FI58940C - Foerfarande foer enzymatisk omvandling av glukos till fruktos - Google Patents

Description

κ '^Τ'-Λ Γβ1 KUULUTUSJULKAISU r Q π λ η jj&l·» W (11)UTlAOONINO*SKRIFT 58940 C «ο Patentti myCnr... tty il 05 1931 Patent ir.eddelat (St, Kv.*.W3 o 12 If 9/92 // o 12 a 1/20 SUOMI —FINLAND (21) ^Miwtlhikemut — Pw*ntti»ftknlnj 792126 (22) Hakamlapilvi — Am6knin(id«( 05.07.79 (23) AlkupUvt—GHtighetidaf 11.10.77 (41) Tullut JulklMksI — Bllvlt off«ntllg

Patentti- )a rakistarihallittM NihtMkrtp™» „ kuuL|«iw*,n pvm. -

Patant* och roglstcrstyrofMn ' Amöku uti*|d och uti.*knft*n pubikarad 30.01.81 (32)(33)(31) Pyydetty ·ωο»ι«ιι*—β·*ΐΛΐ priorit·* 20.10.76 USA(US) 73^222 (71) R.J. Reynolds Tobacco Company, Main & Fourth Streets, Winston Salem,

North Carolina, USA(US) (72) Chin Kee Lee, Winston Salem, North Carolina, USA(US) (ib) Oy Kolster Ab (5*0 Menetelmä glukoosin entsymaattiseksi muuttamiseksi fruktoosiksi -Förfarande för enzymatisk omvandling av glukos tili fruktos (62) Jakamalla erotettu hakemuksesta 773006 (kuulutusjulkaisu 5Ö939) ~

Avdelad frän ansökan 773006 (utläggningsskrift 58939)

Keksinnön kohteena on menetelmä glukoosin entsymaattiseksi muuttamiseksi fruktoosiksi.

Viime vuosina on esiintynyt huomattava mielenkiintoa glukoosin muuttamiseksi entsymaattisesti fruktoosiksi erityisesti fruktoosia sisältävien siirappien valmistuksen yhteydessä maissitärkkelyk-sestä. Tätä konversiota varten käytettyä glukoosi-isomeraasia voidaan saada mikro-organismeista, jotka kuuluvat eri sukuihin, kuten Arthrobacter, Streptomyces, Bacillus ja Actinoplanes. Eräs glukoosi-isomeraasilähde on äskettäin esitetty US-patentissa n:o 3 965 066, jossa esitetään glukoosi-isomeraasin valmistusta Flavobacterium devorans -lajin avulla.

Tämä keksintö perustuu havaintoon, että Flavobacterium arborescens -lajin kannat pystyvät tuottamaan glukoosi-isomeraasia 2 58940 huomattavissa määrissä. Tämä entsyymi sopii hyvin käytettäväksi glu-koosi-isomerointiprosessissa.

Vaikka tässä esitetyt organismit luetaan kuuluviksi Flavobac-terium arborescens -lajiin, on huomattava, että on erilaisia mielipiteitä näiden organismien oikeasta luokittelusta. Sivuilla 362-363 Bergey'n teoksen Manual of Determinative Bacteriology 8. painoksessa ilmoitetaan, että F. arborescens -laji on väärin luokiteltu Flavobacterium-suvun jäseneksi. Näiden organismien uutta luokittelua ja korjattua nimistöä ei vielä ole julkaistu. Sen tähden tässä käytetään olemassa olevaa nimistöä, jolloin on ymmärrettävää, että mahdollisesti otetaan käyttöön toinen suku-nimitys Flavobacte-rium arborescens1 in uudelleen luokittelussa. Huomattakoon, että Flavobacterium devorans -lajia, johon US-patentissa n:o 3 956 066 viitataan, ei ole ehdotettu uudelleen luokiteltavaksi ja täten itse asiassa kuuluu eri sukuun.

