FI60032C - Foerfarande foer framstaellning av nytt terapeutiskt verkande cyklosporin g - Google Patents

Description

·:Τ·Τϊ-'τΊ rm Μ1ν KUULUTUSJULKAISU nn70 jpPjg ™ (11) UTLÄGGNINGSSKRIFT 600ϋ2 ^§2^ «11 Kvik3/intci3 C 12 P 17/10 // C 07 D 259/00, (51) / C 07 C 105/52 SUOMI—FINLAND (M) Pstsnttlhiksmua— Pttsntanaöknlng 7931.1)2 (22) Hsksmiaptivl — AnsOknlngsdag 10.10.79 ' ' (23) Alku p&lvl— Glttlfhaudag 10.10.79 (41) Tullut Julkteuksl — Bllvlt offsntllf , -

Patentti- ja rekisterihallitus .......... - . 19.0k.00 _ , (44) NlhttvSksIpMon |a kuuLjulkatain pvm. —

Patent· och registerstyrelsen ' Ansakin utlsgd och uti.akriftan publicand 31.07.8l (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus —Begird prlorltet 18.10.78 22.03.79, 15.08.79 Sveitsi-Schveiz(CK)· 10776/78, 2696/79, 7^80/79 (71) Sandoz A.G., Basel, Sveitsi-Schweiz(CH) (72) Rene P. Traber, Basel, Hans Hoftoann, Ettingen, Eugen Harri, Therwil,

Max Kuhn, Basel, Sveitsi-Schveiz(CH) (7IO Oy Kolster Ab (5k) Menetelmä uuden terapeuttisesti vaikuttavan syklosporiini G:n valmistand-seksi - Förfarande för framställning av nytt terapeutiskt verkande

cyklosporin G

Tämän keksinnön kohteena on menetelmä terapeuttisesti vaikuttavan kaavan I

mukaisen syklosporiini G:n valmistamiseksi CH,- χΉ c CH XCH H fl2 fH3 1

' ?H PH PH HO ^CH- CH

I ^“3x . ,pw (R) CH_ I 2 CH CH- J CH J CH- (R)| 3 CH„ CH- I 2 I 3 1 I 3 I I 2 I 3 CH -N-CH-C0-N-CH-C-N-CH-CO-N-CH-C-N-CH- 3 U l » L 11» I 2 CH3 f ° H 0 co

VCH-CH - CH L

CH/ I N-CH, 3 CH,-N 3

3 I n r H _ 0 T H

I o L I L II L I T

0C-CH-N—C0-CH-N-CO-CH-N-C—CH-N—CO —CH

ill 'll I

ch3 H ch3 CH2 ch3 ^ ch2

^CH / \ ^CH

CH3 ^CH3 CH3 CH3 CH3 >CH3 60012 2 Tämän keksinnön mukaisesti valmistetaan syklosporiini G:tä siten, että tunnettua sienilajin Tolypocladium inflatum Gams kantaa NRRL 80I+U viljellään ravintoliuoksessa, ja syklosporiini G eristetään tavanomaisin menetelmin viljelyliuok-sesta, joka sisältää myös tunnettuja syklosporiineja A, B, C ja D,

Viljely tapahtuu tunnetuilla, vastaavien kantojen viljelyssä käytetyillä menetelmillä, kuten esim. esimerkissä on selostettu.

Edullinen syklosporiini G:tä tuottava kanta on Tolypocladium inflatum Gams-sienilajiin kuuluva NRRL 80UU. Näyte tästä kannasta luovutettiin United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, 111., USA, kokoelmiin, jossa sille annettiin numero NRRL 80UU, ja josta se on yleisesti saatavissa. Toinen näyte tästä kannasta luovutettiin Fermentation Research Instituteen, Inage, Chiba City, Japan, jossa sille annettiin numero FRI FERM-P No. 2796. Tämä kanta luettiin aikaisemmin sienilajiin Trichoderma polysporum (Link ex. Pers.), ja sitä on selostettu esim. suomalaisessa patenttijulkaisussa 5^ 606.

