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ES2253737T3 - Polipeptidos implicados en la biosintesis de los estreptograminas, secuencias nucleotidicas que codifican estos polipeptidos y su utilizacion. - Google Patents

Polipeptidos implicados en la biosintesis de los estreptograminas, secuencias nucleotidicas que codifican estos polipeptidos y su utilizacion.

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ES2253737T3
ES2253737T3 ES93920919T ES93920919T ES2253737T3 ES 2253737 T3 ES2253737 T3 ES 2253737T3 ES 93920919 T ES93920919 T ES 93920919T ES 93920919 T ES93920919 T ES 93920919T ES 2253737 T3 ES2253737 T3 ES 2253737T3
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ES
Spain
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seq
gene
biosynthesis
fragment
streptogramins
Prior art date
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Expired - Lifetime
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ES93920919T
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English (en)
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Veronique Blanc
Francis Blanche
Joel Crouzet
Nathalie Jacques
Patricia Lacroix
Denis Thibaut
Monique Zagorec
Valerie De Crecy-Lagarde
Laurent Debussche
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Aventis Pharma SA
Original Assignee
Aventis Pharma SA
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Publication date
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Application filed by Aventis Pharma SA filed Critical Aventis Pharma SA
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LAS SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS QUE CODIFICAN UN POLIPEPTIDO IMPLICADO EN LA BIOSINTESIS DE LAS STREPTOGRAMINAS, CONTENIENDO LAS CELULAS RECOMBINANTES TALES SECUENCIAS, Y SU UTILIZACION.

Description

Polipéptidos implicados en la biosíntesis de las estreptograminas, secuencias nucleótidas que codifican estos polipéptidos y su utilización.
La presente invención se refiere a nuevos polipéptidos implicados en la biosíntesis de las estreptograminas y comprende, igualmente, el aislamiento y la identificación de los genes de la biosíntesis de los compuestos A y B de las estreptograminas, la expresión de estos genes con el fin de aumentar el rendimiento porcentual y su utilización para construir mutantes bloqueados que pueden conducir a la síntesis de nuevos antibióticos o a nuevas formas derivadas de las estreptograminas.
Las estreptograminas forman un grupo homogéneo de antibióticos constituidos por la asociación de dos tipos de moléculas químicamente diferentes; por una parte, las macrolactonas poliinsaturadas (compuestos del grupo A, de los que se presentan dos ejemplos de estructuras en la figura 1) y, por la otra parte, los depsipéptidos (compuestos del grupo B, de los que se presentan tres ejemplos de estructura en la figura 2). Este grupo comprende numerosos antibióticos (véanse la tabla 1 y la figura 3) conocidos con diferentes nombres en función de su origen tales como las pristinamicinas, las micamicinas y las virginiamicinas (para una revisión, véase Cocito 1979, 1983).
Los compuestos A y B tienen una actividad antibacteriana sinérgica que puede alcanzar 100 veces la de los compuestos separados y que, contrariamente a la de cada compuesto, es bactericida (Cocito 1979). Esta actividad es más particularmente eficaz contra las bacterias gram-positivas, como los estafilococos y los estreptococos (Cocito 1979, Videau 1982). Los compuestos A y B inhiben la síntesis proteica al fijarse a la subunidad 50S del ribosoma (Cocito 1979; para una revisión, véase Di Giambattista et al. 1989).
Las estreptograminas son esencialmente producidas por los actinomicetos, entre ellos numerosos estreptomicetos, presentados en la tabla 1. Además, las estreptograminas también son sintetizadas por eucariotas como Micromonospora, que sintetiza las vernamicinas. Los actinomicetos constituyen un grupo de microorganismos muy interesante debido a la cantidad importante de metabolitos secundarios que producen, entre los cuales hay numerosos antibióticos (beta-lactamas, tetraciclinas, macrólidos, aminoglucósidos, poliacetatos, etc.), herbicidas, antineoplásicos, antifúngicos, inmunomoduladores e inhibidores de enzimas. Hasta la fecha, ya se han estudiado numerosas vías de biosíntesis, con relación a los antibióticos que pertenecen a clases variadas, así como otros metabolitos secundarios como los pigmentos (para una revisión, Chater 1990), en los actinomicetos. Un aspecto importante de este grupo de bacterias es que los genes implicados en una misma vía de biosíntesis, genes estructurales, pero también gen(es) de resistencia y gen(es) de regulación, se agrupan físicamente sobre el cromosoma, constituyendo agrupamientos que pueden alcanzar más de 100 kb (Hopwood et al.1986a. Hopwood et al. 1986b, Hallam et al. 1988, Anzai et al. 1987, Ohnuki et al. 1985). Hasta la fecha, ningún ejemplo ha contradicho estos hallazgos. Una organización estructural como esta presenta un interés importante en el desarrollo de estrategias de clonación de los genes de biosíntesis. En efecto, es posible, a partir de un solo gen previamente clonado mediante técnicas diversas, gen de biosíntesis, de resistencia o de regulación, recorrer todo el cromosoma y aislarlo, así como el conjunto de genes del agrupamiento de biosíntesis.
Actualmente, el conocimiento de las vías de síntesis de cada uno de los componentes de las estreptograminas no es sino muy parcial, pero se ha identificado el origen de diferentes partes de cada molécula por marcación radiactiva (Kingston et al. 1983). Así, los compuestos del tipo A se forman de dos regiones procedentes de la condensación de acetatos y de varios aminoácidos como la serina y la glicina, por ejemplo. En cuanto a los compuestos de tipo B, los estudios han demostrado que todos los aminoácidos presentes en la cadena peptídica derivan de aminoácidos naturales (Hook et Vining 1973). Sin embargo, ningún polipéptido implicado en estas vías se ha purificado en cantidad suficiente hasta la fecha como para permitir su caracterización molecular, y no se ha descrito ningún gen de biosíntesis. En el procedimiento de biosíntesis de compuestos del tipo B, se pueden distinguir dos partes:
1)
Síntesis de precursores, o de sus análogos, del macrociclo: ácido 3-hidroxipicolínico, ácido L-2-aminobutírico, p-dimetilamino-L-fenilalanina, ácido 4-oxo-L-pipecólico y L-fenilglicina.
2)
Formación del macrociclo a partir de precursores citados anteriormente, de la L-treonina y de la L-prolina, o de sus análogos, con la modificación, opcionalmente, de estos precursores o de la N-metilación peptídica.
Hasta la fecha, el origen metabólico probable de los precursores del macrociclo de los compuestos del tipo B se ha determinado mediante estudios que utilizan isótopos marcados (Reed et al., 1986, Molinero et al., 1989, Reed et al., 1989).
La presente invención tiene su origen en la purificación de polipéptidos que intervienen en la biosíntesis de las estreptograminas así como de la clonación de los genes cuyo producto interviene en la biosíntesis de las estreptograminas. Se entiende que el término "biosíntesis de las estreptograminas" comprende los genes reguladores y los genes que confieren la resistencia a los microorganismos productores. La presente invención permite así aumentar el rendimiento porcentual de estos metabolitos gracias a las técnicas de ADN recombinante. Otro interés de la presente invención reside en la posibilidad, mediante la construcción de mutantes bloqueados en las diferentes etapas de esta biosíntesis, de producir intermediarios de síntesis de cada uno de los dos compuestos. Estos intermediarios pueden servir de sustratos en nuevas modificaciones por vía química, bioquímica, enzimática o microbiológica. También, el aislamiento de los genes de biosíntesis permite, mediante transferencia de genes entre cepas productoras, fabricar antibióticos híbridos que tienen propiedades farmacológicamente interesantes (Hopwood et al. 1985a, Hopwood et al. 1985b, Hutchinson et al. 1989). Otro interés de la presente invención reside en el hecho de que aporta un mejor conocimiento de las vías de biosíntesis de metabolitos clasificados como estreptograminas. En efecto, la invención permite construir cepas bacterianas o fúngicas en las que se expresa, bajo el control de señales de expresión apropiadas, una o varias proteínas que intervienen en la biosíntesis de las estreptograminas. En tal caso, estas cepas se pueden utilizar para realizar bioconversiones. Estas bioconversiones se pueden realizar bien con la ayuda de células enteras, o bien con la ayuda de extractos acelulares de dichas células. Estas bioconversiones pueden permitir transformar una estreptogramina en una forma derivada, con una enzima de una vía de biosíntesis. Por ejemplo, la pristinamicina IIB se puede, de esta manera, transformar en pristinamicina IIA. El mismo razonamiento se puede aplicar a cualquier intermediario de biosíntesis.
Un primer objeto de la invención se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido implicado en la biosíntesis de las estreptograminas.
Más particularmente, se han aislado diversos genes cuyo producto interviene en la biosíntesis de las estreptograminas a partir de Streptomyces pristinaespiralis. Al estar las estreptograminas producidas por esta cepa más comúnmente designadas por el término pristinamicinas (véase la tabla 1), de aquí en adelante se hará referencia en algunos casos a los genes de biosíntesis de las pristinamicinas. Pero está claro que los resultados obtenidos se aplican al conjunto de las estreptograminas. Las pristinamicinas I y II corresponden, respectivamente, a los compuestos B y A de las estreptograminas. Así, las moléculas de la familia de las pristinamicinas II y de la familia de las pristinamicinas I designan pues, de aquí en adelante, los compuestos A y B de las estreptograminas, respectivamente.
La presente invención describe, en particular, el aislamiento y la caracterización de los genes snaA, snaB, snaC, snaD, papA, papM, samS, snbA, snbC, snbD, snbE y snbR. Estos genes se han aislado a partir de una genoteca genómica de S. pristinaespiralis. Esta genoteca se ha obtenido por digestión parcial del ADN genómico de S. pristinaespiralis con la enzima de restricción Sau3A. Los fragmentos de ADN grandes, de 40 a 50 kb de media, se han clonado en el cósmido pHC79 (Hohn, B., y Collins, J. F., 1980). Después de la encapsidación in vitro, se han transfectado las cepas de E. coli HB101 (Boyer y Roulland-Dussoix, 1969) y DH1 (Low, 1968). Así, la genoteca de ADN de S. pristinaespiralis se encuentra en dos cepas diferentes de E. coli.
Los genes snaA, snaB y samS (inicialmente denominado snaC) están presentes en el cósmido pIBV1 (figura 4). El producto de los genes snaA y snaB, que corresponden a los polipéptidos SnaA y SnaB, interviene en la última etapa de biosíntesis del compuesto II de las pristinamicinas (conversión de la pristinamicina IIB en pristinamicina IIA) que corresponde a la oxidación del enlace 2,3 de la D-prolina. Estos dos polipéptidos constituyen las dos subunidades de la pristinamicina IIA sintasa cuya purificación se describe en la presente invención. El producto del gen samS intervendría en la síntesis de la SAM (donante de grupos metilo) a partir de ATP y metionina. En efecto, el compuesto A de la mayoría de las estreptograminas está metilado en C-4 (figura 1), y se ha descrito (Kingston et al., 1983) que este metilo deriva del metilo de la metionina, muy probablemente por una reacción de metilación con la SAM. Por lo tanto, el gen samS codificaría una SAM sintasa (SamS; EC. 2.5.1.6) específica de la vía de biosíntesis de las pristinamicinas.
Los genes snbA, snbR, papA y papM están presentes en el cósmido pIBV2 (figura 5). El gen snbA corresponde, a partir de los estudios bioquímicos presentados en el ejemplo 5, a la primera etapa de la síntesis de las pristinamicinas I. Se trata de la activación del primer ácido de la cadena, el ácido 3-hidroxipicolínico, por adenilación. El gen snbR podría intervenir en el transporte de moléculas de la familia de las pristinamicinas I (véanse las pristinamicinas II) fuera de la célula después de la síntesis, lo que confiere así a la cepa productora una resistencia en este compuesto. El gen papA corresponde, a partir de los análisis de secuencia (ejemplo 8.8) y del estudio de un mutante al que se ha eliminado este gen (ejemplo 9.3), a un gen de biosíntesis de la para-aminofenilalanina a partir del corismato. A continuación, la para-aminofenilalanina es dimetilada por el producto del gen papM, una N-metiltransferasa descrita en la presente invención, para formar la para-dimetilaminofenilalanina que, luego, se incorpora en la pristinamicina IA. Así, los genes papA y papM intervienen en la síntesis de uno de los precursores de la pristinamicina IA.
Los genes snaA, snaD, snbC, snbD y snbE están presentes en el cósmido pIBV3 (figura 6) que, por lo tanto, linda con el cósmido pIBV1 en el cual el gen snaA ya está presente. El gen snaD codifica, después del análisis de su secuencia (ejemplo 8.9) y del estudio de un mutante al que se ha eliminado en este gen (ejemplo 9.5), una péptido sintasa implicada en la biosíntesis de la pristinamicina II. El gen snbC, cuyo producto se describe en la presente invención, interviene en la incorporación de los restos treonina y ácido aminobutírico en la cadena peptídica de la pristinamicina IA. El gen snbD, cuyo producto se describe también en la presente invención, está implicado en la incorporación de los restos prolina y para-dimetilaminofenilalanina en la cadena peptídica de la pristinamicina IA. También dirige la N-metilación del enlace peptídico entre estos 2 restos. Finalmente, el gen snbE, cuyo producto también se describe en la presente invención, interviene en la incorporación de los dos últimos restos de la pristinamicina IA, a saber, la fenilglicina y el ácido 4-oxopipecólico.
El gen snaC está presente en el cósmido pIBV4 (figura 7). Codifica una FMN:NADH oxidorreductasa, denominada igualmente como FMN reductasa, descrita en la presente invención y que proporciona a la pristinamicina IIA sintasa el FMNH_{2} a partir de FMN y de NADH. Por lo tanto, el gen snaC interviene en la etapa final de la biosíntesis de la pristinamicina IIA.
Estos distintos genes se han subclonado a partir de su cósmido de origen y se han determinado sus secuencias nucleicas. Los genes snaA, snaB y samS se han subclonado en un fragmento BamHI-BamHI de 6 kb, del que se ha secuenciado una parte (SEQ ID n.º 1). El gen snbA se ha subclonado en un fragmento EcoRI-BglII de 5,5 kb, del que se ha secuenciado una parte (SEQ ID n.º 5). El gen snbR se ha subclonado en un fragmento BglII-BglII de 4,6 kb, del que se ha secuenciado una parte (SEQ ID n.º 6). Una parte del gen papA se ha subclonado en un fragmento XhoI-XhoI de 3,4 kb, del que se ha secuenciado una parte (SEQ ID n.º 9). El gen papM se ha subclonado en un fragmento PstI-PstI de 4,1 kb, del que se ha secuenciado una parte (SEQ ID n.º 10). Una parte del gen snaD se ha subclonado en un fragmento BamHI-SstI de 1,5 kb, del que se ha secuenciado una parte (SEQ ID n.º 8). Una parte del gen snbC se ha subclonado en un fragmento SphI-SphI de 6,2 kb de las que se han secuenciado 2 regiones (SEQ ID n.º 11 y 12). Una parte del gen snbD se ha subclonado en un fragmento SphI-SphI de 8,4 kb del que se han secuenciado 2 regiones (SEQ ID n.º 13 y 14). Una parte del gen snbE se ha subclonado en un fragmento SphI-SphI de 6,6 kb del que se han secuenciado 2 regiones (SEQ ID n.º 15 y 16). El gen snaC se ha subclonado en un fragmento BamHI-BamHI de 4 kb, del que se ha secuenciado una parte (SEQ ID n.º 7).
La proximidad de los genes snaA, snaB, snaD, samS, snbC, snbD y snbE por una parte, así como de los genes snbA, snbR, papA y papM confirma que los genes de biosíntesis de los compuestos A y B de las estreptograminas se localizan en agrupamientos. Además, los 4 cósmidos descritos en la presente invención están reagrupados en una región del cromosoma de un peso estimado en 200 kb por electroforesis en campo pulsante, es decir, el 3% del genoma total (7500 kb) de Streptomyces pristinaespiralis (ejemplo 13). Por lo tanto, es evidente que las regiones que rodean los genes identificados en la presente invención (snaA, snaB, snaD, samS, snbC, snbD y snbE; snbA, snbR, papA y papM; snaC), contienen los otros genes del agrupamiento de biosíntesis de las pristinamicinas, y que estos genes se pueden utilizar para localizar los otros genes de biosíntesis de las estreptograminas.
Preferiblemente, la invención tiene por objeto una secuencia nucleotídica elegida entre:
a) todos o parte de los genes snaA (SEQ ID n.º 2), snaB (SEQ ID n.º 3), snaC (SEQ ID n.º 7), snaD (SEQ ID n.º 8), papA (SEQ ID n.º 9), papM (SEQ ID n.º 10), samS (SEQ ID n.º 4), snbA (SEQ ID n.º 5), snbC (SEQ ID n.º 11 y 12), snbD (SEQ ID n.º 13 y 14), snbE (SEQ ID n.º 15 y 16) y snbR (SEQ ID n.º 6),
b) las secuencias adyacentes a los genes a) que constituyen los agrupamientos de biosíntesis y que codifican los polipéptidos implicados en la biosíntesis de las estreptograminas,
c) las secuencias que se hibridan con todo o parte de los genes a) o b) y que codifican un polipéptido de la biosíntesis de las estreptograminas, y,
d) las secuencias derivadas de las secuencias a), b) y c) con motivo de la degeneración del código genético.
Todavía más preferiblemente, la invención tiene por objeto las secuencias nucleotídicas representadas por los genes snaA (SEQ ID n.º 2), snaB (SEQ ID n.º 3), snaC (SEQ ID n.º 7), snaD (SEQ ID n.º 8), papA (SEQ ID n.º 9), papM (SEQ ID n.º 10), samS (SEQ ID n.º 4), snbA (SEQ ID n.º 5), snbC (SEQ ID n.º 11 y 12), snbD (SEQ ID n.º 13 y 14), snbE (SEQ ID n.º 15 y 16) y snbR (SEQ ID n.º 6).
Otro objeto de la invención se refiere a todo ADN recombinante que comprende un gen de biosíntesis de las estreptograminas. Más preferiblemente, se trata de un ADN recombinante que comprende todos o parte de los cósmidos pIBV1, pIBV2, pIBV3 o pIBV4 como los representados en las figuras 4 a 7, o todas o parte de las secuencias que se hibridan con los cósmidos pIBV1 a pIBV4 o con fragmentos de los mismos.
En un modo preferido de la invención, las secuencias nucleotídicas definidas anteriormente forman parte de un vector de expresión, que puede ser de replicación autónoma o integrativo.
Como se indicó más arriba, aunque la invención se ilustre más particularmente con los genes de biosíntesis de la pristinamicina, está claro que los resultados obtenidos se aplican al conjunto de las estreptograminas.
Más particularmente, las técnicas desarrolladas en la presente invención para purificar proteínas o clonar genes de biosíntesis de las estreptograminas a partir de S. pristinaespiralis se pueden aplicar a otros microorganismos productores de estreptograminas (véase la tabla 1).
Así, la purificación de una actividad enzimática a partir de S. pristinaespiralis hace posible la purificación de la misma actividad a partir de otra cepa productora de estreptogramina. Por lo tanto, la presente invención se puede aplicar a la clonación de genes de biosíntesis de las estreptograminas a partir de cualquier microorganismo productor por purificación de una proteína que interviene en la biosíntesis, y después, con la ayuda de la secuencia del extremo NH_{2} de ésta, la síntesis de una sonda oligonucleotídica que permite clonar el gen correspondiente. Luego, un paseo sobre el cromosoma permite identificar el agrupamiento de biosíntesis en su totalidad.
Además, a partir de los genes identificados en la presente solicitud, es posible, por hibridación, clonar directamente los genes de biosíntesis de las estreptograminas a partir del ADN de otro microorganismo productor. En efecto, los genes de biosíntesis de las pristinamicinas se hibridan con fuerza a los de otras estreptograminas. También es posible clonar por hibridación los genes de biosíntesis de las estreptograminas utilizando, como sonda, los genes sna, snb o pap, o fragmentos de éstos, o los fragmentos adyacentes a éstos que contienen, como se demuestra en la presente invención, otros genes sna y snb. Esto es el resultado del hecho de que: 1) las estreptograminas producidas por los diferentes microorganismos tienen estructuras idénticas o similares (véanse las figuras 1 a 3), 2) los genes de biosíntesis de las estreptograminas se organizan en agrupamientos, y 3) los sistemas enzimáticos responsables de esta biosíntesis no tienen una especificidad absoluta por sus sustratos.
Por otro lado, la clonación de los genes implicados en la biosíntesis de las estreptograminas también se puede realizar utilizando oligonucleotídicos degenerados, preparados a partir de las secuencias de los genes sna o snb citados más arriba, o fragmentos de estos genes, o fragmentos contiguos a estos genes. También es posible ir a pescar los genes de biosíntesis de los compuestos A y B de diferentes cepas productoras de estreptograminas. Estas cepas pueden formar parte del género Streptomyces, pero también de otros géneros (véase la tabla 1). Además, si el ADN genómico de las cepas de partida utilizadas tiene una composición de G+C diferente a la observada en los Streptomyces, las sondas utilizadas se pueden sintetizar con un uso codones específico del género o de la especie a partir de la cual se quiere aislar el ADN.
Otro objeto de la presente invención se refiere a los polipéptidos que surgen de la expresión de las secuencias nucleotídicas definidas anteriormente. Más particularmente, la presente invención se refiere a los polipéptidos que comprenden todos o parte de los polipéptidos snaA (SEQ ID n.º 2), snaB (SEQ ID n.º 3), snaC (SEQ ID n.º 7), snaD (SEQ ID n.º 8), papA (SEQ ID n.º 9), papM (SEQ ID n.º 10), samS (SEQ ID n.º 4), snbA (SEQ ID n.º 5), snbC (SEQ ID n.º 11 y 12), snbD (SEQ ID n.º 13 y 14), snbE (SEQ ID n.º 15 y 16) y snbR (SEQ ID n.º 6) o derivados de éstos. En el sentido de la presente invención, el término "derivado" designa cualquier molécula obtenida por modificación de naturaleza genética y/o de la secuencia peptídica. Por "modificación de naturaleza genética y/o química" se puede entender cualquier mutación, sustitución, deleción, adición y/o modificación de uno o varios restos. Tales derivados se pueden generar con objetivos diferentes, tales como, especialmente, el de aumentar la afinidad del péptido por su(s) sustrato(s), el de mejorar sus niveles de producción, el de aumentar su resistencia a las proteasas, el de aumentar y/o modificar su actividad o el de conferir nuevas propiedades biológicas. Entre los derivados que surgen de una adición, se pueden citar, por ejemplo, los polipéptidos quiméricos que contienen una parte heteróloga adicional unida en un extremo. El término "derivado" comprende igualmente los polipéptidos homólogos a los polipéptidos descritos en la presente invención, procedentes de otras fuentes celulares y, particularmente, de cepas productoras de estreptograminas.
La invención también tiene por objeto cualquier célula recombinante que contenga una secuencia nucleotídica o un vector como el definido anteriormente. Las células recombinantes según la invención también pueden ser tanto células eucarióticas como procarióticas. Entre las células eucariotas que convienen, se pueden citar las células animales, las levaduras o los hongos. En particular, tratándose de levaduras, se pueden citar las levaduras del género Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces o Hansenula. Tratándose de células animales, se pueden citar las células COS, CHO, C127, los huevos de Xenopus, etc. Entre los hongos, se pueden citar más particularmente Micromonospora, Aspergillus ssp. o Trichoderma ssp. Como células procariotas, se prefieren utilizar las bacterias siguientes: los actinomicetos, particularmente Streptomyces, E. coli (ejemplo 11) y Bacillus. Preferiblemente, las células recombinantes de la invención se eligen entre las células productoras de estreptograminas (véase la tabla 1). Las células recombinantes de la invención se pueden obtener mediante cualquier método que permita introducir una secuencia nucleotídica foránea en una célula. Se puede tratar especialmente de transformación, electroporación, conjugación, fusión de protoplastos o de cualquier otra técnica conocida por el experto en la técnica.
La invención también tiene por objeto un procedimiento de producción de un polipéptido implicado en la biosíntesis de las estreptograminas según el cual se cultiva una célula recombinante según se definió anteriormente y se recupera el polipéptido producido.
La invención también tiene por objeto la utilización de una célula recombinante según se definió anteriormente que exprese al menos un polipéptido implicado en la biosíntesis de las estreptograminas en una reacción de bioconversión. En particular, estas células pueden permitir transformar una estreptogramina en una forma derivada. Por ejemplo, la pristinamicina IIB se puede, de esta manera, transformar en pristinamicina IIA. El mismo razonamiento se puede aplicar a cualquier intermediario de biosíntesis. Estas células también pueden permitir fabricar antibióticos híbridos que tengan propiedades farmacológicamente interesantes (Hopwood et al. 1985a, Hopwood et al. 1985b, Hutchinson et al. 1989). Estas bioconversiones se pueden realizar bien con la ayuda de células enteras, o bien con la ayuda de extractos acelulares de dichas células.
Otro objeto de la invención se refiere a la utilización de una secuencia nucleotídica según se definió anteriormente para amplificar la producción de estreptogramina. La invención también se refiere a un procedimiento de producción de estreptograminas según el cual se introduce y/o se amplifica en una célula productora de estreptograminas, o potencialmente productora de estreptograminas, una o varias secuencias nucleotídicas según la invención, se cultiva dicha célula en las condiciones de producción de las estreptograminas y se recuperan las estreptograminas producidas.
La sobreexpresión de determinados genes implicados en la biosíntesis puede permitir el aumento de la producción de las estreptograminas A y/o B de cepas productoras. Esta sobreproducción se puede realizar en numerosas cepas: ya sean cepas que sólo producen moléculas de la familia de las estreptograminas A, ya sean cepas que sólo producen moléculas de la familia de las estreptograminas B, ya sean cepas que producen los dos compuestos A y B. Estas sobreexpresiones pueden ser resultado del aumento de las tasas de síntesis, por lo tanto, de la productividad, de los compuestos A y/o B ya sea en un matraz, ya sea en pequeños fermentadores, o ya sea en grandes fermentadores industriales. Por otro lado, la sobreexpresión específica de un gen implicado en la biosíntesis de un compuesto A o B permite también hacer variar el % de compuestos A y B producidos por la cepa y, así, obtener una mejor sinergia entre estas moléculas. Además, los genes de biosíntesis aislados a partir de un microorganismo productor de estreptograminas se pueden utilizar para amplificar la producción en otro microorganismo productor.
Otro objeto de la invención se refiere a un procedimiento de preparación de células bloqueadas en una etapa de la vía de biosíntesis de las estreptograminas según el cual se realiza, sobre una célula productora de estreptograminas, la mutagénesis de al menos un gen de la vía de biosíntesis.
Preferentemente, la mutagénesis se realiza in vitro o in situ, por supresión, sustitución, deleción y/o adición de una o varias bases en el gen considerado o por interrupción génica.
Otro aspecto de la presente invención reside, en efecto, en la construcción de mutantes bloqueados en determinadas etapas de la biosíntesis de las estreptograminas. El interés reside, por una parte, en el estudio de la funcionalidad de proteínas mutadas y, por la otra parte, en la elaboración de cepas que produzcan intermediarios de la biosíntesis. Estos intermediarios se pueden modificar, opcionalmente después de la separación, ya sea añadiendo compuestos particulares a los medios de producción, ya sea por la introducción, en las cepas así mutadas, de otros genes capaces de modificar el intermediario sirviéndose de él como sustrato. Estos intermediarios también se pueden modificar por vía química, bioquímica, enzimática y/o microbiológica. En este contexto, se ha construido el mutante SP92::pVRC505 de la cepa S. pristinaespiralis SP92: S. pristinaespiralis SP92::pVRC505 se ha aislado por integración homóloga en el gen snaA de un plásmido suicida pVRC505, construido a partir del vector pDH5 y de un fragmento interno en el gen snaA. También se han construido los mutantes siguientes: SP92 samS::d2,amR; SP92::pVRC508; SP92::pVRC404 y SP92::pVRC1000 (ejemplo 9).
La invención se refiere, por lo tanto, también a un procedimiento de preparación de un intermediario de biosíntesis de las estreptograminas según el cual:
-
se prepara una célula bloqueada en una etapa de la vía de biosíntesis de las estreptograminas como la descrita anteriormente,
-
se cultiva dicha célula y
-
se recupera el intermediario acumulado.
La invención también se refiere a un procedimiento de preparación de una molécula derivada de las estreptograminas según el cual:
-
se prepara una célula bloqueada en una etapa de la vía de biosíntesis de las estreptograminas como la descrita anteriormente,
-
se cultiva dicha célula y.
-
se modifica el intermediario acumulado por esta célula, opcionalmente después de la separación del medio de cultivo.
La presente invención se ilustra con ayuda de los ejemplos que siguen, que se deben considerar como ilustrativos y no limitadores.
Lista de figuras
Figura 1: ejemplo de la estructura de los compuestos A de las estreptograminas.
Figura 2: ejemplo de la estructura de los compuestos B de las estreptograminas.
Figura 3: otros ejemplos de estructuras de las estreptograminas.
Figura 4: representación del cósmido pIBV1.
Figura 5: representación del cósmido pIBV2.
Figura 6: representación del cósmido pIBV3.
Figura 7: representación del cósmido pIBV4.
Figura 8: reacción catalizada por la pristinamicina IIA sintasa.
Figura 9: reacción catalizada por el ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa.
Figura 10: reacción catalizada por SnbC.
Figura 11: reacción catalizada por SnbD.
Figura 12: reacción catalizada por SnbE.
Figura 13: reacción catalizada por SnbC.
Figura 14: reacción catalizada por PapM.
Figura 15: representación de los plásmidos pVRC402 (A) y pVRC501 (B).
Figura 16: representación del plásmido pXL2045.
Figura 17: representación del plásmido pVRC1105.
Figura 18: representación del plásmido pVRC1106.
Figura 19: representación del plásmido pVRC1104.
Figura 20: representación del plásmido pVRC900.
Figura 21: representación del plásmido pVRC1000.
Figura 22: representación del plásmido pVRC509.
Figura 23: representación del plásmido pVRC903.
Figura 24: representación del plásmido pVRC409.
Figura 25: representación del plásmido pVRC505.
Figura 26: representación del plásmido pVRC701.
Figura 27: representación del plásmido pVRC702.
Figura 28: representación del plásmido pVRC508.
Figura 29: representación del plásmido pVRC404.
