FI117674B - Polypeptidit, jotka liittyvät streptogramiinien biosynteesiin, näitä polypeptidejä koodittavat nukleotidisekvenssit, ja niiden käyttö - Google Patents
Polypeptidit, jotka liittyvät streptogramiinien biosynteesiin, näitä polypeptidejä koodittavat nukleotidisekvenssit, ja niiden käyttö Download PDFInfo
- Publication number
- FI117674B FI117674B FI951403A FI951403A FI117674B FI 117674 B FI117674 B FI 117674B FI 951403 A FI951403 A FI 951403A FI 951403 A FI951403 A FI 951403A FI 117674 B FI117674 B FI 117674B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- sequence
- gene
- fragment
- streptogramins
- pristinamycin
- Prior art date
Links
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 134
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 72
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 32
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 30
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title description 7
- 108010034396 Streptogramins Proteins 0.000 claims abstract description 108
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 47
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 401
- 229940041030 streptogramins Drugs 0.000 claims description 70
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 48
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 38
- 101100421754 Streptomyces pristinaespiralis snaA gene Proteins 0.000 claims description 37
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 36
- 101100041837 Bacillus subtilis (strain 168) scmL gene Proteins 0.000 claims description 30
- 101100421759 Streptomyces pristinaespiralis snaB gene Proteins 0.000 claims description 30
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 30
- XUHVCHNJCBBXMP-UHFFFAOYSA-M sodium;10-[(2-hydroxybenzoyl)amino]decanoate Chemical compound [Na+].OC1=CC=CC=C1C(=O)NCCCCCCCCCC([O-])=O XUHVCHNJCBBXMP-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 30
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 27
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 claims description 25
- 241001442654 Percnon planissimum Species 0.000 claims description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 20
- 101100242772 Streptomyces pristinaespiralis papM gene Proteins 0.000 claims description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 18
- 101100421760 Streptomyces pristinaespiralis snaC gene Proteins 0.000 claims description 13
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 12
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 11
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 3
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 claims 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 291
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 141
- DAIKHDNSXMZDCU-OUDXUNEISA-N pristinamycin-IIA Natural products CC(C)[C@H]1OC(=O)C2=CCCN2C(=O)c3coc(CC(=O)C[C@H](O)C=C(C)C=CCNC(=O)C=C[C@@H]1C)n3 DAIKHDNSXMZDCU-OUDXUNEISA-N 0.000 description 139
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 138
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 137
- JOOMGSFOCRDAHL-XKCHLWDXSA-N pristinamycin-IIB Natural products CC(C)[C@@H]1OC(=O)[C@H]2CCCN2C(=O)c3coc(CC(=O)C[C@@H](O)C=C(C)C=CCNC(=O)C=C[C@H]1C)n3 JOOMGSFOCRDAHL-XKCHLWDXSA-N 0.000 description 136
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 131
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 123
- YVMBAUWDIGJRNY-BESUKNQGSA-N 4o8o7q7iu4 Chemical compound C1C(=O)C[C@H](O)\C=C(/C)\C=C\CNC(=O)\C=C\[C@@H](C)[C@@H](C(C)C)OC(=O)C2=CCCN2C(=O)C2=COC1=N2.N([C@@H]1C(=O)N[C@@H](C(N2CCC[C@H]2C(=O)N(C)[C@@H](CC=2C=CC(=CC=2)N(C)C)C(=O)N2CCC(=O)C[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@@H]1C)C=1C=CC=CC=1)=O)CC)C(=O)C1=NC=CC=C1O YVMBAUWDIGJRNY-BESUKNQGSA-N 0.000 description 120
- 108010079780 Pristinamycin Proteins 0.000 description 118
- RLNUPSVMIYRZSM-UHFFFAOYSA-N Pristinamycin Natural products CC1OC(=O)C(C=2C=CC=CC=2)NC(=O)C2CC(=O)CCN2C(=O)C(CC=2C=CC(=CC=2)N(C)C)CCN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(CC)NC(=O)C1NC(=O)C1=NC=CC=C1O RLNUPSVMIYRZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 118
- 229960003961 pristinamycin Drugs 0.000 description 118
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 94
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 77
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 77
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 77
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 59
- BRARRAHGNDUELT-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypicolinic acid Chemical compound OC(=O)C1=NC=CC=C1O BRARRAHGNDUELT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 56
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 54
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 51
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 51
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N Ala-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 50
- 241001518258 Streptomyces pristinaespiralis Species 0.000 description 50
- 239000000047 product Substances 0.000 description 46
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 42
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 42
- 108010015791 Streptogramin A Proteins 0.000 description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 33
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 32
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 32
- 101100183669 Drosophila melanogaster Sam-S gene Proteins 0.000 description 31
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 31
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 108010015795 Streptogramin B Proteins 0.000 description 29
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 29
- 101150070717 papA gene Proteins 0.000 description 29
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 28
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 27
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 26
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 26
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 24
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 23
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 23
- YGXCETJZBDTKRY-DZCVGBHJSA-N pristinamycin IA Chemical compound N([C@@H]1C(=O)N[C@@H](C(N2CCC[C@H]2C(=O)N(C)[C@@H](CC=2C=CC(=CC=2)N(C)C)C(=O)N2CCC(=O)C[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@@H]1C)C=1C=CC=CC=1)=O)CC)C(=O)C1=NC=CC=C1O YGXCETJZBDTKRY-DZCVGBHJSA-N 0.000 description 23
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 22
- 239000007989 BIS-Tris Propane buffer Substances 0.000 description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 22
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 22
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 108010063905 Ampligase Proteins 0.000 description 21
- YGXCETJZBDTKRY-UHFFFAOYSA-N Pristinamycin Component I A Natural products CC1OC(=O)C(C=2C=CC=CC=2)NC(=O)C2CC(=O)CCN2C(=O)C(CC=2C=CC(=CC=2)N(C)C)N(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(CC)NC(=O)C1NC(=O)C1=NC=CC=C1O YGXCETJZBDTKRY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 21
- DAIKHDNSXMZDCU-FQTGFAPKSA-N pristinamycin IIA Chemical compound C1C(=O)C[C@H](O)\C=C(/C)\C=C\CNC(=O)\C=C\[C@@H](C)[C@@H](C(C)C)OC(=O)C2=CCCN2C(=O)C2=COC1=N2 DAIKHDNSXMZDCU-FQTGFAPKSA-N 0.000 description 21
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 21
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 20
- 108010014531 FMN Reductase Proteins 0.000 description 20
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 20
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 20
- DAIKHDNSXMZDCU-UHFFFAOYSA-N pristinamycin component IIA Natural products C1C(=O)CC(O)C=C(C)C=CCNC(=O)C=CC(C)C(C(C)C)OC(=O)C2=CCCN2C(=O)C2=COC1=N2 DAIKHDNSXMZDCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- CMUHFUGDYMFHEI-QMMMGPOBSA-N 4-amino-L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N)C=C1 CMUHFUGDYMFHEI-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 19
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 19
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 description 18
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 18
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 18
- USEYFCOAPFGKLX-JTQLQIEISA-N 4-Dimethylamino-L-phenylalanine Chemical group CN(C)C1=CC=C(C[C@H](N)C(O)=O)C=C1 USEYFCOAPFGKLX-JTQLQIEISA-N 0.000 description 17
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 17
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 16
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 16
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 108010093101 pristinamycin IIA synthase Proteins 0.000 description 16
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 15
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 15
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 15
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 15
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 15
- 101100084009 Pediococcus acidilactici pedA gene Proteins 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 14
- FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N flavin mononucleotide Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000011768 flavin mononucleotide Substances 0.000 description 14
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 14
- 235000019231 riboflavin-5'-phosphate Nutrition 0.000 description 14
- 101150056558 snaA gene Proteins 0.000 description 14
- 101100057358 Escherichia coli (strain K12) atpA gene Proteins 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 101150070197 F7-2 gene Proteins 0.000 description 13
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 13
- 101100226151 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) estA gene Proteins 0.000 description 13
- 101100185373 Streptococcus pneumoniae psaA gene Proteins 0.000 description 13
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 13
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 13
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 13
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 13
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 13
- FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N flavin mononucleotide Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 13
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 13
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 13
- 102100028929 Formin-1 Human genes 0.000 description 12
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 12
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 101001135788 Pinus taeda (+)-alpha-pinene synthase, chloroplastic Proteins 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 229950006790 adenosine phosphate Drugs 0.000 description 12
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 12
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 12
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 12
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 12
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 12
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 11
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 11
- 238000001853 pulsed-field electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N AEBSF hydrochloride Chemical compound Cl.NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 10
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 10
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 10
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 10
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 10
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 10
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 10
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 10
- 101000617808 Homo sapiens Synphilin-1 Proteins 0.000 description 9
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N Norphytane Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 9
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 9
- 102100021997 Synphilin-1 Human genes 0.000 description 9
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 9
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 229940048084 pyrophosphate Drugs 0.000 description 9
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 8
- HHGYNJRJIINWAK-FXQIFTODSA-N Ala-Ala-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HHGYNJRJIINWAK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N Gly-Arg-Pro Natural products NCC(=O)NC(CCNC(=N)N)C(=O)N1CCCC1C(=O)O KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 8
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 8
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 8
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 8
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 8
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 8
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 7
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 7
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 7
- NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N Thiostrepton B Natural products N1C(=O)C(C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(C(C)CC)NC(C(C2=N3)O)C=CC2=C(C(C)O)C=C3C(=O)OC(C)C(C=2SC=C(N=2)C2N=3)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C(C(C)(O)C(C)O)NC(=O)C(N=4)CSC=4C(=CC)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C21CCC=3C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical group CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 7
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- -1 pigments (for review Natural products 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 229930188070 thiostrepton Natural products 0.000 description 7
- NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N thiostrepton Chemical compound C([C@]12C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C(=O)NC(/C=3SC[C@@H](N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)[C@H]1N=1)[C@@H](C)OC(=O)C3=CC(=C4C=C[C@H]([C@@H](C4=N3)O)N[C@H](C(N[C@@H](C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)=O)[C@@H](C)CC)[C@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)=C\C)[C@@H](C)O)CC=1C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N 0.000 description 7
- 229940063214 thiostrepton Drugs 0.000 description 7
- NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N thiostrepton A Natural products CC[C@H](C)[C@@H]1N[C@@H]2C=Cc3c(cc(nc3[C@H]2O)C(=O)O[C@H](C)[C@@H]4NC(=O)c5csc(n5)[C@@H](NC(=O)[C@H]6CSC(=N6)C(=CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)c7csc(n7)[C@]8(CCC(=N[C@@H]8c9csc4n9)c%10nc(cs%10)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(=O)N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC1=O)[C@@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)[C@H](C)O NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N 0.000 description 6
- OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 6
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 6
- 241001625939 Pristina Species 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 6
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 108010041407 alanylaspartic acid Proteins 0.000 description 6
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 6
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 101150102934 papM gene Proteins 0.000 description 6
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 6
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 6
- 101150065698 snaC gene Proteins 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- XWDFHSRKLQGCDB-VIFPVBQESA-N 4-methylamino-L-phenylalanine zwitterion Chemical compound CNC1=CC=C(C[C@H](N)C(O)=O)C=C1 XWDFHSRKLQGCDB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 5
- 241000228431 Acremonium chrysogenum Species 0.000 description 5
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 5
- YTNIXZGTHTVJBW-SCRDCRAPSA-L FMNH2(2-) Chemical compound [O-]P(=O)([O-])OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2NC2=C1NC(=O)NC2=O YTNIXZGTHTVJBW-SCRDCRAPSA-L 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical class CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 5
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 5
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 5
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 5
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 5
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 5
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 5
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 5
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 5
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N carbonyl sulfide Chemical compound O=C=S JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 5
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 5
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 5
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 5
- 108010092114 histidylphenylalanine Proteins 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 5
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 5
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 5
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 5
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 5
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 5
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PBAMJJXWDQXOJA-FXQIFTODSA-N Ala-Asp-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PBAMJJXWDQXOJA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- KIUYPHAMDKDICO-WHFBIAKZSA-N Ala-Asp-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O KIUYPHAMDKDICO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N Ala-Leu-Thr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 4
- OEVCHROQUIVQFZ-YTLHQDLWSA-N Ala-Thr-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OEVCHROQUIVQFZ-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-SCSAIBSYSA-N D-Proline Chemical compound OC(=O)[C@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 4
- 229930182820 D-proline Natural products 0.000 description 4
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 4
- IBMVEYRWAWIOTN-UHFFFAOYSA-N L-Leucyl-L-Arginyl-L-Proline Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCCC1C(O)=O IBMVEYRWAWIOTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 4
- ZDSNOSQHMJBRQN-SRVKXCTJSA-N Leu-Asp-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N ZDSNOSQHMJBRQN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- WMIOEVKKYIMVKI-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WMIOEVKKYIMVKI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000056222 Peptide Synthases Human genes 0.000 description 4
- 108700018928 Peptide Synthases Proteins 0.000 description 4
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 108010045350 alanyl-tyrosyl-alanine Proteins 0.000 description 4
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 4
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 4
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 4
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 4
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 108010082286 glycyl-seryl-alanine Proteins 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 4
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 4
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 4
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 4
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 4
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- WTFXTQVDAKGDEY-UHFFFAOYSA-N (-)-chorismic acid Natural products OC1C=CC(C(O)=O)=CC1OC(=C)C(O)=O WTFXTQVDAKGDEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LXCUAFVVTHZALS-UHFFFAOYSA-N 3-(3-methoxyphenyl)piperidine Chemical compound COC1=CC=CC(C2CNCCC2)=C1 LXCUAFVVTHZALS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 3
- PCIFXPRIFWKWLK-YUMQZZPRSA-N Ala-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N PCIFXPRIFWKWLK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- NBTGEURICRTMGL-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NBTGEURICRTMGL-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- VUGWHBXPMAHEGZ-SRVKXCTJSA-N Arg-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N VUGWHBXPMAHEGZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- NAPNAGZWHQHZLG-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asp-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N NAPNAGZWHQHZLG-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- ZUNMTUPRQMWMHX-LSJOCFKGSA-N Asp-Val-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ZUNMTUPRQMWMHX-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 3
- 241000193764 Brevibacillus brevis Species 0.000 description 3
- WTFXTQVDAKGDEY-HTQZYQBOSA-N Chorismic acid Natural products O[C@@H]1C=CC(C(O)=O)=C[C@H]1OC(=C)C(O)=O WTFXTQVDAKGDEY-HTQZYQBOSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- PYTZFYUXZZHOAD-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN PYTZFYUXZZHOAD-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- VXKCPBPQEKKERH-IUCAKERBSA-N Gly-Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VXKCPBPQEKKERH-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- GAFKBWKVXNERFA-QWRGUYRKSA-N Gly-Phe-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 GAFKBWKVXNERFA-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- 108010001483 Glycogen Synthase Proteins 0.000 description 3
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N L-alanine-L-arginine Natural products CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- LJHGALIOHLRRQN-DCAQKATOSA-N Leu-Ala-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N LJHGALIOHLRRQN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N Leu-Ala-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- IBMVEYRWAWIOTN-RWMBFGLXSA-N Leu-Arg-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(O)=O IBMVEYRWAWIOTN-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 3
- STAVRDQLZOTNKJ-RHYQMDGZSA-N Leu-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O STAVRDQLZOTNKJ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 3
- HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- POZULHZYLPGXMR-ONGXEEELSA-N Leu-Gly-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O POZULHZYLPGXMR-ONGXEEELSA-N 0.000 description 3
- SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N Leu-Ser-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)N1CCCC1C(O)=O SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710167853 N-methyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- GMWNQSGWWGKTSF-LFSVMHDDSA-N Phe-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GMWNQSGWWGKTSF-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 3
- LNLNHXIQPGKRJQ-SRVKXCTJSA-N Pro-Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 LNLNHXIQPGKRJQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 3
- 241000218589 Streptomyces olivaceus Species 0.000 description 3
- BSNZTJXVDOINSR-JXUBOQSCSA-N Thr-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BSNZTJXVDOINSR-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 3
- LVHHEVGYAZGXDE-KDXUFGMBSA-N Thr-Ala-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O LVHHEVGYAZGXDE-KDXUFGMBSA-N 0.000 description 3
- BVOVIGCHYNFJBZ-JXUBOQSCSA-N Thr-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BVOVIGCHYNFJBZ-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 3
- YRJOLUDFVAUXLI-GSSVUCPTSA-N Thr-Thr-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O YRJOLUDFVAUXLI-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 3
- BBPCSGKKPJUYRB-UVOCVTCTSA-N Thr-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BBPCSGKKPJUYRB-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 3
- DNOOLPROHJWCSQ-RCWTZXSCSA-N Val-Arg-Thr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DNOOLPROHJWCSQ-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 3
- JVGDAEKKZKKZFO-RCWTZXSCSA-N Val-Val-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O JVGDAEKKZKKZFO-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004188 Virginiamycin Substances 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 108010024078 alanyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 3
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 3
- 108010001271 arginyl-glutamyl-arginine Proteins 0.000 description 3
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- PCOXSOQWQVRJCH-RIECGXCRSA-N efepristin Chemical compound N([C@@H]1C(=O)N[C@@H](C(N2CCC[C@H]2C(=O)N(C)[C@@H](CC=2C=CC(NC)=CC=2)C(=O)N2CCC(=O)C[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@@H]1C)C=1C=CC=CC=1)=O)CC)C(=O)C1=NC=CC=C1O PCOXSOQWQVRJCH-RIECGXCRSA-N 0.000 description 3
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 108010066198 glycyl-leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 3
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- HXEACLLIILLPRG-RXMQYKEDSA-N l-pipecolic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCCCN1 HXEACLLIILLPRG-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 3
- 150000002678 macrocyclic compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 108010079317 prolyl-tyrosine Proteins 0.000 description 3
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- PCOXSOQWQVRJCH-UHFFFAOYSA-N vernamycin-Bbeta Natural products CC1OC(=O)C(C=2C=CC=CC=2)NC(=O)C2CC(=O)CCN2C(=O)C(CC=2C=CC(NC)=CC=2)N(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(CC)NC(=O)C1NC(=O)C1=NC=CC=C1O PCOXSOQWQVRJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000019373 virginiamycin Nutrition 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SATIISJKSAELDC-ZIOPZPSVSA-N 3-hydroxy-N-[(3R,6S,7R,10S,13S,16S,22R,24R)-24-hydroxy-7,11,13,17,20-pentamethyl-16-[(2S)-3-methylbutan-2-yl]-3-(2-methylpropyl)-2,5,9,12,15,18,21-heptaoxo-10-phenyl-8-oxa-1,4,11,14,17,20-hexazabicyclo[20.3.0]pentacosan-6-yl]pyridine-2-carboxamide Chemical compound CC(C)C[C@H]1NC(=O)[C@@H](NC(=O)c2ncccc2O)[C@@H](C)OC(=O)[C@@H](N(C)C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@H]2C[C@@H](O)CN2C1=O)c1ccccc1 SATIISJKSAELDC-ZIOPZPSVSA-N 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UAISREBYDOFHJY-UHFFFAOYSA-N 4-oxopiperidin-1-ium-2-carboxylate Chemical compound OC(=O)C1CC(=O)CCN1 UAISREBYDOFHJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000187712 Actinoplanes sp. Species 0.000 description 2
- YLTKNGYYPIWKHZ-ACZMJKKPSA-N Ala-Ala-Glu Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O YLTKNGYYPIWKHZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N Ala-Ala-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- CXRCVCURMBFFOL-FXQIFTODSA-N Ala-Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O CXRCVCURMBFFOL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- UGLPMYSCWHTZQU-AUTRQRHGSA-N Ala-Ala-Tyr Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UGLPMYSCWHTZQU-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 2
- ODWSTKXGQGYHSH-FXQIFTODSA-N Ala-Arg-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ODWSTKXGQGYHSH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N Ala-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CCCN=C(N)N JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- KVWLTGNCJYDJET-LSJOCFKGSA-N Ala-Arg-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N KVWLTGNCJYDJET-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 2
- UCIYCBSJBQGDGM-LPEHRKFASA-N Ala-Arg-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N UCIYCBSJBQGDGM-LPEHRKFASA-N 0.000 description 2
- NHCPCLJZRSIDHS-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NHCPCLJZRSIDHS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- YSMPVONNIWLJML-FXQIFTODSA-N Ala-Asp-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O YSMPVONNIWLJML-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- HXNNRBHASOSVPG-GUBZILKMSA-N Ala-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HXNNRBHASOSVPG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- BEMGNWZECGIJOI-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BEMGNWZECGIJOI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- VGPWRRFOPXVGOH-BYPYZUCNSA-N Ala-Gly-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VGPWRRFOPXVGOH-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- YHKANGMVQWRMAP-DCAQKATOSA-N Ala-Leu-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YHKANGMVQWRMAP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N Ala-Leu-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- DEWWPUNXRNGMQN-LPEHRKFASA-N Ala-Met-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N DEWWPUNXRNGMQN-LPEHRKFASA-N 0.000 description 2
- 108010011667 Ala-Phe-Ala Proteins 0.000 description 2
- IORKCNUBHNIMKY-CIUDSAMLSA-N Ala-Pro-Glu Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IORKCNUBHNIMKY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N Ala-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 2
- AETQNIIFKCMVHP-UVBJJODRSA-N Ala-Trp-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AETQNIIFKCMVHP-UVBJJODRSA-N 0.000 description 2
- VHAQSYHSDKERBS-XPUUQOCRSA-N Ala-Val-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O VHAQSYHSDKERBS-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- OMSKGWFGWCQFBD-KZVJFYERSA-N Ala-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OMSKGWFGWCQFBD-KZVJFYERSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SGYSTDWPNPKJPP-GUBZILKMSA-N Arg-Ala-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SGYSTDWPNPKJPP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N Arg-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- YSUVMPICYVWRBX-VEVYYDQMSA-N Arg-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O YSUVMPICYVWRBX-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 2
- GDVDRMUYICMNFJ-CIUDSAMLSA-N Arg-Cys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GDVDRMUYICMNFJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- QAODJPUKWNNNRP-DCAQKATOSA-N Arg-Glu-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O QAODJPUKWNNNRP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- OQCWXQJLCDPRHV-UWVGGRQHSA-N Arg-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OQCWXQJLCDPRHV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- YCYXHLZRUSJITQ-SRVKXCTJSA-N Arg-Pro-Pro Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 YCYXHLZRUSJITQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- AWMAZIIEFPFHCP-RCWTZXSCSA-N Arg-Pro-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O AWMAZIIEFPFHCP-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 2
- UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N Arg-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 2
- YUOXLJYVSZYPBJ-CIUDSAMLSA-N Asn-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O YUOXLJYVSZYPBJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- CBWCQCANJSGUOH-ZKWXMUAHSA-N Asn-Val-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CBWCQCANJSGUOH-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- OERMIMJQPQUIPK-FXQIFTODSA-N Asp-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OERMIMJQPQUIPK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- FAEIQWHBRBWUBN-FXQIFTODSA-N Asp-Arg-Ser Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)CN=C(N)N FAEIQWHBRBWUBN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- WCFCYFDBMNFSPA-ACZMJKKPSA-N Asp-Asp-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O WCFCYFDBMNFSPA-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- SBHUBSDEZQFJHJ-CIUDSAMLSA-N Asp-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O SBHUBSDEZQFJHJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- UJGRZQYSNYTCAX-SRVKXCTJSA-N Asp-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O UJGRZQYSNYTCAX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- DINOVZWPTMGSRF-QXEWZRGKSA-N Asp-Pro-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O DINOVZWPTMGSRF-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 2
- MNQMTYSEKZHIDF-GCJQMDKQSA-N Asp-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O MNQMTYSEKZHIDF-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 2
- 101100065878 Caenorhabditis elegans sec-10 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 101100533749 Danio rerio snap25a gene Proteins 0.000 description 2
- 101100533751 Danio rerio snap25b gene Proteins 0.000 description 2
- 101100310525 Drosophila melanogaster alphaSnap gene Proteins 0.000 description 2
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 2
- 101100176848 Escherichia phage N15 gene 15 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- MPZWMIIOPAPAKE-BQBZGAKWSA-N Glu-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N MPZWMIIOPAPAKE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- CGOHAEBMDSEKFB-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CGOHAEBMDSEKFB-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- FBEJIDRSQCGFJI-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FBEJIDRSQCGFJI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- SYWCGQOIIARSIX-SRVKXCTJSA-N Glu-Pro-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SYWCGQOIIARSIX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N Gly-Ala-Gly Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC([O-])=O UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- CLODWIOAKCSBAN-BQBZGAKWSA-N Gly-Arg-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CLODWIOAKCSBAN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- JPXNYFOHTHSREU-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)CN JPXNYFOHTHSREU-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- TZOVVRJYUDETQG-RCOVLWMOSA-N Gly-Asp-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CN TZOVVRJYUDETQG-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 2
- OLPPXYMMIARYAL-QMMMGPOBSA-N Gly-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN OLPPXYMMIARYAL-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- TVUWMSBGMVAHSJ-KBPBESRZSA-N Gly-Leu-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 TVUWMSBGMVAHSJ-KBPBESRZSA-N 0.000 description 2
- YHYDTTUSJXGTQK-UWVGGRQHSA-N Gly-Met-Leu Chemical compound CSCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YHYDTTUSJXGTQK-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N Gly-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 2
- WNZOCXUOGVYYBJ-CDMKHQONSA-N Gly-Phe-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)CN)O WNZOCXUOGVYYBJ-CDMKHQONSA-N 0.000 description 2
- HFPVRZWORNJRRC-UWVGGRQHSA-N Gly-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN HFPVRZWORNJRRC-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- BMWFDYIYBAFROD-WPRPVWTQSA-N Gly-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN BMWFDYIYBAFROD-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 2
- JQFILXICXLDTRR-FBCQKBJTSA-N Gly-Thr-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCC(O)=O JQFILXICXLDTRR-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 2
- DNVDEMWIYLVIQU-RCOVLWMOSA-N Gly-Val-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O DNVDEMWIYLVIQU-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SYMSVYVUSPSAAO-IHRRRGAJSA-N His-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SYMSVYVUSPSAAO-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- PYNUBZSXKQKAHL-UWVGGRQHSA-N His-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O PYNUBZSXKQKAHL-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- OQDLKDUVMTUPPG-AVGNSLFASA-N His-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OQDLKDUVMTUPPG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- BRQKGRLDDDQWQJ-MBLNEYKQSA-N His-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BRQKGRLDDDQWQJ-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 2
- 101710128038 Hyaluronan synthase Proteins 0.000 description 2
- QWCKQJZIFLGMSD-VKHMYHEASA-N L-alpha-aminobutyric acid Chemical compound CC[C@H](N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N L-isoleucyl-L-alanine Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N L-leucyl-L-phenylalanine Natural products CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- HXEACLLIILLPRG-YFKPBYRVSA-N L-pipecolic acid Chemical group [O-]C(=O)[C@@H]1CCCC[NH2+]1 HXEACLLIILLPRG-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ZRLUISBDKUWAIZ-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O ZRLUISBDKUWAIZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- PBCHMHROGNUXMK-DLOVCJGASA-N Leu-Ala-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 PBCHMHROGNUXMK-DLOVCJGASA-N 0.000 description 2
- WSGXUIQTEZDVHJ-GARJFASQSA-N Leu-Ala-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(O)=O WSGXUIQTEZDVHJ-GARJFASQSA-N 0.000 description 2
- XBBKIIGCUMBKCO-JXUBOQSCSA-N Leu-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XBBKIIGCUMBKCO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 2
- BPANDPNDMJHFEV-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BPANDPNDMJHFEV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- QPXBPQUGXHURGP-UWVGGRQHSA-N Leu-Gly-Met Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N QPXBPQUGXHURGP-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- HYMLKESRWLZDBR-WEDXCCLWSA-N Leu-Gly-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HYMLKESRWLZDBR-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 2
- DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N Leu-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- IEWBEPKLKUXQBU-VOAKCMCISA-N Leu-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O IEWBEPKLKUXQBU-VOAKCMCISA-N 0.000 description 2
- FLNPJLDPGMLWAU-UWVGGRQHSA-N Leu-Met-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C FLNPJLDPGMLWAU-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- JDBQSGMJBMPNFT-AVGNSLFASA-N Leu-Pro-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O JDBQSGMJBMPNFT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- RGUXWMDNCPMQFB-YUMQZZPRSA-N Leu-Ser-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O RGUXWMDNCPMQFB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- SBANPBVRHYIMRR-GARJFASQSA-N Leu-Ser-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N SBANPBVRHYIMRR-GARJFASQSA-N 0.000 description 2
- ZJZNLRVCZWUONM-JXUBOQSCSA-N Leu-Thr-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZJZNLRVCZWUONM-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 2
- VDIARPPNADFEAV-WEDXCCLWSA-N Leu-Thr-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O VDIARPPNADFEAV-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 2
- RNYLNYTYMXACRI-VFAJRCTISA-N Leu-Thr-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O RNYLNYTYMXACRI-VFAJRCTISA-N 0.000 description 2
- FBNPMTNBFFAMMH-AVGNSLFASA-N Leu-Val-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N FBNPMTNBFFAMMH-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N Leu-Val-Arg Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- FZIJIFCXUCZHOL-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN FZIJIFCXUCZHOL-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- XFIHDSBIPWEYJJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN XFIHDSBIPWEYJJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- GMMLGMFBYCFCCX-KZVJFYERSA-N Met-Thr-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GMMLGMFBYCFCCX-KZVJFYERSA-N 0.000 description 2
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010065395 Neuropep-1 Proteins 0.000 description 2
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- FRPVPGRXUKFEQE-YDHLFZDLSA-N Phe-Asp-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O FRPVPGRXUKFEQE-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 2
- QARPMYDMYVLFMW-KKUMJFAQSA-N Phe-Pro-Glu Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 QARPMYDMYVLFMW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- APKRGYLBSCWJJP-FXQIFTODSA-N Pro-Ala-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O APKRGYLBSCWJJP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- CGBYDGAJHSOGFQ-LPEHRKFASA-N Pro-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 CGBYDGAJHSOGFQ-LPEHRKFASA-N 0.000 description 2
- OOLOTUZJUBOMAX-GUBZILKMSA-N Pro-Ala-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OOLOTUZJUBOMAX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- DMKWYMWNEKIPFC-IUCAKERBSA-N Pro-Gly-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O DMKWYMWNEKIPFC-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- FMLRRBDLBJLJIK-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FMLRRBDLBJLJIK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- XYSXOCIWCPFOCG-IHRRRGAJSA-N Pro-Leu-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XYSXOCIWCPFOCG-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- SUENWIFTSTWUKD-AVGNSLFASA-N Pro-Leu-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O SUENWIFTSTWUKD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- SNGZLPOXVRTNMB-LPEHRKFASA-N Pro-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O SNGZLPOXVRTNMB-LPEHRKFASA-N 0.000 description 2
- 101100366070 Rattus norvegicus Napa gene Proteins 0.000 description 2
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- HRNQLKCLPVKZNE-CIUDSAMLSA-N Ser-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HRNQLKCLPVKZNE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- NLQUOHDCLSFABG-GUBZILKMSA-N Ser-Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O NLQUOHDCLSFABG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241001415395 Spea Species 0.000 description 2
- 241000187391 Streptomyces hygroscopicus Species 0.000 description 2
- 241000970910 Streptomyces ostreogriseus Species 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 2
- IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N Thr-Ala-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 2
- TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N Thr-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 2
- BNGDYRRHRGOPHX-IFFSRLJSSA-N Thr-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)C(O)=O BNGDYRRHRGOPHX-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 2
- KCRQEJSKXAIULJ-FJXKBIBVSA-N Thr-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O KCRQEJSKXAIULJ-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 2
- UJQVSMNQMQHVRY-KZVJFYERSA-N Thr-Met-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UJQVSMNQMQHVRY-KZVJFYERSA-N 0.000 description 2
- XKWABWFMQXMUMT-HJGDQZAQSA-N Thr-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XKWABWFMQXMUMT-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N Thr-Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N 0.000 description 2
- BKVICMPZWRNWOC-RHYQMDGZSA-N Thr-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O BKVICMPZWRNWOC-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- 108010064997 VPY tripeptide Proteins 0.000 description 2
- DDRBQONWVBDQOY-GUBZILKMSA-N Val-Ala-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O DDRBQONWVBDQOY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- VDPRBUOZLIFUIM-GUBZILKMSA-N Val-Arg-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)N VDPRBUOZLIFUIM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N Val-Leu-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- MJOUSKQHAIARKI-JYJNAYRXSA-N Val-Phe-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MJOUSKQHAIARKI-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- XBJKAZATRJBDCU-GUBZILKMSA-N Val-Pro-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XBJKAZATRJBDCU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- SSYBNWFXCFNRFN-GUBZILKMSA-N Val-Pro-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SSYBNWFXCFNRFN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- CEKSLIVSNNGOKH-KZVJFYERSA-N Val-Thr-Ala Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O CEKSLIVSNNGOKH-KZVJFYERSA-N 0.000 description 2
- YQYFYUSYEDNLSD-YEPSODPASA-N Val-Thr-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O YQYFYUSYEDNLSD-YEPSODPASA-N 0.000 description 2
- GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N Val-Tyr-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)NCC(O)=O GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 2
- NLNCNKIVJPEFBC-DLOVCJGASA-N Val-Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NLNCNKIVJPEFBC-DLOVCJGASA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 229960001570 ademetionine Drugs 0.000 description 2
- 108010076324 alanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N anthranilic acid Chemical compound NC1=CC=CC=C1C(O)=O RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010091092 arginyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010043240 arginyl-leucyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010029539 arginyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N bis-tris propane Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCNC(CO)(CO)CO HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- SATIISJKSAELDC-UHFFFAOYSA-N etamycin Chemical compound CC1OC(=O)C(C=2C=CC=CC=2)N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(C(C)C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CC(O)CN2C(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=NC=CC=C1O SATIISJKSAELDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940013640 flavin mononucleotide Drugs 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010000434 glycyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 108010040030 histidinoalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 2
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 description 2
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- XMKLKZFSQXZUQU-UHFFFAOYSA-N neoviridogrisein-II Natural products CC1OC(=O)C(C=2C=CC=CC=2)N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(C(C)C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=NC=CC=C1O XMKLKZFSQXZUQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 2
- 108010024607 phenylalanylalanine Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- SIOXPEMLGUPBBT-UHFFFAOYSA-N picolinic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=N1 SIOXPEMLGUPBBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HXEACLLIILLPRG-UHFFFAOYSA-N pipecolic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCCN1 HXEACLLIILLPRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 2
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 2
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 2
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 2
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 2
- 101150003367 snaB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150080510 snap25 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- REFMEZARFCPESH-UHFFFAOYSA-M sodium;heptane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].CCCCCCCS([O-])(=O)=O REFMEZARFCPESH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 2
- 108010017949 tyrosyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GJLXVWOMRRWCIB-MERZOTPQSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-acetamido-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanamide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)C1=CC=C(O)C=C1 GJLXVWOMRRWCIB-MERZOTPQSA-N 0.000 description 1
- LTLYEAJONXGNFG-HBNTYKKESA-N (2r,3r)-3-[[(2s)-1-[4-(diaminomethylideneamino)butylamino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]oxirane-2-carboxylic acid Chemical compound NC(N)=NCCCCNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1O[C@H]1C(O)=O LTLYEAJONXGNFG-HBNTYKKESA-N 0.000 description 1
- XVZCXCTYGHPNEM-IHRRRGAJSA-N (2s)-1-[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- BRPMXFSTKXXNHF-IUCAKERBSA-N (2s)-1-[2-[[(2s)-pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H]1NCCC1 BRPMXFSTKXXNHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- PRCJKXVZYMWNID-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-[4-(dimethylamino)anilino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC1=CC=C(N(C)C)C=C1 PRCJKXVZYMWNID-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- RUUNLLXEBIVUAQ-YTORKDELSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-aminopropanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]propanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=C(O)C=C1 RUUNLLXEBIVUAQ-YTORKDELSA-N 0.000 description 1
- HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N (2s)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- UAISREBYDOFHJY-YFKPBYRVSA-N (2s)-4-oxopiperidin-1-ium-2-carboxylate Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CC(=O)CCN1 UAISREBYDOFHJY-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5alpha,7alpha,12alpha)-3,7,12-trihydroxy-cholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QYAPHLRPFNSDNH-MRFRVZCGSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-7-chloro-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide;hydrochloride Chemical compound Cl.C1=CC(Cl)=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O QYAPHLRPFNSDNH-MRFRVZCGSA-N 0.000 description 1
- 230000006269 (delayed) early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- PQMRRAQXKWFYQN-UHFFFAOYSA-N 1-phenyl-2-sulfanylideneimidazolidin-4-one Chemical class S=C1NC(=O)CN1C1=CC=CC=C1 PQMRRAQXKWFYQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150029062 15 gene Proteins 0.000 description 1
- OMGHIGVFLOPEHJ-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydro-1h-pyrrol-1-ium-2-carboxylate Chemical compound OC(=O)C1NCC=C1 OMGHIGVFLOPEHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PPINMSZPTPRQQB-NHCYSSNCSA-N 2-[[(2s)-1-[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O PPINMSZPTPRQQB-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- DQVAZKGVGKHQDS-UHFFFAOYSA-N 2-[[1-[2-[(2-amino-4-methylpentanoyl)amino]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-4-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O DQVAZKGVGKHQDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 101150055869 25 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150110188 30 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150101112 7 gene Proteins 0.000 description 1
- BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 7028-40-2 Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710102786 ATP-dependent leucine adenylase Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N Acrylic acid Chemical compound OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VTIKDEXOEJDMJP-UHFFFAOYSA-N Actinorhodine Natural products CC1OC(CC(=O)O)CC2=C1C(=O)c3c(O)c(cc(O)c3C2=O)c4cc(O)c5C(=O)C6=C(C(C)OC(CC(=O)O)C6)C(=O)c5c4O VTIKDEXOEJDMJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- DKJPOZOEBONHFS-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Asp Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O DKJPOZOEBONHFS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- WQVFQXXBNHHPLX-ZKWXMUAHSA-N Ala-Ala-His Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(O)=O WQVFQXXBNHHPLX-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N Ala-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)N JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- SITWEMZOJNKJCH-WDSKDSINSA-N Ala-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N SITWEMZOJNKJCH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- JAMAWBXXKFGFGX-KZVJFYERSA-N Ala-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JAMAWBXXKFGFGX-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- STACJSVFHSEZJV-GHCJXIJMSA-N Ala-Asn-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O STACJSVFHSEZJV-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- SHYYAQLDNVHPFT-DLOVCJGASA-N Ala-Asn-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 SHYYAQLDNVHPFT-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- XAEWTDMGFGHWFK-IMJSIDKUSA-N Ala-Asp Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O XAEWTDMGFGHWFK-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- WXERCAHAIKMTKX-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WXERCAHAIKMTKX-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- WDIYWDJLXOCGRW-ACZMJKKPSA-N Ala-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WDIYWDJLXOCGRW-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- LZRNYBIJOSKKRJ-XVYDVKMFSA-N Ala-Asp-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N LZRNYBIJOSKKRJ-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- PAIHPOGPJVUFJY-WDSKDSINSA-N Ala-Glu-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O PAIHPOGPJVUFJY-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- FBHOPGDGELNWRH-DRZSPHRISA-N Ala-Glu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O FBHOPGDGELNWRH-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- OMMDTNGURYRDAC-NRPADANISA-N Ala-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OMMDTNGURYRDAC-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- QHASENCZLDHBGX-ONGXEEELSA-N Ala-Gly-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QHASENCZLDHBGX-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- MQIGTEQXYCRLGK-BQBZGAKWSA-N Ala-Gly-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O MQIGTEQXYCRLGK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- NIZKGBJVCMRDKO-KWQFWETISA-N Ala-Gly-Tyr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 NIZKGBJVCMRDKO-KWQFWETISA-N 0.000 description 1
- SMCGQGDVTPFXKB-XPUUQOCRSA-N Ala-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N SMCGQGDVTPFXKB-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- ZPXCNXMJEZKRLU-LSJOCFKGSA-N Ala-His-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CN=CN1 ZPXCNXMJEZKRLU-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- DVJSJDDYCYSMFR-ZKWXMUAHSA-N Ala-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O DVJSJDDYCYSMFR-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- RUQBGIMJQUWXPP-CYDGBPFRSA-N Ala-Leu-Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O RUQBGIMJQUWXPP-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- HHRAXZAYZFFRAM-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HHRAXZAYZFFRAM-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NOGFDULFCFXBHB-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N NOGFDULFCFXBHB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- OYJCVIGKMXUVKB-GARJFASQSA-N Ala-Leu-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N OYJCVIGKMXUVKB-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- PMQXMXAASGFUDX-SRVKXCTJSA-N Ala-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CCCCN PMQXMXAASGFUDX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- MDNAVFBZPROEHO-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Val Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(C)N)CCCCN MDNAVFBZPROEHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLOMBWNGESDVJU-GUBZILKMSA-N Ala-Met-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O NLOMBWNGESDVJU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- DWYROCSXOOMOEU-CIUDSAMLSA-N Ala-Met-Glu Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N DWYROCSXOOMOEU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- PEIBBAXIKUAYGN-UBHSHLNASA-N Ala-Phe-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 PEIBBAXIKUAYGN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- CJQAEJMHBAOQHA-DLOVCJGASA-N Ala-Phe-Asn Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N CJQAEJMHBAOQHA-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- RNHKOQHGYMTHFR-UBHSHLNASA-N Ala-Phe-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CC=CC=C1 RNHKOQHGYMTHFR-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- OSRZOHXQCUFIQG-FPMFFAJLSA-N Ala-Phe-Pro Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H]([NH3+])C)C(=O)N1[C@H](CCC1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 OSRZOHXQCUFIQG-FPMFFAJLSA-N 0.000 description 1
- YCRAFFCYWOUEOF-DLOVCJGASA-N Ala-Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 YCRAFFCYWOUEOF-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- CYBJZLQSUJEMAS-LFSVMHDDSA-N Ala-Phe-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](C)N)O CYBJZLQSUJEMAS-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 1
- IHMCQESUJVZTKW-UBHSHLNASA-N Ala-Phe-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CC=CC=C1 IHMCQESUJVZTKW-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- IPZQNYYAYVRKKK-FXQIFTODSA-N Ala-Pro-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IPZQNYYAYVRKKK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XAXHGSOBFPIRFG-LSJOCFKGSA-N Ala-Pro-His Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(O)=O XAXHGSOBFPIRFG-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- ADSGHMXEAZJJNF-DCAQKATOSA-N Ala-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C)N ADSGHMXEAZJJNF-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- YHBDGLZYNIARKJ-GUBZILKMSA-N Ala-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C)N YHBDGLZYNIARKJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- YNOCMHZSWJMGBB-GCJQMDKQSA-N Ala-Thr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YNOCMHZSWJMGBB-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- AAWLEICNDUHIJM-MBLNEYKQSA-N Ala-Thr-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O AAWLEICNDUHIJM-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 1
- IOFVWPYSRSCWHI-JXUBOQSCSA-N Ala-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](C)N IOFVWPYSRSCWHI-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- AENHOIXXHKNIQL-AUTRQRHGSA-N Ala-Tyr-Ala Chemical compound [O-]C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]([NH3+])C)CC1=CC=C(O)C=C1 AENHOIXXHKNIQL-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- YCTIYBUTCKNOTI-UWJYBYFXSA-N Ala-Tyr-Asp Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N YCTIYBUTCKNOTI-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- JNJHNBXBGNJESC-KKXDTOCCSA-N Ala-Tyr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O JNJHNBXBGNJESC-KKXDTOCCSA-N 0.000 description 1
- ZXKNLCPUNZPFGY-LEWSCRJBSA-N Ala-Tyr-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N ZXKNLCPUNZPFGY-LEWSCRJBSA-N 0.000 description 1
- JPOQZCHGOTWRTM-FQPOAREZSA-N Ala-Tyr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JPOQZCHGOTWRTM-FQPOAREZSA-N 0.000 description 1
- YEBZNKPPOHFZJM-BPNCWPANSA-N Ala-Tyr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O YEBZNKPPOHFZJM-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- IYKVSFNGSWTTNZ-GUBZILKMSA-N Ala-Val-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IYKVSFNGSWTTNZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- YJHKTAMKPGFJCT-NRPADANISA-N Ala-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O YJHKTAMKPGFJCT-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- SSQHYGLFYWZWDV-UVBJJODRSA-N Ala-Val-Trp Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](C)N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(O)=O SSQHYGLFYWZWDV-UVBJJODRSA-N 0.000 description 1
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010052434 Aminodeoxychorismate synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000192542 Anabaena Species 0.000 description 1
- 241001115693 Aponogeton azureus Species 0.000 description 1
- OOBVTWHLKYJFJH-FXQIFTODSA-N Arg-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OOBVTWHLKYJFJH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- VKKYFICVTYKFIO-CIUDSAMLSA-N Arg-Ala-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N VKKYFICVTYKFIO-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DBKNLHKEVPZVQC-LPEHRKFASA-N Arg-Ala-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(O)=O DBKNLHKEVPZVQC-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- OTOXOKCIIQLMFH-KZVJFYERSA-N Arg-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N OTOXOKCIIQLMFH-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- KGSJCPBERYUXCN-BPNCWPANSA-N Arg-Ala-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O KGSJCPBERYUXCN-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- VWVPYNGMOCSSGK-GUBZILKMSA-N Arg-Arg-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O VWVPYNGMOCSSGK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N Arg-Arg-Glu Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- IASNWHAGGYTEKX-IUCAKERBSA-N Arg-Arg-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(O)=O IASNWHAGGYTEKX-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- NABSCJGZKWSNHX-RCWTZXSCSA-N Arg-Arg-Thr Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N NABSCJGZKWSNHX-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- RWCLSUOSKWTXLA-FXQIFTODSA-N Arg-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RWCLSUOSKWTXLA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- PQWTZSNVWSOFFK-FXQIFTODSA-N Arg-Asp-Asn Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N)CN=C(N)N PQWTZSNVWSOFFK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- DQNLFLGFZAUIOW-FXQIFTODSA-N Arg-Cys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DQNLFLGFZAUIOW-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HPKSHFSEXICTLI-CIUDSAMLSA-N Arg-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HPKSHFSEXICTLI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- XLWSGICNBZGYTA-CIUDSAMLSA-N Arg-Glu-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O XLWSGICNBZGYTA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- QAXCZGMLVICQKS-SRVKXCTJSA-N Arg-Glu-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N QAXCZGMLVICQKS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HPSVTWMFWCHKFN-GARJFASQSA-N Arg-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O HPSVTWMFWCHKFN-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- AQPVUEJJARLJHB-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N AQPVUEJJARLJHB-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- AUFHLLPVPSMEOG-YUMQZZPRSA-N Arg-Gly-Glu Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AUFHLLPVPSMEOG-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- CYXCAHZVPFREJD-LURJTMIESA-N Arg-Gly-Gly Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O CYXCAHZVPFREJD-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- ZATRYQNPUHGXCU-DTWKUNHWSA-N Arg-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O ZATRYQNPUHGXCU-DTWKUNHWSA-N 0.000 description 1
- WVNFNPGXYADPPO-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Ser Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WVNFNPGXYADPPO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- NKNILFJYKKHBKE-WPRPVWTQSA-N Arg-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NKNILFJYKKHBKE-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- MSILNNHVVMMTHZ-UWVGGRQHSA-N Arg-His-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CN=CN1 MSILNNHVVMMTHZ-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- UPKMBGAAEZGHOC-RWMBFGLXSA-N Arg-His-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O UPKMBGAAEZGHOC-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 1
- CRCCTGPNZUCAHE-DCAQKATOSA-N Arg-His-Ser Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CC1=CN=CN1 CRCCTGPNZUCAHE-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N Arg-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YBZMTKUDWXZLIX-UWVGGRQHSA-N Arg-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YBZMTKUDWXZLIX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- NMRHDSAOIURTNT-RWMBFGLXSA-N Arg-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N NMRHDSAOIURTNT-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 1
- JEOCWTUOMKEEMF-RHYQMDGZSA-N Arg-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JEOCWTUOMKEEMF-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- VVJTWSRNMJNDPN-IUCAKERBSA-N Arg-Met-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(O)=O VVJTWSRNMJNDPN-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- JCROZIFVIYMXHM-GUBZILKMSA-N Arg-Met-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JCROZIFVIYMXHM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- YTMKMRSYXHBGER-IHRRRGAJSA-N Arg-Phe-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N YTMKMRSYXHBGER-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- FKQITMVNILRUCQ-IHRRRGAJSA-N Arg-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FKQITMVNILRUCQ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- DPLFNLDACGGBAK-KKUMJFAQSA-N Arg-Phe-Glu Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N DPLFNLDACGGBAK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- GSUFZRURORXYTM-STQMWFEESA-N Arg-Phe-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=CC=C1 GSUFZRURORXYTM-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- LXMKTIZAGIBQRX-HRCADAONSA-N Arg-Phe-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O LXMKTIZAGIBQRX-HRCADAONSA-N 0.000 description 1
- BSYKSCBTTQKOJG-GUBZILKMSA-N Arg-Pro-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BSYKSCBTTQKOJG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WKPXXXUSUHAXDE-SRVKXCTJSA-N Arg-Pro-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O WKPXXXUSUHAXDE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- LFAUVOXPCGJKTB-DCAQKATOSA-N Arg-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N LFAUVOXPCGJKTB-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ASQKVGRCKOFKIU-KZVJFYERSA-N Arg-Thr-Ala Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O ASQKVGRCKOFKIU-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- INOIAEUXVVNJKA-XGEHTFHBSA-N Arg-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O INOIAEUXVVNJKA-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- XRNXPIGJPQHCPC-RCWTZXSCSA-N Arg-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)O)C(O)=O XRNXPIGJPQHCPC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- XOZYYXMHMIEJET-XIRDDKMYSA-N Arg-Trp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XOZYYXMHMIEJET-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- PJOPLXOCKACMLK-KKUMJFAQSA-N Arg-Tyr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PJOPLXOCKACMLK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- XRLOBFSLPCHYLQ-ULQDDVLXSA-N Arg-Tyr-His Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O XRLOBFSLPCHYLQ-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- ULBHWNVWSCJLCO-NHCYSSNCSA-N Arg-Val-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ULBHWNVWSCJLCO-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- CGXQUULXFWRJOI-SRVKXCTJSA-N Arg-Val-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O CGXQUULXFWRJOI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- AKEBUSZTMQLNIX-UWJYBYFXSA-N Asn-Ala-Tyr Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N AKEBUSZTMQLNIX-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- XQQVCUIBGYFKDC-OLHMAJIHSA-N Asn-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XQQVCUIBGYFKDC-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 1
- SUEIIIFUBHDCCS-PBCZWWQYSA-N Asn-His-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SUEIIIFUBHDCCS-PBCZWWQYSA-N 0.000 description 1
- WIDVAWAQBRAKTI-YUMQZZPRSA-N Asn-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O WIDVAWAQBRAKTI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- DJIMLSXHXKWADV-CIUDSAMLSA-N Asn-Leu-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DJIMLSXHXKWADV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- OROMFUQQTSWUTI-IHRRRGAJSA-N Asn-Phe-Arg Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N OROMFUQQTSWUTI-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- BYLSYQASFJJBCL-DCAQKATOSA-N Asn-Pro-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BYLSYQASFJJBCL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- VCJCPARXDBEGNE-GUBZILKMSA-N Asn-Pro-Pro Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 VCJCPARXDBEGNE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JXMREEPBRANWBY-VEVYYDQMSA-N Asn-Thr-Arg Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JXMREEPBRANWBY-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- KRXIWXCXOARFNT-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O KRXIWXCXOARFNT-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- HPNDBHLITCHRSO-WHFBIAKZSA-N Asp-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O HPNDBHLITCHRSO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- VPPXTHJNTYDNFJ-CIUDSAMLSA-N Asp-Ala-Lys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N VPPXTHJNTYDNFJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- CXBOKJPLEYUPGB-FXQIFTODSA-N Asp-Ala-Met Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N CXBOKJPLEYUPGB-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- NECWUSYTYSIFNC-DLOVCJGASA-N Asp-Ala-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 NECWUSYTYSIFNC-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- XPGVTUBABLRGHY-BIIVOSGPSA-N Asp-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N XPGVTUBABLRGHY-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- ZLGKHJHFYSRUBH-FXQIFTODSA-N Asp-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZLGKHJHFYSRUBH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- RYEWQKQXRJCHIO-SRVKXCTJSA-N Asp-Asn-Tyr Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 RYEWQKQXRJCHIO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- JGDBHIVECJGXJA-FXQIFTODSA-N Asp-Asp-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JGDBHIVECJGXJA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- VPSHHQXIWLGVDD-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VPSHHQXIWLGVDD-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- SVFOIXMRMLROHO-SRVKXCTJSA-N Asp-Asp-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 SVFOIXMRMLROHO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- LKIYSIYBKYLKPU-BIIVOSGPSA-N Asp-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)C(=O)O LKIYSIYBKYLKPU-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N Asp-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N Asp-Gly-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- BIVYLQMZPHDUIH-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Cys Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)C(=O)O BIVYLQMZPHDUIH-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- PZXPWHFYZXTFBI-YUMQZZPRSA-N Asp-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O PZXPWHFYZXTFBI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- KPNUCOPMVSGRCR-DCAQKATOSA-N Asp-His-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O KPNUCOPMVSGRCR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- WSXDIZFNQYTUJB-SRVKXCTJSA-N Asp-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O WSXDIZFNQYTUJB-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YRBGRUOSJROZEI-NHCYSSNCSA-N Asp-His-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O YRBGRUOSJROZEI-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- GBSUGIXJAAKZOW-GMOBBJLQSA-N Asp-Ile-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O GBSUGIXJAAKZOW-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- SCQIQCWLOMOEFP-DCAQKATOSA-N Asp-Leu-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O SCQIQCWLOMOEFP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- PAYPSKIBMDHZPI-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PAYPSKIBMDHZPI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N Asp-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- AYFVRYXNDHBECD-YUMQZZPRSA-N Asp-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O AYFVRYXNDHBECD-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- UMHUHHJMEXNSIV-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O UMHUHHJMEXNSIV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ORRJQLIATJDMQM-HJGDQZAQSA-N Asp-Leu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O ORRJQLIATJDMQM-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- YQKYLDVPCOGIRB-SEKJGCFDSA-N Asp-Leu-Thr-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YQKYLDVPCOGIRB-SEKJGCFDSA-N 0.000 description 1
- QNMKWNONJGKJJC-NHCYSSNCSA-N Asp-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QNMKWNONJGKJJC-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- HJCGDIGVVWETRO-ZPFDUUQYSA-N Asp-Lys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(O)=O HJCGDIGVVWETRO-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- NVFSJIXJZCDICF-SRVKXCTJSA-N Asp-Lys-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N NVFSJIXJZCDICF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- MYLZFUMPZCPJCJ-NHCYSSNCSA-N Asp-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MYLZFUMPZCPJCJ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- RRUWMFBLFLUZSI-LPEHRKFASA-N Asp-Met-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N RRUWMFBLFLUZSI-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- WOPJVEMFXYHZEE-SRVKXCTJSA-N Asp-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WOPJVEMFXYHZEE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- PWAIZUBWHRHYKS-MELADBBJSA-N Asp-Phe-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)C(=O)O PWAIZUBWHRHYKS-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- NONWUQAWAANERO-BZSNNMDCSA-N Asp-Phe-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 NONWUQAWAANERO-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- KPSHWSWFPUDEGF-FXQIFTODSA-N Asp-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CC(O)=O KPSHWSWFPUDEGF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- AHWRSSLYSGLBGD-CIUDSAMLSA-N Asp-Pro-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AHWRSSLYSGLBGD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WMLFFCRUSPNENW-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WMLFFCRUSPNENW-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- KGHLGJAXYSVNJP-WHFBIAKZSA-N Asp-Ser-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O KGHLGJAXYSVNJP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ZQFRDAZBTSFGGW-SRVKXCTJSA-N Asp-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O ZQFRDAZBTSFGGW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- MGSVBZIBCCKGCY-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MGSVBZIBCCKGCY-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- JSHWXQIZOCVWIA-ZKWXMUAHSA-N Asp-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O JSHWXQIZOCVWIA-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- MJJIHRWNWSQTOI-VEVYYDQMSA-N Asp-Thr-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O MJJIHRWNWSQTOI-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- IWLZBRTUIVXZJD-OLHMAJIHSA-N Asp-Thr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IWLZBRTUIVXZJD-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 1
- GWWSUMLEWKQHLR-NUMRIWBASA-N Asp-Thr-Glu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O GWWSUMLEWKQHLR-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- GCACQYDBDHRVGE-LKXGYXEUSA-N Asp-Thr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@H](O)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O GCACQYDBDHRVGE-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- JDDYEZGPYBBPBN-JRQIVUDYSA-N Asp-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JDDYEZGPYBBPBN-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- WAEDSQFVZJUHLI-BYULHYEWSA-N Asp-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WAEDSQFVZJUHLI-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101000623895 Bos taurus Mucin-15 Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- DNLZTXBMWCIDPN-PVSSEACSSA-N CNC1=CC=C(C[C@H](N)C(=O)O)C=C1.NC1=CC=C(C[C@H](N)C(=O)O)C=C1 Chemical compound CNC1=CC=C(C[C@H](N)C(=O)O)C=C1.NC1=CC=C(C[C@H](N)C(=O)O)C=C1 DNLZTXBMWCIDPN-PVSSEACSSA-N 0.000 description 1
- 101100402795 Caenorhabditis elegans mtl-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100172879 Caenorhabditis elegans sec-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 description 1
- 239000004380 Cholic acid Substances 0.000 description 1
- 102100034330 Chromaffin granule amine transporter Human genes 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PKNIZMPLMSKROD-BIIVOSGPSA-N Cys-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N PKNIZMPLMSKROD-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- CLDCTNHPILWQCW-CIUDSAMLSA-N Cys-Arg-Glu Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)CN=C(N)N CLDCTNHPILWQCW-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BYALSSDCQYHKMY-XGEHTFHBSA-N Cys-Arg-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CS)N)O BYALSSDCQYHKMY-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- XGIAHEUULGOZHH-GUBZILKMSA-N Cys-Arg-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CS)N XGIAHEUULGOZHH-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- DEVDFMRWZASYOF-ZLUOBGJFSA-N Cys-Asn-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O DEVDFMRWZASYOF-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- KXUKWRVYDYIPSQ-CIUDSAMLSA-N Cys-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KXUKWRVYDYIPSQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IZUNQDRIAOLWCN-YUMQZZPRSA-N Cys-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N IZUNQDRIAOLWCN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- UIKLEGZPIOXFHJ-DLOVCJGASA-N Cys-Phe-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UIKLEGZPIOXFHJ-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- OELDIVRKHTYFNG-WDSKDSINSA-N Cys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CS OELDIVRKHTYFNG-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000180 D-prolyl group Chemical group N1[C@@H](C(=O)*)CCC1 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 238000007702 DNA assembly Methods 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 108010002156 Depsipeptides Proteins 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 206010013457 Dissociation Diseases 0.000 description 1
- 101150007322 Eh gene Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241001452028 Escherichia coli DH1 Species 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- RUFHOVYUYSNDNY-ACZMJKKPSA-N Glu-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O RUFHOVYUYSNDNY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- UTKUTMJSWKKHEM-WDSKDSINSA-N Glu-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O UTKUTMJSWKKHEM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- CGYDXNKRIMJMLV-GUBZILKMSA-N Glu-Arg-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CGYDXNKRIMJMLV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KKCUFHUTMKQQCF-SRVKXCTJSA-N Glu-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KKCUFHUTMKQQCF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- SRZLHYPAOXBBSB-HJGDQZAQSA-N Glu-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SRZLHYPAOXBBSB-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- RDPOETHPAQEGDP-ACZMJKKPSA-N Glu-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RDPOETHPAQEGDP-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- DSPQRJXOIXHOHK-WDSKDSINSA-N Glu-Asp-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O DSPQRJXOIXHOHK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- KVBPDJIFRQUQFY-ACZMJKKPSA-N Glu-Cys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O KVBPDJIFRQUQFY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- SJPMNHCEWPTRBR-BQBZGAKWSA-N Glu-Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O SJPMNHCEWPTRBR-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- QJCKNLPMTPXXEM-AUTRQRHGSA-N Glu-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O QJCKNLPMTPXXEM-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- OGNJZUXUTPQVBR-BQBZGAKWSA-N Glu-Gly-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OGNJZUXUTPQVBR-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- CAVMESABQIKFKT-IUCAKERBSA-N Glu-Gly-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N CAVMESABQIKFKT-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- LRPXYSGPOBVBEH-IUCAKERBSA-N Glu-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LRPXYSGPOBVBEH-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- HKTRDWYCAUTRRL-YUMQZZPRSA-N Glu-His Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 HKTRDWYCAUTRRL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- VXQOONWNIWFOCS-HGNGGELXSA-N Glu-His-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N VXQOONWNIWFOCS-HGNGGELXSA-N 0.000 description 1
- XIKYNVKEUINBGL-IUCAKERBSA-N Glu-His-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(O)=O XIKYNVKEUINBGL-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- VGOFRWOTSXVPAU-SDDRHHMPSA-N Glu-His-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O VGOFRWOTSXVPAU-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- HVYWQYLBVXMXSV-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HVYWQYLBVXMXSV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WNRZUESNGGDCJX-JYJNAYRXSA-N Glu-Leu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O WNRZUESNGGDCJX-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- UGSVSNXPJJDJKL-SDDRHHMPSA-N Glu-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N UGSVSNXPJJDJKL-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 1
- OQXDUSZKISQQSS-GUBZILKMSA-N Glu-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OQXDUSZKISQQSS-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ILWHFUZZCFYSKT-AVGNSLFASA-N Glu-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ILWHFUZZCFYSKT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- PMSMKNYRZCKVMC-DRZSPHRISA-N Glu-Phe-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N PMSMKNYRZCKVMC-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- RXESHTOTINOODU-JYJNAYRXSA-N Glu-Phe-His Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N RXESHTOTINOODU-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- LPHGXOWFAXFCPX-KKUMJFAQSA-N Glu-Pro-Phe Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=CC=C2)C(=O)O LPHGXOWFAXFCPX-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- BIYNPVYAZOUVFQ-CIUDSAMLSA-N Glu-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BIYNPVYAZOUVFQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- SWDNPSMMEWRNOH-HJGDQZAQSA-N Glu-Pro-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SWDNPSMMEWRNOH-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- NNQDRRUXFJYCCJ-NHCYSSNCSA-N Glu-Pro-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NNQDRRUXFJYCCJ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- WIKMTDVSCUJIPJ-CIUDSAMLSA-N Glu-Ser-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N WIKMTDVSCUJIPJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- QCMVGXDELYMZET-GLLZPBPUSA-N Glu-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QCMVGXDELYMZET-GLLZPBPUSA-N 0.000 description 1