Syklosporiini G voidaan erottaa tunnetuilla menetelmillä, kuten esim. esimerkissä kuvataan. Tällöin syklosporiini G saadaan erilleen samanaikaisesti läsnäolevista luonnontuotteista, kuten vähemmän polaarisesta syklosporiini D:stä, hieman polaarisemmasta syklosporiini A:sta (tunnetaan myös nimellä S 7^81/F-l), polaarisemmasta syklosporiini B:stä (tunnetaan myös nimellä S 7*+8l/F-2) ja vielä polaarisemmasta syklosporiini C:stä.

Syklosporiini G:llä on mielenkiintoisia farmakologisia ominaisuuksia, joiden ansiosta sitä voidaan käyttää lääkkeenä.

Syklosporiini G:llä on varsinkin immunosupressiivista ja tulehdusten-vastaista vaikutusta.

Syklosporiini G:tä voidaan käyttää lääkkeenä sellaisenaan tai valmisteina, joihin on sekoitettu farmaseuttisesti hyväksyttäviä inerttejä apuaineita.

Syklosporiini G:llä on osoittautunut olevan erinomainen vaikutus Freund-Adjuvans-Arthritis-kokeessa. Tällöin yhdiste on osoittautunut tehokkaammaksi (EDj-q = 10 mg/kg p.o.) kuin rakenteellisesti samankaltainen suomalaisessa patenttijulkaisussa 52 851 kuvattu syklosporiini A-yhdiste S 7^81/F-1 (ed^q = 25 mg/kg p.o.) sekä suomalaisessa patenttihakemuksessa 781 3^+8 kuvattu syklosporiini D-yhdiste (ED^ = 1^4 mg/kg).

Sitä paitsi syklosporiini G:llä on havaittu olevar. voimakas immunosupres-siivinen vaikutus, Lymfosyyttistimulointikokeessa (Jänossy ja Greaves, Clin. exp. Immunol. 9 (1971) ^+83 ja 10 (1972) 525) syklosporiini G:r on havaittu estävän in vitro 96-$:isesti hiiren pernasta eristettyjen Concanavalin A:11a stimuloitujen 3 60032 lymfosyyttien jakaantumisnopeutta pitoisuuden ollessa 0,1 ^ig/ml (vastaava arvo syklosporiini A:lie oli -78 %).

Seuraavassa esimerkissä tarkoittavat kaikki lämpötilat Celsius-asteita.

Esimerkki

Syklosporiini G

500 litraan ravintoliuosta, joka sisältää litraa kohti t0 g glukoosia, 2,0 g natriumkaseinaattia, 2,5 g ammoniumfosfaattia, 5 g MgSO^.TH^O, 2 g KH^PO^, 3 g NaNO^, 0,5 g KC1, 0,01 g FeSO^ sekä mineraaleista vapaata vettä, siirroste-taan 50 litraa sienilajin Tolypocladium inflatum Gams kannan NRRL 80UU esiviljel-mää ja saatua seosta inkuboidaan teräsfermentorissa 13 vuorokautta 27°C:ssa käyttämällä sekoitusta (170 l/min) ja ilmastusta (1 litra ilmaa/min/litra ravinto-liuosta) (ks. FI-patenttijulkaisu 5^ 606).

