FI58939C - Foerfarande foer framstaellning av ett glukos isomeriserande enzym - Google Patents

Description

FväF»! [b] (11)KUULUTUSJULKAISU cqotq fGSA lDJ 'Ί1' UTLAGG N I NGSSKRI FT 3 O ¥ ö 7 3-3νΒ> C Patentti työnnetty li 05 1901 ^ Patent mcidolat ^ v (51) Kv.lk.3/tat.CI.3 C 12 N 9/92 SUOMI —FINLAND (21) P»t.nttlh«k*mu»-P»t*nu»*^n| 773006 (22) Hakamhpllvl —AntMcnlngadag 11.10.77 ' * (23) Alku pilvi—GUtlghttsdag 11.10.77 (41) Tullut ivIklMksI — Bllvit 21 04 78 ^ ia r.ki.t*rih.llltui NlhUvtolp^ ). ku«L|u.W«,„ pvm. _

Patani och ragisterstyrelaan ' ’ Anaöku utlapd oeh uti.*krifun puMiund 30.01.81 (32)(33)(31) Bjflrtttty «uoikw·—B«glrd priority 20.10.76 USA(US) 731+222 (71) R.J. Reynolds Tobacco Company, Main & Fourth Streets,Winston Salem,

North Carolina, USA(US) (72) Chin Kee Lee, Winston Salem, North Carolina, USA(US) (7*0 Oy Kolster Ab (51*) Menetelmä glukoosia isomeroivan entsyymin valmistamiseksi - Förfarande för framställning av ett glukos isomeriserande enzym

Keksinnön kohteena on menetelmä sellaisen entsyymin,valmistamiseksi, joka on sopiva käytettäväksi glukoosin isomeroinnissa fruktoosiksi.

Viime vuosina on esiintynyt huomattavaa mielenkiintoa glukoosin muuttamiseksi entsymaattisesti fruktoosiksi erityisesti fruktoosia sisältävien siirappien valmistuksen yhteydessä maissitärkkelyksestä. Tätä konversiota varten käytettyä glukoosi-isomeraasia voidaan saada mikro-organismeista, jotka kuuluvat eri sukuihin, kuten Arthrobacter, Streptomyces, Bacillus ja Actinopianes. Eräs glukoosi-isomeraasilähde on äskettäin esitetty US-patentissa n:o 3 956 066, jossa esitetään glukoosi-isomeraasin valmistus Flavobacterium devorans-lajin avulla.

Nyt on havaittu, että Flavobacterium arborescens-lajin kannat pystyvät tuottamaan huomattavat määrät glukoosi-isomeraasia, joka entsyymi sopii hyvin käytettäväksi glukoosin isomeroinnissa fruktoosiksi.

Vaikka tässä esitetyt organismit luetaan kuuluviksi Flavobacterium arbores-cens-lajiin, on huomattava, että parhaillaan neuvotellaan näiden organismien oikeasta luokittelusta. Sivuilla 362-363 Bergey'n teoksen Manual of Determinative Bacteriology 8. painoksessa ilmoitetaan, että F. arborescens-laji on väärin luokiteltu 58939

Flavobacterium-suvun jäseneksi. Uutta luokittelua ja korjattua nimistöä ei vielä ole julkaistu näille organismeille. Sen tähden tässä käytetään olemassa olevaa nimistöä ymmärtäen, että mahdollisesti omaksutaan toinen suku-nimitys Flavobacterium arborescens'in uudelleen luokittelussa. On huomattava, että Flavobacterium devoratis-lajia, johon United US-patentissa n:o 3 956 066 viitataan, ei ole ehdotettu uudelleen luokitettavaksi ja täten itseasiassa kuuluu eri sukuun.

Edulliset organismit, joita tämän keksinnön yhteydessä käytetään, ovat kannasta ATCC ^358 eristetyt kaksi mutanttikantaa, jotka on saatavissa kokoelmasta "Amrican Type Culture Collection". F. arborescens mainitut edulliset mutanttikannat, jotka pystyvät tuottamaan merkittäviä määriä glukoosi-isomeraasia, on talletettu pysyvään kokoelmaan ARS Culture Collection of the, USDA Northern Regional Research Laboratory Peoriassa, Illinoisissa, ja niitä on saatavina viljelminä NRRL Br-11.022 ja NRRL B-II.O23.