- DDXZHOHEABQXSE-NKIYYHGXSA-N Glu-Thr-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O DDXZHOHEABQXSE-NKIYYHGXSA-N 0.000 description 1
- YQAQQKPWFOBSMU-WDCWCFNPSA-N Glu-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YQAQQKPWFOBSMU-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- DTLLNDVORUEOTM-WDCWCFNPSA-N Glu-Thr-Lys Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O DTLLNDVORUEOTM-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- UMZHHILWZBFPGL-LOKLDPHHSA-N Glu-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O UMZHHILWZBFPGL-LOKLDPHHSA-N 0.000 description 1
- CAQXJMUDOLSBPF-SUSMZKCASA-N Glu-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CAQXJMUDOLSBPF-SUSMZKCASA-N 0.000 description 1
- YSWHPLCDIMUKFE-QWRGUYRKSA-N Glu-Tyr Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 YSWHPLCDIMUKFE-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- MLILEEIVMRUYBX-NHCYSSNCSA-N Glu-Val-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O MLILEEIVMRUYBX-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- UZWUBBRJWFTHTD-LAEOZQHASA-N Glu-Val-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O UZWUBBRJWFTHTD-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- HQTDNEZTGZUWSY-XVKPBYJWSA-N Glu-Val-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O HQTDNEZTGZUWSY-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010073324 Glutaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000009127 Glutaminase Human genes 0.000 description 1
- VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- MZZSCEANQDPJER-ONGXEEELSA-N Gly-Ala-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MZZSCEANQDPJER-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- LJPIRKICOISLKN-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LJPIRKICOISLKN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- QIZJOTQTCAGKPU-KWQFWETISA-N Gly-Ala-Tyr Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 QIZJOTQTCAGKPU-KWQFWETISA-N 0.000 description 1
- JRDYDYXZKFNNRQ-XPUUQOCRSA-N Gly-Ala-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN JRDYDYXZKFNNRQ-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- JXYMPBCYRKWJEE-BQBZGAKWSA-N Gly-Arg-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JXYMPBCYRKWJEE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- UPOJUWHGMDJUQZ-IUCAKERBSA-N Gly-Arg-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O UPOJUWHGMDJUQZ-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N Gly-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- KRRMJKMGWWXWDW-STQMWFEESA-N Gly-Arg-Phe Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KRRMJKMGWWXWDW-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- DTPOVRRYXPJJAZ-FJXKBIBVSA-N Gly-Arg-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N DTPOVRRYXPJJAZ-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- JVWPPCWUDRJGAE-YUMQZZPRSA-N Gly-Asn-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O JVWPPCWUDRJGAE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- KQDMENMTYNBWMR-WHFBIAKZSA-N Gly-Asp-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KQDMENMTYNBWMR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- LLXVQPKEQQCISF-YUMQZZPRSA-N Gly-Asp-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)CN LLXVQPKEQQCISF-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- FZQLXNIMCPJVJE-YUMQZZPRSA-N Gly-Asp-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FZQLXNIMCPJVJE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LXXLEUBUOMCAMR-NKWVEPMBSA-N Gly-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)CN)C(=O)O LXXLEUBUOMCAMR-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- PMNHJLASAAWELO-FOHZUACHSA-N Gly-Asp-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PMNHJLASAAWELO-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- IXKRSKPKSLXIHN-YUMQZZPRSA-N Gly-Cys-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IXKRSKPKSLXIHN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- UEGIPZAXNBYCCP-NKWVEPMBSA-N Gly-Cys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CN)C(=O)O UEGIPZAXNBYCCP-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- SOEATRRYCIPEHA-BQBZGAKWSA-N Gly-Glu-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SOEATRRYCIPEHA-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- YYPFZVIXAVDHIK-IUCAKERBSA-N Gly-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CN YYPFZVIXAVDHIK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- GDOZQTNZPCUARW-YFKPBYRVSA-N Gly-Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O GDOZQTNZPCUARW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QPCVIQJVRGXUSA-LURJTMIESA-N Gly-Gly-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN QPCVIQJVRGXUSA-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- KAJAOGBVWCYGHZ-JTQLQIEISA-N Gly-Gly-Phe Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 KAJAOGBVWCYGHZ-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N Gly-Gly-Pro zwitterion Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N Gly-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 1
- ADZGCWWDPFDHCY-ZETCQYMHSA-N Gly-His-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CN=CN1 ADZGCWWDPFDHCY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- YFGONBOFGGWKKY-VHSXEESVSA-N Gly-His-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)CN)C(=O)O YFGONBOFGGWKKY-VHSXEESVSA-N 0.000 description 1
- HMHRTKOWRUPPNU-RCOVLWMOSA-N Gly-Ile-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O HMHRTKOWRUPPNU-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- PAWIVEIWWYGBAM-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Ala Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PAWIVEIWWYGBAM-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YTSVAIMKVLZUDU-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Asp Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YTSVAIMKVLZUDU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YIFUFYZELCMPJP-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Cys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O YIFUFYZELCMPJP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LIXWIUAORXJNBH-QWRGUYRKSA-N Gly-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)CN LIXWIUAORXJNBH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N Gly-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- YSDLIYZLOTZZNP-UWVGGRQHSA-N Gly-Leu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN YSDLIYZLOTZZNP-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- MIIVFRCYJABHTQ-ONGXEEELSA-N Gly-Leu-Val Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MIIVFRCYJABHTQ-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- VBOBNHSVQKKTOT-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VBOBNHSVQKKTOT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LOEANKRDMMVOGZ-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LOEANKRDMMVOGZ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- DBJYVKDPGIFXFO-BQBZGAKWSA-N Gly-Met-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DBJYVKDPGIFXFO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HHRODZSXDXMUHS-LURJTMIESA-N Gly-Met-Gly Chemical compound CSCC[C@H](NC(=O)C[NH3+])C(=O)NCC([O-])=O HHRODZSXDXMUHS-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- JJGBXTYGTKWGAT-YUMQZZPRSA-N Gly-Pro-Glu Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O JJGBXTYGTKWGAT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- NSVOVKWEKGEOQB-LURJTMIESA-N Gly-Pro-Gly Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O NSVOVKWEKGEOQB-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- JNGHLWWFPGIJER-STQMWFEESA-N Gly-Pro-Tyr Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 JNGHLWWFPGIJER-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- IRJWAYCXIYUHQE-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN IRJWAYCXIYUHQE-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N Gly-Ser-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- OHUKZZYSJBKFRR-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Asp Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O OHUKZZYSJBKFRR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- MKIAPEZXQDILRR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN MKIAPEZXQDILRR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- ABPRMMYHROQBLY-NKWVEPMBSA-N Gly-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)C(=O)O ABPRMMYHROQBLY-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- LCRDMSSAKLTKBU-ZDLURKLDSA-N Gly-Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN LCRDMSSAKLTKBU-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- ZLCLYFGMKFCDCN-XPUUQOCRSA-N Gly-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)C(O)=O ZLCLYFGMKFCDCN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- YXTFLTJYLIAZQG-FJXKBIBVSA-N Gly-Thr-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YXTFLTJYLIAZQG-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- DBUNZBWUWCIELX-JHEQGTHGSA-N Gly-Thr-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DBUNZBWUWCIELX-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- RHRLHXQWHCNJKR-PMVVWTBXSA-N Gly-Thr-His Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 RHRLHXQWHCNJKR-PMVVWTBXSA-N 0.000 description 1
- ZZWUYQXMIFTIIY-WEDXCCLWSA-N Gly-Thr-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZZWUYQXMIFTIIY-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- MYXNLWDWWOTERK-BHNWBGBOSA-N Gly-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN)O MYXNLWDWWOTERK-BHNWBGBOSA-N 0.000 description 1
- TVTZEOHWHUVYCG-KYNKHSRBSA-N Gly-Thr-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O TVTZEOHWHUVYCG-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 1
- UMRIXLHPZZIOML-OALUTQOASA-N Gly-Trp-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)NC(=O)CN UMRIXLHPZZIOML-OALUTQOASA-N 0.000 description 1
- UMBDRSMLCUYIRI-DVJZZOLTSA-N Gly-Trp-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)CN)O UMBDRSMLCUYIRI-DVJZZOLTSA-N 0.000 description 1
- HQSKKSLNLSTONK-JTQLQIEISA-N Gly-Tyr-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 HQSKKSLNLSTONK-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- NGBGZCUWFVVJKC-IRXDYDNUSA-N Gly-Tyr-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 NGBGZCUWFVVJKC-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- BIAKMWKJMQLZOJ-ZKWXMUAHSA-N His-Ala-Ala Chemical compound C[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)Cc1cnc[nH]1)C(O)=O BIAKMWKJMQLZOJ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- AWHJQEYGWRKPHE-LSJOCFKGSA-N His-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AWHJQEYGWRKPHE-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- HTZKFIYQMHJWSQ-INTQDDNPSA-N His-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N HTZKFIYQMHJWSQ-INTQDDNPSA-N 0.000 description 1
- HXKZJLWGSWQKEA-LSJOCFKGSA-N His-Ala-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HXKZJLWGSWQKEA-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- TVQGUFGDVODUIF-LSJOCFKGSA-N His-Arg-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N TVQGUFGDVODUIF-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- UCDWNBFOZCZSNV-AVGNSLFASA-N His-Arg-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O UCDWNBFOZCZSNV-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- MAABHGXCIBEYQR-XVYDVKMFSA-N His-Asn-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N MAABHGXCIBEYQR-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- QZAFGJNKLMNDEM-DCAQKATOSA-N His-Asn-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 QZAFGJNKLMNDEM-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- MVADCDSCFTXCBT-CIUDSAMLSA-N His-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MVADCDSCFTXCBT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- LSQHWKPPOFDHHZ-YUMQZZPRSA-N His-Asp-Gly Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)NCC(=O)O)N LSQHWKPPOFDHHZ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YJBMLTVVVRJNOK-SRVKXCTJSA-N His-Asp-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N YJBMLTVVVRJNOK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- LMMPTUVWHCFTOT-GARJFASQSA-N His-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)C(=O)O LMMPTUVWHCFTOT-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- TXLQHACKRLWYCM-DCAQKATOSA-N His-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O TXLQHACKRLWYCM-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- NQKRILCJYCASDV-QWRGUYRKSA-N His-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 NQKRILCJYCASDV-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- ZUPVLBAXUUGKKN-VHSXEESVSA-N His-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)C(=O)O ZUPVLBAXUUGKKN-VHSXEESVSA-N 0.000 description 1
- FSOXZQBMPBQKGJ-QSFUFRPTSA-N His-Ile-Ala Chemical compound [O-]C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CN=CN1 FSOXZQBMPBQKGJ-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- YAALVYQFVJNXIV-KKUMJFAQSA-N His-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 YAALVYQFVJNXIV-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- SKOKHBGDXGTDDP-MELADBBJSA-N His-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N SKOKHBGDXGTDDP-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- VGYOLSOFODKLSP-IHPCNDPISA-N His-Leu-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 VGYOLSOFODKLSP-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- ZVKDCQVQTGYBQT-LSJOCFKGSA-N His-Pro-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZVKDCQVQTGYBQT-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- BZAQOPHNBFOOJS-DCAQKATOSA-N His-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BZAQOPHNBFOOJS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ABCCKUZDWMERKT-AVGNSLFASA-N His-Pro-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O ABCCKUZDWMERKT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- KAXZXLSXFWSNNZ-XVYDVKMFSA-N His-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KAXZXLSXFWSNNZ-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- UWSMZKRTOZEGDD-CUJWVEQBSA-N His-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UWSMZKRTOZEGDD-CUJWVEQBSA-N 0.000 description 1
- KFQDSSNYWKZFOO-LSJOCFKGSA-N His-Val-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KFQDSSNYWKZFOO-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- FFYYUUWROYYKFY-IHRRRGAJSA-N His-Val-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FFYYUUWROYYKFY-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- FBOMZVOKCZMDIG-XQQFMLRXSA-N His-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N FBOMZVOKCZMDIG-XQQFMLRXSA-N 0.000 description 1
- GBMSSORHVHAYLU-QTKMDUPCSA-N His-Val-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N)O GBMSSORHVHAYLU-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- 101000641221 Homo sapiens Chromaffin granule amine transporter Proteins 0.000 description 1
- RCFDOSNHHZGBOY-ACZMJKKPSA-N Ile-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- RPZFUIQVAPZLRH-GHCJXIJMSA-N Ile-Asp-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N RPZFUIQVAPZLRH-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- JZNVOBUNTWNZPW-GHCJXIJMSA-N Ile-Ser-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N JZNVOBUNTWNZPW-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- PXKACEXYLPBMAD-JBDRJPRFSA-N Ile-Ser-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N PXKACEXYLPBMAD-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- COWHUQXTSYTKQC-RWRJDSDZSA-N Ile-Thr-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N COWHUQXTSYTKQC-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 1
- NURNJECQNNCRBK-FLBSBUHZSA-N Ile-Thr-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NURNJECQNNCRBK-FLBSBUHZSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 201000008225 Klebsiella pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- HGCNKOLVKRAVHD-UHFFFAOYSA-N L-Met-L-Phe Natural products CSCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HGCNKOLVKRAVHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N L-alanyl-L-prolylglycine zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N L-arginyl-L-glutamic acid Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N L-cysteinylglycine Chemical compound SC[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N L-valyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001478479 Lechevalieria flava Species 0.000 description 1
- CZCSUZMIRKFFFA-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CZCSUZMIRKFFFA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- CQQGCWPXDHTTNF-GUBZILKMSA-N Leu-Ala-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CQQGCWPXDHTTNF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- QPRQGENIBFLVEB-BJDJZHNGSA-N Leu-Ala-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O QPRQGENIBFLVEB-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- REPPKAMYTOJTFC-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O REPPKAMYTOJTFC-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HASRFYOMVPJRPU-SRVKXCTJSA-N Leu-Arg-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HASRFYOMVPJRPU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- POJPZSMTTMLSTG-SRVKXCTJSA-N Leu-Asn-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N POJPZSMTTMLSTG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YKNBJXOJTURHCU-DCAQKATOSA-N Leu-Asp-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YKNBJXOJTURHCU-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ZURHXHNAEJJRNU-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ZURHXHNAEJJRNU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ILJREDZFPHTUIE-GUBZILKMSA-N Leu-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ILJREDZFPHTUIE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ULXYQAJWJGLCNR-YUMQZZPRSA-N Leu-Asp-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O ULXYQAJWJGLCNR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- XVSJMWYYLHPDKY-DCAQKATOSA-N Leu-Asp-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O XVSJMWYYLHPDKY-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- JQSXWJXBASFONF-KKUMJFAQSA-N Leu-Asp-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O JQSXWJXBASFONF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- CLVUXCBGKUECIT-HJGDQZAQSA-N Leu-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CLVUXCBGKUECIT-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- NFHJQETXTSDZSI-DCAQKATOSA-N Leu-Cys-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O NFHJQETXTSDZSI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- HQUXQAMSWFIRET-AVGNSLFASA-N Leu-Glu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN HQUXQAMSWFIRET-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- LLBQJYDYOLIQAI-JYJNAYRXSA-N Leu-Glu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O LLBQJYDYOLIQAI-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- BABSVXFGKFLIGW-UWVGGRQHSA-N Leu-Gly-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N BABSVXFGKFLIGW-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- KGCLIYGPQXUNLO-IUCAKERBSA-N Leu-Gly-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O KGCLIYGPQXUNLO-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- KEVYYIMVELOXCT-KBPBESRZSA-N Leu-Gly-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 KEVYYIMVELOXCT-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- PBGDOSARRIJMEV-DLOVCJGASA-N Leu-His-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PBGDOSARRIJMEV-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- OHZIZVWQXJPBJS-IXOXFDKPSA-N Leu-His-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OHZIZVWQXJPBJS-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- IAJFFZORSWOZPQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IAJFFZORSWOZPQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- PDQDCFBVYXEFSD-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PDQDCFBVYXEFSD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N Leu-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N Leu-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- KYIIALJHAOIAHF-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 KYIIALJHAOIAHF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N Leu-Leu-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- FOBUGKUBUJOWAD-IHPCNDPISA-N Leu-Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 FOBUGKUBUJOWAD-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- CPONGMJGVIAWEH-DCAQKATOSA-N Leu-Met-Ala Chemical compound CSCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CPONGMJGVIAWEH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- DDVHDMSBLRAKNV-IHRRRGAJSA-N Leu-Met-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DDVHDMSBLRAKNV-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- GCXGCIYIHXSKAY-ULQDDVLXSA-N Leu-Phe-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GCXGCIYIHXSKAY-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- INCJJHQRZGQLFC-KBPBESRZSA-N Leu-Phe-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(O)=O INCJJHQRZGQLFC-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- WXDRGWBQZIMJDE-ULQDDVLXSA-N Leu-Phe-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O WXDRGWBQZIMJDE-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- YWKNKRAKOCLOLH-OEAJRASXSA-N Leu-Phe-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YWKNKRAKOCLOLH-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- RRVCZCNFXIFGRA-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RRVCZCNFXIFGRA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HGUUMQWGYCVPKG-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N HGUUMQWGYCVPKG-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- VULJUQZPSOASBZ-SRVKXCTJSA-N Leu-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VULJUQZPSOASBZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- DPURXCQCHSQPAN-AVGNSLFASA-N Leu-Pro-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 DPURXCQCHSQPAN-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IZPVWNSAVUQBGP-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IZPVWNSAVUQBGP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- PPGBXYKMUMHFBF-KATARQTJSA-N Leu-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PPGBXYKMUMHFBF-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- ZDJQVSIPFLMNOX-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N ZDJQVSIPFLMNOX-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- ODRREERHVHMIPT-OEAJRASXSA-N Leu-Thr-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ODRREERHVHMIPT-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- UCRJTSIIAYHOHE-ULQDDVLXSA-N Leu-Tyr-Arg Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N UCRJTSIIAYHOHE-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- VJGQRELPQWNURN-JYJNAYRXSA-N Leu-Tyr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VJGQRELPQWNURN-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- SEOXPEFQEOYURL-PMVMPFDFSA-N Leu-Tyr-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O SEOXPEFQEOYURL-PMVMPFDFSA-N 0.000 description 1
- VQHUBNVKFFLWRP-ULQDDVLXSA-N Leu-Tyr-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 VQHUBNVKFFLWRP-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- XZNJZXJZBMBGGS-NHCYSSNCSA-N Leu-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XZNJZXJZBMBGGS-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- TUIOUEWKFFVNLH-DCAQKATOSA-N Leu-Val-Cys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O TUIOUEWKFFVNLH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N Leu-Val-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- FDBTVENULFNTAL-XQQFMLRXSA-N Leu-Val-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N FDBTVENULFNTAL-XQQFMLRXSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- IRNSXVOWSXSULE-DCAQKATOSA-N Lys-Ala-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN IRNSXVOWSXSULE-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- YNNPKXBBRZVIRX-IHRRRGAJSA-N Lys-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YNNPKXBBRZVIRX-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- LZWNAOIMTLNMDW-NHCYSSNCSA-N Lys-Asn-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N LZWNAOIMTLNMDW-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- AAORVPFVUIHEAB-YUMQZZPRSA-N Lys-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O AAORVPFVUIHEAB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- GKFNXYMAMKJSKD-NHCYSSNCSA-N Lys-Asp-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O GKFNXYMAMKJSKD-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- SKRGVGLIRUGANF-AVGNSLFASA-N Lys-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SKRGVGLIRUGANF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N Lys-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- HVAUKHLDSDDROB-KKUMJFAQSA-N Lys-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HVAUKHLDSDDROB-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- UQJOKDAYFULYIX-AVGNSLFASA-N Lys-Pro-Pro Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 UQJOKDAYFULYIX-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- JHNOXVASMSXSNB-WEDXCCLWSA-N Lys-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O JHNOXVASMSXSNB-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- RPWTZTBIFGENIA-VOAKCMCISA-N Lys-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RPWTZTBIFGENIA-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- VHTOGMKQXXJOHG-RHYQMDGZSA-N Lys-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VHTOGMKQXXJOHG-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- QFSYGUMEANRNJE-DCAQKATOSA-N Lys-Val-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N QFSYGUMEANRNJE-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- DRRXXZBXDMLGFC-IHRRRGAJSA-N Lys-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN DRRXXZBXDMLGFC-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 229930190515 Madumycin Natural products 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- YRAWWKUTNBILNT-FXQIFTODSA-N Met-Ala-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YRAWWKUTNBILNT-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- NKDSBBBPGIVWEI-RCWTZXSCSA-N Met-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NKDSBBBPGIVWEI-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- HLQWFLJOJRFXHO-CIUDSAMLSA-N Met-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HLQWFLJOJRFXHO-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DGNZGCQSVGGYJS-BQBZGAKWSA-N Met-Gly-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O DGNZGCQSVGGYJS-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- XKJUFUPCHARJKX-UWVGGRQHSA-N Met-Gly-His Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 XKJUFUPCHARJKX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- ABHVWYPPHDYFNY-WDSOQIARSA-N Met-His-Trp Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 ABHVWYPPHDYFNY-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- AFFKUNVPPLQUGA-DCAQKATOSA-N Met-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O AFFKUNVPPLQUGA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- PHKBGZKVOJCIMZ-SRVKXCTJSA-N Met-Pro-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O PHKBGZKVOJCIMZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YLDSJJOGQNEQJK-AVGNSLFASA-N Met-Pro-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YLDSJJOGQNEQJK-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- XIGAHPDZLAYQOS-SRVKXCTJSA-N Met-Pro-Pro Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 XIGAHPDZLAYQOS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- XPVCDCMPKCERFT-GUBZILKMSA-N Met-Ser-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O XPVCDCMPKCERFT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- MNGBICITWAPGAS-BPUTZDHNSA-N Met-Ser-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O MNGBICITWAPGAS-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- QQPMHUCGDRJFQK-RHYQMDGZSA-N Met-Thr-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C QQPMHUCGDRJFQK-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- CQRGINSEMFBACV-WPRPVWTQSA-N Met-Val-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O CQRGINSEMFBACV-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- 229930189782 Methylenomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000187708 Micromonospora Species 0.000 description 1
- 241000187723 Micromonospora sp. Species 0.000 description 1
- WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N N-L-alanyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N N-L-cysteinyl-L-phenylalanine Natural products SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N N-L-tyrosyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010066427 N-valyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- DAYLJWODMCOQEW-TURQNECASA-N NMN zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)([O-])=O)O2)O)=C1 DAYLJWODMCOQEW-TURQNECASA-N 0.000 description 1
- XQHMUSRSLNRVGA-TURQNECASA-N NMNH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 XQHMUSRSLNRVGA-TURQNECASA-N 0.000 description 1
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 241000282376 Panthera tigris Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- BJEYSVHMGIJORT-NHCYSSNCSA-N Phe-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BJEYSVHMGIJORT-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- BBDSZDHUCPSYAC-QEJZJMRPSA-N Phe-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BBDSZDHUCPSYAC-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- UHRNIXJAGGLKHP-DLOVCJGASA-N Phe-Ala-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UHRNIXJAGGLKHP-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- VHWOBXIWBDWZHK-IHRRRGAJSA-N Phe-Arg-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 VHWOBXIWBDWZHK-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N Phe-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- LXVFHIBXOWJTKZ-BZSNNMDCSA-N Phe-Asn-Tyr Chemical compound N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O LXVFHIBXOWJTKZ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- LDSOBEJVGGVWGD-DLOVCJGASA-N Phe-Asp-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 LDSOBEJVGGVWGD-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- RIYZXJVARWJLKS-KKUMJFAQSA-N Phe-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RIYZXJVARWJLKS-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- OWCLJDXHHZUNEL-IHRRRGAJSA-N Phe-Cys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OWCLJDXHHZUNEL-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- MGBRZXXGQBAULP-DRZSPHRISA-N Phe-Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 MGBRZXXGQBAULP-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- AKJAKCBHLJGRBU-JYJNAYRXSA-N Phe-Glu-His Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N AKJAKCBHLJGRBU-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- PSKRILMFHNIUAO-JYJNAYRXSA-N Phe-Glu-Lys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N PSKRILMFHNIUAO-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- JJHVFCUWLSKADD-ONGXEEELSA-N Phe-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JJHVFCUWLSKADD-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- RFEXGCASCQGGHZ-STQMWFEESA-N Phe-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O RFEXGCASCQGGHZ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- JEBWZLWTRPZQRX-QWRGUYRKSA-N Phe-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O JEBWZLWTRPZQRX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- QPVFUAUFEBPIPT-CDMKHQONSA-N Phe-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QPVFUAUFEBPIPT-CDMKHQONSA-N 0.000 description 1
- WFHRXJOZEXUKLV-IRXDYDNUSA-N Phe-Gly-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 WFHRXJOZEXUKLV-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- BEEVXUYVEHXWRQ-YESZJQIVSA-N Phe-His-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CC3=CC=CC=C3)N)C(=O)O BEEVXUYVEHXWRQ-YESZJQIVSA-N 0.000 description 1
- KBVJZCVLQWCJQN-KKUMJFAQSA-N Phe-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KBVJZCVLQWCJQN-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- CKJACGQPCPMWIT-UFYCRDLUSA-N Phe-Pro-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CKJACGQPCPMWIT-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- QSWKNJAPHQDAAS-MELADBBJSA-N Phe-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)C(=O)O QSWKNJAPHQDAAS-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- LTAWNJXSRUCFAN-UNQGMJICSA-N Phe-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O LTAWNJXSRUCFAN-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- GNRMAQSIROFNMI-IXOXFDKPSA-N Phe-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GNRMAQSIROFNMI-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- ABEFOXGAIIJDCL-SFJXLCSZSA-N Phe-Thr-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 ABEFOXGAIIJDCL-SFJXLCSZSA-N 0.000 description 1
- MJOJSHOTYWABPR-WIRXVTQYSA-N Phe-Trp-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 MJOJSHOTYWABPR-WIRXVTQYSA-N 0.000 description 1
- VFDRDMOMHBJGKD-UFYCRDLUSA-N Phe-Tyr-Arg Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N VFDRDMOMHBJGKD-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- CDHURCQGUDNBMA-UBHSHLNASA-N Phe-Val-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 CDHURCQGUDNBMA-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- FXEKNHAJIMHRFJ-ULQDDVLXSA-N Phe-Val-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N FXEKNHAJIMHRFJ-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 1
- 206010035717 Pneumonia klebsiella Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- FCCBQBZXIAZNIG-LSJOCFKGSA-N Pro-Ala-His Chemical compound C[C@H](NC(=O)[C@@H]1CCCN1)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(O)=O FCCBQBZXIAZNIG-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- IFMDQWDAJUMMJC-DCAQKATOSA-N Pro-Ala-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IFMDQWDAJUMMJC-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- XQLBWXHVZVBNJM-FXQIFTODSA-N Pro-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 XQLBWXHVZVBNJM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HFZNNDWPHBRNPV-KZVJFYERSA-N Pro-Ala-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HFZNNDWPHBRNPV-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- NHDVNAKDACFHPX-GUBZILKMSA-N Pro-Arg-Ala Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NHDVNAKDACFHPX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- IHCXPSYCHXFXKT-DCAQKATOSA-N Pro-Arg-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IHCXPSYCHXFXKT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- KDIIENQUNVNWHR-JYJNAYRXSA-N Pro-Arg-Phe Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O KDIIENQUNVNWHR-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- ICTZKEXYDDZZFP-SRVKXCTJSA-N Pro-Arg-Pro Chemical compound N([C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1 ICTZKEXYDDZZFP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- ZSKJPKFTPQCPIH-RCWTZXSCSA-N Pro-Arg-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZSKJPKFTPQCPIH-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- UTAUEDINXUMHLG-FXQIFTODSA-N Pro-Asp-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 UTAUEDINXUMHLG-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- JARJPEMLQAWNBR-GUBZILKMSA-N Pro-Asp-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JARJPEMLQAWNBR-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KPDRZQUWJKTMBP-DCAQKATOSA-N Pro-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KPDRZQUWJKTMBP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N Pro-Glu-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FRKBNXCFJBPJOL-GUBZILKMSA-N Pro-Glu-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FRKBNXCFJBPJOL-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- NMELOOXSGDRBRU-YUMQZZPRSA-N Pro-Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 NMELOOXSGDRBRU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- VPFGPKIWSDVTOY-SRVKXCTJSA-N Pro-Glu-His Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O VPFGPKIWSDVTOY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HAAQQNHQZBOWFO-LURJTMIESA-N Pro-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 HAAQQNHQZBOWFO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- WSRWHZRUOCACLJ-UWVGGRQHSA-N Pro-Gly-His Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CN=CN1 WSRWHZRUOCACLJ-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- AFXCXDQNRXTSBD-FJXKBIBVSA-N Pro-Gly-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O AFXCXDQNRXTSBD-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- QEWBZBLXDKIQPS-STQMWFEESA-N Pro-Gly-Tyr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O QEWBZBLXDKIQPS-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- AUQGUYPHJSMAKI-CYDGBPFRSA-N Pro-Ile-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 AUQGUYPHJSMAKI-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- VTFXTWDFPTWNJY-RHYQMDGZSA-N Pro-Leu-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O VTFXTWDFPTWNJY-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- RMODQFBNDDENCP-IHRRRGAJSA-N Pro-Lys-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RMODQFBNDDENCP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- ULWBBFKQBDNGOY-RWMBFGLXSA-N Pro-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O ULWBBFKQBDNGOY-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 1
- HBBBLSVBQGZKOZ-GUBZILKMSA-N Pro-Met-Ala Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HBBBLSVBQGZKOZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- GNADVDLLGVSXLS-ULQDDVLXSA-N Pro-Phe-His Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(O)=O GNADVDLLGVSXLS-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- KDBHVPXBQADZKY-GUBZILKMSA-N Pro-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 KDBHVPXBQADZKY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SXJOPONICMGFCR-DCAQKATOSA-N Pro-Ser-Lys Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O SXJOPONICMGFCR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- GVUVRRPYYDHHGK-VQVTYTSYSA-N Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 GVUVRRPYYDHHGK-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- KIDXAAQVMNLJFQ-KZVJFYERSA-N Pro-Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](NC(=O)[C@@H]1CCCN1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KIDXAAQVMNLJFQ-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- DCHQYSOGURGJST-FJXKBIBVSA-N Pro-Thr-Gly Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O DCHQYSOGURGJST-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N Pro-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2)O AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N 0.000 description 1
- YHUBAXGAAYULJY-ULQDDVLXSA-N Pro-Tyr-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YHUBAXGAAYULJY-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- QKWYXRPICJEQAJ-KJEVXHAQSA-N Pro-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2)O QKWYXRPICJEQAJ-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- WWXNZNWZNZPDIF-SRVKXCTJSA-N Pro-Val-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 WWXNZNWZNZPDIF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- IMNVAOPEMFDAQD-NHCYSSNCSA-N Pro-Val-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IMNVAOPEMFDAQD-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- KHRLUIPIMIQFGT-AVGNSLFASA-N Pro-Val-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KHRLUIPIMIQFGT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- ZMLRZBWCXPQADC-TUAOUCFPSA-N Pro-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 ZMLRZBWCXPQADC-TUAOUCFPSA-N 0.000 description 1
- YDTUEBLEAVANFH-RCWTZXSCSA-N Pro-Val-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 YDTUEBLEAVANFH-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- FHJQROWZEJFZPO-SRVKXCTJSA-N Pro-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FHJQROWZEJFZPO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010003201 RGH 0205 Proteins 0.000 description 1
- 102100026115 S-adenosylmethionine synthase isoform type-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000015473 Schizothorax griseus Species 0.000 description 1
- 241000311088 Schwanniomyces Species 0.000 description 1
- WTUJZHKANPDPIN-CIUDSAMLSA-N Ser-Ala-Lys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N WTUJZHKANPDPIN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- PZZJMBYSYAKYPK-UWJYBYFXSA-N Ser-Ala-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O PZZJMBYSYAKYPK-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- QGMLKFGTGXWAHF-IHRRRGAJSA-N Ser-Arg-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O QGMLKFGTGXWAHF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- HBOABDXGTMMDSE-GUBZILKMSA-N Ser-Arg-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HBOABDXGTMMDSE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BNFVPSRLHHPQKS-WHFBIAKZSA-N Ser-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O BNFVPSRLHHPQKS-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- VQBCMLMPEWPUTB-ACZMJKKPSA-N Ser-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VQBCMLMPEWPUTB-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- MUARUIBTKQJKFY-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MUARUIBTKQJKFY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N Ser-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- QYSFWUIXDFJUDW-DCAQKATOSA-N Ser-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O QYSFWUIXDFJUDW-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CO VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- MUJQWSAWLLRJCE-KATARQTJSA-N Ser-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MUJQWSAWLLRJCE-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- GZSZPKSBVAOGIE-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GZSZPKSBVAOGIE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- JAWGSPUJAXYXJA-IHRRRGAJSA-N Ser-Phe-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)N)CC1=CC=CC=C1 JAWGSPUJAXYXJA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- XKFJENWJGHMDLI-QWRGUYRKSA-N Ser-Phe-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(O)=O XKFJENWJGHMDLI-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- PJIQEIFXZPCWOJ-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PJIQEIFXZPCWOJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- VFWQQZMRKFOGLE-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Cys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O VFWQQZMRKFOGLE-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N Ser-Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- XJDMUQCLVSCRSJ-VZFHVOOUSA-N Ser-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XJDMUQCLVSCRSJ-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- RXUOAOOZIWABBW-XGEHTFHBSA-N Ser-Thr-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N RXUOAOOZIWABBW-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- WUXCHQZLUHBSDJ-LKXGYXEUSA-N Ser-Thr-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WUXCHQZLUHBSDJ-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- VLMIUSLQONKLDV-HEIBUPTGSA-N Ser-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O VLMIUSLQONKLDV-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 1
- KIEIJCFVGZCUAS-MELADBBJSA-N Ser-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O KIEIJCFVGZCUAS-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N Ser-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000269400 Sirenidae Species 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010063483 Streptogramin Group A Proteins 0.000 description 1
- 108010063479 Streptogramin Group B Proteins 0.000 description 1
- 241000187432 Streptomyces coelicolor Species 0.000 description 1
- 241000936762 Streptomyces daghestanicus Species 0.000 description 1
- 241000187389 Streptomyces lavendulae Species 0.000 description 1
- 101000702699 Streptomyces pristinaespiralis NADH:riboflavin 5'-phosphate oxidoreductase Proteins 0.000 description 1
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N Sulfisoxazole Chemical compound CC1=NOC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=C1C NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MQCPGOZXFSYJPS-KZVJFYERSA-N Thr-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O MQCPGOZXFSYJPS-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- DWYAUVCQDTZIJI-VZFHVOOUSA-N Thr-Ala-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWYAUVCQDTZIJI-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- CAGTXGDOIFXLPC-KZVJFYERSA-N Thr-Arg-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CCCN=C(N)N CAGTXGDOIFXLPC-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- GLQFKOVWXPPFTP-VEVYYDQMSA-N Thr-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GLQFKOVWXPPFTP-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- PKXHGEXFMIZSER-QTKMDUPCSA-N Thr-Arg-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N)O PKXHGEXFMIZSER-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- JNQZPAWOPBZGIX-RCWTZXSCSA-N Thr-Arg-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)CCCN=C(N)N JNQZPAWOPBZGIX-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- VXMHQKHDKCATDV-VEVYYDQMSA-N Thr-Asp-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O VXMHQKHDKCATDV-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- MFEBUIFJVPNZLO-OLHMAJIHSA-N Thr-Asp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O MFEBUIFJVPNZLO-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 1
- GKMYGVQDGVYCPC-IUKAMOBKSA-N Thr-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N GKMYGVQDGVYCPC-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- ZUUDNCOCILSYAM-KKHAAJSZSA-N Thr-Asp-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ZUUDNCOCILSYAM-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- ASJDFGOPDCVXTG-KATARQTJSA-N Thr-Cys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ASJDFGOPDCVXTG-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- SHOMROOOQBDGRL-JHEQGTHGSA-N Thr-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O SHOMROOOQBDGRL-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- WDFPMSHYMRBLKM-NKIYYHGXSA-N Thr-Glu-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N)O WDFPMSHYMRBLKM-NKIYYHGXSA-N 0.000 description 1
- OQCXTUQTKQFDCX-HTUGSXCWSA-N Thr-Glu-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N)O OQCXTUQTKQFDCX-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 1
- SLUWOCTZVGMURC-BFHQHQDPSA-N Thr-Gly-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SLUWOCTZVGMURC-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- AQAMPXBRJJWPNI-JHEQGTHGSA-N Thr-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AQAMPXBRJJWPNI-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- JKGGPMOUIAAJAA-YEPSODPASA-N Thr-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O JKGGPMOUIAAJAA-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- FDALPRWYVKJCLL-PMVVWTBXSA-N Thr-His-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(O)=O FDALPRWYVKJCLL-PMVVWTBXSA-N 0.000 description 1
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- AMXMBCAXAZUCFA-RHYQMDGZSA-N Thr-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AMXMBCAXAZUCFA-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- MEJHFIOYJHTWMK-VOAKCMCISA-N Thr-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O MEJHFIOYJHTWMK-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- VRUFCJZQDACGLH-UVOCVTCTSA-N Thr-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O VRUFCJZQDACGLH-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- KRDSCBLRHORMRK-JXUBOQSCSA-N Thr-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KRDSCBLRHORMRK-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- WRQLCVIALDUQEQ-UNQGMJICSA-N Thr-Phe-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O WRQLCVIALDUQEQ-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- IWAVRIPRTCJAQO-HSHDSVGOSA-N Thr-Pro-Trp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O IWAVRIPRTCJAQO-HSHDSVGOSA-N 0.000 description 1
- PRTHQBSMXILLPC-XGEHTFHBSA-N Thr-Ser-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O PRTHQBSMXILLPC-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- NDZYTIMDOZMECO-SHGPDSBTSA-N Thr-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NDZYTIMDOZMECO-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 1
- CSNBWOJOEOPYIJ-UVOCVTCTSA-N Thr-Thr-Lys Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O CSNBWOJOEOPYIJ-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- BEZTUFWTPVOROW-KJEVXHAQSA-N Thr-Tyr-Arg Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N)O BEZTUFWTPVOROW-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- OGOYMQWIWHGTGH-KZVJFYERSA-N Thr-Val-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OGOYMQWIWHGTGH-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- FYBFTPLPAXZBOY-KKHAAJSZSA-N Thr-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYBFTPLPAXZBOY-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- QNXZCKMXHPULME-ZNSHCXBVSA-N Thr-Val-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O QNXZCKMXHPULME-ZNSHCXBVSA-N 0.000 description 1
- VYVBSMCZNHOZGD-RCWTZXSCSA-N Thr-Val-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VYVBSMCZNHOZGD-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 240000002657 Thymus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000007303 Thymus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- BRBCKMMXKONBAA-KWBADKCTSA-N Trp-Ala-Ala Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)=CNC2=C1 BRBCKMMXKONBAA-KWBADKCTSA-N 0.000 description 1
- CXUFDWZBHKUGKK-CABZTGNLSA-N Trp-Ala-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 CXUFDWZBHKUGKK-CABZTGNLSA-N 0.000 description 1
- SCQBNMKLZVCXNX-ZFWWWQNUSA-N Trp-Arg-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(=O)O)N SCQBNMKLZVCXNX-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- XZSJDSBPEJBEFZ-QRTARXTBSA-N Trp-Asn-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O XZSJDSBPEJBEFZ-QRTARXTBSA-N 0.000 description 1
- LHHDBONOFZDWMW-AAEUAGOBSA-N Trp-Asp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)NCC(=O)O)N LHHDBONOFZDWMW-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 1
- GTNCSPKYWCJZAC-XIRDDKMYSA-N Trp-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N GTNCSPKYWCJZAC-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- LTLBNCDNXQCOLB-UBHSHLNASA-N Trp-Asp-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)=CNC2=C1 LTLBNCDNXQCOLB-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- KVMZNMYZCKORIG-UBHSHLNASA-N Trp-Cys-Asp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N KVMZNMYZCKORIG-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- UDCHKDYNMRJYMI-QEJZJMRPSA-N Trp-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UDCHKDYNMRJYMI-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- FEZASNVQLJQBHW-CABZTGNLSA-N Trp-Gly-Ala Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)=CNC2=C1 FEZASNVQLJQBHW-CABZTGNLSA-N 0.000 description 1
- DZIKVMCFXIIETR-JSGCOSHPSA-N Trp-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DZIKVMCFXIIETR-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- OAZLRFLMQASGNW-PMVMPFDFSA-N Trp-His-Tyr Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC3=CN=CN3)C(=O)N[C@@H](CC4=CC=C(C=C4)O)C(=O)O)N OAZLRFLMQASGNW-PMVMPFDFSA-N 0.000 description 1
- CXPJPTFWKXNDKV-NUTKFTJISA-N Trp-Leu-Ala Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)=CNC2=C1 CXPJPTFWKXNDKV-NUTKFTJISA-N 0.000 description 1
- BVZABQIRMYTKCF-JSGCOSHPSA-N Trp-Met Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O)=CNC2=C1 BVZABQIRMYTKCF-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- UEFHVUQBYNRNQC-SFJXLCSZSA-N Trp-Phe-Thr Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CC=CC=C1 UEFHVUQBYNRNQC-SFJXLCSZSA-N 0.000 description 1
- VDCGPCSLAJAKBB-XIRDDKMYSA-N Trp-Ser-His Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC3=CN=CN3)C(=O)O)N VDCGPCSLAJAKBB-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- UGFOSENEZHEQKX-PJODQICGSA-N Trp-Val-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UGFOSENEZHEQKX-PJODQICGSA-N 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VCXWRWYFJLXITF-AUTRQRHGSA-N Tyr-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 VCXWRWYFJLXITF-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- KSVMDJJCYKIXTK-IGNZVWTISA-N Tyr-Ala-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 KSVMDJJCYKIXTK-IGNZVWTISA-N 0.000 description 1
- HSVPZJLMPLMPOX-BPNCWPANSA-N Tyr-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HSVPZJLMPLMPOX-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- ADBDQGBDNUTRDB-ULQDDVLXSA-N Tyr-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ADBDQGBDNUTRDB-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- PEVVXUGSAKEPEN-AVGNSLFASA-N Tyr-Asn-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PEVVXUGSAKEPEN-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- AYHSJESDFKREAR-KKUMJFAQSA-N Tyr-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AYHSJESDFKREAR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- QNJYPWZACBACER-KKUMJFAQSA-N Tyr-Asp-His Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N)O QNJYPWZACBACER-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- VFJIWSJKZJTQII-SRVKXCTJSA-N Tyr-Asp-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VFJIWSJKZJTQII-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HVHJYXDXRIWELT-RYUDHWBXSA-N Tyr-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O HVHJYXDXRIWELT-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- PMDWYLVWHRTJIW-STQMWFEESA-N Tyr-Gly-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PMDWYLVWHRTJIW-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- GIOBXJSONRQHKQ-RYUDHWBXSA-N Tyr-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GIOBXJSONRQHKQ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- IJUTXXAXQODRMW-KBPBESRZSA-N Tyr-Gly-His Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N)O IJUTXXAXQODRMW-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- RIFVTNDKUMSSMN-ULQDDVLXSA-N Tyr-His-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@@H](N)Cc1ccc(O)cc1)C(O)=O RIFVTNDKUMSSMN-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- GULIUBBXCYPDJU-CQDKDKBSSA-N Tyr-Leu-Ala Chemical compound [O-]C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 GULIUBBXCYPDJU-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- ARJASMXQBRNAGI-YESZJQIVSA-N Tyr-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N ARJASMXQBRNAGI-YESZJQIVSA-N 0.000 description 1
- FMXFHNSFABRVFZ-BZSNNMDCSA-N Tyr-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FMXFHNSFABRVFZ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- XJPXTYLVMUZGNW-IHRRRGAJSA-N Tyr-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O XJPXTYLVMUZGNW-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- YFOCMOVJBQDBCE-NRPADANISA-N Val-Ala-Glu Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N YFOCMOVJBQDBCE-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- ASQFIHTXXMFENG-XPUUQOCRSA-N Val-Ala-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O ASQFIHTXXMFENG-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- RUCNAYOMFXRIKJ-DCAQKATOSA-N Val-Ala-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN RUCNAYOMFXRIKJ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ZLFHAAGHGQBQQN-GUBZILKMSA-N Val-Ala-Pro Natural products CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O ZLFHAAGHGQBQQN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SLLKXDSRVAOREO-KZVJFYERSA-N Val-Ala-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O SLLKXDSRVAOREO-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- LABUITCFCAABSV-BPNCWPANSA-N Val-Ala-Tyr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LABUITCFCAABSV-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- LABUITCFCAABSV-UHFFFAOYSA-N Val-Ala-Tyr Natural products CC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LABUITCFCAABSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COYSIHFOCOMGCF-UHFFFAOYSA-N Val-Arg-Gly Natural products CC(C)C(N)C(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CCCN=C(N)N COYSIHFOCOMGCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LNYOXPDEIZJDEI-NHCYSSNCSA-N Val-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)N LNYOXPDEIZJDEI-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- ISERLACIZUGCDX-ZKWXMUAHSA-N Val-Asp-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N ISERLACIZUGCDX-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- QHDXUYOYTPWCSK-RCOVLWMOSA-N Val-Asp-Gly Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)NCC(=O)O)N QHDXUYOYTPWCSK-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- TZVUSFMQWPWHON-NHCYSSNCSA-N Val-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N TZVUSFMQWPWHON-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- SRWWRLKBEJZFPW-IHRRRGAJSA-N Val-Cys-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N SRWWRLKBEJZFPW-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- VVZDBPBZHLQPPB-XVKPBYJWSA-N Val-Glu-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O VVZDBPBZHLQPPB-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- XWYUBUYQMOUFRQ-IFFSRLJSSA-N Val-Glu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O XWYUBUYQMOUFRQ-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 1
- JTWIMNMUYLQNPI-WPRPVWTQSA-N Val-Gly-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N JTWIMNMUYLQNPI-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- PIFJAFRUVWZRKR-QMMMGPOBSA-N Val-Gly-Gly Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)NCC([O-])=O PIFJAFRUVWZRKR-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- GMOLURHJBLOBFW-ONGXEEELSA-N Val-Gly-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N GMOLURHJBLOBFW-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- LAYSXAOGWHKNED-XPUUQOCRSA-N Val-Gly-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LAYSXAOGWHKNED-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- XXROXFHCMVXETG-UWVGGRQHSA-N Val-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O XXROXFHCMVXETG-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- BNQVUHQWZGTIBX-IUCAKERBSA-N Val-His Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CN=CN1 BNQVUHQWZGTIBX-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- PTFPUAXGIKTVNN-ONGXEEELSA-N Val-His-Gly Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)NCC(=O)O)N PTFPUAXGIKTVNN-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- YTUABZMPYKCWCQ-XQQFMLRXSA-N Val-His-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N YTUABZMPYKCWCQ-XQQFMLRXSA-N 0.000 description 1
- OTJMMKPMLUNTQT-AVGNSLFASA-N Val-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N OTJMMKPMLUNTQT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- AGXGCFSECFQMKB-NHCYSSNCSA-N Val-Leu-Asp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N AGXGCFSECFQMKB-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- LYERIXUFCYVFFX-GVXVVHGQSA-N Val-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N LYERIXUFCYVFFX-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- ZHQWPWQNVRCXAX-XQQFMLRXSA-N Val-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N ZHQWPWQNVRCXAX-XQQFMLRXSA-N 0.000 description 1
- JVGHIFMSFBZDHH-WPRPVWTQSA-N Val-Met-Gly Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)O)N JVGHIFMSFBZDHH-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- WSUWDIVCPOJFCX-TUAOUCFPSA-N Val-Met-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N WSUWDIVCPOJFCX-TUAOUCFPSA-N 0.000 description 1
- YDVDTCJGBBJGRT-GUBZILKMSA-N Val-Met-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N YDVDTCJGBBJGRT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- QPPZEDOTPZOSEC-RCWTZXSCSA-N Val-Met-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O QPPZEDOTPZOSEC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- LJSZPMSUYKKKCP-UBHSHLNASA-N Val-Phe-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 LJSZPMSUYKKKCP-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- WMRWZYSRQUORHJ-YDHLFZDLSA-N Val-Phe-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N WMRWZYSRQUORHJ-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- ZXYPHBKIZLAQTL-QXEWZRGKSA-N Val-Pro-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N ZXYPHBKIZLAQTL-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- RYQUMYBMOJYYDK-NHCYSSNCSA-N Val-Pro-Glu Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N RYQUMYBMOJYYDK-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- NSUUANXHLKKHQB-BZSNNMDCSA-N Val-Pro-Trp Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC2=CC=CC=C12 NSUUANXHLKKHQB-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- VIKZGAUAKQZDOF-NRPADANISA-N Val-Ser-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O VIKZGAUAKQZDOF-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- PZTZYZUTCPZWJH-FXQIFTODSA-N Val-Ser-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N PZTZYZUTCPZWJH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- NZYNRRGJJVSSTJ-GUBZILKMSA-N Val-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NZYNRRGJJVSSTJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- GVRKWABULJAONN-VQVTYTSYSA-N Val-Thr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GVRKWABULJAONN-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- UVHFONIHVHLDDQ-IFFSRLJSSA-N Val-Thr-Glu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O UVHFONIHVHLDDQ-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 1
- DVLWZWNAQUBZBC-ZNSHCXBVSA-N Val-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O DVLWZWNAQUBZBC-ZNSHCXBVSA-N 0.000 description 1
- OFTXTCGQJXTNQS-XGEHTFHBSA-N Val-Thr-Ser Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O OFTXTCGQJXTNQS-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N Val-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- AYHNXCJKBLYVOA-KSZLIROESA-N Val-Trp-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N3CCC[C@@H]3C(=O)O)N AYHNXCJKBLYVOA-KSZLIROESA-N 0.000 description 1
- QPJSIBAOZBVELU-BPNCWPANSA-N Val-Tyr-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N QPJSIBAOZBVELU-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- RTJPAGFXOWEBAI-SRVKXCTJSA-N Val-Val-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N RTJPAGFXOWEBAI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- ZLNYBMWGPOKSLW-LSJOCFKGSA-N Val-Val-Asp Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZLNYBMWGPOKSLW-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- AEFJNECXZCODJM-UWVGGRQHSA-N Val-Val-Gly Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC([O-])=O AEFJNECXZCODJM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- YGXVNFMRNNRJJE-UHFFFAOYSA-N [Na].CCCCCCC Chemical compound [Na].CCCCCCC YGXVNFMRNNRJJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N ac1ldcw0 Chemical compound Cl.C1CN(C)CCN1C1=C(F)C=C2C(=O)C(C(O)=O)=CN3CCSC1=C32 LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- VTIKDEXOEJDMJP-WYUUTHIRSA-N actinorhodin Chemical compound C([C@@H](CC(O)=O)O[C@@H]1C)C(C(C2=C(O)C=3)=O)=C1C(=O)C2=C(O)C=3C(C(=C1C2=O)O)=CC(O)=C1C(=O)C1=C2[C@@H](C)O[C@H](CC(O)=O)C1 VTIKDEXOEJDMJP-WYUUTHIRSA-N 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 229960001456 adenosine triphosphate Drugs 0.000 description 1
- 230000006154 adenylylation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 108010084217 alanyl-glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010011559 alanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 125000000266 alpha-aminoacyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 229960004050 aminobenzoic acid Drugs 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 101150073130 ampR gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- XZNUGFQTQHRASN-XQENGBIVSA-N apramycin Chemical compound O([C@H]1O[C@@H]2[C@H](O)[C@@H]([C@H](O[C@H]2C[C@H]1N)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](N)[C@@H](CO)O1)O)NC)[C@@H]1[C@@H](N)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O XZNUGFQTQHRASN-XQENGBIVSA-N 0.000 description 1
- 229950006334 apramycin Drugs 0.000 description 1
- 108010009111 arginyl-glycyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010069926 arginyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010066119 arginyl-leucyl-aspartyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010036533 arginylvaline Proteins 0.000 description 1
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019416 cholic acid Nutrition 0.000 description 1
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 description 1
- 229960002471 cholic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 230000014107 chromosome localization Effects 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 210000001520 comb Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 244000278127 dammar Species 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010054813 diprotin B Proteins 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 208000018459 dissociative disease Diseases 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000010435 extracellular transport Effects 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108010080575 glutamyl-aspartyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010042598 glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010008237 glutamyl-valyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010073628 glutamyl-valyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- HPAIKDPJURGQLN-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-histidyl-L-phenylalanine Natural products C=1C=CC=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)CN)CC1=CN=CN1 HPAIKDPJURGQLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010075431 glycyl-alanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010027668 glycyl-alanyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010062266 glycyl-glycyl-argininal Proteins 0.000 description 1
- 108010051307 glycyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010033719 glycyl-histidyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010050475 glycyl-leucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010079413 glycyl-prolyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010048994 glycyl-tyrosyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- IUAYMJGZBVDSGL-XNNAEKOYSA-N gramicidin S Chemical compound C([C@@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCN)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1)C(C)C)=O)CC(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 IUAYMJGZBVDSGL-XNNAEKOYSA-N 0.000 description 1
- ZWCXYZRRTRDGQE-SORVKSEFSA-N gramicidina Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC=O)C(C)C)CC(C)C)C(=O)NCCO)=CNC2=C1 ZWCXYZRRTRDGQE-SORVKSEFSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 108010051673 leucyl-glycyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 150000007931 macrolactones Chemical class 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041033 macrolides Drugs 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010005942 methionylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010068488 methionylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- NVLSIZITFJRWPY-ONEGZZNKSA-N n,n-dimethyl-4-[(e)-2-(4-nitrophenyl)ethenyl]aniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1\C=C\C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 NVLSIZITFJRWPY-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108010025993 neoviridogriseins Proteins 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 108010082795 phenylalanyl-arginyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 108010070409 phenylalanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010018625 phenylalanylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- 108010083476 phenylalanyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 1
- 229940081066 picolinic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 101150059159 proA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 108010020755 prolyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010007513 prolyl-glycyl-prolyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108700042769 prolyl-leucyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010093296 prolyl-prolyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 108010029895 rubimetide Proteins 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- UOENJXXSKABLJL-UHFFFAOYSA-M sodium;8-[(2-hydroxybenzoyl)amino]octanoate Chemical compound [Na+].OC1=CC=CC=C1C(=O)NCCCCCCCC([O-])=O UOENJXXSKABLJL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N sulfanilamide Chemical compound NC1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 229940040944 tetracyclines Drugs 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108010029384 tryptophyl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 108010084932 tryptophyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010072644 valyl-alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010009962 valyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
- C07K5/06182—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and Pristinamycin II; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
1 : 117674
Polypeptidit, jotka liittyvät streptogramllnlen biosynteesiin, näitä polypeptidejä koodittavat nukleotidisekvenssit, ja niiden käyttö 5 Esillä oleva keksintö koskee uusia polypeptidejä, jotka liittyvät streptogramiinien biosynteesiin, ja käsittää samoin streptogramiinien rakenneosien A ja B biosyn-teesigeenien eristämisen ja identifikaation, näiden geenien ilmentämisen tuotantotasojen lisäämiseksi ja niiden 10 käytön salvattujen mutanttien rakentamiseksi, joka voi johtaa uusien antibioottien tai streptogramiinien johdan-naismuotojen synteesiin.
Streptogramiinit muodostavat homogeenisen ryhmän antibiootteja, jotka muodostuvat kahden tyyppisten, ke-15 miallisesti erilaisten molekyylien yhdistelmästä; yhtäältä polytyydyttymättömistä makrolaktoneista (ryhmän A rakenneosat, jotka kaksi rakenne-esimerkkiä esitetään kuviossa 1) ja toisaalta depsipeptideistä (ryhmän B rakenneosat, joista kolme rakenne-esimerkkiä esitetään kuvios-20 sa 2). Tämä ryhmä käsittää lukuisia antibiootteja (vrt. taulukko 1 ja kuvio 3), jotka tunnetaan eri nimillä alku-peränsä funktiona, joista mainittakoon pristinamysiinit, • · .···. mikamysiinit, virginiamysiinit (katsauksen osalta katso
Cocito 1979, 1983).
*· 1 ' ****, 25 Rakenneosilla A ja B on synergistinen bakteerivas- , , täinen aktiivisuus, joka voi olla aina 100 kertaa erillis- • 1 · •1j 1 ten rakenneosien aktiivisuus ja joka vastoin kummankin * 1 1 *.1 1 rakenneosan aktiivisuutta on bakterisidinen (Cocito 1979).
Tämä aktiivisuus on erityisemmin tehokas vastaan gram-po-30 sitiivisia bakteereja, kuten stafylokokit ja streptokokit ;1 ; (Cocito 1979, Videau 1982). Rakenneosat A ja B inhiboivat proteiinisynteesin kiinnittymällä ribosomin 50S-alayksik- • · **’. köön (Cocito 1979; katsauksen osalta katso Di Giambattista et ai., 1989).
• · · ··· • · · n 2 117674
Streptogramiineja tuottavat oleellisesti Actinomy-cestesit, joista lukuisat ovat Streptomycetestejä ja esitetään taulukossa 1. Lisäksi streptogramiineja syntetisoivat myös eukaryootit, kuten Micromonospora, joka synteti-5 soi vernamysiinejä. Actinomecetesit muodostavat hyvin mielenkiintoisen mikro-organismiryhmän niiden tuottamien sekundaaristen metaboliittien merkittävän määrän johdosta, joista lukuisat ovat antibiootteja (β-laktaamit, tetrasyk-liinit, makrolidit, aminoglykosidit, polyasetaatit jne.)» 10 herbisidejä, syöpävastaisia aineita, sienivastaisia aineita, immuunisäätelijöitä, entsyymi-inhibiittoreita. Lukuisia biosynteesireittejä, jotka koskevat antibiootteja, jotka kuuluvat eri luokkiin, sekä muita sekundaarisia me-taboliitteja, kuten pigmentit (katsauksen osalta, Chater 15 1990), on tähän päivään mennessä jo tutkittu Actinomy- cesteseillä. Tämän bakteeriryhmän tärkeä näkökohta on, että geenit, jotka liittyvät samaan biosynteesireittiin, rakennegeenit, mutta samoin yksi tai useampi resistenssi-geeni ja yksi tai useampi säätelygeeni, ovat ryhmittyneet 20 fysikaalisesti kromosomiin muodostaen rykelmiä, jotka voivat olla kooltaan aina 100 ke (Hopwood et ai, 1986a,
Hopwood et ai. 1986b, Haliman et ai. 1988, Anzai et ai.
• · .···. 1987, Ohnuki et ai. 1985). Tähän päivään mennessä yksikään * · ^ esimerkki ei ole ilmennyt vastustamaan tätä havaintoa.
25 Tällainen rakenneorganisaatio on hyvin kiinnostava biosyn- • · . . teesigeenien kloonausstrategioiden kehittämisessä. Itse * · · *;;t* asiassa on mahdollista lähtien yhdestä ainoasta, edeltä- * * * *·' päin eri tekniikoilla kloonatusta geenistä, biosynteesi-, resistenssi- tai säätelygeenistä, kävellä pitkin kromoso- ·,·.· 30 mia ja eristää täten biosynteesin geenirykelmä kokonaisuu- • * * : : dessaan.
* · · .···. Streptogramiinien kummankin rakenneosan biosyntee- * * ***. sireittien tuntemus on vain hyvin osittainen tällä hetkel- * · . lä, mutta kunkin molekyylin eri osien alkuperä on iden- 35 tifioitu radioaktiivisesti leimaamalla (Kingston et ai.
• * · # · • · -¾ 117674 3 1983). Täten tyypin A rakenneosat ovat muodostuneet kahdesta alueesta, jotka ovat peräisin asetaattien ja lukuisten aminohappojen, kuten esimerkiksi seriini, glysiini, kondensaatiosta. Mitä tulee tyypin B rakenneosiin, tut-5 kimukset ovat osoittaneet, että kaikki peptidiketjussa esiintyvät aminohapot ovat peräisin luonnollisista aminohapoista (Hook ja Vining 1973). Kuitenkaan yhtäkään näihin reitteihin liittyvää polypeptidiä ei ole puhdistettu riittävänä määränä tähän mennessä, jotta molekyylikarakteri-10 sointi olisi mahdollinen, eikä yhtäkään biosynteesigeeniä ole kuvattu. Tyypin B rakenneosien biosynteesiprosessissa voidaan erottaa kaksi osaa: a) Makrosyklin prekursorien tai niiden analogien synteesi: 3-hydroksipikoliinihappo, L-2-aminovoihappo, 15 p-dimetyyliamino-L-fenyylialaniini, 4-okso-L-pipekoolihap- po, L-fenyyliglysiini.
2) Makrosyklin muodostaminen edellä mainituista prekursoreista, L-treoniinista ja L-proliinista, tai niiden analogeista, modifioiden mahdollisesti näitä prekurso-20 reita tai peptidi-N-metylaatio.
Tähän päivään mennessä ainoastaan tyypin B rakenne- I
•V. osien makrosyklin prekursorien todennäköinen metabolinen • t' .···. alkuperä on määritetty tutkimuksilla, joissa käytetään 11 · ,·, leimattuja isotooppeja (Reed et ai. 1986, Molinero et ai♦ 25 1989, Reed et ai. 1989).
• · . . Esillä oleva keksintö on seurausta polypeptidien * · * - puhdistuksesta, jotka osallistuvat streptogramiinien bio- t · · *·* synteesiin, sekä geenien kloonauksesta, joiden tuote osal listuu streptogramiinien biosynteesiin. Huomattakoon, että ·,·.· 30 ilmaisu streptogramiinien biosynteesi käsittää säätelygee- • · * nit ja geenit, jotka tuottavat resistenssin tuottajamikro- .···. organismeille. Esillä oleva keksintö tekee täten mahdolli- ^ * * seksi näiden metaboliittien tuotantotasojen nostamisen • f . yhdistelmä-DNA-tekniikoiden johdosta. Esillä olevan kek- # 35 sinnön toinen kiinnostava näkökohta johtuu mahdollisuudes- # • * t« f 4 117674 ta, rakentamalla tämän biosynteesin eri valheissa salvattuja mutantteja, tuottaa kummankin kahden rakenneosan synteesin välituotteita. Nämä välituotteet voivat toimia substraatteina uusille modifikaatioille, kemiallisesti, 5 biokemiallisesti, entsymaattisesti tai mikrobiologisesti.
Samoin biosynteesigeenien eristäminen tekee mahdolliseksi geenejä tuottajakantojen välillä siirtelemällä valmistaa hybrldiantibiootteja, joilla on kiinnostavia farmakologisia ominaisuuksia (Hopwood et ai. 1985a, Hopwood et ai.
10 1985b, Hutchinson et ai. 1989). Esillä olevan keksinnön 0 toinen mielenkiintoinen näkökohta perustuu siihen, että se suo streptogramiineiksi luokiteltujen metaboliittien bio-synteesireittien paremman tuntemuksen, itse asiassa keksintö tekee mahdolliseksi rakentaa bakteeri- tai sienikan-15 toja, joissa ilmennetään sopivien ilmentämissignaalien kontrollissa yksi tai useampi proteiini, joka osallistuu streptogramiinien biosynteesiin. Tällaisia kantoja voidaan s- sitten käyttää biokonversioiden suorittamiseksi. Nämä bio-konversiot voidaan suorittaa joko kokonaisten solujen 20 avulla tai mainittujen solujen soluvapaiden uutteiden % avulla. Nämä biokonversiot voivat mahdollistaa streptogra-miinin muuttamisen johdannaismuotoon jonkin biosynteesi-
II
.···. reitin entsyymillä. Esimerkiksi pristinamysiini IIB voi- ♦ · daan tällä tavalla muuttaa pristinamysiiniksi IIA. Saman- * " 25 kaltaista järkeilyä voidaan soveltaa mihin tahansa biosyn- • » · t · , , teesivälituotteeseen. ' l • · · :·ί ! Keksinnön ensimmäinen kohde on siten nukleotidisek- • * · *.* * venssi, joka koodittaa polypeptidiä, joka liittyy strepto gramiinien biosynteesiin.
i.j.i 30 Tarkemmin ottaen useita geenejä, joiden tuote : : osallistuu streptogramiinien biosynteesiin, on eristetty .···. Streptomyces pristinaespiralis -lajista. Koska tämän kan- * · ***. nan tuottamia streptogramiineja kutsutaan yleisemmin ni- • · . mellä pristinamysiinit (vrt. taulukko 1), seuraavassa vii- ϊ#·#ί 35 tataan tietyissä tapauksissa pristinamysiinien biosyntee- • ••Il * · 117674 5 sigeeneihin. Mutta selvää on, että saadut tulokset koskevat kaikkia streptogramiineja. Pristinamysiinit I ja II vastaavat vastaavasti streptogramiinien rakenneosia B ja A. Pristinamysiinien II ryhmän ja pristinamysiinien I ryh-5 män molekyylit merkitsevät siten seuraavassa streptogramiinien rakenneosia A ja vastaavasti B.
Esillä oleva keksintö kuvaa erityisesti geenien snaA, snaB, snaC, snaD, papA, papM, samS, snbA, snbC, snbD, snbE ja snbR eristämistä ja karakterisointia. Nämä 10 geenit eristettiin pristinaespiralis -genomi-DNA-pan-kista. Tämä pankki saatiin pilkkomalla osittain pris-tinaespiraliksen genomi-DNA restriktioentsyymillä Sau3A.
Suuria DNA-fragmentteja, noin 40 - 50 ke, kloonattiin kos-midiin pHC79 (Hohn, B., ja Collins, J.F., 1980). Kapsidaa-15 tion in vitro jälkeen transfektoitiin E^_ coli -kannat f HB101 (Boyer ja Roulland-Dussoix, 1969) ja DH1 (Low, 1968). pristinaespiralis -DNA-pankki on siten kahdessa 4 eri E^_ coli -kannassa.
Geenit snaA, snaB ja samS (jota aluksi kutsuttiin 20 snaC:ksi) esiintyvät kosmidissa pIBVl (kuvio 4). Geenien | snaA ja snaB tuote, joka vastaa polypeptidejä SnaA ja |V. SnaB, osallistuu pristinamysiinien rakenneosan II biosyn- • · ,··1, teesin viimeiseen vaiheeseen (pristinamysiinin IIB konver- • · · ,·, sio pristinamysiiniksi IIA), joka vastaa D-proliinin 2,3- ["1. 25 sidoksen hapettumista. Nämä kaksi polypeptidiä muodostavat * 1 . . pristinamysiini IIA -syntaasin kaksi alayksikköä, joiden 111 **·/ puhdistamista kuvataan esillä olevassa keksinnössä. Geenin 1 · · '·1 samS tuote osallistuisi SAM:in synteesiin (metyyliryhmä- luovuttaja) lähtien ATP:stä ja metioniinista. Useimpien 30 streptogramiinien rakenneosa A on ite asiassa metyloitu *·· C-4:ssä (kuvo 1), ja on kuvattu (Kingston et ai., 1983), ,1··, että tämä metyyli on peräisin metioniinin metyylistä, hy- $ * « vin todennäköisesti metylointireaktion SAM:in kanssa vä- £ * t . lityksellä. samS-geeni koodittaisi siten SAM-syntaasia * · 1 * · · * 1 1 · · 1 · * · 117674 6 (SamS; EC. 2.5.1.6), joka on spesifinen pristinamysiinien biosynteesireitille.
Geenit snbA, snbR, papA ja papM esiintyvät kosmi-dissa pIBV2 (kuvio 5). Geeni snbA vastaa esimerkissä 5 5 esitettyjen biokemiallisten tutkimusten mukaan pristinamy siinien I synteesin ensimmäistä vaihetta. Kyseessä on ketjun ensimmäisen hapon, 3-hydroksipikoliinihapon, aktivaatio adenylaatiolla. Geeni snbR voisi osallistua pristinamysiinien I ryhmän (jopa pristinamysiinien II) molekyylien 10 kuljetukseen solun ulkopuolelle synteesin jälkeen tuottaen siten tuottajakannalle resistenssin tätä rakenneosaa vastaan. Geeni papA vastaa sekvenssianalyysin (esimerkki 8.8) ja tässä geenissä häirityn mutantin tutkimuksen (esimerkki 9.3) perusteella para-aminofenyylialaniinin biosynteesi-15 geeniä korismaatista lähtien. Para-aminofenyylialaniini dimetyloidaan sitten geenin papM tuotteella, joka on N-me-tyylitransferääsi, jota kuvataan esillä olevassa keksinnössä, paradimetyyliaminofenyylialaniinin muodostamiseksi, joka sisällytetään sitten pristinamysiiniin IA. Geenit 20 papA ja papM osallistuvat siten pristinamysiinin IA yhden prekursorin synteesiin.
Geenit snaA, snaD, snbC, snbD ja snbE esiintyvät • · \..'4 kosmidissa pIBV3 (kuvio 6), joka on siten kosmidin pIBVl » · *" vieressä, jossa geeni snaA jo esiintyy. Geeni snaD koodit- • J* ............
,,,\ 25 taa sen sekvenssianalyysin (esimerkki 8.9.) ja tässä gee- « * · f * · nissä häirityn mutantin tutkimisen (esimerkki 9.5.) perus- • · • · *
: teella syntaasipeptidiä, joka liittyy pristinamysiinin II
» « · V * biosynteesiin. Geeni snbC, jonka tuotetta kuvataan esillä olevassa keksinnössä, osallistuu treoniini- ja aminovoi- : 30 happotähteiden sisällyttämiseen pristinamysiinin IA pepti- * * · .***: diketjuun. Geeni snbD, jonka tuotetta kuvataan myös esillä
• M
olevassa keksinnössä, liittyy proliini- ja paradimetyyli- • · *·**# aminofenyylialaniinitähteiden sisällyttämiseen pristinamy- • · · · · * siinin IA peptidiketjuun. Se hallitsee myös näiden kahden * 35 tähteen välisen peptidisidoksen N-metylaatiota. Lopuksi · · ····« • * 117674 7 geeni snbE, jonka tuotetta kuvataan myös esillä olevassa keksinnössä, osallistuu kahden viimeisen tähteen sisällyttämiseen pristinamysiiniin IA, nimittäin fenyyliglysiinin ja 4-oksopipekoolihapon.
5 Geeni snaC esiintyy kosmidissa pIBV4 (kuvio 7). Se koodittaa FMN:NADH-oksidoreduktaasia, jota kutsutaan myös FMN-reduktaasiksi, ja jota kuvataan esillä olevassa keksinnössä ja joka tuottaa pristinamysiini HA -syntaasille FMNH2:n lähtien FMNistä ja NADH:sta. Geeni snaC osallistuu 10 siten pristinamysiinin IIA biosynteesiin viimeiseen vaiheeseen.