Edulliset organismit, joita tämän keksinnön yhteydessä käytetään, ovat kannasta ATCC 4358 eristetyt kaksi mutanttikantaa, jotka on saatavissa kokoelmasta "American Type Culture Collection", F. arborescens -lajin mainitut edulliset mutanttikannat, jotka pystyvät tuottamaan merkittäviä määriä glukoosi-isomeraasia, on talletettu pysyvään kokoelmaan ARS Culture Collection of the, USDA Northern Regional Research Laboratory Peoriassa, Illinoisissa, ja niitä on saatavina viljelminä NRRL B-11,022 ja NRRL B-11,023.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetyn kahden edullisen kannan ominaisuudet ovat seuraavat: muoto sauvamainen; sauvat esiintyvät yksittäin tai ketjuina; sauvojen pituus 0,5-2,5 ^im; käymisliemes-sä muodostuu pitkiä, aaltomaisia nauhoja; kannat liikkumattomia, gram-positiivisia.

Gelatiinikoloniat: pienellä suurennuksella katsottuna koloniat ovat ensin haarautuneita säikeitä; keskusta tulee kellertäväksi ja reunat tulevat läpikuultaviksi ja puumaisiksi.

Gelatiinisauvakoe: nesteytymistä ja keltaisen saostuman muodostuminen.

Agar-vinoviljelmä: hidas, likaisen oranssinvärinen kasvu.

Käymisliemi: turbulentti keltainen liete, ei kalvoa.

Lakmus-maito: hidas koagulaatio, lakmus pelkistyy, reaktio neutraali.

Viljely kiinteässä väliaineessa (peruna): tumman oranssi, 3 58940 rehevä kasvu. Nitraattiliuoksessa ei kasvua, nitriittejä ei muodostu. Aerobinen, fakultatiivisesti anaerobinen. Optimi kasvulämpöti-la 30°C.

ATCC 4358 kykenee kehittämään isomeraasi-aktiviteettia vil-jeltäessä tätä kantaa elatusaineessa, joka sisältää ksyloosia ainoana hiilihydraattilähteenä, mutta ei kykene tuottamaan isomeraasia käytettäessä glukoosia tai laktoosia ainoana hiilihydraattilähteenä .

NRRL B-11,022 kykenee kehittämään oleellisen isomeraasiak-tiviteetin viljeltäessä tätä kantaa elatusaineessa, joka sisältää laktoosia ainoana hiilihydraattilähteenä, mutta kykenee kehittämään vain vähän aktiviteettia, kun glukoosi on ainoana hiilihydraatti-lähteenä.

NRRL B-11,023 kykenee kehittämään oleellisen isomeraasiak-tiviteetin viljeltäessä tätä kantaa elatusaineessa, joka sisältää joko glukoosia tai laktoosia ainoana hiilihydraattilähteenä.

Oleellinen isomeraasiaktiviteetti tarkoittaa aktiviteettia vähintään 500 mikroyksikköä yhtä viljelyliemimillilitraa kohden.

Tässä esitettyjä mikro-organismeja voidaan viljellä useissa eri väliaineissa, jotka sisältävät hiili- ja typpilähteitä sekä epäorgaanisia suoloja. Eräs tyypillinen väliaine sisältää hydrolysoitua eläinproteiinia, maissinliuotusnestettä, panimohiivauutetta, kaliumdivetyfosfaattia, kaliummonovetyfosfaattia ja sopivan hiilihydraatin. Käyttökelpoisia hiilihydraatteja ovat ksyloosi, glukoosi, maltoosi, sakkaroosi ja laktoosi sekä myös ksylaanin, tärkkelyksen ja selluloosan hydrolysaatit. Kasvuväliaineen alku-pH on noin 7 ja käyminen saatetaan tapahtumaan aerobisesti noin 30°C:ssa sopivassa käymislaitteessa tai ravistuspullossa. Suurin isomeraa-siaktiivisuus, saavutetaan yleensä noin 48-72 tunnissa.

