure A (0,08% dans l'eau).
Les gels sont scannés et interprétés avec le logiciel QUANTITY ONE (BIO-RAD).
Les résultats sont exprimés en % d'héparine liée à l'ATIII.
Les résultats obtenus dans le cas d'une culture en flacon de cellules de foie transfectées sont illustrés par la Figure 7.
On observe une liaison de l'ATIII de 31% (valeur théorique 33%) en présence d'héparine standard (SPIM), et de 27% en présence de l'héparine obtenue à partir de mastocytes en culture (composé).
Claims (4)
1) Procédé de production d'héparine, caractérisé en ce qu'il comprend la culture de mastocytes séreux et la récupération de l'héparine à partir des cultures obtenues.
2) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que lesdits mastocytes sont des mastocytes de porc.
3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que lesdits mastocytes sont issus d'une lignée de mastocytes choisie parmi :
- la lignée déposée auprès de la CNCM le 17 octobre 2001, sous le numéro 1-2735 ; - la lignée déposée auprès de la CNCM le 17 octobre. 2001, sous le numéro 1-2736 ; - la lignée déposée auprès de la CNCM le 17 octobre 2001, sous le numéro 1-2734.
4) Préparation d'héparine susceptible d'être obtenue par un procédé selon une quelconque des revendications 1 à 3.
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