Figura 30: representación del plásmido pVRC507.
Figura 31: representación del plásmido pVRC706.
Figura 32: cartografía general.
Materiales
Columna Bio-Sil SEC 125 y 250 (Bio-Rad).
Columna MonoQ HR 5/5, 10/10 y 16/10 (Pharmacia).
Columna PD-10 (Pharmacia).
Columna Superose 6 HR 10/30 (Pharmacia).
Columna Superdex 200 Hi-Load 16/60 y 75 HR 10/30 (Pharmacia).
Columna Superose 12 prep grade (Pharmacia).
Columna Vydac C4 y C18 (The Separations Group).
Columna Nucleosil 5-C18 (Macherey-Nagel).
Columna fenil-Superose HR 10/10 (Pharmacia).
Columna TSK G2000 SW (Tosoh, Japón).
Phenyl Sepharose (Pharmacia).
FMN agarosa (Sigma).
Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia).
Sephadex G25 Fine (Pharmacia).
Centricon 10 ó 30 (Amicon).
Centriprep 10 ó 30 (Amicon).
Centrilutor (Amicon).
Ejemplo 1 Aislamiento del ADN total de la cepa SP92 de Streptomyces pristinaespiralis
Este ejemplo ilustra cómo se puede purificar el ADN de S. pristinaespiralis SP92.
La cepa S. pristinaespiralis SP92 deriva de la cepa S. pristinaespiralis DS5647 (ATCC25486).
Se inoculan 50 ml del medio YEME [sacarosa al 34%, MgCl_{2} a 5 mM, glicina al 0,25% (D. Hopwood et al. 1985)] con 10^{8} esporas de S. pristinaespiralis SP92 y el cultivo se incuba 40 horas a 30ºC, con agitación a 280 rpm.
El micelio se recoge y se lava con 15 ml de sacarosa al 10,3%. Aproximadamente 1 g del sedimento de micelio se recupera con 5 ml de TE enriquecido con sacarosa al 34%, a los que se añaden 1 ml de lisozima a 50 mg/ml en una disolución de Tris-HCl a 10 mM y pH 8,0, y 1 ml de EDTA a 0,25 M y pH 8,0. Después de la incubación a 30ºC durante un periodo de 30 a 60 min, la mezcla se aclara añadiendo 0,8 ml de sarcosil al 10%. Luego, se añaden 2 ml de EDTA a 0,25 M y pH 8,0, 10 ml de TE, 18 g de CsCl y 1,2 ml de BET a 10 mg/ml. Se ultracentrifuga la preparación durante una noche a 55 000 rpm a 20ºC.
El ADN cromosómico presente en el gradiente de CsCl en forma de banda se recupera con ayuda de una pipeta Pasteur. Se elimina el BET mediante varios lavados con una disolución de isopropanol saturada por el tampón TE, NaCl a 5 M. El ADN se precipita añadiendo 3 volúmenes de TE y 4 volúmenes de isopropanol. Después del lavado con etanol al 70%, el ADN se recupera en un volumen apropiado de TE. La cantidad de ADN total obtenido varía entre 250 y 500 \mug por gramo de micelio.
Ejemplo 2 Aislamiento del ADN plasmídico de E. coli
Este ejemplo ilustra cómo se prepara el ADN plasmídico de E. coli a partir de las cepas de E. coli recombinantes.
2.1. Preparación del ADN plasmídico de E. coli en grandes cantidades
Este ejemplo ilustra cómo se realizan las maxipreparaciones del ADN plasmídico en E. coli.
Esta preparación se efectúa a partir de un cultivo de 500 ml en medio LB que contiene ampicilina a 150 \mug/ml. El protocolo de extracción se deriva de los métodos descritos por Birnboim y Doly (1979), e Ish-Horowicz y Burke (1981), y se describe en Maniatis et al. (1989).
Después de esta extracción, el ADN plasmídico se purifica mediante gradiente de CsCl, como se describe en Maniatis et al. (1989). A continuación, el ADN plasmídico se precipita añadiendo 3 volúmenes de TE y 4 volúmenes de isopropanol. Después de la centrifugación, se recupera el precipitado en 0,5 a 1 ml de TE.
2.2. Preparación del ADN plasmídico de E. coli en pequeñas cantidades
Este ejemplo ilustra cómo se realizan las minipreparaciones del ADN plasmídico en E. coli.
Esta preparación se realiza a partir de un cultivo de 1,5 ml en medio LB que contiene ampicilina a 150 \mug/ml. El procedimiento es el descrito por Birnboim y Doly (1979).
Ejemplo 3 Construcción de la genoteca de ADN genómico de S. pristinaespiralis SP92 en E. coli y preparación de las membranas de hibridación
Este ejemplo ilustra cómo se realiza una genoteca de ADN genómico de S. pristinaespiralis SP92 en E. coli.
3.1. Preparación de fragmentos de ADN genómico
Este ejemplo ilustra cómo se pueden preparar fragmentos de ADN genómico de gran masa molecular.
El ADN total de la cepa SP92, preparada como se describe en el ejemplo 1, se digiere parcialmente con Sau3A (New England Biolabs, Beverly, MA. 01915-5510 EE. UU.) en el tampón preconizado por el fabricante: NaCl a 100 mM, Tris-HCl (pH 7,5) a 10 mM, MgCl_{2} a 10 mM y BSA a 100 \mug/ml. La cantidad de la enzima utilizada para obtener fragmentos de ADN de elevada masa molecular se ha determinado empíricamente. Se utilizan aproximadamente 0,025 unidades de enzima para digerir 1 \mug de ADN total durante 20 min a 37ºC. Luego, la reacción se para mediante una incubación de 15 min a 65ºC y la enzima se elimina mediante la adición de un volumen igual de fenol-cloroformo. Después de la centrifugación, el sobrenadante que contiene el ADN total digerido parcialmente se precipita añadiendo acetato de sodio a 0,3 M final y 2,5 volúmenes de etanol.
Así se digieren unos 100 \mug de ADN total y después los fragmentos de ADN de un tamaño comprendido entre 30 y 50 kb se aíslan por gradiente de sacarosa al 10-40%. Su tamaño se verifica mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,4%.
3.2. Preparación del cósmido pHC79
Este ejemplo ilustra cómo se prepara el cósmido pHC79 a partir de E. coli.
El cósmido pHC79 (Hohn, B. y Collins, 1980) comprende una parte de pBR322 (Bolivar, F. et al., 1977), la región cro-cII de \lambda y la región que contiene la secuencia cos de Charon 4A (Blattner, F.R. et al., 1977).
La extracción del cósmido se ha realizado como se describe en el ejemplo 2.1., a partir de una cepa de E. coli TG1 (K12, \Delta(lac-pro) supE thi hsd DS F traD36 proA^{+}B^{+} lacI^{q} LacZ \DeltaM15, Gibson, 1984).
Se han digerido 500 ng del cósmido pHC79 con BamHI (New England Biolabs, Beverly, MA. 01915-5510 EE. UU.) en 20 \mul del tampón con NaCl a 150 mM, Tris-HCl pH 7,9 a 6 mM, MgCl_{2} a 6 mM, 2-mercaptoetanol a 6 mM y BSA a 100 \mug/ml.
3.3. Ligación de los fragmentos del ADN y del cósmido
Este ejemplo ilustra cómo los fragmentos del genoma de S. pristinaespiralis SP92, procedentes de una digestión con Sau3A, se pueden ligar con el vector pHC79 linealizado por BamHI.
Unos 150 ng del cósmido linealizados como se describe más arriba se han precipitado en etanol con 350 ng de fragmentos de ADN total de S. pristinaespiralis SP92 preparados como se describió en el ejemplo 3.2. El precipitado se recuperó en 10 \mul del tampón de ligación: se añadieron Tris-HCl pH 7,8 a 50 mM, MgCl_{2} a 10 mM, DTT a 20 mM, ATP a 1 mM, BSA a 50 \mug/ml y 0,5 \mul de T4 ADN ligasa a 400 000 unidades por mililitro (New England Biolabs, Beverly, MA. 01915-5510 EE. UU.). La incubación se ha realizado durante una noche a 15ºC.
3.4. Realización de la encapsidación in vitro
Este ejemplo ilustra cómo se encapsidan in vitro los cósmidos construidos en 3.3.
La encapsidación de los cósmidos híbridos después de la ligación se ha realizado a partir del kit Gigapack II Gold, desarrollado por Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE. UU.).
2 x 4 \mul de la mezcla de ligación, a saber, 2 x 70 ng de los cósmidos híbridos, se han encapsidado in vitro según el procedimiento descrito por el fabricante.
3.5. Transfección de las cepas de E. coli DH1 y HB101
Este ejemplo ilustra cómo se introducen los cósmidos en E. coli.
Se han realizado dos transfecciones en paralelo con las cepas de E. coli. DH1 (F^{-} gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17 supE44L^{-}. Low 1968) y HB101 (F^{-} supE44 hsdS20(rB^{-}mB^{-}) recA13 ara-14 proA2 lacY1 galK2 rpsL20 xyl-5 mtl-1, Boyer y Roulland-Dussoix 1969).
Las células se han preparado según el protocolo siguiente: se realiza un precultivo de 100 ml en medio LB enriquecido con maltosa al 0,2% y MgSO_{4} a 10 nM durante 4 a 5 horas, hasta que la DO_{600} alcanza el valor de 0,8. Entonces, el cultivo se centrifuga y el precipitado se recupera en 40 ml de MgSO_{4} a 10 mM y se diluye hasta DO_{600} = 0,5, en la misma disolución. Se mezclan 200 \mul de la suspensión celular preparada así con 100 \mul de la mezcla de encapsidación. Después de 20 min de estar contacto a 37ºC, se le añade 1 ml de LB y el conjunto se incuba 1 hora a 37ºC. A continuación, los transfectantes se seleccionan sobre el medio LB sólido que contiene ampicilina a 150 \mug/ml. El número de transfectantes obtenidos es de aproximadamente 10^{4} por \mug del cósmido recombinante.
3.6. Almacenamiento de las genotecas de ADN genómico de S. pristinaespiralis SP92
Este ejemplo ilustra cómo se conservan las genotecas del ADN genómico de S. pristinaespiralis SP92.
Después de la verificación del tamaño medio de los fragmentos insertados en el cósmido pHC79, unas 1500 colonias resultantes de cada una de las transfecciones realizadas con las cepas HB101 y DH1 se replican en unas placas de microvaloración de 96 pocillos que contienen 200 \mul del medio Hogness (medio LB enriquecido con glicerol al 8,8%, acetato de sodio a 3 mM, K_{2}HPO_{4} a 55 mM, KH_{2}PO_{4} a 26 mM, MgSO_{4} a 1 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} a 15 mM y ampicilina a 150 \mug/ml). Estas placas se incuban una noche a 37ºC y después se almacenan a -80ºC.
3.7. Preparación de las membranas de hibridación a partir de las genotecas genómicas de S. pristinaespiralis SP92
Este ejemplo ilustra cómo el ADN de las colonias que constituyen las genotecas genómicas de S. pristinaespiralis SP92 se transfiere sobre una membrana de hibridación.
Estas membranas de hibridación se han realizado por duplicado para cada una de las 2 genotecas, según el protocolo siguiente:
Las 15 placas de microvaloración de cada genoteca se replican con ayuda de un brazo de replicación sobre el medio LB agar que contiene ampicilina a 150 \mug/ml. Después de una noche de crecimiento a 37ºC, la transferencia de las colonias se efectúa sobre la membrana Biohylon Z+ (Bioprope System) según el protocolo siguiente: la membrana recortada al tamaño adecuado se deja en contacto con las colonias durante 1 min. Después se desnaturaliza empapando la membrana con una disolución de NaOH a 0,5 M y NaCl a 1,5 M durante 5 min, seguida de una neutralización al empapar la membrana en una disolución de acetato de sodio a 3 M durante 5 min. El ADN se fija sobre la membrana por exposición bajo una lámpara UV durante 5 min.
Ejemplo 4 4.1. Preparación del ADN cromosómico de la cepa de S. pristinaespiralis SP92 y de las cepas derivadas de SP92 en forma de insertos para la electroforesis en campo pulsante
Este ejemplo ilustra cómo se prepara el ADN de la cepa de S. pristinaespiralis SP92 y de las cepas derivadas de SP92 en forma de insertos para la electroforesis en campo pulsante.
Esta preparación se efectúa a partir de un cultivo de micelio obtenido de la forma siguiente: se inoculan 10^{8} esporas de la cepa estudiada en 30 ml del medio YEME que contiene glicina al 0,25%, el cultivo se incuba durante 48 horas a 30ºC y se agita a 280 rpm en matraces de 250 ml. Luego, el micelio se recoge por centrifugación de 10 min a 3800 rpm y se lava dos veces con sacarosa al 10%. A continuación, el sedimento del micelio se resuspende en 5 ml de la disolución I (EDTA a 250 mM pH 8,0, sacarosa al 20,6%). A 200 \mul del micelio así obtenido se le añaden 400 \mul de una disolución de lisozima a 50 mg/ml en una disolución I así como 800 \mul de agarosa LMP al 1% en EDTA a 25 mM pH 8 y sacarosa al 10,3%, mantenido a 42ºC. Después, la mezcla mantenida a 42ºC se vierte en los pocillos de peines especiales que se cierran con una cinta adhesiva y que se guardan 30 min a 4ºC. La mezcla se solidifica y los 30 a 40 insertos obtenidos y contenidos en los pocillos se sacan del molde con precaución.
Primero, los insertos se enjuagan durante 30 min a 4ºC en una disolución que contiene EDTA a 25 mM y sacarosa al 10,3%. Luego, se les hace empapar en una disolución de EDTA a 500 nM, lauril-sarcosina al 1% y proteinasa K a 1 mg/ml durante 24 horas dos veces a 50ºC, agitando de tanto en tanto. Luego, los insertos se lavan 3 veces una hora en TE que contiene PMSF a 1 mM cambiando la disolución después de cada lavado. Los insertos obtenidos así se conservan a 4ºC durante 4 meses como máximo en EDTA a 0,5 M y pH 8,0.
4.2. Digestión de los insertos del ADN de la cepa S. pristinaespiralis SP92 y de las cepas derivadas de SP92 y análisis por electroforesis en campo pulsante
Este ejemplo ilustra cómo el ADN cromosómico de la cepa S. pristinaespiralis SP92 y de las cepas derivadas de SP92, preparado en forma de insertos como se describe en el ejemplo 4.1, se corta con diferentes enzimas de restricción para la electroforesis en campo pulsante.
\newpage
4.2.1. Digestión del ADN cromosómico en insertos
Primero, los insertos se lavan seis veces en TE y luego se incuban dos veces durante una hora en el tampón de la enzima de restricción elegida. Luego, cada inserto se deposita en la tapa de un tubo eppendorf que contiene 160 \mul del tampón de la enzima de restricción y 40 unidades de la enzima. El conjunto se recubre con un parafilm y el eppendorf se cierra para mantener el parafilm que permite evitar cualquier evaporación del tampón. Los tubos se incuban a la temperatura deseada en una estufa durante una noche.
4.2.2. Análisis del ADN digerido por electroforesis en campo pulsante
La técnica de electroforesis en campo pulsante elegida para este estudio es la del sistema CHEF (campo eléctrico homogéneo alternante) puesto a punto por Chu et al (1986), que permite obtener dos campos alternativos homogéneos orientados de 120º uno con respecto al otro y unas trayectorias rectilíneas para las moléculas de ADN. El aparato utilizado es el "Pulsafor System" comercializado por Pharmacia-LKB.
Se han hecho variar los parámetros de migración electroforética como el tiempo del pulso (a saber, la duración de aplicación del campo eléctrico) y la duración de la migración de manera que se obtenga una separación óptima de los fragmentos de ADN cuyo tamaño oscila entre 10 y 2500 kb. Las tres condiciones de migración utilizadas son las siguientes: para separar grandes fragmentos de un tamaño de 200 a 1700 kb, la migración elegida es de 40 horas con un tiempo de pulso de 90 segundos; para separar fragmentos de un tamaño de 50 a 400 kb, la migración elegida es de 20 horas con un tiempo de pulso de 30 segundos; finalmente, para separar los fragmentos más pequeños de un tamaño de 10 a 200 kb, la migración elegida es de 24 horas con un tiempo de pulso de 10 segundos. Para estas tres condiciones de migración, el voltaje se fija en 150 V constantes, la temperatura se mantiene a 13ºC y los geles de electroforesis contienen agarosa al 1,3%.
Los insertos que contienen el ADN cromosómico de la cepa S. pristinaespiralis SP92 y de las cepas derivadas de SP92 se digieren con las enzimas de restricción como se describió anteriormente y se depositan en los pocillos del gel de electroforesis con ayuda de dos hojas de bisturí. Los marcadores de la masa molecular utilizados son el "marcador de PFG de cromosomas de la levadura" y el "marcador de PFG de escalera de lambdas" comercializados por la sociedad New England Biolabs. La migración se efectúa en una de las condiciones descritas anteriormente y, después, el gel se tiñe en un baño de BET (bromuro de etidio) de 4 \mug/ml durante 20 min, luego se decolora en agua durante 20 min. Después de fotografiar el gel, los fragmentos de ADN se transfieren sobre una membrana de nilón y luego se hibridan con sondas marcadas con [\alpha-^{32}P]dCTP como se describe en el ejemplo 9.1.
Ejemplo 5 Aislamiento de los cósmidos que contienen los genes que codifican las proteínas purificadas implicadas en la biosíntesis de las estreptograminas
Este ejemplo describe cómo, a partir de una proteína purificada que interviene en la biosíntesis de las pristinamicinas, cuya secuencia del extremo NH_{2}, o una secuencia interna se hayan establecido, es posible aislar un cósmido que contiene el gen estructural de esta misma proteína a partir de las genotecas genómicas anteriormente realizadas, o bien identificar el gen estructural correspondiente entre los genes ya secuenciados contenidos en los cósmidos.
5.1 Aislamiento de los cósmidos pIBV1 y pIBV3 que contienen uno o los dos genes estructurales de las dos subunidades de la pristinamicina IIA sintasa 5.1.1. Identificación y purificación de una de las proteínas implicadas en la etapa final de la síntesis de las pristinamicinas II: la pristinamicina IIA sintasa
Como se ha indicado en la introducción, la última etapa de síntesis de la pristinamicina IIA corresponde a una oxidación del enlace 2-3 de la D-prolina a deshidroprolina. La proteína responsable de esta actividad se ha purificado a homogeneidad como se ilustra con este ejemplo.
5.1.1.A. Dosificación de la actividad de la pristinamicina IIA sintasa
Este ejemplo ilustra la dosificación de una actividad de la vía de biosíntesis de la pristinamicina IIA que nunca se ha descrito y que posee la propiedad destacable de expresarse sólo durante el periodo de producción de las pristinamicinas. Se trata de la pristinamicina IIA sintasa que cataliza la conversión de la pristinamicina IIB en pristinamicina IIA por oxidación del resto de D-prolina de la pristinamicina IIB en resto 2-3 deshidroprolina (figura 8) en presencia de oxígeno molecular y de FMNH_{2}. Las fracciones enzimáticas a dosificar (de 0,002 a 0,005 unidades) se incuban una hora a 27ºC en un volumen total de 500 \mul del tampón bis-tris-propano a 50 mM y pH 6,8 que contiene NADH (500 \muM), FMN (5 \muM), pristinamicina IIB (20 \muM) y 0,02 unidades de la FMN reductasa (Boehringer
Mannheim).
La pristinamicina IIA formada se dosifica mediante HPLC después de acabar la incubación añadiendo 500 \mul de ácido clorhídrico a 0,1 N y 500 \mul de acetonitrilo, y una centrifugación de la muestra durante 5 min a 5000 g. Se inyectan 150 \mul del sobrenadante de centrifugación en una columna Nucleosil 5-C8 de 15 cm eluida con una mezcla de acetonitrilo al 34% y tampón fosfato al 66% a 0,1 M y pH 2,9. Las pristinamicinas IIA y IIB se detectan gracias a su absorbencia UV a 206 nm.
La unidad de la actividad enzimática se define como la cantidad de enzima necesaria para sintetizar 1 \mumol de pristinamicina IIA por hora en las condiciones descritas.
5.1.1.B. Purificación de la pristinamicina IIA sintasa de S. pristinaespiralis SP92
Este experimento ilustra cómo se puede purificar una enzima de S. pristinaespiralis SP92 que interviene en la vía de la biosíntesis de la pristinamicina IIA.
Utilizando la dosificación descrita anteriormente en el ejemplo 5.1.1.A, se realiza la purificación de la pristinamicina IIA sintasa como se describe más adelante procurando congelar y conservar las fracciones activas a -30ºC entre cada etapa si es necesario.
Con 450 ml de tampón bis-tris-propano a 50 mM y pH 6,8 que contiene DTT a 5 mM y lisozima a 0,2 mg/ml se recuperan 150 g de un sedimento de centrifugación, lavado con un tampón de fosfato a 0,1 M y pH 7,2 al 10%, v/v, de glicerol, de un cultivo de S. pristinaespiralis SP92 recogido al principio de la fase de producción de las pristinamicinas. La suspensión así obtenida se incuba durante 45 minutos a 27ºC, luego se centrifuga a 50 000 g durante 1 hora. El extracto crudo recogido así se precipita por fraccionamiento con sulfato de amonio. La fracción proteica que precipita entre el 45 y 55% de saturación se desaliniza en una columna de Sephadex G25 Fine y luego se inyecta (100 mg por inyección) en el tampón a pH 6,8 de bis-tris-propano a 50 mM y DTT a 1 mM sobre una colonia MonoQ HR 10/10. Las proteínas se eluyen con un gradiente lineal de KCl (de 0 a 0,5 M). Las fracciones que contienen la actividad enzimática (puestas de manifiesto gracias al ensayo descrito en el ejemplo 5.1.1.A) se reagrupan y se concentran en 20 ml en Centriprep 10. Después de diluir con un volumen de tampón a pH 6,8 de bis-tris-propano a 50 mM y DTT a 1 mM que contiene sulfato de amonio a 2 M, las proteínas se cromatografían (22,5 mg por inyección) en una columna fenil-Superose HR 10/10 con un gradiente decreciente de sulfato de amonio (de 1,0 M a 0 M). Las mejores fracciones que contienen la actividad buscada se reúnen, se reconcentran en 1 ml con Centriprep 10 y luego se aplican (200 \mul por inyección) en una columna Bio-Sil SEC 250. El pico de actividad se detecta en esta técnica en torno a una masa molecular de 77 000 Da. La fracción que contiene la actividad se inyecta en una columna MonoQ HR 5/5 en el tampón a pH 6,8 de bis-tris-propano a 50 mM y DTT a 1 mM eluida con un gradiente lineal de KCl (de 0 a 0,5 M).
Después de esta etapa, la enzima aparece pura, y en la electroforesis PAGE-SDS se ponen de manifiesto dos subunidades de masa molecular estimada de 35 000 y 50 000 Da. Se separan en una columna Vydac C4 de 25 cm eluida con un gradiente lineal del 30 a 50% de acetonitrilo en agua con ácido trifluoroacético al 0,07%.
TABLA
Purificación de la pristinamicina IIA sintasa
Etapa de purificación Vol. (ml) Proteínas (mg) Act. esp. \mumol/(h\cdotmg) Rendimiento (%) Factor de
purificación
Extracto crudo 490 1690 0,14 100 1
40 al 55% S. A. 60 1050 0,19 85 1,4
MonoQ 10/10 95 45 3,0 58 21
Fenil-Superose 8 2,8 12 14 86
BioSil SEC 5 1,3 18 14 130
MonoQ 5/5 10 0,7 23 10 160
El factor de purificación se calcula a partir del aumento de la actividad específica de las fracciones durante la purificación.
5.1.2. Preparación de oligonucleótidos a partir de las secuencias proteicas
Este ejemplo describe cómo, a partir de las secuencias del extremo NH_{2} de dos subunidades de la pristinamicina IIA sintasa purificada como se describió en el ejemplo 5.1.1.B, es posible sintetizar los oligonucleótidos. Las dos subunidades de la pristinamicina IIA sintasa se denominan SnaA y SnaB y corresponden a los polipéptidos de masa molecular de 50 000 y 35 000 Da, respectivamente, tal y como se describe en el ejemplo 5.1.1.B.
Las secuencias del extremo NH_{2} de las proteínas SnaA y SnaB, que corresponden a las subunidades de la pristinamicina IIA sintasa, se han realizado por microsecuenciación. Esto se realiza mediante la técnica de degradación de Edman, con un secuenciador automatizado (modelo 407A de Applied Biosystems) unido a un aparato de HPLC para la identificación de los derivados feniltiohidantoínicos. Para cada una de entre ellas se han determinado una treintena de restos.
Proteína SnaA: (véanse los restos 2 a 29 en la SEQ ID n.º 2).
1
Proteína SnaB: (véanse los restos 2 a 31 en la SEQ ID n.º 3).
2
Por otro lado, se han determinado las secuencias internas de estos dos polipéptidos después de las digestiones trípsicas de SnaA y SnaB y la purificación de los fragmentos obtenidos en la columna de HPLC Vydac C18. Se han encontrado las secuencias internas siguientes:
Proteína SnaA: (véanse los restos 365 a 384 en la SEQ ID n.º 2).
3
Proteína SnaB: (véanse los restos 122 a 136 en la SEQ ID n.º 3).
4
A partir de las regiones subrayadas en cada una de las secuencias de los fragmentos internos en las proteínas SnaA y SnaB y, en función de la degeneración del código genético específico de los Streptomyces (véase el ejemplo 8), se han sintetizado las mezclas de oligonucleótidos siguientes mediante un sintetizador automatizado Biosearch 8600. Luego, se han purificado mediante la técnica ya descrita (Sawadogo M. y Von Dyke M. W., 1991). Los genes snaA y snaB designan los genes estructurales de las proteínas SnaA y SnaB, respectivamente.
Mezcla correspondiente a la parte subrayada de la secuencia interna de SnaA:
5
Mezcla correspondiente a la parte subrayada de la secuencia interna de SnaB:
6
5.1.3. Marcación de las mezclas de oligonucleótidos sintéticos e hibridación con las genotecas del ADN genómico de la cepa SP92
Este ejemplo describe cómo los oligonucleótidos específicos de un gen de biosíntesis de las pristinamicinas se pueden marcar radiactivamente y luego hibridarlos con membranas sobre las cuales se ha transferido el ADN de las genotecas genómicas de S. pristinaespiralis SP92.
La marcación de los oligonucleótidos se realiza por transferencia, a la posición 5' terminal, del grupo [\gamma-^{32}P] fosfato del ATP que cataliza la T4 polinucleótido cinasa. Esta marcación se realiza como se indica en Maniatis et al. (1989). Después de la marcación, los oligonucleótidos se utilizan sin purificación.
Aproximadamente 2 X 500 ng de cada mezcla de oligonucleótidos se han marcado así con ^{32}P y se han utilizado para hibridar cada una de las dos genotecas.
La hibridación de las membranas de cada genoteca se realiza según un protocolo derivado de los desarrollados por Meinkoth, J. y Wahl, G. (1984) y Hames, B. D. y Higgins, S. J. (1985): las 15 membranas se prehibridan durante 3 horas a 50ºC en 40 ml de una disolución que contiene: Denhardt (X5) [Denhardt (X100): Ficoll al 2% (p/v), polivinil-pirrolidona al 2% (p/v), BSA al 2% (p/v))], SSC (X5) [SSC (X20): NaCl a 3 M, citrato de sodio a 0,3 M), NaPO_{4} a pH 6,5 y 50 mM, SDS al 0,1%, ADN de esperma de salmón a 250 \mug/ml].
Luego, la hibridación se realiza durante una noche a 50ºC en 20 ml de la misma disolución, a los que se añaden los 500 ng de los oligonucleótidos marcados.
Después, los filtros se lavan en una disolución de SSC (X 6) y SDS al 0,5%, 2 veces durante 30 min a temperatura ambiente y luego, de forma empírica, a temperaturas gradualmente más elevadas (de 50 a 65ºC). La temperatura de estos últimos lavados se aumenta progresivamente después de las exposiciones autorradiográficas sucesivas que sirven para determinar la especificidad de los clones que se hibridan a las mezclas de oligonucleótidos.
5.1.4. Aislamiento de los cósmidos pIBV1 y pIBV3, y determinación de las regiones que contienen los genes snaA y snaB
Este ejemplo ilustra cómo es posible aislar los cósmidos construidos como se describe en el ejemplo 3, que contienen los genes de biosíntesis de las pristinamicinas.
Los cósmidos pIBV1 y pIBV3 se han aislado de dos clones que provienen, respectivamente, de la genoteca realizada en la cepa HB101 y de la genoteca realizada en la cepa DH1, que se han hibridado con las dos mezclas de oligonucleótidos simultáneamente en el caso de pIBV1 y con la mezcla de oligonucleótidos procedentes de la secuencia interna de la proteína SnaA en el caso de pIBV3.
Estos cósmidos se han purificado como se describe en el ejemplo 2. Los cósmidos pIBV1 y pIBV3 contienen, respectivamente, un inserto de ADN genómico de S. pristinaespiralis SP92 cuyos tamaños se han estimado, respectivamente, en 30 kb y 34 kb. Se ha establecido una cartografía (figuras 4 y 6) a partir de las digestiones con diferentes enzimas de restricción, según los protocolos del fabricante (New England Biolabs, Beverly, MA. 01915-5510 EE. UU.).
Las hibridaciones en Southern del ADN de pIBV1 y de pIBV3 digerido por diferentes enzimas, con las mezclas de oligonucleótidos, han permitido identificar la región de este cósmido que contiene los genes snaA y/o snaB.
Las transferencias Southern se han realizado como se describe en Maniatis et al. (1989). Después de la separación de los fragmentos de restricción por electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, el ADN se transfiere sobre la membrana Biohylon Z+ (Bioprope System). La hibridación del ADN así transferido sobre las membranas con las mezclas de oligonucleótidos se ha realizado como se describe en el ejemplo 5.1.3.
Estas transferencias Southern han permitido demostrar que el cósmido pIBV1 poseía un fragmento BamHI de 6 kb que contenía las secuencias homólogas a las sondas sintetizadas en el ejemplo 5.1.2 (resultantes de las proteínas SnaA y SnaB) así como un fragmento EcoRI de 2,5 kb interno al fragmento BamHI que contenía las secuencias homólogas a las sondas resultantes exclusivamente de la proteína SnaA. Además, las señales de hibridación obtenidas con el cósmido pIBV3 han demostrado que sólo poseía el fragmento EcoRI de 2,5 kb que contenía las secuencias homólogas a las sondas resultantes exclusivamente de la proteína SnaA.