Mikro-organismien tuottama isomeraasiaktiivisuus määritettiin inkuboimalla 60°C:ssa 30 minuuttia seosta, joka sisältää 0,5 ml entsyymiä sisältävää valmistetta ja 1,5 ml liuosta, joka sisältää riittävästi glukoosia, Tricine-puskuria (pH 8) ja magnesium-kloridia antamaan loppupitoisuudeksi vastaavasti 1,0M, 0,1M ja 0,03M. Inkubointijakson lopussa isamerointireaktio lopetetaan lisäämällä 0,5 ml 1,0N kloorivetyhappoa. Linkoamisen jälkeen sakan päällä oleva kirkas jae laimennetaan sopivasti ja muodostunut fruktoosi määritetään L. Messineo'n ja E. Musarra'n menetelmällä, kuten on 4 58940 kuvattu julkaisussa Int. J. Biochem. 3 (18), 691-699 (1972). Iso-meraasiaktiivisuus ilmaistaan mikroyksikköinä, jolloin aktiivisuuden yksi mikroyksikkö määritellään määräksi entsyymiä, joka tuottaa yhden mikrogramman fruktoosia minuutissa edellä kuvatuissa määritys-olosuhteissa.

Edullisten kantojen tuottaman isomeraasin määrän edullisissa viljelyolosuhteissa on havaittu olevan melko suuren ja merkittävästi suuremman kuin muilla tekniikan tunnettuun tasoon kuuluvilla isomeraasia tuottavilla mikro-organismeilla. Edullisten kantojen isomeraasituotanto vaihtelee huomattavasti riippuen käytetyistä viljelyolosuhteista. Erityisen yllättävä ja odottamaton tulos on, että maksimi-isomeraasituotantoon on havaittu päästävän käytettäessä laktoosia kasvuväliaineessa. Esimerkiksi NRRL B-ll,022:n viljely väliaineessa, joka sisältää 2 % laktoosia, antaa 2 892 mikroyk-sikköä isomeraasia ml:aa kohti käymislientä. Edullisille kannoille on edelleen ominaista ja ne eroavat aikaisemmin tunnetuista läheisistä kannoista siinä, että ne pystyvät tuottamaan suuria määriä (ts. 500 mikroyksikköä/ml lientä tai enemmän) isoraeraasiaktiivi-suutta yiljeltäessä niitä ravintovänaineessa, joka sisältää laktoosia ainoana hiilihydraattilähteenä. Hyvin suurta entsyymin tuotantoa tapahtuu myös, kun hiilihydraatteja ei ollenkaan lisätä väliaineeseen. Tämä osoitetaan taulukon 1 arvoilla, jotka perustuvat F. arborescens -kantojen viljelyyn 30°C:ssa väliaineessa, joka sisältää 1 % hydrolysoitua eläinproteiinia (Bacto-Tryptone, jota tuottaa Difco Laboratories Detroitissa, Michiganissa), 1 % maissin-liuotusnestettä, 1 % hiivauutetta, 1 % natriummonovetyfosfaattia, 0,5 % kaliumdivetyfosfaattia ja 2 % hiilihydraattia.

Taulukko 1 F. arborescens'in tuottama isomeraasi

Hiilihydraatti Isomeraasiaktiviteetti mikroyksikköinä/ml väliaineessa tuntia ATCC 4358 NRRL B-11,022 NRRL B-11,023 ei läsnä 72 0 1 042 1 480 ksyloosi 72 546 892 775 glukoosi 72 0 89 1 123 laktoosi 72 02 892 1 679 maltoosi 72 1 314 sakkaroosi 72 - 1 190 5 58940 F. abrorescens'ilia tuotetulla isomeraasilla on käyttökelpoinen aktiviteetti pH-alueella noin 6-10 ja noin 45-90°C:n lämpötilassa. Taulukko 2 osoittaa pH:n vaikutuksen ja taulukko 3 osoittaa lämpötilan vaikutuksen isomeraasiaktiviteettiin, joka liittyy ehjiin soluihin, jotka on saatu viljelemällä kantaa NRRL B-11,022 laktoosia sisältävässä ravintoliuoksessa 30°C:ssa 72 tuntia. Entsyymin pysyvyys on osoitettu taulukossa 4. Taulukossa 2 ja 3 esitettyjä arvoja varten pestiin talteenotetut solut kerran ja suspendoi-tiin uudelleen veteen alkuperäiseen solupitoisuuteen käymisliemes-sä. Edellä kuvattua standardimääritysmenetelmää käytettiin isome-raasiaktiviteetin mittaamiseen, paitsi että puskuria vaihdeltiin pH-tutkimuksessa ja lämpötilaa vaihdeltiin lämpötilan vaikutusko-keissa. Pysyvyystutkimus, joka on koottu taulukkoon 4, käsitti pestyjen solujen inkuboinnin 0,05M TRICINE-puskurissa (pH 8), joka sisältää magnesiumkloridia (0,004M) sekä inkuboitujen solujen määrittämisen määrätyin väliajoin käyttäen standardimääritysmenetelmää.