Nämä eri geenit alakloonattiin lähtien niiden alku-peräkosmidista ja niiden nukleiinihapposekvenssit on määritetty. Geenit snaA, snaB ja samS alakloonattiin 6 ke:n 15 BamHl-BamHI-fragmenttiin, josta osa on sekventoitu (sekvenssi tunnusnro 1). Geeni snbA alakloonattiin 5,5 ke:n EcoRI-Bglll-fragmenttiin, josta osa on sekventoitu (sek- % venssi tunnusnro 5). Geeni snbR alakloonattiin 4,6 ke:n f
Bglll-Bglll-fragmenttiin, josta osa on sekventoitu (sek- r- 20 venssi tunnusnro 6). Osa geenistä papA alakloonattiin 3,4 ke:n XhoI-XhoI-fragmenttiin, josta osa on sekventoitu ·*·*. (sekvenssi tunnusnro 9). Geeni papM alakloonattiin 4,1 • · ,···. ke: n Pstl-Pstl-fragmenttiin, josta osa on sekventointi • · · .·. (sekvenssi tunnusnro 10). Osa geenistä snaD alakloonattiin • - *]"· 25 1,5 ke:n BamHI-SstI-fragmenttiin, josta osa on sekventoitu • · . . (sekvenssi tunnusnro 8). Osa geenistä snbC alakloonattiin • · · ' 6,2 ke:n Sphl-S£hl-fragmenttiin, josta kaksi aluetta on • · · *·* sekventoitu (sekvenssit tunnusnro 11 ja 12). Osa geenistä snbD alakloonattiin 8,4 ke:n SphI-Sphl-fragmenttiin, josta 30 2 aluetta on sekventoitu (sekvenssit tunnusnro 13 ja 14).
« · · !,ttJ Osa geenistä snbE alakloonattiin 6,6 ke:n Sphl-Sphl-frag- ,··*. menttiin, josta 2 aluetta on sekventoitu (sekvenssit tun- s t · nusnro 15 ja 16). Geeni snaC alakloonattiin 4 ke:n BamHI- <& «···* ** « * . BamHI-fragmenttiin, josta osa on sekventoitu (sekvenssi 35 tunnusnro 7).
• '· ..
• · · « · • « ····.·: 117674 8
Yhtäältä geenien snaA, snaB, snaD, samS, snbC, snbD ja snbE likeisyys, kuten myös geenien snbA, snbR, papA ja papM, vahvistaa streptogramiinien rakenneosien A ja B bio-synteesigeenien sijainnin rykelmissä. Lisäksi 4 esillä 5 olevassa keksinnössä kuvattua kosmidia on ryhmittynyt kro- < mosomialueelle, jonka koko arvioidaan 200 ke:ksi sykäys-kenttäelektroforeettisesti, eli 3 %:ksi Streptomyces pris-tinaespiraliksen kokonaisgenomista (7 500 ke) (esimerkki 13). On siten ilmeistä, että esillä olevassa keksinnössä 10 identifioituja geenejä (snaA, snaB, snap, samS, snbC, snbD ja snbE; snbA, snbR, papA ja papM; snaC) ympäröivät alueet sisältävät muita pristinamysiinien biosynteesin rykelmä-geenejä, ja että näitä geenejä voidaan käyttää streptogramiinien muiden biosynteesigeenien paikantamiseksi.
15 Edullisesti keksintö koskee nukleotidisekvenssiä, i joka valitaan seuraavista: (a) kokonaisuudessaan tai osittain geeneistä snaA # (sekvenssi tunnusnro 2), snaB (sekvenssi tunnusnro 3), snaC (sekvenssi tunnusnro 7), snaD (sekvenssi tunnusnro 20 8), papA (sekvenssi tunnusnro 9), papM (sekvenssi tunnus- * nro 10), samS (sekvenssi tunnusnro 4), snbA (sekvenssi
·*·*: tunnusnro 5), snbC (sekvenssi tunnusnro 11 ja 12), snbD
• # .·**. (sekvenssit tunnusnro 13 ja 14), snbE (sekvenssit tunnus- * · · nro 15 ja 16) ja snbR (sekvenssi tunnusnro 6), tttj· 25 (b) geenien (a) viereiset sekvenssit, jotka muodos- • « . . tavat biosynteesirykelmiä ja koodittavat polypeptidejä, i * *".* jotka liittyvät streptogramiinien biosynteesiin, • · · ; *·* (c) sekvenssit, jotka hybridoituvat kokonaisuudes saan tai osittain geeneihin (a) tai (b) ja koodittavat po- Φ *.;.* 30 lypeptidiä, joka liittyy streptogramiinien biosynteesiin, • · · * ϊ ja .*··. (d) sekvenssit, jotka saadaan sekvensseistä (a), i • · titt· (b) ja (c) geneettisen koodin degeneroitumisen vuoksi.
• * . Edelleen edullisemmin keksintö koskee nukleotidi- :.j.i 35 sekvenssejä, joita edustavat geenit snaA (sekvenssi tun- • · ' ' 9 ' 117674 nusnro 2), snaB (sekvenssi tunnusnro 3), snaC (sekvenssi tunnusnro 7), snaD (sekvenssi tunnusnro 8), papA (sekvenssi tunnusnro 9), papM (sekvenssi tunnusnro 10), samS (sekvenssi tunnusnro 4), snbA (sekvenssi tunnusnro 5), snbC ? 5 (sekvenssit tunnusnro 11 ja 12), snbD (sekvenssit tunnusnro 13 ja 14), snbE (sekvenssit tunnusnro 15 ja 16) ja snbR (sekvenssi tunnusnro 6).
Keksinnön toinen kohde on mikä tahansa yhdistelmä-DNA, joka käsittää streptogramiinien biosynteesigeenin.
10 Edullisemmin kyseessä on yhdistelmä-DNA, joka käsittää kokonaisuudessaan tai osittain kosmidit pIBVl, pIBV2, pIBV3 tai pIBV4 kuvioissa 4-7 esitetyn mukaisesti, tai kokonaisuudessaan tai osittain sekvenssejä, jotka hybri-doituvat kosmideihin pIBVl - pIBV4 tai näiden fragmenttei-15 hin.
Keksinnön edullisessa muodossa edellä määritellyt nukleotidisekvenssit ovat osa ilmentämisvektoria, joka voi olla itsenäisesti tai integroidusti replikoituva.
Kuten edellä mainittiin, vaikka keksintöä erityi-20 semmin havainnollistetaan pristinamysiinin biosynteesigee- neillä, selvää on, että saadut tulokset koskevat kaikkia "·1: streptogramiineja.
·***; Tarkemmin ottaen tekniikoita, jotka on kehitetty ··· esillä olevassa keksinnössä proteiinien puhdistamiseksi 25 tai streptogramiinien biosynteesigeenien kloonaamiseksi • · » m»m lähtien pristinaespiraliksesta, voidaan soveltaa muihin • · · ’**.1 streptogramiineja tuottaviin mikro-organismeihin (vrt.
• · · taulukko 1).
Täten entsyymiaktiivisuuden puhdistaminen lähtien « · · 30 S. pristinaespiraliksesta tekee mahdolliseksi saman aktii- mmm visuuden puhdistamisen lähtien toisesta streptogramiinia .**·. tuottavasta kannasta. Esillä olevaa keksintöä voidaan si- • · ·«· ten soveltaa streptogramiinien biosynteesigeenien kloo- s • naukseen lähtien mistä tahansa tuottajamikro-organismista • · · ·.?.· 35 puhdistamalla biosynteesiin liittyvä proteiini, minkä jäi- · 10 117674 keen tämän NH2-pääsekvenssin avulla voidaan syntetisoida oligonukleotidikoetin, joka tekee mahdolliseksi vastaavan geenin kloonauksen. Sitten kromosomikävelyllä voidaan identifioida biosynteesirykelmä kokonaisuudessaan.
5 Lisäksi esillä olevassa patenttihakemuksessa iden tifioiduista geeneistä lähtien on mahdollista hybridisaa-tiolla kloonata suoraan streptogramiinien biosynteesigee-nejä lähtien toisen tuottajamikro-organismin DNA:sta. Itse asiassa pristinamysiinien biosynteesigeenit hybridoituvat 10 voimakkaasti muiden streptogramiinien biosynteesigeenei-hin. Täten on mahdollista kloonata hybridisaatiolla streptogramiinien biosynteesigeenejä käyttäen koettimena geenejä sna, snb tai pap, tai näiden fragmentteja, tai näiden viereisiä fragmentteja, jotka sisältävät, kuten osoitetaan 15 tässä keksinnössä, muita geenejä sna ja snb. Tämä johtaa siihen, että: 1) eri mikro-organismien tuottamilla strep-togramiineilla on identtiset tai samankaltaiset rakenteet i (katso kuviot 1 - 3), 2) streptogramiinien biosynteesigeenit ovat järjestäytyneet rykelmiin, ja 3) tästä biosyntee-20 sistä vastuussa olevilla entsymaattisilla systeemeillä ei ole absoluuttista spesifisyyttä substraattiensa suhteen.
·*·*. Sitä paitsi streptogramiinien biosynteesiin liitty- • * ,···. vät geenit voidaan kloonata myös käyttämällä degeneroituja oligonukleotidejä, jotka on valmistettu edellä mainituista 25 geenien sna tai snb sekvensseistä tai näiden geenien frag- • · . menteista, tai näitä geenejä jatkavista fragmenteista. On j.* täten mahdollista mennä tutkimaan streptogramiinien eri • · · *·' tuottajakantojen rakenneosien A ja B biosynteesigeenejä.
Nämä kannat voivat kuulua sukuun Streptomyces mutta myös :.ϊ.: 30 muihin sukuihin (vrt. taulukko 1). Lisäksi, jos käytetty- jen lähtökantojen genomi-DNA: 11a on G+C-koostumus, joka .···. poikkeaa Streomycesillä havaitusta, käytetyt koettimet * · voidaan syntetisoida käyttäen suvulle tai lajille, josta • · . DNA halutaan eristää, spesifistä "viistoa" kodonia.
• · · • · · : ···..· ··«·· • · 11 117674
Esillä olevan keksinnön toinen kohde ovat polypeptidit, jotka saadaan ilmentämällä edellä määritellyt nukleotidi sekvenssit. Tarkemmin ottaen esillä oleva keksintö koskee polypeptidejä, jotka käsittävät kokonaisuudessaan 5 tai osittain polypeptidit SnaA (sekvenssi tunnusnro 2),
SnaB (sekvenssi tunnusnro 3), SnaC (sekvenssi tunnusnro 7), SnaD (sekvenssi tunnusnro 8), PapA (sekvenssi tunnusnro 9), PapM (sekvenssi tunnusnro 10), SamS (sekvenssi tunnusnro 4), SnbA (sekvenssi tunnusnro 5), SnbC (sekvens-10 sit tunnusnro 11 ja 12), SnbD (sekvenssit tunnusnro 13 ja 14), SnbE (sekvenssit tunnusnro 15 ja 16) ja SnbR (sekvenssi tunusnro 6) tai näiden johdannaisia. Esillä olevan keksinnön merkityksessä ilmaisulla johdannainen tarkoitetaan mitä tahansa molekyyliä, joka saadaan modifioimal-15 la peptidisekvenssiä geneettisesti ja/tai kemiallisesti. Luonteeltaan geneettinen ja/tai kemiallinen modifikaatio voi tarkoittaa mitä tahansa mutaatiota, substituutiota, r deleetiota, lisäystä ja/tai yhden tai useamman tähteen modifikaatiota. Tällaisia johdannaisia voidaan muodostaa 20 eri tarkoituksiin, kuten etenkin tarkoituksessa lisätä f peptidin affiniteettia sen yhden tai useamman substraatin 4 ·· * • *t: suhteen, tarkoituksessa parantaa sen tuotantotasoja, tar- :***· koetuksessa lisätä sen vastustuskykyä proteaaseille, tar- * · · ··· koetuksessa lisätä ja/tai modifioida sen aktiivisuutta,
ItM
25 tai tarkoituksessa antaa sille uusia biologisia ominai- Z
'S· t ,·. suuksia. Johdannaisista, jotka ovat seurausta additiosta, * • Il voidaan mainita esimerkiksi kimeeriset polypeptidit, jotka «Il käsittävät toiseen päähän sidotun ylimääräisen heterologi-sen osan. Ilmaisu johdannainen käsittää samoin polypepti- • · · *·!·* 30 dit, jotka ovat homologisia esillä olevassa keksinnössä *...: kuvattuihin polypeptideihin nähden, ja peräisin muista ;***: solulähteistä ja etenkin streptogramiineja tuottavista s ··♦ kannoista.
• φ \ Keksintö koskee samoin mitä tahansa yhdistelmä-DNA- *.!.* 35 solua, joka sisältää edellä määritellyn mukaisen nukleoti- • m·· • · 12 117674 disekvenssin tai vektorin. Keksinnön mukaiset yhdistelmä-DNA-solut voivat olla yhtä hyvin eukaryoottisia soluja kuin prokaryoottisia soluja. Sopivista eukaryoottisista soluista voidaan mainita eläinsolut, hiivat tai sienet.
5 Erityisesti hiivojen kyseessä ollessa voidaan mainita sukujen Saccharomyces, Kluyveromyces, Plchia, Schwanniomyces tai Hansenula hiivat. Eläinsolujen kyseessä ollessa voidaan mainita solut COS, CHO, C127, X6nope-munat jne. Sienistä voidaan erityisesti mainita Micromosospora, Asper-10 gillus ssp. tai Trichoderma ssp. Prokaryoottisina soluina käytetään edullisesti seuraavia bakteereja: Actinomycetes, ja etenkin Streptomyces, E. coli (esimerkki 11), Bacillus. Edullisesti keksinnön mukaiset yhdistelmä-DNA-solut valitaan streptogramiineja tuottavista soluista (vrt. taulukko 15 1). Keksinnön mukaiset yhdistelmä-DNA-solut voidaan saada millä tahansa menetelmällä, jolla on mahdollista viedä vieras nukleotidisekvenssi soluun. Kyseeseen tulevat etenkin transformointi, elektroporaatio, konjugointi, proto-plastifuusio, tai mikä tahansa muu alan ammattilaiselle 20 tuttu tekniikka. ä
Keksintö koskee vielä menetelmää polypeptidin tuot- ·*·*· tamiseksi, joka liittyy streptogramiinien biosynteesiin, • ·' .*·*. jonka menetelmän mukaan viljellään edellä määritellyn mu- ··· kaista yhdistelmä-DNA-solua ja otetaan talteen tuotettu 25 polypeptidi.
• · • . Keksintö koskee samoin edellä määritellyn mukaisen ***,* yhdistelmä-DNA-solun, joka ilmentää yhden polypeptidin • · · ’·* * vähintään, joka liittyy streptogramiinien biosynteesiin, käyttöä biokonversioreaktiossa. Erityisesti nämä solut 30 voivat mahdollistaa streptogramiinin muuttamisen johdan- • · ί.,,ϊ naismuotoon. Esimerkiksi pristinamysiini IIB voidaan täi- .···. lä tavalla muuttaa pristinamysiiniksi IIA. Samaa järkeilyä voidaan soveltaa mihin tahansa biosynteesivälituotteeseen.
* * . Nämä solut voivat samoin tehdä mahdolliseksi valmistaa 35 hybridiantibiootteja, joilla on kiinnostavia farmakologi- !»··« 117674 13 siä ominaisuuksia (Hopwood et ai., 1985a, Hopwood et ai., . 1985b, Hutchinson et ai., 1989). Nämä biokonversiot voidaan suorittaa joko kokonaisten solujen avulla tai mainittujen solujen soluvapaiden uutteiden avulla.
5 Keksinnön seuraava kohde on edellä määritellyn mu kaisen nukleotidisekvenssin käyttö streptogramiinin tuotannon lisäämiseksi. Keksintö koskee samoin menetelmää streptogramiinien tuottamiseksi, jonka menetelmän mukaan streptogramiineja tuottavaan tai streptogramiineja mahdol-10 lisesti tuottavaan soluun viedään ja/tai siinä monistetaan yhtä tai useampaa keksinnön mukaista nukleotidisekvenssiä, mainittua solua viljellään streptogramiinien tuotanto-olosuhteissa ja tuotetut streptogramiinit otetaan talteen.
Tiettyjen biosynteesiin liittyvien geenien hyvin 15 runsas ilmentäminen voi tehdä mahdolliseksi lisätä tuotta-jakantojen streptogramiinien A ja/tai B tuotantoa. Tämä hyvin runsas tuotanto voidaan toteuttaa useammissa kannoissa: joko kannoissa, jotka tuottavat vain streptogramiinien ryhmän A molekyylejä, tai kannoissa, jotka tuotta-20 vat vain streptogramiinien ryhmän B molekyylejä, tai kannoissa, jotka tuottavat kumpaakin kahta rakenneosaa A ja "·*: B. Nämä hyvin runsaat ilmentämiset voivat johtaa rakenne- • · .***. osien A ja/tai B synteesitasojen, ja siten tuottavuuden, • · · kohoamiseen joko erlenmeyerissä tai pienissä fermentoreis- ···· 25 sa, tai suurissa teollisissa fermentoreissa. Sitä paitsi • · . yhden geenin, joka liittyy rakenneosan A tai B biosyntee- • · · "t.* siin, spesifinen hyvin runsas ilmentäminen tekee samoin • · t * mahdolliseksi varioida kannan tuottamien rakenneosien A ja B prosenttia, ja siten saada parempi synergia näiden mo- *.!.* 30 lekyylien välille. Lisäksi biosynteesigeenejä, jotka on • ♦ ♦ :..4: eristetty streptogramiinien tuottajamikro-organismista, .**. voidaan käyttää tuotannon lisäämiseen toisessa tuottaja- • · ' mikro-organismissa.
• » • Keksinnön seuraava kohde on menetelmä solujen val- 35 mistamiseksi, jotka ovat salvattuja streptogramiinien bio- ··#·· * · 14 117674 synteesireitin yhdessä vaiheessa, jolloin menetelmän mukaan streptogramiinjea tuottavalle solulle suoritetaan mutagenisointi biosynteesireitin vähintään yhden geenin tasolla.
5 Edullisesti mutageneesi suoritetaan in vitro tai in situ yhden tai useamman emäksen kyseessä olevassa geenissä suppressiolla, substituutiolla, deleetiolla ja/tai additions, tai geneettisellä häirinnällä.
Esillä olevan keksinnön toinen näkökohta on itse 10 asiassa mutanttien rakentaminen, jotka ovat salvattuja streptogramiinien biosynteesin tietyissä vaiheissa. Mielenkiinto kohdistuu yhtäältä mutagenisoitujen proteiinien funktionaalisuuden tutkimiseen ja toisaalta kantojen valmistamiseen, jotka tuottavat biosynteesivälituotteita.
15 Näitä välituotteita voidaan modifioida mahdollisesti erottamisen jälkeen joko lisäämällä erityisiä aineosia tuotantoalastaan tai viemällä näin mutagenisoituihin kantoihin muita geenejä, jotka voivat modifioida välituotetta substraattia käyttäessään. Näitä välituotteita voidaan tä- : 20 ten modifioida kemiallisesti, biokemiallisesti, entsy- ^ maattisesti ja/tai mikrobiologisesti. Tämän piirissä ra- Ϊ*·*: kennettiin kannan pristinaespiralis SP92 mutantti SP92: :pVRC505: pristinaespiralis SP92: :pVRC505 eris- « · · ,ϊ. tettiin homologisella integraatiolla itsetuhoplasmidin ____! 25 pVRC505 snaA-geenissä, joka plasmidi rakennettiin lähtien « · . ^ vektorista pDH5 ja geenin snaA sisäisestä fragmentista.
"*.* Rakennettiin myös seuraavat mutantit: SP92 samS::OamR; *·* * SP92: :pVRC508; SP92::pVRC404 ja SP92: :pVRClOOO (esimerk ki 9).
» · *.ί·* 30 Keksintö koskee siis samoin menetelmää streptogra- • * * miinien biosynteesivälituotteen valmistamiseksi, jonka ; .*··. mukaan: • · valmistetaan edellä kuvatun mukainen solu, joka on < « · . salvattu streptogramiinien biosynteesireitin yhdessä vai- 35 heessa, ··«·· • · 117674 15 viljellään mainittua solua, ja otetaan akkumuloitunut välituote talteen.
Keksintö koskee samoin menetelmää streptogramiinien johdannaismolekyylin valmistamiseksi, jonka mukaan: 5 valmistetaan edellä kuvatun mukainen solu, joka on salvattu streptogramiinien biosynteesireitin yhdessä vaiheessa, viljellään mainittua solua, ja tämän solun akkumuloimaa välituotetta modifioidaan, 10 mahdollisesti kasvualustasta erotuksen jälkeen.
Esillä olevaa keksintöä havainnollistetaan seuraa-villa esimerkeillä, jotka tulee katsoa havainnollistaviksi eikä rajoittaviksi.
Luettelo kuvioista 15 Kuvio 1: Esimerkki streptogramiinien rakenneosien A rakenteesta.
Kuvio 2: Esimerkki streptogramiinien rakenneosien B rakenteesta. *
Kuvio 3: Muita esimerkkejä streptogramiinien raken- 20 teista.
Kuvio 4: Esitys kosmidista pIBVl. ,'. Jj j*·*: Kuvio 5: Esitys kosmidista pIBV2.
:***· Kuvio 6: Esitys kosmidista pIBV3.
«««
Kuvio 7: Esitys kosmidista pIBV4.
···· 25 Kuvio 8: Pristinamysiini IIA -syntaasin katalysoima • · • reaktio.
• · a
Kuvio 9: 3-hydroksipikoliinihappo-AMP-ligaasin ka- • · · • · * * talysoima reaktio.
Kuvio 10: SnbCrn katalysoima reaktio.
• « · *·!·* 30 Kuvio 11: SnbD:n katalysoima reaktio.
• ·
Kuvio 12: SnbE:n katalysoima reaktio.
j***· Kuvio 13: SnaC:n katalysoima reaktio.
·*·
Kuvio 14: PapM:n katalysoima reaktio.
·φ Kuvio 15: Esitys plasmideista pVRC402 (A) ja :*:.J 35 pVRCSOl (B).
• · ' 16 117674
Kuvio 16: Esitys plasmidista pXL2045.
Kuvio 17: Esitys plasmidista pVRCHOS.
Kuvio 18: Esitys plasidista pVRCH06.
Kuvio 19: Esitys plasmidista pVRC1104.
5 Kuvio 20: Esitys plasmidista pVRC900.
Kuvio 21: Esitys plasmidista pVRClOOO.
Kuvio 22: Esitys plasmidista pVRC509.
Kuvio 23: Esitys plasmidista pVRC903.
Kuvio 24: Esitys plasmidista pVRC409.
10 Kuvio 25: Esitys plasmidista pVRC505.
Kuvio 26: Esitys plasmidista pVRC701.
Kuvio 27: Esitys plasmidista pVRC702.
Kuvio 28: Esitys plasmidista pVRC508.
Kuvio 29: Esitys plasmidista pVRC404.
15 Kuvio 30: Esitys plasmidista pVRC507.
Kuvio 31: Esitys plasmidista pVRC706.
Kuvio 32: Yleiskartta.
Materiaalit
Kolonnit Bio-Sil SEC 125 ja 250 (Bio-Rad) 20 Kolonnit MonoQ HR5/5, 10/10 ja 16/10 (Pharmacia)
Kolonni PD-10 (Pharmacia)
Kolonni Superose 6 HR 10/30 (Pharmacia) .*··. Kolonni Superdex Hi-Load 16/60 ja 75 HR 10/30 • · (Pharmacia) • - 25 Kolonni Superose 12 prep. laatu (Pharmacia) • · . . Kolonnit Vydac C4 ja C18 (The Separations Group) ···-'.
Kolonni Nucleosil 5-C18 (Macherey-Nagel) • * · "·* * Kolonni fenyyli-Superose HR 10/10 (Pharmacia)
Kolonni TSK G200 SW (Tosoh, Japani) • - 30 Fenyyli-Sepharose (Pharmacia) * * .> ϊ.,.ϊ FMN-agaroosi (Sigma) .···. Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) * ·
Sephadex G25 Fine (Pharmacia) • · . Centricon 10 tai 30 (Amicon) * *.·.· 35 Centriprep 10 tai 30 (Amicon) *!*" Centrilutor (Amicon).
Esimerkki 1 17 1 1 7674
Kokonais-DNA:n eristäminen kannasta Streptomyces pristinaespiralis SP92 Tämä esimerkki esittää, miten pristinaespira-5 liksen SP92 DNA voidaan puhdistaa.
Kanta pristinaespiralis SP92 on peräisin kannasta pristinaespiralis DS5647 (ATCC 25486).
50 ml:aan YEME-kasvualustaa [34 % sakkaroosia, 5 mM MgCl2, glysiiniä 0,25 % (D. Hopwood et ai., 1985)] siirros-10 tetaan 108 pristinaespiralis SP92 -itiöitä ja viljelmää inkuboidaan 40 tunnin ajan 30 °C:ssa sekoittaen 280 kierros ta/min.
Myseeli kerätään talteen ja pestään 15 ml:11a 10,3-%:ista sakkaroosiliuosta. Noin 1 g:n myseelipelletti 15 uudelleenlietetään 5 ml:aan TE:tä, jota on täydenntty 34 %:lla sakkaroosia, ja tähän lisätään 1 ml lysotsyymin 50 mg/ml liuosta 10 mM Tris-HCl:ssä, pH 8,0, ja 1 ml:ssa 0,25 M EDTA-liuosta, pH 8,0. Seosta inkuboidaan 30 °C:ssa 30-60 minuutin ajan, minkä jälkeen sitä kirkastetaan li-20 säämällä 0,8 ml 10-%:ista sarkosyyliliuosta. Sitten lisätään 2 ml 0,25 M EDTA-liuosta, pH 8,0, 10 ml TE:tä, 18 g ·*·*; - CsCl:ää ja 1,2 ml 10 mg/ml BET-liuosta. Valmistetta ultra- φ · sentrifugoidaan yön yli nopeudella 55 000 kierrosta/min 20 °C: ssa.
25 Kromosomi-DNA, joka on CsCl-gradientissa nauhana, • · . . otetaan talteen pasteurpipetin avulla. BET poistetaan pe- ··*/ semällä useaan kertaan TE-puskurilla, 5 M NaCl, kylläste- * · · *** tyllä isopropanoliliuoksella. DNA saostetaan lisäämällä 3 tilavuutta TE:tä ja 4 tilavuutta isopropanolia. 70-pro-30 senttisellä etanolilla pesun jälkeen DNA uudelleenliete- * · · tään sopivaan TE-tilavuuteen. Saatu kokonais-DNA-määrä .···. vaihtelee 250:stä 500 pg:aan kohden myseeligrammaa.
* · ***. Esimerkki 2 • · ' . E^ colin plasmidi-DNA:n eristäminen
·.·.· 35 Tämä esimerkki esittää, miten E^ colin plasmidi-DNA
"**; valmistetaan lähtien yhdistelmä-DNA-E. coli-kannoista.
ie 1 1 7674 2.1. colin plasmidi-DNA:n valmistaminen suurina määrinä Tämä esimerkki esittää, miten plasmidi-DNA:n maksimi valmistuksia suoritetaan E_j_ colissa.
5 Tämä valmistus suoritetaan lähtien 500 ml:n viljel mästä LB-kasvualustassa, joka sisältää 150 pg/ml ampisil-liiniä. Uuttoprotokolla saadaan menetelmistä, joita kuvaavat Birnboim ja Doly (1979) ja Ish-Horowicz ja Burke (1981) ja kuvataan julkaisussa Maniatis et ai. (1989).
10 Tämän uuton jälkeen plasmidi-DNA:ta puhdistetaan
CsCl-gradientilla, kuten kuvataan julkaisussa Maniatis et ai. (1989). Sitten plasmidi-DNA seostetaan lisäämällä 3 tilavuutta TE:tä ja 4 tilavuutta isopropanolia. Sentrifu-goinnin jälkeen pelletti uudelleenlietetään 0,5-1 ml:aan 15 TE:tä.
2.2. E^ colin plasmidi-DNA:n valmistaminen pieninä määrinä Tämä esimerkki havainnollistaa, miten plasmidi- DNA: n minimivalmistuksia suoritetaan E_^ colissa.
20 Tämä valmistus suoritetaan lähtien 1,5 ml:sta vil- £ jelmää LB-kasvualustassa, joka sisältää 150 pg/ml ampisil- i ;*·*; liiniä. Menettely on Birnboimin ja Dolyn kuvaama (1979).
* * .***. Esimerkki 3 • · • · * S. pristinaespiraliksen SP92 genomi-DNA-pankin ra-• 1 25 kentaminen E^_ coliin ja hybridisaatiomembraanien valmista- • · . . minen ♦ · · Tämä esimerkki esittää, miten S. pristinaespiralik- • · · *** sen SP92 genomi-DNA-pankki rakennetaan E_^ coliin.
3.1. Genomi-DNA-fragmenttien valmistaminen :.·.· 30 Tämä esimerkki esittää, miten voidaan valmistaa • * · genomi-DNA-fragmentteja, joiden molekyylipaino on korkea.
.···, Kannan SP92 kokonais-DNA, joka valmistetaan, kuten • · : **'. kuvattiin esimerkissä 1, pilkotaan osittain Sau3A:lla (New f . England Biolabs, Beverly, MA, 01915-5510 USA) toimittajan 35 suosittelemassa puskurissa: 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl • * 117674 19 (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 100 pg/ml BSA:ta. Entsyymimäärä, jota käytetään DNA-fragmenttien saamiseksi, joiden mole-kyylipaino on korkea, määritettiin kokeellisesti. Käytetään noin 0,025 entsyymiyksikköä 1 pg:n kokonais-DNA:ta 5 pilkkomiseksi 20 minuutin ajan 37 °C:ssa. Sitten reaktio pysäytetään inkuboimalla 15 minuutin ajan 65 °C:ssa ja entsyymi poistetaan lisäämällä sama tilavuus fenoli-kloroformia. Sentrifugoinnin jälkeen osittain pilkottua kokonais-DNA: ta sisältävä supernatantti saostetaan lisäämällä nat-10 riumasetaattia 0,3 M loppupitoisuuteen ja 2,5 tilavuutta etanolia.
Näin pilkotaan noin 100 pg kokonais-DNA:ta, minkä jälkeen DNA-fragmentit, jotka ovat kooltaan 30 - 50 ke, eristetään 10 - 40 %:n sakkaroosigradientin avulla. Niiden 15 koko vahvistetaan elektroforeesilla 0,4-%:isessa agaroosi-geelissä.
3.2. Kosmidin pHC79 valmistaminen Tämä esimerkki esittää, miten kosmidi pHC79 valmistetaan E^_ colista.
20 Kosmidi pHC79 (Hohn, B., ja Collins, 1980) käsittää osan pBR322:sta (Bolivar, F., et ai., 1977), lambda-alueen ;*·*; cro-cll ja alueen, joka sisältää cos-sekvenssin Charon • · .**. 4A:sta (Blattner, F.R., et ai., 1977).
* · *
Kosmidi uutettiin, kuten kuvattiin esimerkissä ^ ·
25 2.1., lähtien E^_ coli -kannasta TGI (K12, A(lac-pro) supE
• · . m,' thi hsd DS F traD36 proA*B* lacIqLacZ Δ-Μ15, Gibson, 1984).
500 ng kosmidia pHC79 pilkottiin BamHI:llä (New • · · - • England Biolabs, Beverly, MA, 01915-5510 USA) 20 pl:ssa puskuria, jossa olivat pitoisuudet 150 mM NaCl, 6 mM Tris- *.ϊ.* 30 HC1, pH 7,9, 6 mM MgCl2, 6 mM 2-merkaptoetanoli, 100 pg/ml * * · BSA: ta.
.···. 3.3. DNA-fragmenttien ja kosmidin ligatointl • « « ____i Tämä esimerkki esittää, miten S. pristinaespiralis * • · . SP92 -genomista Sau3A:lla pilkkomalla saadut fragmentit • · · • · · ··· ·····'--* * 20 ', .
117674 voidaan ligatoida BamHI:llä lineaariseksi tehtyyn vektoriin pHC79.
Noin 150 ng kosmidia, joka on linearisoitu, kuten edellä kuvattiin, saostettiin etanolilla 350 ng:n kanssa 5 S_^ pristinaespiralis SP92 -kokonais-DNA-fragmentteja, jot ka valmistettiin, kuten kuvattiin esimerkissä 3.2. Pelletti uudelleenlietettiin 10 pl:aan ligatointipuskuria: 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 20 mM DTT, 1 mM ATP, 50 pg/ ml BSA:ta, ja lisätään 0,5 μΐ T4-DNA-ligaasiliuosta, jossa 10 oli 400 000 yksikköä/ml (New England Biolabs, Beverly, MA, 01915-5510, USA). Inkubointi kestää yön yli 15 °C:ssa.
3.4. Kapsidaation in vitro suorittaminen Tämä esimerkki esittää, miten kohdassa 3.3. rakennetut kosmidit kapsidoidaan in vitro.
15 Hybridikosmidien kapsidaatio ligatoinnin jälkeen
suoritettiin lähtien pakkauksesta Gigapack II Gold, jonka on kehittänyt Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La J
Jolla, CA 92037, USA).
2 x 4 μΐ ligatointiseosta, eli 2 x 70 ng hybridi- 20 kosmideja, kapsidoitiin in vitro toimittajan kuvaaman me- ΐ nettelyn mukaan. } :*·*: 3.5. Kantojen E. coli DH1 ja HB101 transfektointi * · .··*. Tämä esimerkki esittää, miten kosmidit viedään E.
• * f - i < i coliin.
#4". 25 Suoritettiin kaksi rinnakkaista transfektointia • · . . kannoilla coli DHl (F- gyrA96 recAl relAl endAl thi-1
**;t: hsdR17 supE441~, Low 1968) ja HB101 (F" supE44 hsdS2Q
*·* * (rB'mB‘) recAl3 ara-14 proA2 IacYl galK2 rpsL20 xyl-5 mtl-1, Boyer ja Roulland-Dussoix, 1969).
·.·,· 30 Solut valmistettiin seuraavan menettelyjärjestelyn • * · ϊ ! mukaan: valmistettiin 100 ml:n esiviljelmä LB-kasvualus- t···. taan, jota oli täydennetty 0,2 %:lla maltoosia ja pitoi- -z * · suudella 10 mM MgS04, kasvattamalla 4-5 tunnin ajan, kun- 4 • · , nes O.D. 600 saavutti arvon 0,8. Sitten viljelmä sentrifugoi- :,j,: 35 daan ja pelletti uudelleenlietetään 40 ml:aan 10 mM MgS04- • ί »····
*· T
117674 21 liuosta ja laimennetaan samaan liuokseen, kunnes O.D.600 on 0,5. 200 μΐ näin valmistettua solususpensiota sekoitetaan 100 pl:aan kapsidaatioseosta. 20 minuutin kontaktin 37 °C:n lämpötilassa jälkeen lisätään 1 ml LB:tä ja seosta inku-5 boidaan 1 tunnin ajan 37 °C:ssa. Sitten transfektantit valikoidaan kiinteällä LB-kasvualustalla, joka sisältää 150 pg/ml ampisilliiniä. Saatujen transfektanttien määrä on noin 104 kohden yg:aa yhdistelmä-DNA-kosmidia.
3.6. S. pristinaespiralis SP92 -genomi-DNA-pankkien 10 varastointi Tämä esimerkki esittää, miten S^ pristinaespiralis SP92 -genomi-DNA-pankit säilytetään.
Kun kosmidiin pHC79 insertoitujen fragmenttien keskimääräinen koko on vahvistettu, noin 1 500 pesäkettä, 15 jotka on saatu kummastakin kannoilla HB101 ja DH1 suoritetusta transfektoinnista, noukitaan 96-kuoppaisille mikro-tiitterilevyille, jotka sisältävät 200 μΐ Hogness-kasvu-alustaa (LB-kasvualusta, jota on täydennetty 8,8 %:lla glyserolia, pitoisuuksilla 3 mM natriumasetaatti, 55 mM 20 K2HP04, 26 mM KH2P04, 1 mM MgS04, 15 mM (NH4)2S04, 150 μg/ml ampisilliiniä). Näitä levyjä inkuboidaan yön yli 37 °C:ssa, :***: minkä jälkeen ne varastoidaan -80 °C:seen.
• « ·’**. 3.7. Hybridisaatiomembraanien valmistaminen lähtien »«· .:. Sj_ pristinaespiralis SP92 -genomipankeista • · · · ____; 25 Tämä esimerkki esittää, miten S. pristinaespiralis • · . SP92 -genomipankit muodostava pesäke-DNA siirretään hybri- • · · ' % *".* disaatiomembraanille. f • · · · ** * Näitä hybridisaatiomembraaneja valmistettiin kaksin kappalein kohden kumpaakin kahdesta pankista seuraavan 30 menettelyjärjestelyn mukaan: • · · ·...· 15 kummankin pankin mikrotitrausplakkia noukitaan .*··. naulaharjan avulla LB-agarkasvualustalle, joka sisältää ; 150 pg/ml ampisilliiniä. Yhden yön 37 °C:ssa kasvatuksen • · . jälkeen pesäkkeet siirretään Biohylon Z+ -membraanille 35 (Bioprope System) seuraavan menettelyj ärj estelyn mukaan: • · , 117674 · 22 sopivan kokoiseksi leikatun membraanin annetaan olla kosketuksissa pesäkkeisiin 1 minuutin ajan. Sitten suoritetaan denaturointi imeyttämällä membraaniin 0,5 M NaOH-liuosta, 1,5 M NaCl, 5 minuutin ajan, minkä jälkeen neut-5 raloidaan imeyttämällä membraaniin 3 M natriumasetaatti-liuosta 5 minuutin ajan. DNA kiinnitetään membraaniin altistamalla uv-valolle 5 minuutin ajan.
Esimerkki 4 4.1. Kromosomi-DNA:n valmistaminen kannasta 10 pristinaespiralis SP92 ja SP92:n johdannaiskannoista in-serttien muodossa sykäyskenttäelektroforeesiin Tässä esimerkissä esitetään, miten kannan pristinaespiralis SP92 ja SP92:n johdannaiskantojen DNA valmistetaan inserttien muotoon sykäyskenttäelektroforeesiin.
15 Tämä valmistus suoritetaan lähtien myseeliviljel- mästä, joka on saatu seuraavalla tavalla: 30 ml:aan YEME-kasvualustaa, joka sisältää 0,25 % glysiiniä, siirroste-taan 108 tutkitun kannan itiötä, viljelmää inkuboidaan 48 tunnin ajan 30 °C:ssa ja ravistellaan nopeudella 280 kier-20 rosta/min 250 ml:n erlenmeyereissä. Sitten myseeli otetaan talteen sentrifugoimalla 10 minuutin ajan nopeudella 3 800 ;*·*: kierr./min ja pestään kahteen kertaan 10-%:isella sakka- ·***; roosiliuoksella. Sitten myseelipelletti suspendoidaan 5 • · · ml:aan liuosta I (250 mM EDTA, pH 8,0, 20,6 % sakkaroo- • · · · 25 siä). 200 pl:aan näin saatua myseeliä lisätään 400 μΐ ly- * * . sotsyymin 50 mg/ml liuosta liuoksessa I sekä 800 μΐ 1-pro- • * · senttistä LMP-agaroosiliuosta 25 mM EDTA-liuoksessa, pH 8 * · · '·* ja 10,3 % sakkaroosia, jota pidetään 42 °C:ssa. 42 °C:ssa pidetty seos kaadetaan sitten erityisiin kampakuoppiin, *·ί.* 30 jotka suljetaan teipillä ja pidetään 30 minuutin ajan • · · 4 °C:ssa. Seos kiinteytyy ja 30 - 40 näin saatua, kuopissa olevaa inserttiä irrotetaan varovaisesti.
• · ···
Inserttejä huuhdotaan ensin 30 minuutin ajan 4 °C:n : * ·
• lämpötilassa liuoksessa, joka sisältää pitoisuuden 25 mM
*.!.* 35 EDTA ja 10,3 % sakkaroosia. Sitten ne kastellaan 500 mM
·«··· • * 117674 : 23 - EDTA-liuoksella, jossa on 1 % sarkosyyliä ja 1 mg/ml pro-teinaasi-K:ta, kahteen kertaan 24 tunnin ajan 50 °C:ssa ajoittain sekoittaen. Sitten inserttejä pestään 3 kertaan 1 tunnin ajan TE:ssä, joka sisältää pitoisuuden 1 mM PMSF, 5 vaihtaen liuosta kunkin pesun jälkeen. Näin saatuja inserttejä säilytetään 4 °C:ssa korkeintaan 4 kuukauden ajan 0,5 M EDTA:ssa, pH 8,0.
4.2. Kannan S_^ pristinaespiralis SP92 ja SP92:sta saatujen kantojen DNA-inserttien pilkkominen ja analyysi 10 sykäyskenttäelektroforeesilla Tämä esimerkki esittää, miten kannan pristinaespiralis SP92 ja SP92:n johdannaiskantojen kromosomi-DNA, joka on valmistettu inserttien muotoon, kuten kuvataan esimerkissä 4.1., leikataan eri restriktioentsyymeillä 15 sykäyskenttäelektroforeesia varten.
4.2.1. Kromosomi-DNA-inserttien pilkkominen Insertit pestään ensin 6 kertaan TE:ssä, minkä jälkeen niitä inkuboidaan 2 kertaan 1 tunnin ajan valitun restriktioentsyymin puskurissa. Sitten kukin insertti si-20 joitetaan eppendor f putkeen, joka sisältää 160 μΐ restrik- $ tioentsyymipuskuria ja 40 yksikköä entsyymiä. Seos peite-i**ji tään parafilmillä ja eppendorf suljetaan parafilmin pitä- ·***; miseksi paikoillaan, mikä tekee mahdolliseksi puskurin • · · .:. haihtumisen täydellisen estämisen. Putkia inkuboidaan ha- • · · · 25 lutussa lämpötilassa uunissa yön yli.
• * • 4.2.2. Pilkotun DNA:n analyysi sykäyskenttäelektro- • * · foreesilla · · • Tähän tutkimukseen valittu sykäyskenttäelektrofo-reesitekniikka on CHEF (Clamped Homogenous Electric Field) • · · 30 -systeemin mukainen, jonka ovat kehittäneet Chu et ai.
··· ' ' (1986) ja joka tekee mahdolliseksi saada kaksi vaihtoeh- ,***. toista homogeenista kenttää, jotka ovat 120°:n kulmassa • »f toisiinsa nähden, ja suorat kulkuradat DNA-molekyyleil- • » * le. Käytetty laite on "Pulsafor System", jota markkinoi *.:.* 35 Pharmacia-LKB.
• * · · · • * : 117674 24
Vaihdellaan elektroforeettisen migraation parametrejä, kuten sykäysaika (eli sähkökentän käytön kesto) ja migraation kesto, siten, että saadaan kooltaan 10-2 500 ke:n DNA-fragmenttien optimaalinen erotus. Käytetyt kolme 5 migraatio-olosuhdetta ovat seuraavat: suurten, kooltaan 200 - 1 700 ke:n fragmenttien erottamiseksi valittu migraatio kestää 40 tuntia sykäysajan ollessa 90 sekuntia; kooltaan 50 - 400 ke:n fragmenttien erottamiseksi valittu migraatio kestää 20 tuntia sykäysajan ollessa 10 sekuntia 10 ja sitten 20 tuntia sykäysajan ollessa 30 sekuntia; lopuksi pienimpien, kooltaan 10 - 200 ke:n fragmenttien erottamiseksi valittu migraatio kestää 24 tuntia sykäysajan ollessa 10 sekuntia. Näissä kolmessa migraatio-olosuhteessa jännite asetetaan 150 voltin vakioarvoon, lämpötila pide-15 tään 13 °C:na ja elektroforeesigeelit sisältävät 1,3 % aga-roosia.
Insertit, jotka sisältävät kanssa pristinaespi- ralis SP92 ja SP92:n johdannaiskantojen kromosomi-DNA:ta, pilkotaan restriktioentsyymeillä edellä kuvatun mukaises- 20 ti, ja sijoitetaan elektroforeesigeelin kuoppiin kahden skalpelliterän avulla. Käytetyt molekyylipainomerkit ovat
ί1 2·'ϊ "Yeast Chromosome PFG Marker" ja "Lambda Ladder PFG
• # ;***; Marker", joita markkinoi yritys New England Biolabs. Mig- ··· raatio suoritetaan joissain edellä kuvatuissa olosuhteis- « 25 sa, minkä jälkeen geeliä värjätään BET (etidiumbromidi) • · . -kylvyssä, jossa pitoisuus on 4 pg/ml, 20 minuutin ajan, • · · "!.1 minkä jälkeen väriä poistetaan vedessä 20 minuutin ajan.
111 • 1 · * Geelin kuvaamisen jälkeen DNA-fragmentit siirretään nai-lonmembraanille, minkä jälkeen niitä hybridoidaan [a-32]- • · ® *·ί·1 30 dCTF:llä leimattuihin koettimiin, kuten kuvataan esimer- • · · ·...· kissä 9.1.
··· • · ··· • · > 1 · • 1 ··· • · · *·· · 1 2 • · 117674 25
Esimerkki 5
Kosmidien eristäminen, jotka käsittävät geenejä, jotka koodittavat puhdistettuja proteiineja, jotka liittyvät streptogramiinien biosynteesiin 5 Tässä esimerkissä kuvataan, miten lähtemällä puh distetusta proteiinista, joka osallistuu pristinamysiinien biosynteesiin, joiden NH2-pääsekvenssi tai jokin sisäinen sekvenssi on määritetty, on mahdollista eristää aiemmin valmistetuista genomipankeista kosmidi, joka käsittää tä-10 män saman proteiinin rakennegeenin, tai toisaalta identifioida kosmidien käsittämistä, jo sekventoiduista geeneistä vastaava rakennegeeni.
5.1. Kosmidien plBVl ja pIBV3 eristäminen, jotka käsittävät pristinamysiini Ι1Ά -syntaasin kahden alayksi- 15 kön yhden rakennegeenin tai molemmat kaksi rakennegeeniä 5.1.1. Yhden niistä proteiineista identifiointi ja puhdistaminen, jotka liittyvät pristinamysiinien synteesin viimeiseen vaiheeseen: pristinamysiini HA -syntaasi
Kuten johdannossa mainittiin, pristinamysiinin Ha 20 synteesin viimeinen vaihe vastaa D-proliinin 2-3-sidoksen hapettumista dehydroproliiniksi. Tästä aktiivisuudesta :**|ϊ vastuussa oleva proteiini on puhdistettu homogeeniseksi, ;***· kuten tämä esimerkki osoittaa.
·· 5.1.1. A Pristinamysiini XIA -syntaasiaktiivisuuden ··* 25 määrittäminen # ♦
• β·β Tässä esimerkissä esitetään pristinamysiinin IIA
• · · .
biosynteesireitin aktiivisuuden määritys, jota ei ole vie- · · * lä koskaan kuvattu ja jolla on se merkittävä ominaisuus, että se ilmentyy vain pristinamysiinien tuotannon aikana.
• · · *·ί·* 30 Kyseessä on pristinamysiini IIA -syntaasi, joka katalysoi *··
*...· pristinamysiinin IIB konversiota pristinamysiiniksi IIA
• · .***. pristinamysiinin IIB D-proliinitähteen hapettumisen väli- *** tyksellä 2-3-dehydroproliinitähteeksi (kuvio 8) molekulaa-• risen hapen ja FMNH2:n läsnä ollessa. Määritettäviä entsyy mi·* 35 mifraktioita (0,002 - 0,005 yksikköä) inkuboidaan 1 tunnin Φ • · .
26 117674 ajan 27 °C:ssa 500 μ1:η kokonaistilavuudessa 50 mM bis-tris-propaanipuskuria, pH 6,8, joka sisältää NADH:ta (500 μΜ), FMN:ää (5 μΜ), pristinamysiiniä IIB (20 μΜ) ja 0,02 yksikköä FMN-reduktaasia (Boehringer Mannheim).
5 Muodostunut pristinamysiini IIA määritetään HPLCillä, sitten kun inkubointi on keskeytetty lisäämällä 500 μΐ 0,1 N kloorivetyhappoa ja 500 μΐ asetonitriiliä, ja näytettä sentrifugoitu 5 minuutin ajan 5 000 x g:ssä. 150 μΐ sentrifugointisupernatanttia ruiskutetaan 15 cm: n 10 Nucleosil 5-C8 -kolonniin, jota eluoidaan seoksella, jossa on 34 % asetonitriiliä ja 66 % 0,1 M fosfaattipuskuria, pH 2,9. Pristinamysiinit IIA ja IIB todetaan niiden UV-absor-banssin 206 nm:ssä perusteella.
Entsyymiaktiivisuusyksiköksi määritellään entsyymi-15 määrä, joka tarvitaan 1 mikromoolin pristinamysiiniä IIA * syntetisoimiseksi tunnissa kuvatuissa olosuhteissa.
5.I.I.B. pristinaespiraliksen SP92 pristinamy-siini IIA -syntaasin puhdistus Tämä esimerkki esittää, miten pristinamysiinin IIA 20 biosynteesireittiin osallistuva pristinaespiralis SP92 -entsyymi voidaan puhdistaa.
Käyttäen edellä esimerkissä 5.1.1.A kuvattua määri- • · ·'**· tystä pristinamysiini IIA -syntaasin puhdistaminen suori- • * tetaan, kuten alla kuvataan, huolehtien siitä, että aktii- • · · · 25 viset fraktiot jäädytetään ja säilytetään -30 °C:ssa kunkin • · • '·' vaiheen välillä, jos tarpeen.
• * ·
"ΐ.* 150 g:n sentrifugointipelletti, joka on pesty 0,1 M
* fosfaattipuskurilla, pH 7,2, jossa on 10 % v/v glyserolia, S. pristinaespiralis SP92 -viljelmästä, joka on otettu • i · *·!* 30 talteen pristinamysiinien tuotantovaiheen alussa, liete- ··· *...* tään 450 ml:aan 50 mM bis-tris-propaanipuskuria, pH 6,8, .·**. joka sisältää pitoisuuden 5 mM DTT sekä 0,2 mg/ml lyso- ··· tsyymiä. Näin saatua suspensiota inkuboidaan 45 minuutin • · • ajan 27 °C:ssa, minkä jälkeen sitä sentrifugoidaan 50 000 x * · · M.* 35 g:ssä 1 tunnin ajan. Näin talteen saatu raakauute frak- m·· • · 117674 27 tioidaan seostamalla ammoniumsulfaatilla. Proteiinifraktiosta, joka saostuu 40 - 55 %:n kyllästyksessä, poistetaan suolat Sephadex G25 Fine -kolonnissa, minkä jälkeen se ruiskutetaan (100 mg/ruiske) 50 mM bis-tris-propaani-5 puskurissa, pH 6,8, jossa on pitoisuus 1 mM DTT, MonoQ HR 10/10 -kolonniin. Proteiinit eluoidaan käyttämällä lineaarista KCl-gradienttia (0 - 0,5 M). Entsyymiaktiivisuutta sisältävät (mikä osoitetaan esimerkissä 5.1.1.A kuvatulla kokeella) fraktiot yhdistetään ja haihdutetaan 20 ml:ksi 10 Centriprep 10:ssä. Laimennetaan yhdellä tilavuudella 50 mM bis-tris-propaanipuskuria, pH 6,8, 1 mM DTT, joka sisältää pitoisuuden 2 M ammoniumsulfaattia, minkä jälkeen proteiineille suoritetaan kromatografia-ajo (22,5 mg/ruiske) fe-nyyli-Superose HR 10/10 -kolonnissa käyttäen laskevaa am-15 moniumsulfaattigradienttia (1,0 M -1 0 M). Parhaat haluttua aktiivisuutta sisältävät fraktiot yhdistetään, haihdutetaan jälleen 1 ml:ksi Centriprep 10:ssä ja panostetaan sitten (200 μΐ/ruiske) Bio-Sil SEC 250 -kolonniin. Aktii-visuuspiikki todetaan tässä tekniikassa molekyylipainokes-20 kuksessa 77 000. Aktiivisuutta sisältävä fraktio ruiskute- # taan MonoQ HR 5/5 -kolonniin 50 mM bis-tris-propaanipusku- • 2tJ rissa, pH 6,8, 1 mM DTT, ja eluoidaan käyttämällä lineaa- :***: rista KCl-gradienttia (0 - 0,5 M).
• · · ··· Tämän vaiheen jälkeen entsyymi on puhdas ja SDS- ··«· ....: 25 PAGE-elektroforeesissa todetaan kaksi alayksikköä, joiden • molekyyiipaino on 35 000 ja 50 000. Ne erotetaan 25 cm:n • 1 · #···1 Vydac C4 -kolonnissa, jota eluoideen käyttäen lineaarista • · ♦ gradienttia 30 - 50 % asetonitriiliä vedessä, jossa on 0,07 % trifluorietikkahappoa.
• · 1 ···.- ···· ♦ · · .
• ♦ • · * ··· • · * · ··1 ·····, * · * * * « t ' · · 2 ·«··1 117674 28
Taulukko: Ρτ-iBtlnaariiinl IIA -ipitaaiin puhdistasiηκη
Puhdistu·- Tll. Proteiineja Spea. akt. Saanto Puhdistus- vaihe (ai) (eg) μηοΐ/h/eg (») tekijä 5 raakauute 490 1690 0.14 100 1 40 - 55 * a.s. 60 1050 0,19 85 1.4
MonoSJ 10/10 95 45 3,0 58 21 fenyyli-Sup. 8 2,8 12 14 86 10 BioSil SEC 5 1.3 18 14 130
MonoQ 5/5 10 0,7 23 10 160
Puhdistustekijä lasketaan fraktioiden spesifisen aktiivisuuden kohoamisesta puhdistuksen aikana.
15 5.1.2. Oligonukleotidien valmistaminen proteiini- sekvensseistä lähtien Tämä esimerkki kuvaa, miten lähtemällä esimerkissä 5.1.1.B kuvatun mukaisesti puhdistetun pristinamysiini IIA -syntaasin kahden alayksikön NH2-pääsekvensseistä on mah-20 dollista syntetisoida oligonukleotidejä. Pristinamysiini IIA -syntaasin kahta alayksikköä kutsutaan SnaAjksi ja SnaB:ksi ja ne vastaavat polypeptidejä, joiden molekyyli-paino on 50 000 ja 35 000 vastaavasti esimerkissä 5.1.1.B kuvatun mukaisesti.
·* · i .* 25 Proteiinien SnaA ja SnaB, jotka vastaavat pristina- ··· mysiini IIA -syntaasin alayksiköitä, NH2-pääsekvenssit mää-,.*·* ritettiin mikrosekventoinnilla. Tämä suoritetaan Edmanin ·:*·: pilkkomistekniikalla käyttäen automaattista sekventoijaa • ·*· (Applied Biosystems malli 407A), joka on kytketty HPLC- • * · · 30 laitteeseen fenyylitiohydantoiinijohdannaisten identifioi- miseksi. Kummallekin niistä määritettiin noin 30 tähdettä.
β β·β Proteiini SnaA: (vrt. tähteet 2-29 sekvenssissä • « « "* tunnusnro 2) ♦ *
*':** T A P(R)(R,W)R ITLAGIIDGPGGHVA A(W)R
35 HP (A) T
*:·*: Proteiini SnaB: (vrt. tähteet 2-31 sekvenssissä *. tunnusnro 3) ···
***. TAPILVATLDTRGPAATLGTI T ( R) A
V(R)A A E A
117674 29
Lisäksi näiden kahden polypeptidin sisäisiä sekvenssejä määritettiin pilkkomalla SnaA:ta ja SnaB:tä tryp-siinillä ja puhdistamalla saatuja fragmentteja Vydac C18 -HPLC-kolonnissa. Löydettiin seuraavat sisäiset sekvens-5 sit:
Proteiini SnaA: (vrt. tähteet 365 - 384 sekvenssissä tunnusnro 2) G A D G F N IPFPYLPG S A D D F V Proteiini SnaB: (vrt. tähteet 122 - 136 sekvenssis-10 sä tunnusnro 3)
G L(-)D S FDDDAFVHD R
Lähtien proteiinien SnaA ja SnaB sisäisten fragmenttien kummassakin sekvenssissä alleviivatuista alueista sekä Streptomycesille spesifisestä geneettisen koodin de-15 generoitumisesta (vrt. esimerkki 8) syntetisoitiin seuraa vat oligonukleotidiseokset automaattisella syntetisaatto- * rilla Biosearch 8600. Sitten niitä puhdistettiin jo kuvatulla tekniikalla (Sawadogo, M., ja Von Dyke, M. W., 1991). Geenit snaA ja snaB merkitsevät vastaavasti pro-20 teiinien SnaA ja SnaB rakennegeenejä.
Seos, joka vastaa SnaA:n sisäisen sekvenssin alle- ·· · • viivattua osaa:
.·***! ATC GAC TTC CCC TAC CTC CCC GG
·«·
·;· T T G T G G
···
25 A
• 1
• # T
• · · 1 • φ · ,·./ Seos, joka vastaa SnaB:n sisäisen sekvenssin alle- • » · viivattua osaa:
, TTC GAC GAT GAT GCA TTC GTC CAT GAC
’·:2 30 C C T G c • · · • « * · r% • « ^ ··· _.
: : g ·· ....: 5.1.3. Synteettisten oligonukleotidiseosten leimaa- *( minen ja hybridointi kannan SP92 genomi-DNA-pankkeihin • 9 1 *···| 35 Tämä esimerkki kuvaa, miten oligonukleotidejä, jot- 1 ka ovat spesifisiä pristinamysiinien biosynteesigeenille, 2 1 1 7674 ' . , 30 ^ voidaan leimata radioaktiivisesti ja hybridoida sitten membraaneihin, joihin on siirretty Sj_ pristinaespiralis SP92 -genomipankkien DNA:ta.
Oligonukleotidien leimaaminen suoritetaan siirtä-5 mällä 5'-pääasemaan ryhmä ATP:n [gamma-32P]fosfaatti käyttäen T4-polynukleotidikinaasia. Tämä leimaaminen suoritetaan, kuten kuvataan julkaisussa Maniatis et ai. (1989). Leimauksen jälkeen oligonukleotidejä käytetään niitä puhdistamatta.
10 Noin 2 x 500 ng kutakin oligonukleotidiseosta lei mattiin täten 32P:llä ja niitä käytettiin hybridisaatiossa kumpaankin kahteen pankkiin.
Kummankin pankin membraanien hybridisaatio suoritetaan menettelyjärjestelyn mukaan, joka on saatu menettely-15 järjestelyistä, joita ovat kehittäneet Meinkoth, J., ja Wahl, G. (1984) ja Hames, B.D., ja Higgins, S. J. (1985): 15 membraania esihydridoidaan 3 tunnin ajan 50 °C:ssa 40 ml:ssa liuosta, joka sisältää seuraavia: Denhardt (x5) [Denhardt (xlOO): 2 % (w/v) Ficoll, 2 % (w/v) polyvinyyli-20 pyrrolidoni, 2 % (w/v) BSA)], SSC (x5) [SSC (x20): NaCl 3 M, natriumsitraatti 0,3 M), NaP04 pH 6,5 50 mM, SDS 0,1 %, lohensperma-DNA 250 pg/ml] .
* · .···. Hybridisaatio suoritetaan sitten yön yli 50 °C:ssa • * 20 ml:ssa samaa liuosta, johon lisätään 500 ng leimattuja 25 oligonukleotidejä.
• · . , Suodattimia pestään sitten SSC (x6) -liuoksella, • · · **|#* 0,5 % SDS:ää, 2 kertaan 30 minuutin ajan ympäristön lämpö- · · *·* tilassa, minkä jälkeen kokeellisesti vähittäin kohoavissa lämpötiloissa (50 - 65 °C). Näiden viimeisten pesujen läm-*.·.· 30 pötilaa nostetaan progressiivisesti perättäisten autora- m* m diokuvien ottojen jälkeen oligonukleotidiseoksiin hybri- .···. doituvien kloonien spesifisyyden määrittämiseksi.
• · • · · * • · · · · • · 1 2 3 4 5 2 *·* 3 4 * * * • ' ; 5 • · 117674 31 5.1.4. Kosmidien pIBVl ja pIBV3 eristäminen ja snaA- ja snaB-geenejä sisältävien alueiden määritys Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista eristää esimerkissä 3 kuvatun mukaisesti rakennettuja kosmide-5 ja, jotka sisältävät pristinamysiinien biosynteesigeenejä.
Kosmidit pIBVl ja pIBV3 eristettiin kahdesta kloonista, jotka olivat peräisin vastaavasti kantaan HB101 valmistetusta pankista ja kantaan DH1 valmistetusta pankista, joita oli hybridoitu kahteen oligonukleotidiseok-10 seen samanaikaisesti pIBVljlle ja proteiinin SnaA sisäiseen sekvenssiin perustuvaan oligonukleotidiseokseen plBV3:lie.
Nämä kosmidit puhdistettiin, kuten kuvattiin esimerkissä 2. Kosmidit pIBVl ja plBV3 sisältävät vastaavasti 15 pristinaespiralis SP92 -genomi-DNA-insertin, joiden koot on arvioitu vastaavasti 30 ke:ksi ja 34 ke:ksi. Muo- % dostettiin kartta (kuviot 4 ja 6) käyttäen pilkkomisia eri restriktioentsyymeillä toimittajan menettelyjärjestelyjen mukaan (New England Biolabs, Beverly, MA, 01915-5510 USA).
20 pIBVlin ja pIBV3:n eri entsyymeillä pilkotun DNA:n
Southern-hybridisaatiot oligonukleotidiseoksiin tekivät •V. mahdolliseksi identifioida tämän kosmidin geenit snaA ja/ • · .··*. tai snaB sisältävän alueen.
• · ‘ —
Southern-määritykset suoritettiin, kuten kuvataan ||||. 25 julkaisussa Maniatis et ai. (1989). Restriktiofragmenttien • · . . elektroforeettisen erotuksen jälkeen 0,8-%:isessa agaroo- * · · · · ••j#* sigeelissä DNA siirretään Biohylon Z* -membraanille (Bio- ' • · · *·’ * prope System). Näin membraaneille siirretyn DNA:n hybridi saatio oligonukleotidiseoksiin suoritettiin, kuten kuvat- :.·.· 30 tiin esimerkissä 5.1.3.
* · · Näillä Southern-määrityksillä oli mahdollista osoittaa, että kosmidissa pIBVl oli 6 ke:n BamHI-fragment-ti, joka sisälsi esimerkissä 5.1.2. syntetisoituihin koet- • ••M . . 4 * · , timiin (peräisin proteiineista SnaA ja SnaB) nähden homo- i.;.: 35 logisia sekvenssejä, sekä BamHI-fragmentin sisäinen 2,5 • · · · * » · 117674 32 ke:n EcoRI-fragmentti, joka sisälsi sekvenssejä, jotka olivat homologisia koettimiin nähden, jotka olivat peräisin yksinomaan proteiinista SnaA. Lisäksi kosmidilla pIBV3 saadut hybridisaatiosignaalit osoittivat, ettei siinä ol-5 lut kuin 2,5 ke:n EcoRI-fragmentti, joka sisälsi sekvenssejä, jotka olivat homologisia yksinomaan proteiinista SnaA peräisin oleviin koettimiin nähden.
5.2. Kosmidin pIBV2 eristäminen, joka sisältää 3-hydroksipikoliinihappo-AMP-ligaasin rakennegeenin 10 (snabA) Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista saada esimerkissä 3 rakennetun kaltainen kosmidi, joka sisältää pristinamysiinien I vähintään yhden biosynteesigeenin.
5.2.1. 3-hydroksipikoliinihapon aktivaatioon liit- 15 tyvän proteiinin identifiointi ja puhdistaminen Tämä esimerkki esittää, miten 3-hydroksipikoliini-hapon aktivaatiosta vastuussa oleva proteiini voidaan puhdistaa homogeeniseksi lähtien S. pristinaespiraliksesta SF92.
20 5.2.1.A. 3-hydroksipikoliinihappo-AMP-ligaasin aktiivisuuden määrittäminen f :***: Tämä esimerkki esittää pristinamysiinin IA biosyn- ·***· teesireitin aktiivisuuden määrityksen, jota ei ole vielä • · · milloinkaan kuvattu ja jolla on se merkittävä ominaisuus, • · · * 25 ettei se ilmenny kuin pristinamysiinien tuotantojakson • · ; aikana. Kyseessä on 3-hydroksipikoliinihappo-AMP-ligaasi, * * * '".* joka katalysoi 3-hydroksipikoliinihappoadenylaatin muo- * · · .
* dostumista (kuvio 9) lähtien tästä vapaasta haposta ja ATP:stä MgCl2:n läsnä ollessa.
*·:.* 30 Määritettäviä entsyymifraktioita (0,002 - 0,020 • · * ·...· yksikköä) inkuboidaan 15 minuutin ajan 27 °C:ssa 250 μ1:η
.***. kokonaistilavuudessa 50 mM bis-tris-propaanipuskuria, pH
6,8, 1 mM DTT, 10 % v/v glyserolia, 3-hydroksipikoliiniha- • ♦ . pon (1 mM), ATP:n (2 mM), MgCl2:n (5 mM) ja tetranatriumpy- • · ♦ • · · ··· ♦····'· • · ' 33 ' 117674 rofosfaatin, joka on leimattu fosforiatomin radioaktiivisella isotoopilla 32 (200 μΜ), läsnä ollessa.
Reaktio keskeytetään lisäämällä 1 ml 10 g/litra aktiivihiililietettä seoksessa, jossa on 75 % 0,1 M tetra-5 natriumpyrofosfaattiliuosta ja 25 % 14-%:ista perkloori-happoliuosta. Sekoituksen jälkeen hiili otetaan talteen ja pestään kahteen kertaan 1 ml:11a pyrofosfaatti-perkloori-happoseosta. Radioaktiiviset orgaaniset molekyylit eluoi-daan sitten kolmeen kertaan 1 ml:11a seosta, jossa on 50 % 10 metanolia ja 50 % 1 M ammoniakkiliuosta, tuikeampullissa, joka sisältää 12 ml vettä. Radioaktiivisuus mitataan Cerenkov-efektistä tuikelaskijalla (Minaxi TriCarb 4000 Packard).
Entsyymiaktiivisuusyksiköksi määritellään se määrä 15 entsyymiä, joka tarvitaan 1 mikromoolin pyrofosfaattia sisällyttämiseksi ATP:hen 1 tunnissa edellä kuvatuissa olosuhteissa.