5.2. Aislamiento del cósmido pIBV2 que contiene el gen estructural del ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa (snbA)
Este ejemplo ilustra cómo es posible obtener un cósmido, como el construido en el ejemplo 3, que contenga al menos un gen de biosíntesis de las pristinamicinas L.
5.2.1. Identificación y purificación de la proteína implicada en la activación del ácido 3-hidroxipicolínico
Este ejemplo ilustra cómo la proteína responsable de la activación del ácido 3-hidroxipicolínico se puede purificar a homogeneidad a partir de S. pristinaespiralis SP92.
5.2.1.A. Dosificación de la actividad del ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa
Este ejemplo ilustra la dosificación de una actividad de la vía de biosíntesis de la pristinamicina IA que nunca se ha descrito y que posee la propiedad destacable de expresarse sólo durante el periodo de producción de las pristinamicinas. Se trata de la ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa, que cataliza la formación del adenilato del ácido 3-hidroxipicolínico (figura 9) a partir de este ácido libre y del ATP en presencia de MgCl_{2}.
Las fracciones enzimáticas a dosificar (de 0,002 a 0,020 unidades) se incuban durante 15 min a 27ºC en un volumen total de 250 \mul del tampón a pH 6,8, bis-tris-propano a 50 mM, DTT a 1 mM y glicerol al 10% v/v, en presencia del ácido 3-hidroxipicolínico (1 mM), ATP (2 mM), MgCl_{2} (5 mM) y pirofosfato de tetrasodio marcado con el isótopo 32 radiactivo del átomo del fósforo (200 \muM).
La reacción se detiene añadiendo 1 ml de una suspensión de carbón activado en 10 g/l en una mezcla del 75% de pirofosfato de tetrasodio a 0,1 M y 25% de ácido perclórico al 14%. Después de la agitación, el carbón se recoge y se lava 2 veces con 1 ml de la mezcla de pirofosfato-ácido perclórico. Entonces, las moléculas orgánicas radiactivas se eluyen 3 veces con 1 ml de una mezcla de 50% de metanol y de 50% de amoniaco N, en un vial de recuento que contiene 12 ml de agua. La radiactividad se mide por el efecto Cerenkov con un contador de centelleo (Minaxi TriCarb 4000 PACKARD).
La unidad de la actividad enzimática se define como la cantidad de enzima necesaria para incorporar 1 \mumol de pirofosfato en ATP en 1 hora en las condiciones descritas anteriormente.
5.2.1.B. Purificación del ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa de S. pristinaespiralis SP92
Este experimento ilustra cómo se puede purificar una enzima de S. pristinaespiralis SP92 que interviene en la vía de la biosíntesis de la pristinamicina IA.
Utilizando la dosificación descrita anteriormente en el ejemplo 5.2.1.A, se realiza la purificación de la ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa como se describió anteriormente procurando congelar a -70ºC las fracciones activas y conservarlas a -30ºC entre cada etapa si fuera necesario.
Con 234 ml de tampón a pH 8,0, tris-HCl a 100 mM que contiene DTE a 4 mM, benzamidina a 1 mM, PMSF a 1 mM, glicerol al 15% v/v y lisozima a 0,6 mg/ml se recuperan los 234 g de un sedimento de centrifugación, lavado con un tampón fosfato a 0,1 M y pH 7,2 y glicerol al 10% v/v, de un cultivo de S. pristinaespiralis SP92 recogido al principio de la fase de producción de las pristinamicinas. La suspensión así obtenida se incuba durante 30 minutos a 27ºC, luego se centrifuga a 50 000 g durante 1 hora. El extracto crudo recogido así se inyecta en el tampón a pH 8,0, con Tris-HCl a 100 mM, DTE a 4 mM, benzamidina a 1 mM, PMSF a 1 mM y glicerol al 15% v/v en una columna (80 ml) de Q-Sepharose Fast Flow. Las proteínas se eluyen con un gradiente lineal de KCl (de 0 a 0,4 M). Las fracciones que contienen la actividad enzimática (puestas de manifiesto gracias al ensayo descrito en el ejemplo 5.2.1.A) se reagrupan y se diluyen por un volumen de tampón a pH 8,0 con Tris-HCl a 100 mM, benzamidina a 1 mM, PMSF a 1 mM y glicerol al 15% v/v que contiene sulfato de amonio a 2 M. Entonces, las proteínas se cromatografían en una columna (50 ml) de fenil-Sepharose con un gradiente decreciente de sulfato de amonio (de 1,0 M a 0 M) en el tampón a pH 8,0 con Tris-HCl a 100 mM, benzamidina a 1 mM, PMSF a 1 mM y glicerol al 15% v/v. Después de añadir DTE a 4 mM, las fracciones activas se reúnen, se reconcentran en 5 ml en Centriprep 10, y luego se aplican a una columna (100 ml) de Superose 12 prep grade. Las fracciones que contienen la actividad buscada se reagrupan y se inyectan en el tampón a pH 8,0 con Tris-HCl a 100 mM, DTE a 4 mM, benzamidina a 1 mM, PMSF a 1 mM, y glicerol al 15% v/v (aproximadamente 6 mg por inyección) en una columna de MonoQ HR 5/5 eluida con un gradiente lineal de KCl (de 0 a 0,4 M). Las fracciones activas se reagrupan, se concentran en 1 ml con Centricon 10, se diluyen con 3 volúmenes del tampón a pH 6,8, bis-tris-propano a 50 mM, DTE a 4 mM, benzamidina a 1 mM, PMSF a 1 mM y glicerol al 15% v/v, y luego se inyectan (2 mg por inyección) en este último tampón a una columna de MonoQ HR 5/5 eluida con un gradiente lineal de KCl (de 0 a 0,3 M). Las mejores fracciones que contienen la ligasa buscada se reagrupan, luego se aplican en un tampón a pH 6,8 de fosfato de sodio a 20 mM, sulfato de sodio a 50 mM en una columna Bio-Sil SEC 250. El pico de actividad se detecta en esta técnica a una masa molecular centrada en
60 000 Da.
La proteína que posee la actividad de activación del ácido 3-hidroxipicolínico se denomina, en adelante, SnbA.
Después de esta etapa, la enzima aparece pura y, en electroforesis PAGE-SDS, su masa molecular se estima en unos 67 000 Da.
TABLA
Purificación de la ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa
Etapa de purificación Vol. (ml) Proteínas (mg) Act. esp. \mumol/(h\cdotmg)^{a} Rendimiento (%) Factor de
purificación
Extracto crudo 246 2050 (0,06)
Q-Sepharose 40 188 0,47 100 1
Fenil-Sepharose 70 35 2,21 88 4,7
Superose 12 16 17 2,03 39 4,3
MonoQ pH 8,0 4,5 9,0 2,09 21 4,5
MonoQ pH 6,8 1,0 2,0 2,9 6,6 6,2
Bio-Sil 250 2,5 0,23 12,4 3,2 26
\begin{minipage}[t]{155mm} ^{a} La actividad en el extracto crudo no se puede medir con precisión a causa de los intercambios inespecíficos del ácido 3-hidroxipicolínico entre el pirofosfato y el ATP. \end{minipage}
El factor de purificación se calcula del aumento de la actividad específica de las fracciones durante la purificación.
5.2.2. Preparación de oligonucleótidos a partir de la secuencia de la proteína
Este ejemplo describe cómo, a partir de las secuencias del extremo NH_{2} e interna de la proteína 3-hidroxopicolínico-AMP ligasa, es posible sintetizar oligonucleótidos.
La secuencia del extremo NH_{2} de la proteína SnbA se ha realizado por microsecuenciación como se describe en el ejemplo 5.1.2. Una veintena de restos se han identificado de este modo.
También se ha identificado una secuencia interna en la proteína SnbA, de aproximadamente 20 aminoácidos, después de la hidrólisis trípsica y la purificación de los fragmentos obtenidos con la columna de HPLC Vydac C18.
Secuencia del extremo NH_{2} de la proteína 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa: (véanse los restos 1 a 21 de la SEQ ID n.º 5).
7 
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia interna la proteína 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa: (véanse los restos 448 a 467 de la SEQ ID n.º 5).
\vskip1.000000\baselineskip
8
A partir de las regiones subrayadas en cada una de las secuencias y, en función de la degeneración del código genético específico de los Streptomyces (véase el ejemplo 8), se han sintetizado las mezclas de oligonucleótidos siguientes.
Mezcla correspondiente a la parte subrayada de la secuencia del extremo NH_{2} de la proteína 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa:
9 
\newpage
Mezcla correspondiente a la parte subrayada de la secuencia interna de la proteína 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa:
10
5.2.3. Marcación de las mezclas de oligonucleótidos sintéticos e hibridación de las genotecas del ADN genómico de S. pristinaespiralis SP92
Este ejemplo describe cómo los oligonucleótidos específicos de un gen de biosíntesis de las pristinamicinas pueden marcarse radiactivamente y luego hibridarse con membranas sobre las cuales se ha transferido el ADN de las genotecas genómicas de S. pristinaespiralis SP92.
La marcación de los oligonucleótidos se realiza por transferencia a la posición 5' terminal del grupo [\gamma-^{32}P] fosfato del ATP mediante la T4 polinucleótido cinasa, como se indica en el ejemplo 5.1.3.
Aproximadamente 2 X 500 ng de cada mezcla de oligonucleótidos se han marcado así con ^{32}P y se han utilizado para hibridarse a cada una de las dos genotecas.
La hibridación de las membranas de cada genoteca se ha realizado como se indica en el ejemplo 5.1.3.
5.2.4. Aislamiento del cósmido pIBV2 y determinación de la región que contiene el gen estructural de la ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa
Este ejemplo ilustra cómo es posible obtener un cósmido, como el construido en el ejemplo 3, que contenga al menos el gen estructural de la ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa.
El cósmido pIBV2 se ha aislado de un clon de la genoteca realizada en la cepa de E. coli DH1, que se ha hibridado con las dos mezclas de oligonucleótidos simultáneamente.
Este cósmido se ha purificado como se describe en el ejemplo 2. Contiene un inserto de ADN genómico de S. pristinaespiralis SP92 cuyo tamaño se ha estimado en 47 kb. Se ha establecido una cartografía (figura 5) a partir de las digestiones con diferentes enzimas de restricción, como se indica en el ejemplo 5.1.4.
Las hibridaciones en Southern del ADN de pIBV2 digerido por diferentes enzimas, con las mezclas de oligonucleótidos, han permitido identificar la región que contiene el gen estructural del ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa. Las transferencias Southern y las hibridaciones se han realizado como se describe en el ejemplo 5.1.4.
Los resultados de hibridación han permitido demostrar que el cósmido pIBV2 poseía un fragmento EcoRI-BglII de 5,5 kb, que contenía la secuencia homóloga a las sondas sintetizadas en el ejemplo 5.2.2.
5.3 Poner de manifiesto la presencia de una parte del gen estructural de la pristinamicina I sintasa II (SnbC) sobre el cósmido pIBV3
Este ejemplo ilustra cómo es posible identificar la presencia de genes de biosíntesis de las pristinamicinas I sobre un cósmido ya aislado (ejemplo 5.1).
5.3.1. Identificación de la pristinamicina 1 sintasa II implicada en la incorporación de los restos de treonina y ácido aminobutírico en la cadena peptídica de la pristinamicina IA
Este ejemplo ilustra cómo la proteína responsable de la incorporación de los restos de treonina y ácido aminobutírico en la cadena peptídica de la pristinamicina IA se puede purificar hasta la homogeneidad, a partir de S. pristinaespiralis SP92.
5.3.1.A. Dosificación de las actividades parciales de la pristinamicina I sintasa IL
Este ejemplo ilustra la dosificación de actividades de la vía de biosíntesis de la pristinamicina IA que nunca se han descrito y que poseen la propiedad destacable de sólo expresarse durante el periodo de producción de las pristinamicinas. Se trata de actividades parciales de la péptido sintasa responsable de la incorporación de los restos de treonina
y ácido aminobutírico en la cadena peptídica de la pristinamicina IA (figura 10) en presencia de ATP y de MgCl_{2}.
Las actividades treonina-AMP ligasa y ácido aminobutírico-AMP ligasa se miden en un ensayo enzimático de intercambio ATP-pirofosfato análogo al descrito en 5.2.1.A para la ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa.
Las reacciones de aminoacilación de la enzima con la treonina o la alanina (un análogo del ácido aminobutírico que se encuentra en la pristinamicina IC) permiten diferenciar la péptido sintasa de otras enzimas que pueden efectuar un intercambio ATP-pirofosfato y particularmente las aminoacil-ARNt sintasas. Por lo tanto, el ensayo de aminoacilación de la enzima con la treonina marcada con tritio descrito más abajo se ha utilizado en este ejemplo. Las fracciones enzimáticas a dosificar (de 0,2 a 2 unidades) se incuban durante 15 min a 27ºC en un volumen total de 250 \mul del tampón a pH 6,8, bis-tris-propano a 50 mM, 1 mM de DTT y glicerol al 10% v/v, en presencia de 1 \muCi de [3-^{3}H] L-treonina (15 Ci/mmol), ATP (2 mM) y MgCl_{2} (5 mM).
La reacción se para añadiendo 150 \mul de una disolución de ácido tricloroacético al 25%. Las proteínas precipitadas se recogen en un microfiltro y se lavan 3 veces con 400 \mul de ácido tricloroacético al 7% antes de eluirlas 2 veces con 400 \mul de sosa N en un vial de recuento que contiene 1 ml de HCl N y 12 ml de una mezcla de centelleo (Readygel Beckmann). La cantidad de radiactividad contenida en este vial se mide con un contador de centelleo (Minaxi TriCarb 4000 PACKARD). Representa la cantidad de treonina fijada de forma covalente a la péptido sintasa buscada.
La unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima necesaria para fijar de manera covalente 1 pmol de treonina en 15 min en las condiciones descritas anteriormente.
5.3.1.B. Purificación de la pristinamicina I sintasa II
Este experimento ilustra cómo se puede purificar una enzima de S. pristinaespiralis SP92 que interviene en la vía de la biosíntesis de la pristinamicina IA.
Utilizando la dosificación descrita anteriormente en el ejemplo 5.3.1.A, se realiza la purificación de la péptido sintasa responsable de la incorporación de los restos de treonina y ácido aminobutírico en la cadena peptídica de la pristinamicina IA como se describió anteriormente procurando trabajar a 4ºC y conservar a -70ºC las fracciones activas.
Con 450 ml de un tampón a pH 8,0 con tris-HCl a 100 mM que contiene DTE a 4 mM, benzamidina a 1 mM, PMSF a 1 mM, EDTA a 1 mM, EGTA a 1 mM y glicerol al 15% v/v se recuperan 150 g de un sedimento de centrifugación, lavado con un tampón fosfato a 0,1 M y pH 7,2, y glicerol al 10% v/v, un cultivo de S. pristinaespiralis SP92 recogido al principio de la fase de producción de las pristinamicinas. La suspensión obtenida así se muele con ayuda de una prensa French regulada a la presión de 5000 psi, y luego se centrifuga a 50 000 g durante 1 hora. El extracto crudo recogido así se inyecta en el tampón a pH 8 con tris-HCl a 100 mM, DTE a 4 mM, benzamidina a 2 mM, leupeptina a 2 mg/l, E-64 a 1 mg/l y glicerol al 15% v/v en una columna (200 ml) de Q-Sepharose Fast Flow. Las proteínas se eluyen con un gradiente lineal de KCl (de 0 a 0,6 M). Al salir de la columna, a cada fracción se le añade una décima parte de su volumen de una disolución de PMSF a 1 mM, EDTA a 5 mM y EGTA a 5 mM. Las fracciones que contienen la actividad enzimática (puestas de manifiesto gracias al ensayo descrito en el ejemplo 5.3.1.A) se reagrupan y se reconcentran mediante ultrafiltración en Centriprep 30 hasta un volumen final de 28 ml. Este concentrado se inyecta en alícuotas de 4 ml en una columna de filtración Superdex 200 Hi-Load 16/60 equilibrada en el tampón a pH 6,8 con bis-tris-propano a 50 mM, benzamidina a 1 mM, DTE a 4 mM, Pefabloc a 0,2 mM, EDTA a 1 mM, KCl a 0,1 M, glicerol al 20% v/v. Después de la dosificación, las fracciones activas se reagrupan y se reconcentran en 15 ml con Centriprep 30, luego se desalinizan en PD-10 en el tampón a pH 8,0, tris-HCl a 100 mM, DTE a 4 mM, benzamidina a 2 mM, leupeptina a 2 mg/l, E-64 a 1 mg/l, glicerol al 20% v/v, y se aplican dos veces en una columna MonoQ HR 10/10 equilibrada y eluida con un gradiente lineal de KCl a 0,4 M en este mismo tampón. Las fracciones que contienen la actividad buscada se reagrupan, se reconcentran sobre Centriprep 30, luego sobre Centricon 30 hasta un volumen final de 1 ml y se inyectan cinco veces en una columna de Superose 6 HR 10/30 en el tampón a pH 6,8, bis-tris-propano a 50 mM, benzamidina a 1 mM, DTE a 4 mM, Pefabloc a 0,2 mM, EDTA a 1 mM, KCl a 0,1 M, glicerol al 20% v/v. El pico de actividad se detecta en esta técnica con una masa molecular centrada en 450 000 Da.
Después de esta etapa, la enzima aparece pura en electroforesis PAGE-SDS, su masa molecular se estima en aproximadamente 240 000 Da. Esta banda contiene también toda la radiactividad de la proteína marcada por aminoacilación con la treonina valorada.
En este estadio, la actividad máxima de la enzima utilizando una concentración de 100 \muCi/ml de treonina (15 Ci/mmol) es de 3670 unidades/mg; la enzima también puede formar adenilatos con el ácido-L-aminobutírico o la L-alanina; se detecta una reacción de aminoacilación de la enzima con la alanina y la actividad máxima en presencia de 200 \muCi/ml de [2,3-^{3}H] L-alanina (15 Ci/mmol) es de 2290 pmol/mg en 15 min.
TABLA
Purificación de la pristinamicina I sintasa II
Etapa de purificación vol. (ml) Proteínas (mg) Act. esp.^{a} Rendimiento (%) Factor
(unidades/mg) de purificación
Extracto crudo 445 4700 (1) - -
Q-Sepharose 308 834 7 100 1
Superdex 200 120 105 22 40 3,1
MonoQ HR 15 11,5 96 19 14
Superose 6 7,5 2,8 122 6 17
^{a}: la actividad en el extracto crudo no se puede medir con precisión.
El factor de purificación se calcula del aumento de la actividad específica de las fracciones durante la purificación.
5.3.2. Preparación de oligonucleótidos a partir de la secuencia de la proteína
Este ejemplo describe cómo, a partir de secuencias internas de la pristinamicina I sintasa II, se pueden sintetizar los oligonucleótidos.
Las secuencias internas de la péptido sintasa responsable de la incorporación de los restos treonina y ácido aminobutírico en la cadena peptídica de la pristinamicina IA se han realizado mediante microsecuenciación como se describió en el ejemplo 5.1.2 después de la hidrólisis trípsica y de la purificación de los fragmentos obtenidos en la columna Vydac C18.
Secuencias internas en la proteína pristinamicina I sintasa II. (véanse los restos 49 a 61 en la SEQ ID n.º 12).
11
A partir de las regiones subrayadas en estas secuencias y, en función de la degeneración del código genético específico de los Streptomyces (véase el ejemplo 8), se han sintetizado las mezclas de oligonucleótidos siguientes:
Mezcla correspondiente a la parte subrayada de la secuencia 1 interna en la proteína pristinamicina I sintasa II:
12
Mezcla correspondiente a la parte subrayada de la secuencia 2 interna en la proteína pristinamicina I sintasa II:
13
5.3.3. Marcación de las mezclas de oligonucleótidos sintéticos e hibridación en Southern del ADN del cósmido pIBV3
Este ejemplo describe cómo los oligonucleótidos específicos de un gen de biosíntesis de las pristinamicinas I se pueden marcar radiactivamente, luego hibridarse con una membrana sobre la que se ha transferido el ADN del cósmido pIBV3.
La marcación de los oligonucleótidos se realiza por transferencia en la posición 5' terminal, del grupo [\gamma-^{32}P] fosfato de la ATP por la T4 polinucleótido cinasa, como se indica en el ejemplo 5.1.3.
Aproximadamente 500 ng de la mezcla de oligonucleótidos se han marcado así con ^{32}P y se han utilizado para hibridar en Southern el ADN de pIBV3 digerido por diferentes enzimas. Estas hibridaciones han permitido demostrar que una parte del gen estructural de la pristinamicina I sintasa II lo llevaba el cósmido pIBV3 e identificar la región que contenía este gen. Las transferencias Southern y las hibridaciones se han realizado como se describe en el ejemplo 5.1.4.
Los resultados de hibridación han permitido demostrar que el cósmido pIBV2 poseía un fragmento SphI de 6,2 kb, que contiene la secuencia homóloga a las sondas sintetizadas en el ejemplo 5.3.2.
5.4 Poner de manifiesto la presencia de una parte del gen estructural de la pristinamicina I sintasa III (SnbD) sobre el cósmido pIBV3
Este ejemplo ilustra cómo es posible identificar la presencia de genes de biosíntesis de las pristinamicinas I sobre un cósmido ya aislado (ejemplo 5.1).
5.4.1. Identificación de la pristinamicina I sintasa III implicada en la incorporación de los restos prolina y p-dimetilaminofenilalanina en la cadena peptídica de la pristinamicina IA
Este ejemplo ilustra cómo la proteína responsable de la incorporación de los restos prolina y p-dimetilaminofenilalanina en la cadena peptídica de la pristinamicina IA se puede purificar hasta la homogeneidad, a partir de S. pristinaespiralis SP92.
5.4.1.A. Dosificación de las actividades parciales de la pristinamicina I sintasa III
Este ejemplo ilustra la dosificación de actividades de la vía de biosíntesis de la pristinamicina IA que nunca se han descrito y que poseen la propiedad destacable de sólo expresarse durante el periodo de producción de las pristinamicinas. Se trata de actividades parciales de la péptido sintasa responsable de la incorporación de los restos prolina y paradimetilaminofenilalanina en la cadena peptídica de la pristinamicina IA (figura 11) en presencia de SAM, ATP y de MgCl_{2}.
Las actividades prolina-AMP ligasa y p-dimetilaminofenilalanina-AMP ligasa se miden en un ensayo enzimático de intercambio ATP-pirofosfato análogo al descrito en 5.2.1.A. para el ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa.
Las reacciones de aminoacilación de la enzima con la prolina y la p-dimetilaminofenilalanina permiten diferenciar la péptido sintasa de otras enzimas que pueden efectuar un intercambio ATP-pirofosfato y especialmente las aminoacil-ARNt sintasas. Ocurre igual con la N-metilación de la función \alpha-amino de la p-dimetilaminofenilalanina acilada sobre la enzima. Por lo tanto, este último ensayo es característico de la N-metilación que se ha utilizado en este ejemplo.
Las fracciones enzimáticas a dosificar (de 0,2 a 2 unidades) se incuban durante 15 min a 27ºC en un volumen total de 250 \mul del tampón a pH 6,8, bis-tris-propano a 50 mM, DTT a 1 mM, glicerol al 10% v/v, en presencia de 1 \muCi de [metil-^{3}H], SAM (15 Ci/mmol), paradimetilamino-L-fenilalanina (1 mM), ATP (2 mM) y MgCl_{2} (5 mM).
La reacción se para añadiendo 150 \mul de una disolución de ácido tricloroacético al 25%. Las proteínas precipitadas se recogen sobre un microfiltro y se lavan por 3 veces 400 \mul de ácido tricloroacético al 7% antes de eluirlas por 2 veces 400 \mul de sosa N en un vial de recuento que contiene 1 ml de HCl N y 12 ml de un cóctel de centelleo (Readygel Beckmann). La cantidad de radiactividad contenida en este vial se mide con un contador de centelleo (Minaxi TriCarb 4000 PACKARD). Representa la cantidad de paradimetilaminofenilalanina N-metilada fijada de forma covalente a la péptido sintasa buscada.
La unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima necesaria para fijar de manera covalente 1 pmol de p-dimetilaminofenilalanina N-metilada en 15 min en las condiciones descritas anteriormente.
5.4.1.B. Purificación de la pristinamicina I sintasa III
Este experimento ilustra cómo se puede purificar una enzima de S. pristinaespiralis SP92 que interviene en la vía de la biosíntesis de la pristinamicina IA.
Utilizando la dosificación descrita anteriormente en el ejemplo 5.4.1.A, se realiza la purificación de la péptido sintasa responsable de la incorporación de los restos prolina y paradimetilaminofenilalanina en la cadena peptídica de la pristinamicina IA como se describió anteriormente procurando trabajar a 4ºC y conservar a -70ºC las fracciones activas.
250 g de un sedimento de centrifugación, lavado mediante un tampón de 0,1 M de fosfato, pH 7,2, PMSF a 1 mM, EDTA a 5 mM, EGTA a 5 mM, KCl a 0,5 M, glicerol al 10% v/v, de un cultivo de S. pristinaespiralis SP92 recogido al principio de la fase de producción de las pristinamicinas, se recuperan mediante 750 ml del tampón a pH 8,0 tris-HCl a 100 mM que contiene DTE a 4 mM, benzamidina a 5 mM, Pefabloc a 0,2 mM, EDTA a 1 mM, EGTA a 1 mM, leupeptina a 2 mg/l, STI a 2 mg/ml, aprotinina a 2 mg/l, E-64 a 1 mg/l y glicerol al 20% v/v. La suspensión obtenida así se mezcla con ayuda de una presa French regulada a la presión de 5000 psi, luego se centrifuga a 50000 g durante 1 h. El extracto crudo recogido así se fracciona mediante precipitación en sulfato de amonio. La fracción proteica que oscila entre 0 y 35% de saturación en sulfato de amonio se redisuelve en el tampón de rotura y se desaliniza en una columna de Sephadex G 25 Fine equilibrada y eluida en este mismo tampón. Las proteínas preparadas así se inyectan en el tampón a pH 8,0, tris-HCl a 100 mM, DTE a 4 mM, benzamidina a 2 mM, leupeptina a 2 mg/l, E-64 a 1 mg/l y glicerol al 20% v/v en una columna (200 ml) de Q-Sepharose Fast Flow, luego se eluyen con un gradiente lineal de KCl (de 0 a 0,6 M). A la salida de la columna, a cada fracción se le añade una décima parte de su volumen de una disolución de Pefabloc a 2 mM, EDTA a 5 mM, EGTA a 5 mM y benzamidina a 5 mM. Las fracciones que contienen la actividad enzimática (puestas de manifiesto gracias al ensayo descrito en el ejemplo 5.4.1.A) se reagrupan y se precipitan con sulfato de amonio al 80% de saturación. Las proteínas que oscilaban se redisuelven en un tampón a pH 6,8, bis-tris-propano a 50 mM, benzamidina a 1 mM, DTE a 1 mM, Pefabloc a 0,2 mM, EDTA a 1 mM, EGTA a 1 mM, leupeptina a 2 mg/l, NaCl a 0,15 M, glicerol al 20% v/v y se inyectan en 5 veces con alícuotas de 4 ml en una columna de filtración Superdex 200 HiLoad 16/60 equilibrada en este mismo tampón. Después de la dosificación, las fracciones activas se reagrupan y se reconcentran en 3 ml sobre Centriprep 30, luego se rediluyen hasta 20 ml con un tampón a pH 8.0, tris-HCl a 100 mM, DTE a 4 mM, PMSF a 1 mM, glicerol al 20% v/v y se aplican dos veces en una columna MonoQ HR 10/10 equilibrada y eluida con un gradiente lineal de KCl a 0,4 M en este mismo tampón. Las mejores fracciones que contienen la actividad buscada se reagrupan y sirven de material para la caracterización de las actividades de la enzima y para su microsecuenciación.
Después de esta etapa, la enzima aparece pura y, en electroforesis PAGE-SDS, su masa molecular se estima en unos 250 000 Da. Esta banda contiene también toda la radiactividad de la proteína marcada por aminoacilación con la SAM tritiada y la para-dimetilaminofenilalanina. Por filtración en Superose 6 HR 10/30, la masa molecular nativa de la enzima se estima en 700 000 Da.
En este estadio, la enzima también es capaz de formar adenilatos con la prolina; se detecta una reacción de aminoacilación de la enzima con la prolina tritiada y la actividad máxima en presencia de 200 \muCi/ml de [5-^{3}H] L-prolina (34 Ci/mmol) es de 2490 pmol/mg en 15 min.
TABLA
Purificación de la pristinamicina I sintasa III
Etapa de purificación vol. (ml) Proteínas (mg) Act. esp.^{a} (unidades/mg) Rendimiento (%) Factor de
purificación
Extracto crudo 800 8100 (4) - -
35% de S. A. 200 4000 (6) - -
Q-Sepharose 132 498 46 100 1
Superdex 200 45 39,5 417 71 9
MonoQ HR 9 5,3 1070 25 23
\begin{minipage}{155mm} ^{a}: la actividad en el extracto crudo y después de la precipitación con el sulfato de amonio no se puede medir con precisión. \end{minipage}
El factor de purificación se calcula del aumento de la actividad específica de las fracciones durante la purificación.
5.4.2. Preparación de oligonucleótidos a partir de la secuencia de la proteína
Este ejemplo describe cómo, a partir de secuencias internas de la pristinamicina I sintasa III, se pueden sintetizar los oligonucleótidos.
Una secuencia interna de la péptido sintasa responsable de la incorporación de los restos prolina y paradimetilaminofenilalanina en la cadena peptídica de la pristinamicina IA se ha realizado mediante microsecuenciación como se describió en el ejemplo 5.1.2 después del tratamiento con bromuro de cianógeno y de la purificación de los fragmentos obtenidos en la columna de HPLC Vydac C18.
Secuencia interna en la proteína pristinamicina I sintasa III: 1 (véanse los restos 2 a 20 en la SEQ ID n.º 13).