Keksinnön mukaisesti käytetyn kolmen edullisen kannan yleiset ominaisuudet ovat seuraavat: muoto sauvamainen; sauvat esiintyvät yksittäin tai ketjuina; sauvojen pituus 0,5-2,5 pm; käymisliemessä muodostuu pitkiä, aaltomaisia nauhoja; kannat liikkumattomia, gram-positiivisia.

Gelätiinikoloniät: pienellä suurennuksella katsottuna koloniat ovat ensin haarautuneita säikeitä; keskusta tulee kellertäväksi ja reunat tulevat läpikuultaviksi ja puumaisiksi.

Gelatiinisauvakoe: nesteytymistä ja keltaisen saostuman muodostuminen.

Agar-vinoviljelmä : hidas, likaisen oranssinvärinen kasvu.

Käymisliemi: turbulentti keltainen liete, ei kalvoa.

Lakmus-maito: hidas koagulaatio, lakmus pelkistyy, reaktio neutraali.

Viljely kiinteässä väliaineessa (peruna): tumman oranssi, rehevä kasvu. Nitraattiliuoksessa ei kasvua, nitriittejä ei muodostu. Aerobinen, fakultatiivises-ti aerobinen. Optimi kasvulämpötila 30°C.

Tässä esitettyjä mikro-organismeja voidaan viljellä joukossa eri väliaineita, jotka sisältävät hiili- ja typpilähteitä sekä «epäorgaanisiä suoloja. Eräs tyypillinen väliaine sisältää hydrolysoitua eläinproteiinia, maissinliuotusnestettä, panimohiivauutetta, kaliumdivetyfosfaattia, kaliummonovetyfosfaattia ja sopivan hiilihydraatin. Käyttökelpoisia hiilihydraatteja ovat ksyloosi, glukoosi, maltoosi, sakkaroosi ja laktoosi sekä myös ksylaanin, tärkkelyksen ja selluloosan hydrolysaa-tit. Kasvuväliaineen alku-pH on n. J ja käyminen saatetaan tapahtumaan aerobisesti n. 30°C:ssa sopivassa käymislaitteessa tai ravistuspullossa. Suurin isomeraasi-aktiivisuus saavutetaan yleensä n. 48-72 tunnissa.

ATCC 4358 kykenee kehittämään isomeraasi-aktiviteettia viljeltäessä tätä kantaa elatusaineessa, joka sisältää ksyloosia ainoana hiilihydraattilähteenä, mutta ei kykene tuottamaan isomeraasia käytettäessä glukoosia tai laktoosia ainoana 58939 3 hiilihydraattilähteenä.

NRRL B-11,022 kykenee kehittämään oleellisen isomeraasiaktiviteetin viljel-täessä tätä kantaa elatusaineessa, joka sisältää laktoosia ainoana hiilihydraatti-lähteenä, mutta kykenee kehittämään vain vähän aktiviteettia, kun glukoosi on ainoana hiilihydraattilähteenä.

NRRL B-11,023 kykenee kehittämään oleellisen isomeraasiaktiviteetin viljel-täessä tätä kantaa elatusaineessa, joka sisältää joko glukoosia tai laktoosia ainoana hiilihydraattilähteenä.