5.2.I.B. S. pristinaespirallksen SP92 3-hydroksipi-koliinihappo-AMP-ligaasin puhdistaminen 20 Tämä koe esittää, miten pristinamysiinin IA biosyn- teesireittiin osallistuva pristinaespiralis SP92 -ent- ''& :***: syymi voidaan puhdistaa.
• · ·***. Käyttäen edellä esimerkissä 5.2.1.A kuvattua määri- • » · tystä 3-hydroksipikoliinihappo-AMP-ligaasin puhdistaminen ···· 25 suoritetaan, kuten alla kuvataan, huolehtien siitä, että • · . aktiiviset fraktiot jäädytetään -70 °C:ssa ja säilytetään • · · .
-30 °C:ssa kunkin vaiheen välillä, mikäli tarpeen.
• · ·
* 234 g:n sentrifugointipelletti, joka on pesty 0,1 M
fosfaattipuskurilla, pH 7,2, jossa on 10 % v/v glyserolia, • · · 1 *.J.# 30 S. pristinaespiralis SP92 -viljelmästä, joka on otettu *·· talteen pristinamysiinien tuotantovaiheen alussa, liete- .**·. tään 234 ml: aan 100 mM Tris-HCl-puskuria, pH 8,0, joka • · ·
sisältää pitoisuudet 4 mM DTE, 1 mM bentsamidiini, 1 mM
• · . PMSF, 15 % v/v glyserolia ja 0,6 mg/ml lysotsyymiä. Näin 35 saatua suspensiota inkuboidaan 30 minuutin ajan 27 °C:ssa, 117674 34
minkä jälkeen sitä sentrifugoidaan 50 000 x grssä 1 tunnin ajan. Näin saatu raakauute ruiskutetaan 100 mM Tris-HCl-puskurissa, pH 8,0, 4 mM DTE, 1 mM bentsamidiini, 1 mM
PMSF, 15 % v/v glyserolia Q-Sepharose Fast Flow -kolonniin 5 (80 ml). Proteiinit eluoidaan käyttäen lineaarista KC1-
gradienttia (0 -» 0,4 M). Entsyymiaktiivisuutta sisältävät fraktiot (jotka osoitetaan esimerkissä 5.2.1.A kuvatulla kokeella) yhdistetään ja niitä laimennetaan yhdellä tilavuudella 100 mM Tris-HCl-puskuria, pH 8,0, 1 mM bentsami-10 diini, 1 mM PMSF, 15 % v/v glyserolia, joka sisältää pitoisuuden 2 M ammoniumsulfaattia. Proteiineilla suoritetaan sitten kromatografia-ajo fenyyli-Sepharose-kolonnissa (50 ml) käyttäen laskevaa ammoniumsulfaattigradienttia (1,0 M -» 0 M) 100 mM Tris-HCl-puskurissa, pH 8,0, 1 mM
15 bentsamidiini, 1 mM PMSF, 15 % v/v glyserolia. Lisätään pitoisuus 4 mM DTE, minkä jälkeen aktiiviset fraktiot yhdistetään, ne konsentroidaan 5 ml:ksi Centriprep 10:ssä, ja panostetaan sitten Superose 12 prep. laatu -kolonniin (100 ml). Haluttua aktiivisuutta sisältävät fraktiot yh-20 distetään ja ruiskutetaan 100 mM Tris-HCl-puskurissa, pH 8,0, 4 mM DTE, 1 mM bentsamidiini, 1 mM PMSF, 15 % v/v :**]: glyserolia (noin 6 mg/ruiske) MonoQ HR 5/5 -kolonniin, **": jota eluoidaan käyttäen lineaarista KCl-gradienttia (0 -* • * · 0,4 M). Aktiiviset fraktiot yhdistetään, konsentroidaan ···· 25 1 ml:ksi Centricon 10:ssä, niitä laimennetaan 3 tilavuu- # · . della 50 mM bis-tris-propaanipuskuria, pH 6,8, 4 mM DTE, * « · ‘II,* 1 mM bentsamidiini, 1 mM PMSF, 15 % v/v glyserolia, minkä · Φ • · · • jälkeen ne ruiskutetaan (2 mg/ruiske) tässä viimeksi mainitussa puskurissa MonoQ HR 5/5 -kolonniin, jota eluoidaan *·:.* 30 käyttäen lineaarista KCl-gradienttia (0 -> 0,3 M). Haluttua
• M
:...· ligaasia sisältävät parhaat fraktiot yhdistetään ja panos- .*·*. tetaan sitten 20 mM natriumfosfaattipuskurissa, pH 6,8, • · · 50 mM natriumsulfaatti Bio-Sil SEC 250 -kolonniin. Aktii- • · • visuuspiikki todetaan tässä tekniikassa molekyylipainokes- :.i.’ 35 kuksessa 60 000.
····· • · 117674 35
Proteiinia, jolla on 3-hydroksipikoliinihappoa aktivoivaa aktiivisuutta, kutsutaan jatkossa SnbAtksi.
Tämän vaiheen jälkeen entsyymi on puhdas ja SDS-PAGE-elektroforeesissa sen molekyylipainoksi arvioidaan 5 noin 67 000.
Taulukko: S-hydrokalpikolllnlhappo-MiP-llryBln puhdlstaalnen
Puhdistua- Tll. Protei lneja Spes. akt. Saanto Fuhdlstua- 10 valhe (ai) (ag) |]Bol/h/ngs (t) tekijä raakauuta 246 2050 (0,06) Q-Sepharose 40 188 0,47 100 1 fenyyli-Seph. 70 35 2,21 88 4,7 15 Superoae 12 16 17 2,03 39 4,3
MonoS PH 8,0 4,5 9,0 2,09 21 4,5
Monoö pH 6,8 1,0 2,0 2,9 6,6 6,2
Bio-sil 250 2,5 0,23 12,4 3,2 26 aAktiivisuutta raakauutteessa el pystytä mittaamaan tarkasti, mikä johtuu 3-hydroksl- ,5 20 pikoliinihapolle ei-spesifisistä vaihdoista pyrofosfaatin ja ATP:n välillä. v
Puhdistustekijä lasketaan fraktioiden spesifisen aktiivisuuden kohoamisesta puhdistuksen aikana.
5.2.2. Oligonukleotidien valmistaminen proteiini- „ . 25 sekvenssistä lähtien • * · *#>·* Tämä esimerkki kuvaa, miten lähtien 3-hydroksipiko- • · *···* liinihappo-AMP-ligaasiproteiinin NH2-pää- ja sisäisistä sekvensseistä on mahdollista syntetisoida oligonukleoti-
«•»M
* * deja.
iti*| 30 Proteiinin SnbA NH2-pääsekvenssi määritettiin mik- rosekventoinnilla, kuten kuvattiin esimerkissä 5.1.2. Näin identifioitiin noin 20 tähdettä, . .·, Identifioitiin samoin proteiinin SnbA sisäinen, i * t • · · .···, noin 20 aminohapon sekvenssi suorittamalla trypsiinihydro- * · *** 35 lyysi ja saatujen fragmenttien puhdistaminen Vydac C18 i·· -HPLC-kolonnissa.
····· r • · * ··· ··· ··· «*··· • φ 117674 36 3-hydroksipikoliinihappo-AMP-ligaasiproteiinin NH2-pääsekvenssi: (vrt. tähteet 1-21 sekvenssissä tunnusnro 5) M L· E» G S VPWPEDVAAKY R A A G Y 5 3-hydroksipikoliinihappo-AMP-ligaasiproteiinin sisäinen sekvenssi: (vrt. tähteet 448 - 467 sekvenssissä tunnusnro 5) V S A (-) EVEGHLGAHPDVQQ A A Lähtien kummassakin sekvenssissä alleviivatuista 10 alueista ja geneettisen koodin Streptomycesille spesifisen degeneraation funktiona (vrt. esimerkki 8) syntetisoitiin seuraavat oligonukleotidiseokset:
Seos, joka vastaa 3-hydroksipikoliinihappo-AMP-li-gaasiproteiinin NH2-pääsekvenssissä alleviivattua osaa: 15 5' 3' GTC CCC TGG CCC GAG GAC GTC GCC GCC AAG TAC ^
G G G G G G
Seos, joka vastaa 3-hydroksipikoliinihappo-AMP-li-gaasiproteiinin sisäisessä sekvenssissä alleviivattua 20 osaa: 5’ 3*
• « J
• ·
.*·*. GAG GTC GAG GGC CAC CTC GGC GCC CAC CCC GAC GTC CAG CAG GC
• ·
•S. 6 G G G G G G
···· e#„j 25 5.2.3. Synteettisten oligonukleotidien seosten lei- • · . . maaminen ja hybridisaatio pristinaespiraliksen SP92 • · · genomi-DNA-pankkeihin • · · *·* * Tämä esimerkki kuvaa, miten pristinamysiinien bio- synteesigeenille spesifisiä oligonukleotidejä voidaan lei- • · 30 mata radioaktiivisesti ja sitten hybridoida membraaneihin, ··· :.,.J joille on siirretty pristinaespiraliksen genomipankkien ,···. DNA: ta.
* · ....· Oligonukleotidien leimaaminen suoritetaan siirtä- . mällä 5'-pääasemaan ATP:n [gamma-32P]-fosfaattiryhmä käyt- • · · • « · *·· ····· • · 117674 37 täen T4-polynukleotidikinaasia, kuten esitettiin esimerkissä 5.1.3.
Noin 2 x 500 ng kutakin oligonukleotidiseosta leimattiin täten 32P:llä ja niitä käytettiin hybridisaatiois- .
5 sa kumpaankin kahteen pankkiin.
Hybridisaatio kummankin pankin membraaneihin suoritettiin, kuten kuvattiin esimerkissä 5.1.3.
5.2.4. Kosmidin pIBV2 eristäminen ja 3-hydroksipi-koliinihappo-AMP-ligaasin rakennegeenin sisältävän alueen 10 määrittäminen Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista saada esimerkissä 3 rakennetun kaltainen kosmidi, joka sisältää vähintään 3-hydroksipikoliinihappo-AMP-ligaasin rakenne-geenin.
15 Kosmidi pIBV2 eristettiin coli -kantaan DH1 val mistetun pankin kloonista, joka oli hybridoitunut kahteen oligonukleotidiseokseen samanaikaisesti.
Tätä kosmidia puhdistettiin, kuten kuvattiin esimerkissä 2. Se sisältää pristinaespiraliksen SP92 genomi-20 DNA-insertin, jonka kooksi arvioidaan 47 ke. Muodostettiin kartta (kuvio 5) pilkkomalla eri restriktioentsyymeillä, f ·*·*: kuten esitettiin esimerkissä 5.1.4.
• · ·***. pIBV2:n eri entsyymeillä pilkotun DNA:n Southern- hybridisaatioilla oligonukleotidiseoksiin oli mahdollista ···« 25 identifioida 3-hydroksipikoliinihappo-AMP-ligaasin raken- • · . negeenin sisältävä alue. Southern-määritykset ja hybridi- I « · säätiöt suoritettiin, kuten kuvattiin esimerkissä 5.1.4.
• · · '·'* Hybridisaatiotuloksista voitiin osoittaa, että kos- midissa plBV2 oli 5,5 ke:n EcoRi-Bglii-fragmentti, joka • ·*· *.ί.· 30 sisälsi sekvenssin, joka oli homologinen esimerkissä 5.2.2 • · · ·...· syntetisoituihin koettimiin nähden.
.*··. 5.3. Pristinamysiini I -syntaasi-II:n (SnbC) raken- ··· negeenin osan läsnäolon kosmidissa pIBV3 osoittaminen • * • Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista iden- 35 tifioida pristinamysiinien I biosynteesigeenien läsnäolo *‘**: jo eristetyssä kosmidissa (esimerkki 5.1).
38 117674 5.3.1. Prlstlnamyslinl I -syntaasi-II:n identifiointi, joka liittyy treoniini- ja aminovoihappotähteiden sisällytykseen pristinamysiinin IA peptidiketjuun Tämä esimerkki esittää, miten proteiini, joka on ·.
5 vastuussa treoniini- ja aminovoihappotähteiden sisällytyk- . c sestä pristinamysiinin IA peptidiketjuun, voidaan puhdistaa homogeeniseksi lähtien pristinaespiraliksesta SP92.
5.3.1. A. Pristinamysiini I -syntaasi-II:n osa-aktiivisuuksien määritys 10 Tämä esimerkki esittää pristinamysiinin IA biosyn- teesireitin aktiivisuuksien määrittämisen, joita ei ole vielä milloinkaan kuvattu ja joilla on se merkittävä ominaisuus, etteivät ne ilmenny kuin pristinamysiinien tuotantojakson aikana. Kyseessä ovat treoniini- ja aminovoi-15 happotähteiden sisällytyksestä pristinamysiinin IA peptidiketjuun (kuvio 10) ATP:n ja MgCl2:n läsnä ollessa vas- ? tuussa olevan peptidisyntaasin osa-aktiivisuudet. ί
Treoniini-AMP-ligaasi- ja aminovoihappo-AMP-ligaa- I
siaktiivisuudet mitataan ATP-pyrofosfaattivaihdon entsy- r 20 maattisella kokeella, joka on analoginen kokeeseen, jota kuvattiin kohdassa 5.2.1.A 3-hydroksipikoliinihappo-AMP- ·*·*: ligaasille.
• · .**·. Entsyymin aminoasylaatioreaktiot treoniinin tai • · * alaniinin (aminovoihappoanalogi, jota esiintyy pristinamy- • t·· 25 siinissä IC) kanssa tekevät mahdolliseksi erottaa peptidi- • * • syntaasi muista entsyymeistä, jotka voivat aiheuttaa ATP-« · · "*.* pyrofosfaattivaihdon, ja etenkin aminoasyyli-tRNA-syntaa- • · » • seista. Siten entsyymin alla kuvattua aminoasylaatiokoetta tritiumilla leimatun treoniinin kanssa käytettiin tässä 30 esimerkissä.
• · · Määritettäviä entsyymifraktioita (0,2 - 2 yksikköä) ,···. inkuboidaan 15 minuutin ajan 27 °C:ssa kokonaistilavuudessa 250 μΐ 50 mM bis-tris-propaanipuskuria, pH 6,8, 1 mM DTT, • * • 10 % v/v glyserolia, kun läsnä on 1 pCi [3-3H]-L-treoniinia 35 (15 Ci/mmol), ATP:tä (2 mM) ja MgCl2:ta (5 mM).
• · 117674 39
Reaktio keskeytetään lisäämällä 150 μΐ 25-%:ista trikloorietikkahappoliuosta. Saostuneet proteiinit otetaan talteen mikrosuodattimelle ja pestään 3 kertaan 400 piillä 7-%:ista trikloorietikkahappoa, minkä jälkeen niitä eluoi-5 daan 2 kertaan 400 piillä 1 N NaOH-liuosta tuikeampullis-sa, joka sisältää 1 ml:n 1 N HCllää ja 12 ml tuikekoktai-lia (Readygel Beckmann). Tämän ampullin sisältämä radioaktiivisuuden määrä mitataan tuikelaskijalla (Minaxi TriCarb 4000 Packaed). Se edustaa treoniinin määrää, joka on kiin-10 nittynyt kovalenttisesti haluttuun peptidisyntaasiin.
Entsyymiaktiivisuusyksiköksi määritellään se määrä entsyymiä, joka tarvitaan kiinnittämään kovalenttisesti 1 pikomooli treoniinia 15 minuutissa edellä kuvatuissa olosuhteissa.
15 5.3.I.B. Pristinamysiini I -syntaasi-ll:n puhdista minen Tämä esimerkki esittää, miten pristinamysiinin IA biosynteesireittiin osallistuva pristinaespiralis SP92 t -entsyymi voidaan puhdistaa.
20 Käyttäen edellä esimerkissä 5.3.1.A kuvattua määri tystä treoniini- ja aminovoihappotähteiden sisällytyksestä ·* · > \ *,i pristinamysiinin IA peptidiketjuun vastuussa olevan pepti- :***; disyntaasin puhdistaminen suoritetaan, kuten kuvataan ai- «·· ··. la, huolehtien siitä, että työskennellään 4 “Cissa ja säi- • Ml 25 lytetään aktiiviset fraktiot -70 °Cissa.
• ,·. 150 gin sentrifugointipelletti, joka on pesty 0,1 M
• · · fosfaattipuskurilla, pH 7,2, jossa on 10 % v/v glyserolia, * · · * pristinaespiralis SP92 -viljelmästä, joka on otettu talteen pristinamysiinien tuotantovaiheen alussa, liete- *·!* 30 tään 450 mliaan 100 mM Tris-HCl-puskuria, pH 8,0, joka * · ·
sisältää pitoisuudet 4 mM DTE, 1 mM bentsamidiini, 1 mM
Φ ·***. PMSF, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 15 % v/v glyserolia. Näin saa- » ··· tua suspensiota jauhetaan ranskalaisessa painekennossa, > •t jossa paine on säädetty 350 kpiksi/cm2, minkä jälkeen sitä * · · *···* 35 sentrifugoidaan 50 000 x gissä 1 tunnin ajan. Näin talteen • · 117674 40 saatu raakauute ruiskutetaan 100 mM Tris-HCl-puskurissa, pH 8, 4 mM DTE, 2 mM bentsamidiini, 2 mg/litra leupeptii-niä, 1 mg/litra E-64:ää, 15 % v/v glyserolia Q-Sepharose Fast Flow -kolonniin (200 ml). Proteiinit eluoidaan käyt-5 täen lineaarista KCl-gradienttia (0 1 0,6 H). Kunkin fraktion poistuessa kolonnista siihen lisätään 1/10 sen tilavuudesta liuosta, jossa ovat pitoisuudet 1 mM PMSF, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA. Entsyymiaktiivisuutta sisältävät fraktiot (jotka osoitetaan esimerkissä 5.3.1.A kuvatulla kokeella) 10 yhdistetään ja konsentroidaan Centriprep 30:ssa 28 ml:n lopputilavuudeksi. Tämä konsentraatti ruiskutetaan 4 ml:n erinä Superdex 200 Hi-Load 16/60 -permeaatiokolonniin, jota on tasapainotettu 50 mM bis-tris-propaanipuskurissa, pH 6,8, 1 mM bentsamidiini, 4 mM DTE, 0,2 mM Pefabloc-val-15 miste, 1 mM EDTA, 0,1 M KC1, 20 % v/v glyserolia. Määrityksen jälkeen aktiiviset fraktiot yhdistetään ja konsentroidaan 15 ml:ksi Centriprep 30:ssa, minkä jälkeen niistä f poistetaan suolat PD-l0:llä 100 mM Tris-HCl-puskurissa, pH 8,0, 4 mM DTE, 2 mM bentsamidiini, 2 mg/litra leupeptii-20 niä, 1 mg/litra E-64:ää, 20 % v/v glyserolia ja panostetaan kahteen kertaan MonoQ HR 10/10 -kolonniin, jota tasa- | painotetaan ja eluoidaan käyttäen lineaarista 0,4 M KC1- ·“; gradienttia tässä samassa puskurissa. Haluttua aktiivi- ·· .:. suutta sisältävät fraktiot yhdistetään, ne konsentroidaan 0000 25 Centriprep 30:ssa ja sitten Centricon 30:ssa 1 ml:n loppu- • · tilavuudeksi ja ruiskutetaan 5 eränä Superose 6 HR 10/30 • · 2
-kolonniin 50 mM bis-tris-propaanipuskurissa, pH 6,8, 1 mM
• bentsamidiini, 4 mM DTE, 0,2 mM Pefabloc, 1 mM EDTA, 0,1 M KC1, 20 % v/v glyserolia. Aktiivisuuspiikki todetaan tässä • · · 2 ί·1 30 tekniikalla molekyylipainokeskuksessa 450 000.
♦ 2 · *...1 Tämän vaiheen jälkeen entsyymi on puhdas ja SDS- 117674 m Tässä vaiheessa entsyymin maksimaalinen aktiivisuus käyttäen pitoisuutta 100 pCi/ml treoniinia (15 Ci/mmol) kohoaa 3 670 yksikköön/mg; entsyymi kykenee myös muodostamaan adenylaatteja L-aminovoihapon tai L-alaniinin kanssa; 5 entsyymin aminoasylaatioreaktio tritioidun alaniinin kanssa todetaan ja maksimaalinen aktiivisuus pitoisuuden 200 pCi/ml [2,3-3H]-L-alaniinia (15 Ci/mmol) läsnä ollessa on 2 290 pmol/mg 15 minuutissa.
10 Taulukko: Pristinaaysiini I -syntaasi-II:n puhdistaalnen
Puhdistua- Til. Proteiineja Spea. akt.a Saanto Puhdiatus- valhe (ai) (ag) (yks./mg) (1) tekijä 15 raakauute 445 4700 (1) Q-Sepharose 308 834 7 100 1
Superdex 200 120 105 22 40 3,1. ii
MonoQ HR 15 11,5 96 19 14
Superose 6 7,5 2,8 122 6 17 20 aRaakauutteen aktiivisuutta ei voida mitata tarkasti.
Puhdistustekijä lasketaan fraktioiden spesifisen aktiivisuuden kohoamisesta puhdistuksen aikana.
j·^. 5.3.2. Oligonukleotidien valmistaminen proteiini- *..1 25 sekvenssistä lähtien : : ’·· Tämä esimerkki kuvaa, miten lähtien pristinamysiini • · · ···· I -syntaasi-ll:n sisäisistä sekvensseistä on mahdollista • 1 syntetisoida oligonukleotidejä.
• » !.· ; Treoniini- ja aminovoihappotähteiden sisällytykses-
III
:.ί I 30 tä pristinamysiinin IA peptidiketjuun vastuussa olevan peptidisyntaasin sisäisiä sekvenssejä määritettiin mikrosi1· sekventoimalla, kuten kuvattiin esimerkissä 5.1.2., tryp- • m siinihydrolyysin ja saatujen fragmenttien puhdistuksen m jälkeen Vydac C18 -kolonnissa.
* · * t « · a e « · « · 1 • · · ♦ ··· * · · · t * · 117674 42
Pristinamysiini I -syntaasl-II-proteiinin sisäisiä sekvenssejä (vrt. tähteet 49 - 61 sekvenssissä tunnusnro 12) 1 5 10
5 L AAFNDTARP V P R
1 5 10 15 20 | V P A A FVPLDALPL T G N G V L D Lähtien näissä sekvensseissä alleviivatuista alueista ja geneettisen koodin Streptomycesllle spesifisen 10 degeneroitumisen funktiona (vrt. esimerkki 8) syntetisoitiin seuraavat oligonukleotidiseokset:
Seos, joka vastaa pristinamysiini X -syntaasi-II-proteiinin sisäisessä sekvenssissä 1 alleviivattua osaa: 5' 3’
15 GCC GCC TTC AAC GAC ACC GCC CGC CC
G G G G G
Seos, joka vastaa pristinamysiini I -syntaasi-II- * proteiinin sisäisessä sekvenssissä 2 alleviivattua osaa: 5' 3' 20 TTC GTC CCC CTC GAC GCC CTC CCC CT ί
G G G G G G
?*·*: 5.3.3. Synteettisten oligonukleotidiseosten leimaa- ***** minen ja kosmidin plBV3 DNA:n Southern-hybridisaatio ··· .Ϊ. Tämä esimerkki kuvaa, miten oligonukleotidit, jotka ···· 25 ovat spesifisiä pristinamysiinien X biosynteesigeenille, • · ; voidaan leimata radioaktiivisesta ja sitten hybridoida • · · membraaniin, jolle on siirretty kosmidin pIBV3 DNA:ta.
• · · * Oligonukleotidien leimaaminen suoritetaan siirtämällä 5'-pääasemaan ATP:n [gamma-32P] fosfaattiryhmä T4- • · t *.:.* 30 polynukleotidikinaasin avulla, kuten kuvattiin kohdassa • * S 1 3 ··· J φ X f vJ * ;***. Noin 500 ng oligonukleotidiseosta leimattiin täten * ··· 32P:llä ja sitä käytettiin Southern-määrityksessä pIBV3:n | DNA:han hybridoimiseksi, jota oli pilkottu eri entsyymeil- 35 lä. Näillä hybridisaatioilla voitiin osoittaa, että osa • · 117674 43 pristinamysiini I -syntaasi-II:n rakennegeenistä sisältyi kosmidiin pIBV3, ja identifioida tämän geenin sisältävä alue. Southern-määritykset ja hybridisaatiot suoritettiin, kuten kuvattiin esimerkissä 5.1.4.
5 Hybridisaatiotuloksista oli mahdollista osoittaa, että kosmidissa pIBV3 oli 6,2 kein Sphl-fragmentti, joka sisälsi esimerkissä 5.3.2. syntetisoituihin koettimiin nähden homologisen sekvenssin.
5.4. Osan pristinamysiini I -syntaasi-III:n (SnbD) 10 rakennegeenistä läsnäolon kosmidissa pXBV3 osoittaminen Tämä esimerkki osoittaa, miten on mahdollista identifioida pristinamysiinien I biosynteesigeenien läsnäolo jo eristetyssä kosmidissa (esimerkki 5.1), 5.4.1. Pristinamysiini I -syntaasi-III:n identi-15 fiointi, joka liittyy proliini- ja p-dimetyyliaminofenyy-lialaniinitähteiden sisällytykseen pristinamysiinin IA peptidiketjuun Tämä esimerkki osoittaa, miten proliini- ja p-dime- tyyliaminofenyylialaniinitähteiden sisällyttämisestä pris- "i 20 tinamysiinin IA peptidiketjuun vastuussa oleva proteiini voidaan puhdistaa homogeeniseksi lähtien pristinaespi- i ·’·*: raliksesta SP92.
• · -- ;***; 5.4.1.A. Pristinamysiini I -syntaasi-IIIin osa-ak- .1. tiivisuuksien määritys ♦ * · · 25 Tämä esimerkki esittää pristinamysiinin IA biosyn- * · j teesireitin aktiivisuuksien määrityksen, joita ei ole vie- • * · lä milloinkaan kuvattu ja joilla on se merkittävä ominai- • · · ·* suus, etteivät ne ilmenny kuin pristinamysiinien tuotanto- jakson aikana. Kyseessä ovat proliini- ja para-dimetyyli- • ♦ · _ _ *.:.* 30 aminofenyylialaniinitähteiden sisällytyksestä pristinamy- ··· siinin IA peptidiket juun (kuvio 11) SAMiin, ATP:n ja .·**. MgCl2:n läsnä ollessa vastuussa olevan peptidi synt aas in ΐ • m * osa-aktiivisuudet.
• » • Aktiivisuudet proliini-AMP-ligaasi ja p-dimetyy- • · · M.* 35 liaminofenyylialaniini-AMP-ligaasi mitataan kohdassa # * * l· 44 ' 1 1 767 4 5.2.1.A. 3-hydroksipikoliinihappo-AMP-ligaasille kuvattuun nähden analogisella ATP-pyrofosfaattivaihdon entsy-maattisella kokeella.
Entsyymin aminoasylaatioreaktioilla proliinin ja 5 p-dimetyyliaminofenyylialaniinin kanssa on mahdollista erottaa peptidisyntaasi muista entsyymeistä, jotka voivat aikaansaada ATP-pyrofosfaattivaihdon, ja etenkin amino-asyyli-tRNA-syntaaseista. Samoin on entsyymillä asyloidun p-dimetyyliaminofenyylialaniinin α-amiinifunktion N-mety-10 laation kohdalla. Siten juuri tätä viimeksi mainittua N-metylaatiolle karakteristista koetta käytettiin tässä esimerkissä.
Määritettäviä entsyymifraktioita (0,2 - 2 yksikköä) inkuboidaan 15 minuutin ajan 27 °C:ssa kokonaistilavuudessa 15 250 μΐ 50 mM bis-tris-propaanipuskuria, pH 6,8, 1 mM DTT, 10 % v/v glyserolia, 1 pCi:n [metyyli3H]-SAM: ia (15 f
Ci/mmol), para-dimetyyliamino-L-fenyylialaniinin (1 mM), | ATP:n (2 mM) ja MgCl2:n (5 mM) läsnä ollessa.
Reaktio keskeytetään lisäämällä 150 μΐ 25-%:ista 20 trikloorietikkahappoliuosta. Saostuneet proteiinit otetaan talteen mikrosuodattimelle ja pestään 3 kertaan 400 pl:lla f :*·*: 7-%:ista trikloorietikkahappoa, minkä jälkeen niitä eluoi- ;***; daan 2 kertaan 400 pl:lla 1 N NaOH-liuosta tuikeampullis- • · * .:. sa, joka sisältää 1 ml:n 1 N HCl:ää ja 12 ml tuikekoktai- • · · * 25 lia (Readygel Beckmann). Tämän ampullin sisältämä radioak- * · ;tiivisuuden määrä mitataan tuikelaskijalla (Minaxi TriCarb · * "*.* 4000 Packard). Se edustaa N-metyloitua para-dimetyyliami-
* · I
* nofenyylialaniinimäärää, joka on kiinnittynyt kovalentti-sesti haluttuun peptidisyntaasiin.
* · · 30 Entsyymiaktiivisuusyksiköksi määritellään se ent- * * · syymimäärä, joka tarvitaan kiinnittämään kovalenttisesti .***. 1 pikomooli N-metyloitua p-dimetyyliaminofenyylialaniinia * · · ' 15 minuutissa edellä kuvatuissa olosuhteissa.
• « * · · ··· » · * ·····' • · 45 1 1 7674 5.4.I.B. Pristinamysiini I -syntaasl-IIIrn puhdistaminen Tämä esimerkki esittää, miten pristinamysiinin IA biosynteesireittiin osallistuva pristinaespiralis SP92 5 -entsyymi voidaan puhdistaa.
Käyttäen edellä esimerkissä 5.4.1.A kuvattua määritystä proliini- ja para-dimetyyliaminofenyylialaniinitähteiden sisällytyksestä pristinamysiinin IA peptidiketjuun vastuussa olevan peptidisyntaasin puhdistaminen suorite-10 taan, kuten kuvataan alla, huolehtien siitä, että työskennellään 4 °C:ssa ja säilytetään -70 °C:ssa aktiiviset fraktiot.
250 g:n sentrifugointipelletti, joka on pesty 0,1 M fosfaattipuskurilla, pH 7,2, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA, 5 mM 15 EGTA, 0,5 M KC1, 10 % v/v glyserolia, pristinaespiralis SP92 -viljelmästä, joka on otettu talteen pristinamy-siinien tuotantovaiheen alussa, uudelleenlietetään 750 * ml:aan 100 mM Tris-HCl-puskuria, pH 8,0, joka sisältää pitoisuudet 4 mM DTE, 5 mM bentsamidiini, 0,2 mM Pefabloc, 20 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mg/litra leupeptiiniä, 2 mg/litra STI:tä, 2 mg/litra aprotiniinia, 1 mg/litra E-64-valmis- ·*·*; tetta, 20 % v/v glyserolia. Näin saatua suspensiota jauhe- • * .**·. taan ranskalaisessa painekennossa, joka on säädetty 350 ··· ? kp:n/cm paineeseen, minkä jälkeen sitä sentrifugoidaan 25 50 000 x g:ssä 1 tunnin ajan. Näin talteen saatu raakauute * · . . fraktioidaan seostamalla ammoniumsulfaatilla. Proteiini- • · · • Φ · “*.* fraktio, joka saostuu ammoniurnsulfaatin 0 - 35 %:n kylläs- ♦ · · *·* * tysasteessa, uudelleenliuotetaan murskauspuskuriin ja sii tä poistetaan suolat Sephadex G25 Fine -kolonnissa, jota 30 eluoidaan samalla puskurilla. Näin valmistetut proteiinit • * · :.,.ί ruiskutetaan 100 mM Tris-HCl-puskurissa, pH 8,0, 4 mM DTE, .···. 2 mM bentsamidiini, 2 mg/litra leupeptiiniä, 1 mg/litra i • · E-64-valmistetta, 20 % v/v glyserolia Q-Sepharose Fast . Flow -kolonniin (200 ml), minkä jälkeen ne eluoidaan käyt- 35 täen lineaarista KCl-gradienttia (0 -» 0,6 M). Kunkin frak- • · 46 117674 tion poistuessa kolonnista siihen lisätään 1/10 sen tilavuudesta liuosta, jossa ovat pitoisuudet 2 mM Pefabloc, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 5 mM bentsamidiini. Entsyymiaktiivisuutta sisältävät fraktiot (jotka osoitetaan esimerkissä 5 5.4.1.A kuvatulla kokeella) yhdistetään ja seostetaan am- % moniumsulfaatilla 80 %:n kyllästyksessä. Saostuneet proteiinit uudelleenlluotetaan 50 mM bis-tris-propaanipusku-riin, pH 6,8, 1 mM bentsamidiini, 1 mM DTE, 0,2 mM Pefabloc, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mg/litra leupeptiiniä, 10 0,15 M NaCl, 20 % v/v glyserolia ja ruiskutetaan viitenä 4 ml:n eränä Superdex 200 Hi-Load 16/60 -permeaatiokolon-niin, jota tasapainotetaan ja eluoidaan tällä samalla puskurilla. Määrityksen jälkeen aktiiviset fraktiot yhdistetään ja konsentroidaan 3 mljksi Centriprep 30:ssa, minkä 15 jälkeen ne uudelleenlaimennetaan 20 ml:ksi 100 mM Tris- HC1-puskurilla, pH 8,0, 4 mM DTE, 1 mM bentsamidiini, 1 mM | PMSF, 20 % v/v glyserolia ja panostetaan kahtena eränä MonoQ HR 10/10 -kolonniin, jota tasapainotetaan ja eluoidaan käyttäen lineaarista gradienttia 0,4 M KC1 tässä sa-20 massa puskurissa. Haluttua aktiivisuutta sisältävät par- ^ haat fraktiot yhdistetään ja niitä käytetään materiaalina ; ·’·*; entsyymin aktiivisuuksien karakterisoimiseksi ja sen mik-
I I
.***. rosekventoimiseksi.
• · Tämän vaiheen jälkeen entsyymi on puhdas ja SDS- ···· ...,· 25 PAGE-elektroforeesissa sen molekyylipainoksi arvioidaan • · . . noin 250 000. Tämä nauha sisältää samoin kaiken radioak- • · * Φ · · *".* tiivisuuden proteiinista, joka leimattiin aminoasyloimal- # · * *·* la tritioidulla SAM:illa ja para-dimetyyliaminofenyyliala- niinilla. Permeaatiossa Superose 6 HR 10/30 -valmisteessa *.:.* 30 entsyymin natiiviksi molekyylipainoksi arvioidaan 700 000.
• · · Tässä vaiheessa entsyymi kykenee samoin muodosta- .···. maan adenylaatteja proliinin kanssa? entsyymin aminoasy- • · mmmtl laatioreaktio tritioidun proliinin kanssa todetaan ja mak- • # . siraaalinen aktiivisuus, kun läsnä on 200 pCi/ml [5-3H]-L- *.:.· 35 proliinia (34 Ci/mmol), on 2 490 pmol/mg 15 minuutissa.
• · 117674 47
Taulukko: Prietinaeyeiini I -eyntaasi-IIIin puhdlstaalnen
Puhdistua- Tll. Proteiineja Spes. akt.1 Saanto Puhdlstua- vaibo (ai) (eg) (yks./ug) (S) tekijä 5 raaksuute 800 8100 (4) 35 1 a.s. 200 4000 (6) Q-Sepharose 132 498 46 100 1 superdex 200 45 39,5 417 71 9 10 MonoO HR 9 5,3 1070 25 23 5 "Aktiivisuutta raakauutteessa ja ammoniumsulfaattisaostuksen j Alkaen ei pystytä mlttaaaaan tarkasti.
Puhdistustekijä lasketaan fraktioiden spesifisen 15 aktiivisuuden kohoamisesta puhdistuksen aikana.
5.4.2. Oligonukleotidien valmistaminen proteiini-sekvenssistä lähtien Tämä esimerkki kuvaa, miten lähtien pristinamysii-ni I -syntaasi-Ill:n sisäisistä sekvensseistä on mahdol-20 lista syntetisoida oligonukleotidejä.
Proliini- ja para-dimetyyliamniofenyylialaniinitähteiden sisällytyksestä pristinamysiinin IA peptidiketjuun vastuussa olevan peptidisyntaasin sisäinen sekvenssi määritettiin mikrosekventoinnilla, kuten kuvattiin esimerkis- ·· 1 i 1.1 25 sä 5.1.2., käsittelyn syaanibromidilla ja saatujen frag- ί,,.ί menttien puhdistuksen jälkeen Vydac C18 -HPLC-kolonnissa.
#Ji1 Pristinamysiini I -syntaasi-III-proteiinin sisäi- ·;··· nen sekvenssi: (vrt. tähteet 2-20 sekvenssissä tunnus- : nro 13) • · · 30 1 5 10 15 20 • · ·
P - VTPYRAYAL AHLAG-DDD
. Lähtien tässä sekvenssissä alleviivatusta alueesta ♦ « · tt1 ja Streptomycesille spesifisestä geneettisen koodin dege- • 1 *·;·1 neraatiosta (vrt. esimerkki 8) syntetisoitiin seuraava 35 oligonukleotidiseos: ·1··· Seos, joka vastaa pristinamysiini I -syntaasi-III- *. proteiinin sisäisen sekvenssin alleviivattua osaa: • · · # · · t» · · · 1 • · • 48 117674 5' ' ' 3’
GTC ACC CCG TAC CGC GCC TAC G G C G G
T
5 5.4.3. Synteettisten oligonukleotldiseosten leimaa minen ja kosmidin pIBV3 DNA:n Southem-hybridisaatio Tämä esimerkki kuvaa, miten pristinamysiinien I biosynteesigeenille spesifisiä oligonukleotidejä voidaan leimata radioaktiivisesti ja sitten hybridoida membraa-10 niin, jolle on siirretty kosmidin pIBV3 DNA:ta.
Oligonukleotidien leimaaminen suoritetaan siirtämällä 51-pääasemaan ATP:n [gamma-32P]fosfaatti T4-polynuk-leotidikinaasilla, kuten kuvattiin kohdassa 5.1.3,
Noin 500 ng oligonukleotidiseosta leimattiin täten 15 3ZP:llä ja sitä Southern-hybridoitiin pIBV3-DNA:han, jota oli pilkottu eri entsyymeillä. Näillä hybridisaatioilla oli mahdollista osoittaa, että kosmidi pIBV3 käsitti osan pristinamysiini I -syntaasi-III:n rakennegeenistä, ja identifioida tämän geenin sisältävä alue. Southern-määri-20 tykset ja hybridisaatiot suoritettiin, kuten kuvattiin esimerkissä 5.1.4. ;
Hybridisaatiotuloksilla oli mahdollista osoittaa, ·***: että kosmidi pIBV3 käsittää 8,4 ke:n Sphl-fragmentin, jo- 4 · 1 ka sisälsi sekvenssin, joka oli homologinen esimerkissä 25 5.4.2. syntetisoituun koettimeen nähden.
• · • ,·. 5.5. Osan pristinamysiini I-syntaasi-lV:n (SnbE) * 1 1 *".1 rakennegeenistä läsnäolon kosmidissa pIBV3 osoittaminen » « · 1 • · i * Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista identifioida pristinamysiinien biosynteesigeenien läsnäolo jo • · · *·:·1 30 eristetyssä kosmidissa (esimerkki 5.1.).
• · · • · • ··· ··· • 1 • · • · 1 *·«·1 • · • · · • · ·· · Φ · · • 1 I : 117674 ! , 49 5.5.1. Peptidisyntaasin (jota kutsutaan pristinamy-siini I -syntaasi-IV:ksi) identifiointi, joka on vastuussa fenyyliglysiinitähteen sisällyttämisestä pristinamysiinin IA peptidiketjuun 5 5.5.1.A. Entsyymiaktiivisuuksien määritys, jotka käsittää peptidisyntaasi (pristinamysiini I -syntaasi-IV), joka on vastuussa fenyyliglysiinitähteen sisällyttämisestä pristinamysiinin IA peptidiketjuun Tämä esimerkki kuvaa pristinamysiinin IA biosyntee-10 sireitin entsyymiaktiivisuuden määritystä, jota ei ole kuvattu tähän mennessä ja jolla on se merkittävä ominaisuus, ettei se ilmenny kuin pristinamysiinien tuotantojakson aikana villimikro-organismissa. Kyseessä on peptidisyntaasin (pristinamysiini I -syntaasi-IV) aktiivisuus, 15 joka on vastuussa L-fenyyliglysiinitähteen sisällyttämisestä peptidiketjuun (kuvio 12) ATP:n ja MgCl2:n läsnä ollessa. Pristinamysiini I -syntaasi-IV:n fenyyliglysiini- j< AMP-ligaasiaktiivisuus mitataan entsymaattisella ATP-pyro- $ fosfaattivaihdon kokeella, joka on samankaltainen kuin 20 esimerkissä 5.2.1,A. 3-hydroksipikoliinihappo-AMP-ligaasi-aktiivisuudelle kuvattu koe, L-fenyyliglysiinin (1 mM) ja : 1]: KCl:n (50 mM) läsnä ollessa inkubointipukurissa.
:***: 5.5.I.B. Peptidisyntaasin puhdistaminen, joka on
• M
vastuussa fenyyliglysiinitähteen sisällyttämisestä pristi- »Ml 25 namysiinin IA peptidiket juun (pristinamysiini I -syntaasi- : .·. iv) * 1 ·
“!.1 Tämä esimerkki osoittaa, miten pristinamysiinin IA
• biosynteesireittiin osallistuva pristinaespiralis SP92 -entsyymi voidaan puhdistaa. Käyttäen määritystä, jota • · t
*·ί·1 30 kuvattiin edellä esimerkissä 5.5.1.A., pristinamysiini I
• · 1 ·...· -syntaasi-lV:n puhdistaminen suoritettiin, kuten kuvataan alla. Kaikki menettelyt suoritetaan 4 °C:ssa. Aktiivisuutta ·♦· sisältävät fraktiot jäädytetään välittömästi ja niitä säi- i « • lytetään -70 °C:ssa.
· • · 1 * · 1 ' ' - · i 50 117674 70 g esimerkissä 5.2.l.B. kuvatun mukaisesti kerättyjä kosteita soluja uudelleenlietetään 250 ml:aan solu-lyysipuskuria (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, joka sisältää pitoisuudet 25 % glyserolia, 4 mM DTE, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 5 1 mM PMSF, 1 mg/litra E64-valmistetta, 2 mg/litra STI-val- mistetta, 2 mg/litra a2-makroglobuliinia, 1 mg/litra leu-peptiiniä, 2 mg/litra aprotiniinia, 5 mM bentsamidiini, 0,6 mg/ml lysotsyymiä. Näin saatua liuosta pidetään 1 tunnin ajan 4 °C:ssa samalla sekoittaen, minkä jälkeen sitä 10 sentrifugoidaan 50 000 x g:ssä 1 tunnin ajan. Sitten su-pernatantti ruiskutetaan solulyysipuskurissa Sephadex-G-25-kolonniin, ja poistunut fraktio (noin 250 mg proteiineja ruiskutetaan kussakin kromatografiässä) ruiskutetaan MonoQ HR 16/10 -kolonniin (Pharmacia), jota on tasapaino-15 tettu 100 mM Tris-HCl-puskurllla, pH 8,0, 4 mM DTE, 1 mg/ , litra E-64-valmistetta, 2 mg/litra STI-valmistetta, 20 % glyserolia. Proteiinit eluoidaan käyttäen lineaarista KC1- 1 gradienttia 0 -> 0,6 M ja kunkin fraktion poistuessa kolonnista siihen lisätään 1/10 sen tilavuudesta liuosta, jossa 20 ovat pitoisuudet 2 mM Pefabloc, 5 mM EGTA, 5 mM EDTA. Aktiivisuutta sisältävät fraktiot yhdistetään, minkä jälkeen
• '^ϊ ne sekoitetaan 1 tilavuuteen 100 mM Tris-HCl-puskuria, pH
8,0, 15 % glyserolia, 1 mM PMSF, 1 mM bentsamidiini, 4 mM
« * · ··· DTT, 3,4 M ammoniumsulfaatti kohden 3 fraktiotilavuutta.
• t ♦ · ....Ϊ 25 Liuos ruiskutetaan fenyyli-Superose HR 10/10 -kolonniin j ,·, (1/5 liuoksesta ruiskutetaan kussakin kromatografiassa), ? • · · ··» i #*··β ja proteiinit eluoidaan käyttäen laskevaa ammoniumsulfaat- ♦ * * tigradienttia 0,9 M -» 0 M. Aktiivisuutta sisältävät frak- . tiot yhdistetään. Liuos konsentroidaan 3 500 pl:ksi Cen- • · · - *···* 30 triprep 30:ssa ja ruiskutetaan 2 eränä Superdex 200 Hi- • · *··.* Load 16/60 -kolonniin, jota tasapainotetaan ja eluoidaan ·***· 50 mM bis-tris-propaanipuskurilla, pH 6,8, joka sisältää • · ·
20 % glyserolia, 0,15 M NaCl, 4 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 mM
\ bentsamidiini, 1 mM EDTA. Aktiivista fraktiota laimenne- • · ·
'···] 35 taan 9 tilavuudella 50 mM bis-tris-propaanipuskuria, pH
’ 51 117674 6,8, joka sisältää 25 % glyserolia, pitoisuudet 4 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 mM bentsamidiini, minkä jälkeen se ruiskutetaan MonoQ HR 5/5 -kolonniin, jota on tasapainotettu samalla puskurilla. Haluttu aktiivisuus eluoidaan käyttäen 5 lineaarista KCl-gradienttia 0 -> 0,4 M ja konsentroidaan 630 piiksi Centricon 30:ssa. Sitten haluttua proteiinia puhdistetaan elektroforeettisesti 6-%:isessa polyakryyli-amidigeelissä näytteen denaturoinnin jälkeen kuumentamalla 10 minuutin ajan 80 °C:ssa seoksella SDS-merkaptoetanoli. 10 Elektroforeesin ja geelin värjäämisen jälkeen Coomassie-sinisellä proteiinin sisältävä geelinauha leikataan ja proteiini elektroeluoidaan geelistä Centrilutoriin.
Huomautus: pristinamysiini I -syntaasi-lV:ää vastaava nauha identifioidaan vertaamalla tritioituun pristi-15 namysiini I -syntaasi-IV-standardiln (tritioidun fenyyli-glysiinin kovalenttisella sitoutumisella; katso kuvaus esimerkissä 5.5.2.).
Tämän vaiheen jälkeen entsyymi on puhdas elektroforeesissa (SDS-PAGE). Sen molekyylipainoksi arvioidaan noin 20 170 000.
5.5.2. Pristinamysiini I -syntaasi-lV:n leimaaminen ·· · |e: tioesteröimällä radioaktiivinen fenyyliglysiini entsyymiin ·“*: Aktivaation adenylaatin muotoon jälkeen fenyyligly- ··· .J. siini-AMP-ligaasiaktiivisuudella fenyyliglysiini siirre- • · · · 25 tään entsyymin aktiivisen kohdan tioliryhmään ennen sisäl- * · • ,·. lytystä peptidiketjuun pidennyksen aikana (peptidianti- • · · bioottien biosynteesin yleinen prosessi, joka tunnetaan • · · * nimellä "tiotemplaattimekanismi"). Yleisesti amiinihapon aktivaation aikaansaavan proteiinin radioaktiivinen lei- • · *.!.* 30 maaminen voidaan siten suorittaa valmistamalla tioesteri- • · · *...* johdannainen amiinihapon radioaktiivisen muodon kanssa.
;***· Esimerkiksi pristinamysiini I -syntaasi-IV:n radio- ««· aktiivinen leimaaminen suoritetaan inkuboimalla 1 tunnin • ·
• ajan 27 °C:ssa 50 pg proteiinia (aktiivinen fraktio MonoQ
t · · 35 HR 5/5 -kromatografiakolonnista poistuessa; katso edellä • * ·· * • * 52 117674 esimerkissä 5.5.1 .B) 10ÖpCi:n (R, S)-2-£enyyli[2-3H]glysii-niä kanssa (18 Ci/mmol; Amersham) 70 yl:ssa 50 mM bis-tris-propaanipuskuria, pH 6,8, joka sisältää 20 % glyserolia, pitoisuudet 25 mM MgClz, 5 mM ATP, 0,15 M NaCl, 4 mM 5 DTT, 1 mM PMSF, 1 mM bentsamidiini, 1 mM EDTA. Denatu-roinnin jälkeen (SDS yksinään merkaptoetanolissa) proteiinit erotetaan elektroforeesilla (SDS-PAGE, 6-%:inen geeli) ja osoitetaan Coomassie-sinisellä. Radioaktiivisuus-profiilin analyysi proteiininauhat laskemalla sekä autora-10 diografisesti (Hyperfilm MP; fluorografia geelin imeyttä-misen jälkeen Amplify Smersham -valmisteella) paljastaa yhden ainoan radioaktiivisuusnauhan molekyylipainokohdassa 1/0 000.
15 Taulukko: Priatinavrsiini I -ayntnael-IV:n puhdistaminen
Puhdistu·- Proteiineja Spee. akt. Proteiineja Puhdistus- -i· vaihe (sg) (tuik./eg)a (eg) tekijä 5 20 raakauute 2200 3,6 -
MonoQ 16/10 136 58 100 16 fenyyli-Superoes ' 32,6 175 72 49
Superdex-200 3,1 870 34 240 •V* MonoQ 5/5 2,0 1000 25 280 ·,· 25 elektroeluutlo 0,1 - - t · *···* aSpesi£ietä aktiivisuutta ei voida mitata tarkasti raakauutteessa fenyyliglysiinistä • · 53 117674 jättäen kuitenkin pois fenyyli-Superose-vaihe, lähiten toisesta pristinaespiralis SP92-viljelmästä, jonka raa-kauute valmistettiin käyttäen ranskalaista painekennoa, kuten kuvattiin kohdassa 5.4.I.B., johti proteiiniin, joka 5 poistuessaan MonoQ HR 5/5 -vaiheesta oli puhtaudeltaan ekvivalenttinen verrattuna siihen, joka saatiin samasta vaiheesta kohdassa 5.5.1.B, kuvatussa esimerkissä, mutta sen molekyylipaino oli noin 250 000 SDS-PAGE:ssa. Tämä uusi valmiste kykeni aktivoimaan ja tioesteröimään fenyy- Ί 10 liglysiinin, mutta sillä oli lisäksi ATP-pyrofosfaatti-vaihtoaktiivisuutta L-pipekoolihapon kanssa (1 mM) kohdassa 5.2.1.A. kuvattuun nähden analogisessa vaihtokokeessa 3-hydroksipikoliinihapolle. Toisaalta voitiin osoittaa, että 170 000:n proteiinilla ei ole ATP-pyrofosfaattivaih-15 toaktiivisuutta L-pipekoolihapon kanssa edes proteiinin vielä hyvin epäpuhtaissa valmisteissa. Huomattakoon, että S. pristinaespiralis SP92 tuottaa luonnollisesti pieninä «.
määrinä pristinamysiini IA -analogia, jossa on pipekooli-happotähde 4-oksopipekoolihapon asemesta. Tämä osoittaa 20 siis, että fenyyliglysiinin sisällytyksestä vastuussa oleva peptidisyntaasi (pristinamysiini I -syntaasi-IV) ka- · j·: talysoi myös edeltävän tähteen (todennäköisesti pipe- :***· koolihappo) sisällytystä. Pristinamysiini I -syntaasi- *·· IV: lie saatu molekyylipainoero näissä kahdessa valmistees- • · · * 25 sa (170 000 ja 250 000) katsotaan johtuvaksi osittaisen • * j S' proteolyyttisen pilkkomisen ilmiöstä ensimmäisessä tapauk- • » i sessa, joka johtaa L-pipekoolihappoaktivaatioaktiivisuuden • · · ♦ « i * menetykseen.
5.5.4. Oligonukleotidien synteesi lähtien proteii- • · · *···* 30 nisekvenssistä • · · ·...· Tämä esimerkki kuvaa, miten lähtien pristinamysiini ·***· I -syntaasi-IV:n sisäisestä sekvenssistä on mahdollista ΐ ··· mennä tutkimaan vastaavaa geeniä sopivasti valittujen oli- i • gonukleotidien avulla.
• · · ··· 1 54 1 1 7674
Pristinamysiinin I -syntaasi-IV:n 15 aminohapon sisäinen sekvenssi identifioitiin pilkkomalla syaanibromi-dilla puhdistettu proteiini ja puhdistamalla Vydac C18 -HPLC-kolonnissa saadut fragmentit.
5 Pristinamysiini I -syntaasi-IV:n sisäinen sekvenssi (vrt. tähteet 82 - 98 sekvenssissä tunnusnro 16) 1 5 10 15 V T V F L N N TRLIQNFR P R - F - GD Lähtien tässä sekvenssissä alleviivatusta alueesta 10 ja geneettisen koodin Streptomycesllle spesifisen degeneraation funktiona (vrt. esimerkki 8) syntetisoitiin seu-raava oligonukleotidiseos:
Seos, joka vastaa pristinamysiini I -syntaasi-IV-proteiinin sisäisessä sekvenssissä alleviivattua osaa: 15 5' 3'
ACG CGC CTC ATC CAG AAC TTC CGC CC C G G G
T T
5.5.5. Synteettisten oligonukleotidiseosten leimaa-20 toinen ja Southern-hybridisaatio kosmidin pIBV3 DNA:hän
Tämä esimerkki kuvaa, miten pristinamysiinien I
• · · • \ϊ biosynteesigeenille spesifisiä oligonukleotidejä voidaan :***; leimata radioaktiivisesta ja sitten hybridoida membraa- ··· niin, johon on siirretty kosmidin pIBV3 DNA:ta.
···· ....: 25 Oligonukleotidit leimattiin siirtämällä 5’-pääase- : .·. maan ATP:n [gamma-32P] fosfaattiryhmä käyttäen T4-polynuk- • · · ”1.’ leotidikinaasia, kuten kuvattiin kohdassa 5.1.3.
• ♦ · • « «
Noin 500 ng oligonukleotidiseosta leimattiin tä- t ten 32P:llä ja sitä käytettiin Southern-hybridisaatiossa • · · ' ’*··* 30 pIBV3:n DNA:hän, jota oli pilkottu eri entsyymeillä. Naii- ··· • · .
*...* lä hybridisaatioilla voitiin osoittaa, että kosmidi pIBV3 ·***· käsitti pristinamysiini I -syntaasi-lV:n rakennegeenin, ja ··· identifioida tämän geenin sisältävä alue. Southern-määri-tykset ja hybridisaatiot suoritettiin, kuten kuvattiin • * « *"·* 35 esimerkissä 5.1.4.
v · · * f • · 55 · 117674
Hybridisaatiotuloksista voitiin osoittaa, että kos-midi plBV3 käsittää 6,6 ke:n Sphl-fragmentin, joka sisälsi sekvenssin, joka oli homologinen esimerkissä 5.5.4. syntetisoituihin koettimiin nähden.
5 5.6. FMN-reduktaasin rakennegeenin sisältävän kos- midin pIBV4 eristäminen (snaC) Tämä esimerkki osoittaa, miten on mahdollista saada esimerkissä 3 rakennetun kaltainen kosmidi, joka sisältää ainakin yhden PII-biosynteesigeenin.
10 5.6.1. Pristinamysiini HA -syntaasiin liittyvän FMN-reduktaasin identifiointi Tämä esimerkki osoittaa, miten proteiini, joka on vastuussa FMN:n pelkistyksestä NADH:lla FMNH2: n muodostamiseksi, joka on välttämätön pristinamysiini IIA -syntaa-15 sin katalysoimalle reaktiolle, voidaan puhdistaa homogee- niseksi lähtien S ^ pristinaespiraliksesta SF92. | 5.6.1.A. FMN-reduktaasin aktiivisuuden määritys Tämä esimerkki kuvaa pristinamysiinin IIA biosyn-teesireitin aktiivisuuden määritystä, jota ei ole vielä 20 milloinkaan kuvattu ja jolla on se merkittävä ominaisuus, h.
ettei se ilmenny kuin pristinamysiinien tuotantojakson ί aikana. Kyseessä on FMN-reduktaasi, jota edelleen kutsu- :***; taan NADH:FMN-oksidoreduktaasiksi, ja joka katalysoi FMN:n ··· pelkistymistä FMNH2:ksi (kuvio 13) NADH:n läsnä ollessa.
» · * · 25 Samaa reaktiota katalysoivia FMN-reduktaaseja, jotka ovat : ,·, tai eivät ole spesifisiä NADH:lie tai NADPH:lie ja liit- • · * tyvät muihin biosynteesireitteihin, kuvataan toisaalla
III
(Duane et ai., 1975; Jablonski et ai., 1977, Watanabe et ai., 1982).
• * · ....
*·|·* 30 Tämän aktiivisuuden toteamiseksi käytetään kahta määritystä: }***· Ensimmäinen perustuu kytkemiseen esimerkissä 5.1.1. f » · · kuvattuun pristinamysiini -lIA-syntaasiin ja sitä käyte- i •4 tään ensimmäisille puhdistusvaiheille. Määritettäviä ent- ‘·!·| 35 symaattisia fraktioita (0,002 - 0,005 yksikköä) inkuboi- • * 117674 56 daan 1 tunnin ajan 27 °C:ssa 500 μ1:η kokonaistilavuudessa 50 mM bis-tris-propaanipuskuria, pH 6,8, joka sisältää
NADH:ta (500 μΜ), FMN:ää (2 μΜ), pristinamysiiniä IIB
(20 μΜ) ja 0,01 yksikköä esimerkissä 5.1.1. kuvattua pris- 5 tinamysiini -IlA-syntaasia. Muodostunut pristinamysiini IIA määritetään HPLCrllä, kuten kuvattiin esimerkissä - 5.1.1.A. 't
Entsyymiaktiivisuusyksiköksi määritellään entsyymi- määrä, joka tarvitaan syntetisoimaan 1 pmol pristinamysii- 10 niiä IIA minuutissa edellä kuvatuissa olosuhteissa.
Toinen on spektrometrinen määritys ja sitä voidaan käyttää vain ainakin osittain puhdistetuilla fraktioilla.
Määritettäviä entsyymifraktioita (0,006 - 0,030 yksikköä) inkuboidaan 13 minuutin ajan 27 °C:ssa 3 ml:n kokonaisti- 15 lavuudessa 50 mM bis-tris-propaanipuskuria, pH 6,8, joka sisältää NADH:ta (500 μΜ) ja FMN:ää (2 μΜ). 7 minuutin in- kuboinnin jälkeen suoritetaan kuusi optisen tiheyden luen- i taa 340 mn:ssä 1 minuutin välein vastaan entsyymiä vailla olevaa verrokkikyvettiä. Aktiivisuus yksiköissä pmol/min 20 lasketaan jakamalla optisen tiheyden vähennys minuutissa kulmakerrointekijällä 6,2 (1 moolin NADH:ta optinen tiheys :*·*: 340 nm:ssä).
• « ·***: Entsyymiaktiivisuusyksiköksi määritellään entsyymi- määrä, joka tarvitaan kuluttamaan 1 pmol NADHrta minuutis-25 sa edellä kuvatuissa olosuhteissa.
• · • ,·4 5.6.I.B. S. pristinaespiraliksen SP92 FMN-reduktaa- t * · " sin puhdistaminen • · » * Tämä esimerkki osoittaa, miten pristinamysiinin IIA biosynteesireittiin osallistuva pristinaespiralis SP92 • · · *!·* 30 -entsyymi voidaan puhdistaa.
· · * ·...* Käyttäen edellä esimerkissä 5.6.1. A. kuvattuja mää- ·*". rityksiä FMN-reduktaasin puhdistaminen suoritetaan, kuten * · · kuvataan alla, huolehtien siitä, että aktiiviset fraktiot • · •# jäädytetään ja säilytetään -30 °C:ssa kunkin vaiheen välil- ’•Ϊ·’ 35 lä, mikäli tarpeen.
···* • · 57 117674 500 g:n sentrifugointipelletti, joka on pesty 0,1 M fosfaattipuskurilla, pH 7,2, jossa on 10 % v/v glyserolia, S. pristinaespiralis SP92 -viljelmästä, joka on otettu talteen pristinamysiinien tuotantovaiheen alussa, uudel-5 leenlietetään 1 500 ml:aan 50 mM bis-tris-propaanipusku-ria, pH 6,8, joka sisältää pitoisuudet 5 mM DTT, 10 % v/v glyserolia ja 0,2 mg/ml lysotsyymiä. Näin saatua suspen- i siota inkuboidaan 45 minuutin ajan 27 °C:ssa, minkä jälkeen sitä sentrifugoidaan 50 000 x g:ssä 1 tunnin ajan. Näin 10 saatu raakauute fraktioidaan seostamalla ammoniumsulfaatilla. Proteiinifraktiosta, joka saostuu 40 - 75 %:n kyllästyksessä, poistetaan suolat Sephadex G25 Fine -kolonnissa, minkä jälkeen se ruiskutetaan 50 mM bis-tris-pro-paanipuskurissa, pH 6,8, 5 mM DTT, 10 % v/v glyserolia 15 Q-Sepharose Fast Flow -kolonniin (300 ml). Kolonni ei pidätä aktiivisia proteiineja, ja niistä poistetaan suolat Sephadex G25 Fine -kolonnissa, minkä jälkeen ne ruiskutetaan jälleen 50 mM Tris-HCl-puskurissa, pH 8,2, 5 mM DTT, 10 % v/v glyserolia Q-Sepharose Fast Flow -kolonniin (35 20 ml) ja eluoidaan käyttäen lineaarista KCl-gradienttia (0 -» 0,5 M). Entsyymiaktiivisuutta sisältävät fraktiot (jotka :v. osoitetaan esimerkissä 5.6.1.A. kuvatulla ensimmäisellä • · • · .···. kokeella) yhdistetään, niistä poistetaan suolat Sephadex ♦ ·
*" G25 Fine -kolonnissa, ja ne ruiskutetaan sitten 50 mM
··♦ r J
*'**. 25 Tris-HCl-puskurissa, pH 8,2, 5 mM DTT, 10 % v/v glyserolia . . MonoQ HR 10/10 -kolonniin. Pidätetyt proteiinit eluoidaan • · · suoraan samalla puskurilla, johon on lisätty pitoisuus • * ’·* ’ 0,2 M KC1. Ne kerätään 1 ml:n tilavuudessa, joka ruiskute taan välittömästi Superdex 75 HR 10/30 -kolonniin, jota 30 eluoidaan 50 mM bis-tris-propaanipuskuriin, pH 6,8, 1 mM : : DTT, 10 % v/v glyserolia. Haluttua aktiivisuutta sisältä- vät fraktiot (jotka osoitetaan tästä vaiheesta esimerkissä • · 5.6.1.A. kuvatulla spektrofotometrisellä kokeella) yhdis-*····' . , . tetään ja poolin kokonaistilavuus säädetään 7 ml:ksi; nämä ' 35 7 ml ruiskutetaan kolonniin, joka on täytetty 8 ml :11a • 58 117674 FMN-agaroosia; kolonni pestään 50 mM bis-tris-propaanipus-kurilla, pH 6,8, 1 mM DTT, 10 % v/v glyserolia, minkä jälkeen sitä eluoidaan samalla puskurilla, joka sisältää pitoisuuden 10 μΜ FMN. Aktiiviset fraktiot yhdistetään, 5 niistä poistetaan suolat PD-10-kolonnissa, ja ne ruiskutetaan 50 mM tris-HCl-puskurissa, pH 8,2, 5 mM DTT, 10 % v/v ί glyserolia MonoQ HR 5/5 -kolonniin ja eluoidaan lineaarisella KCl-gradientilla (0 -1 2 3 0,25 M).
Tämän vaiheen jälkeen entsyymi on puhdas. SDS-PAGE-10 elektroforeesissa vain yksi kohtalaisen suuri nauha ilmenee ja sen molekyylipaino keskittyy arvioidusta noin 28 000:aan, kun taas Bio-Sil 125 -geelipermeaatiokromato-grafiassa tämä proteiini muodostaa symmetrisen piikin, joka keskittyy noin 30 000:n molekyylipainoon.
15 Sekventointia varten proteiinista poistetaan suolat 25 cm:n Vydac C4 -kolonnissa, jota eluoidaan lineaarisella asetonitriiligradientilla 30 -» 70 % vedessä, jossa on 0,07 % trifluorietikkahappoa.
20 Taulukko: FMN-reduktaasin puhdistaa Itien ... Puhdistua-1 Til. Proteiineja Spes. akt,®#b Saanto Puhdistua- • · · ϊ .1 vaihe (ai) (ag) (yks./ng) (1) tekijä • 1 · • · * · * · 25 raakauute 1620 5100 0,0041 100 1 2 • · · ...I 40-75 1 a.s. 155 2930 0.0053 68 1,2 ····· Q-Seph. pH 6,8 357 180 0.058a 49 14 . · Q-Seph. pH 8,2 153 15 0,36a 25 85 * 1 1 ·· · MonoQ HR 10/10 1,0 8 . 0,50a 19 120 30 4,4b
Superdex 75 1,5 3.1 7,4b 12 200 FMN-agarose 7,S 0,28 96b 14 2600 ' t ϊ I MonoQ HR 5/5 3,0 0,29 68b 11 1900
Bio-Sil 125 7,5 0,18 106b 10 2900 ·;· 35 apristinamysiini HA -syntaaalln kytketty määritys ***** ^Spektrofotometrinen määritys 3 • · . Puhdistustekijä lasketaan fraktioiden spesifisen * aktiivisuuden kohoamisesta puhdistuksen aikana.
117674 59 5.6.2. Oligonukleotidien valmistaminen lähtien pro-telinisekvenssistä Tämä esimerkki kuvaa, miten lähtien FMN-reduktaasi-proteiinin NH2-pää- ja sisäisistä sekvensseistä on mahdol-5 lista syntetisoida oligonukleotidejä.
FMN-reduktaasin NH2-pääsekvenssi määritettiin mikro-sekventoinnilla, kuten kuvattiin esimerkissä 5.1.2. Näin identifioitiin noin 30 tähdettä.
(NH2-pääsekvenssejä, jotka lähtevät 4. ja 11. täh-10 teestä, löydettiin myös sekventoidusta näytteestä.)
Identifioitiin samoin FMN-reduktaasin kaksi sisäistä sekvenssiä, 13 ja 21 aminohapon, trypsiinihydrolyysin ja saatujen fragmenttien puhdistuksen jälkeen Vydac C18 -kolonnissa.