14
A partir de la región subrayada en esta secuencia y en función de la degeneración del código genético específico de los Streptomyces (véase el ejemplo 8), se ha sintetizado la mezcla de oligonucleótidos siguiente:
Mezcla correspondiente a la parte subrayada de la secuencia interna de la proteína pristinamicina I sintasa III:
15
5.4.3. Marcación de las mezclas de oligonucleótidos sintéticos e hibridación en Southern del ADN del cósmido pIBV3
Este ejemplo describe cómo se pueden marcar radiactivamente los oligonucleótidos específicos de un gen de biosíntesis de las pristinamicinas I y luego hibridarse con una membrana sobre la que se ha transferido el ADN del cósmido pIBV3.
La marcación de los oligonucleótidos se realiza por transferencia a la posición 5' terminal del grupo [\gamma-^{32}P] fosfato del ATP hecha por la T4 polinucleótido cinasa, como se indica en el ejemplo 5.1.3.
Aproximadamente 500 ng de la mezcla de oligonucleótidos se han marcado así con ^{32}P y se han utilizado para hibridarse por transferencia Southern el ADN de pIBV3 digerido por diferentes enzimas. Estas hibridaciones han permitido demostrar que el cósmido pIBV3 llevaba una parte del gen estructural de la pristinamicina I sintasa III e identificar la región que contenía este gen. Las transferencias Southern y las hibridaciones se han realizado como se describe en el ejemplo 5.1.4.
Los resultados de hibridación han permitido demostrar que el cósmido pIBV2 poseía un fragmento SphI de 8,4 kb, que contiene la secuencia homóloga a la sonda sintetizada en el ejemplo 5.4.2.
5.5 Poner de manifiesto la presencia de una parte del gen estructural de la pristinamicina I sintasa IV (SnbE) que está en el cósmido pIBV3
Este ejemplo ilustra cómo es posible identificar la presencia de genes de biosíntesis de las pristinamicinas I en un cósmido ya aislado (ejemplo 5.1).
5.5.1. Identificación de la péptido sintasa (denominada pristinamicina I sintasa IV) responsable de la incorporación del resto de fenilglicina en la cadena peptídica de la pristinamicina IA 5.5.1.A. Dosificación de las actividades enzimáticas realizadas por la péptido sintasa (pristinamicina I sintasa IV) responsable de la incorporación del resto de fenilglicina en la cadena peptídica de la pristinamicina IA
Este ejemplo ilustra la dosificación de una actividad enzimática de la vía de biosíntesis de la pristinamicina IA que no se ha descrito hasta la fecha y que posee la propiedad destacable de expresarse sólo durante el periodo de producción de las pristinamicinas en el microorganismo salvaje. Se trata de la actividad de la péptido sintasa (pristinamicina I sintasa IV) responsable de la incorporación del resto de L-fenilglicina en la cadena peptídica (figura 12) en presencia de ATP y de MgCl_{2}. La actividad fenilglicina-AMP ligasa de la pristinamicina I sintasa IV se mide en un ensayo enzimático de intercambio de ATP-pirofosfato similar al descrito en 5.2.1.A para la actividad ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa, en presencia de L-fenilglicina (1 mM) y de KCl (50 mM) en el tampón de incubación.
\newpage
5.5.1.B. Purificación de la péptido sintasa responsable de la incorporación del resto de fenilglicina (pristinamicina I sintasa IV) en la cadena peptídica de la pristinamicina IA
Este ejemplo ilustra cómo se puede purificar una enzima de S. pristinaespiralis SP92 que interviene en la vía de la biosíntesis de la pristinamicina IA. Utilizando la dosificación descrita anteriormente en el ejemplo 5.5.1.A, la purificación de la pristinamicina I sintasa IV se realiza como se describió anteriormente. Todas las operaciones se efectúan a 4ºC. Las fracciones que contienen la actividad se congelan inmediatamente y se conservan a
-70ºC.
Se resuspenden 70 g de células húmedas recogidas como se describió en el ejemplo 5.2.1.B en 250 ml del tampón de lisis celular (tris-HCl a 100 mM, pH 8,0 que contiene glicerol al 25%, DTE a 4 mM, EGTA a 1 mM, EDTA a 1 mM, PMSF a 1 mM, E-64 a 1 mg/ml, STI a 2 mg/ml, macroglobulina \alpha2 a 2 mg/l, leupeptina a 1 mg/l, aprotinina a 2 mg/l, benzamidina a 5 mM, lisozima a 0,6 mg/ml). La disolución así obtenida se mantiene 1 hora a 4ºC con agitación y luego se centrifuga a 50 000 g durante 1 hora. Después, el sobrenadante se inyecta en el tampón de lisis celular en una columna Sephadex G-25, y la fracción excluida (aproximadamente 250 mg de las proteínas inyectadas durante cada cromatografía) se inyecta en una columna de Mono Q HR 16/10 (Pharmacia) equilibrada con el tampón de tris-HCl a 100 mM, pH 8,0, DTE a 4 mM, E-64 a 1 mg/l, STI a 2 mg/ml y glicerol al 20%. Las proteínas se eluyen con un gradiente lineal de 0 a 0,6 M de KCl y, al salir de la columna, a cada fracción se le añade 1/10 de su volumen de una disolución de Pefabloc a 2 mM, EGTA a 5 mM y EDTA a 5 mM. Las fracciones que contienen la actividad se reúnen y luego se mezclan con 1 volumen de tris-HCl a 100 mM, pH 8,0, glicerol al 15%, PMSF a 1 mM, benzamidina a 1 mM, DTT a 4 mM y sulfato de amonio a 3,4 M por 3 volúmenes de fracción. La disolución se inyecta en una columna de Fenil-Superose HR 10/10 (la quinta parte de la disolución se inyecta en cada cromatografía) y las proteínas se eluyen con un gradiente lineal de sulfato de amonio que decrece de 0,9 a 0 M. Se reúnen las fracciones que contienen la actividad. La disolución se concentra a 3500 \mul en un Centriprep 30 y se inyecta 2 veces en una columna Superdex 200 Hi-oad 16/60 equilibrada y eluida con el tampón de bis-tris propano a 50 Mm, pH 6,8, que contiene glicerol al 20%, NaCl a 0,15 M, DTT a 4 mM, PMSF a 1 mM, benzamidina a 1 mM y EDTA a 1 mM. La fracción activa se diluye con 9 volúmenes del tampón de bis-tris propano a 50 mM y pH 6,8, que contiene el 25% de glicerol, DTT a 4 mM, PMSF a 1 mM, benzamidina a 1 mM y luego se inyecta en una columna de Mono Q HR 5/5 equilibrada en el mismo tampón. La actividad buscada se eluye con un gradiente lineal de KCl de 0 a 0,4 M, y se concentra en 630 \mul en un Centricon-30. Luego, la proteína buscada se purifica mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% después de la desnaturalización de la muestra por calentamiento durante 10 min a 80ºC con una mezcla de SDS-mercaptoetanol. Después de la electroforesis y la tinción del gel con azul de Coomassie, se corta la banda del gel que contiene la proteína y ésta se electroeluye del gel en un
Centrilutor.
Comentario: la banda que corresponde a la pristinamicina I sintasa IV se identifica mediante comparación con un estándar de pristinamicina I sintasa IV tritiada (mediante unión covalente a la fenilglicina tritiada; véase la descripción en el ejemplo 5.5.2).
Después de esta etapa, la enzima aparece pura por electroforesis (PAGE-SDS). Su masa molecular se estima en aproximadamente 170 000 Da.
5.5.2. Marcación de la pristinamicina I sintasa IV mediante tioesterificación de la fenilglicina radiactiva sobre la enzima
Después de la activación en forma de adenilato mediante la actividad fenilglicina-AMP ligasa, la fenilglicina se transfiere a un grupo tiol del sitio activo de la enzima antes de incorporarla a la cadena peptídica durante la elongación (procedimiento general de la biosíntesis de los antibióticos peptídicos conocido con el nombre de "thiotemplate mechanism"). De manera general, la marcación radiactiva de la proteína que efectúa la activación de un aminoácido se puede efectuar, por lo tanto, preparando el derivado tioéster con una forma radiactiva del aminoácido.
Como ejemplo, la marcación radiactiva de la pristinamicina I sintasa IV se efectúa incubando durante 1 hora a 27ºC 50 \mug de la proteína (fracción activa que sale de la columna de cromatografía Mono Q HR 5/5; véase anteriormente en el ejemplo 5.5.1.B) con 100 \muCi de (R,S)-2-fenil[2-^{3}H]glicina (18 Ci/mmol; Amersham) en 70 \mul del tampón de bis-tris propano a 50 mM y pH 6,8 que contiene glicerol al 20%, MgCl_{2} a 25 mM, ATP a 5 mM, NaCl a 0,15 M, DTT a 4 mM, PMSF a 1 mM, benzamidina a 1 mM y EDTA a 1 mM. Después de la desnaturalización (SDS solo sin mercaptoetanol), las proteínas se separan por electroforesis (PAGE-SDS, gel al 6%) y se revelan con azul de Coomassie. El análisis del perfil de radiactividad por el recuento de las bandas de proteínas así como por autorradiografía (Hyperfilm MP; se radiografía después de la impregnación del gel con Amplify Amersham) revela una sola banda radiactiva con una masa molecular de 170 000 Da.
TABLA
Purificación de la pristinamicina I sintasa IV
Etapa de purificación Proteínas (mg) Act. esp. (cpm/mg)^{a} Proteínas (mg) Factor de
purificación
Extracto crudo 2200 3,6 - -
Mono Q 16/10 136 58 100 16
Fenil-Superose 32,6 175 72 49
Superdex-200 3,1 870 34 240
Mono Q 5/5 2,0 1000 25 280
Electroelución PAGE-SDS 0,1 - - -
^{a} \begin{minipage}[t]{155mm} La actividad específica no se puede medir con precisión en el extracto crudo debido al nivel elevado de intercambio ATP-pirofosfato que no depende de la fenilglicina. El valor de la actividad específica se ha calculado a partir del número de unidades encontradas a la salida de la primera etapa cromatográfica dividido por la cantidad de proteínas en el extracto crudo. \end{minipage}
5.5.3. Otras actividades que lleva la pristinamicina I sintasa IV
La purificación de la péptido sintasa responsable de la incorporación de la fenilglicina descrita en el ejemplo 5.5.2 ha conducido a una proteína pura de masa molecular de 170 000 Da. Esta proteína no activa los otros aminoácidos ensayados, en particular, el ácido pipecólico o el ácido 4-oxopipecólico. Una segunda preparación de esta proteína, efectuada en las condiciones descritas en 5.5.1.B, suprimiendo, sin embargo, la etapa de Fenil-Superose, a partir de otro cultivo de S. pristinaespiralis SP92 cuyo extracto crudo se ha preparado en la prensa French como se describió en 5.4.1.B, ha conducido a una proteína que, al salir de la etapa de Mono Q HR 5/5, era de una pureza equivalente a la obtenida en la misma etapa en el ejemplo descrito en 5.5.1.B, pero presentaba una masa molecular de aproximadamente 250 000 Da en PAGE-SDS. Esta nueva preparación era competente para la activación y la tioesterificación de la fenilglicina, pero poseía además una actividad de intercambio ATP-pirofosfato con el ácido L-pipecólico (1 mM) en el ensayo de intercambio análogo al descrito en 5.2.1.A para el ácido 3-hidroxipicolínico. Por otra parte, se ha podido demostrar que la proteína de 170 000 Da no posee actividad de intercambio ATP-pirofosfato con el ácido L-pipecólico, incluso en las aun muy impuras preparaciones de la proteína. Cabe destacar que S. pristinaespiralis SP92 produce de forma natural y en pequeña cantidad un análogo de la pristinamicina IA que tiene un resto de ácido pipecólico en vez y en el lugar del ácido 4-oxopipecólico. Esto demuestra, por lo tanto, que la péptido sintasa responsable de la incorporación de la fenilglicina (la pristinamicina I sintasa IV) cataliza también la incorporación del resto anterior (probablemente el ácido pipecólico). La diferencia de masa molecular obtenida para la pristinamicina I sintasa IV en las dos preparaciones (170 000 y 250 000 Da) se atribuye a un fenómeno de escisión proteolítica parcial en el primer caso, lo que conduce a la pérdida de la actividad de activación del ácido L-pipecólico.
5.5.4. Síntesis de oligonucleótidos a partir de la secuencia de la proteína
Este ejemplo describe cómo, a partir de una secuencia interna de la pristinamicina I sintasa IV, se puede buscar el gen correspondiente con ayuda de oligonucleótidos elegidos debidamente.
Se ha identificado una secuencia interna de la pristinamicina I sintasa IV de 15 aminoácidos después de la escisión, con bromuro de cianógeno, de la proteína purificada y de la purificación de los fragmentos obtenidos en una columna de HPLC Vydac C18.
Secuencia interna en la proteína pristinamicina I sintasa IV: (véanse los restos 82 a 98 en la SEQ ID n.º 16)
16
A partir de la región subrayada en esta secuencia y en función de la degeneración del código genético específico de los Streptomyces (véase el ejemplo 18), se ha sintetizado la mezcla de oligonucleótidos siguiente:
\newpage
Mezcla correspondiente a la parte subrayada de la secuencia interna de la proteína pristinamicina I sintasa IV:
17
5.5.5. Marcación de las mezclas de oligonucleótidos sintéticos e hibridación en Southern del ADN del cósmido pIBV3
Este ejemplo describe cómo los oligonucleótidos específicos de un gen de biosíntesis de las pristinamicinas I se pueden marcar radiactivamente y luego hibridarse con una membrana sobre la que se ha transferido el ADN del cósmido pIBV3.
La marcación de los oligonucleótidos se realiza por transferencia, en la posición 5' terminal, del grupo [\gamma-^{32}P] fosfato del ATP por medio de la T4 polinucleótido cinasa, como se indica en el ejemplo 5.1.3.
Aproximadamente 500 ng de la mezcla de oligonucleótidos se han marcado así con ^{32}P y se han utilizado para hibridar en Southern el ADN de pIBV3 digerido por diferentes enzimas. Estas hibridaciones han permitido demostrar que el gen estructural de la pristinamicina I sintasa IV lo llevaba el cósmido pIBV3 e identificar la región que contenía este gen. Las transferencias Southern y las hibridaciones se han realizado como se describe en el ejemplo 5.1.4.
Los resultados de hibridación han permitido demostrar que el cósmido pIBV2 poseía un fragmento SphI de 6,6 kb, que contenía la secuencia homóloga a las sondas sintetizadas en el ejemplo 5.5.4.
5.6. Aislamiento del cósmido pIBV4 que contiene el gen estructural de la FMN reductasa (snaC)
Este ejemplo ilustra cómo es posible obtener un cósmido, como el construido en el ejemplo 3, que contenga al menos un gen de biosíntesis de las PII.
5.6.1. Identificación de la FMN reductasa asociada a la pristinamicina IIA sintasa
Este ejemplo ilustra cómo la proteína responsable de la reducción del FMN por el NADH para formar el FMNH_{2} necesario para la reacción catalizada para la pristinamicina IIA sintasa se puede purificar a homogeneidad a partir de S. pristinaespiralis SP92.
5.6.1.A. Dosificación de la actividad FMN reductasa
Este ejemplo ilustra la dosificación de una actividad de la vía de biosíntesis de la pristinamicina IIA que nunca se ha descrito y que posee la propiedad destacable de sólo expresarse durante el periodo de producción de las pristinamicinas. Se trata de la FMN reductasa, llamada también NADH:FMN oxidorreductasa, que cataliza la reducción del FMN en FMNH_{2} (figura 13) en presencia de NADH. Por otro lado, se han descrito FMN reductasas que catalizan la misma reacción, específicas o no del NADH o del NADPH, asociadas a otras vías de biosíntesis (Duane et al., 1975, Jablonski et al., 1977, Watanabe et al., 1982).
Se utilizan dos dosificaciones para detectar esta actividad:
La primera se basa en un acoplamiento con la pristinamicina IIA sintasa descrita en el ejemplo y se utiliza para las primeras etapas de la purificación. Las fracciones enzimáticas a dosificar (0,002 a 0,005 unidades) se incuban una hora a 27ºC en un volumen total de 500 \mul del tampón bis-tris-propano de 50 mM y pH 6,8, que contiene NADH (500 \muM), FMN (2 \muM), pristinamicina IIB (20 \muM) y 0,01 unidades de la pristinamicina IIA sintasa descrita en el ejemplo 5.5.1. La pristinamicina IIA formada se dosifica mediante HPLC como se describe en el ejemplo
5.1.1.A.
La unidad de la actividad enzimática se define como la cantidad de enzima necesaria para sintetizar 1 \mumol de pristinamicina IIA por minuto en las condiciones descritas anteriormente.
La segunda es una dosificación espectrofotométrica y sólo se puede utilizar con fracciones purificadas, al menos parcialmente. Las fracciones enzimáticas a dosificar (de 0,006 a 0,030 unidades) se incuban 13 min a 27ºC en un volumen total de 3 ml del tampón bis-tris-propano a 50 mM y pH 6,8, que contiene NADH (500 \muM) y FMN (2 \muM). Después de 7 min de incubación, se efectúan 6 lecturas de la densidad óptica a 340 nm espaciadas por 1 min y se comparan con una curva de referencia sin enzima. La actividad en \mumol/min se calcula dividiendo la pendiente de disminución por min de la densidad óptica por un factor 6,2 (densidad óptica de 1 mol de NADH a 340 nm).
La unidad de la actividad enzimática se define como la cantidad de enzima necesaria para consumir 1 \mumol de NADH por minuto en las condiciones descritas anteriormente.
5.6.1.B. Purificación de la FMN reductasa de S. pristinaespiralis SP92
Este experimento ilustra cómo se puede purificar una enzima de S. pristinaespiralis SP92 que interviene en la vía de biosíntesis de la pristinamicina IIA.
Utilizado las dosificaciones descritas anteriormente en el ejemplo 5.6.1.A, se realiza la purificación de la FMN reductasa como se describe más adelante procurando congelar y conservar las fracciones activas a -30ºC entre cada etapa si fuera necesario.
Con 1500 ml de tampón de bis-tris-propano a 50 mM y pH 6,8, que contiene DTT a 5 mM, glicerol al 10% v/v y lisozima a 0,2 mg/ml, se recuperan 500 g de un sedimento de centrifugación, lavado con un tampón de fosfato a 0,1 M, pH 7,2 y glicerol al 10% v/v de un cultivo de S. pristinaespiralis SP92 recogido al principio de la fase de producción de las pristinamicinas. La suspensión así obtenida se incuba durante 45 min a 27ºC y luego se centrifuga en 50 000 g durante 1 hora. El extracto crudo recogido así se fracciona mediante precipitación con sulfato de amonio. La fracción de proteínas que precipita entre el 40 y 75% de saturación se desaliniza sobre una columna de Sephadex G25 Fine y luego se inyecta en el tampón bis-tris-propano a 50 mM y pH 6,8, DTT a 5 mM y glicerol al 10% v/v sobre una columna (300 ml) de Q-Sepharose Fast Flow. Las proteínas activas no se quedan retenidas en la columna y se desalinizan en una columna de Sephadex G25 Fine y luego se reinyectan en el tampón a pH 8,2, con Tris-HCl a 50 mM, DTT a 5 mM y glicerol al 10% v/v en una columna (35 ml) de Q-Sepharose Fast Flow y se eluyen con un gradiente lineal de KCl (de 0 a 0,5 M). Las fracciones que contienen la actividad enzimática (puestas de manifiesto gracias al primer ensayo descrito en el ejemplo 5.6.1.A) se reúnen, se desalinizan en una columna de Sephadex G25 Fine, y luego se inyectan en el tampón a pH 8,2 con Tris-HCl a 50 mM, DTT a 5 mM y glicerol al 10% v/v en una columna MonoQ HR 10/10. Las proteínas retenidas se eluyen directamente con el mismo tampón al que se le añade KCl a 0,2 M. Se recogen en un volumen de 1 ml reinyectado inmediatamente en una columna de Superdex 75 HR 10/30 eluida con el tampón a pH 6,8, con bis-tris-propano a 50 mM, DTT a 1 mM y glicerol al 10% v/v. Las fracciones que contienen la actividad buscada (puestas de manifiesto a partir de esta etapa gracias al ensayo espectrofotométrico como se describe en el ejemplo 5.6.1.A) se reúnen y el volumen total del conjunto se lleva a 7 ml; estos 7 ml se inyectan en una columna rellenada con 8 ml de FMN agarosa; la columna se lava con el tampón a pH 6,8, con bis-tris-propano a 50 mM,.DTT a 1 mM y glicerol al 10% v/v, y luego se eluye con el mismo tampón que contiene FMN a 10 \muM. Las fracciones activas se reúnen, se desalinizan en columnas PD-10 y se inyectan en el tampón a pH 8,2, Tris-HCl a 50 mM, DTT a 5 mM y glicerol al 10% v/v en una columna MonoQ HR 5/5, y se eluyen con un gradiente lineal de KCl (de 0 a 0,25 M).
Después de esta etapa, la enzima aparece pura. En la electroforesis PAGE-SDS, aparece una sola banda bastante grande, centrada en una masa molecular estimada en 28 000 Da, mientras que en la cromatografía de filtración en gel Bio-Sil SEC 125, esta proteína forma un pico simétrico centrado sobre una masa molecular de unos 30 000 Da.
Para la secuenciación, la proteína se desaliniza en una columna Vydac C4 de 25 cm eluida con un gradiente lineal del 30 a 70% de acetonitrilo en agua al 0,07% de ácido trifluoroacético.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA
Purificación de la FMN reductasa
Etapa de purificación vol. (ml) Proteínas (mg) Act. esp.^{a,b} Rendimiento (%) Factor de
(unidades/mg) purificación
Extracto crudo 1620 5100 0,004^{a} 100 - 1
40-75% de S.A. 155 2930 0,005^{a} 68 1,2
Q-Seph. pH 6,8 357 180 0,058^{a} 49 14
Q-Seph. pH 8,2 153 15 0,36^{a} 25 85
MonoQ HR 10/10 1,0 8 0,50^{a} 19 120
4,4^{b}
Superdex 75 1,5 3,1 7,4^{b} 12 200
TABLA (continuación)
Etapa de purificación vol. (ml) Proteínas (mg) Act. esp.^{a,b} Rendimiento (%) Factor de
(unidades/mg) purificación
FMN-agarosa 7,5 0,28 96^{b} 14 2600
MonoQ HR 5/5 3,0 0,29 68^{b} 11 1900
Bio-Sil 125 7,5 0,18 106^{b} 10 2900
^{a}: dosificación unida a la pristinamicina IIA sintasa.
^{b}: dosificación espectrofotométrica.
El factor de purificación se calcula del aumento de la actividad específica de las fracciones durante la purificación.
5.6.2. Preparación de oligonucleótidos a partir de la secuencia de la proteína
Este ejemplo describe cómo, a partir de las secuencias del extremo NH_{2} e internas de la proteína FMN reductasa, se pueden sintetizar los oligonucleótidos.
La secuencia del extremo NH_{2} de la FMN reductasa se ha realizado por microsecuenciación como se describe en el ejemplo 5.1.2. Una treintena de restos se han identificado así.
(En la muestra secuenciada también se han encontrado secuencias del extremo NH_{2} que comienzan en el 4.º y el 11.º resto).
También se han identificado dos secuencias internas de la FMN reductasa, de 13 y 21 aminoácidos, después de la hidrólisis trípsica y la purificación de los fragmentos obtenidos en la columna Vydac C18.
Secuencia del extremo NH_{2} de la proteína FMN reductasa: (véanse los restos 2 a 25 en la SEQ ID n.º 7).
18
Secuencias internas de la proteína FMN reductasa: (véanse los restos 102 a 122 en la SEQ ID n.º 7).
19
(véanse los restos 149 a 161 en la SEQ ID n.º 7).
20
A partir de las regiones subrayadas en cada una de las secuencias y, en función de la degeneración del código genético específico de los Streptomyces (véase el ejemplo 8), se han sintetizado las mezclas de oligonucleótidos siguientes:
Mezcla correspondiente a la secuencia del extremo NH_{2} de la proteína FMN reductasa:
21
Mezclas correspondientes a las secuencias internas de la proteína FMN reductasa:
22 
\vskip1.000000\baselineskip
5.6.3. Marcación de las mezclas de oligonucleótidos sintéticos e hibridación de las genotecas del ADN genómico de S. pristinaespiralis SP92
Este ejemplo describe cómo los oligonucleótidos específicos de un gen de biosíntesis de las pristinamicinas pueden marcarse radiactivamente y luego hibridarse con membranas sobre las cuales se ha transferido el ADN de las genotecas genómicas de S. pristinaespiralis SP92.
La marcación de los oligonucleótidos se realiza por transferencia, en la posición 5' terminal, del grupo [\gamma-^{32}P] fosfato del ATP marcado por medio de la T4 polinucleótido cinasa, como se indica en el ejemplo 5.1.3.
Aproximadamente 2 X 500 ng de cada mezcla de oligonucleótidos se han marcado así con ^{32}P y se han utilizado para hibridar cada una de las dos genotecas.
La hibridación de las membranas de cada genoteca se ha realizado como se indica en el ejemplo 5.1.3.
5.6.4. Aislamiento del cósmido pIBV4 y determinación de la región que contiene el gen estructural de la FMN reductasa (snaC)
El cósmido pIBV4 se ha aislado de un clon de la genoteca realizada en la cepa de E. coli HB101, que se ha hibridado con las tres mezclas de oligonucleótidos simultáneamente.
Este cósmido se ha purificado como se describe en el ejemplo 2. Contiene un inserto de ADN genómico de S. pristinaespiralis SP92 cuyo tamaño se ha estimado en 48 kb. Se ha establecido una cartografía (figura 7) a partir de digestiones con diferentes enzimas de restricción, como se indica en 5.1.4.
Las hibridaciones en Southern del ADN de pIBV4 digerido por diferentes enzimas, con las mezclas de oligonucleótidos, han permitido identificar la región que contiene snaC, el gen estructural de la FMN reductasa. Las transferencias Southern y las hibridaciones se han realizado como se describe en el ejemplo 5.1.4. Los resultados de hibridación han permitido demostrar que el cósmido pIBV4 poseía un fragmento BamHI-BamHI de 4 kb que contenía las secuencias homólogas a las sondas sintetizadas en el ejemplo 5.6.3.
5.7 Poner de manifiesto la presencia del gen estructural de la p-aminofenilalanina (fenil-N)-metiltransferasa sobre el cósmido pIBV2
Este ejemplo ilustra cómo, a partir de una proteína purificada, se puede identificar el gen estructural correspondiente entre los genes ya analizados y secuenciados como se describe en los ejemplos 6.7 y 7.8, y también expresados en E. coli como se describe en el ejemplo 11.
5.7.1. Identificación y purificación de la proteína implicada en la metilación de la p-aminofenilalanina en p-dimetilaminofenilalanina
Este ejemplo ilustra cómo la proteína responsable de la metilación de la p-aminofenilalanina en p-dimetilaminofenilalanina [la p-aminofenilalanina (fenil-N)-metiltransferasa], se puede purificar a homogeneidad a partir de la cepa S. pristinaespiralis SP92 y cómo se puede igualmente obtener pura a partir de una cepa recombinante de E. coli (ejemplo 11).
5.7.1.A. Dosificación de la actividad de metilación de la p-aminofenilalanina en p-metilaminofenilalanina y de la actividad de metilación de la p-metilaminofenilalanina en p-dimetilaminofenilalanina
Este ejemplo ilustra la dosificación de dos actividades del final de la biosíntesis de la p-dimetilaminofenilalanina, compuesto de la pristinamicina IA. Estas actividades nunca se han descrito y poseen la propiedad destacable de sólo expresarse durante el periodo de producción de las pristinamicinas. Se trata de la metilación de la p-aminofenilalanina en p-metilaminofenilalanina (metilación 1), por una parte, y de la metilación de la p-metilaminofenilalanina en p-dimetilaminofenilalanina (metilación 2), utilizando estas dos actividades la SAM como el donador del grupo metilo (figura 14).
Las fracciones enzimáticas a dosificar (de 1 a 20 unidades) se incuban durante 30 min a 27ºC en un volumen total de 200 \mul del tampón a pH 6,8 con bis-tris-propano a 50 mM que contiene la SAM (200 \muM), cuyo grupo metilo se marca radiactivamente con el isótopo 14 del átomo de carbono (2 Ci/mol), en presencia de la p-amino-L-fenilalanina (1 mM) para la dosificación de la metilación 1 o de la p-metilamino-L-fenilalanina (2,5 mM) para la dosificación de la metilación 2.
La reacción se para añadiendo 16 \mul de ácido clorhídrico al 37% y luego 20 \mul de heptanosulfonato de sodio a 240 g/l. Después de la centrifugación, se inyectan 150 \mul del sobrenadante en el sistema de HPLC en el modo gradiente siguiente:
-
Fase móvil: eluyente A = 1,2 g de heptanosulfonato de sodio + 2,5 ml de ácido acético glacial + agua (qsp 1000 ml) eluyente B = 1,2 g de heptanosulfonato de sodio + 2,5 ml de ácido acético glacial + 300 ml de acetonitrilo + agua (qsp 1000 ml).
Gradiente: t (min) % de B
0 30
16 30
17 100
20 100
21 30
25 30
-
Fase estacionaria: columna Nucleosil C18 5 \mum 150 x 4,6 mm (Macherey-Nagel).
Al salir de la columna, los sustratos y los productos de la reacción enzimática se cuantifican mediante absorción a 254 nm. Esta detección está unida a una detección radioquímica en línea por medio de un detector Berthold LB506 equipado con una célula de centelleo sólida del tipo GT400-U4. Esto permite seguir específicamente la incorporación de los grupos metilo radiactivos en los productos de la reacción.
La unidad de actividad enzimática para la metilación 1 (para la metilación 2) se define como la cantidad de enzima necesaria para incorporar 1 nmol de grupos metilo en la p-aminofenilalanina (en la p-metilaminofenilalanina).
5.7.1.B. Purificación a partir de S. pristinaespiralis SP92 de la N-metiltransferasa dependiente de SAM que cataliza la metilación de la p-aminofenilalanina en p-dimetilaminofenilalanina [p-aminofenilalanina (fenil-N)-fenil-transferasa]
Este experimento ilustra cómo se puede purificar una enzima de S. pristinaespiralis SP92 que interviene en la vía de biosíntesis de la pristinamicina IA.