Mikro-organismien tuottama isomeraasiaktiivisuus määritetään inkuboimalla 60°C:ssa 30 minuuttia seosta, joka sisältää 0,5 ml entsyymiä sisältävää valmistetta ja 1,5 ml liuosta, joka sisältää riittävästi dekstroosia, Tricine-puskuria (pH 8) ja magnesiumkloridia antamaan loppupitoisuudeksi vastaavasti 1,CJM, 0,1M ja 0,03M. Inkubointijakson lopulla isomerointireaktio lopetetaan lisäämällä 0,5 ml 1,0N kloo-rivetyhappoa. Linkoamisen jälkeen sakan päällä oleva kirkas jae laimennetaan sopivasti ja muodostunut fruktoosi määritetään L. Messineo'n ja E. Musarra'n menetelmällä, kuten on kuvattu julkaisussa Int. J. Biochem. 3 (l8), 691-699 (1972). Isomeraasiaktiivisuus ilmaistaan mikroyksikköinä, jolloin aktiivisuuden yksi mikroyksikkö määritellään määräksi entsyymiä, joka tuottaa yhden mikrogramman fruktoosia minuutissa edellä kuvatuissa määritysolosuhteissa.

Edullisten kantojen tuottaman isaneraasin määrän edullisissa viljelyolosuhteissa on havaittu olevan melko suuri ja merkittävästi suurempi kuin muilla tekniikan tason esittämillä isomeraasia tuottavilla mikro-organismeilla. Edullisten kantojen isomeraasituotanto vaihtelee huomattavasti riippuen käytetyistä viljelyolosuhteista. Erityisen yllättävä ja odottamaton tulos on, että maksimi-isomeraasi-tuotantoon on havaittu päästävän käytettäessä laktoosia kasvuväliaineessa. Esimerkiksi, NRRL B-11.022:n viljely väliaineessa, joka sisälsi 2 % laktoosia, antaa 2892 mikroyksikköä isomeraasia ml:aa kohti käymislientä. Niinpä edullisille kannoille on edelleen ominaista ja ne erottuvat aikaisenmista tunnetuista läheisistä kannoista siinä, että ne pystyvät tuottamaan suuria määriä (ts. 500 mikroyksikköä/ml lientä tai enemmän) isomeraasiaktiivisuutta, kun niitä viljellään ravintoväliainees-sa, joka sisältää laktoosia ainoana hiilihydraattilähteenä. Hyvin suurta entsyymin tuotantoa tapahtuu myös, kun hiilihydraatteja ei ollenkaan lisätä väliaineeseen.

Tämä osoitetaan arvoilla taulukossa 1, jotka perustuvat F. arborescens-kantojen viljelyyn 30°C:ssa väliaineessa joka sisältää 1 % hydrolysoitua eläinproteiinia (Bacto-Tryptone, jota tuottaa Difco Laboratories Detroitissa, Michiganissa), 1 % maissinliuotusnestettä, 1 % hiivauutetta, 1 % natriummonovetyfosfaattia, 0,5 % kaliumdivetyfosfaattia ja 2 % hiilihydraattia.

11 58939

Taulukko 1 F. arborescens'in tuottama isomeraasi

Hiilihydraatti Isomeraasiaktiivisuus mikroyksikköinä/ml väliaineessa tuntia ATCC 1+358_NRRL B-11.022 NRRL B-11.023 ei läsnä 72 0 10k2 ll+80 ksyloosi 72 5^+6 892 775 glukoosi 72 0 89 1123 laktoosi 72 0 2892 1Ö79 maltoosi 72 - 131^ sakkaroosi 72 - 1190 F. abrorescens'illa tuotetulla isameraasilla on käyttökelpoinen aktiivisuus pH-alueella n. 6-10 ja n. l*5-90°C:een lämpötilassa. Taulukko 2 osoittaa pH:n vaikutuksen ja taulukko 3 osoittaa lämpötilan vaikutuksen isomeraasiaktiivisuuteen, joka liittyy ehjiin soluihin, jotka on saatu viljelemällä NRRL B-11.022 laktoosia sisältävässä ravintoliuoksessa 30°C;ssa 72 tuntia. Entsyymin pysyvyys on osoitettu taulukossa k. Arvoja varten taulukoissa 2 ja 3» pestiin talteenotetut solut kerran ja suspendoitiin uudelleen veteen alkuperäiseen solupitoisuuteen käymisliemessä. Edellä kuvattua standardimääritysmenetelmää käytettiin isomeraasiaktiivisuuden mittaamiseen, paitsi että puskuria vaihdeltiin pH-tutkimuksessa ja lämpötilaa vaihdeltiin lämpötilan vaikutuskokeissa. Pysyvyystutkimus, joka on koottu taulukkoon k, käsitti pestyjen solujen inkuboinnin 0,05M TRICIKE-puskurissa (pH 8), joka sisältää magne-siumkloridia (Ο,ΟΟ^Μ) sekä inkuboitujen solujen määrittämisen määrätyin väliajoin käyttäen standardimääritysmenetelmää.