15 FMN-reduktaasiproteiinin NH2-pääsekvenssi: (vrt.
tähteet 2-25 sekvenssissä tunnusnro 7) 1 5 10 15 20 25
TGADDPARPAVGPQS FRDAMAQLA S P V
FMN-reduktaasiproteiinin sisäisiä sekvenssejä: 20 (vrt. tähteet 102 - 122 sekvenssissä tunnusnro 7) 1 5 10 15 20
FAGGEFAAWDGTGVPYLPDAK
• · -- * * .···. (vrt. tähteet 149 - 161 sekvenssissä tunnusnro 7) • · • · ·
25 TGDPAKPPLLWYR
• · * · · --------—1- • · t t Lähtien kummassakin sekvenssissä alleviivatuista * · · “| · alueista ja geneettisen koodin Streptomycesille spesifi- • · · *·* * sestä degeneraation funktiosta (vrt. esimerkki 8) synteti soitiin seuraavat oligonukleotidiseokset: * ϊ,ί.ϊ 30 Seos, joka vastaa FMN-reduktaasiproteiinin NH2-pää-
• M
! : sekvenssiä: * · · 5· 3' • · TTC CGC GAC GCC ATG GCC CAG CTC GC ' i
* G G G G
»·* • · · *·*·· • · 117674 ' 60 " . .
Seos, joka vastaa FMN-reduktaasiproteiinin sisäisiä sekvenssejä: 5’ 3’
TTTC GCC GGC GGC GAG TTC GCC GCC TGG GAC GGC ACC GG 5 G G G G G G
5’ 3’
GAC CCC GCC AAG CCC CCC CTG CTG TGG TAC CG G G G G C C
5.6.3. Synteettisten oligonukleotidiseosten leimaa-10 minen ja hybridisaatio pristinaespiraliksen SP92 geno-mipankki-DNA:hän Tämä esimerkki kuvaa, miten pristinamysiinien bio- synteesigeenille spesifisiä oligonukleotidejä voidaan leimata radioaktiivisesti ja hybridoida sitten membraaneihin, 15 joille on siirretty espiraliksen genomipankki-DNA:ta.
Oligonukleotidien leimaaminen suoritettiin siirtä- vs mällä 5 '-pääasemaan leimattu ATP: n [gamma-32P] fosfaattiryh-mä käyttäen T4-polynukleotidikinaasia, kuten esitettiin kohdassa 5.1.3.
20 Noin 2 x 500 ng kutakin oligonukleotidiseosta lei mattiin täten 32P:llä ja niitä käytettiin kumpaankin kah- ·*·*: teen pankkiin hybridoimiseksi.
• · · ;”*· Hybridisaatio kummankin pankin membraaneihin suori- ··· tettiin, kuten esitettiin esimerkissä 5.1.3.
··*· 25 5.6.4. Kosmidin plBV4 eristäminen ja FMN-reduktaa- . sin rakennegeenin (snaC) sisältävän alueen määritys
Kosmidi pIBV4 eristettiin kantaan E. coli HB101 φ · · ““ * valmistetun pankin kloonista, johon oli samanaikaisesti hybridoitu kolme nukleotidiseosta.
· · *.ί·* 30 Tätä kosmidia puhdistettiin, kuten kuvattiin esi-
Ml merkissä 2. Se sisältää pristinaespiraliksen SP92 geno- .*··. mi-DNA-insert in, jonka kooksi arvioidaan 48 ke. Pilkkomi- * · · sista eri restriktioentsyymeillä valmistettiin kartta (ku- • · • vio 7), kuten esitetään kohdassa 5.1.4.
* • a · « · · *·· ·'''· ··«*· • » 117674 61
Eri entsyymeillä pilkotun pIBV4:n DNA-Southern-hyb-ridisaatioista oligonukleotidiseoksiin voitiin identifioida snaC:n, FMN-reduktaasin rakennegeenin, sisältävä alue. Southern-määritykset ja hybridisaatiot suoritettiin, kuten 5 kuvataan esimerkissä 5.1.4.
Hybridisaatiotuloksista voitiin osoittaa, että kos-midissa pIBV4 oli 4 ke:n BamHI-BamHI-fragmentti, joka si- | sälsi esimerkissä 5.6.3. syntetisoituihin koettimiin nähden homologisia sekvenssejä.
10 5.7. p-aminofenyylialaniini(fenyyli-N)-metyyli- transferaasin rakennegeenin läsnäolon osoittaminen kosmi-dissa pIBV2 Tämä esimerkki osoittaa, miten on mahdollista identifioida puhdistetusta proteiinista lähtien vastaava ra-15 kennegeeni geeneistä, jotka on jo analysoitu ja sekventoi-tu, kuten kuvataan esimerkissä 6.7. ja 7.8., ja samoin ilmennetty E_j_ colissa, kuten kuvataan esimerkissä 11.
5.7.1. p-aminofenyylialaniinin metylointiin p-dime-tyyliaminofenyylialaniiniksi liittyvän proteiinin identi-20 fikaatio ja puhdistaminen Tämä esimerkki osoittaa, miten p-aminofenyyliala- ·*·’: niinin metyloinnista p-dimetyyliaminofenyylialaniiniksi * * vastuussa oleva proteiini [p-aminofenyylialaniini( fenyy- • * * .:. li-N)metyylitransferaasi] voidaan puhdistaa homogeeniseksi * · · · 25 lähtien kannasta S. pristinaespiralis SP92 ja miten se * · . voidaan samoin saada puhtaana lähtien yhdistelmä-DNA-E.
• · · "*.* coli -kannasta (esimerkki 11).
• · · '** * 5.7.1.A. p-aminofenyylialaniinin metyloinnin p-me- tyyliaminofenyylialaniiniksi aktiivisuuden ja p-metyyli- • · · ·.:.* 30 aminofenyylialaniinin metyloinnin p-dimetyyliaminofenyyli- * · · ·.,.· alaniiniksi aktiivisuuden määritys .***. Tämä esimerkki esittää pristinamysiinin IA rakenne- • · · . · osan p-dimetyyliaminofenyylialaniinin biosynteesin kahden • ♦ . terminaalisen aktiivisuuden määrityksen. Näitä aktiivi- 35 suuksia ei vielä milloinkaan ole kuvattu ja niillä on se 117674 62 merkittävä ominaisuus, etteivät ne ilmenny kuin pristi- namysiinien tuotantojakson aikana. Kyseessä on yhtäältä p-aminofenyylialaniinin metylointi p-metyyliaminofenyyli- ^ alaniiniksi (metylointi 1) ja toisaalta p-metyyliaminofe- 5 nyylialaniinin metylointi p-dimetyyliaminofenyylialanii- niksi (metylointi 2), jolloin nämä kaksi aktiivisuutta ? käyttävät SAM:ia metyyliryhmäluovuttajana (kuvio 14).
Määritettäviä entsyymifraktioita (1-20 yksikköä) inkuboidaan 30 minuutin ajan 27 °C:ssa 200 μ1:η kokonais- 10 tilavuudessa 50 mM bis-tris-propaanipuskuria, pH 6,8, joka sisältää SAM:ia (200 μΜ), jonka metyyliryhmä on leimattu radioaktiivisesta hiiliatomin isotoopilla 14 (2 Ci/mol), p-amino-L-fenyylialaniinin (1 mM) läsnä ollessa metyloin- nin 1 määrityksessä tai p-metyyliamino-L-fenyylialaniinin 15 (2,5 mM) läsnä ollessa metyloinnin 2 määrityksessä.
Reaktio keskeytetään lisäämällä 16 μΐ 37-%:ista kloorivetyhappoa ja sitten 20 μΐ natriumheptaanisulfonaat- tiliuosta, jonka pitoisuus on 240 g/litra. Sentrifugoinnin jälkeen 150 μΐ supernatanttia ruiskutetaan HPLC-systeemiin 20 käyttäen seuraavaa gradienttimuotoa: liikkuva faasi: eluentti A = 1,2 g natriumheptaa- ·1·'· nisulfonaattia + 2,5 ml jääetikkahappoa + vettä (q.s.
• · ·1". 1 000 ml); eluentti B = 1,2 g natriumheptaanisulfonaat- tia + 2,5 ml jääetikkahappoa + 300 ml asetonitriiliä + 25 vettä (q.s. 1 000 ml) • ·
• gradientti: t (min) % B
o 30 ** 16 30 17 100 30 20 100 C: 21 30 .·". 25 30 • · • · 1 stationaarifaasi: Nucleosil C18 5 pm -kolonni, • · • 150 x 4,6 mm (Macherey-Nagel) ♦ · ♦ • · · ·· ···#.. .
* » : 117674 63
Niiden poistuessa kolonnista entsyymireaktioiden substraatit ja tuotteet kvantitoidaan absorptiosta 254 nm:ssä. Tämä detektio on kytketty radiokemialliseen detek-tioon linjassa käyttäen Berthold LB506 -detektoria, joka 5 on varustettu tyyppiä GT400-U4 edustavalla kiinteällä tui- kekennolla. Tämä tekee mahdolliseksi seurata spesifisesti 4 radioaktiivisten metyyliryhmien sisällytystä reaktiotuotteisiin.
Entsyymiaktiivisuusyksiköksi metyloinnille 1 (mety- 10 loinnille 2) määritellään entsyymimäärä, joka tarvitaan 1 nanomoolin metyyliryhmiä sisällyttämiseksi p-aminofenyy- lialaniiniin (p-metyyliaminofenyylialaniiniin).
5.7.I.B. SAM:ista riippuvaisen N-metyylitransferaa- sin, joka katalysoi p-aminofenyylialaniinin metylaatiota 15 p-dimetyyliaminofenyylialaniiniksi [p-aminofenyylialanii- ni(fenyyli-N)-metyylitransferääsi], puhdistaminen lähtien S. pristinaespiraliksesta SP92
Tämä esimerkki esittää, miten pristinamysiinin IA
biosynteesireittiin osallistuva pristinaespiralis SP92 20 -entsyymi voidaan puhdistaa.
Käyttäen edellä esimerkissä 5.7.1.A. kuvattua mää- ·*·*: ritystä SAM:ista riippuvaisen N-metyylitransferaasin puh- • « distaminen suoritetaan, kuten kuvataan alla, huolehtien • · ' r • · · siitä, että aktiiviset fraktiot jäädytetään ja säilytetään «M· ,...· 25 -70 °C:ssa kunkin vaiheen välillä, mikäli tarpeen.
* * . 240 g:n sentrifugointipelletti, joka on pesty "!.* 100 mM fosfaattipuskurilla, pH 7,2, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA, • · · * 5 mM EGTA, 0,5 M KC1, 10 % v/v glyserolia, pristinaespiralis SP92 -viljelmästä, joka on otettu talteen pristi- \ί.: 30 namysiinien tuotantovaiheen alussa, uudelleenlietetään 480 * * * ml:aan 0,1 M Tris-HCl-puskuria, pH 8,0, joka sisältää pi-.···. toisuudet 4 mM DTE, 5 mM bentsamidiini, 0,2 mM Pefabloc, i 100 pg/litra E-64-valmistetta, 2 mg/litra leupeptiiniä, s . 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mg/litra STI-valmistetta, 2 mg/ 35 litra aprotiniinia, 20 % v/v glyserolia ja 2 mg/litra ly-
• I
117674 64 sotsyymiä, jolloin puskuria pidetään +4 °C:ssa. Näin saatua suspensiota sekoitetaan kiivaasti 4 °C:ssa. 30 minuutin sekoituksen jälkeen lisätään 0,2 mg/ml deoksiribonukleaa-sia I ja pitoisuuteen 5 mM MgClz:ta. 90 minuutin sekoituk-5 sen jälkeen uutetta sentrifugoidaan 1 tunnin ajan 50 000 x g:ssä- Supernatantti jaetaan kolmeen noin 180 ml:n fraktioon. Kustakin poistetaan suolat geelipermeaatiolla 500 ml:n Sephadex G 25 -kolonnissa, jota on tasapainotettu luonnollisella virtauksella 20 mM bis-tris-puskurissa, pH 10 6,8, joka sisältää pitoisuudet 4 mM DTE, 5 mM bentsamidii- ni, 0,2 mM Pefabloc, 100 pg/litra E-64-valmistetta, 2 mg/ litra leupeptiiniä, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mg/litra STI-valmistetta, 2 mg/litra aprotiniinia, 20 % v/v glyserolia.
Sitten proteiinieluaatilla suoritetaan kromatografia-ajo 15 (400 mg proteiinia kussakin syklissä) MonoQ HR 16/10 -ko lonnissa virtauksella 6 ml/min käyttäen kasvavaa lineaarista natriumkloridigradienttia (0 -> 0,3 M) 20 mM bis-tris-puskurissa, pH 6,8, joka sisältää pitoisuudet 4 mM DTE, 2 mM bentsamidiini, 100 pg/litra E-64-valmistetta, 20 2 mg/litra leupeptiiniä, 20 % v/v glyserolia. Fraktioiden poistuessa kolonnista niitä täydennetään 10 %:lla v/v ·**': 20 mM bis-tris-puskuria, pH 6,8, joka sisältää pitoisuudet * · .***. 4 mM DTE, 30 mM bentsamidiini, 2 mM Pefabloc, 100 pg/litra • · · E-64-valmistetta, 2 mg/litra leupeptiiniä, 5 mM EDTA, 5 mM 25 EGTA, 10 mg/litra STI-valmistetta, 10 mg/litra aprotinii- • · . nia, 20 % v/v glyserolia. Näissä olosuhteissa kyseiset *11.* kaksi metylaatioaktiivisuutta (1 ja 2) todetaan identti- • i · • sellä tavalla eksluusiofraktioista ja ensimmäisistä eluu-tiofraktioista. Nämä fraktiot yhdistetään ja konsentroi- 30 daan ultrasuodattamalla CentriPrep 10:ssä. Tämä konsent- ··· •,.,1 raatti säädetään pitoisuuteen 0,85 M ammoniumsulfaatti, ,···. minkä jälkeen sillä suoritetaan kromatograf ia-ajo (20 - 80 mg kussakin syklissä) fenyyli-Superose HR 10/10 -kolonnis- :¾ * · . sa virtauksella 1 ml/min käyttäen laskevaa lineaarista « •,:.1 35 ammoniumsulfaattigradienttia (0,85 -* 0 M) 50 mM bis-tris- • · 117674 65 puskurissa, pH 6,8, joka sisältää pitoisuudet 4 mM DTE, 2 mM bentsamidiini, 100 pg/litra E-64-valmistetta, 2 mg/ litra leupeptiiniä, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 % v/v glyserolia. Niiden poistuessa kolonnista fraktioita täydenne-5 tään 10 %:lla v/v 50 mM bis-tris-puskuria, pH 6,8, joka sisältää pitoisuudet 4 mM DTE, 30 mM bentsamidiini, 2 mM Pefabloc, 100 pg/litra E-64-valmistetta, 2 mg/litra leu- i peptiiniä, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 mg/litra STI-valmis-tetta, 10 mg/litra aprotiniinia, 10 % v/v glyserolia.
10 Näissä olosuhteissa kyseiset kaksi metylaatioaktiivisuutta (1 ja 2) todetaan identtisellä tavalla eluutiofraktioista, jotka vastaavat pitoisuutta noin 0,15 M ammoniumsulfaatti.
Nämä fraktiot yhdistetään, ne konsentroidaan ultrasuodat-tamalla Centricon 10:ssä, niistä poistetaan suolat PD-10-15 kolonneissa, joita on tasapainotettu 50 mM Tris-puskuril-la, pH 8,2 (5 °C:ssa), joka sisältää pitoisuudet 4 mM DTE, 2 mM bentsamidiini, 100 pg/litra E-64-valmistetta, 2 mg/ litra leupeptiiniä, 20 % v/v glyserolia, minkä jälkeen niillä suoritetaan kromatografia-ajo (noin 10 mg kussakin 20 syklissä) MonoQ HR 5/5 -kolonnissa, jota on tasapainotettu / samassa puskurissa, virtauksella 1 ml/min. Näissä olosuh- :***; teissä kyseiset kaksi aktiivisuutta eivät pidäty kolon- • · .**·, niin. Niiden poistuessa kolonnista eksluusiof raktioita, M» jotka siis sisältävät nämä kaksi aktiivisuutta, täydenne-25 tään 10 %:lla v/v 50 mM Tris-puskuria, pH 8,2, joka sisäl- • · , . tää pitoisuudet 4 mM DTE, 30 mM bentsamidiini, 2 mM Pefa- • · · bloc, 100 pg/litra E-64-valmistetta, 2 mg/litra leupeptii- · · *·* * niä, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 20 % v/v glyserolia. Nämä frak tiot konsentroidaan sitten ultrasuodattamalla Centricon 30 10:ssä, minkä jälkeen niillä suoritetaan kromatografia-ajo * · • ,,,ϊ TSK G2000 SW -kolonnissa 300 x 7,5 mm 10 pm, jota on tasa- .···. painotettu virtauksella 0,5 ml/min 50 mM Hepes-puskurissa, • · pH 7,0, joka sisältää pitoisuudet 4 mM DTE, 0,2 mM Pefa-
. bloc, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 % v/v glyserolia, 0,15 M
*,·,* 35 natriumkloridi. Kyseiset kaksi aktiivisuutta eluoituvat « * · 66 '' 117674 tässä tekniikassa yhdessä retentioajassa, joka vastaa mo-lekyylipainoa noin 30 000. Tämän vaiheen jälkeen vallitseva proteiini nähdään SDS-PAGE:ssa. Se sijaitsee kohdassa noin 32 000.
5
Tauluko: p-oBinofenyyllalaniininetyloinnin p-dinetyylianlnofenyylialaniinikei entayyminpuhdl·-taaiaen
Puhdistus- Til. Proteiineja Spes. akt. Saanto Puhdietua- 10 vaihe (ai) (ag) (yka.a/ag) (S) tekijä rsakauute 510 1800 29 - G25 Fine 560 1560 34 102 1.17
MonoQ HR 16/10 670 82 430 67 14,8 15 fenyyli-Super. 10 3,48 6300 42 217
MonoO HR 5/5 7 0,88 17200 29 593 TSK G2000 0,8 0,113 40300 8,7 1390 aKyseessä ovat entsyymiaktiivisuusykaiköt metylaatiolle 1, Kussakin vaiheessa entsyy-miaktiivisuusyksiköiden arvo metylaatiolle 2 oli 120 X yksiköiden metylaatiolle 1 arvosta.
20 ' Puhdistustekijä laskettiin fraktioiden spesifisen aktiivisuuden kohoamisesta puhdistuksen aikana.
5.7.I.C. S. pristinaespiralis SP92 -yhdistelmä-DNA-proteiinin, jolla on SAMeista riippuvaista N-metyylitrans-j·,·. 25 feraasiaktiivisuutta, joka katalysoi p-aminofenyylialanii- ,···, nin metylaatiota p-dimetyyliaminofenyylialaniiniksi, puh- • · **I distaminen lähtien coli: :pVRC706: sta ***, Tämä koe esittää, miten S. pristinaespiralis SP92 , ,* -entsyymi, joka osallistuu pristinamysiinin IA biosyntee- I * · ··· · 30 sireittiin ja ilmentyy colissa kloonaamalla geeni papM, i t · V * voidaan puhdistaa.
Käyttäen määritystä, jota kuvattiin edellä esimer- •t*t* kissä 5.7.1.A., osoitimme, että yhdistelmä-DNA-kannan E_j_ :***: coli: : pVRC706 raakauutteet osoittavat voimakasta aktiivi- • · · - t.I. 35 suutta metylaatiolle 1 ja metylaatiolle 2, kun taas • · ***. coli -verrokkikannassa (pMTL23) kumpaakaan näistä kahdes- χ *, ta aktiivisuudesta ei ole todettu. SAM:ista riippuvaisen p-aminofenyylialaniini( fenyyli-N)-metyylitransferaasin, «IM* • · 117674 67 joka katalysoi p-aminofenyylialaniinin metylaatiota p-di- metyyliaminofenyylialaniiniksi, puhdistus on siten suoritettu.
Samoissa olosuhteissa kuin esimerkissä 5.7.l.B. 5 kuvatut, lukuun ottamatta yhtä kromatografiavaihetta, jo ka jätettiin pois (puhdistusvaihe MonoQ HR 5/5 -kolonnissa), puhdistimme homogeeniseksi proteiinin, jonka molekyy-lipaino kromatografiässä TSK G2000 -kolonnissa ja SDS-PAGE:ssa on identtinen esimerkissä 5.7.l.B. puhdistetun 10 proteiinin edustamaan.
Taulukko: p-aalnofenyTlialanllnlii —I ilMtlnnp-<11aeljillM<Tiofgnyylliil«niiniksi entsyyln puhdistaminen lähtien kannasta K. coli::pVRC706 15 Puhdistus- Tll. Proteiineja Upea, akt. Saanto Puhdistus- vaihe (ai) (ag) (yke-a/ag) (*) tekijä raakauute 15 190 235 - - G25 Pine 22 175 231 91 1 20 MonoQ HR 16/10 24 13,4 2100 63 β.9 fenyyli-Super. 3,0 0,39 35500 31 145 TSK 02000 0,8 0,092 45200 9,3 192 a Kyseessä ovat entsyynlaktiivisuusyksiköt metylaatiolle 1. Kussakin valheessa entayy-mlaktllvisuusyksiköiden arvo metylaatiolle 2 oli 120 £ yksiköiden metylaatiolle 1 arvosta.
!V. 25 • · ·'*· Puhdistustekijä laskettiin fraktioiden spesifisen ··· aktiivisuuden kohoamisesta puhdistuksen aikana.
···· 5.7.2. p-aminofenyylialaniini(fenyyli-N)-metyyli- • » • (*( transferaasin rakennegeenin identifiointi • · · "I.* 30 Esimerkissä 5.7. l.B. puhdistetun 32 000:n proteii- • · · ’·* * nin NH2-pääsekvenssi määritettiin mikrosekventoinnilla, ku ten kuvattiin esimerkissä 5.1.2. Näin määritettiin noin 10 tähdettä:
;...i TAAAPTLAQA
.***. 35 Esimerkissä 5.7.I.C. puhdistetun 32 000:n proteii- • · · nin NH2-pääsekvenssi määritettiin mikrosekventoinnilla, ku- • · • ten kuvattiin esimerkissä 5.1.2. Näin määritettiin noin 10 tähdettä:
TAAAPTLAQA
117674 68
Kyseessä ovat kahdessa kyseisessä tapauksessa samat tähteet ja tämä sekvenssi vastaa täsmälleen proteiinisek-venssin alkua, joka pääteltiin geenin papM sekvenssistä (vrt. tähteet 2-11 sekvenssissä tunnusnro 10). Puhdis-5 tettu p-aminofenyylialaniini( f enyyli-N)-metyylitransf erääsi on siten proteiini papM. #
Esimerkki 6 DNA-fragmenttien alakloonaus, jotka kloonattiin esimerkissä 3 valmistetun kaltaisiin kosmideihin ja jotka 10 sisältävät kiinnostavia geenejä Tämä esimerkki esittää, miten lähtien kosmidelsta, jotka rakennettiin, kuten kuvattiin esimerkissä 3, ja jotka sisältävät pristinamysiinien II tai pristinamysiinien I biosynteesigeenejä, on mahdollista alakloonata näitä gee-15 nejä sisältäviä DNA-fragmentteja.
Nämä alakloonaukset suoritettiin, jotta voitaisiin lopulta määrittää identifioitujen geenien nukleiinisek-venssi sekä valmistaa seuraavissa esimerkeissä esitetyt eri rakenteet.
20 6.1. 5,5 ke:n EcoRl-Bglll-fragmentin eristäminen, joka sisältää 3-hydroksipikoliinihappo-AMP-ligaasin raken- ·* · • *f! negeenin Tämä esimerkki kuvaa, miten lähtien kosmidista ··· pIBV2, joka sisältää 3-hydroksipikoliinihappo-AMP-ligaasin • · * ·...! 25 rakennegeenin, on mahdollista alakloonata tämän geenin : sisältävä pieni DNA-fragmentti.
I · t l«t » ,·;· Noin 10 pg kosmidia pIBV2 leikattiin toisiaan seu- **·.·· raten restriktioentsyymeillä Bglll ja EcoRl (New England . Biolabs) toimittajan suosittelemissa olosuhteissa. Näin • · · *·*·* 30 saadut restriktiofragmentit erotettiin elektroforeesilla • · *··.* 0,8-%:isessa agaroosigeelissä ja 5,5 ke:n Bglll-EcoRI- :***· fragmentti eristettiin elektroeluutiolla, kuten kuvataan julkaisussa Maniatis et ai. (1989).
·, Noin 100 ng pUC19:ää (Yanisch-Perron et ai., 1985), • · · *···* 35 jota on leikattu BamHI: llä ja EcoRl: llä. ligatoidaan 200 • •••S • · 117674 69 ng:aan 5,5 ke:n Bglll-EcoRI-fragmenttia esimerkissä 3.3. kuvatuissa olosuhteissa.
Kannan TG1 transformoinnin jälkeen ja transfor-manttien valikoinnin jälkeen kiinteällä LB-kasvualustal-5 la, joka sisältää 150 μg/ml ampisilliiniä ja 20 pg/ml X-gal;ia, Maniatiksen et ai. (1989) kuvaaman tekniikan mukaan eristettiin halutun fragmentin käsittävä klooni. Yhdistelmä-DNA-plasmidi nimettiin pVRC402:ksi. Sen res-triktiokartta esitetään kuviossa 15(A). Esimerkissä 5.2. 10 osoitettiin hybridisaatiolla, että 5,5 ke:n EcoRI-Bglll-fragmentti sisältää 3-hydroksipikoliinihappo-AMP-ligaasin S. pristinaespiraliksesta SP92 rakennegeenin. Plasmidi pVRC402 sisältää siten 3-hydroksipikoliinihappo-AMP-ligaa-sin pristiaespiraliksesta SP92 rakennegeenin.
15 6.2. 4,6 ke:n Nglll-Bcjd.il-fragmentin eristäminen kosmidista pIBV2 Tämä esimerkki kuvaa, miten lähtien kosmidista pIBV2 on mahdollista alakloonata pienikokoinen DNA-frag- mentti tarkoituksessa identifioida 3-hydroksipikoliinihap- 20 po-AMP-ligaasin rakennegeenin viereisiltä alueilta muiden geenien läsnäolo, jotka liittyvät pristinamysiinien I bio- :*·*· synteesiin.
• · ·*". Kloonauksen eri vaiheet suoritettiin, kuten edellä • · r »·· on kuvattu.
* 25 Noin 10 pg kosmidia pIBV2 leikattiin Bglll: 11a.
• · . Näin saadut restriktiofragmentit erotettiin elektroforee- • · · "j.* silla 0,8-%:isessa agaroosigeelissä ja Bglll-Bglll-frag- * * mentti eristettiin eletroeluutiolla.
Noin 100 ng BamHl:llä leikattua pUC19:ää ligatoi- *.!.* 30 tiin 200 ng:aan Bglll-Bglll-fragmenttia.
• · ·
Halutun fragmentin käsittävä klooni eristettiin .*··, kannan TG1 transformoinnin jälkeen esimerkissä 6.1.
t · » · · kuvatun mukaisesti. Yhdistelmä-DNA-plasmidi nimettiin • · pVRC501:ksi. Sen restriktiokartta esitetään kuviossa 35 15(B).
• ...
• · · · · • « 117674 70 6.3. 6 ke: n BamHI-BamHI- fragment in eristäminen, joka sisältää pristinamysiini IIA -syntaasin kahden alayksikön rakennegeenit Tämä esimerkki kuvaa, miten lähtien kosmidista 5 pIBVl on mahdollista alakloonata pienikokoinen DNA-fragmentti, joka sisältää pristinamysiini IIA -syntaasin kah-den alayksikön rakennegeenit. f
Kloonauksen eri vaiheet suoritettiin edellä kuvatun mukaisesti.
10 Noin 10 pg kosmidia pIBVl leikattiin BamHI:llä.
Näin saadut restriktiofragmentit erotettiin elektroforeesilla 0,8-%:isessa agaroosigeelissä ja 6 ke:n BamHI-frag-mentti eristettiin elektroeluutiolla.
Noin 100 ng BamHI:llä leikattua pBKS':sta (Strata-15 gene Cloning Systems, La Jolla, Kalifornia) ligatoitiin 200 ng:aan 6 kein BamHI-fragmenttia.
Halutun fragmentin käsittävä geeni eristettiin kannan TG1 transformoinnin jälkeen. Yhdistelmä-DNA-plasmidi nimettiin pXL2045:ksi. Sen restriktiokartta esitetään ku-20 viossa 16. Esimerkissä 5.1. osoitettiin hybridisaatiolla, että 6 ke:n BamHI-fragmentti sisältää geenit snaA ja snaB, :***! jotka koodattavat pristinaespiraliksen SP92 pristinamy- ·***· siini IIA -syntaasin kahta alayksikköä. Plasmidi pXL2045 ··· sisältää siten geenit snaA ja snaB, jotka koodittavat S^ ···· ....· 25 pristinaespiraliksen SP92 pristinamysiini IIA -syntaasin • · • kahta alayksikköä.
• · · 6.4. 6,2 ke:n SphI-fragmentin eristäminen, joka si- * · ♦ - * sältää osan pristinamysiini 1 -syntaasi-II:n rakennegee- nistä * • · · · ' *.Σ.* 30 Tämä esimerkki kuvaa, miten lähtien kosmidista • · · plBV3 on mahdollista alakloonata pienikokoinen DNA-frag- .*··. mentti, joka sisältää osan pristinamysiini I -syntaasi- »·« ....· II:n rakennegeenistä.
• · . Kloonauksen eri vaiheet suoritettiin, kuten on *.:.* 35 edellä kuvattu.
• * 117674 71
Noin 10 pg kosmidia pIBV3 leikattiin Sphl:llä. Näin saadut restriktiofragmentit erotettiin 0,8-%:isessa aga-roosigeelissä ja 6,2 ke:n Sphl-fragmentti eristettiin pakkauksen "Geneclean", jota markkinoi yritys BiolOl-Ozyme, 5 tekniikalla.
Noin 100 ng Sphltllä leikattua pUC19:ää ligatoitiin 200 ng:aan 6,2 ke:n Sphl-fragmenttia.
Halutun fragmentin käsittävä klooni eristettiin kannan TG1 transformoinnin jälkeen. Yhdistelmä-DNA-plasmi- 10 di nimettiin pVRC1105:ksi. Sen restriktiokartta esitetään kuviossa 17.
6.5. 8,4 ke:n Sphl-fragmentin, joka sisältää osan pristinamysiini I -syntaasi-III:n rakennegeenistä, eristäminen 15 Tämä esimerkki kuvaa, miten lähtien kosmidista pIBV3 on mahdollista alakloonata pienikokoinen DNA-frag-mentti, joka sisältää osan pristinamysiini I -syntaasi-III: n rakennegeenistä.
Kloonauksen eri vaiheet suoritettiin, kuten edellä 20 on kuvattu.
Noin 10 pg kosmidia pIBV3 leikattiin Sphl:llä. Näin ·*·*; saadut restriktiofragmentit erotettiin 0,8-%:isessa aga- • · .···. roosigeelissä ja 8,4 ke: n Sphl-fragmentti eristettiin pak- kauksen "Geneclean", jota markkinoi yritys BiolOl-Ozyme, *’**. 25 tekniikalla.
• · * * » , . Noin 100 ng Sphl:llä leikattua pUC19:ää ligatoitiin • · ·"/ 200 ng:aan 8,4 ke:n Sphl-fragmenttia.
• · · *·* Halutun fragmentin käsittävä klooni eristettiin kannan TG1 transformoinnin jälkeen. Yhdistelmä-DNA-plasmi- * 30 di nimettiin pVRCHOö: ksi. Sen restriktiokartta esitetään • · # • · kuviossa 18.
* * * ,···, 6.6. 6,6 ke:n Sphl-fragment in eristäminen, joka si- * · sältää osan pristinamysiini I -syntaasi-IV:n rakennegee- • · , nistä 35 Tämä esimerkki kuvaa, miten lähtien kosmidista "**: pIBV3 on mahdollista alakloonata pienikokoinen DNA-frag- 72 117674 mentti, joka sisältää osan pristinamysiini I -syntaasi-IV:n rakennegeenistä.
Kloonauksen eri vaiheet suoritettiin, kuten edellä on kuvattu.
5 Noin 10 pg kosmidia pIBV3 leikattiin Sphlillä. Näin saadut restriktiofragmentit erotettiin 0,8-%:isessa aga-roosigeelissä ja 6,6 ke:n Sphl-fragmentti eristettiin pakkauksen "Geneclean", jota markkinoi yritys BiolOl-Ozyme, tekniikalla.
10 Noin 100 ng Sphltllä leikattua pUC19:ää ligatoitiin 200 ng:aan 6,6 ke:n Sphl-fragmenttia.
Halutun fragmentin käsittävä klooni eristettiin kannan TG1 transformoinnin jälkeen. Yhdistelmä-DNA-plasmi-di nimettiin pVRC1104:ksi. Sen restriktiokartta esitetään 15 kuviossa 19. · 6.7. 17 ke:n Hindlll-Hindlll-fragmentin eristämi-nen, joka sisältää kosmidin pHC79 ja käsittää geenit, jotka sijaitsevat ylävirtaan 3-hydroksipikoliinihappo-AMP-li-gaasista (pristinamysiini I -syntaasi I) 20 Tämä esimerkki kuvaa, miten lähtien kosmidista pIBV2, joka sisältää 3-hydroksipikoliinihappo-AMP-ligaa- ·*·*· sin rakennegeenin, on mahdollista deletoida iso osa tätä • · .**·. kosmidia säilyttäen vain osa, joka sijaitsee ylävirtaan 3-hydroksipikoliinihappo-AMP-ligaasista.
25 Noin 200 ng kosmidia pIBV2 leikattiin restriktio- • · . . entsyymillä Hindlll. Entsyymiä denaturoitiin 30 minuutin • · · ~ ajan 85 °C:ssa toimittajan suositusten mukaisesti. Näin *·* pilkottu kosmidi plBV2 saostettiin etanolilla, kuten kuva taan julkaisussa Maniatis et ai. (1989), ja uudelleenliga-30 toitiin itseensä 50 μ1:η tilavuudessa.
• ·· ·...· Kannan TG1 transformoinnin ja transformanttien va- .·*·. likoinnin jälkeen kiinteällä LB-kasvualustalla, joka si- • · sältää 150 yg/ral ampisilliiniä Maniatiksen et ai. kuvaa- • · . man tekniikan mukaan (1989), eristettiin klooni, joka si- 35 sältää kosmidin pHC79 ja 3-hydroksipikoliinihappo-AMP-li- • · 73 117674 gaasista ylävirtaan sijaitsevan osan (yhdistelmä vastaa noin 17 ke: n kokoa). Yhdistelmä-DNA-plasmidi nimettiin pVRC900:ksi. Sen restriktiokartta esitetään kuviossa 20.
6.8. Kosmidista pIBV3 peräisin olevan 1,5 ke:n Bam-5 HX-SstI-fragmentin eristäminen Tämä esimerkki kuvaa, miten lähtien kosmidista pIBV3, joka sisältää geenin snaA, joka koodittaa PIIA-syn-taasin suurta alayksikköä, on mahdollista alakloonata ylävirtaan sijaitseva DNA-fragmentti sen tutkimiseksi ja sek-10 ventoimiseksi.
Noin 10 pg kosmidia pIBV3 leikattiin peräkkäin res-triktioentsyymeillä SstI ja BamHI. Näin saadut restriktio-fragmentit erotettiin 0,8-%:isessa agaroosigeelissä ja 1,5 ke:n BamHI-Sstl-fragmentti eristettiin pakkauksen "Gene-15 clean", jota markkinoi yritys BiolOl-Ozyme, tekniikalla.
Noin 100 ng BamHI:llä ja SstI:llä leikattua plasmi-dia pDH5 (Hilleman et ai., 1991) ligatoitiin 200 ng:aan BamHI-SstI-fragmenttia esimerkissä 3.3. kuvatuissa olosuhteissa.
20 Kun kanta TG1 oli transformoitu ja transformantit **.
valikoitu kiinteällä LB-kasvualustalla, joka sisälsi 150 :*·*: pg/ml ampisilliiniä ja X-gal:ia Maniatiksen et ai. ku- ·*’*· vaarnan tekniikan mukaan, eristettiin yksi halutun f ragmen- • · · .:. tin käsittävä klooni. Yhdistelmä-DNA-plasmidi nimettiin • · · · ,...· 25 pVRCl000:ksi. Sen restriktiokartta esitetään kuviossa 21.
* * • 6.9. 4 ke:n BamHI-BamHI-fragmentin eristäminen, jo- • * · ‘II.* ka sisältää FMN-reduktaasin rakennegeenin • · · *** Tämä esimerkki kuvaa, miten lähtien kosmidista pIBV4, joka sisältää FMN-reduktaasin rakennegeenin (snaC), # i i *.!.* 30 on mahdollista alakloonata pienikokoinen tämän geenin si- II* sältävä DNA-fragmentti.
.***. Kloonauksen eri vaiheet suoritettiin edellä kuvatun • · • · · mukaisesti.
• « • Noin 10 pg kosmidia pIBV4 leikattiin restriktioent- 35 syymillä BamHI. Näin saadut restriktiofragmentit erotet- • · 117674 74 tiin 0,8-%:isessa agaroosigeelissä ja 4 ke:n BamHI-BamHI-fragmentti eristettiin elektroeluutiolla.
Noin 100 ng BamHI:llä leikattua pUC19:ää ligatoi-tiin 200 ng:aan 4 ke:n BamHI-BamHI-fragmenttia.
5 Kun kanta coli DH5a (supE44 DlacU169 (f801acZDM15) hsdR17 recAl endAi gyrA96 thi-1 relAl) (Hanahan, 1983) oli transformoitu ja transformantit valittu kiinteällä LB-kasvualustalla, joka sisälsi 150 pg/ml ampisilliiniä ja X-gal:ia Maniatiksen et ai. kuvaaman 10 tekniikan mukaan (1989), eristettiin halutun fragmentin käsittävä klooni. Yhdistelmä-DNA-plasmidi nimettiin pVRC509:ksi. Sen restriktiokartta esitetään kuviossa 22.
Esimerkki 7
Eristettyjen DNA-fragmenttien sekvenssi, jotka si-15 sältävät pristinaespiraliksen SP92 pristinamysiinien biosynteesigeenejä Tämä esimerkki kuvaa DNA-fragmenttien sekventoin- tia, jotka käsittävät yhtäältä pristinamysiinien I ryhmän pristinamysiinien biosynteesiin liittyviä geenejä ja toi- 20 saalta geenejä, jotka liittyvät pristinamysiinien II ryh- f: män kannasta pristinaespiralis pristinamysiinien bio- ·'·1. synteesiin.
• · 7.1. 5 ke:n BamHI-XhoI-fragmentin sekventointi • · · Tämä esimerkki kuvaa, miten voidaan saada nukleoti-25 disekvenssi fragmentille, joka sisältää S. pristinaespira- • · . liksen SP92 geenit snaA ja snaB.
*".1 BamHI-XhoI-fragmentti on osa 6 ke:n BamHl-BamHl- • · · * fragmenttia, joka kloonattiin fasmidiin pBKS-, jolloin saatiin plasmidi pXL2045, jota kuvataan esimerkissä 6.3.
*.:.· 30 Tämän 5 ke:n BamHI-XhoI-insertin alafragmentteja saatiin • · · ·...· sitten entsymaattisesti pilkkomalla, minkä jälkeen ne ala- .··1. kloonattiin faageihin M13mpl8 tai M13mpl9 (Messing et ai., 1981) kahdessa suuntauksessa. Käytetyt alakloonauskohdat • · . olivat seuraavat: EcoRI, PstI, PstI, Nrul, EcoRl, NruI, • ♦ 1 • · * 1 1 · 1 · • · 117674 75
NotI,"Sali, SstI, Xhol, Sali ja Xhol ja ne esitetään kuviossa 16.
Nämä eri insertit sekventoitiin ketjupääreaktio-menetelmällä käyttäen synteesialukkeena yleisaluketta 5 (Maniatis et ai., 1989) tai syntetisoituja oligonukleotl-dejä (kuten kuvataan esimerkissä 5), jotka olivat komplementaarisia sekventoitavan insertin 20 nukleotidin sekvenssiin.
Näiden eri inserttien peitolla oli mahdollista muo-10 dostaa nukleotidisekvenssi kokonaisuudessaan 5 392 ep käsittävän fragmentin BamHI-XhoI kahdelle säikeelle (sekvenssi tunnusnro 1).
7.2. 5,5 ke: n EcoRI-Bglll-fragmentin 1 870 ep:n alueen sekventointi 15 Tämä esimerkki esittää, miten voidaan saada nukleo- '} tidisekvenssi S^ pristinaesplraliksen SP92 snbA-geenin sisältävälle fragmentille.
Sekventoitu 1 870 ep:n alue on osa 5,5 ke:n EcoRI-
Bglll-fragmenttia, joka kloonattiin plasmidiin pUC19, jol- 20 loin saatiin plasmidi pVRC402, jota kuvattiin esimerkissä 6 [kuvio 15(A)]. 5,5 ke:n EcoRI-Bglll-insertin alafrag- i ·*ϊ mentteja saatiin entsymaattisesti leikkaamalla, minkä jäl- ·***· keen ne alakloonattiin faageihin M13mpl8 tai M13mpl9 kah- • · ·
dessa suuntauksessa. Alakloonauskohdat ovat Hindlll, PstI
*··♦ ....: 25 ja Hindlll ja ne esitetään kuviossa 15(A).
• · • .·. Näiden fragmenttien peitolla voitiin määrittää • « · *11.* 1 870 ep käsittävän Sau3A-Sau3A-alueen sekvenssi kokonai- ♦ · · - -- • · · * suudessaan (sekvenssi tunnusnro 5).
7.3. 1 830 ep:n alueen sekvenssi 4,6 ke:n Bglll- *"·’ 30 Bglll-fragmentissa ♦ *** Tämä esimerkki esittää, miten voidaan saada nukleo- Φ .***. tidisekvenssi fragmentille, joka on sen fragmentin vieres- ··· ....: sä, joka sisältää pristinaesplraliksen SP92 geenin • snbA.
··· • · « ··· ···*.
* · 76 1 1 7674 Tämä sekvenssi määritettiin alakloonaamalla 1 ke:n BamHI-Pstl-fragmentti ja 2,1 ke:n Pstl-EcoHI-fragmentti [kuvio 15(B)] pVRC501:stä (esimerkki 6) vektoreihin Ml3mpl8 ja M13mpl9. PstI-kohta ylitettiin alakloonaamalla 5 423 ep:n Sau3A-Sau3A-fragmentti, joka limittyy tähän koh taan, ja sitten sekventoimalla. Näin saatu 1 830 ep:n sekvenssi esitetään sekvenssinä tunnusnro 6.
7.4. 6,2 ke:n Sphl-fragmentin 227 ep:n ja 247 ep:n kahden alueen sekventointi 10 Tämä esimerkki esittää, miten voidaan saada nukleo- tidisekvenssi fragmenteille, jotka sisältävät osan S. pristinaespiraliksen pristinamysiini I -syntaasi-II:n ra-kennegeenistä (snbC)♦
Sekventoidut 227 ja 247 ep:n alueet muodostavat 15 osia 6,2 ke: n Sphl-fragmentista, joka plasmidiin pUC19 kloonaamalla saatiin plasmidi pVRCHOS, jota kuvattiin ? esimerkissä 6.4. (kuvio 17). 6,2 ke:n Sphl-insertin ala-fragmentteja saatiin leikkaamalla entsyymeillä, minkä jälkeen ne alakloonattiin faageihin M13mpl8 tai M13mpl9 kah-20 dessa suuntauksessa. Alakloonauskohdat ovat XhoI, PstI ja Bglll ja ne esitetään kuviossa 17. 227 ep:n Pstl-Bglll-fragmentti sekventoitiin kokonaisuudessaan ja 247 ep sek-·**'; ventoitiin lähtien 900 ep:n Xhol-fragmentista: nämä sek-
Ml venssit esitetään sekvensseinä tunnusnro 11 ja 12.
25 7.5. 8,4 ke:n Sphl-fragmentin 192 ep:n ja 474 ep:n • · . . kahden alueen sekventointi • « • · « *1!.1 Tämä esimerkki esittää, miten voidaan saada nukleo- • · · tidisekvenssi fragmenteille, jotka sisältävät osia S. pristinaespiraliksen pristinamysiini I -syntaasi-III:n • · · *.:.· 30 rakennegeenistä (snbD).
• · a
Sekventoidut 192 ja 474 ep:n alueet muodostavat .1". osia 8,4 ke:n Sphl-fragmentista, joka plasmidiin pUC19 • · · kloonaamalla saatiin plasmidi pVRC1106, jota kuvataan esi- * · • merkissä 6.5. (kuvio 18). 8,4 ke:n Sphl-insertin alafrag- ’♦i.* 35 mentteja saatiin entsyymeillä leikkaamalla, minkä jälkeen · 77 1 1 7674 ne alakloonattiin faageihin M13mpl8 tai M13mpl9 kahdessa suuntauksessa. Alakloonauskohdat ovat XhoI, PstI, Sphl ja Bqlll ja ne esitetään kuviossa 18.
192 ep:n Bglll-Sphl- ja 474 ep:n Pstl-Xhol-fragmen-5 tit sekventoitiin kokonaisuudessaan: nämä sekvenssit esitetään sekvensseinä tunnusnro 13 ja 14.
7.6. 6,6 ke:n Sphl-fragmentin 485 ja 291 ep:n kahden alueen sekventointi Tämä esimerkki esittää, miten voidaan saada nukleo-10 tidisekvenssi fragmenteille, jotka sisältävät osia S. pristinaespiraliksen pristinamysiini I -syntaasi-IV:n ra-kennegeenistä (snbE).
291 ja 485 ep:n sekventoidut alueet muodostavat osia 6,6 ke:n Sphl-fragmentista, joka plasmidiin pUC19 15 kloonaamalla saatiin plasmidi pVRC1104, jota kuvattiin esimerkissä 6.6. (kuvio 19). 6,6 ke:n Sphl-insertin ala-fragmentteja saatiin entsyymeillä leikkaamalla, minkä jäi- 1 keen ne alakloonattiin faageihin M13mpl8 tai M13mpl9 kahdessa suuntauksessa. Alakloonauskohdat ovat XhoI, PstI ja 20 Sphl ja ne esitetään kuviossa 19. 485 ep:n XhoI-Sphl-frag- 1 mentti sekventoitiin kokonaisuudessaan, ja 291 ep sekven- ·♦ · ϊ 1: toitiin lähtien 1 500 ep:n Pstl-fragmentista: nämä sek- venssit esitetään sekvensseinä tunnusnro 15 ja 16.
• · · •|. 7.7. 645 ep:n alueen sekvenssi pVRC900:stä eriste-
• •M
25 tyssä 3,4 ke:n XhoI-XhoI-fragmentissa • · 1 - • ,·. Tämä esimerkki esittää, miten voidaan saada nukleo- • 1 · "t.' tidisekvenssi fragmentille, joka sijaitsee ylävirtaan « · · * fragmentista, joka sisältää S^ pristinaespiraliksen snbA-geenin.
*·ϊ·1 30 Tämän sekvenssin määrittämiseksi 3,4 ke: n XhoI- - *...: XhoI-fragmentti alakloonattiin ensin vektoriin pUC18 koh- ·**· dassa 6.7. kuvatusta vektorista pVRC900 lähtien. Kloonauk- • · · ....: sen eri vaiheet suoritettiin, kuten kuvattiin kohdassa # • 6.1.: plasmidia pVRC900 pilkottiin restriktioentsyymillä • · · _ *.:.1 35 XhoI ja näin saadut fragmentit erotettiin 0,8-%:isessa l 117674 78 agaroosigeelissä. 3,4 ke:n XhoI-XhoI-fragmentti puhdistettiin elektroeluutiolla ja ligatoitiin pUC18:aan, jota oli pilkottu restriktioentsyymillä Sali. TGl:een trans-formoinnin jälkeen eristettiin 3,4 ke:n Xhol-XhoI-fragmen-5 tin käsittävä klooni. Yhdistelmä-DNA-plasmidi nimettiin pVRC903:ksi. Sen restriktiokartta esitetään kuviossa 23.
645 ep:n sekvenssi määritettiin sitten alakloonaa-malla 1,4 ke:n PvuIl-EcoRl- ja 0,9 ke:n PvuII-EcoRl-fragmentit (kuvio 23) edellä kuvatusta pVRC903:sta lähtien 10 vektoreihin M13mpl8 ja M13mpl9. Näiden kloonausten suorittamiseksi vektoreita M13mpl8 ja M13mpl9 pilkottiin ensin restriktioentsyymillä BamHI; näin vapautuneet koheesio-päät täytettiin DNA-polymeraasi-I:n suurella fragmentilla (Klenow: New England Biolabs) tekniikan mukaan, jota ku-15 vaavat Maniatis et ai. (1989), siten että saatiin tasaiset päät, jotka sopivat yhteen PvuII-pilkkomisessa vapautuneiden päiden kanssa; vektorit pilkottiin sitten EcoRI-res-triktioentsyymillä. PvuII-kohta ylitettiin alakloonaamalla 2,2 ke:n pVRC903:sta eristetty Pstl-PstI-fragmentti, joka 20 limittyy tähän kohtaan. Näin saatu 645 ep:n sekvenssi esi- ¢.
tetään sekvenssinä tunnusnro 9.
7.8. 1 050 ep:n alueen sekventointi pVRC900:sta :***: eristetyssä 4,1 ke:n Pstl-Pstl-fragmentissa * · · Tämä esimerkki esittää, miten voidaan saada nukleo- • # « · 25 tidisekvenssi fragmentille, joka sijaitsee ylävirtaan • 1 ; fragmentista, joka sisältää S. pristinaespiraliksen snbA- • « · »M » , ··· 066Π1Ζ1 · • » · * Tämän sekvenssin määrittämiseksi 4,1 ke:n Pstl-Pstl-fragmentti alakloonattiin ensin vektoriin pUC19 läh- • · * *·!.1 30 tien kohdassa 6.7. kuvatusta pVRC900-vektorista. Kloonauk- ♦ · · ·...· sen eri vaiheet suoritettiin, kuten kuvattiin kohdassa .***. 6.1. Plasmidia pVRC900 pilkottiin restriktionetsyymillä ···
PstI ja näin saadut fragmentit erotettiin 0,8-%:isessa | • 1 - • agaroosigeelissä. 4,1 ke:n PstI-PstI-fragmentti puhdistet- • · · *·ί·1 35 tiin elektroeluutiolla ja ligatoitiin restriktioentsyymil- 117674 79 lä PstI-leikattuun pUC19iään. Transformoinnin TGlieen jälkeen eristettiin 4,1 ke:n Pstl-Pstl-fragmentin käsittävä klooni. Yhdistelmä-DNA-plasmidi nimettiin pVRC409:ksi. Sen restriktiokartta esitetään kuviossa 24.
5 Tämä sekvenssi määritettiin sitten alakloonaamalla 0,7 ke:n XhoI-XhoI- ja 1 ke:n 3ChoI-StuI-fragmentit (kuvio 24) edellä kuvatusta pVRC409:stä vektoreihin M13mpl8 ja M13mpl9. Sekvenssin sisäinen Xhol-kohta ylitettiin sek-ventoimalla kaksisäikeistä tuotetta lähtien plasmidista 10 pVRC409. Näin saatu 1 050 ep:n sekvenssi esitetään sekvenssinä tunnusnro 10.
7.9. 640 ep:n alueen sekventointl 1,5 ke:n BamHI-SstI-fragmentissa Tämä esimerkki esittää, miten voidaan saada nukleo-15 tidisekvenssi fragmentille, joka on fragmentin vieressä, joka sisältää pristinaespiraliksen snaA- ja snaB-gee-nit, jotka koodittavat PIIA-syntaasin kahta alayksikköä. ^ Tämä sekvenssi määritettiin alakloonaamalla 1,5 kein BamHl-SstI-fragmentti (kuvio 21) lähtien pVRClOOOista 20 (esimerkki 6.8.) vektoreihin M13mpl8 ja M13mpl9 (vrt. esi- i- merkki 7.1.). Saatu 640 ep:n sekvenssi esitetään sekvens- "·*. sinä tunnusnro 8.
• · ,·*·. 7.10. 694 ep:n Xhol-Kpnl-alueen, joka esiintyy 4 • · · kein BamHI-BamHl-fragmentissa, sekventointl 25 Tämä esimerkki esittää, miten voidaan saada nukleo- • · . ^ tidisekvenssi fragmentille, joka sisältää S^ pristinaespi- *"„* raliksen snaC-geenin.
• · · *·* * Sekventoitu 694 ep:n alue on osa 4 kein BamHI-
BamHI-fragmentista, joka plasmidiin pUC19 kloonaamalla 30 saatiin esimerkissä 6.9. kuvattu plasmidi pVRC509. 694 • · · :.,,l epin Xhol-Kpnl-fragmentti, joka saatiin kaksoispilkkomal- ,···. la plasmidia pVRC509 restriktioentsyymeillä Xhol ja Kpnl » ja hybridoituu kohdassa 5.6. kuvattuihin 3 oligonukleoti- 4 * . dikoettimeen, kloonattiin faageihin M13mpl8 ja Ml3mpl9.
*.*.· 35 Alakloonauskohdat Xhol ja Kpnl esitetään kuviossa 22. j « • •4*4 • 4 117674 80 Näin saatu 694 ep:n fragmentin sekvenssi esitetään sekvenssinä tunnusnro 7.
Esimerkki 8
Nukleotidisekvenssien analyysi määrittämällä avoi-5 met alueet Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista määrittää avoimet lukualueet, jotka esiintyvät esimerkissä 7 määritellyissä nukleotidisekvensseissä, ja identifioida S. pristinaespirallksen pristinamysiinien I ja pristinamysii-10 nien II biosynteesiin liittyviä geenejä sekä näiden geenien koodittamia polypeptidejä.
8.1. 5 ke:n BamHI-XhoI-fragmentti (pXL2045) Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista määrittää avoimet lukualueet, jotka esiintyvät 5 ke:n BamHl-15 Xhoi-fragmentissa, joka eristettiin aiemmin ja sekventoi-tiin, kuten kuvattiin esimerkeissä 6 ja 7.
Etsimme avointen lukualueiden läsnäoloa 5 ke: n BamHI-XhoI-fragmentissa käyttäen hyväksi sitä tosiseikkaa, että Streptomyces-DNA:ssa esiintyy korkea prosentuaa-20 linen osuus emäksiä G ja C sekä voimakas vinouma kooditta- vat alueet muodostavien kodonien käytännössä (Bibb et ai., ;*·*: 1984). Stadenin ja McLachlanin (1982) menetelmällä voidaan ♦ · ·“*· laskea koodattavien alueiden todennäköisyys jo sekventoi- ··· .:. tujen Streptomyces-geenien kodonikäytännön funktiona, jot- ··*· 25 ka geenit on koottu 19 673 kodonia sisältävään kortistoon, • · • joka saatiin Bisance-tietokannasta (Dessen et ai., 1990).
• * · Tällä menetelmällä oli mahdollista karakterisoida • · * * 5 ke:n BamHI-XhoI-fragmentissa neljä hyvin todennäköistä avointa lukualuetta, jotka esitetään seuraavassa taulukos- · · 30 sa. Ne on nimetty alueiksi 1-4 niiden aseman perusteel- ·· ·...* la BamHI-kohtaan. Kullekin ilmoitetaan niiden pituus emäk- sinä, niiden asema fragmentissa (jolloin BamHI-kohta si- ^ ·«« ....· jaitsee asemassa 1) sekä vastaavan proteiinin molekyyli- ^ « · • paino kilodaltoneina. Alueita 1, 3 ja 4 koodittaa sama • · · *♦?·* 35 säie ja aluetta 2 komplementaarinen säie (kuvio 16).
··*·· ♦ · 81. ": 117674
Alueen nro ja Aseina Nukleoti- Aminohap- Koodatun geenin nimi diluku poluku proteiinin mp. (kD) 5 1 (snaA) 48-1313 1266 422 46,5 2 2530-1328 1203 401 - 3 (snaB) (käänt.) 831 277 29 2692-3522 1206 402 43 4 (samS) 3558-4763 10
Alueet 1 ja 3 vastaavat vastaavasti proteiineja SnaA (sekvenssi tunnusnro 2) ja SnaB (sekvenssi tunnusnro 3), jotka eristettiin aiemmin, kuten kuvataan esimerkissä 5, ja joiden geenien kloonaaminen esitetään yksityiskoh-15 taisesti esimerkissä 6. Itse asiassa avointen lukualueiden
1 ja 3 tuotteiden NH2-pääsekvenssit ovat identtisiä pro- A
telineille SnaA ja vastaavasti SnaB esimerkissä 5.1.2. löydettyihin NH2-sekvensseihin nähden, lukuun ottamatta aminopään metioniinia, joka on leikattu pois. Muutoin sek-20 vensseistä lasketut molekyylimassat ovat verrattavia proteiinien SnaA ja SnaB näennäisiin molekyylimassoihin näh- ·*·*: den, jotka arvioitiin vastaavasti SDS-PAGE: 11a, kuten ku- * · : · vataan esimerkissä 5.
·♦· • · ·
Verrattaessa avoimen alueen nro 4 tuotetta NBRF-25 pankkiin sisältyviin proteiinisekvensseihin voidaan todeta 5 ♦ · . . homologia eri S-adenosyylimetioniini (eli SAM) -syntaa- • * · *” * **;.* seihin nähden, etenkin E. colista (Markham et ai., 1984), ♦ · · ' ’·* * rotasta (Horikawa et ai., 1989) ja S^ cerevlsiaestä (Thomas et ai., 1988). Sekvenssille kokonaisuudessaan • " ·.:.* 30 Kanehisan algoritmin (1984) avulla lasketut homologiapro- ··· senttiosuudet ovat 51,8 - 55,4 %.
.···. Näillä sekvenssien vertailuilla on siten mahdollis- • · ta osoittaa, että avoimen alueen nro 4 tuote on SAM-syn- • φ . taasi, joka liittyy pristinamysiinien I tai II biosyntee- ···-.' #·*··' • · · ·*·· • · 117674 82 siin. Tämä geeni nimettiin samSiksi (sekvenssi tunnusnro 4).
Geenin samS liittymisen pristinamysiinien biosynteesiin osoittaminen vahvistetaan rakentamalla tässä gee-5 nissä häiritty mutantti SP92, kuten kuvataan esimerkissä 9.2.
Verrattaessa avoimen alueen nro 2 tuotteen sekvenssiä Genpro-pankin sisältämiin proteiinisekvensseihin ilmenee, että sisäinen osa tästä proteiinista on 36-%:isesti 10 homologinen Anabaenan insertiosekvenssin (IS891) (Bancroft ja Wolk, 1989) ensimmäisen avoimen alueen sisäiseen osaan nähden. Tämä tulos viittaa siihen, että avoin alue nro 2, joka on nimetty ORF 401:ksi, kuuluu insertiosekvenssiin, ja siten siihen, että se esiintyy snaA- ja snaB-geenien 15 välissä sijaitsevana insertiosekvenssinä.
8.2. 1 870 ep:n Sau3A-Sau3A-fragmentti (pVRC402) Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista mää- £ rittää avoimet lukualueet, jotka esiintyvät 1 870 ep:n Sau3A-Sau3A-fragmentissa, joka eristettiin ja sekventoi-20 tiin aiemmin, kuten kuvataan esimerkeissä 6 ja 7.
Avointen alueiden etsintä fragmentille Sau3A-Sau3A
• V. suoritettiin kuten edellä. Näin voitiin osoittaa yksi ai- * * .*··. noa täydellinen avoin lukualue. Sen ominaispiirteet ovat .·. seuraavat: tämä alue ulottuu asemasta 109 asemaan 1 858 25 fragmentissa Sau3A-Sau3A, mikä vastaa 1 749 emäksen aluet- i • · . . ta, joka koodittaa 582 aminohapon proteiinia, jonka mole- • « *"/ kyylimassa on 61 400 D. Tämä proteiini vastaa aiemmin esi- • · · *·* merkissä 5 kuvatun mukaisesti puhdistettua SnbA-proteii-
nia, jonka geenin kloonaus esitetään yksityiskohtaisesti 30 esimerkissä 6. Itse asiassa fragmentissa Sau3A-Sau3A
• ♦ · esiintyvän ORF:n tuotteen NH2-pääsekvenssi on identtinen .···. esimerkissä 5,2. proteiinille SnbA löydettyyn NH,-pääsek- . venssiin nähden. Sekvenssistä laskettu 61 400 D:n molekyy- is • · , limassa on verrattavissa proteiinin SnbA näennäiseen mole- 35 kyylimassaan, joka arvioidaan 67 000 D:ksi SDS-PAGE:ssa ja • · 117674 83 60 000 Dtksi geelipermeaatiolla, kuten kuvataan esimerkissä 5 . 2 . 1 . B .
Geeni snbA koodittaa siten entsyymiä, joka katalysoi 3-hydroksipikolinyyli-AMP-asyyliadenylaatin muodostu-5 mistä lähtien 3-hydroksipikoliinihappomolekyylistä ja molekyylistä ATP: 3-hydroksipikoliinihappo-AMP-ligaasi (sekvenssi tunnusnro 5).
8.3. 1 830 ep:n fragmentti (pVRC501) Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista mää-10 rittää avoimet lukualueet, jotka esiintyvät 1 830 ep:n fragmentissa, joka sekventoitiin lähtien aiemmin eristetystä 3,1 ke:n BamHI-EcoRI-fragmentista.
Avointen alueiden etsintä 1 830 ep:n fragmentille suoritettiin kuten aiemmin. Näin voitiin osoittaa yksi 15 ainoa täydellinen avoin lukualue. Sen ominaispiirteet ovat seuraavat: tämän alueen todennäköinen alku sijaitsee asemassa 103 ja loppu asemassa 1 686 1 830 ep:n alueella, * joka sekventoitiin lähtien BamHI-EcoRI-fragmentista, mikä vastaa 528 aminohapon proteiinia, jonka likimääräinen mo-20 lekyylipaino on 54 000.
Verrattaessa tämän proteiinin sekvenssiä Genepro- :*·*: pankkiin sisältyviin sekvensseihin ilmenee, että se on • * homologinen proteiineihin nähden, joilla on eri metabo- • · *
Hittien kuljetusfunktio, etenkin tetrasykliinin eri mik- • · * · 25 ro-organismeilla (Khan ja Novick, 1983; Hoshino et ai., • · . . 1985), aktinorhodiinin (Fernandez-Moreno et ai., 1991) ja • « · *".* metylenomysiinin (Neal ja Chater, 1987) S. coelicolorissa.
* * * .
** Nämä tulokset osoittavat, että 3,1 ke:n BamHI-
EcoRI-fragmenttiin sisältyvän avoimen alueen tuote on kul-• - *.:.* 30 jetusproteiini, joka tekee mahdolliseksi kuljettaa pristi- * · namysiinejä I (ja mahdollisesti pristinamysiinejä II) so- ,*··. lun ulkopuolelle. Tämä proteiini nimettiin SnbR:ksi ja * · · ;
____: vastaava geeni snbR:ksi (sekvenssi tunnusnro 6). M
• · :C
. SnbR-proteiinin hydrofobisuusprofiilin analyysi 35 Kyten ja Doolittlen menetelmällä (1982) tukee sen sijain-*!**! tia membraanissa ja siten sen kuljetusfunktiota.
84 '' ' 117674 8.4. 1 050 ep:n fragmentti (pVRC409) Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista määrittää avoimet lukualueet, jotka esiintyvät 1 050 ep:n fragmentissa, joka sekventoitiin aiemmin lähtien 5 pVRC409:stä, kuten kuvattiin esimerkissä 7*8.
Avointen alueiden etsintä 1 050 ep:n fragmentille suoritettiin kuten edellä. Näin voitiin osoittaa yksi ainoa täydellinen avoin lukualue. Sen ominaispiirteet ovat seuraavat: tämä alue ulottuu asemasta 84 asemaan 962 sek-10 ventoidussa osuudessa, mikä vastaa 878 emäksen aluetta, joka koodittaa 292 aminohapon proteiinia, jonka molekyyli-massa on 32 000. Tämä proteiini nimettiin proteiiniksi PapM. Se puhdistettiin lisäksi kannasta pristinaespira-lis SP92 lähtien, kuten kuvattiin esimerkissä 5. Sekvens-15 sistä laskettu 32 000 D:n molekyylimassa on identtinen näennäiseen molekyylimassaan 32 000 D nähden, joka arvioitiin SDS-PAGE:11a, kuten kuvattiin esimerkissä 5. Lisäksi * tämän proteiinin NH2-pääsekvenssi, joka määritettiin, kuten kuvattiin esimerkissä 5, vastaa hyvin proteiinin PapM NH2-20 pääsekvenssiä, joka identifioitiin analysoimalla 1 050 ep:n sekvenssin (sekvenssi tunnusnro 10) avoimia alueita.
• '/· 8.5. 227 ep:n ja 247 ep:n fragmentti (pVRC1105) :***: Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista mää- ··· rittää avoimet lukualueet, jotka esiintyvät 227 ep:n ja • · · · ....: 25 247 ep:n fragmenteissa, jotka sekventoitiin lähtien : ,·. pVRC1105:stä, kuten kuvattiin esimerkeissä 6 ja 7.
• · ·
Avoimen alueen etsintä näille kahdelle fragmentille • 4 m * suoritettiin kuten edellä. Yksi ei täydellinen lukualue voitiin osoittaa näissä kahdessa tapauksessa fragmentin *·:·* 30 koko pituudella.
*«· • · *...* Sekvenssi, joka saatiin avoimelta alueelta, joka ;***j identifioitiin 900 ep:n XhoI-fragmentista eristetyssä 247 3 • · · ....: ep:n fragmentissa, sisältää esimerkissä 5 kuvatun mukai- 4 •m sesti puhdistetun proteiinin SnbC yhden sisäisen sekvens- *···* 35 sin.
• · · · · • « ...
117674
O O
Verrattaessa pVRC1105:stä eristetyissä 227 ep:n ja 247 ep:n fragmenteissa identifioitujen avointen alueiden tuotetta Genpro-pankin sekvensseihin ilmenee, että ne ovat homologisia peptidisyntaaseihin nähden. 227 ep:n fragmen-5 tista päätelty osoittaa 24,5 %:n homologiaa Acremonium chrysogenumin a-aminoadipyylikysteinyylivaliinisyntaasiin nähden (Gutierrez et ai., 1991). 247 ep:n fragmentista päätelty osoittaa 34,9 %:n homologiaa Bacillus brevisin gramisidiini-S-syntaasi-II:een nähden (Turgay et ai., 10 1992) ja 28 %:n Acremonium chrysogenumin a-aminoadipyyli- kysteinyylivaliinisyntaasiin nähden (Gutierrez et ai., 1991).