Utilizado la dosificación descrita anteriormente en el ejemplo 5.7.1.A, se realiza la purificación de la N-metiltransferasa dependiente de SAM como se describe más adelante procurando congelar y conservar a -70ºC las fracciones activas entre cada etapa si fuera necesario.
En 480 ml del tampón a pH 8,0 con Tris-HCl a 0,1 M que contiene DTE a 4 mM, benzamidina a 5 mM, Pefabloc a 0,2 mM, E-64 a 100 \mug/l, leupeptina a 2 mg/l, EDTA a 1 mM, EGTA a 1 mM, STI a 2 mg/ml, aprotinina a 2 mg/l, glicerol al 20% v/v y lisozima a 2 mg/ml, manteniéndose este tampón a 4ºC, se recuperan 240 g de un sedimento de centrifugación, lavado con un tampón fosfato a 0,1 M, pH 7,2, PMSF a 1 mM, EDTA a 5 mM, EGTA a 5 mM, KCl a 0,5 M y glicerol al 10% v/v, de un cultivo de S. pristinaespiralis SP92 recogido al principio de la fase de producción de las pristinamicinas. La suspensión obtenida así se agita enérgicamente a 4ºC. Después de 30 min de agitación, se añaden 0,2 mg/ml de desoxirribonucleasa 1 y MgCl_{2} a 5 mM. Después de 90 min de agitación, el extracto se centrifuga durante 1 hora a 50 000 g. El sobrenadante se reparte en 3 fracciones de aproximadamente 180 ml. Cada una se desaliniza por filtración en gel en una columna de 500 ml de Sephadex G 25 Fine equilibrada a flujo natural en un tampón a pH 6,8, con bis-tris a 20 mM que contiene DTE a 4 mM, benzamidina a 5 mM, Pefabloc a 0,2 mM, E-64 a 100 \mug/l, leupeptina a 2 mg/l, EDTA a 1 mM, EGTA a 1 mM, STI a 2 mg/ml, aprotinina a 2 mg/l y glicerol al 20% v/v. Entonces, el eluido proteico se cromatografía (400 mg de proteína en cada ciclo) en una columna MonoQ HR 16/10 a un flujo de 6 ml/min con un gradiente lineal creciente de cloruro de sodio (de 0 a 0,3 M) en un tampón a pH 6,8 de bis-tris a 20 mM que contiene DTE a 4 mM, benzamidina a 2 mM, E-64 a 100 \mug/l, leupeptina a 2 mg/l y glicerol al 20% v/v. Al salir la columna, las fracciones se completan al 10% v/v con un tampón a pH 6,8 de bis-tris a 20 mM, que contiene DTE a 4 mM, benzamidina a 30 mM, Pefabloc a 2 mM, E-64 a 100 \mug/l, leupeptina a 2 mg/l, EDTA a 5 mM, EGTA a 5 mM, STI a 10 mg/l, aprotinina a 10 mg/l y glicerol al 20% v/v. En estas condiciones, las dos actividades de metilación (1 y 2) se detectan de forma idéntica en las fracciones de exclusión y las primeras fracciones de elución. Estas fracciones se reúnen y se concentran por ultrafiltración sobre CentriPrep 10. Este concentrado se lleva a 0,85 M de sulfato de amonio y luego se cromatografía (de 20 a 80 mg en cada ciclo) en una columna Fenil-Superose HR 10/10 a un flujo de 1 ml/min con un gradiente lineal decreciente de sulfato de amonio (de 0,85 a 0 M) en un tampón a pH 6,8 con bis-tris a 50 mM que contiene DTE a 4 mM, benzamidina a 2 mM, E-64 a 100 \mug/l, leupeptina a 2 mg/l, EDTA a 1 mM, EGTA a 1 mM y glicerol al 10% v/v. Al salir de la columna, las fracciones se completan al 10% v/v con un tampón a pH 6,8 de bis-tris a 50 mM que contiene DTE a 4 mM, benzamidina a 30 mM, Pefabloc a 2 mM, E-64 a 100 \mug/l, leupeptina a 2 mg/l, EDTA a 1 mM, EGTA a 1 mM, STI a 10 mg/l, aprotinina a 10 mg/l y glicerol al 10% v/v. En estas condiciones, las dos actividades de metilación (1 y 2) se detectan de forma idéntica en las fracciones de elución que corresponden a aproximadamente sulfato de amonio a 0,15 M. Estas fracciones se reúnen, se concentran por ultrafiltración en Centricon 10, se desalinizan en columnas PD-10 equilibradas en un tampón a pH 8,2 (a 5ºC) de Tris a 50 mM que contiene DTE a 4 mM, benzamidina a 2 mM, E-64 a 100 \mug/l, leupeptina a 2 mg/l y glicerol al 20% v/v, y luego se cromatografían (unos 10 mg en cada ciclo) en una columna MonoQ HR 5/5 equilibrada en el mismo tampón a un flujo de 1 ml/min. En estas condiciones, las dos actividades no se retienen en la columna. Al salir de la columna, las fracciones de exclusión que contienen estas dos actividades se completan al 10% v/v con un tampón a pH 8,2 de Tris a 50 mM que contiene DTE a 4 mM, benzamidina a 30 mM, Pefabloc a 2 mM, E-64 a 100 \mug/l, leupeptina a 2 mg/l, EDTA a 1 mM, EGTA a 1 mM y glicerol al 20% v/v. Entonces, estas fracciones se concentran por ultrafiltración sobre Centricon 10 y luego se cromatografían en columna TSK G2000 SW 300 x 7,5 mm 10 \mum equilibrada a un flujo de 0,5 ml/min en un tampón a pH 7,0 de Hepes a 50 mM que contiene DTE a 4 mM, Pefabloc a 0,2 mM, EDTA a 1 mM, EGTA a 1 mM, glicerol al 20% v/v y cloruro de sodio a 0,15 M. Las dos actividades se coeluyen en esta técnica con un tiempo de retención que corresponde a una masa molecular de 30 000 Da. Después de esta etapa, se puede ver una proteína mayoritaria en SDS-PAGE. Se sitúa en aproximadamente 32 000 Da.
TABLA
Purificación de la enzima de metilación de la p-aminofenilalanina en p-dimetilaminifenilalanina
Etapa de purificación vol. (ml) Proteínas (mg) Act. esp. Rendimiento (%) Factor de
(unidades^{a}/mg) purificación
Extracto crudo 510 1800 29 - -
G25 Fine 560 1560 34 102 1,17
MonoQ HR 16/10 670 82 430 67 14,8
Fenil-Superose 10 3,48 6300 42 217
MonoQ HR5/5 7 0,88 17200 29 593
TSK G2000 0,8 0,113 40300 8,7 1390
^{a} \begin{minipage}[t]{155mm} Se trata de las unidades de actividad enzimática para la metilación 1. En cada etapa, el valor de las unidades de actividad enzimática para la metilación 2 era igual al 120% de la de las unidades para la metilación 1. \end{minipage}
El factor de purificación se calcula del aumento de la actividad específica de las fracciones durante la purificación.
5.7.1.C. Purificación, a partir de E. coli::pVRC706, de la proteína recombinante de S. pristinaespiralis SP92 que presenta la actividad N-metiltransferasa dependiente de SAM que cataliza la metilación de la p-aminofenilalanina en p-dimetilaminofenilalanina
Este experimento ilustra cómo se puede purificar una enzima de S. pristinaespiralis SP92 que interviene en la vía de biosíntesis de la pristinamicina IA y que se expresa en E. coli por clonación del gen papM.
Utilizando la dosificación descrita anteriormente en el ejemplo 5.7.1.A., hemos demostrado que los extractos crudos de la cepa recombinante E. coli::pVRC706 presentan mucha actividad de metilación 1 y de metilación 2, mientras que en la cepa E. coli de testigo (pMTL23) no se ha detectado ninguna de estas dos actividades. Entonces, se ha realizado la purificación de la p-aminofenilalanina (fenil-N)-metiltransferasa dependiente de SAM que cataliza la metilación de la p-aminofenilalanina en p-dimetilaminofenilalanina.
En las mismas condiciones que las descritas en el ejemplo 5.7.1.B., salvo que se ha eliminado una etapa de cromatografía (la etapa de purificación sobre MonoQ HR 5/5), hemos purificado a homogeneidad una proteína que presenta una masa molecular en cromatografía en la columna TSK G2000 y en SDS-PAGE idéntica a la que presenta la proteína purificada en el ejemplo 5.7.1.B.
TABLA
Purificación de la enzima de metilación de la p-aminofenilalanina en p-dimetilaminifenilalanina a partir de la
cepa E. coli::pVRC706
Etapa de purificación vol. (ml) Proteínas (mg) Act. esp. Rendimiento (%) Factor de
(unidades^{a}/mg) purificación
Extracto crudo 15 190 235 - -
G2S Fine 22 175 231 91 1
MonoQ HR16/10 24 13,4 2100 63 8,9
Fenil-Superose 3,0 0,39 35500 31 145
TSK G2000 0,8 0,092 45200 9,3 192
^{a} \begin{minipage}[t]{155mm} Se trata de las unidades de actividad enzimática para la metilación 1. En cada etapa, el valor de las unidades de actividad enzimática para la metilación 2 era igual al 120% de la de las unidades para la metilación 1. \end{minipage}
El factor de purificación se calcula del aumento de la actividad específica de las fracciones durante la purificación.
5.7.2. Identificación del gen estructural de la p-aminofenilalanina (fenil-N)-metiltransferasa
La secuencia del extremo NH_{2} de la proteína de 32 000 Da purificada en el ejemplo 5.7.1.B se ha determinado por microsecuenciación como se describe en el ejemplo 5.1.2. Se han determinado así una decena de restos:
TAAAPTLAQA
La secuencia del extremo NH_{2} de la proteína de 32 000 Da purificada en el ejemplo 5.7.1.C se ha determinado por microsecuenciación como se describe en el ejemplo 5.1.2. Se han determinado así una decena de restos:
TAAAPTLAQA
En los dos casos se trata de los mismos restos, y esta secuencia corresponde exactamente al comienzo de la secuencia de la proteína que se deduce de la secuencia del gen papM (véanse los restos 2 a 11 en la SEQ ID n.º 10). Por lo tanto, la p-aminofenilalanina (fenil-N)-metiltransferasa purificada es la proteína PapM.
Ejemplo 6 Subclonación de los fragmentos de ADN clonados en cósmidos como los preparados en el ejemplo 3 y que contienen los genes de interés
Este ejemplo ilustra cómo, a partir de los cósmidos construidos en el ejemplo 3 y que contienen genes de biosíntesis de las pristinamicinas II o de las pristinamicinas I, se pueden subclonar los fragmentos de ADN que contienen estos genes.
Estas subclonaciones se han efectuado para poder realizar posteriormente la secuencia de nucleótidos de los genes identificados, así como las diferentes construcciones presentadas en los ejemplos siguientes.
6.1. Aislamiento del fragmento EcoRI-BglII de 5,5 kb que contiene el gen estructural de la ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa
Este ejemplo describe cómo a partir del cósmido pIBV2, que contiene el gen estructural de la ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa, se puede subclonar un fragmento de ADN de menor tamaño que contiene este gen.
Se han cortado unos 10 \mug del cósmido pIBV2 sucesivamente con las enzimas de restricción BglIIy EcoRI (New England Biolabs) en las condiciones recomendadas por el fabricante. Los fragmentos de restricción obtenidos así se han separado mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y el fragmento BglII-EcoRI de 5,5 kb se ha aislado mediante electroelución, como se describe en Maniatis et al. (1989).
\newpage
Unos 100 ng de pUC19 (Yanisch-Perron et al., 1985) cortados por BamHI y EcoRI se han ligado con 200 ng del fragmento BglII-EcoRI de 5,5 kb en las condiciones descritas en el ejemplo 3.3.
Después de transformar la cepa TG1 y de seleccionar los transformantes sobre el medio LB sólido que contiene ampicilina a 150 \mug/ml y X-gal a 20 \mug/ml, según la técnica descrita por Maniatis et al. (1989), se ha aislado un clon que contiene el fragmento deseado. El plásmido recombinante se ha llamado pVRC402. Su mapa de restricción se presenta en la figura 15(A). Se ha demostrado mediante hibridación, en el ejemplo 5.2, que el fragmento EcoRI-BglII de 5,5 kb contiene el gen estructural de la ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa de S. pristinaespiralis SP92. Por lo tanto, el plásmido pVRC402 contiene el gen estructural de la ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa de S. pristinaespiralis SP92.
6.2. Aislamiento de un fragmento BglII-BglII de 4,6 kb a partir del cósmido pIBV2
Este ejemplo describe cómo, a partir del cósmido pIBV2, se puede subclonar un fragmento de ADN de menor tamaño, con el objetivo de identificar en las regiones adyacentes al gen estructural del ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa la presencia de otros genes implicados en la biosíntesis de las pristinamicinas L.
Las diferentes etapas de clonación se han realizado como se describió más arriba.
Se han cortado unos 10 \mug del cósmido pIBV2 con BglII. Los fragmentos de restricción obtenidos así se han separado mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, y el fragmento BglII-BglII de 4,6 kb se ha aislado por electroelución.
Unos 100 ng de pUC19 cortados por BamHI se han ligado con 200 ng del fragmento BglII-BglII.
Después de transformar la cepa TG1, como se describe en el ejemplo 6.1., se ha aislado un clon que contiene el fragmento deseado. El plásmido recombinante se ha llamado pVRC501. Su mapa de restricción se presenta en la figura 15(B).
6.3. Aislamiento del fragmento BamHI-BamHI de 6 kb que contiene los genes estructurales de las dos subunidades de la pristinamicina IIA sintasa
Este ejemplo describe cómo, a partir del cósmido pIBV1, se puede subclonar un fragmento de ADN de menor tamaño que contiene los genes estructurales de las dos subunidades de la pristinamicina IIA sintasa.
Las diferentes etapas de clonación se han realizado como se describió más arriba.
Unos 10 \mug del cósmido pIBV1 se han cortado con BamHI. Los fragmentos de restricción obtenidos así se han separado mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y el fragmento BamHI de 6 kb se ha aislado por electroelución.
Unos 100 ng de pBKS^{-} (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, California) cortados con BamHI se han ligado con 200 ng del fragmento BamHI de 6 kb.
Después de transformar la cepa TG1 se ha aislado un clon que contiene el fragmento deseado. El plásmido recombinante se ha denominado pXL2045. Su mapa de restricción se presenta en la figura 16. Se ha demostrado mediante hibridación, en el ejemplo 5.1, que el fragmento BamHI de 6 kb contiene los genes snaA y snaB que codifican las dos subunidades de la pristinamicina IIA-sintasa de S. pristinaespiralis SP92. Por lo tanto, el plásmido pXL2045 contiene los genes snaA y snaB que codifican las dos subunidades de la pristinamicina IIA sintasa de S. pristinaespiralis SP92.
6.4. Aislamiento del fragmento SphI de 6,2 kb que contiene una parte del gen estructural de la pristinamicina I sintasa II
Este ejemplo describe cómo, a partir del cósmido pIBV3, se puede subclonar un fragmento de ADN de menor tamaño que contiene una parte del gen estructural de la de la pristinamicina I sintasa II.
Las diferentes etapas de clonación se han realizado como se describe más arriba.
Unos 10 \mug del cósmido pIBV3 se han cortado con SphI. Los fragmentos de restricción obtenidos así se han separado en gel de agarosa al 0,8% y el fragmento SphI de 6,2 kb se ha aislado mediante la técnica del kit "Geneclean" comercializado por la sociedad Bio101-Ozyme.
Unos 100 ng de pUC19 cortados por SphI se han ligado con 200 ng del fragmento SphI de 6,2 kb.
Un clon que contiene el fragmento deseado se ha aislado después de transformar la cepa TG1. El plásmido recombinante se ha denominado pVRC1105. Su mapa de restricción se presenta en la figura 17.
6.5. Aislamiento del fragmento SphI de 8,4 kb que contiene una parte del gen estructural de la pristinamicina I sintasa III
Este ejemplo describe cómo, a partir del cósmido pIBV3, se puede subclonar un fragmento de ADN de menor tamaño que contiene una parte del gen estructural de la pristinamicina I sintasa III.
Las diferentes etapas de clonación se han realizado como se describe más arriba.
Unos 10 \mug del cósmido pIBV3 se han cortado con SphI. Los fragmentos de restricción obtenidos así se han separado en gel de agarosa al 0,8% y el fragmento SphI de 8,4 kb se ha aislado mediante la técnica del kit "Geneclean" comercializado por la sociedad Bio101-Ozyme.
Unos 100 ng de pUC19 cortados por SphI se han ligado con 200 ng del fragmento SphI de 8,4 kb.
Un clon que contiene el fragmento deseado se ha aislado después de transformar la cepa TG1. El plásmido recombinante se ha denominado pVRC1106. Su mapa de restricción se presenta en la figura 18.
6.6. Aislamiento del fragmento SphI de 6,6 kb que contiene una parte del gen estructural de la pristinamicina I sintasa IV
Este ejemplo describe cómo, a partir del cósmido pIBV3, se puede subclonar un fragmento de ADN de menor tamaño que contiene una parte del gen estructural de la pristinamicina I sintasa IV.
Las diferentes etapas de clonación se han realizado como se describe más arriba.
Unos 10 \mug del cósmido pIBV3 se han cortado con SphI. Los fragmentos de restricción obtenidos así se han separado en gel de agarosa al 0,8% y el fragmento SphI de 6,6 kb se ha aislado mediante la técnica del kit "Geneclean" comercializado por la sociedad Bio101-Ozyme.
Unos 100 ng de pUC19 cortados por SphI se han ligado con 200 ng del fragmento SphI de 6,6 kb.
Un clon que contiene el fragmento deseado se ha aislado después de transformar la cepa TG1. El plásmido recombinante se ha denominado pVRC1104. Su mapa de restricción se presenta en la figura 19.
6.7. Aislamiento del fragmento HindIII-HindIII de 17 kb que contiene el cósmido pHC79 y que contiene los genes situados cadena arriba de la ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa (pristinamicina I sintasa I)
Este ejemplo describe cómo, a partir del cósmido pIBV2 que contiene el gen estructural de la ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa, se puede eliminar una gran parte de este cósmido para conservar sólo la parte situada cadena arriba de la ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa.
Unos 200 ng del cósmido pIBV2 se han cortado con la enzima de restricción HindIII. La enzima se ha desnaturalizado a 85ºC, como preconiza el fabricante. El cósmido pIBV2 digerido así se ha precipitado con etanol como se describe en Maniatis et al. (1989) y se ha religado sobre sí mismo en un volumen de 50 \mul.
Después de transformar la cepa TG1 y de seleccionar los transformantes sobre LB sólido + ampicilina a 150 \mug/ml según la técnica descrita en Maniatis et al. (1989), se ha aislado un clon que contiene el cósmido pHC79 y la parte situada cadena arriba de la ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa (el conjunto se corresponde con un tamaño de aproximadamente 17 kb). El plásmido recombinante se ha llamado pVRC900. Su mapa de restricción se presenta en la figura 20.
6.8. Aislamiento del fragmento BamHI-SstI de 1,5 kb procedente del cósmido pIBV3
Este ejemplo describe cómo, a partir del cósmido pIBV3 que contiene el gen snaA que codifica la subunidad mayor de la PIIA sintasa, se puede subclonar un fragmento de ADN situado cadena arriba para estudiarlo y secuenciarlo.
Unos 10 \mug del cósmido pIBV3 se han cortado sucesivamente por las enzimas de restricción SstI y BamHI. Los fragmentos de restricción obtenidos así se han separado en gel de agarosa al 0,8% y el fragmento BamHI-SstI de 1,5 kb se ha aislado mediante la técnica del kit "Geneclean" comercializado por la sociedad Bio101-Ozyme.
Unos 100 ng del plásmido pDH5 (Hilleman et al 1991) cortados por BamHI y SstI se han ligado con 200 ng del fragmento BamHI-SstI, en las condiciones descritas en el ejemplo 3.3.
Después de transformar la cepa TG1 y de seleccionar los transformantes sobre LB sólido + ampicilina a 150 \mug/ml + X-gal, según la técnica descrita por Maniatis et al. (1989), se ha aislado un clon que contiene el fragmento deseado. El plásmido recombinante se ha llamado pVRC1000. Su mapa de restricción se presenta en la figura 21.
6.9. Aislamiento del fragmento BamHI-BamHI de 4 kb que contiene el gen estructural de la FMN reductasa
Este ejemplo describe cómo, a partir del cósmido pIBV4 que contiene el gen estructural de la FMN reductasa (snaC), se puede subclonar un fragmento de ADN de menor tamaño que contiene este gen.
Las diferentes etapas de clonación se han realizado como se describe más arriba.
Se han cortado unos 10 \mug del cósmido pIBV4 con la enzima de restricción BamHI. Los fragmentos de restricción obtenidos así se han separado mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y el fragmento BamHI-BamHI de 4 kb se ha aislado por electroelución.
Unos 100 ng de pUC19 cortados por BamHI se han ligado con 200 ng del fragmento BamHI-BamHI de 4 kb.
Después de transformar la cepa E. coli DH5\alpha (supE44 DlacU169 (f80lacZDM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1) (Hanahan, 1983) y de seleccionar los transformantes sobre LB sólido + ampicilina a 150 \mug/ml + X-gal, según la técnica descrita por Maniatis et al. (1989), se ha aislado un clon que contiene el fragmento deseado. El plásmido recombinante se ha llamado pVRC509. Su mapa de restricción se presenta en la figura 22.
Ejemplo 7 Secuencia de los fragmentos de ADN aislados que contienen los genes de biosíntesis de las pristinamicinas de S. pristinaespiralis SP92
Este ejemplo ilustra la secuenciación de los fragmentos de ADN que llevan, por una parte, los genes implicados en la biosíntesis de las pristinamicinas de la familia de las pristinamicinas I y, por otra parte, los genes implicados en la biosíntesis de las pristinamicinas de la familia de las pristinamicinas II de la cepa S. pristinaespiralis.
7.1. Secuenciación de un fragmento BamHI-XhoI de 5 kb
Este ejemplo ilustra cómo se puede obtener la secuencia de nucleótidos de un fragmento que contiene los genes snaA y snaB de S. pristinaespiralis SP92.
El fragmento BamHI-XhoI forma parte del fragmento BamHI-BamHI de 6 kb que se ha clonado en el plásmido pBKS- para obtener el plásmido pXL2045 descrito en el ejemplo 6.3. A continuación, se han obtenido subfragmentos de este inserto BamHI-XhoI de 5 kb mediante digestión enzimática, y luego se han subclonado en los fagos M13mp18 o M13mp19 (Messing et al, 1981) en las dos orientaciones. Los sitios de subclonación utilizados son los siguientes: EcoRI, PstI, PstI, NruI, EcoRI, NruI, NotI, SalI, SstI, XhoI, SalI y XhoI y se representan en la figura 16.
Estos diferentes insertos se han secuenciado mediante el método de terminación de cadena utilizando como cebador de síntesis el primer universal (Maniatis et al, 1989) o los oligonucleótidos sintetizados (como se describe en el ejemplo 5) y complementarios de una secuencia de 20 nucleótidos del inserto a secuenciar.
El solapamiento entre estos diferentes insertos ha permitido establecer la secuencia de nucleótidos total sobre las dos cadenas del fragmento BamHI-XhoI que comprende 5392 pb (SEQ ID n.º 1).
7.2. Secuenciación de una región de 1870 bp del fragmento EcoRI-BglII de 5,5 kb
Este ejemplo ilustra cómo se puede obtener la secuencia de nucleótidos de un fragmento que contiene el gen snbA de S. pristinaespiralis SP92.
La región de 1870 pb secuenciada forma parte del fragmento EcoRI-BglII de 5,5 kb que se ha clonado en el plásmido pUC19 para obtener el plásmido pVRC402 descrito en el ejemplo 6 [figura 15 (A)]. Los subfragmentos del inserto EcoRI-BglII de 5,5 kb se han obtenido mediante corte enzimático y luego se han subclonado en los fagos M13mp18 o M13mp19 en las dos orientaciones. Los sitios de subclonación son HindIII, PstI y HindIII, y se representan en la figura 15(A).
La recuperación entre estos fragmentos ha permitido establecer la secuencia total de la región Sau3A-Sau3A que comprende 1870 pb (SEQ ID n.º 5).
7.3. Secuencia de una región de 1830 pb en el fragmento BglII-BglII de 4,6 kb
Este ejemplo ilustra cómo se puede obtener la secuencia de nucleótidos de un fragmento adyacente al que contiene el gen snbA de S. pristinaespiralis SP92.
Esta secuencia se ha realizado mediante subclonación de los fragmentos BamHI-PstI de 1 kb y PstI-EcoRI de 2,1 kb [figura 15(B)] a partir del pVRC501 (ejemplo 6) en los vectores M13mp18 y M13mp19. El sitio PstI se ha sobrepasado por subclonación de un fragmento Sau3A-Sau3A de 423 pb que se solapa con este sitio y luego su secuenciación. La secuencia de 1830 pb obtenida así se representa en la (SEQ ID n.º 6).
7.4. Secuenciación de dos regiones de 227 pb y de 247 pb del fragmento SphI de 6,2 kb
Este ejemplo ilustra cómo se puede obtener la secuencia de nucleótidos de los fragmentos que contienen una parte del gen estructural de la pristinamicina I sintasa II (snbC) de S. pristinaespiralis. Las regiones de 227 y 247 pb secuenciadas forman parte del fragmento SphI de 6,2 kb que se ha clonado en el plásmido pUC19 para obtener el plásmido pVRC1105 descrito en el ejemplo 6.4 (figura 17). Los subfragmentos del inserto SphI de 6,2 kb se han obtenido mediante corte enzimático y luego se han subclonado en los fagos M13mp18 o M13mp19 en las dos orientaciones. Los sitios de subclonación son XhoI, PstI y BglII y se representan en la figura 17. El fragmento PstI-BglII de 227 pb se ha secuenciado por completo, y se han secuenciado 247 pb a partir del fragmento XhoI de 900 pb: estas secuencias se presentan en las SEQ ID n.º 11 y 12.
7.5. Secuenciación de dos regiones de 192 pb y 474 pb del fragmento SphI de 8,4 kb
Este ejemplo ilustra cómo se puede obtener la secuencia de nucleótidos de los fragmentos que contienen partes del gen estructural de la pristinamicina I sintasa III (snbD) de S. pristinaespiralis.
Las regiones de 192 y 474 pb secuenciadas forman parte del fragmento SphI de 8,4 kb que se ha clonado en el plásmido pUC19 para obtener el plásmido pVRC1106 descrito en el ejemplo 6.5 (figura 18). Los subfragmentos del inserto SphI de 8,4 kb se han obtenido mediante corte enzimático y luego se han subclonado en los fagos M13mp18 o M13mp19 en las dos orientaciones. Los sitios de subclonación son XhoI, PstI y SphI y BglII y se representan en la figura 18.
Los fragmentos BglII-SphI de 192 pb y PstI-XhoI de 474 pb se han secuenciado por completo: estas secuencias se presentan en las SEQ ID n.º 13 y 14.
7.6. Secuenciación de dos regiones de 485 pb y 291 pb del fragmento SphI de 6,6 kb
Este ejemplo ilustra cómo se puede obtener la secuencia de nucleótidos de los fragmentos que contienen partes del gen estructural de la pristinamicina I sintasa IV (snbE) de S. pristinaespiralis.
Las regiones de 291 y 485 pb secuenciadas forman parte del fragmento SphI de 6,6 kb que se ha clonado en el plásmido pUC19 para obtener el plásmido pVRC1104 descrito en el ejemplo 6.6 (figura 19). Los subfragmentos del inserto SphI de 6,6 kb se han obtenido por corte enzimático y luego se han subclonado en los fagos M13mp18 o M13mp19 en las dos orientaciones. Los sitios de subclonación son XhoI, PstI y SphI, y se representan en la figura 19. El fragmento XhoI-SphI de 485 pb se ha secuenciado por completo, y se han secuenciado 291 pb a partir del fragmento PstI de 1500 pb: estas secuencias se presentan en las SEQ ID n.º 15 y 16.
7.7. Secuencia de una región de 645 pb en un fragmento XhoI-XhoI de 3,4 kb aislado del pVRC900
Este ejemplo ilustra cómo se puede obtener la secuencia de nucleótidos de un fragmento situado cadena arriba que contiene el gen snbA de S. pristinaespiralis.
Para obtener esta secuencia, se ha subclonado previamente un fragmento XhoI-XhoI de 3,4 kb en el vector pUC18, a partir del vector pVRC900 descrito en 6.7. Las diferentes etapas de clonación se han realizado como se describe en 6.1: el plásmido pVRC900 se ha digerido con la enzima de restricción XhoI y los fragmentos así obtenidos se han separado en gel de agarosa al 0,8%. El fragmento XhoI-XhoI de 3,4 kb se ha purificado por electroelución y se ha ligado al pUC18 cortado por la enzima de restricción SalI. Después de transformar TG1, se ha aislado un clon que contiene el fragmento XhoI-XhoI de 3,4 kb. El plásmido recombinante se ha llamado pVRC903. Su mapa de restricción se presenta en la figura 23.
A continuación, se ha obtenido la secuencia de 645 pb mediante subclonación de los fragmentos PvuII-EcoRI de 1,4 kb y PvuII-EcoRI de 0,9 kb (figura 23) a partir del pVRC903 descrito anteriormente, en los vectores M13mp18 y M13mp19. Para realizar estas clonaciones, los vectores M13mp18 y M13mp19 se han digerido, en primer lugar, con la enzima de restricción BamHI; los extremos cohesivos liberados así se han rellenado con el gran fragmento Klenow de la ADN polimerasa I (New England Biolabs), según la técnica descrita por Maniatis et al. (1989), de modo que se generen unos extremos romos compatibles con los extremos liberados por la digestión con PvuII; a continuación, los vectores se han digerido con la enzima de restricción EcoRI. El sitio PvuII se ha sobrepasado mediante la subclonación de un fragmento PstI-PstI de 2,2 kb, aislado del pVRC903, que se solapa con este sitio. La secuencia de 645 pb obtenida así se representa en la SEQ ID n.º 9.
7.8. Secuencia de una región de 1050 pb en un fragmento PstI-PstI de 4,1 kb aislado del pVRC900
Este ejemplo ilustra cómo se puede obtener la secuencia de nucleótidos de un fragmento situado cadena arriba del que contiene el gen snbA de S. pristinaespiralis SP92.