Taulukko 2 pH:n vaikutus NRRL B-ll,022:sta saatuun isomeraasiin

Puskuri pH Isomeraasiaktiviteetti mikro- yksikköinä/ml PIPES1 6,0 598 PIPES1 6,5 1 204 PIPES1 7,0 1 782 PIPES1 7,5 2 202 TRICINE2 7,5 2 624 TRICINE2 8,0 3 016 TRICINE2 8,5 3 456 TRICINE2 9,0 3 408 PIPES on mononatrium-1,4-piperatsiinidietaanisulfonihappo 2 TRICINE on N-/5-hydroksi-l,l-bis(hydroksimetyyli^-glysiini β 58940

Taulukko 3 Lämpötilan vaikutus kannasta NRRL B-11,022 saatuun isomeraa-siin pH 8,0:ssa Lämpötila °C:ssa Isomeraasiaktiviteetti mikroyksikköinä/ml 45 775 50 1 717 55 2 776 60 3 500 65 4 400 70 5 104 75 5 960 80 6 592 85 7 088

Taulukko 4

Kannasta NRRL B-11,022 saadun isomeraasin pysyvyys valituissa lämpötiloissa

Kokonaisin- Isomeraasiaktiviteetti mikroyksiköissä/ml kubointiaika 60°C:seen 70°C=seen un emä inkubointi inkubointi 24 2 212 2 340 96 2 276 2 244 158 2 276 2 036 240 2 262 2 092

Taulukon 4 arvoista ilmenee, että entsyymi on pääasiallisesti pysyvä ainakin 200 tuntia pH-arvossa 8 ja 60°C:ssa, kuten on määritetty analysoimalla entsyymin sisältäviä pestyjä soluja. Pestyjen solujen muodostamalle entsyymivalmisteelle on edelleen ominaista, että se säilyttää ainakin 85 % aktiviteetistaan, kun sitä kuumennetaan 200 tuntia 70°C:ssa ja pH-arvossa 8.

F. arborescens'in tuottama isomeraasi on hyvin tehokas glukoosin muuttamisessa fruktoosiksi ja useita erilaisia tunnettuja menetelmiä voidaan käyttää tällaisia konversioita varten. Esimerkiksi ehjiä soluja voidaan käyttää suoraan panoksittaisessa prosessissa, jossa entsyymivalmiste käsittää soluaineen, joka on peräisin mikro-organismista tai solut voidaan immobilisoida kiinteään patjaan jatkuvaa toimintaa varten. Vaihtoehtoisesti voidaan 7 58940 käyttää soluvapaata uutetta, jolloin isomeraasi vapautetaan soluista tunnetuin menetelmin ja käytetään liukoisena entsyyminä panok-sittaisessa järjestelmässä tai tehdään liikkumattomaksi käytettäväksi jatkuvassa prosessissa. Menetelmät entsyymien käyttämiseksi tällä tavalla ovat hyvin tunnettuja, kuten on osoitettu esimerkiksi W.R. Vieth’in ja K. Venkatasubramanian'in katsauksessa, joka on julkaistu CHEMTECH 3:ssa, 677-684 (1973) ja 4:ssä, 47-55, 309-320 ja 434-444 (1974).

Huolimatta muodosta, jossa isomeraasia käytetään glukoosi-isomerointia varten, tulee reaktio saattaa tapahtumaan lämpötilassa väliltä 45-90°C ja edullisesti noin 60-75°C:ssa. Glukoosia sisältävän liuoksen pH tulee pitää arvossa noin 6-10, edullisesti arvossa noin 6,5 - 8,0 hajoamistuotteiden muodostumisen vähentämiseksi korotetuissa lämpötiloissa. Entsyymi on tehokas suhteellisen puhtaiden glukoosiliuosten kanssa sekä myös tärkkelyshydrolysaat-tien kanssa, jotka on valmistettu happo- ja/tai entsyymikäsittelyl-lä. 30-60 paino-%:n glukoosipitoisuudet ovat edullisia konversio-vaihetta varten. Entsyymiaktiviteettia parannetaan lisäämällä pieniä määriä magnesiumioneja glukoosia sisältävään liuokseen. Fruktoosia sisältävä liuos, joka on saatu isomeroinnista, voidaan puhdistaa käyttäen tavanomaisia menetelmiä, kuten käsittelyä aktiivihiilellä ja ioninvaihtohartseilla.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksinnön käyttöä ja etuja edelleen.