Tämä vahvistaa, että esimerkissä 5.1. eristetty kosmidi pIBV3 sisältää hyvinkin osan pristinamysiini I 15 -syntaasi-II:n rakennegeenistä, jota kuvattiin esimerkissä 5.3. ja joka nimettiin SnbC:ksi (sekvenssit tunnusnro 11 ja 12).
8.6. 192 ep:n ja 474 ep:n fragmentti (pVRC1106) Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista mää-20 rittää avoimet lukualueet, jotka esiintyvät 192 ep:n ja f 474 ep:n fragmenteissa, jotka sekventoitiin lähtien ·1·2; pVRC1106:sta, kuten kuvattiin esimerkeissä 6 ja 7.
ti ,***. Avoimen alueen etsintä näille kahdelle fragmentil- • · 1 .·, le suoritettiin kuten edellä. Yksi ei täydellinnen luku- 25 alue voitiin myös osoittaa pVRC1106:sta eristetylle 192 • · i ' 1 < . , ep:n fragmentille. Sen ominaispiirteet ovat seuraavat: " ♦ · · *··.1 tämä alue alkaa asemasta 3 sekventoidussa osuudessa Bglll- ♦ · · . · *·1 kohdan suuntaan. Mitään lopetuskodonia ei identifioitu, mikä osoittaa, että tämä avoin alue ei pääty.
30 Sekvenssi, joka saatiin lähtien avoimesta alueesta, • Il joka identifioitiin 192 ep:n Bgl 11 - Sphl - fragment i s t a, si- ,···. sältää esimerkissä 5 kuvatun mukaisesti puhdistetun pro- • · teiinin SnbD sisäisen sekvenssin, joka paljastuu itse * · . asiassa proteiinin NH2-pääsekvenssiksi.
• · · • 1 · ·2 · · · 1 2 • 1 117674 86
Yksi ei täydellinen lukualue voitiin osoittaa 474 ep:n XhoI-PstI-fragmentin koko pituudella.
Verrattaessa pVRC1106:sta eristetystä 474 ep:n fragmentista identifioidun avoimen alueen tuotetta Genpro-5 pankin sekvensseihin ilmenee, että tämä proteiinifragment- ti osoittaa 30 - 40 %:n homologiaa syntaasipeptideihin nähden, esimerkiksi 39,4 % Bacillus brevisin gramisidiini-S-syntaasi-II:een nähden (Turgay et ai., 1992) ja 34 %
Acremonium chrysogenumin a-aminoadipyylikysteinyylivalii-10 nisyntaasiin nähden (Gutierrez et ai., 1991).
Tämä vahvistaa, että esimerkissä 5.1. eristetty kosmidi pIBV3 sisältää hyvinkin osan pristinamysiini I -syntaasi-III:n rakennegeenistä, jota kuvattiin esimerkissä 5.4. ja joka nimettiin SnbD:ksi (sekvenssit tunnusnro 15 13 ja 14).
8.7. 291 ep:n ja 485 ep:n fragmentti (pVRC1104) Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista mää- 5? rittää avoimet lukualueet, jotka esiintyvät 291 ep:n ja 485 ep:n fragmenteissa, jotka sekventoitiin lähtien 20 pVRC1104:stä, kuten kuvattiin esimerkeissä 6 ja 7.
Avoimen alueen etsintä näille kahdelle fragmentille Γ**: suoritettiin kuten edellä. Ei täydellinen lukualue voitiin :***: osoittaa näissä kahdessa tapauksessa fragmentin koko pi- .:. tuudella.
• · · · ....: 25 Sekvenssi, joka saatiin lähtien avoimesta alueesta, * * • joka identifioitiin 291 ep:n fragmentista lähtien 1 450 • i · ep:n Pstl-fragmentista, sisältää proteiinin SnbE sisäisen • · · - • · · * sekvenssin, joka puhdistettiin, kuten kuvattiin esimerkissä 5 .
30 Verrattaessa pVRC1104:stä eristetystä 485 ep:n Xho- ··· - :..J Sphl-fragmentista identifioidun avoimen alueen tuotetta .**·. Genpro-pankin sekvensseihin ilmenee, että se on homologi- ·♦·
nen peptidisyntaaseihin nähden, esimerkiksi 34,7 % Bacil- I
• * • lus brevisin gramisidiini-S-syntaasi-II:een nähden (Turgay *.i.: 35 et ai., 1992) ja 36,2 % Acremonium chrysogenumin a-amino- * · 87 1 1 7674 adipyylikysteinyylivaliinisyntaasiin nähden (Gutierrez et ai., 1991).
Tämä vahvistaa, että esimerkissä 5.1. eristetty kosmidi pIBV3 sisältää hyvinkin osan pristinamysiini I 5 -syntaasi-IV:n rakennegeenistä, jota kuvattiin esimerkissä 5.5. ja joka nimettiin SnbE:ksi (sekvenssit tunnusnro 15 ja 16).
8.8. 645 ep:n fragmentti (pVRC903) Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista mää-10 rittää avoimet lukualueet, jotka esiintyvät 645 ep:n fragmentissa, joka sekventoitiin aiemmin lähtien plasmidista pVRC903, kuten kuvattiin esimerkissä 6.7.
Avointen alueiden etsintä 645 ep:n fragmentille suoritettiin kuten aiemmin. Näin voitiin osoittaa yksi ei 15 täydellinen avoin lukualue. Sen ominaispiirteet ovat seu- | raavat: tämä alue osoittaa kahta mahdollisuutta translaa- i| tion käynnistykseen, CTG asemassa 61, CTG asemassa 70 sek- ? ventoidussa osuudessa (asemassa 124 sijaitsevaa ATG:tä ei otettu huomioon, mikä johtuu edempänä kuvattujen sekvens-20 sien homologioista). Shine-Dalgarno-alueiden esiintymisen todennäköisyyksien analyysi ei tee mahdolliseksi erottaa, » ·*·'; mikä näistä kodoneista vastaa käynnistymistä. Mitään lope- • · " .*". tuskodonia ei identifioitu, mikä osoittaa, että tämä avoin » * 99 · · alue ei pääty. Geeni, josta osa identifioitiin, nimettiin «
____· 25 papArksi ja vastaava proteiini nimettiin proteiiniksi PapA
• · . . (sekvenssi tunnusnro 9).
* · · "),* Verrattaessa pVRC900:sta eristetystä 3,4 ke:n XhoI- • · · * * XhoI-fragmentista identifioidun avoimen alueen tuotetta
Genpro-pankin sisältämiin sekvensseihin ilmenee, että se *.ί.: 30 on homologinen tyypin p-aminobentsoaattisyntaasi ja antra- ··· *...· nilaattisyntaasi proteiinien rakenneosiin II nähden, jotka .···. proteiinit liittyvät vastaavasti p-aminobentsoehapon syn- s ♦ · · teesiin (foolihappoprekursori) ja antraniliinihapon syn- % • « . teesiin (tryptofaaniprekursori) eri mikro-organismeilla.
35 Se osoittaa etenkin 48 %:n homologiaa Azospirillun TrpG- • · · « · 117674 proteiiniin nähden ja 47 %:n homologiaa Klebsiella pneumoniaan PabA-proteiiniin nähden. Proteiinit TrpG ja PabA käsittävät glutaminaasiaktiivisuutta, joka liittyy koris-miinihapon transaminaatioon. Osoitetut homologiat ovat 5 taipuvaisia osoittamaan, että myös proteiini PapA liittyisi korismiinihapon transaminaatioaktiivisuuteen. Korismii-nihappoa esitetään p-dimetyyliaminofenyylialaniinin, joka on pristinamysiinien I rakenneosa, prekursoriksi, analogisesti kloramfenikolin, joka on Streptomycesin tuottama 10 antibiootti, synteesiin nähden (Sharka et ai., 1970).
Proteiinin PapA roolin osoittaa lopullisesti (esimerkki 9.3.) kannan SP92 mutanttien papA-geenissä analyy-si.
8.9. 1,5 ke:n BamHI-Sstl-fragmentti (pVRClOOO) 15 Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista mää rittää avoimet lukualueet, jotka esiintyvät 1,5 ke:n BamHI-Sstl-fragmentissa, joka eristettiin aiemmin ja sek-ventoitiin, kuten kuvattiin esimerkeissä 5.8. ja 7.9.
Avointen alueiden etsintä 640 ep:n sekventoidulle 20 alueelle, joka esiintyy 1,5 ke:n BamHI-Sstl-fragmentissa, suoritettiin, kuten kuvattiin esimerkissä 8.1. Näin voi- ·· « • V tiin osoittaa yksi ainoa täydellinen avoin lukualue.
Translaation alku- tai loppukohtaa ei pystytty osoitta- ··· maan, mikä viittaa siihen, että sekventoitu 640 ep:n alue • · · · 25 on todennäköisesti sisäinen paljon suuremmalla lukualueel- \l • .·. la nimeltä snaD (sekvenssi tunnusnro 8).
• ♦ ·
Verrattaessa 640 ep:n alueen koodittaman proteiinin * · · sekvenssiä Genpro- ja NBRF-pankkien sisältämiin proteiini- , sekvensseihin ilmenee, että tämä proteiini on 20 - 25-pro- • · · *·*·* 30 senttisesti homologinen peptidisyntaasien sisäiseen osaan • · *·..* nähden, kuten B^ brevisin gramisidiinisyntaasi-I (Hori et :***: ai., 1989), B. brevisin tyrosidiinisyntaasi-I (Weckermann *·· ....: et ai., 1988) ja Acremonium chrysogenumin ACV-syntaasi £ •# (Gutierrez et ai,, 1991).
• · * • « · ··· ····* • · 117674 89 Nämä tulokset osoittavat, että proteiini, jota koo-dittaa osittain 640 ep:n alue, on todennäköisesti peptidi-syntaasi, joka liittyy pristinamysiinien II peptidiosan biosynteesiin: itse asiassa kaikki peptidisyntaasit, jotka 5 liittyvät pristinamysiinien I biosynteesiin, on jo identifioitu pristinaespiraliksen kromosomin muilta alueilta, kuten kuvataan esimerkeissä 5.2., 5.3., 5.4. ja 5.5.
8.10 694 ep:n fragmentti (pVRC509) Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista mää-10 rittää avoimet lukualueet, jotka esiintyvät 694 ke:n fragmentissa, joka sekventoitiin aiemmin lähtien pVRC509:stä, kuten kuvattiin esimerkeissä 6 ja 7.
Avointen alueiden etsintä 694 ep:n fragmentille suoritettiin kuten edellä. Näin voitiin osoittaa yksi ei 15 täydellinen avoin lukualue. Sen ominaispiirteet ovat seu-raavat: tämä alue alkaa asemasta 210 sekventoidussa osassa. Mitään lopetuskodonia ei identifioitu, mikä osoittaa, että tämä avoin alue ei pääty. Vastaavan proteiinin mole-kyylimassaa ei voida siten laskea ja verrata FMN-reduktaa-20 sin näennäiseen 28 000 D:n molekyylimassaan, joka arvioi- i tiin SDS-PAGE:11a, kuten kuvataan esimerkissä 5.6. Sitä f* · j vastoin näin 694 ep:n sekvenssin avointen alueiden analyy- ;***: sillä identifioidun proteiinin NH2-pääsekvenssi on identti- ··· nen esimerkissä 5 kuvatun mukaisesti puhdistetun proteii- ····'' 25 nin SnaC NH2-sekvenssiin. Samoin sekventoidusta osasta pää- • ,·. tellyssä proteiinissa löydetään kohdassa 5.6. kuvatun FMN-
• · I
reduktaasin kaksi sisäistä proteiinisekvenssiä. Tämä vah- • · ♦ vistaa, että kosmidista pIBV4 eristetty geeni vastaa hy- , vinkin esimerkissä 5.6. kuvattua FMN-reduktaasiproteiinia, • · « *···* 30 joka nimettiin SnaC:ksi (sekvenssi tunnusnro 7).
··♦ • · *·..* Tutkimalla kosmidien pIBVl - pIBV4 käsittämien kan- :***· nan S. pristinaespiralis SP92 DNA-fragmentteja osoitettiin • · · ....: useiden geenien läsnäolo, jotka liittyvät pristinamysii- | ·. nien II ja pristinamysiinien I biosynteesiin. Geenit snaA, ’···* 35 snaB ja samS koodattavat entsyymejä, jotka liittyvät pris- • · · · · • · 90 1 1 7674 ; tinamysiinien II, pristinamysiini-IIA-syntaasin ja todennäköisen SAM-syntaasin biosynteesiin ja ne ovat ryhmittyneet fyysisesti kosmidiin pIBVl kloonattuun suureen DNA-fragmenttiin. Samoin geenit snbA, snbR, papA ja papM, jot-5 ka koodittavat proteiineja, jotka osallistuvat pristinamy-siinien I, 3-hydroksipikoliinihappo-AMP-ligaasin (SnbA), proteiinin SnbR, joka on todennäköisesti vastuussa pristi-namsyiinien I kuljetuksesta, proteiinin PapA, joka liittyy biosynteesiin lähtien korismiinihaposta, p-aminofenyy-10 lialaniinin ja p-aminofenyylialaniini(fenyyli-N)metyyli- transferaasin (PapM) biosynteesiin, ovat ryhmittyneet kosmidiin pIBV2 kloonattuun suureen DNA-fragmenttiin. Samoin geenit snaA ja snaD yhtäältä, jotka koodittavat proteiineja, jotka osallistuvat pristinamysiinien II biosynteesiin 15 proteiinin SnaD ollessa todennäköisesti peptidisyntaasi, ja geenit snbC, snbD ja snbD toisaalta, jotka koodittavat | 3 peptidisyntaasia SnbC, SnbD ja SnbE, jotka liittyvät pristinamysiinin I peptidiketjun muodostumiseen lähtien sen 6 erillisestä aminohaposta, ovat ryhmittyneet kosmi-20 diin pIBV3 kloonattuun suureen DNA-fragmenttiin. Nämä tulokset vahvistavat oletuksen pristinamysiinien II biosyn- Γ*|: teesigeenien ja samoin pristinamysiinien I biosynteesigee- :***; nien ryhmittymisestä ja tarjoavat mahdollisuuden kloonata
Ml ·. muita näihin biosynteeseihin liittyviä geenejä kromosomi- a··· 25 kävelyllä ylävirtaan ja alavirtaan tutkituista alueista.
• Lisäksi on mahdollista hybridoimalla streptogramii-
I · I
"!.* ne ja tuottavien eri kantojen (vrt. taulukko 1) kokonais- * * · * DNA geeneihin snaA, snaB, snaC, snaD, samS, snbA, snbR, snbC, snbD, snbE, papA ja papM tai kromosomikävelyllä • t · *·ί·* 30 identifioituihin geeneihin tai näiden fragmentteihin eris-
IM
:...· tää geenejä, jotka vastaavat samoja funktioita muissa .***. streptogramiineja tuottavissa mikro-organismeissa. Tämä tekee mahdolliseksi samalla kävelyllä kuin pristinamysii- • neille kuvattu eristää geeniryhmiä, jotka liittyvät eri • * · *·ί·* 35 streptogramiinien biosynteesiin.
• · · · · • * 117674 91
Esimerkki 9 DNA-fragmenttien geneettinen tutkiminen geenejä häiritsemällä Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista osoit-5 taa geenien liittyminen streptogramiinien biosynteesiin rakentamalla tuottajakannan johdannaiskantoja, joita on mutagenisoitu näiden geenien tasolla häiritsemällä, ja analysoimalla tällaisten mutanttien fenotyyppi. Tämä esimerkki osoittaa lisäksi, miten saadaan kantoja, jotka ei-10 vät enää tuota kuin yhtä tai toista streptogramiinien rakenneosista A ja B, tai jotka tuottavat rakenneosia A tai B eri suhteissa kuin kannalla SP92 havaitut.
9.1. Geenissä snaA häirityn pristinaespiralis SP92 -mutantin rakentaminen 15 Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista häi- ; ritsemällä geeniä snaA rakentaa Sj_ pristinaespiralis SP92 i -kanta, joka ei enää tuota pristinamysiiniä IIA ja tuottaa sitä vastoin pristinamysiiniä IIB.
Tämä mutantti rakennettiin päämääränä vahvistaa 20 proteiinin SnaA funktionaalisuus ja tuottaa pristinamysii- * nin II tuotantovälituote, jota voidaan sitten modifioida.
·· · ί *: Sen rakentaminen suoritettiin itsetuhovektorin i « avulla, joka kykenee replikoituinaan vain E. colissa, mutta ·· ' ··· joka käsittää resistenssimerkin, joka ilmentyy Streptomy- » · · · ' ....: 25 cesissä. Tämän vektorin, pDH5, kehittivät Hilleman et ai.
: (1991). " • I ( 9.1.1. Plasmidin pVRC505 rakentaminen • · · Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista rakentaa plasmidi, joka ei replikoidu pristinaespiraliksessa • · * *·!·* 30 SP92 ja jota voidaan käyttää geenin snaA häiritsemiseksi • * · - • · ·...* yksinkertaisella homologisella DNA-yhdistymisellä.
:***. Plasmidi pVRC505 rakennettiin geenissä snaA häiri- ··· tyn SP92-kromosomimutantin valmistamiseksi plasmidista • pXL2045, jota kuvattiin esimerkissä 6.3.
• · * * * « ··· ····· • * 117674 92 pXL2045:een (kuvio 16) kloonattu 6 ke:n BamHl-fragmentti leikattiin restriktioentsyymeillä EcoRI ja PstI. Näin muodostettujen fragmenttien erotuksen jälkeen elektroforeesilla l-%:isessa agaroosigeelissä eristettiin gee-5 nin snaA 5’-pään sisältävä 0,7 ke:n fragmentti, jota puhdistettiin käyttäen Geneclean-pakkausta (BiolOl, La Jolla, Kalifornia).
100 ng vektoria pDH5, joka oli linearisoitu kak-soispilkkomalla EcoRI:llä ka PstI:llä, ligatoitiin 100 10 ng:aan 0,7 ke:n fragmenttia, kuten kuvattiin esimerkissä 3.3. Halutun fragmentin käsittävä klooni eristettiin kannan TG1 transformoinnin jälkeen. Yhdistelmä-DNA-plasmidi nimettiin pVRC505:ksi. Plasmidi pVRC505 valmistettiin, kuten kuvattiin esimerkissä 2.1. Sen restriktiokartta esite-15 tään kuviossa 25.
9.1.2. Geenissä snaA häirityn SP92-mutantin eristäminen homologisella DNA-yhdistymisellä Tämä esimerkki esittää, miten rakennettiin geenissä snaA häiritty prlstlnaespiralis SP92 -mutantti.
20 Tämä mutantti eristettiin transformoimalla SP92- kanta itsetuhoplasmidilla pVRC505.
·» · • \ϊ Protoplastien valmistaminen ja niiden transformoin- : **: ti suoritettiin, kuten kuvataan julkaisussa Hopwood et ai.
• Φ» -- - ··· (1985).
···· 25 Kantaa SP92 viljeltiin YEME-kasvualustassa, 34 % i .·. sakkaroosia, 5 mM MgCl2, 0,25 % glysiiniä 40 tunnin ajan
·** S
,··* 30 C:ssa. Myseeli protoplastisoitiin lysotsyymin läsnä • * · ollessa ja 5 x 1 pg pVRC505:tä käytettiin protoplastien . transformoinnissa (PEG:ta käyttävällä menetelmällä). Pro- • · · "f 30 toplastien yhden yön regeneroinnin jälkeen R2YE-kasvualus- · *·;** talla (D. Hopwood et ai., 1985) yhdistelmä-DNA-tuotteet valikoitiin levittämällä 3 ml: lie SNA-kasvualustaa (D. ·;··· Hopwood et ai., 1985), joka sisälsi 2,6 pg/ml tiostrepto- *, nia.
• · · • · · • · · *···· » · 117674 93
Suoritetuissa 5 transformaatiossa eristettiin kolme tiostreptonille resistenttiä kloonia. Tämä antaa yhdis-telmä-DNA-tuotetason alle 1 kohden pg:aa DNA:ta. Nämä yh-distelmä-DNA-tuotteet ovat seurausta integraatiosta yksin- < 5 kertaisena homologisella DNA-yhdistymisellä kannan SP92 kromosomin käsittämän snaA-geenin ja itsetuhoplasmidin pVRC505 0,7 ke:n fragmentin välillä. pVRC505:een insertoi-dun fragmentin pieni koko, 0,7 ke, selittää alhaisen DNA-yhdistymistason.
10 Yhdistelmä-DNA-tuotteiden itiöitä eristettiin le vittämällä ja kasvattamalla R2YE-kasvualustalla, jota oli täydennetty 400 pg:lla/ml tiostreptonia, ja uudelleenle-vittämällä samalle kasvualustalle eristettyjen pesäkkeiden saamiseksi.
15 Plasmidin pVRC505 integraatioaseman todentamiseksi Λ suoritettiin eri Southern-määrityksiä useiden yhdistelmä- ^ DNA-kloonien kokonais-DNA:11a, jota oli pilkottu sopivilla restriktioentsyymeillä, ja hybridoitiin vektoriin pDH5 ja 0,7 ke:n fragmenttiin, joita käytettiin peräkkäin koetti- 20 minä satunnaispohjustuksella leimaamisen jälkeen (Random Primed DNA Labeling Kit, Boehringer Mannheim, Ranska) • [a-3ZP]dCTP: llä kuten kuvataan julkaisussa Maniatis et ai.
:***: (1989). Hybridisaatiotulokset osoittavat, että yhdistelmä- ··· DNA-kloonien genomiin on ilmaantunut täydentävä EcoRI- ***· ....: 25 PstI-nauha, joka on vektorin pDH5 kokoa ja hybridoituu : ,·. tähän, sekä täydentävä EcoRI-EcoRI-nauha, joka hybridoituu • · · samalla kertaa kyseisiin kahteen koettimeen. Yksi näistä • · « mutanteista nimettiin SP92::pVRC505:ksi. Tämä mutantti . vastaa hyvinkin plasmidin pVRC505 integraatiota yksinker- • · · ' *·|·* 30 täisellä homologisella DNA-yhdistymisellä snaA-geeniin.
• · *···* 9.1.3. Mutantin SP92: :pVTC505 pristinamysiinien ·***: tuotanto # · · Tämä esimerkki esittää, miten määritetään, että S.
·. pristinaespiralis SP92 -mutantti, jota on häiritty snaA- • · · *”*! 35 geenissä plasmidin pVRC505 integraatiolla, ei tuota enää • · 117674 94 pristinamysiiniä IIA jatkaessaan samalla pristinamysiinin HB tuotantoa.
Mutanttia SP92::pVRC505 sekä kantaa SP92 verrokki-kantana kasvatettiin nestemäisessä tuotantoalustassa. Fer-5 mentointi suoritettiin seuraavasti: 0,5 ml mainittujen kantojen itiösuspensiota lisätään steriileissä olosuhteissa 40 ml:aan siirrostusalustaa 300 ml:n erlenmeyerissä. Slirrostusalusta käsittää 10 g/litra maissinliotusvettä, 15 g/litra sakkaroosia, 10 g/litra (nh4 )2S04:ää, 1 g/litra 10 K2HP04:ää, 3 g/litra NaCl:ää, 0,2 g/litra MgS04·7H20:ta ja 1,25 g/litra CaC03:a. pH säädetään 6,9:ksi lisäämällä nat-ronlipeää ennen kalsiumkarbonaatin lisäämistä. Erlenmeye-reitä ravistellaan 44 tunnin ajan 27 °C:ssa kiertävässä sekoittajassa, jonka kiertonopeus on 325 kierrosta/min.
15 2,5 ml edeltävää, 44 tunnin ikäistä viljelmää lisätään steriilisti 30 ml:aan tuotantoalustaa 300 ml:n erlenmeye- ; rissä. Tuotantoalusta käsittää 25 g/litra soijajauhoa, 7,5 g/litra tärkkelystä, 22,5 g/litra glukoosia, 3,5 g/litra leipomohiivaa, 0,5 g/litra sinkkisulfaattia ja 20 6 g/litra kalsiumkarbonaattia. pH säädetään 6,0:ksi lisää mällä kloorivetyhappoa ennen kalsiumkarbonaatin lisäämis- ;*·*: tä. Erlenmeyereitä ravistellaan 24, 28 ja 32 tunnin ajan • · ;"*· 27 °C:ssa. Kunakin ajankohtana 10 g lietettä punnitaan si- • · · .:. leään erlenmeyeriin, johon lisätään 20 ml liikkuvaa faa- • * · · 25 siä, joka koostuu 62,5 %:sta asetonitriiliä ja 37,5 %:sta * · · . ' . ^ 0,1 M KH2P04-liuosta (pH säädetty 3,0:ksi H3P04:llä) ja sai- * · · *".* lii pristinamysiinien uuttamisen. Kun seosta on sekoitettu * · · ’·' * sekoittajassa (325 kierr./min) 20 minuutin ajan ympäristön lämpötilassa, se suodatetaan paperisuodattimella ja pris-30 tinamysiinit määritetään HPLC:llä, kuten kuvataan esimer- * · · kissä 5.1.1.A.
.·**. Tulokset osoittivat, että käytetyissä fermentointi- • · *
....j olosuhteissa mutantti SP92: :pVRC505 on tuottanut pristina- J
• ® . mysiiniä I määrän, joka on ekvivalenttinen SP92:n tuotta- 35 maan määrään nähden, ja tämä testatuille 3 ajankohdalle.
* · . .
95 1 1 7674
Sitä vastoin verrokki tuotti 24, 28 ja 32 tunnin fermen-toinnissa noin 70 % pristinamysiiniä IIA ja 30 % pristina-mysiiniä IIB, mutantti SP92::pVRC505 oli tuottanut näinä samoina ajankohtina 100 % pristinamysiiniä IIB määrinä, 5 jotka olivat ekvivalenttisia kannan SP92 tuottamien pris-tinamysiinin IIA ja pristinamysiinin IIB summaan. Mutan-tissa on siis hyvinkin salvattu yksi pristinamysiinin II biosynteesivaihe, joka vastaa pristinamysiini IIB -välituotteen D-proliinin 2,3-sidoksen hapettumista. Tämä mu-10 tantti akkumuloi siten pristinamysiiniä IIB. Tämä osoittaa hyvin snaA-geenin funktionaalisen merkityksen pristinamy- ^ siinin IIB konversiossa pristinamysiiniksi IIA.
Tämä esimerkki osoittaa, että on mahdollista lähtien kloonatuista biosynteesigeeneistä rakentaa pristina-15 mysiinien biosynteesivaiheissa mutagenisoituja kantoja.
Tämä osoitettiin pristinamysiineille II, mutta samat tulokset voidaan saada pristinamysiineille I ja laajemmin H
streptogramiinien eri rakenneosille. Näin voidaan saada eri välituotteita tuottavia kantoja. Näitä kantoja voi-20 daan käyttää uusien molekyylien tuottamiseksi mainittujen * välituotteiden yhdellä tai useammalla kemiallisella, bio- :*·*; kemiallisella, entsymaattisella jne. modifikaatiolla. Sai- • · ;***. paus streptogramiinien yhden tai toisen rakenneosan bio- • · · synteesireitin varhaisessa vaiheessa voi samoin johtaa • · * · 25 mutagenisoituihin kantoihin, jotka eivät enää tuota kuin • · . . yhtä tai toista rakenneosista. ^ • * · • · * 9.2. samS-geenissä häirityn S. pristinaespiralis * · · *·* * SP92 -mutantin rakentaminen Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista häi- *.:.· 30 ritsemällä samS-geeniä rakentaa S. pristinaespiralis SP92 * * · ·...· -kanta, joka tuottaa 35 % vähemmän PIA:ta ja noin 10 ker- .**·. taa enemmän PIB:tä (kemialliset rakenteet esitetään ku- * · • · * viossa 2) verrattuna SP92-villikantaan. Tämä mutantti ra- • ♦ . kennettiin tarkoituksessa varmistaa oletettu SMA-syntaasi- 35 funktio samS-geenin koodittamalle proteiinille ja saada • · 96 1 1 7674 kanta, joka syntetisoi enemmän PlB:tä kuin SP92-villikan-ta.
9.2.1. Plasmidin pVRC702 rakentaminen Lähtien plasmidista pXL2045 (kuvataan esimerkissä 5 6.3.) eristettiin entsymaattisesti leikkaamalla 3,2 ke:n
BamHI-EcoRI-fragmentti, jota puhdistettiin elektroforeesin l-%:isessa agaroosigeelissä jälkeen pakkauksen Geneclean menetelmällä (katso esimerkki 6.8.). Tämä fragmentti käsittää snaB-geenin, kuten myös samS-geenin (kuvio 16).
10 Tämä fragmentti kloonattiin sitten plasmidiin pUC18 seu-raavalla tavalla: 50 ng pUC18:ta tehtiin lineaariseksi kaksoispilkkomalla entsyymeillä EcoRI ja BamHI, minkä jälkeen ligatoitiin T4-DNA-ligaasin (Biolabs) läsnä ollessa 300 ng:aan 3,2 ke:n BamHI-EcoRI-fragmenttia. Kannan 15 coli TG1 transformoitumiskelpoisten solujen transformoin- nin tällä ligatointiseoksella jälkeen voitiin eristää yksi ί yhdistelmä-DNA-klooni, joka käsitti plasmidin pUC18 3,2 kein insertin ohella ja joka nimettiin pVRC701:ksi (kuvio 26).
20 Plasmidi pVRC702 saadaan plasmidista pVRC701 liit tämällä geenin samS keskellä sijaitsevien kahden Sstl-koh-dan väliin (kuvio 27) kasetti, joka käsittää apramysiini- • · .**·. ja genitisiiniresistenssin koodittavan ampR-geenin. Tässä • · t tarkoituksessa eristettiin ensin 2,2 ke: n BamHI-BamHI- # 25 fragmentti, joka käsittää kasetin Ω-amR, pilkkomalla • ♦ . . BamHI:llä plasmidia pHP45-0-amR (saatiin J.L. Perno- • · · ---—‘ *”.* det'Itä, Laboratoire de Gänätique d'Orsay) käyttäen samaa • · · *·* * tekniikkaa kuin edellä. 200 ng tätä fragmenttia ligatoi tiin sitten 50 ng:aan plasmidia pUC1318 (Kay ja McPherson, 30 1987), joka oli tehty lineaariseksi entsyymillä BamHI, ja «»· ί,,.ί tämä ligatointiseos vietiin transformoitumiskelpoisiin E^ .·*·. coli TG1 -soluihin. Lähtien yhdistelmä-DNA-kloonista, joka • · ·-; käsittää kasetin Ω-amR sisältävän plasmidin pUC1318, voi- % • · . tiin uudelleeneristää leikkaamalla osittain Sstl-entsyy- 35 millä 50 ng 2,2 ke:n Sstl-SstI-fragmenttia, joka sisältää * 117674 97 kasetin Ω-amR, ja ligatoitiin 30 ng:aan SstI:llä leikattua plasmidia pVRC701 (kuvio 26), jolloin saatiin transformoi-tumiskelpoisten E^_ coli TG1 -solujen transformoinnin jälkeen plasmidi pVRC702, jonka rakenne esitetään yksityis-5 kohtaisesti kuviossa 27.
Näin saatua plasmidia pVRC702 valmistettiin suurina määrinä menetelmän mukaan, jota kuvattiin edellä esimerkissä 2.1.
9.2.2. Kannan rakentaminen, jossa on kromosomigeeni 10 samSi:Ω-amR
Tämä kanta saatiin transformoimalla pristinaes-piralls -protoplasteja 1 pg:lla itsetuhoplasmidia pVRC702, joka ei kykene replikoituinaan Streptomyces-solussa. Proto-plastien valmistuksen ja transformoinnin protokollat ovat 15 samat kuin edellä (esimerkki 9.1.). Ainoat modifikaatiot, jotka tehtiin verrattuna esimerkkiin 9.1., koskevat vali-kointiantibioottia. Tässä kyseessä olevassa tapauksessa yhdistelmä-DNA-protoplastit 18 tunnin regeneroinnin jälkeen 30 °C:ssa R2YE-kasvualustalla valikoidaan 50 pg:n/ml 20 loppupitoisuuden genetisiiniä (Sigma Chemical Co.) läsnä ollessa. Täten kuhunkin R2YE-maljaan lisätään kerros, joka :*·*: koostuu 3 ml:sta SNA:ta, joka sisältää 383 pg/ml geniti- siiniä.
• · · .:. Näin pystyttiin eristämään 500 genetisiinille re- 25 sistenttiä yhdistelmä-DNA-kloonia, jotka voivat olla tu-losta joko integraatiosta plasmidin pVRC702 kromosomiin • * · *!!.* seurauksena yksinkertaisesta homologisesta DNA-yhdistymi- * sestä kromosomigeenien ja plasmidin samS välillä (yksinkertainen crossing over) tai vaihdosta samS-kromosomigee- « · *·ί.* 30 nin ja plasmidigeenin samS::Ω-amR välillä seurauksena ho- • · · ·...· mologlsen DNA-yhdistymisen kaksoistapahtumasta (kaksinker- .···. täinen crossing over). Näissä kahdessa kuvion tapauksessa * · · kasetti Ω-amR löytyy siirrettynä kannan kromosomiin antaen • · sille amR-resistenssin, joka on stabiili sukupolvien ku- *.:.* 35 luessa.
·*««· • · 117674 98
Yhdistelmä-DNA-kloonit eristettiin levittämällä ja kasvattamalla R2YE-kasvualustalla, joka sisältää 50 pg/ml loppupitoisuuden genetisiiniä, minkä jälkeen ne analysoitiin pesäkehybridisaatiotekniikalla. Kloonien hybridisaa-5 tiolla ensimmäiseen koettimeen, joka saatiin, kuten kuvataan esimerkissä 9.1., lähtien pVRC702:sta peräisin olevasta 2,7 ke:n BamHl-EcoRI-fragmentista, joka vastaa pUC18:aa, sekä toiseen koettimeen, joka vastaa 2,2 ke:n BamHI-fragmenttia, joka käsittää kasetin Ω-amR, voitiin 10 erottaa yksinkertaisen crossing over -tapahtuman (hybridisaatio kahteen koettimeen) tapaukset kaksinkertaisesta crossing over -tapahtumasta (hybridisaatio vain toiseen koettimeen). Näin valikoidut 3 kloonia, jotka ovat tulosta kaksinkertaisesta crossing over -tapahtumasta, puhdistet-15 tiin levittämällä ja kasvattamalla R2YE-kasvualustalla, joka sisältää 50 pg:n/ml loppupitoisuuden genetisiiniä, ja saatiin itiövarastoj a.
Kolmen kaksoisyhdistelmä-DNA-kloonin genomiraken-teen vahvistamiseksi suoritettiin näiden kloonien entsyy-20 meillä EcoRI ja BamHI pilkotun kromosomi-DNA:n Southern-määrityksiä ja hybridoitiin seuraaviin 3 koettimeen: koe-tin, joka vastaa kasettia Ω-amR, joka saadaan lähtien ·*’*; pVRC702:n 2,2 ke:n BamHI-fragmentista, koetin, joka vastaa •j. pUC18:aa, joka saadaan lähtien pVRC701:n 2m7 ke:n BamHI- ···· 25 EcoRI-fragmentista, ja lopuksi koetin, joka sadaan lähtien • .·. pVRC701:n 1,3 ke:n EcoRI-Sstl-fragmentista, joka käsittää • · · *".* geenin snaB ja alun samSistä. Näillä hybridisaatioilla • · · • · * * voitiin vahvistaa, että kyseiset 3 testattua kloonia olivat hyvinkin peräisin homologisen DNA-yhdistymisen kak- • # · ' 30 soistapahtumasta, joka mahdollisti ehyen samS-kromosomi- • · · geenin korvaamisen mutagenisoidulla samS-geenillä, jonka .*·*. katkaisee kasetti Ω-amR.
• · - »«(
Yksi näistä kolmesta mutageni soidusta kloonista • · • nimettiin SP92samS::Ω-amR:ksi.
* - - • · * • · · ' • · · *«··· · 99 1 1 7674
9.2.3. Pristinamysiinien tuotanto mutanttikannalla samS::Ω-amR
Tämä esimerkki esittää, miten määritetään, että mutantti SP92samS::Ω-amR, jonka samS-geeniä on häiritty, 5 tuottaa 35 % vähemmän pristinamysiiniä IA ja 10 kertaa enemmän pristinamysiiniä IB kuin villikanta SP92.
Mutanttia SP92samS::Ω-amR sekä verrokkikantaa SP92 viljeltiin nestemäisessä tuotantoalustassa ja niiden pris-tinamysiinin II ja pristinamysiinin I tuotannot määritet-10 tiin, kuten kuvattiin esimerkissä 9.1.
Tulokset osoittivat, että käytetyissä fermentointi-olosuhteissa mutantti SP92samS::Ω-amR tuottaa pristinamy-siinejä II määrän, joka on ekvivalenttinen verrokin SP92 tuottamaan määrään testattuina 3 aikajaksona. Sitä vastoin 15 mutantti SP92samS:;Ω-amR tuottaa kolmena testattuna aikajaksona noin 35 % vähemmän pristinamysiiniä IA ja 10 kertaa enemmän pristinamysiiniä IB kuin verrokkikanta. Pris-tinamysiinien muoto IB edustaa täten 20 % tyypin I pristi-namysiinien kokonaismäärästä, jonka tuottaa mutantti 20 SP92samS::Ω-amR, kun taas verrokkikanta ei tuota kuin noin 1 %:n PIB:tä. Pristinamysiinien muoto IB eroaa muodosta IA
a··.'1 j · : siinä, että 5. tähde on p-metyyliaminofenyylialaniini p-dimetyyliaminofenyylialaniinin asemesta pristinamysii- • φ · nille IA. Se, että mutantti SP92samS: :Ω-amR tuottaa enem- ···· 25 män pristinamysiiniä IB ja vähemmän pristinamysiiniä IA, · * ... osoittaa, että geenin samS häirintä aikaansaa pristinamy- II· *.1!.1 siinien I 5. tähteen metylaatioasteen laskun, ja siis että • · ·
geeni samS liittyy todennäköisesti metyyliluovuttajan SAM
biosynteesiin, eli että se koodittaa SMA-syntaasia.
• · · *.!·1 30 9.3. Geenissä papA häirityn S. pristinaespiralis «· · “ *...: SP92 -mutantin rakentaminen j“1. Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista häi- ritsemällä geeniä papA rakentaa S^_ pristinaespiralis SP92 1 • -kanta, joka ei enää tuota Pl:tä. Tämä mutantti rakennet- · · *·ί.1 35 tiin tarkoituksessa vahvistaa proteiinin PapA funktionsa- · 100 117674 lisuus. Se rakennettiin käyttämällä itsetuhovektoria pDH5, jota kuvattiin esimerkissä 9.1.
9.3.1. Plasmidin pVRC508 rakentaminen Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista raken-5 taa plasmidi, joka ei replikoidu S^_ pristinaespiralis -kannassa SP92 ja jota voidaan käyttää geenin papA häiritsemiseksi yksinkertaisella homologisella DNA-yhdistymi-sellä.
Plasmidi pVRC508 rakennettiin geenissä papA häiri-10 tyn SP92-kromosomimutantin valmistamiseksi plasmidista pVRC903, jota kuvattiin esimerkissä 7.7.
Esimerkissä 7.7. kuvattiin 1,4 ke:n PvuII-EcoRI-fragmentin kloonausta M13mpl8:aan lähtien plasmidista pVRC903 geenin papA sekventoimiseksi (tämä fragmentti vas-15 taa 1,4 ke:n PvuII-XhoI-fragmenttia, joka esiintyy vektorissa pVRC903, kuvio 23).
Tätä rakennetta M13mpl8:ssa pilkottiin restriktio- entsyymeillä HindiII ja EcoRl. Vektorin M13mpl8 ja 1,4 ke:n fragmentin, joka sisältää osan geenistä papA, erotuk- 20 sen jälkeen elektroforeesilla 0,8-%:isessa agaroosigeelis- sä tämä eristettiin ja puhdistettiin Geneclean-pakkausta | 14: käyttäen (BiolOl, La Jolla, Kalifornia). Fragmentin si- ;***· jainti geenissä papA esitetään kuviossa 23.
··· 1-“- ··· 100 ng vektoria pDH5, joka oli tehty lineaariseksi *·«* 25 kaksoispilkkomalla restriktioentsyymeillä Hindlll ja • .·. EcoRl, ligatoitiin 200 ng:aan 1,4 ke:n fragmenttia, kuten • · · "!.1 kuvattiin esimerkissä 3.3. Halutun fragmentin sisältävä • · · * klooni eristettiin kantaan TG1 transformoinnin jälkeen. Yhdistelmä-DNA-plasmidi nimettiin pVRC508:ksi. Plasmidi • · · *·ί·* 30 pVRC508 valmistettiin, kuten kuvattiin esimerkissä 2.1.
• · · *...1 Sen restriktiokartta esitetään kuviossa 28.
;***· 9.3.2. Geenissä papA homologisella DNA-yhdistämi- • •a sellä häirityn mutantin SP92 eristäminen • « Tämä esimerkki esittää, miten rakennettiin papA- • · · *·!·1 35 geenissä häiritty S. pristianespiralis SP92 -mutantti.
· 117674 101 Tämä mutantti eristettiin transformoimalla kanta SP92 it-setuhoplasmidilla pVRC508. Protoplastien valmistus ja niiden transformointi suoritettiin, kuten kuvattiin esimerkissä 9.1. Kannan SP92 protoplastien transformoinnin jäl-5 keen yhdistelmä-DNA-kloonit valikoitiin levittämällä 3 ml SNA-kasvualustaa, joka sisältää 2,6 mg/ml tiostreptonia.
Viidestä transformoinnista, jotka suoritettiin 5 kertaan 1 pgilla plasmidia pVRC508, eristettiin noin 12 tiostrep-tonille resistenttiä kloonia. Tämä antaa yhdistelmä-DNA-10 tuotetason noin 2 kohden pg DNA:ta. Nämä yhdistelmä-DNA-tuotteet ovat seurausta integraatiosta yksinkertaisella homologisella DNA-yhdistymisellä kannan SP92 kromosomin käsittämän geenin papA ja itsetuhoplasmidin pVRC508 1,4 ke:n fragmentin välillä.
15 Yhdistelmä-DNA-tuoteitiöt eristettiin levittämällä ja kasvattamalla R2YE-kasvualustalla, joka sisälsi 400 pg/ml tiostreptonia, ja ne levitettiin uudelleen samalle kasvualustalle eristettyjen pesäkkeiden saamiseksi.
Plasmidin pVRC508 integraatioaseman todentamiseksi 20 suoritettiin erilaisia Southern-määrityksiä useiden yhdis-telmä-DNA-kloonien kokonais-DNA:11a, joita oli puhdistettu • · « • edellä kuvatun mukaisesti, ja niitä hybridoitiin vekto-riin pDH5 ja 1,4 ke:n fragmenttiin, joita käytettiin pe- ··· räkkäin koettimina leimauksen jälkeen satunnaispohjustuk- ....: 25 sella [a-32P]dCTP:llä kuten kuvattiin esimerkissä 9.1. Hyb- ί j ,·. ridisaatiotulokset osoittavat, että restriktioentsyymillä ··♦ * φ··.# EcoRI (1,4 kein fragmentin ympäröivä kohta) pilkottujen • · · yhdistelmä-DNA-kloonien genomista on hävinnyt 6,8 kein . EcoRI-nauha ja siihen on ilmaantunut kaksi ylimääräistä w * *“·’ 30 nauhaa verrokkikantaan SP92 nähden, yksi 2,4 kein, joka 9 9 *···* hybridoituu 1,4 kein fragmenttiin, ja toinen 10,5 kein, ;***: joka hybridoituu yhdellä kertaa pDH5:een ja 1,4 kein frag- «·· ....i menttiin. Yhdistelmä-DNA-klooneja restriktioentsyymillä •# PstI pilkkomalla ilmenee kaksi ylimääräistä nauhaa suh- • · · *···* 35 teessä verrokkikantaan SP92, yksi 1,0 kein, joka hybridoi- • · 117674 tuu 1,4 ke:n fragmenttiin, ja toinen 5,1 ke:n, joka hybri-doituu samalla kertaa pDH5:een ja 1,4 ke:n fragmenttiin.
Yksi näistä mutanteista nimettiin SP92::pVRC508:ksi.
9.3.3. Pristinamysiinien tuotanto mutantilla 5 SP92::pVRC508 Tämä esimerkki esittää, miten määritetään, että S. pristinaespiralis SP92 -mutantti, jota on häiritty geenissä papA integroimalla plasmidi pVRC508, ei enää tuota pristinamysiiniä I.
10 Mutanttia SP92::pVRC508 sekä kantaa SP92 verrokki- kantana viljeltiin nestemäisessä tuotantoalustassa. Fer-mentointi sekä pristinamysiinien I ja II määritykset suoritettiin, kuten kuvataan esimerkissä 9.1.
Tulokset osoittivat, että käytetyissä fermentointi-15 olosuhteissa, kun verrokkikanta SP92 tuottaa vakiomäärän pristinamysiinejä I, jälkeäkään tyypin I pristinamysii-neistä ei todettu mutantin SP92::pVRC508 fermentointiliet-teessä. Lisäksi pristinamysiinien II tuotanto mutantilla SP92::pVRC508 on samankaltaista kuin verrokin SP92. Mu-20 tantti SP92::pVRC508 ei siten enää tuota kuin pristinamysiinejä II. Nämä tulokset osoittavat hyvin, että geeni • · · • *,i papA koodittaa proteiinia, joka liittyy pristinamysiinien I biosynteesiin.
*· Lisäksi, jotta varmistuttaisiin siitä, että suori- • · · · ···.; 25 tettu häirintä ei koske kuin kohdegeeniä papA, mutanttia Ϊ ,·. SP92: :pVRC508 fermentoiniin p-dimetyyliaminofenyylialanii- nin läsnä ollessa. Mutanttia SP92: :pVRC508 fermentoitiin, • I « kuten kuvattiin edellä lisäten fermentolntiajankohtana . 17 tuntia 100 mg/litra p-dimetyyliaminofenyylialaniinia.
f · 30 Näissä täydennysolosuhteissa mutantti SP92::pVRC508 tuot-*··* taa pristinamysiinejä I määrän, joka on ekvivalenttinen :‘**j kannan SP92 tuottamaan nähden. Pristinamysiinien II tuo- ; ····· tanto on ekvivalenttinen näissä kahdessa kannassa. Tästä *, voimme päätellä, että mutantti SP92::pVRC508 ei tuota • · · '···[ 35 pristinamysiinejä I, koska sitä on hyvinkin häiritty gee- • · 117674 103 nissä, joka osallistuu p-dimetyyliaminofenyylialaniinin biosynteesiin (geeni papA). Tämän mutantin täydentäminen p-dimetyyliaminofenyylialaniinilla palauttaa sen kyvyn tuottaa pristinamysiinejä I, mikä osoittaa, että mutaa-5 tiolla geenissä papA ei ole polaarista vaikutusta pristi-namysiinien I muiden prekursoreiden synteesiin tai pepti-diketjun muodostumiseen näistä prekursoreista.
Tämä esimerkki osoittaa, että on mahdollista lähtien kloonatuista biosynteesigeeneistä rakentaa kantoja, 10 joita on mutagenisoitu pristinamysiinien ja erityisesti pristinamysiinien I biosynteesivaiheissa. Tämä esimerkki osoittaa samoin, että tällä lähestymistavalla on mahdollista rakentaa pristinaespiralis -kantoja, jotka tuottavat spesifisesti pristinamysiinejä II, ja siitä seuraten 15 kantoja, jotka tuottavat spesifisesti pristinamysiinejä I.
Tätä samaa lähestymistapaa voitaisiin samoin käyttää muille Actlnomycetes-kannoille, jotka tuottavat streptogramii-neja.
9.4. Geenissä snbA häirityn pristinaespiralis 20 SP92 -mutantin rakentaminen Tämä esimerkki osoittaa, miten on mahdollista häi- ·· : ritsemällä geeniä snbA rakentaa S^ pristinaespiralis SP92 ··· \..ϊ -kanta, joka ei enää tuota pristinamysiinejä I. Tämä mu- tantti rakennettiin tarkoituksessa vahvistaa proteiinin ·:**· 25 SnbA funktionaalisuus. Sen rakentaminen suoritettiin käyt- • ·'. täen itsetuhovektoria pDH5, jota kuvattiin esimerkissä ♦ *· · «** Q 1 • · · 7*1« · · 9.4.1. Plasmidin pVRC404 rakentaminen . Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista raken- • · · ' •a · * VV. 30 taa plasmidi, joka ei replikoidu S_^ pristinaespiraliksessa 1 SP92 ja jota voidaan käyttää geenin snbA häiritsemiseksi ·*· • : yksinkertaisella homologisella DNA-yhdistymisellä.
*;··· Plasmidi pVRC404 rakennettiin plasmidista pVRC402, jota kuvattiin esimerkissä 6.1., geenissä snbA häirityn • · · **·, 35 SP92-kromosomimutantin valmistamiseksi. Plasmidia pVRC402 ···· • · : 117674 pilkottiin restriktioentsyymeillä XhoI ja HindiII. Näin muodostuneet fragmentit erotettiin elektroforeettisesti 0,8-%:isessa agaroosigeelissä, minkä jälkeen eristettiin 1 170 ep:n fragmentti, joka sisälsi geenin snbA sisäisen 5 osan, ja puhdistettiin se käyttäen Geneclean-pakkausta (BiolOl, La Jolla, Kalifornia). Fragmentin sijainti geenissä snbA esitetään kuviossa ISA.
100 ng Smal;llä pilkkomalla lineaariseksi tehtyä vektoria pDH5 ligatoitiin 200 ng:aan fragmenttia 1 170 ep, 10 kuten kuvataan esimerkissä 3.3. Halutun fragmentin käsit-tävä klooni eristettiin kannan TG1 transformoinnin jälkeen. Yhdistelmä-DNA-plasmidi nimettiin pVRC404:ksi. Plas-midi pVRc404 valmistettiin, kuten kuvattiin esimerkissä 2.1. Sen restriktiokartta esitetään kuviossa 29.
15 9.4.2. Geenissä snbA homologisella DNA-yhdistymi- sellä häirityn SP-mutantin eristäminen Tämä esimerkki esittää, miten geenissä snbA häiritty pristinaespiralis SP92 -mutantti rakennettiin.
Tämä mutantti eristettiin transformoimalla kanta 20 SF92 itsetuhoplasmidilla pVRC404. Protoplastien valmistus ja niiden transformointi suoritettiin, kuten kuvattiin I esimerkissä 9.1. Kannan SP92 protoplastien transformoin- ;***; nin jälkeen yhdistelmä-DNA-tuotteet valikoitiin levittä- ··· mällä 3 ml SNA-kasvualustaa, joka sisälsi 2,6 mg/ml tlo- *·· 25 streptonia. Viidestä transformoinnista, jotka suoritettiin • · • β·β 5 kertaa 1 pg:lla plasmidia pVRC404, eristettiin noin 30 ·.
♦ · 1 “!.1 streptomysiiniresistenttiä kloonia. Tästä saadaan yhdis- • · · * telmä-DNA-tuotetasoksi noin 5 kohden pg DNA:ta. Nämä yhdistelmä-DNA- tuotteet ovat tulosta geenin snbA, jonka kä- • · · *··«1 30 sittää kannan SP92 kromosomi, ja itsetuhoplasmidin pVRC404 ♦ 1### 1 170 ep:n fragmentin välisestä integraatiosta yksinker- .’2♦ täisellä homologisella DNA-yhdistymisellä. Yhdistelmä-DNA- ··· tuoteitiöitä eristettiin levittämällä ja kasvattamalla R2YE-kasvualustalla, joka sisälsi 400 pg/ml tiostreptonia, • · · 2 ί·1 35 ja ne levitettiin uudelleen samalle kasvualustalle eris- ··»·· • « 105 1 1 7674 tettyjen pesäkkeiden saamiseksi. Plasmidin pVRc404 in-tegraatioaseman todentamiseksi suoritettiin useiden yh-distelmä-DNA-kloonien edellä kuvatun mukaisesti puhdistetun kokonais-DNA:n erilaisia Southern-määrityksiä, ja 5 niitä hybridoitiin vektoriin pDH5 ja 1 170 ke:n fragmenttiin, joita käytettiin peräkkäin koettimena leimauksen [a-32P]dCTP:llä satunnaispohjustuksen jälkeen, kuten kuvataan esimerkissä 9.1. Hybridisaatiotuloksista ilmenee, että restriktioentsyymeillä XhoI ja HindiII pilkottujen 10 yhdistelmä-DNA-kloonien genomiin on ilmaantunut ylimääräinen 4,7 ke:n nauha XhoI-HindiII (vektori pDH5 + 1,14 ke) verrattuna verrokkikantaan SP92, joka nauha hybridoituu samalla kertaa pDH5:een ja 1 170 ep:n fragmenttiin. Yhdistelmä-DNA-kloonien pilkkominen restriktioentsyymillä PfiMl 15 (1 170 ep:n XhoI-HindiII-fragmenttia ympäröivät kohdat) osoittaa 3,1 ke:n nauhan PfiMl-PfiMi katoamisen ja 8,8 ke:n nauhan, joka hybridoituu kyseisiin kahteen koetti-meen, ilmaantumisen. Nämä tulokset osoittavat, että analysoitujen kloonien genomirakenne on hyvinkin odotusten 20 mukainen homologisen DNA-yhdistymistapahtuman jälkeen pVRC404:n ja snbA-kromosomigeenin välillä. Yksi näistä | *4: mutanteista nimettiin SP92: : pVRC404: ksi.
;***: 9.4.3. Pristinamysiinien tuotanto mutantilla • •a SP92: :pVRC404 aa·· 25 Tämä esimerkki esittää, miten määritetään, että • * • _·. geenissä snbA plasmidin pVRC404 integraatiolla häiritty S.
aa·' **!.* pristinaespiralis SP92 -mutantti ei enää tuota pristinamy- • · * siiniä I.
Mutanttia SP92::pVRC404 sekä kantaa SP92 verrokki- • aa.- *··»* 30 kantana viljeltiin nestemäisessä tuotantoalustassa. Fer- mentointi sekä pristinamysiinien I ja II määritys suori- a ·***· tettiin, kuten kuvattiin esimerkissä 9.1. Tulokset osoit- a a a tivat, että käytetyissä fermentointiolosuhteissa, kun ver- | rokkikanta SP92 tuotti vakiomäärän pristinamysiinejä I, ’·!·* 35 jälkeäkään pristinamysiineistä I ei todettu mutantin a • aaaa a a ...
117674 106 SP92::pVRc404 fermentointilietteessä. Lisäksi mutantin SP92::pVRC404 pristinamysiinien II tuotanto on ekvivalenttien verrokin SP92 tuotantoon. Mutantti SP92::pVRc404 ei enää tuota kuin pristinamysiinejä II. Tämä osoittaa hyvin, 5 että geeni snbA koodittaa proteiinia SnbA, joka liittyy pristinamysiinien I biosynteesiin, kuten osoitettiin puhdistuksen esimerkissä 5.2. aikana. f Tämä esimerkki osoittaa, kuten edellisessä esimerkissä, että on mahdollista lähtien kloonatuista biosyn-10 teesigeeneistä rakentaa pristinamysiinien ja erityisesti pristinamysiinien I biosynteesivaiheissa mutagenisoituja kantoja. Tämä esimerkki osoittaa samoin, että tällä lähestymistavalla on mahdollista tuottaa pristinaespiralis -kantoja, jotka tuottavat spesifisesti pristinamysiinejä 15 II ja siitä seurauksena kantoja, jotka tuottavat spesifisesti pristinamysiinejä I, kuten kuvataan seuraavassa esi- - merkissä 9.5. Tätä samaa lähestymistapaa voitaisiin samoin käyttää muille Actinomycetes-kannoille, jotka tuottavat streptogramiineja.
20 9.5. pristinaespiralis SP92 -mutantin rakentami nen, jota on häiritty snaD geenissä, joka koodittaa toden-{*· : näköisesti peptidisyntaasia, joka liittyy pristinamysii- nien II biosynteesiin •ί. Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista häi- t 9 • «•e 25 ritsemällä geeniä snaD, joka koodittaa todennäköisesti • .·, peptidisyntaasia, joka liittyy pristinamysiinien II bio- • · · "1/ synteesiin, rakentaa pristinaespiralis SP92 -kanta, • · · * joka ei enää tuota pristinamysiinejä II.
Tämä mutantti rakennettiin tarkoituksessa vahvistaa ··'·· *·ϊ·* 30 geenin snaD funktionaalisuus ja saada SP92-johdannaiskan- ***· - *...· ta, joka ei enää syntetisoi kuin pristinamysiinejä I.
*
.***. Sen rakentaminen suoritettiin plasmidin pVRClOOO
··· . · avulla, jota kuvataan esimerkissä 6.8. ja joka saadaan itsetuhovektorista pDH5 ja joka kykenee replikoitumaan E^_ • · · • * * * * * ·· ····· • · 117674 1°7 ' ' colissa ainoastaan ja käsittää Streptomycesissä ilmentyvän resistenssimerkin (vrt. esimerkki 9.1.).
9.5.1. Plasmidin pVRClOOO rakentaminen Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista raken-5 taa plasmidi, joka ei replikoidu £L_ pristinaespiraliksessa SP92 ja jota voidaan käyttää geenin snaD häiritsemiseksi yksinkertaisella homologisella DNA-yhdistymisellä. Osan geenistä snaD käsittävän plasmidin pVRClOOO rakentamista kuvataan esimerkissä 6.8.
10 9.5.2. Geenissä snaD homologisella DNA-yhdistymi sellä häirityn SP92-mutantin eristäminen Tämä esimerkki esittää, miten rakennettiin S. pris-tinaespiralis SP92 -mutantti, joka on häiritty geenissä snaD. Tämä mutantti eristettiin transformoimalla kanta 15 SP92 itsetuhoplasmidilla pVRClOOO. Protoplastien valmistus ja niiden transformointi suoritettiin, kuten kuvattiin esimerkissä 9.1. Suoritetuista 5 transformoinnista, joissa käytettiin 1 pg pVRClOOO, eristettiin noin 1 500 kloonia, jotka olivat resistenttejä tiostreptonille. Tästä saadaan 20 yhdistelmä-DNA-tuotetasoksi noin 375 kohden pg DNArta. Nämä yhdistelmä-DNA-tuotteet ovat tulosta integraatiosta ·· * •*.S yksinkertaisella homologisella DNA-yhdistymisellä geenin i*": snaD, jonka käsittää kannan SP92 kromosomi, ja itsetuho- ··· plasmidin pVRClOOO 1,5 ke:n BamHI-Sstl-fragmentin välillä.
·*·· --- 25 Noin 20 yhdistelmä-DNA-kloonia noukittiin R2YE-kasvualus- : .*. talle, joka sisälsi 400 pg/ml tiostreptonia, ja näiden ·· · .*;·, yhdistelmä-DNA-tuotteiden itiöitä eristettiin levittämällä • * · uudelleen ja kasvattamalla 400 pg/ml tiostreptonia sisäl-. tävällä R2YR-kasvualustalla.
• * a *“·* 30 Plasmidin pVRClOOO integraatioaseman todentamiseksi • « *···* suoritettiin 7 yhdistelmä-DNA-kloonin edellä kuvatun mu- kaisesti puhdistetun kokonais-DNA:n Southern-määrityksiä, ··· ' ja niitä hybridoitiin vektoriin pDH5 ja 1,5 ke:n BamHI- ·, Sstl-fragmenttiin, joka sisältyi pVRC1000:een, joita vek- • * * *···* 35 toria ja fragmenttia käytettiin peräkkäin koettimina lei- *»·«* • · 117674 108 maamisen [a-32P]dCTP: llä jälkeen, kuten kuvattiin esimerkissä 9.1. Hybridisaatiotuloksista ilmenee, että 7 yhdis-telmä-DNA-kloonin genomiin on ilmaantunut 13,8 ke:n EcoRI-nauha ja noin 17 ke:n Bglll-nauha, jotka hybridoituvat 5 kyseisiin kahteen koettimeen, sekä 3,7 ke:n EcoRl-nauha, joka hybridoituu koettimeen 1,5 ke:n BamHI-SstI. Yksi näistä mutanteista nimettiin SP92::pVRC1000:ksi ja se vas-taa hyvin plasmidin pVRClOOO integraatiota yksinkertaisella homologisella DNA-yhdistymisellä geeniin snaD.
10 9.5.3. Mutantin SP92::pVRC1000 pristinamysiinien tuotanto Tämä esimerkki esittää, miten määritetään, että S. pristinaespiralis SP92 -mutantti, jota on häiritty geenissä snaD plasmidin pVRClOOO integraatiolla, ei tuota enää 15 pristinamysiinejä II, vaan ainoastaan pristinamysiinejä I. a
Mutanttia SP92::pVRClOOO sekä verrokkikantaa SP92 viljeltiin nestemäisessä tuotantokasvualustassa ja niiden pristinamysiinien II ja I tuotannot määritettiin, kuten kuvattiin esimerkissä 9.1.
20 Tulokset osoittivat, että käytetyissä fermentointi- olosuhteissa ja testatuille kolmelle näytteelle mutantti : SP92::pVRClOOO tuottaa 0 mg/litra pristinamysiinejä II ja :’**· pristinamysiinejä I määrän, joka on ekvivalenttinen verro- * · · .j. kin SP92 tuottamaan määrään. Tämä mutantti on siis hyvin ··1 25 salvattu pristinamysiinien II yhdessä biosynteesivaihees- • 1 • sa, mikä osoittaa, että geeni snaD koodittaa pristinamy- • · siinien II biosynteesiin liittyvää entsyymiä, ja on hyvin # 1 todennäköisesti peptidisyntaasi.
Tämä esimerkki osoittaa, kuten edeltävässä esimer-• 1 · · *·ί·1 30 kissä, että on mahdollista lähtien kloonatuista biosyn- * 1 1 *.„· teesigeeneistä rakentaa pristinamysiinien ja erityisesti pristinamysiinien II biosynteesivaiheissa mutagenisoituja • · · kantoja. Tämä esimerkki osoittaa samoin, että tällä lähes- • · • tymistavalla on mahdollista tuottaa pristinaespiralis • · ·
*.ί·1 35 -kantoja, jotka tuottavat spesifisesti pristinamysiinejä I
· 117674 109 ja siitä seurauksena kantoja, jotka tuottavat spesifisesti pristinamysiinejä II. Tätä samaa lähestymistapaa voitaisiin samoin käyttää muille Actinomycetes-kannoille, jotka tuottavat streptogramiineja.
5 Esimerkki 10
Kannan SP92 ei-tuottajamutantin täydentäminen Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista ilmentää pristinamysiinien biosynteesigeenejä. Tämä ilmentäminen suoritettiin erityisemmin kosmidin pIBVl käsittämille 10 geeneille snaA ja snaB SP92:SP120:sta saadussa mutantti-kannassa. Tämä mutantti ei tuota pristinamysiiniä IIA. Se akkumuloi pristinamysiinin II biosynteesireitin viimeistä välituotetta, pristinamysiiniä IIB.
10.1. Geenien snaA ja snaB kloonaaminen sukkulavek-15 toriin pIJ903 Tämä esimerkki esittää, miten kosmidin pIBVl ala-fragmentti, joka sisältää geenit snaA ja snaB, kloonattiin vektoriin, joka kykenee replikoitumaan yhdellä kertaa sekä E. collssa että Streptomycesissä.
20 Vektori pIJ903 (Lydiate D.J. et ai., 1985) on suk- kulavektori, jonka kopioluku on alhainen (1-3 solua koh-: den), ja joka kykenee replikoitumaan yhdellä kertaa sekä E. colissa johtuen sen pBR322-replikaatioalkukohdasta että • · · •j. Streptomycesissä johtuen sen SCT21-replikaatioalkukohdas- ···♦ 25 ta. Ampisilliiniresistenssigeeni tekee mahdolliseksi vali- • .·_ koinnin E. colissa ja tiostreptoniresistenssiaeeni tekee ♦ · · |1J.1 mahdolliseksi valikoinnin Streptomycesissä.
• · ·
Kosmidia pIBVl pilkottiin restriktioentsyymillä . SstI. Suuri, geenit snaA ja snaB käsittävä 7,6 ke:n DNA- • · · ***** 30 fragmentti eristettiin elektroforeesilla 0,8-%:isessa aga- • · *...1 roosigeelissä ja elektroeluoitiin. 500 ng tätä fragmenttia ;**'· ligatoitiin 100 ng:aan vektoria pUC1813 (Kay ja McPherson, * · ·
1987), joka oli tehty lineaariseksi sstl: llä. Kannan J
•m coll DH5a (supE44 A-lacU169 (f801ac2-A-M15) hsdRl7 recAl • · · *·ϊ·1 35 end AI gyrA96 thi-1 relAl) transformoinnin ja transformant- • ~ · 110 117674 tien valikoinnin jälkeen kiinteällä LB-kasvualustalla, joka sisältää 150 pg/ml ampisilliiniä ja 20 pg/ml X-ga-li:a, eristettiin 7,6 ke:n fragmentin käsittävä klooni.
Tämä plasmidi nimettiin pVRC506:ksi. Tämän yhdistelmä-DNA-5 plasmidin valmistus suoritettiin, kuten kuvattiin esimerkissä 2.1.
Kloonaus vektoriin pIJ903 suoritettiin HindiII-koh-taan. Plasmidia pVRC506 leikattiin Hindlll:11a ja geenit snaA ja snaB käsittävä 7,6 ke:n fragmentti eristettiin 10 elektroforeesilla 0,8-%:isessa agaroosigeelissä ja elekt-roeluoitiin. 500 ng tätä fragmenttia ligatoitiin 500 ng:aan vektoria plJ903, josta oli tehty lineaarinen Hindlll: 11a. Kannan E_^ coli DH5a transformoinnin ja trans-formanttien valikoinnin jälkeen kiinteällä LB-kasvualus-15 talla, joka sisältää 150 pg/ml ampisilliiniä, eristettiin 7,6 ke:n fragmentin käsittävä klooni. Plasmidi nimettiin pVRC507:ksi. Tämän yhdistelmä-DNA-plasmidin valmistus suoritettiin, kuten kuvattiin esimerkissä 2.1. Sen kartta esitetään kuviossa 30.