Taulukko 2 pHin vaikutus NRRL B-11.022:sta saatuun isomer aasiin Puskuri pH Isomeraasiaktiivisuus mikroyksikköinä/ml PIPES1 6,0 598 PIPES1 6,5 1201+ PIPES1 7,0 1782 PIPES1 7,5 2202

TRICINE2 7,5 262U

TRICINE2 8,0 3OI6 TRICINE2 8,5 3I+56 TRICINE2 9,0 3I+08 ^IPES on mononatrium l,U-piperatsiinidietaanisulfonihappo.

^TRICINE on N-/2-hydroksi-l,l-bis(hydroksimetyyli7-glysiini.

5 58939

Taulukko 3 Lämpötilan vaikutus HREL B-11.022:sta saatuun isomeraasiin pH 3,0:ssa.

Lämpötila °C:ssa_Isomer aasi aktiivisuus mikroyksikköinä/ml ^5 775 50 1717 55 2776 60 3500 65 UUoo

70 510U

75 5960 80 6592 85 7088

Taulukko U

HRRL B-11.022:sta saadun isomeraasin pysyvyys valituissa lämpö-_tiloissa_

Isomeraasiaktiivisuus mikroyksiköissä/ml

Kokonais- inkubointiaika 60 C:een inkubointi 70uC:een inkubointi tunteina_______ 21 2212 23l0 96 2276 22kk 158 2276 2036 2l0 2262 2092

Taulukon 1 arvoista käy ilmi, että entsyymi on pääasiallisesti pysyvä ainakin 200 tuntia pH 8:ssa ja 60°C:ssa, kuten on määritetty analysoimalla entsyymin sisältäviä pestyjä soluja. Pestyjen solujen muodostamalle entsyymivalmisteelle on edelleen ominaista, että se säilyttää ainakin 85 % aktiivisuudestaan, kun sitä kuumennetaan 200 tuntia 70°C:ssa ja pH 8:ssa.

F. arborescens'in tuottama isomeraasi on hyvin tehokas glukoosin muuttamiseksi fruktoosiksi ja useita erilaisia tunnettuja menetelmiä voidaan käyttää tällaisia konversioita varten.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksinnön käyttöä ja etuja edelleen.

Esimerkki 1 500 ml: n Eirlenmeyer-pulloon pantiin 100 ml ravintoväliainetta, joka sisälsi seuraavaa: 6 * 58939 hydrolysoitu eläinproteiin ia 1,0 maissin 1iuotuanestettä 1,0 hi ivauutetta 1,0 κ2ηρο^ 1,0 ΚΗ2Ρ0^ 0,5 laktoosia 2,0

Edellä esitetty väliaine ympättiin vastavaImistetu11 a F. arborescens NRRL B-11.022:sta saadulla ympillä ja ympättyä väliainetta sekoitettiin 30°:ssa käyttäen pyörivää ravistinta. 72 tunnin kuluttua suoritettu analyysi ilmaisi isomeraa-siaktiivisuusekvivalentteja olevan läsnä 2892 mikroyksikköä ml:aa kohti kokonais-1ientä.

Esimerkki 2

Esimerkin 1 menettely toistettiin, paitsi että laktoosi korvattiin glukoosilla ravintovä1 iaineessa ja ymppi saatiin F. abrorescens NRRL B-11 .023:sta. Sh tunnin kuluttua suoritettiin analyysi ja havaittiin isomeraasiaktiivisuusekvivalentin olevan 580 mikroyksikköä ml:aa kohti kokonais 1ientä.