Para realizar esta secuencia, se ha subclonado previamente un fragmento PstI-PstI de 4,1 kb en el vector pUC19 a partir del vector pVRC900 descrito en 6.7. Las diferentes etapas de clonación se han realizado como se describe en 6.1. El plásmido pVRC900 ha sido digerido con la enzima de restricción PstI y los fragmentos así obtenidos se han separado en gel de agarosa al 0,8%. El fragmento PstI-PstI de 4,1 kb se ha purificado por electroelución y se ha ligado al pUC19 cortado por la enzima de restricción PstI. Después de transformar TG1, se ha aislado un clon que contiene el fragmento PstI-PstI de 4,1 kb. El plásmido recombinante se ha llamado pVRC409. Su mapa de restricción se presenta en la figura 24.
A continuación, se ha realizado esta secuenciación de mediante la subclonación de los fragmentos XhoI-XhoI de 0,7 kb y XhoI-StuI de 1 kb (figura 24) a partir del pVRC409 descrito anteriormente, en los vectores M13mp18 y M13mp19. El sitio XhoI interno en la secuencia se ha sobrepasado con la secuenciación del molde bicatenario del plásmido pVRC409. La secuencia de 1050 pb obtenida así se representa en la SEQ ID n.º 10.
7.9. Secuencia de una región de 640 pb en el fragmento BamHI-SstI de 1,5 kb
Este ejemplo ilustra cómo se puede obtener la secuencia de nucleótidos de un fragmento adyacente al que contiene los genes snaA y snaB de S. pristinaespiralis que codifican las dos subunidades de la PIIA sintasa.
Esta secuencia se ha realizado por la subclonación del fragmento BamHI-SstI de 1,5 kb (figura 21) a partir del pVRC1000 (ejemplo 6.8) en los vectores M13mp18 y M13mp19 (véase el ejemplo 7.1). La secuencia de 640 pb obtenida así se representa en la SEQ ID n.º 8.
7.10. Secuenciación de la región XhoI-KpnI de 694 bp presente en el fragmento BamHI-BamHI de 4 kb
Este ejemplo ilustra cómo se puede obtener la secuencia de nucleótidos de un fragmento que contiene el gen snaC de S. pristinaespiralis.
La región de 694 pb secuenciada forma parte del fragmento BamHI-BamHI de 4 kb que se ha clonado en el plásmido pUC19 para obtener el plásmido pVRC509 descrito en el ejemplo 6.9. Un fragmento XhoI-KpnI de 694 pb, obtenido mediante digestión doble del plásmido pVRC509 con las enzimas de restricción XhoI y KpnIy que se hibrida con las 3 sondas oligonucleotídicas descritas en 5.6, se ha clonado en los fagos M13mp18 y M13mp19. Los sitios de subclonación XhoI y KpnI se representan en la figura 22.
La secuencia del fragmento de 694 pb obtenida así se presenta en la SEQ ID n.º 7.
Ejemplo 8 Análisis de las secuencias de nucleótidos mediante determinación de los marcos abiertos
Este ejemplo ilustra cómo se pueden determinar los marcos de lectura abiertos presentes en las secuencias de nucleótidos definidas en el ejemplo 7 e identificar los genes implicados en la biosíntesis de las pristinamicinas I y las pristinamicinas II de S. pristinaespiralis SP92 así como los polipéptidos codificados por estos genes.
8.1. Fragmento BamHI-XhoI de 5 kb (pXL2045)
Este ejemplo ilustra cómo se pueden determinar los marcos de lectura abiertos presentes dentro del fragmento BamHI-XhoI de 5 kb previamente aislado y secuenciado como se describe en los ejemplos 6 y 7.
Hemos buscado la presencia de marcos de lectura abiertos dentro del fragmento BamHI-XhoI de 5 kb utilizando el hecho de que el ADN de los Streptomyces presenta un porcentaje de bases G y C elevado así como un fuerte sesgo en el uso de codones que componen las fases codificantes (Bibb et al. 1984). El método de Staden y McLachlan (1982) permite calcular la probabilidad de las fases codificantes en función de los codones de los genes de Streptomyces ya secuenciados y reunidos en un fichero que contiene 19673 codones obtenido a partir del servidor informático BISANCE (Dessen et al. 1990).
Este método ha permitido caracterizar dentro del fragmento BamHI-XhoI de 5 kb cuatro marcos de lectura abiertos muy probables que se representan en la tabla siguiente. Se han denominado fases 1 a 4 según su posición a partir del sitio BamHI. Para cada una, se ha indicado su longitud en bases, su posición dentro del fragmento (situándose el sitio BamHI en la posición 1) así como la masa molecular en kDa de la proteína correspondiente. Los marcos 1, 3 y 4 están codificados en la misma cadena y la fase 2 en la cadena complementaria (figura 16).
Número del marco Posición Número de nucleótidos Número de aminoácidos PM en kDa del PM
y nombre del gen en kDa codificado
1 (snaA) 48 a 1313 1266 422 46,5
2 2530 a 1328 1203 401 -
3 (snaB) (inv) 2692 831 277 29
a 3522
4 (samS) 3558 a 4763 1206 402 43
-
Los marcos 1 y 3 corresponden, respectivamente, a las proteínas SnaA (SEQ ID n.º 2) y SnaB (SEQ ID n.º 3) previamente aisladas como se describe en el ejemplo 5 y cuya clonación de los genes se detalla en el ejemplo 6. En efecto, las secuencias del extremo NH_{2} de los productos de los ORF 1 y 3 son idénticos a las secuencias del extremo NH_{2} halladas en las proteínas SnaA y SnaB, respectivamente, en el ejemplo 5.1.2, excepto por que se ha escindido la metionina del extremo amino. Por otro lado, las masas moleculares calculadas de las secuencias son comparables a las masas moleculares aparentes de las proteínas SnaA y SnaB estimadas, respectivamente, por PAGE-SDS como se describe en el ejemplo 5.
-
La comparación del producto del marco abierto n.º 4 con las secuencias proteicas contenidas en la base de datos NBRF muestra una homología con diferentes S-adenosilmetionina (o SAM) sintasas, particularmente de E. coli (Markham et al., 1984), de rata (Horikawa et al., 1989) y de S. cerevisiae (Thomas et al., 1988). Los porcentajes de homología calculados sobre la totalidad de la secuencia con ayuda del algoritmo de Kanehisa (1984) varían del 51,8 al 55,4%.
Estas comparaciones de secuencias permiten, por lo tanto, poner de manifiesto que el producto del marco abierto n.º 4 es una SAM sintasa, implicada en la biosíntesis de las pristinamicinas I o II. Este gen se ha denominado samS (SEQ ID n.º 4).
La prueba de la implicación del gen samS en la biosíntesis de las pristinamicinas se confirmó con la construcción del mutante SP92 que contiene este gen interrumpido, como se describe en ejemplo 9.2.
-
La comparación de la secuencia del producto del marco abierto n.º 2 con las secuencias proteicas contenidas en la base de datos Genpro demuestra que una parte interna de esta proteína es homóloga en un 36% a una parte interna del primer marco abierto de la secuencia de inserción (IS891) de Anabaena (Bancroft y Wolk, 1989). Este resultado sugiere que el marco abierto n.º 2, denominado ORF 401, pertenece a una secuencia de inserción y, por lo tanto, existe una secuencia de inserción situada entre los genes snaA y snaB.
8.2. Fragmento Sau3A-Sau3A de 1870 pb (pVRC402)
Este ejemplo ilustra cómo se pueden determinar los marcos de lectura abiertos presentes en el fragmento Sau3A-Sau3A de 1870 pb previamente aislado y secuenciado como se describe en los ejemplos 6 y 7.
La búsqueda de los marcos abiertos para el fragmento Sau3A-Sau3A se ha efectuado como anteriormente. Así, se ha podido poner de manifiesto un solo marco abierto de lectura completo. Sus características son las siguientes: este marco se extiende desde la posición 109 a la posición 1858 del fragmento Sau3A-Sau3A, que corresponde a un marco de 1749 bases que codifican una proteína de 582 aminoácidos que tiene una masa molecular de 61 400 Da. Esta proteína corresponde a la proteína SnbA previamente purificada como se describe en el ejemplo 5 y cuya clonación del gen se detalla en el ejemplo 6. En efecto, la secuencia del extremo NH_{2} del producto del ORF presente sobre el fragmento Sau3A-Sau3A es idéntica a la secuencia del extremo NH_{2} encontrada para la proteína SnbA, en el ejemplo 5.2. La masa molecular de 61400 Da calculada a partir de la secuencia es comparable a la masa molecular aparente de la proteína SnbA, estimada en 67 000 Da en PAGE-SDS y en 60 000 Da mediante filtración en gel como se describe en el ejemplo 5.2.1.B.
El gen snbA codifica, por lo tanto, la enzima que cataliza la formación del aciladenilato-3-hidroxipicolinil-AMP a partir de una molécula del ácido 3-hidroxipicolínico y de una molécula de ATP: la ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa (SEQ ID n.º 5).
8.3. Fragmento de 1830 pb (pVRC501)
Este ejemplo ilustra cómo se pueden determinar los marcos de lectura abiertos presentes dentro del fragmento de 1830 pb secuenciado a partir del fragmento BamHI-EcoRI de 3,1 kb previamente aislado.
La búsqueda de los marcos abiertos para el fragmento de 1830 pb se ha efectuado como anteriormente. Así, se ha podido poner de manifiesto un solo marco abierto de lectura completo. Sus características son las siguientes: el comienzo probable de este marco se sitúa en la posición 103 y el final en la posición 1686 de la región de 1830 pb secuenciada a partir del fragmento BamHI-EcoRI, que corresponde a una proteína de 528 aminoácidos que tiene una masa molecular aproximada de 54 000 Da.
La comparación de la secuencia de esta proteína con las secuencias contenidas en la base de datos Genepro muestra que es homóloga a las proteínas que tienen una función de transporte para diferentes metabolitos, particularmente para la tetraciclina en diferentes microorganismos (Khan y Novick, 1983; Hoshino et al, 1985), la actinorrodina (Fernández-Moreno et al. 1991) y la metilenomicina (Neal y Chater, 1987) en S. coelicolor.
Estos datos indican que el producto del marco abierto contenido en el fragmento BamHI-EcoRI de 3,1 kb es una proteína de transporte que permite exportar las pristinamicinas I (y opcionalmente las pristinamicinas II) al exterior de la célula. Esta proteína se ha denominado SnbR y el gen correspondiente snbR (SEQ ID n.º 6).
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El análisis del perfil de hidrofobia de la proteína SnbR mediante el método de Kyte y Doolittle (1982) corrobora su localización membranaria y, por lo tanto, su función de transporte.
8.4. Fragmento de 1050 pb (pVRC409)
Este ejemplo ilustra cómo se pueden determinar los marcos de lectura abiertos presentes en el fragmento de 1050 pb previamente secuenciado a partir del pVRC409, como se describe en el ejemplo 7.8.
La búsqueda de los marcos abiertos para el fragmento de 1050 pb se ha efectuado como anteriormente. Así, se ha podido poner de manifiesto un solo marco abierto de lectura completo. Sus características son las siguientes: este marco se extiende desde la posición 84 a la posición 962 de la porción secuenciada, que corresponde a un marco de 878 bases que codifican una proteína de 292 aminoácidos que tiene una masa molecular de 32 000 Da. Esta proteína se ha denominado proteína PapM. Por otro lado, se ha purificado a partir de la cepa S. pristinaespiralis SP92 como se describe en el ejemplo 5. La masa molecular de 32 000 Da calculada a partir de la secuencia es idéntica a la masa molecular aparente de 32 000 Da estimada en PAGE-SDS como se describe en el ejemplo 5. Por otro lado, la secuencia del extremo NH_{2} de esta proteína, realizada como se describe en el ejemplo 5, corresponde por completo a la secuencia del extremo NH_{2} de la proteína PapM identificada mediante el análisis de los marcos abiertos de la secuencia de 1050 pb (SEQ ID n.º 10).
8.5. Fragmento de 227 pb y 247 pb (pVRC1105)
Este ejemplo ilustra cómo se pueden determinar los marcos de lectura abiertos presentes dentro de los fragmentos de 227 pb y 247 pb secuenciados a partir del pVRC1105, como se describe en los ejemplos 6 y 7.
La búsqueda del marco abierto para estos dos fragmentos se ha efectuado como anteriormente. Se ha podido poner de manifiesto un marco de lectura incompleto en los dos casos por toda la extensión del fragmento.
La secuencia obtenida a partir del marco abierto identificado en el fragmento de 247 pb aislado del fragmento XhoI de 900 pb contiene una de las secuencias internas de la proteína SnbC purificada, como se describe en el ejemplo 5.
La comparación del producto de los marcos abiertos identificados en los fragmentos de 227 pb y 247 pb aislados del pVRC1105 con las secuencias de la base de datos Genpro muestra que son homólogas a las péptido sintasas. La deducida del fragmento de 227 pb presenta un 24,5% de homología con la \alpha-aminodipil-cisteinilvalina sintasa de Acremonium chrysogenum (Gutiérrez et al. 1991). La deducida del fragmento de 247 pb presenta un 34,9% de homología con la gramicidina S sintasa II de Bacillus brevis (Turgay et al. 1992) y un 28% con la \alpha-aminodipil-cisteinilvalina sintasa de Acremonium chrysogenum (Gutiérrez et al. 1991).
Esto confirma que el cósmido pIBV3 aislado en el ejemplo 5.1 contiene realmente una parte del gen estructural de la pristinamicina I sintasa II descrita en el ejemplo 5.3, denominada SnbC (SEQ ID n.º 11 y 12).
8.6. Fragmento de 192 pb y de 474 pb (pVRC1106)
Este ejemplo ilustra cómo se pueden determinar los marcos de lectura abiertos presentes dentro de los fragmentos de 192 pb y 474 pb secuenciados a partir del pVRC1106, como se describe en los ejemplos 6 y 7.
La búsqueda del marco abierto para estos dos fragmentos se ha efectuado como anteriormente. También se ha podido poner de manifiesto un marco de lectura incompleto en el fragmento de 192 pb aislado del pVRC1106. Sus características son las siguientes: este marco comienza en la posición 3 de la porción secuenciada en dirección del sitio BglII. No se ha identificado ningún codón de parada, lo que indica que este marco abierto no se ha terminado.
La secuencia obtenida a partir del marco abierto identificado en el fragmento BglII-SphI de 192 pb contiene la secuencia interna de la proteína SnbD purificada como se describe en el ejemplo 5 que se revela, en efecto, por ser la secuencia del extremo NH_{2} de la proteína.
Se ha podido poner de manifiesto un marco de lectura incompleto en todo el fragmento XhoI-PstI de 474 pb.
La comparación del producto del marco abierto identificado en el fragmento de 474 pb aislado del pVRC1106 con las secuencias de la base de datos Genpro muestra que este fragmento de proteína presenta del 30 al 40% de homología con las péptido sintasas, por ejemplo, el 39,4% con la gramicidina S sintasa II de Bacillus brevis (Turgay et al. 1992) y el 34% con la \alpha-aminoadipil-cisteinil-valina sintasa de Acremonium chrysogenum (Gutiérrez et al. 1991).
Esto confirma que el cósmido pIBV3 aislado en el ejemplo 5.1 contiene realmente una parte del gen estructural de la pristinamicina I sintasa III descrita en el ejemplo 5.4, denominada SnbD (SEQ ID n.º 13 y 14).
8.7. Fragmento de 291 pb y de 485 pb (pVRC1104)
Este ejemplo ilustra cómo se pueden determinar los marcos de lectura abiertos presentes dentro de los fragmentos de 291 pb y 485 pb secuenciados a partir del pVRC1104, como se describe en los ejemplos 6 y 7.
La búsqueda del marco abierto para estos dos fragmentos se ha efectuado como anteriormente. Se ha podido poner de manifiesto un marco de lectura incompleto en los dos casos en todo el fragmento.
La secuencia obtenida a partir del marco abierto identificado en el fragmento de 291 pb a partir del fragmento PstI de 1450 pb contiene la secuencia interna de la proteína SnbE purificada como se describe en el ejemplo 5.
La comparación del producto del marco abierto identificado en el fragmento XhoI-SphI de 485 pb aislado del pVRC1104 con las secuencias de la base de datos Genpro demuestra que es homóloga a las péptido sintasas, por ejemplo, un 34,7% con la gramicidina S sintasa II de Bacillus brevis (Turgay et al. 1992) y un 36,2% con la \alpha-aminoadipil-cisteinil-valina sintasa de Acremonium chrysogenum (Gutiérrez et al. 1991).
Esto confirma que el cósmido pIBV3 aislado en el ejemplo 5.1 contiene realmente una parte del gen estructural de la pristinamicina I sintasa IV descrita en el ejemplo 5.5, denominada SnbE (SEQ ID n.º 15 y 16).
8.8. Fragmento de 645 pb (pVRC903)
Este ejemplo ilustra cómo se pueden determinar los marcos de lectura abiertos presentes dentro del fragmento de 645 pb previamente secuenciado a partir del plásmido pVRC903, como se describe en el ejemplo 6.7.
La búsqueda de los marcos abiertos para el fragmento de 645 pb se ha efectuado como anteriormente. Así, se ha podido poner de manifiesto un solo marco abierto de lectura incompleto. Sus características son las siguientes: este marco presenta dos posibilidades de inicio de traducción: un GTG en la posición 61 y un GTG en la posición 70 de la porción secuenciada (el ATG situado en la posición 124 no se ha tenido en cuenta debido a las homologías de las secuencias descritas anteriormente). El análisis de las probabilidades de la presencia de las regiones de Shine-Dalgarno no permite distinguir cuál de estos codones corresponde al inicio. No se ha identificado ningún codón de parada, lo que indica que no se ha terminado esta fase abierta. El gen del que se ha identificado una parte se ha denominado papA y la proteína correspondiente se ha denominado proteína PapA (SEQ ID n.º 9).
La comparación del producto del marco abierto identificado en el fragmento XhoI-XhoI de 3,4 kb aislado del pVRC900 con las secuencias contenidas en la base de datos Genpro demuestra que es homóloga a los compuestos II de las proteínas de tipo p-aminobenzoato sintasa y antranilato sintasa implicadas, respectivamente, en la síntesis del ácido p-aminobenzoico (precursor del ácido fólico) y en la síntesis del ácido antranílico (precursor del triptofano) de diferentes microorganismos. Presenta particularmente una homología del 48% con la proteína TrpG de Azospirillum (Zimmer et al 1991) y una homología del 47% con la proteína PabA de Klebsiella pneumoniae (Kaplan et al 1985). Las proteínas TrpG y PabA contienen la actividad glutaminasa implicada en la transaminación del ácido corísmico. Las homologías puestas de manifiesto tienden a demostrar que la proteína PapA también estará implicada en la actividad de la transaminación del ácido corísmico. El ácido corísmico se propone como precursor de la p-dimetilamino-fenilalanina, componente de las pristinamicinas I, por analogía con la síntesis del cloroamfenicol, antibiótico producido por los Streptomyces (Sharka et al 1970).
El papel de la proteína PapA se ha demostrado posteriormente (ejemplo 9.3) mediante el análisis de los mutantes del gen papA en la cepa SP92.
8.9. Fragmento BamHI-SstI de 1,5 kb (pVRC1000)
Este ejemplo ilustra cómo se pueden determinar los marcos de lectura abiertos presentes dentro del fragmento BamHI-SstI de 1,5 kb previamente aislado y secuenciado como se describió en los ejemplos 6.8 y 7.9.
La búsqueda de los marcos abiertos para la región secuenciada de 640 pb presentes en el fragmento BamHI-SstI de 1,5 kb se ha efectuado como se describe en el ejemplo 8.1. Así, se ha podido poner de manifiesto un solo marco abierto de lectura completo. No se han podido poner de manifiesto ningún inicio ni ningún final de traducción, lo que indica que la región de 640 pb secuenciada probablemente es interna a un marco de lectura mucho más grande, denominado snaD (SEQ ID n.º 8).
La comparación de la secuencia de la proteína codificada por la región de 640 pb con las secuencias proteicas contenidas en las bases de datos Genpro y NBRF demuestra que esta proteína es homóloga en un 20 al 25% en una parte interna de las péptido sintasas como la gramicidina sintasa I de B. brevis (Hori et al, 1989), de la tirocidina sintasa I de B. brevis (Weckermann et al 1988), y de la ACV sintasa de Acremonium chrysogenum (Gutiérrez et al, 1991).
Estos datos indican que la proteína codificada en parte por la región de 640 pb probablemente es una péptido sintasa implicada en la biosíntesis de la parte peptídica de las pristinamicinas II: en efecto, ya se han identificado todas las péptido sintasas implicadas en la biosíntesis de las pristinamicinas I en otras regiones del cromosoma de S. pristinaespiralis tal y como se describe en los ejemplos 5.2, 5.3, 5.4 y 5.5.
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8.10. Fragmento de 694 pb (pVRC509)
Este ejemplo ilustra cómo se pueden determinar los marcos de lectura abiertos presentes dentro del fragmento de 694 pb previamente secuenciado a partir del pVRC509, como se describe en los ejemplos 6 y 7.
La búsqueda de los marcos abiertos para el fragmento de 694 pb se ha efectuado como anteriormente. Así, se ha podido poner de manifiesto un solo marco abierto de lectura incompleto. Sus características son las siguientes: esta fase comienza en la posición 210 de la porción secuenciada. No se ha identificado ningún codón de parada, lo que indica que no se ha terminado este marco abierto. Por lo tanto, la masa molecular de la proteína correspondiente no se ha podido calcular y comparar con la masa molecular aparente de 28 000 Da de la FMN reductasa, estimada en PAGE-SDS como se describe en el ejemplo 5.6. En cambio, la secuencia del extremo NH_{2} de la proteína así identificada mediante el análisis de los marcos abiertos de la secuencia de 694 pb es idéntica a la secuencia del extremo NH_{2} de la proteína SnaC purificada como se describe en el ejemplo 5. Igualmente, en la proteína deducida de la porción secuenciada se encuentran las dos secuencias proteicas internas de la FMN reductasa descrita en 5.6. Esto confirma que el gen aislado a partir del cósmido pIBV4 corresponde realmente a la proteína FMN reductasa descrita en el ejemplo 5.6, denominada SnaC (SEQ ID n.º7).
El estudio de los fragmentos del ADN de la cepa S. pristinaespiralis SP92, contenidos en los cósmidos pIBV1 a pIBV4, ha puesto de manifiesto la presencia de varios genes implicados en la biosíntesis de las pristinamicinas II y de las pristinamicinas I. Los genes snaA, snaB y samS codifican las enzimas que intervienen en la biosíntesis de las pristinamicinas II, la pristinamicina IIA sintasa y una probable SAM sintasa, y se agrupan físicamente en un gran fragmento de ADN clonado en el cósmido pIBV1. Igualmente, los genes snbA, snbR, papA y papM -que codifican las proteínas que intervienen en la biosíntesis de las pristinamicinas I, la ácido 3-hidroxipicolínico-AMP ligasa (SnbA), la proteína SnbR probablemente responsable del transporte de las pristinamicinas I, la proteína PapA implicada en la biosíntesis, a partir del ácido corísmico, de la p-aminofenilalanina, y la p-aminofenilalanina (fenil-N)-metiltransferasa (PapM)- se agrupan en un gran fragmento de ADN clonado en el cósmido pIBV2. Igualmente, los genes snaA y snaD, por una parte -que codifican las proteínas que intervienen en la biosíntesis de las pristinamicinas II, la proteína SnaD que probablemente sea una péptido sintasa- y los genes snbC, snbD y snbE, por otra parte -que codifican las 3 péptido sintasas SnbC, SnbD y SnbE, implicadas en la formación de la cadena peptídica de la pristinamicina I a partir de sus 6 aminoácidos separados- se agrupan en un gran fragmento de ADN clonado en el cósmido pIBV3. Estos resultados confirman la hipótesis del agrupamiento de los genes de biosíntesis de las pristinamicinas II e, igualmente, de los genes de biosíntesis de las pristinamicinas I, y ofrecen la posibilidad de clonar los otros genes implicados en estas biosíntesis, mediante el paseo cromosómico, hacia 5' y hacia 3' de las regiones estudiadas.
Además, se puede, mediante hibridación del ADN total de las diferentes cepas productoras de estreptograminas (véase la tabla 1) con los genes snaA, snaB, snaC, snaD, samS, snbA, snbR, snbC, snbD, snbE, papA y papM o con los genes identificados por paseo cromosómico, o con los fragmentos de los mismos, aislar los genes correspondientes a las mismas funciones en los otros microorganismos productores de estreptograminas. Esto permite, mediante el mismo método que el contemplado para las pristinamicinas, aislar el conjunto de los genes implicados en la biosíntesis de las diferentes estreptograminas.
Ejemplo 9 Estudio genético de fragmentos de ADN por interrupción de genes
Este ejemplo ilustra cómo se puede poner de manifiesto la implicación de los genes en la biosíntesis de las estreptograminas construyendo cepas derivadas de una cepa productora, mutadas en estos genes mediante interrupción y analizando el fenotipo de tales mutantes. Además, este ejemplo muestra como obtener unas cepas que sólo produzcan uno u otro de los compuestos A y B de las estreptograminas, o que produzcan los compuestos A o B con unas proporciones diferentes de las que se observan con la cepa SP92.
9.1. Construcción de un mutante de S. pristinaespiralis SP92 con en el gen snaA interrumpido
Este ejemplo ilustra cómo se puede construir, mediante interrupción del gen snaA, una cepa de S. pristinaespiralis SP92 que ya no produce la pristinamicina IIA y que, en cambio, produce la pristinamicina IIB.
Este mutante se ha construido con el objetivo de confirmar la funcionalidad de la proteína SnaA y de proporcionar un intermediario de producción de la pristinamicina II que, más tarde, se pueda modificar.
Su construcción se ha realizado con ayuda de un vector suicida, que puede replicarse en E. coli solamente pero que contiene un marcador de resistencia que se expresa en Streptomyces. Este vector, pDH5, ha sido desarrollado por Hillemann et al. (1991).
9.1.1. Construcción del plásmido pVRC505
Este ejemplo ilustra cómo se puede construir un plásmido que no se replique en S. pristinaespiralis SP92 y que se pueda utilizar para interrumpir el gen snaA mediante recombinación homóloga simple.
El plásmido pVRC505 se ha construido para realizar el mutante cromosómico SP92 con el gen snaA interrumpido a partir del plásmido pXL2045 descrito en el ejemplo 6.3.
El fragmento BamHI de 6 kb, clonado en el pXL2045 (figura 16), se ha cortado con las enzimas de restricción EcoRI y PstI. Después de la separación de los fragmentos así generados mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, se ha aislado y purificado por Geneclean (Bio101, La Jolla, California) un fragmento de 0,7 kb, que contiene el extremo 5' del gen snaA.
Con 100 ng del fragmento de 0,7 kb se han ligado 100 ng del vector pDH5 linealizados mediante una doble digestión EcoRI-PstI, como se describe en el ejemplo 3.3. Un clon que contiene el fragmento deseado se ha aislado después de transformar la cepa TG1. El plásmido recombinante se ha denominado pVRC505. El plásmido pVRC505 se ha preparado como se describe en el ejemplo 2.1. Su mapa de restricción se presenta en la figura 25.
9.1.2. Aislamiento del mutante SP92 con el gen snaA interrumpido mediante recombinación homóloga
Este ejemplo ilustra cómo se ha construido el mutante de S. pristinaespiralis SP92, con el gen snaA interrumpido.
Este mutante se ha aislado mediante transformación de la cepa SP92 con el plásmido suicida pVRC505.
La preparación de los protoplastos y su transformación se han realizado como se describe en D. Hopwood et al. (1985).
La cepa SP92 se ha cultivado en el medio YEME, sacarosa al 34%, MgCl_{2} a 5 mM y glicina al 0,25%, durante 40 horas a 30ºC. El micelio se ha convertido en protoplastos en presencia de lisozima y se han utilizado 5X1 \mug de pVRC505 para la transformación (mediante el método que utiliza el PEG) de los protoplastos. Después de una noche de regeneración de los protoplastos sobre el medio R2YE (D. Hopwood et al. 1985), los recombinantes se han seleccionado al sembrar 3 ml del medio SNA (D. Hopwood et al. 1985) que contiene tioestreptón a 2,6 \mug/ml.
En las 5 transformaciones realizadas se han aislado 3 clones resistentes al tioestreptón. Esto da una tasa de recombinantes inferior a 1 por \mug de ADN. Estos recombinantes proceden de la integración mediante recombinación homóloga simple entre el gen snaA contenido en el cromosoma de la cepa SP92 y el fragmento de 0,7 kb del plásmido suicida pVRC505. El pequeño tamaño del fragmento insertado en pVRC505, 0,7 kb, explica la minúscula tasa de recombinación.
Las esporas de los recombinantes se han aislado mediante su siembra y crecimiento en el medio R2YE complementado con tioestreptón a 400 \mug/ml, y retrosembradas en el mismo medio para obtener colonias aisladas.
Para verificar la posición en la que se ha integrado el plásmido pVRC505, con el vector pDH5 y el fragmento de 0,7 kb, utilizados sucesivamente como sondas después de la marcación mediante cebado aleatorio (kit de marcación Random primed DNA, Boehringer Mannheim, Francia) con [\alpha-^{32}P]dCTP, como se describe en Maniatis et al. (1989), se han realizado e hibridado diferentes Southern del ADN total de varios clones recombinantes digeridos con las enzimas de restricción adecuadas. Los resultados de la hibridación muestran la aparición, en el genoma de los clones recombinantes, de una banda EcoRI-PstI adicional, del tamaño de un vector pDH5 y que se hibrida con éste, así como de una banda adicional EcoRI-EcoRI que se hibrida a la vez con las 2 sondas. Uno de estos mutantes se ha denominado SP92::pVRC505. Este mutante corresponde realmente a la integración mediante recombinación simple homóloga del plásmido pVRC505 en el gen snaA.
9.1.3. Producción de las pristinamicinas mediante el mutante SP92::pVRC505
Este ejemplo ilustra cómo se ha determinado que el mutante S. pristinaespiralis SP92, con el gen snaA interrumpido mediante la integración del plásmido pVRC505, ya no produce pristinamicina IIA, al mismo tiempo que continúa produciendo la pristinamicina IIB.