20 10.2. Geenin snaA ja snaB ilmentäminen mutantissa SP120 • · · I * : Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista tuot- taa proteiineja SnaA ja SnaB S^ pristinaespiraliksessa ··· SP92 viemällä tähän kantaan vastaavat rakennegeenit käsit- • · « · ....: 25 tävä plasmidi. Geenien snaA ja snaB ilmentäminen suori- : tettiin mutanttikannan SP120 transformoinnin jälkeen 500 * * · . . "··· ng:lla plasmidia pVRC507. SP120:n protoplastien transfor- * * · mointi ja transformanttien valinta tiostreptonin suhteen , suoritettiin, kuten kuvattiin esimerkissä 9.1.2.
• · · ’”·* 30 Näin saatiin lukuisia transformantteja, joista 3 • * *···* valittiin tuotantokokeisiin nestemäisessä kasvualustassa.
;***: Plasmidin pIJ903 käsittävä kanta SP120 valittiin verrokik- * · · ....: si. Fermentoinnit sekä biosynteesituotteiden uuttaminen ·. suoritettiin, kuten kuvattiin esimerkissä 9.1.3.
* · · • » · • · '111 117674
Tulokset osoittivat, että käytetyissä fermentoin-tiolosuhteissa, kun verrokki (plasmidin pIJ903 käsittävä SP120) tuotti fermentoinnin ajankohtina 24, 28 ja 32 tuntia 100 % P IIB:tä ja 0 % P IIA:ta, plasmidilla pVRC507 5 transformoidun kannan SP120 3 kloonia olivat tuottaneet *' näinä samoina ajankohtina noin 85 - 80 % pristinamysiiniä IIB ja 15 - 20 % pristinamysiiniä IIA, joiden summa on ekvivalenttinen määrältään verrokkikannan (SP120, joka käsittää plasmidin pIJ903) pristinamysiinin IIB tuotantoon.
10 pVRC507:n käsittävät kloonit ovat hyvinkin tulleet osittain täydennetyiksi pristinamysiinien II biosynteesivai-heessa, joka vastaa välituotteen pristinamysiini IIB D-proliinin 2,3-sidoksen hapettumista. Tämä vahvistettiin pristinamysiini IIA -syntaasin entsymaattisen aktiivisuu-15 den määrityksellä, kuten kuvattiin esimerkissä 5.1.1.A.
kannoille SP120, joka käsittää pVRC507:n, ja SP120, joka / käsittää pIJ903:n. Kun pIJ903:n käsittävä SP120-verrokki- ® kanta ei osoita mitään pristinamysiini IIA -syntaasiaktii-visuutta, pVRC507:n käsittävä kanta SP120 osoittaa PIIA-20 syntaasiaktiivisuutta.
Tämä esimerkki osoittaa, että on mahdollista ilmen- M t • tää streptogramiinien biosynteesigeenej ä. Tätä ilmentymis- tä tutkittiin erityisemmin geeneille, jotka koodittavat ··· pristinamysiini IIA -syntaasia, mutta muitakin pristinamy- ···♦ 25 siinien II ja pristinamysiinien I biosynteesigeenejä sekä : niitä, jotka liittyvät eri streptogramiinien rakenneosien • · · j.J/ biosynteesiin, voidaan näin ilmentää. Tämä ilmentäminen ♦ · ♦ voidaan suorittaa mutanttikannoissa, kuten on asianlaita . esimerkissä 10, mutta myös tuottajakannoissa tarkoituksena • * a *“·* 30 lisätä streptogramiinien tuotantotasoja. Ilmentymistä voi- • · *···* daan modifioida kloonaamalla geenejä vektoriin, jonka ko- :***· pioluku vaihtelee (alhainen tai korkea), tai integroitu- ..j • · · vaan vektoriin näiden geenien epäsäätelyllä kloonaamalla -0 \ nämä geenit homologisen tai heterologisen promoottorin • · · *···* 35 alaisuuteen (voimakas tai spesifisesti säädelty promootto- * ♦ 117674 ri). Streptogramiinien biosynteesin eri geenien ilmentäminen voidaan samoin suorittaa heterologisissa kannoissa lähtien sopivista ilmentämisvektoreista hybridiantibioot-tien tuottamiseksi.
5 Esimerkki 11 S. pristinaespiraliksen geenin papM ilmentäminen :¾ colissa d Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista ilmentää S_^ pristinaespiralis -geeni colissa siten, että 10 tämän geenin koodittama proteiini voidaan identifioida, puhdistaa ja tutkia.
11.1. Plasmidin pVRC706 rakentaminen Geenin papA ilmentyminen Eh_ colissa saadaan sijoittamalla tämä geeni alavirtaan promoottorista ja colin 15 geenin IacZ ribosomien kiinnittymiskohdasta. 1,7 kein
Mlul-Stul-fragmentti eristettiin esimerkissä 7.8. kuvatus- | ta plasmidista pVRC409 ja kloonattiin sitten plasmidiin pMTL23 (Chambers et ai., 1988), jota oli leikattu BamHI- ?? kohdassa, joka täytettiin lopuksi Klenow-entsyymin avulla 20 (Maniatis et ai., 1989), ja Mlul-kohdassa plasmidin pVRC706 saamiseksi, joka esitetään kuviossa 31. Kloonaami- ·· · ί ' : nen Mlul-kohtaan tekee mahdolliseksi saada fuusio alueella • I - :***: plasmidin pMTL23 geenin IacZ koodittaman fi-galaktosidaasin • · · -- ··· 32 ensimmäisen aminohapon ja papMistä juuri ylävirtaan 25 sijaitsevan geenin 11 viimeisen aminohapon välillä, jol- : loin on mahdollista säilyttää translaatiokytkentä, joka • · · vaikuttaa vallitsevan geenin papM ja tämän geenin välillä, • * · joka on ylävirtaan esimerkissä 7.8. esitettyyn nukleoti-disekvenssiin nähden. Täten lacZrn ja geenin ylävirtaan • · * *···* 30 papM: stä välisen hybridigeenin sekä geenin papM ilmentymi- • · nen on geenin IacZ ilmentymissignaalien kontrollissa.
:***· 11.2. Geenin papM tuotteen ilmentäminen kannassa E. 4¾ ···
coli DH5a I
* · •t Plasmidit pVRC706 ja pMTL23 vietiin transformoimal- II* *···* 35 la kantaan coli DH5a ja niiden geenien ilmentymistä • · · · · • i 117674 113 tutkittiin olosuhteissa, joissa geenin IacZ promoottori indusoituu, kuten jo on kuvattu (Maniatis et ai♦, 1989).
Plasmidin pVRC706 käsittävää coli -kantaa tai verrokki-plasmidia pMTL23 viljeltiin 500 ml:ssa runsasravinteista 5 LB-kasvualustaa, joka sisälsi 100 pg/ml ampisilliiniä ja pitoisuuden 1 mM 1PTG, joka teki mahdolliseksi geenin IacZ ; promoottorin induktion. Nämä viljelmät otetaan talteen niiden saavutettua O.D.600-arvon noin 1 ja valmistetaan proteiiniuutteet, kuten kuvataan alla.
10 11.3. colissa ilmennetyn geenin papM tuotteen aktiivisuuden määritys
Geenin papM koodittamaa proteiinia vastaava aktiivisuus määritetään kahdelle uutteelle, jotka valmistettiin lähtien coli -viljelmistä, jotka käsittävät plasmidin 15 pVRC706 tai plasmidin pTML23, esimerkki 5.7.). Osoitettiin, että kannasta coli::pVRC706 lähtien valmistettu uute katalysoi p-aminofenyylialaniinin metylointia p-dime-tyyliaminofenyylialaniiniksi aktiivisuuden ollessa 235 yk-sikköä/mg, kun tämä aktiivisuus puuttuu verrokkikannan ^ 20 coli::pMTL23 uutteista (katso esimerkki 5.7.I.C.). Nämä * tulokset osoittavat, että on mahdollista ilmentää pris-ί tinaespiraliksen papM-geeni E. colissa ja että vastaava :***: proteiini on hyvinkin entsyymi, joka katalysoi p-aminofe-
• M
·*· nyylialaniinin metylointia p-dimetyyliaminofenyylialanii- «(·» 25 niksi. Tämä esimerkki osoittaa, että on mahdollista ilmen- : tää streptogramiinien biosynteesigeenejä heterologisissa • * · "1/ kannoissa (kuten coli, mutta myös muissa mikro-organis- • · · * meissä) lähtien ilmentämisvektoreista, jotka sopivat anti-bioottiprekursoreiden tai myös luonnollisten tai hybridi- • » · *·!·* 30 antibioottien tuotantoon.
* *
Esimerkki 12 • - ;***. Geenien homologian osoittaminen, jotka liittyvät • · · streptogramiinien biosynteesiin, eri Streptomyceseillä •4 Tämä esimerkki osoittaa, miten on mahdollista **ϊ·* 35 osoittaa hybridoimalla kokonais-DNA:hän homologia, joka • · 114 117674 esiintyy eri geenien välillä, jotka liittyvät streptogra-miinien biosynteesiin eri Streptomyces-kannoilla, jotka tuottavat streptogramiineja.
12.1. Kokonais-DNA:n uuttaminen eri Streptomyce-5 seistä, jotka tuottavat streptogramiineja Tämä esimerkki esittää, miten streptogramiineja tuottavien eri kantojen DNA puhdistettiin. Nämä Strepto- * myces-kannat valittiin taulukossa 1 kuvatuista:
Streptomyces loidensis 10 Streptomyces olivaceus
Streptomyces ostreogriseus Streptomyces virglnae
Streptogramiineja ei-tuottava kanta, Streptomyces hygroscopicus, valittiin negatiiviseksi verrokiksi.
15 Eri kokonais-DNA:iden uutot suoritettiin lähtien viljelmistä YEME-kasvualustassa, kuten kuvattiin esimerkissä 1.
12.2. Streptogramiineja tuottavien kantojen kokonais-DNA: iden hybridisaatio DNA-fragmentteihin, jotka si- 20 sältävät geenejä, jotka liittyvät pristinamysiinien biosynteesiin ja on eristetty kannasta S_j_ pristinaespiralis SP92 I i Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista läh- • · · ··· tien geeneistä, jotka liittyvät pristinamysiinien biosyn- • · · · 25 teesiin ja on eristetty kannasta SP92, kuten on kuvattu • .·. edeltävissä esimerkeissä, osoittaa homologisia geenejä ··· * S*.' hybridoimalla kokonais-DNA:itä streptogramiinien muista • · · tuottajakannoista.
, Koettimena käytetty DNA-fragmentti oli: • * * ···* 30 3,6 ke:n XhoI-XhoI-fragmentti, joka eristettiin • · '...* pVRC1106:sta, jota kuvattiin esimerkissä 6.5. ja jonka <· 1 ·***· restriktiokartta esitetään kuviossa 18. Tämä fragmentti • · ·
....; sisältää osan pristinamysiini I -syntaasi-ll:ta kooditta- I
•t vasta geenistä.
• · · ··· ·** *····' ♦ · 117674 115 6 ke:n BamHl-BamHI-fragmentti eristettiin plasmi-dista pXL2045, jota kuvattiin esimerkissä 6.3. ja jonka restriktiokartta esitetään kuviossa 16. Tämä fragmentti sisältää PIIA-syntaasin kahden alayksikön rakennegeenit.
5 Neljän streptogramiineja tuottavan kannan, kannan S. hygroscopicus sekä kannan SP92 kokonais-DNA, pilkottiin restriktioentsyymeillä BamHl ja XhoI. Näin saadut DNA-fragmentit erotettiin 0,7-%:isessa agaroosigeelissä ja DNA siirrettiin nailonmembraanille, kuten kuvaavat Maniatis et 10 ai. (1989). 3,6 ke:n XhoI-XhoI-fragmentin ja 6 ke:n BamHl-BamHI -fragmentin leimaaminen suoritettiin leimaamalla sa-tunnalspohjustuksella, kuten kuvattiin esimerkissä 9.1.2. Membraanien hybridisaatiot suoritettiin 50 %:n formamidia läsnä ollessa 42 °C:n lämpötilassa, kuten kuvataan julkai-15 sussa Maniatis et ai. (1989). Membraanien pesut hybridi-saation jälkeen suoritettiin 50 ja 60 °C:ssa liuoksessa, joka sisältää SSC:tä (Maniatis et ai., 1989), jota on laimennettu 10 kertaa, sekä 0,1 % SDS:ää.
Nämä hybridisaatiot osoittavat seuraavat tulokset: 20 Kanta hygroscopicus ei osoita mitään hybridisaa tiota käytettyyn kahteen koettimeen.
Kokonais-DNA (jota on pilkottu XhoI: llä ja j***: BamHIrllä) kannoista S. ostreogriseus, S. olivaceus, S.
* * * .j. loidensis ja virginae osoittavat kaikkia hybridisaatio- ··· 25 signaaleja, joiden intensiteetti on verrattavissa signaa- • * • leihin, jotka todettiin kannan SP92 kokonais-DNA: 11a käy-'···.
“!.* tetyillä kahdella koettimella.
f · · • · · * Tämä esimerkki osoittaa, että streptogramiineja tuottavat eri Streptomyces-kannat käsittävät geenejä, jot- • · · *·ί·* 30 ka hybridoituvat S. pristinaespiraliksesta SP92 eristet-
Ml * * tyihin geeneihin ja liittyvät streptogramiinien biosyntee- .***. siin, kuten kuvataan edeltävissä esimerkeissä. Nämä hybri- M· .,,,· disaatiot osoittavat myös homologian, joka esiintyy gee- * · • nien, jotka liittyvät streptogramiinien kannasta SP92 bio- 35 synteesiin, ja niiden, jotka liittyvät streptogramiinien • ••M • * 117674 116 biosynteesiin muista streptogramiineja tuottavista kannoista, välillä.
Tämä esimerkki osoittaa siis, että on mahdollista lähtien SP92:sta eristetyistä geeneistä, jotka liittyvät 5 streptogramiinien biosynteesiin, eristää hybridisaatiolla ja kloonaamalla homologisia geenejä, jotka esiintyvät muissa streptogramiineja tuottavissa kannoissa.
Esimerkki 13
Eri pristinaespiralis SP92 -geenien, jotka liit-10 tyvät pristinamysiinien I ja pristinamysiinien II biosynteesiin, fyysisen sitoutumisen tutkiminen Tämä esimerkki esittää, miten on mahdollista tutkia S. pristinaespiralis SP92 -geenien, jotka liittyvät pristinamysiinien I ja II biosynteesiin, fyysistä sitoutumis-15 ta. Tämä tutkimus suoritettiin päämääränä osoittaa, että ώ kaikki nämä geenit ovat ryhmittyneet kromosomiin rykelmäksi, jolloin on mahdollista kromosomikävelyllä lähtien jo identifioiduista geeneistä eristää muita geenejä, jotka liittyvät pristinamysiinien I ja II biosynteesiin. Tällai-20 nen kävely voidaan kuvitella geeneille, jotka liittyvät muiden streptogramiinien biosynteesiin.
• Φ · | 13.1. Sykäyskenttäelektroforeesissa käytetyt res- ί **j triktioentsyymit ··· S. pristinaespiralis SP92 -genomi koostuu 70 - 75 • · · ♦ 25 %:sta emäksiä G ja C sisältäviä nukleotidejä. Sen genomin • .·. leikkaamiseksi pieneksi määräksi suuria fragmentteja käy- f 1 s .··/ timme entsyymejä, jotka tunnistavat AT-rikkaan sekvenssin, • · * kuten Asel (AT/TAAT), SspI (AAT/ATT) mutta myös HindiII (A/AGCTT), EcoRI (G/AATTC), Ndel (CA/TATG) ja Clal (AT/ • · · ’»·' 30 CGAT).
##··# *···1 13.2. Sykäyskenttäelektroforeesissa käytettyjä S.
:***: pristinaespiralis -kantoja • · 1 Käytimme kromosomi-DNA:ta useammista kannoista tut- 1 \ kiaksemme sykäyskenttäelektroforeesilla pristinamysiinien • · · *·”1 35 I ja pristinamysiinien II biosynteesiin liittyvien geenien · 117674 117 fyysistä sitoutumista. Valmistimme inserttejä esimerkissä 4.1. kuvatun mukaisesti kannan pristinaespiralis kromo-somi-DNA:sta mutta myös SP92-johdannaiskantojen kromosomi-DNAista, joiden rakentamista kuvataan esimerkeissä 9.1. ja 5 9.4. Kyseessä on kanta SP92::pVRC505, jonka snaA-geeniä on häiritty integroimalla plasmidi pVRC505 (esimerkki 9.1.), $ ja kanta SP92::pVRC404, jonka snbA-geeniä on häiritty integroimalla plasmidi pVRC404 (esimerkki 9.4.). Nämä kaksi viimeistä kantaa sisällytettiin tähän tutkimukseen, koska 10 ne tekivät mahdolliseksi sijoittaa tarkasti geenit snaA ja snbA kromosomikarttaan käyttämällä kromosomi-DNA:ta harvoin leikkaavien kohtien Asel, SspI, Hindlll, EcoRI, Ndel ja Clal läsnäoloa plasmideissa pVRC505 ja pVRC404.
13.3. DNA-koettimet, joita käytettiin sykäyskenttä-15 elektroforeesilla eristettyjen fragmenttien hybridisaa- tioissa Käytimme eri DNA-fragmentteja radioaktiivisesti * leimattujen koettimien saamiseksi, kuten kuvataan esimer- ; kissä 9.1. ja hybridoimme ne fragmentteihin, jotka oli 20 erotettu sykäyskenttäelektroforeesilla sen jälkeen kun kolmen edellä läsnä olevan kannan (esimerkki 4.2.) kromo- • · · • *,! somi-DNA-inserttejä oli entsymaattisesti leikattu. Koettiin*: met ovat seuraavat: plasmidista pVRC701 eristetty 3,2 ke:n
·;· EcoRI-BamHI-fragmentti, joka käsittää geenit snaB ja samS
···· - - - -- 25 (vrt. esimerkki 9.2.), plasmidista pVRClOOO eristetty 1,5 J ,·, ke:n BamHI-Sstl-fragmentti, joka käsittää osan geenistä .···! snaD (vrt. esimerkki 6,8,), plasmidista pVRC402 eristetty 1,1 ke: n Xhol -Hindi 11 - fragmentti, joka käsittää geenin . snbA (vrt. esimerkki 6.1.), plasmidista pVRC900 eristetty * · ♦
‘»f 30 2,4 ke:n Pstl-Pstl-fragmentti, joka käsittää geenin papA
• · *···* (vrt. esimerkit 6.7. ja 8.8.) ja plasmidista pVRC509 eris- ;***; tetty 1,5 ke:n Xhol-Pstl-fragmentti, joka käsittää geenin ····· snaC (vrt. esimerkki 6.9.). . . . 3 • · • « · ··· * ' ····· • · 117674 118 13.4. Pristinamysiinien I ja II biosynteesiin liittyvien eri geenien paikantaminen kromosomissa ja niiden fyysisen sitoutumisen tutkiminen
Hybridisaatiot edellä kuvattuihin eri koettimiin ΐ 5 kromosomi-DNA:11a kannoista pristinaespiralis SP92, SP92::pVRC404 ja SP92::pVRC505, jota on leikattu yksin- ί kertaisilla pilkkomisilla ja kaksoispilkkomisilla kuuden edellä mainitun entsyymin avulla, johtivat yleiskarttaan, joka esitetään kuviossa 32: tärkeiden kohtien asema on 10 merkitty, sekä pristinamysiinien PI ja PII biosynteesiin liittyvien geenien asema ja transkription suunta. Näin on voitu laskea etäisyys, joka erottaa 3 kromosomialuetta, jotka sisältävät identifioituja geenejä: geenien snbA, snbR, papA ja papM (kosmidi pIBV2, esimerkki 5.2.), gee-15 nien snaA, snaB, samS, snap, snbC, snbD, snbE (kosmidit pIBVl ja 3, esimerkki 5.1.), ja lopuksi geenin snaC (kosmidi pIBV4, esimerkki 5.6.). Esimerkiksi geenien snaA ja snbA etäisyydeksi arvioitiin noin 160 - 170 ke. Tämä osoittaa, että jo identifioidut geenit sisältyvät kaikki 20 alueeseen, joka kattaa vain 200 ke kannan pristinaespiralis kromosomista, tai alle 3 % genomin kokonaispituudes- ·· · • ’,ί ta, jonka pystyimme arvioimaan 7 500 ke:ksi sykäyskenttä- elektroforeesitekniikalla.
«·· ·1· Nämä tulokset osoittavat, etä geenit, jotka liitty- *··* ;··; 25 vät pristinamysiinien I ja II biosynteesiin, ovat ryhmit- : tyneet kromosomiin rykelmäksi, jolloin on mahdollista kro- ,···, mosomikävelyllä jo identifioiduista geeneistä lähtien • · 1 eristää muita geenejä, jotka liittyvät pristinamysiinien . 1 ja pristinamysiinien II biosynteesiin. Yleisemmin on • · · •|·* 30 mahdollista kromosomikävelyllä lähtien mistä tahansa gee- • · ’···1 nistä, joka liittyy streptogramiinien biosynteesiin, iden- :***: tifioida muita tähän biosynteesiin liittyviä geenejä.
' ·** • MM • « • · · • · · ··· · 117674 119
Taulukko 1
Mikro-organismi Antibiootti
Sienet
Micromonospora sp. vernamysiinit 5 Streptomyces S. alborectus virginiamysiinit
S. conganensis (ATCC13528) F1370 A, B
diastaticus plaurasiinit, streptogramiinit 10 graminofasciens streptogramiinit S. griseus (NRRL2426) viridogriseiini (etamysiini) S. griseovlridus griseoviridiini griseoviridus (FERMP3562) neoviridogriseiinit 15 S_. lavendulae etamysiinit S. loidensis (ATCC11415) vernamysiinit S. mitakaensis (ATCC15297) mikamysiinit S. olivaceus (ATCC12019) synergistiinit (PA114 A, B) 20 ostreogriseus (ATCC27455) ostreogrysiinit S. prlstinaespiralis (ATCC25486) pristinamysiinit •» · ; 1,! S_^ virginae (ATCC13161) virginiamysiinit (stafylomysiinit) ··· Actinomycetes ···1 ....j 25 A^ auranticolor (ATCC31011) plaurasiinit j ,·. A. azureus (ATCC31157) plaurasiinit • · · — —— .···! A. daghestanicus etamysiini • · ·
A. philippinensis A-2315 A, B, C
. Actinoplanes sp. (ATCC33002) A15104 • · ·
30 Actinoplanes sp. A17002 A, B, C, F
• » *···1 Actinomadura flava madumysiinit • 1 “ • Φ · • 9 • · ··· • '5 • · · ♦ · .
• 1 m • 1 · ··· ··
Mi • · 117674 120 Käytetyt lyhenteet DNA: deoksiribonukleiinihappo AMP: adenosiini-5'-monofosfaatti ATP: adenosiini-5'-trifosfaatti 5 BET: etidiumbromidi bis-tris: (bis[2-hydroksietyyli]imino-trls[hydroksimetyy- ? li]metaani bis-tris-propaani: (1,3-bis[tris(hydroksimetyyli)metyyli-amino]propaani) 10 BSA: nautaseerumialbumiini HPLC: korkeapainenestekromatografia O.D.: optinen tiheys DTE: ditioerytritoli DTT: ditiotreitoli 15 E64: trans-epoksisukkinyyli-L-leusyyliamido-( 4-guanidino)- butaani EDTA: etyleenidiamiinitetraetikkahappo EGTA: etyleeniglykoli-bis(B-aminoetyyli)tetraetikkahappo FMN: flaviinimononukleotidi 20 FMNH2: pelkistynyt flaviinimononukleotidi
Hepes: (N-[2-hydroksietyyli]piperatsiini-N'-[2-etaanisul- ·· · • fonihappo]) :*J“; IPTG: isopropyyli-B-D-tiogalaktopyranosidi ·· kD: kilodalton «··· ·...: 25 ke: kiloemäs • · ί ,·. LB: Luria-liemi (runsasravinteinen kasvualusta E. colille) *·* * - - .···] NAD: nikotiiniamididinukleotidi • · · NADH: pelkistynyt nikotiiniamididinukleotidi , PAGE: polyakryyliamidigeelielektroforeesi • · · '•|·* 30 ep: emäspari • · *···* PMSF: fenyylimetyylisulfonyylif luoridi ·**’· PPi: pyrofosfaatti • · · kierr./min: kierrosta/minuutti ·φ a.s.: ammoniumsulfaatti • « · *·’·* 35 SAM: S-adenosyylimetioniini ····· * · 117674 121 SDS: natriumdodesyylisulfaatti STI: soijan trypsiini-inhibiittori TE: 10 mM Tris-HCl-puskuri, 1 mM EDTA, pH 7,5 Tris: amino-2-hydroksimetyyli-2-propaanidioli-l,3 5 UV: ultraviolettisäteet X-gal: 5-bromi-4-kloori-3-indoyyli-B-D-galaktosidi YEME: hiivauute-mallasuutekasvualusta (runsasravinteinen kasvualusta Streptomycesille) PEG: polyetyleeniglykoli 10 LMP: Low Melting Point (alhainen sulamispiste) mp.: molekyylipaino • · · ...
* · t 1 • 1 1 »·· * · · * ····, • · • · **· ···' • · 1 · „ · • · 1 ····' * · · • · · • · * · · • 1 · * 1 • · ·· * * · · • · • · • · · • 1 · 1 · • · * ··· • · · * 1 1 1 1 · · • · - 122 117674 pihliographie : - Anzai H., Murakami T., Imai A., Satoh A., Nagaoka K. et Thompson C. J.
(1987) J. BacterioL, 169 : 3482-3488.
- Bancroft I. et WolK C. P. (1989) J. BacterioL, 171: 5949-5954.
- Bibb M. J., Findlay P. R. et Johnson M. W. (1984) Gene, 30 : 157-166.
- Bimboim H. C. et DolyJ. (1979) Nucleic Acids Res., 7 : 1513-1523.
- Blattner F. R., Williams B. G., Blechl A. E., Denniston-Thompson K., Faber H. E., Furlong L. A., Grunwald D. J., Kiefer D. O., Moore D.D., Schumm J.W., Sheldon E. L. et Smithies O. (1977) Science, 196 :161-169.
- Bolivar F., Rodriguez R. L., Greene P. J., Betlach M. C, Heynecker H. L„ Boyer H. W., CrosaJ. H. et Falkow S. (1977) Gene, 2 : 95-113.
- Boyer H. W. et Roulland-Dussoix D. (1969) J. Mol. Biol., 41 : 459.
- ChaterK. F. (1990) Bio/Technology, 8 : 115-121.
- Cocito C. G. (1979) Microbiol. Rev., 43 : 145-198.
- Cocito C. G. (1983) In Antibiotics, 6 : (Ed. F. E. Hahn), 296-332.
- Dessen P. C., Fondrat C., Valencien C. et Mugnier C. (1990) Comp. Appi. in Biosciences, 6 : 355-356.
- Di Giambattista M„ Chinali G. et Cocito C. G. (1989) J. Antim. Chemother., 24 : 485-507.
- Femandez-Moreno M. A., Caballero J. L., Hopwood D. A. et Malpartida F.
(1991) Cell, 66:769-780.
- Gibson T. J. (1984) Ph.D. thesis, Cambridge University, England.
- Hallam S. E., Malpartida F. et Hopwood D. A. (1988) Gene, 74 : 305-320.
- Hames B. D. et Higgins S. J. (1985) IRL Press Ltd., Oxford, U. K., - Hanahan D. (1983) J. Mol. Biol. , 166 :557 - Hillemann D.f Piilher A. et Wohlleben W. (1991) Nucl. Acids Res., 19 : 727-731.
- Hohn B. et Collins J. F. (1980) Gene, 11 : 291-298.
- Hook J. D. et Vining L. C. (1973) J.C.S. Chem. Comm., 185-186.
- Hopwood D. A., Bibb M. J., ChaterK. F., KieserT., Bruton C.J., KieserH. M., LydiateD. J., Smith C. P.t Ward J. M. etScrempfH. (1985)4 laboratory manual., The John Innes Fondation, Norwich, England.
·.· · - Hopwood D. A., Bibb M. J., Chater K. F., Janssen G. R., Malpartida F. et Smith C. (1986b) In Regulation of gene expression -25years on (ed. I; A. Booth C; F. Higgins), 251-276.
- Hopwood D. A., Malpartida F., Kieser H. M., Ikeda H., Duncan J., Fujii I., Rudd ί A. M., Floss H. G. et Omura S. (1985a) Nature, 314 : 642-644.
.···. - Hopwood D. A., Malpartida F., Kieser H. M., Ikeda H. et Omura S. (1985b) In **;·* Microbiology (ed S. Silver). American Society for Microbiology, Washington D.
: C, 409-413.
- Hopwood D. A., Malpartida F. et Chater K. F. (1986a) In Regulation of *. * secondary metabolite formation, (eds. H. Kleinkauf, H. von Hohren, H. Dornauer : *’j G. Nesemann), 22-33.
***. - Hoshino T„ Ikeda T., Tomizuka N. et Furukawa K. (1985) Gene, 37: 131-138.
*···· ' ’ * · ^ 123 117674 - Hutchinson C. R., Borell C. W., Otten S. L., Stutzman-Engwall K. J. et Wang Y.
(1989) J. Med. Chem., 32:929-937.
- Ish-Horowitz D. et Burk J. F. (1981) Nucleic Acids Res., 9 : 2989-298.
- Kanehisa M. I. (1984) Nucleic Acids Res., 12 : 203-215.
- Kay R. et McPherson J. (1987) Nucleic Acids Res., 15 (6): 2778.
- Khan S. A. et Novick R. (1983) Plasmid, 10 : 251-259.
- Kingston D. G. I., Kolpak M. X, Lefevre W. et Borup-Grochtmann I. B. (1983) J, Am. Chem. Soc., 105 : 5106-5110.
- Kyte J. et Doolittle R. (1982) J. Biol Mol, 157 : 105-135.
- Low B. (1968) Proc. Nall Acad. Scl, 60 : 160.
- Lydiate D. J., Malpartida F. et Hopwood D. A. (1985) Gene, 35 : 223-235.
- Maniatis T., Fritsh E. F. et SambrookJ. (1989) Molecular cloning : a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y., - MeinkothJ. et Wahl G. (1984) Anal Biochem., 138 : 267-284.
- Messing J., Crea R. et SeeburgP. H. (1981) Nucleic Acids Res., 9 : 309.
- Neal R. J. et Chater K. F. (1987) Gene, 58 : 229-241.
- Ohnuki T., Imanaka T. et Aiba S. (1985) J. Bacterial, 164 : 85-94.
- Sawadogo M. et Van Dyke M. W. (1991) Nucl. Acids Res., 19 : 674. ' - Staad J. F., Elkins M. F. et Earhart C. F. (1989) FEMS Microbial Lett., 59 :15.
- Staden R. et McLachlan A. D. (1982) Nucleic Acids Res., lO : 141-156.
- Videau D. (1982) Path. Biol, 30 : 529-534.
- Chambers S. P., Prior S. E., Barstow D. A. et Minton N. P. (1988) Gene, 68:139.
- Gutierrez S., Diez B., Montenegro E. et Martin J.F. (1991) Journal of bacteriology, 173: 2354-2365.
- Hori K„ Yamamoto Y., Minetoki T., Kurotsu T„ Kanda M., Miura S., Okamura K. , Kuruyama J. et Saito Y. (1989) J. Biochem., 106: 639-645.
:*·*: - Horikawa S., Ishikawa M., Ozaka H. etTsukada K. (1989) Eur.J. Biochem., ; )···*. 184:497-501.
*··;* - Kaplan J„ Merkel W. et Nichols B. (1985) J. Mol. Biol., 183: 327-340.
..)·* - Markham G.D., DeParasis J. et Gatmaitan J. (1984) J. Biol. Chem., 259:14505- ....: 14507.
., -SharkaB., Westlake D, W. S.etViningL. C. (1970) Chem. Zvesti, 24: 66-72.
:.:: - Thomas D., Rothstein R., Rosenberg N. et Surdin-Kerjan Y. (1988) Mol. Cell.
Biol., 8: 5132-5139.
- Turgay K. et al (1992) Molecular Microbiology, 6(4): 546.
- Weckermann R., FYrbab R. et Marahiel M.A. (1988) Nucl. Acids Res., 16: 11841 .···. - Yanisch-Perron C., Vieira J. et Messing J. (1985) Gene, 33: 103-119.
’·;·* - Zimmer W., Aparicio C. et Elmerich C. (1991) Mol. Gen. Genet., 229:41-51.
.'··. - Reed et al. J.Nat.Prod 49 (1986) 626 ‘-I - Molinero et al., J.Nat.Prod 52 (1989) 99 - Reed et al. J.Org.Chem. 54 (1989) 1161 , )., - Watanabe et al., Mol.Cell.Biochem. 44 (1982) 181 '·") -Jablonski et al., Biochemistry 16 (1977) 2832 *:**: - Duane et al., Mol.Cell.Biochem. 6 (1975) 53.
117674 124
LTSTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE: (i) DEPOSANT: (A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, avenue Raymond ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(ii) TITRE DE L' INVENTION : POLYPEPTIDES TMPLTQUES DANS LA
BIOSYNTHESE DES STREPTOGRAMINES, SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CODANT POUR CES POLYPEPTIDES ET UTILISATIONS.
(lii) NOMBRE DE SEQUENCES: 16 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 5392 paires de bases * (B) TYPE: aclde nucleique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: lingaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
·· ·
• ·* (iii) ANTI-SENS: NON
• · .
f · '*·.·’ (vi) ORIGINE: ·;· (A) ORGANISME: Streptomyces pristinaespiralis .¾ *··* (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: • · · * · · *".* GGATCCTGGC GTCCGCCGTC AAGAACTGAA CCGAGGAGAC ACCCACCATG ACCGCACCCC 60 • · · * · * GCCGGCGCAT CACCCTCGCC GGCATCATCG ACGGCCCCGG CGGCCATGTG GCCGCCTGGC 120 . GCCACCCGGC GACCAAGGCG GACGCCCAGC TCGACTTCGA ATTCCACCGC GACAACGCCC 180 • · * · · "I GCACCCTCGA ACGCGGCCTG TTCGACGCCG TGTTCATCGC GGACATCGTC GCCGTGTGGG 240 • * • · *" GCACCCGCCT GGACTCCCTG TGCCGCACCT CGCGCACCGA GCACTTCGAA CCGCTCACCC 300 • · · *···* TGCTCGCCGC CTACGCCGCG GTCACCGAGC ACATCGGCCT GTGCGCCACC GCCACCACCA 360 CGTACAACGA ACCGGCGCAC ATCGCCGCCC GCTTCGCCTC CCTCGACCAC CTCAGCGGCG 420 • " ' ·ΐ :,·.ϊ GCCGGGCCGG CTGGAACGTC GTCACCTCCG CCGCACCGTG GGAGTCCGCC AACTTCGGCT 480 ' TCCCCGAGCA CCTGGAGCAC GGCAAACGCT ACGAGCGGGC CGAGGAGTTC ATCGACGTCG 540 117674 125 TCAAAAAACT GTGGGACAGC GACGGCCGCC CCGtCGACCA CCGCGGCACC CACTTCGAGG 600 CCCCCGGCCC GCTCGGGATC GCCCGCCCCC CGCAGGGCCG CCCCGTCATC ATCCAGGCCG 660 GCTCCTCGCC GGTGGGACGC GAGTTCGCCG CCCGGCACGC CGAGGTCATC TTCACCCGGC 720 ACAACCGGCT CTCCGACGCC CAGGACTTCT ACGGCGACCT CAAGGCACGC GTCGCCCGGC 780 ACGGCCGCGA CCCCGAGAAG GTCCTCGTGT GGCCGACCCT CGCGCCGATC GTCGCCGCCA 840 CCGACACCGA GGCGAAGCAG CGCCTGCAGG AACTGCAGGA CCTCACCCAC GACCATGTCG 900 CCCTGCGCAC CCTTCAGGAC CACCTCGGCG ACGTCGACCT GAGCGCGTAC CCGATCGACG 960 GGCCCGTCCC CGACATCCCG TACACCAACC AGTCCCAGTC GACGACCGAG CGGCTGATCG 1020 GCCTGGCCAG GCGCGAGAAC CTCAGCATCC GCGAGCTGGC CCTGCGGCTG ATGGGCGACA 1080 TCGTCGTCGG CACACCGGAG CAGCTCGCCG ACCACATGGA GAGCTGGTTC ACCGGCCGCG 1140 GCGCCGACGG CTTCAACATC GACTTCCCGT ACCTGCCGGG CTCCGCCGAC GACTTCGTCG 1200 ACCACGTGGT GCCCGAACTG CAGCGCCGCG GCCTGTACCG CTCGGGCTAC GAGGGCACCA 1260 CCCTGCGGGC CAACCTCGGC ATCGACGCCC CCCGGAAGGC AGGTGCAGCG GCTTGACTTC 1320 CGTCCTAAAG GCGGGGGATT CCAGCGGTCG CCCGCTGGGG TTCCTGCTTC ACCGACGACC 1380 GCCCCGTCCG GGAGGACTCC CGTTGAGGTC TTATACCGTC TCCACAGGCC GACGCCGCCA 1440 GCCCGGCGGC CAGGATGTTG CGTGCCGCAT TCACGTCGCG GTCATGCACA GCGCCGCAGT 1500 CGCACGTCCA CTCCCGGACG TTCAGCGGCA GCTTCCCGCG GACCGTGCCG CAGGTTCCGC 1560 ACAGCTTGGA GCTGGGGAAC CAGCGGTCGA TCACGACGAG TTCGCGCCCA TACCAGGCGC 1620 ACTTGTACTC CAGCATGGAG CGCAGTTCCG TCCAGGCCGC GTCGGAGATG GCGCGCGCGA 1680 • · • · .1··. GCTTGCCGTT CTTCAGCAGG TTGCGGACGG TGAGGTCCTC GATCACGACC GTTTGGTTCT 1740 • · # CACGGACGAG TCGAGTCGAC AGCTTGTGGA GGAAGTCGCA GCGCCGGTCG GTGATCCGGG 1800
• •M
...·· CGTGGACGCG GGCGACCTTG CGGCGGGCTT TCTTCCGGTT CGCCGACCCC TTCGCCTTGC 1860 ; ·1· GCGACACGTC CCGCTGAGCC TTCGCGAGGC GGGCGCGGTC ACGGCGCTCG TGCTTGGGGT 1920 • » · · ' ;1·1; TGGTGATCTT CTCCCCGGTG GACAGGGTCA CCAGGGAGGT GATCCCGGCG TCGATGCCGA 1980 * CGGCCGCCGT GGTGGCGGGC GCGGGGGTGA TGGTGTCCTC GCACAGCAGG GACACGAACC 2040 • ·1· AGCGGCCCGC ACGGTCGCGG GACACGGTCA CCGTCGTCGG CTCCGCCCCT TCGGGAAGGG 2100 • · · ·"1· GACGGGACCA GCGGATGTCC AGGGGCTCCG CGGTCTTCGC CAGCGTGAGC TGTCCGTTAC 2160 9 · · .1.^ GCCACGTGAA GGCGCTGCGG GTGTACTCGG CCGACGCCCT GGACTTTTTC CGCGACTTGT 2220 » · ACCGCGGGTA CTTCGACCGC TTGGCGAAGA AGTTGGCGAA CGCCGTCTGC AAGTGCCGCA 2280 GCGCCTGCTG GAGCGGGACG GAGGACACCT CCGAGAGGAA GGCGAGTTCT TCGGTCTTCT 2340 • · · ’··2 TCCACTCCGT CAGCGCGGCG GACGACTGCA CGTAGGAGAC CCGGCGCTGC TCGCCGTACC 2400 2 • · 117674 126 AGGCTCGCGT GCGCCCCTCA AGCGCCTTGT TGTACACGAG GCGGACACAG CCGAACGTGC 2460 GGGACAGCTC AGCCGCCTGC TCGTCCGTGG GATAAAAGCG GTACTTGAAA GCCCGCTTGA 2520 CCTGCTGCAT CACGCCTCAC ACGCTATCAG TTCCCGTGTG AGCGGCGGGT GTCTGCCGGT 2580 GGTTGCAGAC GCCGAACCGC CCTGGCGGCG ATTCGCCCAT CCCTGCCCTG CTCCGCAAGA 2640 GCTTCGTCTC CTCCCCGGTC TGAAGGCCGG GGTATCCACG AAGGAATTCT GATGACCGCG 2700 CCCATCCTCG TCGCCACCCT CGACACCCGC GGCCCCGCCG CCACCCTCGG CACGATCACC 2760 CGCGCCGTGC GGGCCGCGGA GGCCGCCGGA TTCGACGCCG TCCTGATCGA CGACCGGGCC 2820 GCCGCCGGCG TCCAGGGCCG GTTCGAGACG ACGACGCTGA CCGCCGCGCT GGCCGCCGTC 2880 ACCGAGCACA TCGGCCTGAT CACCGCCCCG CTCCCGGCCG ACCAGGCCCC CTACCACGTG 2940 TCCCGGATCA CCGCCTCGCT CGACCACCTC GCCCACGGCC GCACCGGCTG GCTCGCGAGC 3000 ACGGACACCA CCGACCCCGA GGGCCGCACC GGCGAACTCA TCGACGTCGT CCGCGGCCTG 3060 TGGGACAGCT TCGACGACGA CGCCTTCGTC CACGACCGCG CCGACGGCCT GTACTGGCGG 3120 ; CTGCCCGCCG TCCACCAACT CGACCACCAG GGCAGGCACT TCGACGTGGC CGGCCCCCTC 3180 AACGTCGCCC GCCCGCCGCA GGGCCACCCC GTCGTCGCCG TCACCGGCCC CGCCCTCGCC 3240 GCGGCCGCCG ACCTCGTCCT GCTCGACGAG GCGGCCGACG CCGCCTCGGT GAAGCAGCAG 3300 GCACCGCACG CCAAGATCCT CCTGCCGCTG CCCGGCCCGG CCGCCGAACT GCCCGCCGAC 3360 AGCCCCGCGG ACGGCTTCAC GGTGGCGCTC ACCGGCTCCG ACGACCCGGT CCTGGCCGCG 3420 CTCGCCGCCC GGCCCGGCCG CCCGGACCGC ACCGCGGCCA CCACCCTGCG CGAACGCCTG 3480 .. . GGCCTGGCCC GCCCCGAGAG CCGCCACGCC CTCACCACCG CCTGACGACC CGTCCGCCCG 3540 • · · · CTGCTTCCTG GAGAGTCATG TCCCGTCGCC TGTTCACCTC GGAGTCCGTG ACCGAGGGCC 3600 • · *·*;" ACCCCGACAA GATCGCCGAC CAGATCAGTG ACACCGTCCT CGACGCCCTG CTGCGCGAGG 3660 • * · ·*·*, ACCCCGCCTC ACGCGTCGCG GTCGAGACCC TGATCACCAC CGGCCAGGTC CACATCGCCG 3720 • · . # GCGAGGTCAC CACCAAGGCG TACGCGCCCA TCGCCCAACT GGTCCGCGAC ACGATCCTGG 3780 • · · • · · CCATCGGCTA CGACTCGTCC GCCAAGGGCT TCGACGGCGC CTCCTGCGGC GTCTCCGTCT 3840 • · · t · * * CCATCGGCGC GCAGTCCCCG GACATCGCCC AGGGCGTCGA CAGCGCCTAC GAGACCCGCG 3900 . TCGAGGGCGA GGACGACGAG CTCGACCAGC AGGGCGCCGG CGACCAGGGC CTGATGTTCG 3960 • · • · · I” GCTACGCCAC CGACGAGACC CCCTCGCTGA TGCCGCTGCC CATCGAGCTC GCCCACCGCC 4020 • · • · *" TCTCGCGCCG GCTCACCGAG GTCCGCAAGG ACGGCACCGT CCCCTACCTG CGCCCCGACG 4080 ··· « · 1 GCAAGACCCA GGTCACCATC GAGTACCAGG GCAGCCGCCC GGTGCGCCTG GACACCGTCG 4140 4
• ’J
TCGTCTCCTC CCAGCACGCC GCCGACATCG ACCTCGGCTC CCTGCTCACC CCCGACATCC 4200 : i ί GCGAGCACGT CGTCGAGCAC GTCCTCGCCG CACTCGCCGA GGACGGCATC AAGCTCGAGA 4260 ··· ♦ *"*ί CGGACAACTA CCGCCTGCTG GTCAACCCGA CCGGCCGTTT CGAGATCGGC GGCCCGATGG 4320 117674 127 GCGACGCCGG CCTGACCGGC CGCAAGATCA TCATCGACAC GTACGGCGGC ATGGCCCGCC 4380 ACGGCGGTGG CGCGTTCTCC GGCAAGGACC CGTCCAAGGT CGACCGTTCC GCCGCGTACG 4440 CGATGCGCTG GGTCGCCAAG AACGTCGTCG CCGCGGGCCT CGCCTCCCGC TGCGAGGTCC 4500 AGGTCGCCTA CGCCATCGGC AAGGCCGAGC CGGTCGGCCT GTTCGTCGAG ACGTTCGGCA 4560 CCGGCACCGT CGCCCAGGAG CGCATCGAGA AGGCCATCAC CGAGGTCTTC GACCTGCGCC 4620 CCGCGGCCAT CATCCGCGAC CTCGACCTGC TGCGGCCCAT CTACGCCGCC ACCGCCGCCT 4680 ACGGCCACTT CGGCCGCGAA CTGCCCGACT TCACCTGGGA GCGGACCGAC CGCGCCCACC 4740 GGCTCAAGGC CGCGGCCGGT CTCTGAGCCG GCCGGACCTG TGAGGAGACC TGACGTGCGC 4800 ATCGCTGTCA CCGGTTCCAT CGCCACCGAC CATCTGATGG TCTTCCCCGG CCGGTTCGCG 4860 GATCAGCTGA TCCCCGACCA GCTCGCTCAT GTCTCGCTCT CCTTCCTGGT CGACGCACTC 4920 GAGGTGCGCC GGGGCGGAGT GGCGGACAAC GTCGCCTTCG GCCTCGGCGG CCTCGGCCTC 4980 ACCCCCCAGC TGGTCGGCGC CGTGGGCAGC GACTTCGCCG AGTACGAGGT CTGGCTCAAG 5040 GAACACGGCG TCGACACCGG CCCCGTCCTG GTCTCCACCG AGCGGCAGAC CGCCCGGTTC 5100 ATGTGCATCA CCGACCAGGA CTCCAACCAG ATCGCCTCCT TCTACGCGGG CGCCATGCAA 5160 GAGGCCCGCG ACATCGACGT GTGGCACCTG ACCACCGGCA GCGTCCGCCC CGACCTCGTC 5220 CTGGTCTGCC CGAACGACCC GGCGGCGATG CTGCGCCACA CGGGGAGTGC CGCGAAACTG 5280 GGCCTGCCGT TCGCCGCCGA CCCCTCCCAG CAGCTCGCCC GCCTGGAGGG AGGGAGGTAC 5340 GCGAACTCGG TCGACGGGGC CCGTTGGTTT TTCACCAACG AAGTACGAGG CC 5392 ·· · ·*· • ·* (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2: • · a • » "*"* (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: ·;· (A) LONGUEUR: 1269 paires de bases ***· (B) TYPE: acide nucleique *:·*: (C) NOMBRE DE BRINS: double . . (D) CONFIGURATION: lineaire • * * (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
• (lii) HYPOTHETIQUE: NON
. (ill) ANTI-SENS: NON
• · · ♦ * · !“ (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Streptomyces pristinaespiralis ,···. (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
....: (B) EMPLACEMENT: 1..1269 ···".
Ϊ (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: * ··· *:*: ATG ACC GCA CCC CGC CGG CGC ATC ACC CTC GCC GGC ATC ATC GAC GGC 48 128 117674
Met Thr Ala Pro Arg Arg Arg lie Thr Leu Ala Gly He lie Asp Gly 1 5 10 15 CCC GGC GGC CAT GTG GCC GCC TGG CGC CAC CCG GCG ACC AAG GCG GAC 96
Pro Gly Gly His Val Ala Ala Trp Arg His Pro Ala Thr Lys Ala Asp 20 25 30 GCC CAG ere GAC TTC GAA TTC CAC CGC GAC AAC GCC CGC ACC CTC GAA 144
Ala Gin Leu Asp Phe Glu Phe His Arg Asp Asn Ala Arg Thr Leu Glu 35 40 45 CGC GGC CTG TTC GAC GCC GTG TTC ATC GCG GAC ATC GTC GCC GTG TGG 192
Arg Gly Leu Phe Asp Ala Vai Phe He Ala Asp He Val Ala Val Trp 50 55 60 GGC ACC CGC CTG GAC TCC CTG TGC CGC ACC TCG CGC ACC GAG CAC TTC 240
Gly Thr Arg Leu Asp Ser Leu Cys Arg Thr Ser Arg Thr Glu His Phe 65 70 75 80 GAA CCG CTC ACC CTG CTC GCC GCC TAC GCC GCG GTC ACC GAG CAC ATC 288
Glu Pro Leu Thr Leu Leu Ala Ala Tyr Ala Ala Val Thr Glu His He 85 90 95 GGC CTG TGC GCC ACC GCC ACC ACC ACG TAC AAC GAA CCG GCG CAC ATC 336 ;
Gly Leu Cys Ala Thr Ala Thr Thr Thr Tyr Asn Glu Pro Ala His He 100 105 110 j GCC GCC CGC TTC GCC TCC CTC GAC CAC CTC AGC GGC GGC CGG GCC GGC 384
Ala Ala Arg Phe Ala Ser Leu Asp His Leu Ser Gly Gly Arg Ala Gly 115 120 125 TGG AAC GTC GTC ACC TCC GCC GCA CCG TGG GAG TCC GCC AAC TTC GGC 432
Trp Asn Val Val Thr Ser Ala Ala Pro Trp Glu Ser Ala Asn Phe Gly 130 135 140 TTC CCC GAG CAC CTG GAG CAC GGC AAA CGC TAC GAG CGG GCC GAG GAG 480 , Phe Pro Glu His Leu Glu His Gly Lys Arg Tyr Glu Arg Ala Glu Glu ,·*·*: 145 1 50 155 160 • · :**’· TTC ATC GAC GTC GTC AAA AAA CTG TGG GAC AGC GAC GGC CGC CCC GTC 528 *" Phe He Asp Val Val Lys Lys Leu Trp Asp Ser Asp Gly Arg Pro Val *:· 165 170 175 ♦ ··· ·;·*: GAC CAC CGC GGC ACC CAC TTC GAG GCC CCC GGC CCG CTC GGG ATC GCC 576 . . Asp His Arg Gly Thr His Phe Glu Ala Pro Gly Pro Leu Gly He Ala ::: ieo 185 190 * * * * :T: CGC CCC CCG CAG GGC CGC CCC GTC ATC ATC CAG GCC GGC TCC TCG CCG 624
Arg Pro Pro Gin Gly Arg Pro Vai Ile He Gin Ala Gly Ser Ser Pro 195 200 205
Se;*: GTG GGA CGC GAG TTC GCC GCC CGG CAC GCC GAG GTC ATC TTC ACC CGG 672 "I Val Gly Arg Glu Phe Ala Ala Arg His Ala Glu Val He Phe Thr Arg : : 210 215 220 ··· .
• ' V
.···. CAC AAC CGG CTC TCC GAC GCC CAG GAC TTC TAC GGC GAC CTC AAG GCA 720 1 *···* His Asn Arg Leu Ser Asp Ala Gin Asp Phe Tyr Gly Asp Leu Lys Ala ϊ ....: 225 230 235 240 ί • · · *. CGC GTC GCC CGG CAC GGC CGC GAC CCC GAG AAG GTC CTC GTG TGG CCG 768 ::: Arg Val Ala Arg His Gly Arg Asp Pro Glu Lys Val Leu Val Trp Pro 245 250 255 • · 117674 129 ACC CTC GCG CCG ATC GTC GCC GCC ACC GAC ACC GAG GCG AAG CAG CGC 816
Thr Leu Ala Pro Ile Val Ala Ala Thr Asp Thr Glu Ala Lys Gin Arg 260 265 270 CTG CAG GAA CTG CAG GAC CTC ACC CAC GAC CAT GTC GCC CTG CGC ACC 864
Leu Gin Glu Leu Gin Asp Leu Thr His Asp His Val Ala Leu Arg Thr 275 280 285 CTT CAG GAC CAC CTC GGC GAC GTC GAC CTG AGC GCG TAC CCG ATC GAC 912
Leu Gin Asp His Leu Gly Asp Val Asp Leu Ser Ala Tyr Pro lie Asp 290 295 300 GGG CCC GTC CCC GAC ATC CCG TAC ACC AAC CAG TCC CAG TCG ACG ACC 960
Gly Pro Val Pro Asp lie Pro Tyr Thr Asn Gin Ser Gin Ser Thr Thr 305 310 315 320 GAG CGG CTG ATC GGC CTG GCC AGG CGC GAG AAC CTC AGC ATC CGC GAG 1008
Glu Arg Leu lie Gly Leu Ala Arg Arg Glu Asn Leu Ser lie Arg Glu 325 330 335 CTG GCC CTG CGG CTG ATG GGC GAC ATC GTC GTC GGC ACA CCG GAG CAG 1056
Leu Ala Leu Arg Leu Met Gly Asp lie Val Val Gly Thr Pro Glu Gin 340 345 350 CTC GCC GAC CAC ATG GAG AGC TGG TTC ACC GGC CGC GGC GCC GAC GGC 1104
Leu Ala Asp His Met Glu Ser Trp Phe Thr Gly Arg Gly Ala Asp Gly 355 360 365 TTC AAC ATC GAC TTC CCG TAC CTG CCG GGC TCC GCC GAC GAC TTC GTC 1152
Phe Asn lie Asp Phe Pro Tyr Leu Pro Gly Ser Ala Asp Asp Phe Val 370 375 380 GAC CAC GTG GTG CCC GAA CTG CAG CGC CGC GGC CTG TAC CGC TCG GGC 1200
Asp His Val Val Pro Glu Leu Gin Arg Arg Gly Leu Tyr Arg Ser Gly 385 390 395 400 TAC GAG GGC ACC ACC CTG CGG GCC AAC CTC GGC ATC GAC GCC CCC CGG 1248 ;"·*· Tyr Glu Gly Thr Thr Leu Arg Ala Asn Leu Gly lie Asp Ala Pro Arg ♦ * 405 410 415 ··· • · *···* AAG GCA GGT GCA GCG GCT TG 1269 ··· Lys Ala Gly Ala Ala Ala *·" 420 «#»·♦ • ♦ :* » **: (2) INFORMATION pour LA SEQ ID NO: 3: ·· · * (i) caracteristiques de la sequence: * (A) LONGUEUR: 834 paires de bases (B) TYPE: acide nucleique , (C) NOMBRE DE BRINS: double ::: (D) CONFIGURATION: linöaire ·♦· :***: (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc ···
.··*. (iii) HYPOTHETIQUE: NON
...,: (iii) ANTI-SENS: NON
« · ·, (vi) ORIGINE: ::: (A) ORGANISME: Streptomyces pristinaespiralis *:·*: (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: 117674 130
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..834 : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: ATG ACC GCG CCC ATC CTC GTC GCC ACC CTC GAC ACC CGC GGC CCC GCC 48
Met Thr Ala Pro lie Leu Val Ala Thr Leu Asp Thr Arg Gly Pro Ala 1 5 10 15 GCC ACC CTC GGC ACG ATC ACC CGC GCC GTG CGG GCC GCG GAG GCC GCC 96
Ala Thr Leu Gly Thr lie Thr Arg Ala Val Arg Ala Ala Glu Ala Ala 20 25 30 GGA TTC GAC GCC GTC CTG ATC GAC GAC CGG GCC GCC GCC GGC GTC CAG 144
Gly Phe Asp Ala Val Leu lie Asp Asp Arg Ala Ala Ala Gly Val Gin 35 40 45 GGC CGG TTC GAG ACG ACG ACG CTG ACC GCC GCG CTG GCC GCC GTC ACC 192
Gly Arg Phe Glu Thr Thr Thr Leu Thr Ala Ala Leu Ala Ala Val Thr 50 55 60 GAG CAC ATC GGC CTG ATC ACC GCC CCG CTC CCG GCC GAC CAG GCC CCC 240
Glu His lie Gly Leu lie Thr Ala Pro Leu Pro Ala Asp Gin Ala Pro 65 70 75 80 TAC CAC GTG TCC CGG ATC ACC GCC TCG CTC GAC CAC CTC GCC CAC GGC 288
Tyr His Val Ser Arg lie Thr Ala Ser Leu Asp His Leu Ala His Gly 85 90 95 CGC ACC GGC TGG CTC GCG AGC ACG GAC ACC ACC GAC CCC GAG GGC CGC 336
Arg Thr Gly Trp Leu Ala Ser Thr Asp Thr Thr Asp Pro Glu Gly Arg 100 105 110 ACC GGC GAA CTC ATC GAC GTC GTC CGC GGC CTG TGG GAC AGC TTC GAC 384
Thr Gly Glu Leu lie Asp Val Val Arg Gly Leu Trp Asp Ser Phe Asp ... 115 120 125 : GAC GAC GCC TTC GTC CAC GAC CGC GCC GAC GGC CTG TAC TGG CGG CTG 432 ϊ : ' Asp Asp Ala Phe Val His Asp Arg Ala Asp Gly Leu Tyr Trp Arg Leu **; 130 135 140 • · * • ***. CCC GCC GTC CAC CAA CTC GAC CAC CAG GGC AGG CAC TTC GAC GTG GCC 480 *ϊ"ί Pro Ala Val His Gin Leu Asp His Gin Gly Arg His Phe Asp Val Ala . . 145 150 155 160 •II • · «
Vj.* GGC CCC CTC AAC GTC GCC CGC CCG CCG CAG GGC CAC CCC GTC GTC GCC 528 ·,· ί Gly Pro Leu Asn Val Ala Arg Pro Pro Gin Gly His Pro Val Val Ala 165 170 175 „ #· GTC ACC GGC CCC GCC CTC GCC GCG GCC GCC GAC CTC GTC CTG CTC GAC 576 ·,{.· Val Thr Gly Pro Ala Leu Ala Ala Ala Ala Asp Leu Val Leu Leu Asp 180 185 190 • · GAG GCG GCC GAC GCC GCC TCG GTG AAG CAG CAG GCA CCG CAC GCC AAG 624 ;’**· Glu Ala Ala Asp Ala Ala Ser Val Lys Gin Gin Ala Pro His Ala Lys *·· 195 200 205 . ’ ATC CTC CTG CCG CTG CCC GGC CCG GCC GCC GAA CTG CCC GCC GAC AGC 672 , .· He Leu Leu Pro Leu Pro Gly Pro Ala Ala Glu Leu Pro Ala Asp Ser 210 215 220 CCC GCG GAC GGC TTC ACG GTG GCG CTC ACC GGC TCC GAC GAC CCG GTC 720 117674 131
Pro Ala Asp Gly Phe Thr Vai Ala Leu Thr Gly Ser Asp Asp Pro Vai 225 230 235 240 CTG GCC GCG CTC GCC GCC CGG CCC GGC CGC CCG GAG CGC ACC GCG GCC 768
Leu Ala Ala Leu Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Asp Arg Thr Ala Ala 245 250 255 ACC ACC CTG CGC GAA CGC CTG GGC CTG GCC CGC CCC GAG AGC CGC CAC 816
Thr Thr Leu Arg Glu Arg Leu Gly Leu Ala Arg Pro Glu Ser Arg His 260 265 270 GCC CTC ACC ACC GCC TG 834
Ala Leu Thr Thr Ala 275 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1209 paires de bases (B) TYPE: acide nucleique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: lineaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON ‘ (vi) ORTGTNE: (A) ORGANISME: Streptomyces pristinaespiralis (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..1209 • · · • · * : ·* (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: * * · • * *···* ATG TCC CGT CGC CTG TTC ACC TCG GAG TCC GTG ACC GAG GGC CAC CCC 48 ·ί· Met Ser Arg Arg Leu Phe Thr Ser Glu Ser Vai Thr Glu Gly His Pro *···* 1 5 10 15 GAC AAG ATC GCC GAC CAG ATC AGT GAC ACC GTC CTC GAC GCC CTG CTG 96 • ;*· Asp Lys Ile Ala Asp Gin Ile Ser Asp Thr Vai Leu Asp Ala Leu Leu ··* * 20 25 30 * * * I f i *** CGC GAG GAC CCC GCC TCA CGC GTC GCG GTC GAG ACC CTG ATC ACC ACC 144
Arg Glu Asp Pro Ala Ser Arg Vai Ala Vai Glu Thr Leu Ile Thr Thr 35 40 45 * • * · *;;;* ggc cag gtc cac atc gcc ggc gag gtc acc acc aag gcg tac gcg ccc 192 ; *: Gly Gin Vai_His Ile Ala Gly Glu Vai Thr Thr Lys Ala Tyr Ala Pro *;* 50 55 60 • · · ' ATC GCC CAA CTG GTC CGC GAC ACG ATC CTG GCC ATC GGC TAC GAC TCG 240
Ile Ala Gin Leu Vai Arg Asp Thr lie Leu Ala Ile Gly Tyr Asp Ser * * 66 70 75 80 ♦ 'ii.:;.
: TCC GCC AAG GGC TTC GAC GGC GCC TCC TGC GGC GTC TCC GTC TCC ATC 288 *** Ser Ala Lys Gly Phe Asp Gly Ala Ser Cys Gly Vai Ser Vai Ser Ile ·:··· 85 90 95 117674 132 GGC GCG CAG TCC CCG GAC ATC GCC CAG GGC GTC GAC AGC GCC TAC GAG 336
Gly Ala Gin Ser Pro Asp Ile Ala Gin Gly Val Asp Ser Ala Tyr Glu 100 105 110 ACC CGC GTC GAG GGC GAG GAC GAC GAG CTC GAC CAG CAG GGC GCC GGC 384
Thr Arg Val Glu Gly Glu Asp Asp Glu Leu Asp Gin Gin Gly Ala Gly 115 120 125 GAC CAG GGC CTG ATG TTC GGC TAC GCC ACC GAC GAG ACC CCC TCG CTG 432
Asp Gin Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr Asp Glu Thr Pro Ser Leu 130 135 140 ATG CCG CTG CCC ATC GAG CTC GCC CAC CGC CTC TCG CGC CGG CTC ACC 480
Met Pro Leu Pro lie Glu Leu Ala His Arg Leu Ser Arg Arg Leu Thr 145 150 155 160 GAG GTC CGC AAG GAC GGC ACC GTC CCC TAC CTG CGC CCC GAC GGC AAG 528
Glu Val Arg Lys Asp Gly Thr Val Pro Tyr Leu Arg Pro Asp Gly Lys 165 170 175 ACC CAG GTC ACC ATC GAG TAC CAG GGC AGC CGC CCG GTG CGC CTG GAC 576
Thr Gin Val Thr lie Glu Tyr Gin Gly Ser Arg Pro Val Arg Leu Asp 180 185 190 ACC GTC GTC GTC TCC TCC CAG CAC GCC GCC GAC ATC GAC CTC GGC TCC 624
Thr Val Val Val Ser Ser Gin His Ala Ala Asp lie Asp Leu Gly Ser 195 200 205 CTG CTC ACC CCC GAC ATC CGC GAG CAC GTC GTC GAG CAC GTC CTC GCC 672
Leu Leu Thr Pro Asp He Arg Glu His Val Val Glu His Val Leu Ala 210 215 220 GCA CTC GCC GAG GAC GGC ATC AAG CTC GAG ACG GAC AAC TAC CGC CTG 720
Ala Leu Ala Glu Asp Gly He Lys Leu Glu Thr Asp Asn Tyr Arg Leu 225 230 235 240 CTG GTC AAC CCG ACC GGC CGT TTC GAG ATC GGC GGC CCG ATG GGC GAC 768 • ·* Leu Val Asn Pro Thr Gly Arg Phe Glu He Gly Gly Pro Met Gly Asp .***. 245 250 255 ® · • · * .:. GCC GGC CTG ACC GGC CGC AAG ATC ATC ATC GAC ACG TAC GGC GGC ATG 816 *··· Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys He Ile He Asp Thr Tyr Gly Gly Met ···.: 260 265 270 • · ; GCC CGC CAC GGC GGT GGC GCG TTC TCC GGC AAG GAC CCG TCC AAG GTC 864 **· · Ala Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser Lys Val 275 280 285 GAC CGT TCC GCC GCG TAC GCG ATG CGC TGG GTC GCC AAG AAC GTC GTC 912
Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Met Arg Trp Val Ala Lys Asn Val Val : 290 295 300 **♦ GCC GCG GGC CTC GCC TCC CGC TGC GAG GTC CAG GTC GCC TAC GCC ATC 960 *** Ala Ala Gly Leu Ala Ser Arg Cys Glu Val Gin Val Ala Tyr Ala He .···. 305 310 31 5 320 * · GGC AAG GCC GAG CCG GTC GGC CTG TTC GTC GAG ACG TTC GGC ACC GGC 1008 * * Gly Lys Ala Glu Pro Val Gly Leu Phe Val Glu Thr Phe Gly Thr Gly • 325 330 335 • « · ACC GTC GCC CAG GAG CGC ATC GAG AAG GCC ATC ACC GAG GTC TTC GAC -1056 *;*·; Thr Val Ala Gin Glu Arg He Glu Lys Ala He Thr Glu Val Phe Asp 117674 133 340 345 350 CTG CGC CCC GCG GCC ATC ATC CGC GAC CTC GAC CTG CTG CGG CCC ATC 1104
Leu Arg Pro Ala Ala lie lie Arg Asp Leu Asp Leu Leu Arg Pro lie 355 360 365 - TAC GCC GCC ACC GCC GCC TAC GGC CAC TTC GGC CGC GAA CTG CCC GAC 1152
Tyr Ala Ala Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg Glu Leu Pro Asp 370 375 380 TTC ACC TGG GAG CGG ACC GAC CGC GCC CAC CGG CTC AAG GCC GCG GCC 1200
Phe Thr Trp Glu Arg Thr Asp Arg Ala His Arg Leu Lys Ala Ala Ala 385 390 395 400 GGT CTC TG 1209
Gly Leu (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1879 paires de bases (B) TYPE: acide nucleique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: lineaire | (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(lii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON ' ' (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Streptomyces pristihaespiralis (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
;**. (B) EMPLACEMENT: 110..1858 • · ··· • * '··;* (Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: **·· GATCGGCTCC TGACGGAGCG GCGGCGCGCG GGCGCGGCGC ATCAGCGGCG TGTCAACGGC 60 GCTGCCGACA CTGGGCGCGA CGCGAGGACG AAGCCGGAAA GGACCAACG ATG CTG 115 : Met Leu
* * · · A
* · · * * * * .