Kasvuliuokseen sekoitetaan kasvuliuoksen tilavuuden verran n-butyyli-asetaattia, orgaaninen faasi erotetaan ja väkevöidään vakuumissa ja konsentraatista poistetaan rasva kolmivaiheisessa erotuksessa metanoli-vesiseoksen (9:1 ) ja petrolieetterin avulla, Metanolifaasi otetaan talteen, väkevöidään vakuumissa ja raakatuote saostetaan lisäämällä vettä. Suodattamalla talteenotettu tuote kroma-tografoidaan 5_7“kertaisella määrällä "Sephadex LH-20:tä" käyttämällä eluenttina metanolia. Sen jälkeen kärkijakeet kromatografoidaan silikageeli 60:llä, raekoko 0,063-0,2 mm (Merck) käyttämällä eluenttina asetoni-heksaaniseosta (2:1), ja tällöin ensimmäisinä eluoituneissa jakeissa on pääasiassa syklosporiini A:ta ja syklosporiini D:tä ja myöhemmin eluoituneissa osissa pääasiassa syklosporiini 0:tä. Jatkopuhdistusta varten kiteytetään syklosporiini A:ta ja D:tä sisältävät jakeet 2-2,5-kertaisesta määrästä asetonia -15°C:ssa, ja kun sen jälkeen kromatografoidaan kaksi kertaa silikageeli 60;llä, raekoko 0,063-0,2 mm (Merck) käyttämällä eluenttina asetoni-heksaaniseosta (2:1), eluoituu ensimmäisissä jakeissa syklosporiini D:tä voimakkaasti rikastuneena. Nämä jakeet liuotetaan kaksinkertaiseen määrään asetonia ja annetaan kiteytyä -15°C:ssa, Epäpuhdas kidemassa koostuu hyvin voimakkaasti rikastuneesta syklosporiini P:stä ja emäliuos sisältää syklosporiini D:n lisäksi myös muita komponentteja, kuten syklosporiini G:tä. Syklosporiini G:n erottamiseksi emäliuos haihdutetaan kuiviin, ja kun jäännös kromatografoidaan silikageeli 60:llä, raekoko 0,063-0,2 mm (Merck) käyttämällä eluenttina vedellä kyllästettyä etikkaesteriä, sisältävät ensin eluoituneet jakeet syklosporiini D:tä ja myöhemmin eluoituneet jakeet syklosporiini G:tä sekä muita komponentteja. Rikastamista jatketaan siten, että seos kromatografoidaan silikageeli 60:llä, raekoko 0,063-0,2 mm (Merck) käyttämällä ensin eluenttina kloroformi-metanoliseosta (98:2) ja sen jälkeen heksaani-asetoniseosta (2:1), ja ^' , 60032 k tällöin myöhemmin eluoituneet jakeet sisältävät syklosporiini G:tä erittäin rikastuneessa muodossa, Kun puhdistusta jatketaan siten, että syklosporiini G:ta sisältävät jakeet kiteytetään kahdesti huoneenlämpötilassa eetteri-petroli-eetteriseoksesta (l:l), saadaan ohutkerroskromatografisesti yhtenäistä, puhdasta (puhtausaste >95 %) syklosporiini G:tä värittöminä monitahokkaina, sp. 190-19*»° (kiteitä kuivattu korkeavakuumissa 80°C:ssa 2 tuntia).

/o<J7p0= -2*»5° (c = 1,00 kloroformissa) -191° (c = 1,01» metanolissa), UV-spektri metanolissa: pääteabsorptio IR-spektri metyleenikloridissa: ks. kuva 1, 1H-NMR-spektri (CDCl^), 90 MHz, sisäisenä standardina tetrametyylisilaani: ks. kuva 2.

Bruttokaava: 13^11°12’ •r 3

Claims (3)

1. 3. L L I L I L Ί 2 'n O ^ H ^ 0 CH | CO \ I NCH-CH -CH L CH,/ | "-CH3
2. 5 CH -N In T H r 0 _ H I D L I L H L 1 L OC-CH-N-CO-CH-N-CO-CH-N-C —CH —N—CO — CH III ill I CH. H CH- CH0 CH, CH CH0
3. 3. I 2 3 / \ I 2 CH CH CH ^CH CH3 CH3 CH3 CH3 tunnettu siitä, että tunnettua sienilajin Tolypocladium inflatum Gams kantaa NRRL 80^ viljellään ravintoliuoksessa, ja syklosporiini G eristetään tavanomaisin menetelmin viljelyliuoksesta, joke, sisältää myös tunnettuja syklosporiineja A, B, C ja D,