El mutante SP92::pVRC505, así como la cepa SP92, en tanto que cepa de testigo, se han cultivado en un medio de producción líquido. La fermentación se ha realizado como sigue: se añaden 0,5 ml de una suspensión de esporas de las cepas citadas en condiciones estériles a 40 ml de un medio de inóculo en un matraz de 300 ml. El medio inóculo está constituido por Corn Steep a 10 g/l, sacarosa a 15 g/l, (NH_{4})_{2}SO_{4} a 10 g/l, K_{2}HPO_{4} a 1 g/l, NaCl a 3 g/l, MgSO_{4}-7H_{2}O a 0,2 g/l y CaCO_{3} a 1,25 g/l. El pH se ajusta a 6,9 con sosa antes de introducir el carbonato de calcio. Los matraces se agitan durante 44 horas a 27ºC en un agitador rotatorio con una velocidad de 325 rpm. Se añaden 2,5 ml del cultivo anterior agitado 44 horas en esterilidad a 30 ml de un medio de producción en un matraz de 300 ml. El medio de producción está constituido por harina de soja a 25 g/l, almidón a 7,5 g/l, glucosa a 22,5 g/l, levadura de forraje a 3,5 g/l, sulfato de cinc a 0,5 g/l y carbonato de calcio a 6 g/l. El pH se ajusta a 6,0 con ácido clorhídrico antes de introducir el carbonato de calcio. Los matraces se agitan durante 24, 28 y 32 horas a 27ºC. A su debido momento, se pesan 10 g de mosto en un matraz liso, a los que se les añaden 20 ml de fase móvil compuesta de acetonitrilo al 62,5% y una disolución de KH_{2}PO_{4} a 0,1 M (ajustado a un pH 3,0 con H_{3}PO_{4}) al 37,5% y permitiéndose la extracción de las pristinamicinas. Después de la agitación en un agitador (325 rpm) durante 20 min a temperatura ambiente, se filtra todo en un filtro de papel y las pristinamicinas se dosifican mediante HPLC como se describe en el ejemplo 5.1.1.A.
Los resultados han demostrado que, en las condiciones de fermentación realizadas, el mutante SP92::pVRC505 ha producido una cantidad de pristinamicina I equivalente a la del testigo SP92 en los 3 tiempos analizados. En cambio, mientras que el testigo ha producido a las 24, 28 y 32 horas de fermentación aproximadamente el 70% de pristinamicina IIA y el 30% de pristinamicina IIB, el mutante SP92::pVRC505 ha producido, para estos mismos tiempos, el 100% de pristinamicina IIB, en cantidades equivalentes a la suma de la pristinamicina IIA + la pristinamicina IIB producidas por la cepa SP92. Por lo tanto, el mutante tiene completamente bloqueada una etapa de biosíntesis de la pristinamicina II que corresponde a la oxidación del enlace 2-3 de la D-prolina del intermediario pristinamicina IIB. Por lo tanto, este mutante acumula la pristinamicina IIB. Esto demuestra con claridad la implicación funcional del gen snaA en la conversión de la pristinamicina IIB en la pristinamicina IIA.
Este ejemplo muestra que es posible, a partir de los genes de biosíntesis clonados, construir cepas mutadas en las etapas de biosíntesis de las pristinamicinas. Esto se ha demostrado para las pristinamicinas II, pero se pueden obtener los mismos resultados para las pristinamicinas I y, por extensión, para los diferentes compuestos de las estreptograminas. Así, se pueden obtener cepas que produzcan diferentes intermediarios. Estas cepas se pueden utilizar para producir unas moléculas nuevas, mediante modificación(s) química(s), bioquímica(s), enzimática(s), etc., de los mencionados intermediarios. Un bloqueo de una etapa temprana de la vía de biosíntesis de uno u otro de los componentes de las estreptograminas también puede conducir a unas cepas mutadas que no produzcan más que uno u otro de los componentes.
9.2 Construcción de un mutante de S. pristinaespiralis SP92 interrumpido en el mismo gen samS
Este ejemplo ilustra cómo se puede, mediante interrupción del gen samS, construir una cepa de S. pristinaespiralis SP92 que produce un 35% menos de PIA y aproximadamente 10 veces más de PIB (las estructuras químicas se representan en la figura 2) con relación a la cepa salvaje SP92. Este mutante se ha construido con el fin de confirmar la función de la SAM sintasa, que se supone que es la proteína codificada por el gen samS, y obtener una cepa que sintetice más PIB que la cepa salvaje SP92.
9.2.1. Construcción del plásmido pVRC702
A partir del plásmido pXL2045 (descrito en el ejemplo 6.3.), se ha aislado mediante corte enzimático el fragmento BamHI-EcoRI de 3,2 kb que se ha purificado después de la electroforesis en gel de agarosa al 1% por el método del kit Geneclean (véase el ejemplo 6.8). Este fragmento contiene el gen snaB así como el gen samS (figura 16). A continuación, este fragmento se ha clonado en el plásmido pUC18 de la manera siguiente: se han linealizado 50 ng de pUC18 mediante doble digestión con ayuda de las enzimas EcoRI y BamHI y luego se han ligado en presencia de la T4 ADN ligasa (Biolabs) con 300 ng del fragmento BamHI-EcoRI de 3,2 kb. Después de transformar células competentes de la cepa E. coli TG1 con esta mezcla de ligación, se ha podido aislar un clon recombinante que posee el plásmido pUC18 con el inserto de 3,2 kb que se ha denominado pVRC701 (figura 26).
El plásmido pVRC702 deriva del plásmido pVRC701 mediante la introducción de una casete que contiene el gen amR, que codifica la resistencia a la apramicina y a la geniticina, entre los dos sitios SstI situados en medio del gen samS (figura 27). Para esto, se ha aislado primero un fragmento BamHI-BamHI de 2,2 kb que contiene la casete \OmegaamR por digestión con BamHI del plásmido pHP45\OmegaamR (proporcionado por J.L. Pernodet, Laboratoire de Génétique de Orsay) con la misma técnica que anteriormente. A continuación, 200 ng de este fragmento se han ligado con 50 ng del plásmido pUC1318 (Kay y McPherson, 1987) linealizados con la enzima BamHI, y esta mezcla de ligación se ha introducido en las células competentes E. coli TG1. A partir del clon recombinante que posee el plásmido pUC1318 que contiene la casete \OmegaamR, se han podido reaislar, mediante corte parcial con ayuda de la enzima SstI, 50 ng de un fragmento SstI-SstI de 2,2 kb que contiene la casete \OmegaamR que se ha ligado con 30 ng del plásmido pVRC701 cortado con SstI (figura 26) para proporcionar, después de la transformación de las células competentes E. coli TG1, el plásmido pVRC702 cuya estructura se detalla en la figura 27.
El plásmido pVRC702 obtenido así se ha preparado en grandes cantidades según el método previamente descrito en el ejemplo 2.1.
9.2.2. Construcción de la cepa que tiene el gen cromosómico samS::\OmegaamR
Esta cepa se ha obtenido mediante transformación de protoplastos de S. pristinaespiralis con 1 \mug del plásmido suicida pVRC702 que no puede replicarse en una célula de Streptomyces. Los protocolos de preparación de los protoplastos y de la transformación son los mismos que anteriormente (ejemplo 9.1). Las únicas modificaciones aportadas con relación al ejemplo 9.1 se refieren al antibiótico de selección. En el caso actual, los protoplastos recombinantes, después de una regeneración de 18 horas a 30ºC en un medio R2YE, se seleccionan en presencia de geneticina a 50 \mug/ml finales (Sigma Chemical Co.). Así, en cada frasco de RY2E, se añade una sobrecapa compuesta de 3 ml de SNA que contiene geniticina a 383 \mug/ml.
Así se han podido aislar 500 clones recombinantes resistentes a la geneticina que pueden proceder bien de una integración en el cromosoma del plásmido pVRC702 después de una recombinación homóloga simple entre los genes cromosómico y plasmídico samS (caso de entrecruzamiento simple), o bien de un intercambio entre el gen cromosómico samS y el gen plasmídico samS::\OmegaamR después de un doble acontecimiento de recombinación homóloga (caso de entrecruzamiento doble). En estos dos casos de figura, la casete \OmegaamR se encuentra transferida al cromosoma de la cepa y le confiere una resistencia amR estable durante generaciones.
Los clones recombinantes se han aislado mediante siembra y crecimiento en un medio R2YE que contiene 50 \mug/ml finales de geneticina y luego se han analizado con la técnica de hibridación en colonias. La hibridación de los clones con una primera sonda, obtenida como se describe en el ejemplo 9.1 a partir del fragmento BamHI-EcoRI de 2,7 kb procedente del pVRC702 y que corresponde al pUC18, así como con una segunda sonda, que corresponde al fragmento BamHI de 2,2 kb que contiene la casete \OmegaamR, ha permitido distinguir los casos de entrecruzamiento simple (que hibrida con las dos sondas) de los casos de entrecruzamiento doble (que sólo hibridan con la segunda sonda). Los 3 clones que surgen de un entrecruzamiento doble así seleccionados se han purificado mediante siembra y crecimiento en un medio R2YE que contiene 50 \mug/ml finales de geneticina, y se han obtenido reservas de esporas.
Para verificar la estructura genómica de los 3 recombinantes dobles, se han realizado diferentes Southern del ADN cromosómico de estos clones digerido con las enzimas EcoRI y BamHI, y se han hibridado con las tres sondas siguientes: la sonda correspondiente a la casete \OmegaamR obtenida a partir del fragmento BamHI de 2,2 kb del pVRC702, la sonda correspondiente al pUC18 obtenida a partir del fragmento BamHI-EcoRI de 2,7 kb del pVRC701 y, finalmente, una sonda obtenida a partir del fragmento EcoRI-SstI de 1,3 kb del pVRC701 que contiene el gen snaB y el comienzo de samS. Estas hibridaciones han permitido verificar que los tres clones ensayados resultaban realmente de un doble acontecimiento de recombinación homóloga que ha permitido el reemplazo del gen cromosómico intacto samS por el gen mutado samS interrumpido por la casete \OmegaamR.
Uno de estos tres clones mutantes se ha denominado SP92 samS::\OmegaamR.
9.2.3. Producción de pristinamicinas para la cepa mutante samS:: \OmegaamR
Este ejemplo ilustra cómo se determina que el mutante SP92 samS:: \OmegaamR que tiene el gen samS interrumpido produce un 35% menos de pristinamicina IA y 10 veces más de pristinamicina IB que la cepa salvaje SP92.
El mutante SP92 samS:: \OmegaamR así como la cepa testigo SP92 se han cultivado en un medio de producción líquido, y sus producciones de pristinamicina II y de pristinamicina I se han dosificado como se describe en el ejemplo 9.1.
Los resultados han demostrado que, en las condiciones de fermentación realizadas, el mutante SP92 samS:: \OmegaamR produce una cantidad de pristinamicinas II equivalente a la del testigo SP92 para los tres tiempos analizados. En cambio, el mutante SP92 samS:: \OmegaamR produce, en los tres tiempos ensayados, aproximadamente un 35% menos de pristinamicina IA y 10 veces más de pristinamicina IB que la cepa testigo. La forma IB de las pristinamicinas representa, así, el 20% del conjunto de las pristinamicinas del tipo I totales producidas por el mutante SP92 samS:: \OmegaamR, mientras que la cepa testigo sólo sintetiza del orden del 1% de PIB. La forma IB de las pristinamicinas difiere de la forma IA por el hecho de que el quinto resto es la p-metilaminofenilalanina en lugar de la p-dimetilaminofenilalanina para la pristinamicina IA. El hecho de que el mutante SP92 samS:: \OmegaamR produzca más pristinamicina IB y menos pristinamicina IA demuestra que la interrupción del gen samS provoca una disminución del grado de metilación del quinto resto de las pristinamicinas I y, por lo tanto, que el gen samS está probablemente implicado en la biosíntesis del donante de metilo, la SAM, es decir, que codifica una SAM sintasa.
9.3. Construcción de un mutante de S. pristinaespiralis SP92 con el gen papA interrumpido
Este ejemplo ilustra cómo se puede, mediante interrupción del gen papA, construir una cepa de S. pristinaespiralis SP92 que ya no produce PI. Este mutante se ha construido con el fin de confirmar la funcionalidad de la proteína papA. Su construcción se ha realizado con ayuda del vector suicida, pDH5, descrito en el ejemplo 9.1.
9.3.1. Construcción del plásmido pVRC508
Este ejemplo ilustra cómo se puede construir un plásmido que no se replique en S. pristinaespiralis SP92, que se puede utilizar para interrumpir el gen papA mediante recombinación homóloga simple.
El plásmido pVRC508 se ha construido para realizar el mutante cromosómico de SP92 con el gen papA interrumpido, a partir del plásmido pVRC903, descrito en el ejemplo 7.7.
En el ejemplo 7.7, se ha descrito la clonación del fragmento PvuII-EcoRI de 1,4 kb en M13mp18 a partir del plásmido pVRC903, con vistas a la secuenciación del gen papA (este fragmento corresponde al fragmento PvuII-XhoI de 1,4 kb presente en el vector pVRC903, figura 23).
Esta construcción en M13mp18 se ha digerido con las enzimas de restricción HindIII y EcoRI. Después de la separación por electroforesis en gel de agarosa al 0,8% del vector M13mp18 y del fragmento de 1,4 kb, que contiene una parte del gen papA, éste se ha aislado y purificado por Geneclean (Bio101, La Jolla, California). La localización del fragmento en el gen papA se presenta en la figura 23.
100 ng del vector pDH5, linealizados mediante una doble digestión con las enzimas de restricción HindIII y EcoRI, se han ligado con 200 ng del fragmento de 1,4 kb, como se describe en el ejemplo 3.3. Un clon que contiene el fragmento deseado se ha aislado después de transformar la cepa TG1. El plásmido recombinante se ha denominado pVRC508. El plásmido pVRC508 se ha preparado como se describe en el ejemplo 2.1. Su mapa de restricción se presenta en la figura 28.
9.3.2. Aislamiento del mutante SP92 interrumpido en el gen papA mediante recombinación homóloga
Este ejemplo ilustra cómo se ha construido el mutante de S. pristinaespiralis SP92 con el gen papA interrumpido. Este mutante se ha aislado mediante la transformación de la cepa SP92 con el plásmido suicida pVRC508. La preparación de los protoplastos y su transformación se han realizado como se describe en el ejemplo 9.1. Después de la transformación de los protoplastos de la cepa SP92, los recombinantes se han seleccionado sembrando 3 ml del medio SNA que contiene 2,6 mg/ml de tioestreptón. En las 5 transformaciones realizadas con 5 veces 1 \mug del plásmido pVRC508, se han aislado una decena de clones resistentes al tioestreptón. Esto da una tasa de recombinantes de aproximadamente 2 por \mug de ADN. Estos recombinantes son el producto de la integración mediante recombinación homóloga simple entre el gen papA contenido en el cromosoma de la cepa SP92 y el fragmento de 1,4 kb del plásmido suicida pVRC508.
Las esporas de los recombinantes se han aislado mediante siembra y crecimiento en el medio R2YE que contiene 400 \mug/ml de tioestreptón y se han resembrado en el mismo medio para obtener las colonias aisladas.
Para verificar la posición en la que se ha integrado el plásmido pVRC508, se han realizado diferentes Southern del ADN total de varios clones recombinantes, purificados como se describe anteriormente, y se han hibridado con el vector pDH5 y el fragmento de 1,4 kb utilizados sucesivamente como sondas después de la marcación mediante cebado aleatorio con [\alpha-^{32}P]dCTP como se describe en el ejemplo 9.1. Los resultados de la hibridación muestran la desaparición, en el genoma de los clones recombinantes digeridos por la enzima de restricción EcoRI (sitio que flanquea el fragmento de 1,4 kb), de la banda EcoRI de 6,8 kb y la aparición de dos bandas adicionales en comparación con la cepa de testigo SP92, una de 2,4 kb que se hibrida con el fragmento de 1,4 kb y la otra de 10,5 kb que se hibrida, a la vez, con pDH5 y con el fragmento de 1,4 kb. La digestión de los clones recombinantes por la enzima de restricción PstI muestra la aparición de dos bandas adicionales en relación a la cepa de testigo SP92, una de 1,0 kb que se hibrida con el fragmento de 1,4 kb y la otra de 5,1 kb que se hibrida, al mismo tiempo, con pDH5 y con el fragmento de 1,4 kb. Uno de estos mutantes se ha denominado SP92::pVRC508.
9.3.3. Producción de pristinamicinas mediante el mutante SP92::pVRC508
Este ejemplo ilustra cómo se determina que el mutante de S. pristinaespiralis SP92 con el gen papA interrumpido por la integración del plásmido pVRC508 ya no produce pristinamicina I.
El mutante SP92::pVRC508, así como la cepa SP92, en tanto que cepa de testigo, se han cultivado en un medio de producción líquido. La fermentación, así como la dosificación de las pristinamicinas I y II, se han realizado como se describe en el ejemplo 9.1.
Los resultados han mostrado que en las condiciones de fermentación realizadas, mientras que la cepa de testigo SP92 produce una cantidad estándar de pristinamicinas I, no se ha detectado ninguna traza de pristinamicinas de tipo I en el mosto de fermentación del mutante SP92::pVRC508. Por otro lado, la producción de las pristinamicinas II por el mutante SP92::pVRC508 es equivalente a la del testigo SP92. Por lo tanto, el mutante SP92::pVRC508 ya no produce más que pristinamicinas II. Estos resultados demuestran totalmente que el gen papA codifica una proteína implicada en la biosíntesis de las pristinamicinas I.
Por otro lado, para asegurar que la interrupción realizada sólo afecta al gen objetivo papA, se ha fermentado el mutante SP92::pVRC508 en presencia de p-dimetilaminofenilalanina. El mutante SP92::pVRC508 se ha fermentado como se describe más arriba añadiendo, a las 17 horas de fermentación, 100 mg/l de p-dimetilaminofenilalanina. En estas condiciones de complementación, el mutante SP92::pVRC508 produce una cantidad de pristinamicinas 1 equivalente a la que produce la cepa SP92. La producción de pristinamicinas II es equivalente en las dos cepas. Esto nos permite concluir que el mutante SP92::pVRC508 ya no produce pristinamicinas I porque se ha interrumpido completamente un gen que interviene en la biosíntesis de la p-dimetilaminofenilalanina (el gen papA). La complementación de este mutante por la p-dimetilaminofenilalanina restaura su capacidad para producir pristinamicinas I, lo que demuestra que la mutación en el gen papA no tiene efecto polar en la síntesis de otros precursores de las pristinamicinas I o en la formación de la cadena peptídica a partir de estos precursores.
Este ejemplo muestra que es posible, a partir de los genes de biosíntesis clonados, construir las cepas mutadas en las etapas de biosíntesis de las pristinamicinas y, en particular, las pristinamicinas I. También, este ejemplo muestra que, con esta estrategia, se pueden construir las cepas de S. pristinaespiralis que produzcan específicamente las pristinamicinas II y, por extensión, cepas que produzcan específicamente las pristinamicinas I. También, se podría utilizar esta misma estrategia para las otras cepas de actinomicetos productores de estreptograminas.
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9.4 Construcción de un mutante de S. pristinaespiralis SP92 con el gen snbA interrumpido
Este ejemplo ilustra cómo se puede, mediante interrupción del gen snbA, construir una cepa de S. pristinaespiralis SP92 que ya no produzca pristinamicinas I. Este mutante se ha construido con el fin de confirmar la funcionalidad de la proteína SnbA. Su construcción se ha realizado con ayuda del vector suicida, pDH5, descrito en el ejemplo 9.1.
9.4.1. Construcción del plásmido pVRC404
Este ejemplo ilustra cómo se puede construir un plásmido que no se replique en S. pristinaespiralis SP92, que se puede utilizar para interrumpir el gen snbA mediante recombinación homóloga simple.
El plásmido pVRC404 se ha construido a partir del plásmido pVRC402 descrito en el ejemplo 6.1 para realizar el mutante cromosómico SP92 con el gen snbA interrumpido. El plásmido pVRC402 ha sido digerido con las enzimas de restricción XhoI y HindIII. Después de la separación de los fragmentos así generados mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se ha aislado y purificado por Geneclean (Bio101, La Jolla, California) un fragmento de 1170 kb, que contiene una parte interna del gen snaA. La localización del fragmento en el gen snbA se presenta en la figura 15A.
100 ng del vector pDH5 linealizados mediante una digestión con SmaI, se han ligado con 200 ng del fragmento de 1170 pb, como se describe en el ejemplo 3.3. Después de transformar la cepa TG1, se ha aislado un clon que contiene el fragmento deseado. El plásmido recombinante se ha denominado pVRC404. El plásmido pVRC404 se ha preparado como se describe en el ejemplo 2.1. Su mapa de restricción se presenta en la figura 29.
9.4.2. Aislamiento del mutante SP92 con el gen snbA interrumpido mediante recombinación homóloga
Este ejemplo ilustra cómo se ha construido el mutante de S. pristinaespiralis SP92 con el gen snbA interrumpido.
Este mutante se ha aislado mediante transformación de la cepa SP92 con el plásmido suicida pVRC404. La preparación de los protoplastos y su transformación se han realizado como se describe en el ejemplo 9.1. Después de la transformación de los protoplastos de la cepa SP92, los recombinantes se han seleccionado sembrando 3 ml del medio SNA que contiene 2,6 mg/ml de tioestreptón. En las 5 transformaciones realizadas con 5 veces 1 \mug del plásmido pVRC404, se han aislado una treintena de clones resistentes al tioestreptón. Esto da una tasa de recombinantes de aproximadamente 5 por \mug de ADN. Estos recombinantes son el resultado de la integración mediante recombinación homóloga simple entre el gen snbA contenido en el cromosoma de la cepa SP92 y el fragmento de 1170 pb del plásmido suicida pVRC404. Las esporas de los recombinantes se han aislado mediante siembra y crecimiento en el medio R2YE + 400 \mug/ml de tioestreptón y se han resembrado en el mismo medio para obtener colonias aisladas. Para verificar la posición en la que se ha integrado el plásmido pVRC404, se han realizado diferentes Southern del ADN total de varios clones recombinantes, purificados como se describe anteriormente, y se han hibridado con el vector pDH5 y el fragmento de 1170 kb utilizados sucesivamente como sondas después de la marcación mediante cebado aleatorio con [\alpha-^{32}P]dCTP, como se describe en el ejemplo 9.1. Los resultados de hibridación demuestran la aparición, en el genoma de los clones recombinantes digeridos con las enzimas de restricción XhoI y HindIII, de una banda XhoI-HindIII adicional de 4,7 kb (vector pDH5 + 1,17 kb), en relación a la cepa testigo SP92, que se hibrida, al mismo tiempo, con pDH5 y con el fragmento de 1170 pb. La digestión de los clones recombinantes con la enzima de restricción Pf1MI (sitios que flanquean el fragmento XhoI-HindIII de 1170 pb) muestra la desaparición de la banda Pf1MI-Pf1MI de 3,1 kb y la aparición de una banda de 8,8 kb que se hibrida con las dos sondas. Estos resultados indican que la estructura genómica de los clones analizados es realmente la que se espera después de un acontecimiento de recombinación homóloga entre pVRC404 y el gen cromosómico snbA. Uno de estos mutantes se ha denominado
SP92::pVRC404.
9.4.3. Producción de pristinamicinas por el mutante SP92::pVRC404
Este ejemplo ilustra cómo se determina que el mutante de S. pristinaespiralis SP92, interrumpido en el gen snbA por la integración del plásmido pYRC404, ya no produce pristinamicina I.
El mutante SP92::pVRC404, así como la cepa SP92, en tanto que cepa de testigo, se han cultivado en un medio de producción líquido. La fermentación, así como la dosificación de las pristinamicinas I y II, se han realizado como se describe en el ejemplo 9.1. Los resultados han mostrado que en las condiciones de fermentación realizadas, mientras que la cepa de testigo SP92 produce una cantidad estándar de pristinamicinas I, no se ha detectado ninguna traza de pristinamicinas de tipo I en el mosto de fermentación del mutante SP92::pVRC404. Por otro lado, la producción de las pristinamicinas II por el mutante SP92::pVRC404 es equivalente a la del testigo SP92. Por lo tanto, el mutante SP92::pVRC404 ya no produce más que pristinamicinas II. Esto demuestra totalmente que el gen snbA codifica una proteína snbA implicada en la biosíntesis de las pristinamicinas I, como se había demostrado durante la purificación en el ejemplo 5.2.
Este ejemplo muestra, como en el ejemplo anterior, que a partir de los genes de biosíntesis clonados, se pueden construir cepas mutadas en las etapas de biosíntesis de las pristinamicinas y, en particular, de las pristinamicinas L. Este ejemplo también muestra que, con esta estrategia, se pueden producir cepas de S. pristinaespiralis que producen específicamente las pristinamicinas II y, por extensión, cepas que producen específicamente las pristinamicinas I, como se describe en el ejemplo 9.5 siguiente. También se podría utilizar esta misma estrategia para las otras cepas de actinomicetos productores de estreptograminas.
9.5 Construcción de un mutante de S. pristinaespiralis SP92 con el gen snaD interrumpido que codifica, seguramente, una péptido sintasa implicada en la biosíntesis de las pristinamicinas II
Este ejemplo ilustra cómo se puede, mediante interrupción del gen snaD que codifica, seguramente, una péptido sintasa implicada en la biosíntesis de las pristinamicinas II, construir una cepa de S. pristinaespiralis SP92 que ya no produzca pristinamicinas II.
Este mutante se ha construido con el fin de confirmar la funcionalidad del gen snaD y obtener una cepa derivada de SP92 que no sintetice más que las pristinamicinas I.
Su construcción se ha realizado con ayuda del plásmido PVRC1000 descrito en el ejemplo 6.8 derivado del vector suicida pDH5, que puede replicarse sólo en E. coli y que contiene un marcador de resistencia que se expresa en Streptomyces (véase el ejemplo 9.1).
9.5.1. Construcción del plásmido pVRC1000
Este ejemplo ilustra cómo se puede construir un plásmido que no se replique en S. pristinaespiralis SP92, que se puede utilizar para interrumpir el gen snaD mediante recombinación homóloga simple. La construcción del plásmido pVRC1000 que contiene una parte del gen snaD se describe en el ejemplo 6.8.
9.5.2. Aislamiento del mutante SP92 con el gen snaD interrumpido mediante recombinación homóloga
Este ejemplo ilustra cómo se ha construido el mutante de S. pristinaespiralis SP92 con el gen snaD interrumpido. Este mutante se ha aislado mediante transformación de la cepa SP92 con el plásmido suicida pVRC1000. La preparación de los protoplastos y su transformación se han realizado como se describe en el ejemplo 9.1. Se han aislado aproximadamente 1500 clones resistentes en las 5 transformaciones realizadas con 1 \mug del pVRC1000. Esto proporciona una tasa de recombinantes de aproximadamente 375 por \mug de ADN. Estos recombinantes son el resultado de la integración mediante recombinación homóloga simple entre el gen snaD contenido en el cromosoma de la cepa SP92 y el fragmento BamHI-SstI de 1,5 kb del plásmido suicida pVRC1000. Se han replicado una veintena de recombinantes en el medio R2YE que contiene 400 \mug/ml de tioestreptón y se han aislado las esporas de estos recombinantes mediante resiembra y crecimiento en el medio R2YE que contiene 400 \mug/ml de tioestreptón.
Para verificar la posición en la que se ha integrado el plásmido pVRC1000, se han realizado e hibridado diferentes Southern del ADN total de 7 clones recombinantes, como se describe anteriormente, con el vector pDH5 y el fragmento BamHI-SstI de 1,5 kb contenido en el PVRC1000, utilizados sucesivamente como sondas después de la marcación con [\alpha-^{32}P]dCTP como se describe en el ejemplo 9.1. Los resultados de hibridación muestran la aparición, en el genoma de los 7 clones recombinantes, de una banda EcoRI de 13,8 kb y de una banda BglII de 17 kb, aproximadamente, que se hibridan con las 2 sondas así como de una banda EcoRI de 3,7 kb que se hibrida con la sonda BamHI-SstI de 1,5 kb. Uno de estos mutantes se ha denominado SP92::pVRC1000 y se corresponde perfectamente con la integración del plásmido pVRC1000 en el genoma snaD, mediante recombinación homóloga simple.
9.5.3. Producción de pristinamicinas por el mutante SP92::pVRC1000
Este ejemplo ilustra cómo se determinó que el mutante de S. pristinaespiralis SP92, con el gen snaD interrumpido mediante la integración del plásmido pVRC1000, ya no produce pristinamicinas II sino sólo pristinamicinas I. Se han cultivado el mutante SP92::pVRC1000 así como la cepa de testigo SP92 en el medio de producción líquido y se han dosificado sus producciones de pristinamicinas II y I como se describe en el ejemplo 9.1.
Los resultados han demostrado que, en las condiciones de fermentación realizadas y para los tres tiempos analizados, el mutante SP92:pVRC1000 produce 0 mg/l de pristinamicinas II y una cantidad de pristinamicinas I equivalente a la del testigo SP92. Por lo tanto, este mutante tiene completamente bloqueada una etapa de biosíntesis de las pristinamicinas II, lo que demuestra que el gen snaD codifica una enzima implicada en la biosíntesis de las pristinamicinas II y, muy probablemente, sea una péptido sintasa.
Este ejemplo muestra, como en el ejemplo anterior, que a partir de los genes de biosíntesis clonados se pueden construir cepas mutadas en las etapas de biosíntesis de las pristinamicinas y, en particular, de las pristinamicinas II. Este ejemplo también muestra que, con esta estrategia, se pueden producir cepas de S. pristinaespiralis que produzcan específicamente las pristinamicinas I y, por extensión, cepas que produzcan, específicamente, las pristinamicinas II. También se podría utilizar esta misma estrategia para las otras cepas de actinomicetos productores de
estreptograminas.
Ejemplo 10 Complementación de un mutante no productor de la cepa SP92
Este ejemplo muestra cómo se pueden expresar los genes de biosíntesis de las pristinamicinas. Más particularmente, se ha realizado esta expresión para los genes snaA y snaB contenidos en el cósmido pIBV1 en una cepa mutante derivada de SP92:SP120. Este mutante no produce pristinamicina IIA. Acumula el último intermediario de la vía de la biosíntesis de la pristinamicina II: pristinamicina IIB.
10.1. Clonación de los genes snaA y snaB en el vector versátil pIJ903
Este ejemplo ilustra cómo se ha clonado un subfragmento del cósmido pIBV1, que contiene los genes snaA y snaB, en un vector capaz de replicarse al mismo tiempo en E. coli y en Streptomyces.