* GAC GGA TGC GTT CCC TGG CCC GAG GAT GTG GCC GCG AAG TAC CGG GCG 163
Asp Gly Cys Val Pro Trp Pro Glu Asp Val Ala Ala Lys Tyr Arg Ala . 5 10 15 • · · • · · "* GCC GGC TAC TGG CGG GGC GAG CCG CTG GGC ATG CTG CTG GGC CGC TGG 211 ί : Ala Gly Tyr Trp Arg Gly Glu Pro Leu Gly Met Leu Leu Gly Arg Trp 20 25 30 ;
* » · , I
GCG GAG CAG TAC GGC GAG CGG GAG GCG CTG GTC GGC GCG GAC GGG TGC 259 ...,: Ala Glu Gin Tyr Gly Glu Arg Glu Ala Leu Val Gly Ala Asp Gly Cys ’ * : 35 40 45 50 : tcc cgt gtc acc tac cgt gcc ctg gac cgc tgg tgc gac cgg ctg gcg 307 t **’. Ser Arg Val Thr Tyr Arg Ala Leu Asp Arg Trp Cys Asp Arg Leu Ala "**: 55 60 65 117674 : 134 GCG GGG TTC GCG GCG CGC GGG ATC GGC GCC GGC GAG CGG GTG CTG GTG 355
Ala Gly Phe Ala Ala Arg Gly Ile Gly Ala Gly Glu Arg Val Leu Val 70 75 80 CAG CTG CCG AAC ACG CCC GAG TTC GTC GCG GTG TGC TTC GCG CTG TTC 403
Gin Leu Pro Asn Thr Pro Glu Phe Val Ala Val Cys Phe Ala Leu Phe 85 90 95 CGT CTG GGC GCG CTG CCG GTG TTC GCG CTG CCC GCG CAC CGT GCC GCC 451
Arg Leu Gly Ala Leu Pro Val Phe Ala Leu Pro Ala His Arg Ala Ala 100 105 110 GAG GTG GGG CAC CTG CTC GAG CTG TCC GGC GCC GTC GCC CAC ATC CTG 499
Glu Val Gly His Leu Leu Glu Leu Ser Gly Ala Val Ala His He Leu 115 120 125 130 CCG GGC ACC GGC ACC GGC TAG GAC CAT GTC GCG GCG GCC GTG GAG GCC 547
Pro Gly Thr Gly Thr Gly Tyr Asp His Val Ala Ala Ala Val Glu Ala 135 140 145 CGT GCC CGC CGT GCC CGC CCG GTG CAG GTG TTC GTG GCG GGC GAG GCG 595
Arg Ala Arg Arg Ala Arg Pro Val Gin Val Phe Val Ala Gly Glu Ala 150 155 160 CCC GCG GTG CTG CCC GAG GGG TTC ACC GCG CTG GCC GAC GTG GAC GGC 643
Pro Ala Val Leu Pro Glu Gly Phe Thr Ala Leu Ala Asp Val Asp Gly 165 170 175 GAC CCG GTG GCG CCG GCG GAC GTG GAC GCC TTC CGA CGT GGC GTC TTC 691
Asp Pro Val Ala Pro Ala Asp Val Asp Ala Phe Arg Arg Gly Val Phe 180 185 190 CTG CTG TCC GGG GGG ACG ACC GCG CTG CCG AAG CTG ATC CCG CGC ACC 739
Leu Leu Ser Gly Gly Thr Thr Ala Leu Pro Lys Leu He Pro Arg Thr 195 200 205 210 ·**; CAC GAC GAC TAC GCC TAC CAG TGC CGG GTC ACG GCC GGT ATC TGC GGC 787 * · His Asp Asp Tyr Ala Tyr Gin Cys Arg Val Thr Ala Gly He Cys Gly 215 220 225 • · · ··· CTG GAC GCG GAC AGT GTC TAT CTG GCG GTG CTG CCG GCC GAG TTC AAC 835 *··* Leu Asp Ala Asp Ser Val Tyr Leu Ala Val Leu Pro Ala Glu Phe Asn ·:··· 230 235 240 * :*: TTC CCC TTC GGC TGC CCG GGC ATC CTG GGC ACC CTG CAC GCC GGC GGG 883 *** * Phe Pro Phe Gly Cys Pro Gly He Leu Gly Thr Leu His Ala Gly Gly ;Y: 245 250 255 CGG GTG GTG TTC GCG CTG TCA CCG CAG CCC GAG GAG TGC TTC GCG CTG 931 . Arg Val Val Phe Ala Leu Ser Pro Gin Pro Glu Glu Cys Phe Ala Leu ::: 260 265 270 * ♦ · :***; ATC GAA CGC GAA CAC GTC ACC TTC ACC TCC GTC ATC CCC ACG ATC GTG 979 *1* He Glu Arg Glu His Val Thr Phe Thr Ser Val He Pro Thr He Val .*··. 275 280 285 290 ·· ....: CAC CTG TGG CTG GCG GCC GCC GCA CAA GGC CAC GGC CGC GAC CTG GGC 1027 * * * His Leu Trp Leu Ala Ala Ala Ala Gin Gly His Gly Arg Asp Leu Gly ♦, 295 300 305 ; • · · ·.· * *·*. AGC CTT CAG CTG CTG CAG GTC GGC AGC GCC AAA CTC CAC GAG GAG CTC 1075 *:·*: Ser Leu Gin Leu Leu Gin Val Gly Ser Ala Lys Leu His Glu Glu Leu 2.35 117674 310 315 320 GCC GCC CGG ATC GGC CCC GAA CTG GGG GTG CGG CTG CAG CAG GTG TTC 1123
Ala Ala Arg He Gly Pro Glu Leu Gly Val Arg Leu Gin Gin Val Phe 325 330 335 GGC ATG GCC GAG GGA CTG CTG ACC TTC ACC CGC GAC GAC GAC CCG GCG 1171
Gly Met Ala Glu Gly Leu Leu Thr Phe Thr Arg Asp Asp Asp Pro Ala 340 345 350 GAC GTG GTG CTG CGC ACC CAG GGC CGG CCG GTG TCC GAG GCC GAC GAG 1219
Asp Val Val Leu Arg Thr Gin Gly Arg Pro Val Ser Glu Ala Asp Glu 355 360 365 370 ATA CGC GTC GCC GAC CCC GAC GGC CGG CCC GTG CCC CGC GGT GAG ACC 1267
He Arg Val Ala Asp Pro Asp Gly Arg Pro Val Pro Arg Gly Glu Thr 375 380 385 GGT GAA CTG CTC ACC CGC GGC CCC TAC ACG CTG CGC GGC TAC TAC CGG 1315
Gly Glu Leu Leu Thr Arg Gly Pro Tyr Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Arg 390 395 400 GCC CCC GAG CAC AAC GCC CGC GCG TTC ACC GAG GAC GGC TTC TAC CGC 1363
Ala Pro Glu His Asn Ala Arg Ala Phe Thr Glu Asp Gly Phe Tyr Arg 405 410 415 AGC GGC GAT CTG GTG CGG CTC ACC GCC GAC GGG CAG TTG GTG GTG GAG 1411
Ser Gly Asp Leu Val Arg Leu Thr Ala Asp Gly Gin Leu Val Val Glu 420 425 430 GGC AGG ATC AAG GAC GTC GTC ATC CGC GGC GGC GAC AAG GTC TCC GCG 1459
Gly Arg He Lys Asp Val Val He Arg Gly Gly Asp Lys Val Ser Ala 435 440 445 450 ACC GAG GTC GAG GGC CAC CTG GGC GCC CAC CCC GAC GTC CAG CAG GCC 1507
Thr Glu Val Glu Gly His Leu Gly Ala His Pro Asp Val Gin Gin Ala ,, , 455 460 465 ; . ; *,,* GCC GTC GTC GCC ATG CCC GAC CCG GTG TGG GGC GAG AAG GTC TGC GCC 1555 ! ; Ala Val Val Ala Met Pro Asp Pro Val Trp Gly Glu Lys Val Cys Ala *" 470 475 480 • · · ♦ .··· ***. TAC ATC GTG CCC GCA CCC GGC CGT CCC GCA CCG CCG ATG GCG GCG CTG 1603 *ϊ**ί Tyr He Val Pro Ala Pro Gly Arg Pro Ala Pro Pro Met Ala Ala Leu . . 485 490 495 • · · • · · CGC CGG CTG CTG CGC GCG CGG GGA CTG GCC GAC TAC AAG CTT CCC GAC 1651 ϊ ϊ ί Arg Arg Leu Leu Arg Ala Arg Gly Leu Ala Asp Tyr Lys Leu Pro Asp 500 505 510 . CGG GTG GAG GTC GTC GAC GCG TTC CCG CTG ACC GGC CTC AAC AAG GTC 1699 *,» · Arg Val Glu Val Val Asp Ala Phe Pro Leu Thr Gly Leu Asn Lys Val ... 515 520 525 530 • · • · '·" GAC AAG AAG GCC CTG GCG GCC GAC ATC GCC GCC AAG ACC GCC CCC ACC 1747 ;***· Asp Lys Lys Ala Leu Ala Ala Asp He Ala Ala Lys Thr Ala Pro Thr *···* 535 540 545 ! CGC CCC ACC ACC GCC GGC CAC GGC CCG ACC ACG GAC GGC GAT ACG GCC 1795
Arg Pro Thr Thr Ala Gly His Gly Pro Thr Thr Asp Gly Asp Thr Ala ·#·φ· 550 555 560 • GGT GGG GGT GGG TCC GCG GGC GGG GTG ACG GCC GCC GGT GGC GGG CGG 1843 117674 136
Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Gly Val Thr Ala Ala Gly Gly Gly Arg 565 570 575 GAG GAG GCG GCG TGAGCGGGCC CGGGCCCGAG GGCG 1879
Glu Glu Ala Ala 580 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1833 paires de bases (B) TYPE: acide nucleique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Streptomyces pristinaespiralis - (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: CDS " (B) EMPLACEMENT: 103..1689 .- (Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: GGATCCCCTC GCCCAGGGCC CTGGCGGGCC CGCCGGGCCG TGGGGGAGGT GCGGGGGCCG 60 CGGGCCCCGG CACCGCACGA ACAGAACAAC CGCTCCGGGC CC ATG CGG ACT TCA 114
Met Arg Thr Ser ·* * • · · .
* ·* CGG TCC CAC GAC CAG CGG GCC CCT ACC CCC TGG AGA CAT CCC TTG CAC 162 ;***· Arg Ser His Asp Gin Arg Ala Pro Thr Pro Trp Arg His Pro Leu His ···’ 5 10 1 5 20 .
• · * AGC ACC CGG CCC GCG CCC GCG GCC GAC CGT GAC CCC AGG CGC TGG GTC 210 ····· Ser Thr Arg Pro Ala Pro Ala Ala Asp Arg Asp Pro Arg Arg Trp Val , . 25 30 35 • · · .
ATC CTC GGC GTG ATC TGC CTG GCC CAA CTC GTC GTC CTG CTC GAC AAC 258 ; lie Leu Gly Val lie Cys Leu Ala Gin Leu Val Val Leu Leu Asp Asn * . 40 45 50 . ACC GTC CTC AAC GTC GCC ATC CCG GTG CTC ACC ACC GAC CTG GGC GCC 306 * Ϊ J Thr Val Leu Asn Val Ala lie Pro Val Leu Thr Thr Asp Leu Gly Ala ::: 55 eo 65 • · • · *" AGC ACC GCC GAC ATC CAG TGG ATG ATC AAC GCC TAC GCG CTC GTG CAG 354 ,**·. Ser Thr Ala Asp lie Gin Trp Met lie Asn Ala Tyr Ala Leu Val Gin 70 75 80 * * TCC GGG CTG CTG CTC ACC GCG GGC AGC CTC GCG GAC CGC TAC GGC CGC 402 *. Ser Gly Leu Leu Leu Thr Ala Gly Ser Leu Ala Asp Arg Tyr Gly Arg ::: 85 90 95 100 • · · *:**: AAA CGG CTG CTG ATG CTC GGA CTG GTG CTC TTC GGC GCC GGG TCC GCC 450 137 117674
Lys Arg Leu Leu Met Leu Gly Leu Val Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ala 105 110 115 TGG GCG GCC TTC GCC CAG GAC TCC GCC CAA CTC ATC GCC GCC CGG GCC 498
Trp Ala Ala Phe Ala Gin Asp Ser Ala Gin Leu lie Ala Ala Arg Ala 120 125 130 GGC ATG GGC GTG GGC GGG GCG CTG CTG GCG ACC ACC ACC CTC GCC GTC 546
Gly Met Gly Val Gly Gly Ala Leu Leu Ala Thr Thr Thr Leu Ala Val 135 140 145 ATC ATG CAG GTC TTC GAC GAC GAC GAA CGC CCC CGG GCG ATC GGC CTG 594 lie Met Gin Val Phe Asp Asp Asp Glu Arg Pro Arg Ala lie Gly Leu 150 155 160 TGG GGA GCG GCC AGC TCA CTG GGC TTC GCG GCC GGC CCG CTG CTC GGC 642
Trp Gly Ala Ala Ser Ser Leu Gly Phe Ala Ala Gly Pro Leu Leu Gly 165 170 175 180 GGC GCC CTC CTC GAC CAC TTC TGG TGG GGC TCC ATC TTC CTG ATC AAC 690
Gly Ala Leu Leu Asp His Phe Trp Trp Gly Ser lie Phe Leu lie Asn 185 190 195 CTG CCC GTC GCG CTG CTG GGC CTG CTG GCC GTC GCC CGC CTG GTG CCC 738
Leu Pro Val Ala Leu Leu Gly Leu Leu Ala Val Ala Arg Leu Val Pro 200 205 210 GAG ACG AAG AAC CCC GAA GGC CGG CGC CCC GAC CTG CTC GGC GCC GTG 786
Glu Thr Lys Asn Pro Glu Gly Arg Arg Pro Asp Leu Leu Gly Ala Val 215 220 225 CTC TCC ACC CTC GGC ATG GTC GGC GTC GTC TAC GCC ATC ATC TCC GGC 834
Leu Ser Thr Leu Gly Met Val Gly Val Val Tyr Ala lie lie Ser Gly 230 235 . 240 CCC GAA CAC GGC TGG ACG GCC CCG CAG GTC CTC CTG CCG GCC GCC GTC 882
Pro Glu His Gly Trp Thr Ala Pro Gin Val Leu Leu Pro Ala Ala Val :*·*; 245 250 255 260 GCG GCC GCC GCG CTC ACC GCG TTC GTC CGC TGG GAA CTG CAC ACC CCC 930 *·* Ala Ala Ala Ala Leu Thr Ala Phe Val Arg Trp Glu Leu His Thr Pro ·:* 265 270 275 ···· *:··· CAC CCC ATG CTC GAC ATG GGC TTC TTC ACC GAC CGG CGC TTC AAC GGG 978.
, . His Pro Met Leu Asp Met Gly Phe Phe Thr Asp Arg Arg Phe Asn Gly : : : 280 285 290 *·« · :T: CCG TCG CCG GCG GAG TGC TOG TCG TTC GGC ATG GCC GGC TCG CTC TTC 1026
Pro Ser Pro Ala Glu Cys Ser Ser Phe Gly Met Ala Gly Ser Leu Phe 295 300 305
Ifi*: ! CTG CTC ACC CAG CAC CTC CAA CTC GTC CTC GGC TAC GAC GCC CTG CAG 1074 !!ΐ Leu Leu Thr Gin His Leu Gin Leu Val Leu Gly Tyr Asp Ala Leu Gin .* ·* 310 315 320 * * * • .·**. GCC GGC CTG CGC ACC GCG CCA CTG GCT TTG ACG ATC GTC GCC CTC AAC 1122 **··* Ala Gly Leu Arg Thr Ala Pro Leu Ala Leu Thr lie Val Ala Leu Asn ....: 325 330 335 340 * · *. CTG GCC GGC CTC GGC GCG AAA CTC CTC GCC GCG CTC GGC ACC GCC CGC 1170 ί : · Leu Ala Gly Leu Gly Ala Lys Leu Leu Ala Ala Leu Gly Thr Ala Arg 345 350 355 • * 117674 138 AGC ATC GCC CTG GGC ATG AGA CTG CTG GCC GCC GGC CTC AGC GCG GTG 1218
Ser lie Ala Leu Gly Met Thr Leu Leu Ala Ala Gly Leu Ser Ala Val 360 365 370 GCC GTC GGC GGA TCG GGC CCC GAC GCC GGC TAC GGC GGC ATG CTC GCC 1266
Ala Val Gly Gly Ser Gly Pro Asp Ala Gly Tyr Gly Gly Met Leu Ala 375 380 385 GGC CTG CTC CTC ATG GGC GCG GGC ATC GCA CTG GCC ATG CCC GCC ATG 1314
Gly Leu Leu Leu Met Gly Ala Gly lie Ala Leu Ala Met Pro Ala Met 390 395 400 GCC ACC GCC GTG ATG TCC TCC ATC CCG CCC GCC AAG GCC GGG GCC GGA 1362
Ala Thr Ala Val Met Ser Ser lie Pro Pro Ala Lys Ala Gly Ala Gly 405 410 415 420 GCG GGC GTG CAG GGC ACC CTG ACC GAG TTC GGC GGC GGA CTG GGA GTG 1410
Ala Gly Val Gin Gly Thr Leu Thr Glu Phe Gly Gly Gly Leu Gly Val 425 430 435 GCG ATC CTC GGC GCC GTC CTC GGC TCC CGC TTC GCC TCC CAA CTG CCC 1458
Ala lie Leu Gly Ala Val Leu Gly Ser Arg Phe Ala Ser Gin Leu Pro 440 445 450 GCC GCC ATC ACC GGC ACC GGC TCC CTC GAC GAG GCA CTG CGC GAC GCC 1506
Ala Ala lie Thr Gly Thr Gly Ser Leu Asp Glu Ala Leu Arg Asp Ala ; 455 460 465 ; ACA CCC CAA CAG GCC GGG CAG GTC CAC GAC GCG TTC GCC GAC GCG GTG 1554
Thr Pro Gin Gin Ala Gly Gin Val His Asp Ala Phe Ala Asp Ala Val 470 475 480 AAC ACC AGC CAA CTC ATC GGC GCC GCC GCC GTG TTC ACC GGC GGC CTG 1602
Asn Thr Ser Gin Leu lie Gly Ala Ala Ala Val Phe Thr Gly Gly Leu 485 490 495 500 CTC GCC GCG CTG CTG CTG CAC CGC GCC GAC CGC AAG GCC GCC CCC CAG 1650 .
**·*· Leu Ala Ala Leu Leu Leu His Arg Ala Asp Arg Lys Ala Ala Pro Gin ·’ ·* 505 510 515 tM t · '···* CCC ACC GCC CCC ACC CCC GAA CCC ACC ACC ACC GCC TGACCCCCGG 1696 ··· Pro Thr Ala Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr Thr Ala ·*·· 520 525 // CCCGCCGGGC ACCACACAAC CCACGGCCCC ACCCCTGCGG CTCCCCACCG GGACCCACAG 1756 t ft ft ft ';;/ GGGCGGGGCC GTGCCGCTGC CCTGCCCACA CACACAGCCC CCACACACAC AGCCCCCGCA 1816 ' > ft ft ft ’** CGGCCGACAG CGCCGGG 1833 ft · ft ;;; (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7: ft ft • ft (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: ,···, (A) LONGUEUR: 695 paires de bases (B) TYPE: acide nucleique (C) NOMBRE DE BRINS: double * * (D) CONFIGURATION: lineaire
: au type de molecule: adnc I
* · · *:·*: (iii) HYPOTHETIQUE: non 117674 139 (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: S.pristinaespiralis (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 212..695 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /product= "Gene SnaC" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: CTCGAGCCGC GCCCCCAGGT GCTGGTGTCG CTCGCCGTGG AGAAGGGCGC CGACGGCACC 60 GCGCCGCCGG ACCGGCTGCT GATCCACGAC GGCTTCCCCT GGGGCCGCGC CGCCCCGCGC 120 GAAGCGGAGC TGCCCACCGG GCACCGCGCC CTGCCGGCCC TGGCCGGCGC CGCCCGCTGA 180 GGCGCGGCAA CCACCAACAG AAGGAGCCCC C GTG ACA GGA GCC GAC GAC CCG 232
Val Thr Gly Ala Asp Asp Pro 1 5 GCA AGG CCC GCG GTC GGC CCG CAG AGT TTC CGA GAC GCG ATG GCG CAG 280 Ala Arg Pro Ala Val Gly Pro Gin Ser Phe Arg Asp Ala Met Ala Gin & 10 15 20 CTG GCG TCG CCC GTC ACC GTC GTA ACC GTC CTC GAC GCG GCC GGA CGC 328
Leu Ala Ser Pro Val Thr Val Val Thr Val Leu Asp Ala Ala Gly Arg 25 30 35 CGC CAC GGC TTC ACG GCC GGC TCG GTG GTC TCT GTG TCG CTG GAC CCG 376
Arg His Gly Phe Thr Ala Gly Ser Val Val Ser Val Ser Leu Asp Pro 40 45 50 55 .. , CCG CTG GTG ATG GTC GGC ATC GCG CTC ACC TCC AGC TGC CAC ACG GCG 424 ί * I Pro Leu Val Met Val Gly lie Ala Leu Thr Ser Ser Cys His Thr Ala 60 65 70 • · ··.···.·- ·: .· · · ’** ATG GCC GCC GCC GCC GAG TTC TGC GTC AGC ATC CTC GGC GAG GAC CAG 472 *ί* ; Met Ala Ala Ala Ala Glu Phe Cys Val Ser lie Leu Gly Glu Asp Gin “**. 75 80 85 ««•I· • · . . CGC GCC GTC GCG AAG CGG TGC GCG ACG CAC GGC GCC GAC CGG TTC GCG 520 • * ί Arg Ala Val Ala Lys Arg Cys Ala Thr His Gly Ala Asp Arg Phe Ala ..-.--1 ...* 90 95 100 • · · · .
• ♦ · GGC GGC GAG TTC GCC GCC TGG GAC GGT ACG GGG GTG CCC TAC CTG CCG 568
Gly Gly Glu Phe Ala Ala Trp Asp Gly Thr Gly Val Pro Tyr Leu Pro . 105 110 115 • · · • · · GAC GCC AAG GTC GTC CTG CGC TGC CGC ACC ACG GAC GTG GTG CGC GCC 616
Asp Ala Lys Val Val Leu Arg Cys Arg Thr Thr Asp Val Val Arg Ala • 120 125 130 135 » · · • · *···’ GGC GAC CAC GAC CTG GTG CTC GGC ACG CCC GTG GAG ATC CGC ACG GGC 664 ·;·*ί Gly Asp His Asp Leu Val Leu Gly Thr Pro Val Glu lie Arg Thr Gly 140 145 150 • :.·.ί GAC CCG GCG AAG CCA CCC CTG CTG TGG TAC C 695 t . Asp Pro Ala Lys Pro Pro Leu Leu Trp Tyr - . -¾ :**: 155 160 117674 140 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 640 paires de bases (B) TYPE: acide nucleique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: lineaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ill) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON (Vi) ORIGINE; (A) ORGANISME: S.pristinaespiralis (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..640 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /product= "gene SnaD" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: GCG ACC GCC CGG CTC ATC GGC CCG CTG CCG CGC CGG CTG GGC CTC CAG 48
Ala Thr Ala Arg Leu lie Gly Pro Leu Pro Arg Arg Leu Gly Leu Gin 1 5 10 15 GTG CAC CAG GTG ATG ACG GGC GCG TTC GCG CAG GCC CTC GCC CGC TGG 96
Val His Gin Val Met Thr Gly Ala Phe Ala Gin Ala Leu Ala Arg Trp 20 25 30 ... CGG GGC AGC CGC GCC GTC ACC TTC GAC GTG GAG ACC CAC GGA CGG CAC 144 Γ * ; Arg Gly Ser Arg Ala Val Thr phe Asp Val Glu Thr His Gly Arg His 35 40 45 : • · *" GGC CGC GAC GAA CTG TTC CGT ACC GTC GGC TGG TTC ACC TCC ATC CAC 192 *;* Gly Arg Asp Glu Leu Phe Arg Thr Val Gly Trp Phe Thr Ser lie His *···. 50 55 60 • · · · * • . . CCC GTC GTC CTG GGC GCG GAC CGC TCC GTG CAC CCC GAG CAG TAC CTC 240 ϊ Γ ί Pro Val Val Leu Gly Ala Asp Arg Ser Val His Pro Glu Gin Tyr Leu 65 70 75 80 * · ·
I » I
GCC CAG ATC GGC GCG GCG CTG ACC GCC GTA CCG GAC GGC GGC GTC GGC 288
Ala Gin lie Gly Ala Ala Leu Thr Ala Val Pro Asp Gly Gly Val Gly . 85 90 95 * · • · « "I TTC GGC GCC TGC CGC GAG TTC TCC CCG GAC GCC GGG CTG CGC ACT CTG 336 ·, ί Phe Gly Ala Cys Arg Glu Phe Ser Pro Asp Ala Gly Leu Arg Thr Leu . 100 105 110 ··· • « *···’ CTG CGT GAC CTG CCG CCC GCC CTG GTG TGC TTC AAC TAC TAC GGT CAG 384 ···.! Leu Arg Asp Leu Pro Pro Ala Leu Val Cys Phe Asn Tyr Tyr Gly Gin * * 115 120 125 • : GCC GAC CAG TTG AGC CCG AAC GGC GGT TTC CGT ATG TCG GGC CGT CCC 432 ***. Ala Asp Gin Leu Ser Pro Asn Gly Gly Phe Arg Met Ser Gly Arg Pro “*·? 130 135 140 117674 141 ATC CCG CGC GAG CAC TCC GCC CGC TGC GAG CGC GTC TAC GGC ATC GAG 480 lie Pro Arg Glu His Ser Ala Arg Cys Glu Arg Val Tyr Gly lie Glu 145 150 155 160 GTG TAC GGC ATC GTC CAC GGC GGC CGC CTG CGC ATG GGC CTG ACC TGG 528
Val Tyr Gly lie Val His Gly Gly Arg Leu Arg Met Gly Leu Thr Trp 165 170 175 GTG CCG AGC CCG GCG GAC GGT GTG GAC GAG GCC GGC GTC GAC GCG CTC 576
Val Pro Ser Pro Ala Asp Gly Val Asp Glu Ala Gly Val Asp Ala Leu 180 185 190 GTG GAG CAG ATG AGC TGG GTG CTG GCC ACG CTC GCG GGC GCC GAC CCG 624
Val Glu Gin Met Ser Trp Val Leu Ala Thr Leu Ala Gly Ala Asp Pro 195 200 205 CAC GCC GTG ACC CCG G 640
His Ala Val Thr Pro 210 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 645 paires de bases (B) TYPE: acide nucleique (C) N0MBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: • ·* (A) ORGANISME: S.pristinaespiralis ♦ ·* • · *···' (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
··· (A) NOM/CLE: CDS
···* (B) EMPLACEMENT: 61..645 ·;··· (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /product= "gene papA" ♦ · · (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: • · · *** * GGCGTCAAGA ACCTGCCGCT GACCGTACGG CGCGGCTGAC ACAGACAAGG GGGCCACCTG 60 . GTG CGC ACC GTG CGA ACC CTG CTG ATC GAC AAC TAC GAC TCG TTC ACC 108
Val Arg Thr Val Arg Thr Leu Leu lie Asp Asn Tyr Asp Ser Phe Thr ::: 1 5 10 15 • ft • » ·;* TAC AAC CTC TTC CAG ATG CTG GCC GAG GTG AAC GGC GCC GCT CCG CTC 156 ,··*. Tyr Asn Leu Phe Gin Met Leu Ala Glu Val Asn Gly Ala Ala Pro Leu 20 25 30 * * * GTC GTC CGC AAC GAC GAC ACC CGC ACC TGG CAG GCC CTG GCG CCG GGC 204 *, Val Val Arg Asn Asp Asp Thr Arg Thr Trp Gin Ala Leu Ala Pro Gly ::: 35 40 45 ··· ' *:*·: GAC TTC GAC AAC GTC GTC GTC TCA CCC GGC CCC GGC CAC CCC GCC ACC 252 ; 142 1 1 7674
Asp Phe Asp Asn Vai Vai Vai Ser Pro Gly Pro Gly His Pro Ala Thr 50 55 60 GAC ACC GAC CTG GGC CTC AGC CG C CGG GTG ATC ACC G AA TGG G AC CTG 300
Asp Thr Asp Leu Gly Leu Ser Arg Arg Vai Ile Thr Glu Trp Asp Leu 65 70 75 80 CCG CTG CTC GGG GTG TGC CTG GGC CAC CAG GCC CTG TGC CTG CTC GCC 348
Pro Leu Leu Gly Vai Cys Leu Gly His Gin Ala Leu Cys Leu Leu Ala 85 90 95 GGC GCC GCC GTC GTC CAC GCA CCC GAA CCC TTT CAC GGC CGC ACC AGC 396
Gly Ala Ala Vai Vai His Ala Pro Glu Pro Phe His Gly Arg Thr Ser 100 105 110 GAC ATC CGC CAC GAC GGG CAG GGC CTG TTC GCG AAC ATC CCC TCC CCG 444
Asp Ile Arg His Asp Gly Gin Gly Leu Phe Ala Asn Ile Pro Ser Pro 115 120 125 CTG ACC GTG GTC CGC TAC CAC TCG CTG ACC GTC CGG CAA CTG CCC GCC 492
Leu Thr Vai Vai Arg Tyr His Ser Leu Thr Vai Arg Gin Leu Pro Ala 130 135 140 GAC CTG CGC GCC ACC GCC CAC ACC GCC GAC GGG CAG CTG ATG GCC GTC 540
Asp Leu Arg Ala Thr Ala His Thr Ala Asp Gly Gin Leu Met Ala Vai 145 150 155 160 GCC CAC CGC CAC CTG CCC CGC TTC GGC GTG CAG TTC CAC CCC GAA TCG 588
Ala His Arg His Leu Pro Arg Phe Gly Vai Gin Phe His Pro Glu Ser 165 170 175 ATC AGC AGC GAA CAC GGC CAC CGG ATG CTC GCC AAC TTC CGC GAC CTG 636
Ile Ser Ser Glu His Gly His Arg Met Leu Ala Asn Phe Arg Asp Leu 180 185 190 TCC CTG CGC 645
Ser Leu Arg 195 * · • · ··· • · • · (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10: ···* (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: * * (A) LONGUEUR: 1052 paires de bases * .*. (B) TYPE: acide nucleique : (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: lineaire • * * (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
. .*. (iii) HYPOTHETIQUE: NON
• * « • · ·
(iii) ANTI-SENS: NON
• · • · · (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: S.pristinaespiralis ·:**: (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
. (A) NOM/CLE: CDS
. (B) EMPLACEMENT: 84..962 *.ί·* (D) AUTRES RENSEIGNEMENTSr /product= "Gene PapM" 117674 143 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: CTCGAGGACG AGTGGATCGC CTCCGGCGGC GCCCCCGTCC CCACGCCCGT GCACGCGTCC 60 GCGTCCGCGC GGGGGGCCGT GTC GTG ACC GCC GCC GCA CCC ACC CTC GCC 110
Val Thr Ala Ala Ala Pro Thr Leu Ala 1 5 CAG GCG CTG GAC GAG GCC ACC GGG CAG CTG ACC GGC GCC GGG ATC ACC 158
Gin Ala Leu Asp Glu Ala Thr Gly Gin Leu Thr Gly Ala Gly He Thr 10 15 20 25 GCC GAC GCC GCC CGG GCC GAC ACC CGG CTG CTG GCC GCC CAC GCC TGC 206
Ala Asp Ala Ala Arg Ala Asp Thr Arg Leu Leu Ala Ala His Ala Cys 30 35 40 CAG GTC GCC CCG GGG GAC CTC GAC ACC TGC CTG GCC GGC CCG GTG CCG 254
Gin Val Ala Pro Gly Asp Leu Asp Thr Cys Leu Ala Gly Pro Val Pro 45 50 55 CCC CGG TTC TGG CAC TAC GTC CGG CGC CGT CTG ACC CGC GAA CCC GCC 302
Pro Arg Phe Trp His Tyr Val Arg Arg Arg Leu Thr Arg Glu Pro Ala 60 65 70 GAA CGC ATC GTC GGC CAC GCC TAC TTC ATG GGC CAC CGC TTC GAC CTG 350
Glu Arg He Val Gly His Ala Tyr Phe Met Gly His Arg Phe Asp Leu 75 80 85 GCC CCC GGC GTC TTC GTC CCC AAA CCC GAG ACC GAG GAG ATC ACC CGG 398
Ala Pro Gly Val Phe Val Pro Lys Pro Glu Thr Glu Glu He Thr Arg 90 95 100 105 GAC GCC ATC GCC CGC CTG GAG GCC CTC GTC CGC CGC GGC ACC ACC GCA 446
Asp Ala He Ala Arg Leu Glu Ala Leu Val Arg Arg Gly Thr Thr Ala 110 115 120 ... CCC CTG GTC GTC GAC CTG TGC GCC GGA CCG GGC ACC ATG GCC GTC ACC 494 • * Ϊ Pro Leu Val Val Asp Leu Cys Ala Gly Pro Gly Thr Met Ala Val Thr 125 130 135 • * • * CTG GCC CGC CAC GTA CCG GCC GCC CGC GTC CTG GGC ATC GAA CTC TCC 542 ,,)·* Leu Ala Arg His Val Pro Ala Ala Arg Val Leu Gly He Glu Leu Ser . 140 145 150 • · * t · * · - ; #·# CAG GCC GCC GCC CGC GCC GCC CGG CGC AAC GCC CGC GGC ACC GGC GCC 590 ϊ,; : Gin Ala Ala Ala Arg Ala Ala Arg Arg Asn Ala Arg Gly Thr Gly Ala 155 160 165 • · * CGC ATC GTG CAG GGC GAC GCC CGC GAC GCC TTC CCC GAA CTG AGC GGC 638
Arg He Val Gin Gly Asp Ala Arg Asp Ala Phe Pro Glu Leu Ser Gly . 170 175 180 185 • * * • · · .*··. ACC GTC GAC CTC GTC GTC ACC AAC CCG CCC TAC ATC CCC ATC GGA CTG 686 *...* Thr Val Asp Leu Val Val Thr Asn Pro Pro Tyr He Pro He Gly Leu 190 195 200 **·, CGC ACC TCC GCA CCC GAA GTG CTC GAG CAC GAC CCG CCG CTG GCC CTG 734 ^ "·*: Arg Thr Ser Ala Pro Glu Val Leu Glu His Asp Pro Pro Leu Ala Leu . 205 210 215 ; TGG GCC GGG GAG GAG GGC CTC GGC ATG ATC CGC GCC ATG GAA CGC ACC · 782 ..,.: Trp Ala Gly Glu Glu Gly Leu Gly Met He Arg Ala Met Glu Arg Thr • · 144 117674 220 225 230 GCG GCC CGG CTG CTG GCC CCC GGC GGC GTC CTG CTC CTC GAA CAC GGC 830
Ala Ala Arg Leu Leu Ala Pro Gly Gly Val Leu Leu Leu Glu His Gly 235 240 245 TCC TAG CAA CTC GCC TCC GTG CCC GCC CTG TTC CGC GCA ACC GGC CGC 878
Ser Tyr Gin Leu Ala Ser Val Pro Ala Leu Phe Arg Ala Thr Gly Arg 250 255 260 265 TGG AGC CAC GCC TCG TCC CGT CCC ACC TGC AAC GAC GGC TGC CTG ACC 926
Trp Ser His Ala Ser Ser Arg Pro Thr Cys Asn Asp Gly Cys Leu Thr 270 275 280 GCC GTA CGC AAC CAC ACC TGC GCA CCG CCC GCC TGACACGGCG TCACGGCACG 979 Ala Val Arg Asn His Thr Cys Ala Pro Pro Ala 285 290 GCCGGCCTGT CGGCAACGAC CCTACGCCAT TGACAAACCG ACCGTGCCGT TTTTTTAATG 1039 TCGGGGTGGC GGA 1 052 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: j (A) LONGUEUR: 227 paires de bases (B) TYPE: acide nucleique ' (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON J·.·. (vi) ORIGINS: : .* (A) ORGANISME: S.pristinaespiralis ···''' (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
.:. (A) NOM/CLE: CDS
...: (B) EMPLACEMENT: 3..227 ....; (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /product» "Partie du gene SnbC" • · • · • · * ί.: : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: • · · *·* * AG ATC TTC GAG CAC AAG ACC GTC GCC CAG CTC GCA CCC GTC GCC GAG 47 lie Phe Glu His Lys Thr Val Ala Gin Leu Ala Pro Val Ala Glu 1 5 10 15 • · · ACG CTC GCC GAC ACC ACC CGC GAG GAA CCC GCC GCC GTC GCC GCG ACC 95 .*·*. Thr Leu Ala Asp Thr Thr Arg Glu Glu Pro Ala Ala Val Ala Ala Thr *·..* 20 ' 25 30 ♦ Ί GGC GAC GTA CCG CTC ACC CCG ATC ATG CAC TGG CTG CGC GAA CGC GGC 143 ***. Gly Asp Val Pro Leu Thr Pro lie Met His Trp Leu Arg Glu Arg Gly ·:··: 35 40 45 . .·. GGC CCC GTC GAC GCG TTC AGC CAG ACG ATG GCC GTC ACC GTC CCC GCC 191 *.:.· Gly Pro Val Asp Ala Phe Ser Gin Thr Met Ala Val Thr Val Pro Ala ....: 50 55 60 • · . · i 117674 145 GGC CTG GAC CGG GAA CGG CTC GTG GCC GCC CTG CAG 227
Gly Leu Asp Arg Glu Arg Leu Val Ala Ala Leu Gin 65 70 75 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 247 paires de bases (B) TYPE: acide nucleique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: lineaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ill) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISMS: S.pristinaespiralis (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..247 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /product= "Partie du gene SnbC" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: CTC GAG TAC GAC ACC GCC CTG TAC GAG CGG GCC ACC GCC GAA GCC CTC 48
Leu Glu Tyr Asp Thr Ala Leu Tyr Glu Arg Ala Thr Ala Glu Ala Leu 1 5 10 15 . ' ACC GGC CGG CTG CTG CGG CTC CTC GAC GCC GTC GTC ACC GAC CCG CAG 96
Thr Gly Arg Leu Leu Arg Leu Leu Asp Ala Val Val Thr Asp Pro Gin 20 25 30 • · ·***; GCG CCG GTC GGC TCC CAC GAC CTC CTC GAA GAG GCC GAA CAC GCC CGC 144 *··* Ala Pro Val Gly Ser His Asp Leu Leu Glu Glu Ala Glu His Ala Arg ··· 35 40 45 ·;··; CTG GCA GCC TTC AAC GAC ACC GCC CGG CCC GTG CCG CGA GCC GGC CTC 192
Leu Ala Ala Phe Asn Asp Thr Ala Arg Pro Val Pro Arg Ala Gly Leu : 50 55 eo • · · · GCC GAA CTC TTC ACC GCC CAG GCC CGC CGC ACC GCC GAT GCG GTC GCC 240 * Ala Glu Leu Phe Thr Ala Gin Ala Arg Arg Thr Ala Asp Ala Val Ala 65 70 75 80 : gtc gtc g 247 vai vai • t * · *·· e «·· (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13: ’ * (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: *. (A) LONGUEUR: 192 paires de bases I ! ΐ (B) TYPE: acide nucleique **'. (C) NOMBRE DE BRINS: double · *:*·: (D) CONFIGURATION: lineaire 117674 146 (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETJQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: S.pristinaespiralis (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 3..192 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /product» "Partie du gene SnbD" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: GC ATG CCC CCC GTC ACC CCC TAC CGC GCC TAG CTG GCC CAC CTC GCC 47
Met Pro Pro Val Thr Pro Tyr Arg Ala Tyr Leu Ala His Leu Ala 1 5 10 15 GGC CGT GAC GAC GAC GCC GCC CGC GCC GCG TGG CGG ACC GCC CTC GCG 95
Gly Arg Asp Asp Asp Ala Ala Arg Ala Ala Trp Arg Thr Ala Leu Ala 20 25 30 GAC CTG GAG GAG CCG AGC CTC GTC GCG GGC GCC GGA GCA GGC CGC GGC 143 .5
Asp Leu Glu Glu Pro Ser Leu Val Ala Gly Ala Gly Ala Gly Arg Gly 35 40 45 GCC GCC GAC GGC TCC GCC CTG CCC GGC CAG ATC CCC GGT TAC CGA GCT C 192
Ala Ala Asp Gly Ser Ala Leu Pro Gly Gin lie Pro Gly Tyr Arg Ala 50 55 60 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 14: • · · • f · : . (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: :***· (A) LONGUEUR: 474 paires de bases ·** (B) TYPE: acide nucläique ·;· (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
: (iii) HYPOTHETIQUE: NON
• · *
*** ' (iii) ANTI-SENS: NON
. (vi) ORIGINE: ::: (A) ORGANISME: S.pristinaespiralis • Φ · :'**: (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
‘I* (A) NOM/CLE: CDS
.·**, (B) EMPLACEMENT: 1..474 *...* (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /product» "Partie du gene SnbD" Φ····'' *. (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14: t · · * · » CTG CAG GTC GAG GGC CGG CCC GCG CAC CTG GAA CTG CCC TGC GAC CAC 48 *:**: Leu Gin Val Glu Gly Arg Pro Ala His Leu Glu Leu Pro Cys Asp His 117674 147 1 5 10 1 h CCC CGG CCC GCC GTC GCC ACC CAC CGC GGC GCC ACC GTG CCC TTC CAC 96
Pro Arg Pro Ala Vai Ala Thr His Arg Gly Ala Thr Vai Pro Phe His 20 25 30 ATC GAC GCC GGC CTC CAC GAG AAG CTG ACC GCG CTC TCC AAG GCC TGC 144
Ile Asp Ala Gly Leu His Glu Lys Leu Thr Ala Leu Ser Lys Ala Cys 35 40 45 GAC AGC AGC CTG TTC ATG GTG CTC CAG GCC GCG GTC GCC GCC CTG CTC 192
Asp Ser Ser Leu Phe Met Vai Leu Gin Ala Ala Vai Ala Ala Leu Leu 50 55 60 ACC CGG CAC GGC GCC GGC ACC GAC ATC CCC GTC GGC AGC CCC GTC GCC 240
Thr Arg His Gly Ala Gly Thr Asp Ile Pro Vai Gly Ser Pro Vai Ala 65 70 75 80 GGC CGC ACC GAC GAC GCC CTC GAC GAC CTG GTG GGC TTC TTC GTC AAC 288
Gly Arg Thr Asp Asp Ala Leu Asp Asp Leu Vai Gly Phe Phe Vai Asn 85 90 95 ACC CTC GTC CTG CGC ACC GAC ACC TCC GGC GAC CCC ACC TTC CGC GAA 336
Thr Leu Vai Leu Arg Thr Asp Thr Ser Gly Asp Pro Thr Phe Arg Glu 100 105 110 CTC GTC GCA CGC GTG CGG CAG TTC GAC CTC GCC GCC TAC ACG CAC CAG 384
Leu Vai Ala Arg Vai Arg Gin Phe Asp Leu Ala Ala Tyr Thr His Gin 115 120 125 GAC ATG CCG TTC GAA AAG CTC GTC GAA GAG GTC AAC CCC GAG CGC TCC 432
Asp Met Pro Phe Glu Lys Leu Vai Glu Glu Vai Asn Pro Glu Arg Ser 130 135 140 CTG GCC CGC AAC CCG CTC TTC CAG GTC GTC CTG GCG CTG CAG 474
Leu Ala Arg Asn Pro Leu Phe Gin Vai Vai Leu Ala Leu Gin 145 150 155 • · · • · • · :***: (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 15: ·*· (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 485 paires de bases *"*! (B) TYPE: acide nucleique . . (C) NOMBRE DE BRINS: double :.·· (D) CONFIGURATION: lineaire • ♦ · ' v : (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON
(Vi) ORIGINE: - • (A) ORGANISME: S.pristinaespiralis **·*] (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
*:··· (A) NOM/CLE: CDS
. (B) EMPLACEMENT; 3..485 , (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /product= "Partie du gene SnbE" • · · • · · (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15: 117674 148 GC ATG CCG CGC TCC CTC GAC CTG TAC GTC GCA CTG CTC GCC GTC CTC 47
Met Pro Arg Ser Leu Asp Leu Tyr Val Ala Leu Leu Ala Val Leu 1 5 10 15 AAG ACC GGC GCC GCC TAC CTG CCC GTC GAC ATC TCC TAC CCG GCC GAA 95
Lys Thr Gly Ala Ala Tyr Leu Pro Val Asp lie Ser Tyr Pro Ala Glu 20 25 30 CGC ATC GCG TTC ATG ATC GAG GAC GCC CGC CCG GTG ACC GTC CTC GAC 143
Arg lie Ala Phe Met lie Glu Asp Ala Arg Pro Val Thr Val Leu Asp 35 40 45 CGC CTG CCC GAC GAC CTG GGC GCC TAC CGG GAC ACC GAC CTC ACC GAC 191
Arg Leu Pro Asp Asp Leu Gly Ala Tyr Arg Asp Thr Asp Leu Thr Asp 50 55 60 GCC GAC CGC ACG GCG CCG CTA CGG CCC GAA CAC CCG GCG TAC GTC ATC 239
Ala Asp Arg Thr Ala Pro Leu Arg Pro Glu His Pro Ala Tyr Val lie 65 70 75 CAC ACC TCC GGC TCC ACC GGC ACC CCC AAG GCC GTC GTC ATG CCC CAC 287
His Thr Ser Gly Ser Thr Gly Thr Pro Lys Ala Val Val Met Pro His 80 85 90 95 : .i GCC GGC CTG GTC AAC CTG CTG ACC TGG CAC GCC CGC CGC TTC CCC GGC 335
Ala Gly Leu Val Asn Leu Leu Thr Trp His Ala Arg Arg Phe Pro Gly 100 105 110 GGC ACC GGG GTG CGC ACC GCC CAG TTC ACC GCC ATC GGC TTC GAC TTC 383
Gly Thr Gly Val Arg Thr Ala Gin Phe Thr Ala lie Gly Phe Asp Phe 1 1 5 1 20 1 25 TCG GTG CAG GAG ATC CTC TCC CCG CTC GTC ATG GGC AAG ACC CTC GCC 431
Ser Val Gin Glu lie Leu Ser Pro Leu Val Met Gly Lys Thr Leu Ala 130 135 140 ·*·'. GTG CCC TCG GAA GAG GTC CGC CAC AGC GCC GAA CTG CTG GCC GGC TGG 479 *t * Val Pro Ser Glu Glu Val Arg His Ser Ala Glu Leu Leu Ala Gly Trp : **J 145 150 155 ··· *·· CTC GAG 485 ·***, Leu Glu ‘ *:·*: 160 : . .
"I.1 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 16: t · * * · · * (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 291 paires de bases • (B) TYPE: acide nucleique !t; Ϊ (C) NOMBRE DE BRINS: double m (D) CONFIGURATION: lineaire • · *" (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc * · · • *
*···' (iii) HYPOTHETIQUE: NON
• » · · «
* * (iii) ANTI-SENS: NON
• j i,:*: (vi) ORIGINE: ***. (A) ORGANISME: S.pristinaespiralis • : 149 Π 7674 (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT; 1..291 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /product» "Partie du gene SnbE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE; SEQ ID NO: 16: CTG CAG GCC GAG GGC GCC GAA GTG AGC CTG CTG GCC GTC CTC GAC GGC 48
Leu Gin Ala Glu Gly Ala Glu Vai Ser Leu Leu Ala Vai Leu Asp Gly 1 5 10 15 TAC CCC GAC GCC TAC GAC GGC ACC G AG CAC GAG GTC GGC GAG GAA CAG 96
Tyr Pro Asp Ala Tyr Asp Gly Thr Glu His Glu Vai Gly Glu Glu Gin 20 25 30 GTC CTG GCG ATC CTC CTC AAC GCC GCC GGC GTC GAC CGG GCC CAG GCC 144
Vai Leu Ala Ile Leu Leu Asn Ala Ala Gly Vai Asp Arg Ala Gin Ala 35 40 45 TTC GGC GAC GCC CCC CTC CAA CGG GCC GCC GTG CTC GAG AAG CTG CGC 192
Phe Gly Asp Ala Pro Leu Gin Arg Ala Ala Vai Leu Glu Lys Leu Arg 50 55 60 GAC AGC GGC AGC GCC CTG GGC AAC CTC GAC GAC GAC GCG GTC GGC CGC 240
Asp Ser Gly Ser Ala Leu Gly Asn Leu Asp Asp Asp Ala Vai Gly Arg 65 70 75 80 ATG GTC ACC GTC TTC CTC AAC AAC ACG CGC CTC ATC CAG AAC TTC CGG 288 ;
Met Vai Thr Vai Phe Leu Asn Asn Thr Arg Leu Ile Gin Asn Phe Arg 85 90 95 CCC 291
Pro ·· · ♦ · ' *·· • 1 ·♦··. ....
* · · • ’ · · * 1 · · » 5 • · · 1 « • 1 • 1 • · · • •a • · · · • · · • 1 » • · · • · · • 1 1 ··· • · · • · • · * « · #·« • · • · .·; ···.' ····· • · Λ • ; • · · • » · • · 1 ·
Claims (19)
1. Nukleotidisekvenssi, joka koodittaa polypepti-diä, joka liittyy streptogramiinien biosynteesiin, 5 tunnettu siitä, että se valitaan seuraavista: (a) geenit snaA (sekvenssi tunnusnumero 2), snaB (sekvenssi tunnusnumero 3), snaC (sekvenssi tunnusnumero 7), snap (sekvenssi tunnusnumero 8), papA (sekvenssi tunnusnumero 9), papM (sekvenssi tunnusnumero 10), samS (sek- 10 venssi tunnusnumero 4), snbA (sekvenssi tunnusnumero 5), snbC (sekvenssit tunnusnumero 11 ja 12), snbD (sekvenssit tunnusnumero 13 ja 14), snbE (sekvenssit tunnusnumero 15 ja 16) ja snbR (sekvenssi tunnusnumero 6), (b) sekvenssit, jotka hybridisoituvat geeneihin (a) 15 ja koodittavat polypeptidiä, joka liittyy streptogramiinien biosynteesiin, ja (c) sekvenssit, jotka saadaan sekvensseistä (a) geneettisen koodin degeneroitumisen johdosta.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen nukleotidise-20 kvenssi, tunnettu siitä, että se valitaan geeneistä snaA, snaB, snaC, snaD, papA, papM, samS, snbA, ·*·*· snbC, snbD, snbE ja snbR.
• * - " ;***; 3. Yhdistelmä-DNA, joka käsittää patenttivaatimuk- ·*# sen 2 mukaisen streptogramiinien biosynteesigeenin. • * · · _ ^ ....· 25
4. Itsenäisesti replikoituva ja/tai integroituva • ft . ilmentämisvektori, tunnettu siitä, että se käsit- tää joko patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen nukleotidi- • · * sekvenssin tai patenttivaatimuksen 3 mukaisen yhdistelmä-DNA:n. ft 30
, 5. Yhdistelmä-DNA-solu, joka sisältää patenttivaa- • Φ * timuksen 4 mukaisen ilmentämisvektorin.
.***. 6. Menetelmä polypeptidin tuottamiseksi, joka .III: liittyy streptogramiinien biosynteesiin, tunnettu - • · siitä, että viljellään patenttivaatimuksen 5 mukaista yh-:.:.J 35 distelmä-DNA-solua ja otetaan talteen tuotettu polypeptidi. • · d 117674 151 f
7. Patenttivaatimuksen 5 mukaisen yhdistelmä-DNA-solun, joka ilmentää vähintään yhtä polypeptidiä, joka liittyy streptogramiinien biosynteesiin, käyttö biokonver-sioreaktiossa.
8. Joko patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen nuk- leotidisekvenssin tai patenttivaatimuksen 3 mukaisen yh-distelmä-DNA:n tai patenttivaatimuksen 4 mukaisen vektorin käyttö streptogramiinien tuotannon lisäämiseksi.
9. Menetelmä streptogramiinien tuottamiseksi, 10 tunnettu siitä, että: streptogramiineja tuottavaan soluun tai soluun, joka mahdollisesti on streptogramiinien tuottaja, viedään : ja/tai siinä monistetaan yksi tai useampi jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen sekvenssi ja/tai vektori, 15 viljellään mainittua solua streptogramiinien tuo tanto-olosuhteissa ja otetaan talteen tuotetut streptogramiinit.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä pris- . tinamysiinien, mikamysiinien tai virginiamysiinien tuotta- ΐ 20 miseksi.
11. Menetelmä solujen valmistamiseksi, jotka on • · » ί ·* salvattu streptogramiinien biosynteesireitin jossain vai- • * · *...· heessa, tunnettu siitä, että suoritetaan strepto- gramiinia tuottavalle solulle biosynteesireitin vähintään "**i 25 yhden geenin mutagenisointi, jolloin mainittu geeni vali- • taan geeneistä snaA (sekvenssi tunnusnumero 2) , snaD (sek- ·♦♦ · - venssi tunnusnumero 8) , papA (sekvenssi tunnusnumero 9) , ♦ samS (sekvenssi tunnusnumero 4) ja snbA (sekvenssi tunnus- . .·. numero 5) . * * ·
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, • · *1’ tunnettu siitä, että mutagenisointi suoritetaan in • · · vitro tai in situ yhden tai useamman emäksen suppressiol-la, substituutiolla, deleetiolla ja/tai additiolla kysees-' sä olevassa geenissä, tai geenin katkaisulla. • · *
13. Streptogramiineja tuottavan mikro-organismin • * mutantti, tunnettu siitä, että siinä on geneetti- .152 117674 nen modifikaatio vähintään yhdessä geenissä, joka liittyy streptogramiinien biosynteesiin, jolloin mainittu geeni valitaan geeneistä snaA (sekvenssi tunnusnumero 2), snaD (sekvenssi tunnusnumero 8) , papA (sekvenssi tunnusnumero 5 9) , samS (sekvenssi tunnusnumero 4) ja snbA (sekvenssi tunnusnumero 5) .
14. Menetelmä streptogramiinien biosynteesiväli-tuotteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että: valmistetaan solu, joka on salvattu streptogramii-10 nien biosynteesireitin jossain vaiheessa, patenttivaatimuksen 11 mukaan, viljellään mainittua solua ja otetaan talteen akkumuloitunut välituote.
15. Menetelmä streptogramiinien molekyyli}ohdan-15 naisen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että: valmistetaan solu, joka on salvattu streptogramiinien biosynteesireitin jossain vaiheessa, patenttivaatimuksen 11 mukaan, ϊ viljellään mainittua solua ja 20 modifioidaan tämän solun akkumuloimaa välituotet- tt ta, mahdollisesti kasvualustasta erotuksen jälkeen.
• · · • ·* 16. Menetelmä streptogramiinien valmistamiseksi, • * * * · *·.·* tunnettu siitä, että viljellään patenttivaatimuk- sen 13 mukaista solua, joka lisäksi sisältää jonkin pa- ; • '1 *·*’· 25 tenttivaatimuksen 1 - 4 mukaisen nukleotidisekvenssin j • · ...... ·! jj ! }a/tai yhdistelmä-DNA:n ja/tai ilmentämisvektorin.
17. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen sek- venssin ja/tai vektorin käyttö hybridiantibioottien val- . mistamiseksi. ♦ · # »·« .···. 30
18. Polypeptidi, joka saadaan ilmentämällä joko * · *" patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen sekvenssi. ··· * ·
19. Polypeptidi, joka valitaan polypeptideistä **“· SnaA (sekvenssi tunnusnumero 2), SnaB (sekvenssi tunnusnu- . .·. mero 3), SnaC (sekvenssi tunnusnumero 7), SnaD (sekvenssi • * · * · * 35 tunnusnumero 8) , PapA (sekvenssi tunnusnumero 9) , PapM • * (sekvenssi tunnusnumero 10), SamS (sekvenssi tunnusnumero 117674 4), SnbA (sekvenssi tunnusnumero 5), SnbC (sekvenssit tunnusnumero 11 ja 12) , SnbD (sekvenssit tunnusnumero 13 ja 14), SnbE (sekvenssit tunnusnumero 15 ja 16) ja SnbR (sekvenssi tunnusnumero 6). * · · ··· • * • · • · · • · • · • · · * • · · Φ ·· · · • · ··· • * · • * * * ·*· * · * * * · ··· ♦ * * • · * • * · * · • · ♦ * * *·· * · • φ • · · * · k- • · * • Φ · * * * Φ Φ 1 1 7674
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9211441A FR2696189B1 (fr) | 1992-09-25 | 1992-09-25 | Polypeptides impliqués dans la biosynthèse des streptogramines, séquences nucléotidiques codant pour ces polypeptides et leur utilisation. |
| FR9211441 | 1992-09-25 | ||
| PCT/FR1993/000923 WO1994008014A1 (fr) | 1992-09-25 | 1993-09-25 | Polypeptides impliques dans la biosynthese des streptogramines, sequences nucleotidiques codant pour ces polypeptides et leur utilisation |
| FR9300923 | 1993-09-25 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI951403L FI951403L (fi) | 1995-03-24 |
| FI951403A0 FI951403A0 (fi) | 1995-03-24 |
| FI117674B true FI117674B (fi) | 2007-01-15 |
Family
ID=9433883
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI951403A FI117674B (fi) | 1992-09-25 | 1995-03-24 | Polypeptidit, jotka liittyvät streptogramiinien biosynteesiin, näitä polypeptidejä koodittavat nukleotidisekvenssit, ja niiden käyttö |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5891695A (fi) |
| EP (1) | EP0662134B1 (fi) |
| JP (1) | JP4036467B2 (fi) |
| KR (1) | KR100359226B1 (fi) |
| AT (1) | ATE314477T1 (fi) |
| AU (2) | AU692138B2 (fi) |
| CA (1) | CA2145523C (fi) |
| DE (1) | DE69333954T2 (fi) |
| DK (1) | DK0662134T3 (fi) |
| ES (1) | ES2253737T3 (fi) |
| FI (1) | FI117674B (fi) |
| FR (1) | FR2696189B1 (fi) |
| MX (1) | MX9305913A (fi) |
| NZ (1) | NZ256053A (fi) |
| TW (1) | TW570978B (fi) |
| WO (1) | WO1994008014A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA937102B (fi) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6670157B1 (en) * | 1999-01-15 | 2003-12-30 | Aventis Pharma S.A. | Polypeptides involved in the biosynthesis of streptogramins, nucleotide sequences coding for these polypeptides and their use |
| US6524812B1 (en) | 1993-10-07 | 2003-02-25 | Regents Of The University Of Minnesota | Genes encoding resistance to DNA alkylating agents |
| US6495348B1 (en) | 1993-10-07 | 2002-12-17 | Regents Of The University Of Minnesota | Mitomycin biosynthetic gene cluster |
| FR2713658B1 (fr) * | 1993-12-08 | 1996-04-12 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Séquences d'acides nucléiques régulatrices et utilisations. |
| FR2722210B1 (fr) * | 1994-07-08 | 1996-08-14 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouvelles streptogramines et procede de preparation de streptogramines par mutasynthese |
| FR2723373B1 (fr) | 1994-08-02 | 1996-09-13 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Forme purifiee de streptogramines, sa preparation et les compositions pharmaceutiques qui la contiennent |
| EP0870053A4 (en) | 1995-12-19 | 2002-09-11 | Univ Minnesota | METABOLIC METHOD FOR PRODUCING POLYHYDROXYALKANOATE MONOMER SYNTHASES |
| US6312920B1 (en) * | 1996-11-13 | 2001-11-06 | Eli Lilly And Company | SAM operon |
| FR2766489B1 (fr) | 1997-07-28 | 1999-08-27 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Derives de streptogramines, leur preparation et les compositions qui les contiennent |
| FR2767337B1 (fr) | 1997-08-14 | 2002-07-05 | Pasteur Institut | Sequences nucleiques de polypeptides exportes de mycobacteri es, vecteurs les comprenant et applications au diagnostic et a la prevention de la tuberculose |
| US6013510A (en) * | 1997-09-25 | 2000-01-11 | Becton, Dickinson And Company | Identification of a DNA region potentially useful for the detection of Mycobacterium kansasii |
| US7416699B2 (en) * | 1998-08-14 | 2008-08-26 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Carbon nanotube devices |
| US20020155445A1 (en) * | 1999-12-16 | 2002-10-24 | Jarvik Jonathan W. | Methods and products for peptide based DNA sequence identification and analysis |
| KR100526770B1 (ko) * | 2001-07-16 | 2005-11-08 | 서주원 | 스트렙토마이세스 속 균주 유래의 아데노실메치요닌 생합성 효소, 이를 코딩하는 유전자 염기서열 및 항생제를 포함하는 유용한 이차대사산물의 대량 생산방법 |
| FR2841563B1 (fr) * | 2002-06-28 | 2006-09-01 | Aventis Pharma Sa | Nouveaux variants du polypeptide papm de bacteries du genre streptomyces |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5959198A (ja) * | 1982-09-29 | 1984-04-04 | Sanraku Inc | 抗生物質ネオビリドグリゼイン２の新規な製造方法 |
| US5252474A (en) * | 1989-03-31 | 1993-10-12 | Merck & Co., Inc. | Cloning genes from Streptomyces avermitilis for avermectin biosynthesis and the methods for their use |
| FR2674539B1 (fr) * | 1991-03-28 | 1993-05-21 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de preparation enzymatique de macrolactone. |
-
1992
- 1992-09-25 FR FR9211441A patent/FR2696189B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-09-24 MX MX9305913A patent/MX9305913A/es active IP Right Grant
- 1993-09-24 ZA ZA937102A patent/ZA937102B/xx unknown
- 1993-09-25 EP EP93920919A patent/EP0662134B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-25 CA CA002145523A patent/CA2145523C/fr not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-25 US US08/403,852 patent/US5891695A/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-25 DK DK93920919T patent/DK0662134T3/da active
- 1993-09-25 AT AT93920919T patent/ATE314477T1/de active
- 1993-09-25 KR KR1019950701157A patent/KR100359226B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-25 WO PCT/FR1993/000923 patent/WO1994008014A1/fr active IP Right Grant
- 1993-09-25 NZ NZ256053A patent/NZ256053A/en not_active IP Right Cessation
- 1993-09-25 ES ES93920919T patent/ES2253737T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-25 TW TW082107903A patent/TW570978B/zh not_active IP Right Cessation
- 1993-09-25 AU AU48239/93A patent/AU692138B2/en not_active Expired
- 1993-09-25 JP JP50876694A patent/JP4036467B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-25 DE DE69333954T patent/DE69333954T2/de not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-03-24 FI FI951403A patent/FI117674B/fi not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-04-14 AU AU61891/98A patent/AU6189198A/en not_active Abandoned
-
1999
- 1999-01-15 US US09/231,818 patent/US6171846B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4036467B2 (ja) | 2008-01-23 |
| NZ256053A (en) | 1997-03-24 |
| TW570978B (en) | 2004-01-11 |
| EP0662134A1 (fr) | 1995-07-12 |
| AU6189198A (en) | 1998-06-11 |
| JPH08501696A (ja) | 1996-02-27 |
| CA2145523A1 (fr) | 1994-04-14 |
| WO1994008014A1 (fr) | 1994-04-14 |
| CA2145523C (fr) | 2003-06-03 |
| DE69333954D1 (de) | 2006-02-02 |
| ES2253737T3 (es) | 2006-06-01 |
| FI951403L (fi) | 1995-03-24 |
| DK0662134T3 (da) | 2006-05-22 |
| US6171846B1 (en) | 2001-01-09 |
| MX9305913A (es) | 1994-05-31 |
| ATE314477T1 (de) | 2006-01-15 |
| KR100359226B1 (ko) | 2003-04-18 |
| US5891695A (en) | 1999-04-06 |
| ZA937102B (en) | 1994-04-22 |
| AU4823993A (en) | 1994-04-26 |
| FR2696189B1 (fr) | 1994-11-10 |
| DE69333954T2 (de) | 2006-09-14 |
| FR2696189A1 (fr) | 1994-04-01 |
| AU692138B2 (en) | 1998-06-04 |
| EP0662134B1 (fr) | 2005-12-28 |
| FI951403A0 (fi) | 1995-03-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI117674B (fi) | Polypeptidit, jotka liittyvät streptogramiinien biosynteesiin, näitä polypeptidejä koodittavat nukleotidisekvenssit, ja niiden käyttö | |
| Steller et al. | Structural and functional organization of the fengycin synthetase multienzyme system from Bacillus subtilis b213 and A1/3 | |
| US7521222B2 (en) | Farnesyl dibenzodiazepinone and processes for its production | |
| KR100379100B1 (ko) | 스트렙토그라민및돌연변이합성에의한이의제조방법 | |
| AU783603B2 (en) | Transformant producing secondary metabolite modified with functional group and novel biosynthesis genes | |
| US6670157B1 (en) | Polypeptides involved in the biosynthesis of streptogramins, nucleotide sequences coding for these polypeptides and their use | |
| US6077699A (en) | Polypeptides involved in the biosynthesis of streptogramins, nucleotide sequences coding for these polypeptides and their use | |
| US7297524B2 (en) | Polynucleotides for production of farnesyl dibenzodiazepinones | |
| US7326782B2 (en) | Metabolic engineering of viomycin biosynthesis | |
| RU2351608C2 (ru) | НОВЫЕ ВАРИАНТЫ ПОЛИПЕПТИДА PapM БАКТЕРИЙ РОДА Streptomyces | |
| JP2009502187A (ja) | チオコラリンの生合成に関与する遺伝子およびその異種産生 | |
| Cho | Identification and molecular characterization of three isoforms of iturin produced by endophytic Bacillus sp. CY22 | |
| CA2538147A1 (en) | Farnesyl dibenzodiazepinone, processes for its production and its use as a pharmaceutical | |
| KR20050019808A (ko) | 스트렙토마이세스 속 세균의 ＰａｐＭ 폴리펩타이드의신규 변이체 | |
| Frustaci | Bradyrhizobium japonicum ferrochelatase: Isolation and characterization of mutants and thehemH gene | |
| Aiyada | Pleiotropic control of secondary metabolism and | |
| EP1520025A2 (en) | Nucleic acid molecules involved in the synthesis of melithiazols |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: AVENTIS PHARMA S.A. |
|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 117674 Country of ref document: FI |
|
| MA | Patent expired |