Esimerkki 1 500 ml:n Erlenmeyer-pulloon pantiin 100 ml ravintoväliainet-ta, joka sisälsi seuraavaa: hydrolysoitua eläinproteiinia 1,0 % maissin liuotusnestettä 1,0 % hiivauutetta 1,0 % k2hpo4 1,0 % KH2P04 0,5 % laktoosia 2,0 %

Edellä esitetty väliaine ympättiin vastavalmistetulla F. arborescens NRRL B-ll,022:sta saadulla ympillä ja ympättyä väliainetta sekoitettiin 30°C:ssa käyttäen pyörivää ravistinta. 72 tunnin kuluttua solut otettiin talteen ja pestiin. Analyysi ilmai- 8 58940 si isomeraasiaktiviteettiekvivalentteja olevan läsnä 2 892 mikro-yksikköä yhtä ml kohti kokonaislientä.

Glukoosin isomerointi fruktoosiksi suoritettiin lisäämällä 10 g pestyjä ehjiä soluja, jotka oli saatu edellä esitetyllä tavalla, 500 ml:aan 50-%:ista (paino/tilavuus) glukoosisiirappia, joka oli 0,01M magnesiumkloridin suhteen. Siirapin pH säädettiin arvoon 8,0 natriumhydroksidin avulla ja siirappia inkuboitiin 60°C:ssa lievästi sekoittaen. 20 tunnin jälkeen siirappi analysoitiin fruktoosin suhteen ja havaittiin, että 45 % glukoosista oli muuttunut fruktoosiksi.

Esimerkki 2

Kantaa F. arborescens NRRL B-11,023 viljeltiin esimerkin 1 mukaisesti, paitsi että laktoosi korvattiin glukoosilla ravintoväli-aineessa. 64 tunnin päätyttyä talteenotetut solut analysoitiin ja havaittiin isomeraasiaktiviteettiekvivalentin olevan 580 mikro-yksikköä yhtä ml kohti kokonaislientä.

Glukoosin entsymaattinen konversio fruktoosiksi suoritettiin lisäämällä 9 g märkiä soluja, jotka oli saatu edellä esitetyllä tavalla, 500 mitään 50-%:ista (paino/tilavuus) glukoosiliuosta, joka oli 0,005M magnesiumkloridin suhteen. Siirapin pH säädettiin arvoon 8,0 natriumhydroksidin avulla ja liuosta inkuboitiin 60°C:ssa lievästi sekoittaen. Liuoksen analyysi 27 tunnin kuluttua antoi fruktoosipitoisuuöeksi 38 %.

Esimerkki 3 F. arborescens-kantaa NRRL B-11,022 viljeltiin 30°C:ssa 70 tuntia 10 l:n New Brunswick-käymislaitteessa käyttäen esimerkissä 1 kuvattua ravintoväliainetta. Solut otettiin talteen ja immobilisoi-tiin flokkulointimenetelmällä, joka on esitetty US-patentissa n:o 3 821 086, niin että saatiin kuiva, flokkuloitu soluaggregaatti, jonka isomeraasiaktiviteetti oli 75 mikroyksikköä/g. 2,54 cm:n läpimittaiseen lasipylvääseen, joka sisälsi 5 g kuivattua aggregaattia, käytettiin glukoosin jatkuvaan isomerointiin. Pylväs pidettiin 60°C:ssa ja 50-%:ista (paino/tilavuus) glukoosiliuosta, joka oli 0,005M magnesiumkloridin suhteen ja jonka pH oli säädetty arvoon 8,0-8,4, syötettiin pylvään läpi virtausnopeudella 26 ml/h. Pylväästä tuleva ulosvirtaus analysoitiin fruktoosin suhteen ja glukoosin konversioasteen fruktoosiksi havaittiin olevan noin 45 %.