El vector pIJ903 (Lydiate D. J. et al., 1985) es un vector versátil con un bajo número de copias (de 1 a 3 por célula), capaz de replicarse al mismo tiempo en E. coli gracias a su origen de replicación de pBR322 y en Streptomyces gracias a su origen de replicación de SCP2*. El gen de resistencia a la ampicilina permite la selección en E. coli y el gen de resistencia al tioestreptón permite la selección en Streptomyces.
Se ha digerido el cósmido pIBV1 con la enzima de restricción SstI. Se ha aislado un gran fragmento de ADN de 7,6 kb que contiene los genes snaA y snaB mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y se ha electroeluido. Se han ligado 500 ng de este fragmento con 100 ng del vector pUC1813 (Kay y McPherson, 1987) linealizado con SstI. Se ha aislado un clon que contiene el fragmento de 7,6 kb después de transformar la cepa E. coli DH5\alpha (supE44 \DeltalacU169 (f80lacZAM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1) y de seleccionar los transformantes en medio LB sólido que contiene ampicilina a 150 \mug/ml y X-gal a 20 \mug/ml. El plásmido se ha denominado pVRC506. Se ha realizado una preparación de este plásmido recombinante como se describe en el ejemplo 2.1.
La clonación en el vector pIJ903 se ha realizado en el sitio HindIII. Se ha cortado el plásmido pVRC506 con HindIII y se ha aislado el fragmento de 7,6 kb que contiene los genes snaA y snaB mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y se ha electroeluido. Se han ligado 500 ng de este fragmento con 500 ng del vector pIJ903 linealizados con HindIII. Se ha aislado un clon que contiene el fragmento de 7,6 kb después de transformar la cepa E. coli DH5\alpha y de seleccionar los transformantes en LB sólido que contiene ampicilina a 150 \mug/ml. El plásmido se ha denominado pVRC507. Se ha realizado una preparación de este plásmido recombinante como se describe en el ejemplo 2.1. Su mapa se presenta en la figura 30.
10.2. Expresión de los genes snaA y snaB en el mutante SP120
Este ejemplo ilustra cómo se pueden producir las proteínas snaA y snaB en S. pristinaespiralis SP92 introduciendo, en esta cepa, un plásmido que contiene los correspondientes genes estructurales. La expresión de los genes snaA y snaB se ha realizado después de transformar la cepa mutante SP120 con 500 ng del plásmido pVRC507. La transformación de los protoplastos de SP120 y la selección de los transformantes en tiostreptón se ha realizado como se describe en el ejemplo 9.1.2.
También se han obtenido numerosos transformantes y se han elegido 3 de entre ellos para los ensayos de producción en el medio líquido. Se ha elegido la cepa SP120 que contiene el plásmido pIJ903 como testigo. Las fermentaciones, así como la extracción de los productos de biosíntesis, se han realizado como se describe en el ejemplo 9.1.3.
Los resultados han demostrado que, en las condiciones de fermentación realizadas, mientras que el testigo (SP120 que contiene el plásmido pIJ903) ha producido en 24, 28 y 32 horas de fermentación el 100% de PIIB y el 0% de PIIA, los 3 clones de la cepa SP120 transformados con el plásmido pVRC507 han producido, para estos mismos tiempos, aproximadamente del 85 al 80% de pristinamicina IIB y del 15 al 20% de pristinamicina IIA, cuya suma es equivalente en cantidad a la producción de pristinamicina IIB de la cepa de testigo (SP120 que contiene el plásmido pIJ903). Los clones que contienen el pVRC507 se han complementado parcialmente para la etapa de biosíntesis de las pristinamicinas II, que corresponde a la oxidación del enlace 2-3 de la D-prolina del intermediario pristinamicina IIB. Se ha confirmado esto mediante la dosis enzimática de la actividad pristinamicina IIA sintasa, como se describe en el ejemplo 5.1.1.A, para la cepa SP120 que contiene el pVRC507 y la cepa SP120 que contiene el pIJ903. Mientras que la cepa de testigo SP120 que contiene el pIJ903 no presenta ninguna actividad pristinamicina IIA sintasa, la cepa SP120 que contiene el pVRC507 presenta una actividad PIIA sintasa.
Este ejemplo muestra que se pueden expresar los genes de biosíntesis de las estreptograminas. Más particularmente, se ha estudiado esta expresión para los genes que codifican la pristinamicina IIA sintasa, pero se pueden expresar igualmente los otros genes de biosíntesis de las pristinamicinas II y las pristinamicinas I así como los implicados en la biosíntesis de los compuestos de las diferentes estreptograminas. Esta expresión se puede realizar en las cepas mutantes, como es el caso del ejemplo 10, pero también en las cepas productoras para aumentar los niveles de producción de las estreptograminas. Se puede modificar la expresión mediante clonación de los genes en un vector con un número de copias diferentes (bajo o elevado) o en un vector integrativo, por desregulación de estos clones, mediante clonación de estos genes junto a un promotor homólogo o heterólogo (promotor fuerte o regulado específicamente). También se puede realizar la expresión de los diferentes genes de biosíntesis de las estreptograminas en cepas heterólogas a partir de vectores de expresión adaptados, con el fin de producir antibióticos híbridos.
Ejemplo 11 Expresión del gen papM de S. pristinaespiralis en E. coli
Este ejemplo ilustra cómo se puede expresar un gen de S. pristinaespiralis en E. coli para poder identificar, purificar y estudiar la proteína codificada por este gen.
11.1. Construcción del plásmido pVRC706
La expresión del gen papM en E. coli se obtiene colocando este gen hacia 3' del promotor y del sitio de fijación de los ribosomas del gen lacZ de E. coli. El fragmento MluI-StuI de 1,7 kb se ha aislado del plásmido pVRC409 descrito en el ejemplo 7.8, luego se ha clonado en el plásmido mMTL23 (Chambers et al, 1988), se ha cortado en el sitio BamHI y se ha rellenado posteriormente con ayuda de la enzima Klenow (Maniatis et al, 1989) y en el sitio MluI para obtener el plásmido pVRC706 representado en la figura 31. La clonación en el sitio MluI permite obtener una fusión en fase entre los 32 primeros aminoácidos de la \beta-galactosidasa codificada por el gen lacZ del plásmido pMTL23 y los once últimos aminoácidos del gen situado justo cadena arriba de papM, lo que permite conservar el acoplamiento traduccional que parece existir entre el gen papM y este gen hacia 5' en vista de la secuencia de nucleótidos proporcionada en el ejemplo 7.8. Por lo tanto, la expresión del gen híbrido entre lacZ y el gen cadena arriba de papM y la del gen papM está bajo el control de las señales de expresión del gen lacZ.
11.2. Expresión en la cepa E. coli DH5\alpha del producto del gen papM
Se han introducido los plásmidos pVRC706 y pMTL23 por transformación en la cepa de E. coli DH5\alpha y se ha estudiado la expresión de sus genes en las condiciones en las que se induce el promotor del gen lacZ, como ya se ha descrito (Maniatis et al, 1989). Se han cultivado las cepas de E. coli que contienen el plásmido pVRC706 o el plásmido de testigo pMTL23 en 500 ml del medio rico LB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml e IPTG a 1 mM para permitir la inducción del promotor del gen lacZ. Se toman estos cultivos cuando han alcanzado una densidad óptica de 600 nm cercana a 1 y se preparan los extractos proteicos como se describió anteriormente.
11.3 Dosificación de la actividad del producto del gen papM expresado en E. coli
Se dosifica la actividad correspondiente a la proteína codificada por el gen papM para los dos extractos preparados a partir de los cultivos de E. coli que contienen el plásmido pVRC706 o el plásmido pMTL23 como se describe en el ejemplo 5.7. Se ha demostrado que el extracto preparado a partir de la cepa E. coli::pVRC706 cataliza la metilación de la p-aminofenilalanina en p-dimetilaminofenilalanina con una actividad de 235 unidades/mg, mientras que esta actividad es inexistente en los extractos de la cepa testigo E. coli::pMTL23 (véase el ejemplo 5.7.1.C). Estos resultados indican que se puede expresar el gen papM de S. pristinaespiralis en E. coli y que la proteína correspondiente es realmente la enzima que cataliza la metilación de la p-aminofenilalanina en p-dimetilaminofenilalanina. Este ejemplo muestra que se pueden expresar los genes de biosíntesis de las estreptograminas en las cepas heterólogas (tales como E. coli pero también de otros microorganismos) a partir de vectores de expresión adaptados para producir precursores de antibióticos o incluso antibióticos naturales o híbridos.
Ejemplo 12 Poner de manifiesto la homología de los genes implicados en la biosíntesis de las estreptograminas, en diferentes Streptomyces
Este ejemplo ilustra cómo se puede poner de manifiesto, mediante hibridación sobre los ADN totales, la homología que existe entre los diferentes genes implicados en la biosíntesis de las estreptograminas en las diferentes cepas de Streptomyces productoras de estreptograminas.
12.1. Extracción del ADN total de diferentes Streptomyces productores de estreptograminas
Este ejemplo ilustra cómo se ha purificado el ADN de las diferentes cepas productoras de estreptograminas. Se han elegido las cepas de Streptomyces entre las descritas en la tabla 1:
Streptomyces loidensis
Streptomyces olivaceus
Streptomyces ostreogriseus
Streptomyces virginiae 
\newpage
Se ha elegido una cepa no productora de estreptograminas, Streptomyces hygroscopicus, como testigo negativo.
Las extracciones de los diferentes ADN totales se han realizado a partir de cultivos en el medio YEME, como se describe en el ejemplo 1.
12.2 Hibridación de los ADN totales de las cepas productoras de estreptograminas con los fragmentos de ADN que contienen los genes implicados en la biosíntesis de las pristinamicinas y aislados de la cepa S. pristinaespiralis SP92
Este ejemplo ilustra cómo se pueden, a partir de los genes implicados en la biosíntesis de las pristinamicinas y aislados de la cepa SP92 como se describe en los ejemplos anteriores, poner de manifiesto los genes homólogos mediante hibridación de los ADN totales de otras cepas productoras de estreptograminas. Los fragmentos de ADN utilizados como sonda han sido:
El fragmento XhoI-XhoI de 3,6 kb aislado a partir del pVRC1106 descrito en el ejemplo 6.5 y cuyo mapa de restricción se presenta en la figura 18. Este fragmento contiene una parte del gen que codifica la pristinamicina I sintasa IL.
El fragmento BamHI-BamHI de 6 kb aislado a partir del plásmido pVRC2045 descrito en el ejemplo 6.3 y cuyo mapa se presenta en la figura 16. Este fragmento contiene los genes estructurales de las dos subunidades de la PIIA sintasa.
Los ADN totales de las cuatro cepas productoras de estreptograminas, de la cepa S. hygroscopicus así como de la cepa SP92 se han digerido con las enzimas de restricción BamHI y XhoI. Se han separado los fragmentos de ADN así obtenidos en gel de agarosa al 0,7% y se ha transferido el ADN a una membrana de nilón como se describe en Maniatis et al. (1989). Se ha realizado la marcación de los fragmentos XhoI-XhoI de 3,6 kb y BamHI-BamHI de 6 kb mediante marcación con cebado aleatorio, como se describe en el ejemplo 9.1.2. Las hibridaciones de las membranas se han realizado en presencia de formamida al 50% a 42ºC como se describe en Maniatis et al. (1989). Se han realizado los lavados de las membranas después de la hibridación a 50 y 60ºC en una disolución que contiene SSC (Maniatis et al. 1989) diluido 10 veces y SDS al 0,1%.
Estas hibridaciones ponen de manifiesto los resultados siguientes:
La cepa S. hygroscopicus no presenta ninguna hibridación con las dos sondas utilizadas.
Los ADN totales (digeridos con XhoI y BamHI) de las cepas S. ostreogriseus, S. olivaceus, S. loidensis y S. virginiae presentan todas ellas señales de hibridación de intensidad comparables a las observadas en el ADN total de la cepa SP92 con las dos sondas utilizadas.
Este ejemplo muestra que las diferentes cepas de Streptomyces que producen las estreptograminas contienen genes que se hibridan con los genes aislados de S. pristinaespiralis SP92 e implicados en la biosíntesis de las estreptograminas, como se describe en los ejemplos anteriores. Por lo tanto, estas hibridaciones ponen de manifiesto la homología que existe entre los genes implicados en la biosíntesis de las estreptograminas de la cepa SP92 y los implicados en la biosíntesis de las estreptograminas de las otras cepas productoras de estreptograminas.
Por lo tanto, este ejemplo demuestra que se puede, a partir de los genes aislados de SP92 e implicados en la biosíntesis de las estreptograminas, aislar los genes homólogos presentes en las otras cepas productoras de estreptograminas por hibridación y clonación.
Ejemplo 13 Estudio del ligamiento físico de los diferentes genes de S. pristinaespiralis SP92 implicados en la biosíntesis de las pristinamicinas I y de las pristinamicinas II
Este ejemplo ilustra cómo se puede estudiar el ligamiento físico de los genes de S. pristinaespiralis SP92 implicados en la biosíntesis de las pristinamicinas I y II. Se ha llevado a cabo este estudio con el fin de demostrar que todos estos genes están agrupados sobre el cromosoma en un agrupamiento y que, por lo tanto, se puede, recorriendo el cromosoma a partir de los genes ya identificados, aislar otros genes implicados en la biosíntesis de las pristinamicinas I y II. Se puede planear un procedimiento similar para los genes implicados en la biosíntesis de otras estreptograminas.
13.1. Enzimas de restricción utilizada para la electroforesis en campo pulsante
El genoma de S. pristinaespiralis SP92 se compone en un 70% al 75% de nucleótidos que contienen las bases G y C. Para cortar su genoma en un pequeño número de grandes fragmentos, hemos utilizado las enzimas que reconocen una secuencia rica en AT tales como AseI (AT/TAAT), SspI (AAT/ATT), pero también HindIII (A/AGCTT), EcoRI (G/AATTC), NdeI (CA/TATG) y ClaI (AT/CGAT).
13.2. Cepas de S. pristinaespiralis utilizadas para la electroforesis en campo pulsante
Hemos utilizado el ADN cromosómico de varias cepas para estudiar, mediante electroforesis en campo pulsante, el ligamiento físico de los genes implicados en la biosíntesis de las pristinamicinas I y de las pristinamicinas II. Hemos preparado los insertos, como se describe en el ejemplo 4.1, del ADN cromosómico de la cepa S. pristinaespiralis SP92 pero también del ADN cromosómico de las cepas derivadas de SP92, cuya construcción se describe en los ejemplos 9.1 y 9.4. Se trata de la cepa SP92::pVRC505 cuyo gen snaA se ha interrumpido mediante la integración del plásmido pVRC505 (ejemplo 9.1) y de la cepa SP92::pVRC404 cuyo gen snbA se ha interrumpido mediante la integración del plásmido pVRC404 (ejemplo 9.4). Se han introducido estas dos últimas cepas en este estudio porque han permitido colocar con precisión los genes snaA y snbA sobre el mapa cromosómico al explotar la presencia de sitios de corte poco frecuente el ADN cromosómico AseI, SspI, HindIII, EcoRI, NdeI y ClaI en los plásmidos pVRC505 y pVRC404.
13.3. Sondas de ADN utilizadas para las hibridaciones de los fragmentos aislados mediante electroforesis en campo pulsante
Hemos utilizado diferentes fragmentos de ADN para obtener las sondas marcadas radiactivamente como se describe en el ejemplo 9.1, que hemos hibridado con los fragmentos separados mediante electroforesis en campo pulsante después de cortar con enzimas los insertos del ADN cromosómico de las tres cepas presentadas anteriormente (ejemplo 4.2). Las sondas son las siguientes: el fragmento EcoRI-BamHI de 3,2 kb aislado del plásmido pVRC701 que contiene los genes snaB y samS (véase el ejemplo 9.2), el fragmento BamHI-SstI de 1,5 kb aislado del plásmido pVRC1000 que contiene una parte del gen snaD (véase el ejemplo 6.8), el fragmento XhoI-HindIII de 1,1 kb aislado del plásmido pVRC402 que contiene el gen snbA (véase el ejemplo 6.1), el fragmento PstI-PstI de 2,4 kb aislado del plásmido pVRC900 que contiene el gen papA (véanse los ejemplos 6.7 y 8.8) y el fragmento XhoI-PstI de 1,5 kb aislado del plásmido pVRC509 que contiene el gen snaC (véase el ejemplo 6.9).
13.4. Localización en el cromosoma de los diferentes genes implicados en la biosíntesis de las pristinamicinas I y II, y estudio de su ligamiento físico
Las hibridaciones con las diferentes sondas descritas anteriormente de los ADN cromosómicos de las cepas S. pristinaespiralis SP92, SP92::pVRC404 y SP92::pVRC505, cortados mediante digestiones simples y digestiones dobles con ayuda de las seis enzimas mencionadas anteriormente, han conducido a la cartografía general representada en la figura 32: se ha indicado la posición de los sitios importantes, así como la posición y el sentido de transcripción de los genes implicados en la biosíntesis de las pristinamicinas PI y PII. Por lo tanto, se ha podido calcular la distancia que separa las 3 regiones cromosómicas que contienen los genes identificados: la de los genes snbA, snbR, papA y papM (cósmido pIBV2, ejemplo 5.2), la de los genes snaA, snaB, samS, snaD snbC, snbD, snbE (cósmidos pIBV1 y 3, ejemplo 5.1) y, finalmente, la del gen snaC (cósmido pIBV4, ejemplo 5.6). Por ejemplo, se ha evaluado la distancia entre los genes snaA y snbA en aproximadamente 160 a 170 kb. Esto demuestra que los genes ya identificados están todos contenidos en una región que cubre sólo 200 kb del cromosoma de la cepa S. pristinaespiralis, es decir, menos del 3% de la longitud total del genoma que hemos podido estimar en 7500 kb con la técnica de electroforesis en campo pulsante.
Estos resultados demuestran que los genes implicados en la biosíntesis de las pristinamicinas I y II están agrupados sobre el mismo cromosoma en un agrupamiento y que, por lo tanto, se puede, recorriendo el cromosoma a partir de los genes ya identificados, aislar otros genes implicados en la biosíntesis de las pristinamicinas I y las pristinamicinas II. Más generalmente, se puede, recorriendo el cromosoma, identificar los otros genes implicados en esta biosíntesis a partir de cualquier gen implicado en la biosíntesis de las estreptograminas.
TABLA 1
Microorganismos Antibióticos
Hongos
\hskip0.5cm Micromonospora sp. Vernamicinas
Streptomyces
\hskip0.5cm S. alborectus Virginiamicinas
\hskip0.5cm S. conganensis (ATCC13528) F1370 A, B
\hskip0.5cm S. diastaticus Plauracinas, estreptograminas
\hskip0.5cm S. graminofasciens Estreptograminas
\hskip0.5cm S. griseus (NRRL2426) Viridogriseína (etamicina)
\hskip0.5cm S. griseoviridus Griseoviridina
\hskip0.5cm S. griseoviridus (FERMP3562) Neoviridogriseínas
\hskip0.5cm S. lavendulae Etamicinas
\hskip0.5cm S. loidensis (ATCC11415) Vemamicinas
TABLA 1 (continuación)
Microorganismos Antibióticos
Hongos
Streptomyces
\hskip0.5cm S. mitakaensis (ATCC15297) Micamicinas
\hskip0.5cm S. olivaceus (ATCC12019) Sinergistinas (PA114 A, B)
\hskip0.5cm S. ostreogriseus (ATCC27455) Ostreogricinas
\hskip0.5cm S. pristinaespiralis (ATCC25486) Pristinamicinas
\hskip0.5cm S. virginiae (ATCC13161) Virginiamicinas (estafilomicinas)
Actinomycetes
\hskip0.5cm A. auranticolor (ATCC31011) Plauracinas
\hskip0.5cm A. azureus (ATCC31157) Plauracinas
\hskip0.5cm A. daghestanicus Etamicina
\hskip0.5cm A. philppinensis A-2315 A, B, C
\hskip0.5cm Actinoplanes sp. (ATCC33002) A15104
\hskip0.5cm Actinoplanes sp. A17002 A, B, C, F
\hskip0.5cm Actinomadura falva Madumicinas
Abreviaturas utilizadas
ADN:
ácido desoxirribonucleico
AMP:
adenosina 5'-monofosfato
ATP:
adenosina 5'-trifosfato
BET:
bromuro de etidio
bis-tris:
(bis[2-hidroxietil]imino-tris[hidroximetil]metano
bis-tris propano:
(1,3-bis[tris(hidroximetil)-metilamino]propano)
BSA:
albúmina de suero bovino
HPLC:
cromatografía de líquidos de alta resolución
DO:
densidad óptica
DTE:
ditioeritritol
DTT:
ditiotreitol
E64:
trans-epoxisuccinil-L-leucilamido4-guanidino)butano
EDTA:
ácido etilenediaminotetraacético
EGTA:
ácido etilenglicol-bis-(\beta-aminoetil)-tetraacético
FMN:
mononucleótido de flavina
FMNH2:
mononucleótido de flavina reducido
Hepes:
(N-[2-hidroxietil]piperazina-N'-[2-ácido etanosulfónico])
IPTG:
isopropil \beta-D-tiogalactopiranósido
kDa:
kilodalton
kb:
kilobase
LB:
caldo de Luria (medio de crecimiento rico para E. coli)
NAD:
nicotinamida dinucleótido
NADH:
nicotinamida dinucleótido reducido
PAGE:
electroforesis en gel de poliacrilamida
pb:
par de bases
PMSF:
fluoruro de fenilmetilsulfonilo
PPi:
pirofosfato
rpm:
revoluciones/min
S. A.:
sulfato de amonio
SAM:
S-adenosilmetionina
SDS:
dodecil-sulfato de sodio
STI:
inhibidor de tripsina de soja
TE:
tampón de Tris-HCl a 10 mM, EDTA a 1 mM, pH 7,5
Tris:
amino-2-hidroxilmetil-2 propanodiol-1,3
U. V.:
rayos ultravioleta
Xgal:
5-bromo-4-cloro-3-indoil-\beta-D-galactósido
YEME:
medio con extracto de levadura y extracto de malta (medio de crecimiento rico para Streptomyces)
PEG:
polietilenglicol
LMP:
bajo punto de fusión
PM:
masa molecular
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- Molinero et al., J. Nat. Prod 52 (1989) 99.
- Reed et al. J. Org. Chem. 54 (1989) 1161.
- Watanabe et al., Mol. Cell. Biochem. 44 (1982) 181.
- Jablonski et al., Biochemistry 16 (1977) 2832.
- Duane et al., Mol. Cell. Biochem. 6 (1975) 53.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: RHONE-POULENC RORER S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 20, avenue Raymond ARON
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: ANTONY
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 92165
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: "Polipéptidos implicados en la biosíntesis de las estreptograminas, secuencias nucleotídicas que codifican estos polipéptidos y utilizaciones".
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 16
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA DE LECTURA EN EL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE SOPORTE: Cinta
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC de IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA DE ORDENADOR: PatentIn lanzamiento n.º 1.0, Versión n.º 1.25 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID n.º 1
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5392 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Streptomyces pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID n.º 1:
\vskip1.000000\baselineskip
23
24
25
26
27 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID n.º 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1269 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Streptomyces pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..1269
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID n.º 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATG ACC GCA CCC CGC CGG CGC ATC ACC CTC GCC GGC ATC ATC GAC GGC 
\hfill
48
28
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID n.º 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 834 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Streptomyces pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..834
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID n.º 3:
\vskip1.000000\baselineskip
30
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID n.º 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1209 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Streptomyces pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..1209
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID n.º 4:
\vskip1.000000\baselineskip
32
33
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID n.º 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1879 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Streptomyces pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 110..1858
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID n.º 5:
\vskip1.000000\baselineskip
35
36
37
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID n.º 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1833 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Streptomyces pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 103..1689
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID n.º 6:
\vskip1.000000\baselineskip
39
40
41 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID n.º 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 695 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: S. pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 212..695
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: /producto= "Gen SnaC"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID n.º 7
\vskip1.000000\baselineskip
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID n.º 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 640 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: S. pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..640
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: /producto= "Gen SnaD"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID n.º 8:
\vskip1.000000\baselineskip
43
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID n.º 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 645 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: S. pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 61..645
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: /producto= "Gen papA"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID n.º 9:
\vskip1.000000\baselineskip
45
46 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID n.º 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1052 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: S. pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 84..962
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: /producto= "Gene papM"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID n.º 10:
47
48 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID n.º 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 227 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: S. pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 3..227
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: /producto= "Parte del gen SnbC"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID n.º 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
49 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID n.º 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 247 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: S. pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..247
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: /producto= "Parte del gen SnbC"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID n.º 12:
\vskip1.000000\baselineskip
50 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID n.º 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 192 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: S. pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 3..192
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: /producto= "Parte del gen SnbD"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID n.º 13:
\vskip1.000000\baselineskip
51 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID n.º 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 474 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: S. pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..474
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: /producto= "Parte del gen SnbD"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID n.º 14:
\vskip1.000000\baselineskip
52
53 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID n.º 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 485 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: S. pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 3..485
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: /producto= "Parte del gen SnbE"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID n.º 15:
54 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID n.º 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 291 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: S. pristinaespiralis 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..291
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS: /producto= "Parte del gen SnbE"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID n.º 16:
\vskip1.000000\baselineskip
55

Claims (19)

1. Secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido implicado en la biosíntesis de las estreptograminas, caracterizada porque se elige entre
a)
los genes snaA (SEQ ID n.º 2), snaB (SEQ ID n.º 3), snaC (SEQ ID n.º 7), snaD (SEQ ID n.º 8), papA (SEQ ID n.º 9), papM (SEQ ID n.º 10), samS (SEQ ID n.º 4), snbA (SEQ ID n.º 5), snbC (SEQ ID n.º 11 y 12), snbD (SEQ ID n.º 13 y 14), snbE (SEQ ID n.º 15 y 16) y snbR (SEQ ID n.º 6),
b)
las secuencias que se hibridan con los genes a) y que codifican un polipéptido implicado en la biosíntesis de las estreptograminas, y
c)
las secuencias derivadas de las secuencias a) con motivo de la degeneración del código genético.
2. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 1, caracterizada porque se ha elegido entre los genes snaA, snaB, snaC, snaD, papA, papM, samS, snbA, snbC, snbD, snbE y snbR.
3. ADN recombinante que comprende un gen de biosíntesis de las estreptograminas según la reivindicación 2.
4. Vector de expresión de replicación autónoma y/o integrativo, que se caracteriza porque comprende una secuencia de nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 o un ADN recombinante según la reivindicación 3.
5. Célula recombinante que contiene un vector de expresión según la reivindicación 4.
6. Procedimiento de producción de un polipéptido implicado en la biosíntesis de las estreptograminas, caracterizado porque se cultiva una célula recombinante según la reivindicación 5 y se recupera el polipéptido producido.
7. Utilización de una célula recombinante según la reivindicación 5, que expresa un polipéptido al menos implicado en la biosíntesis de las estreptograminas, en una reacción de bioconversión.
8. Utilización de una secuencia de nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 o de un ADN recombinante según la reivindicación 3 o un vector según la reivindicación 4 para amplificar la producción de estreptograminas.
9. Procedimiento de producción de estreptograminas caracterizado porque:
-
se introducen y/o se amplifican en una célula productora de estreptograminas o potencialmente productora de estreptograminas una o varias secuencias y/o vectores según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
-
se cultiva dicha célula en las condiciones de producción de las estreptograminas, y
-
se recuperan las estreptograminas producidas.
10. Procedimiento según la reivindicación 9 para la producción de pristinamicinas, micamicinas o virginiamicinas.
11. Procedimiento de preparación de células bloqueadas en una etapa de la vía de biosíntesis de las estreptograminas caracterizado porque se efectúa, en una célula productora de estreptogramina, una mutagénesis en, al menos, un gen de la vía de biosíntesis, eligiéndose dicho gen entre los genes snaA (SEQ ID n.º 2), snaD (SEQ ID n.º 8), papA (SEQ ID n.º 9), samS (SEQ ID n.º 4) y snbA (SEQ ID n.º 5).
12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque se efectúa la mutagénesis in vitro o in situ, mediante eliminación, sustitución, deleción y/o adición de una o varias bases en el gen considerado, o mediante interrupción génica.
13. Mutante de un microorganismo productor de estreptograminas, caracterizado porque posee una interrupción de, al menos, un gen implicado en la biosíntesis de las estreptograminas, eligiéndose dicho gen entre los genes snaA (SEQ ID n.º 2), snaD (SEQ ID n.º 8), papA (SEQ ID n.º 9), samS (SEQ ID n.º 4) y snbA (SEQ ID n.º 5).
14. Procedimiento de preparación de un intermediario de biosíntesis de las estreptograminas, caracterizado porque
-
se prepara una célula bloqueada en una etapa de la vía de biosíntesis de las estreptograminas según la reivindicación 11,
-
se cultiva dicha célula y
-
se recupera el intermediario acumulado.
15. Procedimiento de preparación de una molécula derivada de las estreptograminas, caracterizado porque
-
se prepara una célula bloqueada en una etapa de la vía de biosíntesis de las estreptograminas según la reivindicación 11,
-
se cultiva dicha célula y.
-
se modifica el intermediario acumulado por esta célula, opcionalmente después de la separación del medio de cultivo.
16. Procedimiento de preparación de estreptograminas que comprende el cultivo de una célula según la reivindicación 13 que contiene, además, una secuencia de nucleótidos y/o un ADN recombinante y/o un vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
17. Utilización de una secuencia y/o de un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de antibióticos híbridos.
18. Polipéptido que resulta de la expresión de una secuencia según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.
19. Polipéptido elegido entre los polipéptidos SnaA (SEQ ID n.º 2), SnaB (SEQ ID n.º 3), SnaC (SEQ ID n.º 7), SnaD (SEQ ID n.º 8), PapA (SEQ ID n.º 9), PapM (SEQ ID n.º 10), SamS (SEQ ID n.º 4), SnbA (SEQ ID nº 5), SnbC (SEQ ID n.º 11 y 12), SnbD (SEQ ID n.º 13 y 14), SnbE (SEQ ID n.º 15 y 16) y SnbR (SEQ ID n.º 6).
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